特開 2023-13902 関節炎を治療するための幹細胞製剤の使用、及び幹細胞製剤を製造するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023013902

(43)【公開日】2023-01-26

(54)【発明の名称】関節炎を治療するための幹細胞製剤の使用、及び幹細胞製剤を製造するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20230119BHJP

   A61K 35/51 20150101ALI20230119BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230119BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20230119BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230119BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20230119BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230119BHJP

【ＦＩ】

A61K35/28

A61K35/51

A61P19/02

A61K9/10

A61P43/00 111

C12N5/0775 ZNA

C12N15/09 Z

【審査請求】有

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021164698

(22)【出願日】2021-10-06

(31)【優先権主張番号】110126154

(32)【優先日】2021-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW

(71)【出願人】

【識別番号】521436186

【氏名又は名称】國璽幹細胞應用技術股▲ふん▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100116850

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 隆行

(74)【代理人】

【識別番号】100165847

【弁理士】

【氏名又は名称】関 大祐

(72)【発明者】

【氏名】林峯輝

(72)【発明者】

【氏名】管哲雍

(72)【発明者】

【氏名】林▲ゆー▼楹

(72)【発明者】

【氏名】陳靖▲ゆん▼

(72)【発明者】

【氏名】陳緻宇

(72)【発明者】

【氏名】楊易軒

(72)【発明者】

【氏名】莊明熙

(72)【発明者】

【氏名】林珀丞

(72)【発明者】

【氏名】李家▲しん▼

(72)【発明者】

【氏名】張▲かい▼玲

(72)【発明者】

【氏名】趙沛▲しゅあん▼

(72)【発明者】

【氏名】徐婉馨

(72)【発明者】

【氏名】陳俊宏

(72)【発明者】

【氏名】王亭茹

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065BA25

4B065CA44

4C076AA16

4C076BB11

4C076CC04

4C076FF70

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB59

4C087BB63

4C087BB64

4C087CA04

4C087MA21

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA96

4C087ZB11

4C087ZC02

(57)【要約】

【課題】本発明は、関節炎を治療するための幹細胞製剤の使用を提供する。
【解決手段】本発明に係る幹細胞製剤は、関節炎による軟骨変性を有効に遅らせることができる。また、全血分析及び血液生化学的分析によって三次元幹細胞塊（ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅ）であることが証明された幹細胞製剤は、関節炎に応用する安全な治療を提供する。また、本発明は、幹細胞製剤を製造するための方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

幹細胞製剤は、幹細胞塊（ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅ）を含むことを特徴とする、
関節炎を治療する医薬品を製造するための幹細胞製剤の使用。

【請求項2】

前記関節炎は、変性性関節炎であることを特徴とする、
請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記幹細胞塊は、０μｍを超えてかつ５０μｍ未満の大きさを有することを特徴とする、
請求項１に記載の使用。

【請求項4】

前記幹細胞塊は、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＡＤＭＳＣ）、臍帯間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種の幹細胞を含むことを特徴とする、
請求項１に記載の使用。

【請求項5】

前記脂肪由来間葉系幹細胞は、ヒト初代脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、
請求項４に記載の使用。

【請求項6】

前記幹細胞製剤は、足場に前記ヒト初代脂肪由来間葉系幹細胞を接種して細胞足場複合体を形成し、前記細胞足場複合体に対して順に静的な培養及び動的な培養を行うことによって得られるものであることを特徴とする、
請求項５に記載の使用。

【請求項7】

前記ヒト初代脂肪由来間葉系幹細胞は、１×１０^６細胞／足場以上の濃度で前記足場に接種されることを特徴とする、
請求項６に記載の使用。

【請求項8】

前記幹細胞製剤における前記幹細胞塊の濃度は、１×１０^６細胞／５０μＬ以上であることを特徴とする、
請求項１に記載の使用。

【請求項9】

前記幹細胞製剤における前記幹細胞塊は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種の表面マーカーを発現することを特徴とする、
請求項１に記載の使用。

【請求項10】

前記幹細胞製剤における前記幹細胞塊は、トランスフォーミング増殖因子－β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１、ＴＧＦ－β１）遺伝子、骨形成タンパク質－２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－２、ＢＭＰ－２）遺伝子、Ｓｏｘ９遺伝子、アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）遺伝子、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＯＭＰ）遺伝子、ＩＩ型コラーゲンα１鎖（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ａｌｐｈａ １ ｃｈａｉｎ、Ｃｏｌ２ａ１）遺伝子、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種の軟骨関連遺伝子を発現することを特徴とする、
請求項１に記載の使用。

【請求項11】

前記医薬品は、非経口投与の剤形であることを特徴とする、
請求項１に記載の使用。

【請求項12】

足場にヒト初代脂肪由来間葉系幹細胞を接種して細胞足場複合体を形成し、前記細胞足場複合体に対して順に静的な培養及び動的な培養を行う工程を含むことを特徴とする、
幹細胞製剤を製造するための方法。

【請求項13】

前記ヒト初代脂肪由来間葉系幹細胞は、１×１０^６細胞／足場以上の濃度で前記足場に接種されることを特徴とする、
請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を治療するための幹細胞製剤の使用、及び幹細胞製剤を製造するための方法。

【背景技術】

【0002】

関節炎は、世界中でよく見られる慢性疾患の１つであり、主に関節の軟骨変性又は結合組織の炎症によって関節痛を生じ、関節の正常な動きを妨げる疾患である。関節炎は、全部で１００種類以上あり、病因が沢山あり、起こした関節の損傷もそれぞれ異なる。世界には約３億５５００万人の関節炎患者がいる。中国では、約１億人以上の関節炎患者がおり、米国では、５人の中に１人が関節炎の症状があり、アジアでは、６人の中に１人が人生のある時点で関節炎を発症する。関節炎は、高齢者に特有の疾患ではなく、子供を含むすべての年齢層に影響を与える。

【0003】

関節炎は、背中、首、膝、肩関節、手、股関節、足首に発症する可能性がある。多くの関節炎が老化に関し、６０歳以上の人が特定の関節炎を患う可能性があるが、若い人も関節炎を患う可能性がある。１００種類以上の関節炎には、よく見られるのは変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＯＡ）、関節リウマチ、リウマチ性関節炎、敗血症性関節炎、外傷性変形性関節炎、自己免疫性関節炎である。強直性関節炎も関節炎の１つである。

【0004】

変形性関節症は、変性性関節炎（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）とも呼ばれ、可動関節（ｄｉａｒｔｈｒｏｓｉｓ）不全を起こす疾患であり、主な症状としては、関節軟骨が変性して骨同士がぶつかって、関節痛み、テンダネス（ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ）、硬直（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）、ロッキング（ｌｏｃｋｉｎｇ）、関節に水が溜まる（ｅｆｆｕｓｉｏｎ）、関節可動域の縮小、関節スペースの狭小化、骨棘及び嚢胞の生成、関節変形を起こし、厳しい場合、障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）を引き起こす可能性がある。高齢化社会につれて様々な慢性疾患が現れ、そのうち、変形性関節症も深刻な問題となる。変形性関節症は、よく見られる関節疾患であり、米国の３０％の人口が影響を受ける。２０００年に、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ＷＨＯ）は、２０００年から２０１０年までの１０年を骨と関節の１０年と定め、さらに毎年１０月１２日を「世界関節炎の日（Ｗｏｒｌｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｄａｙ）」と定めた。現在、世界で約４億人が関節炎に苦しんでいる。ＧｌｏｂａｌＤａｔａの市場調査レポートによると、２０１６年の変形性関節症の市場規模が１６億ドルであり、２０２６年に３５億ドルに成長し、２０１６から２０２６年の年平均成長率（Ｃｏｍｐｕｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒａｔｅ、ＣＡＧＲ）が８．１％と予想される。２０１７年の台湾国民健康保険の年次報告書によると、台湾では、変形性関節症の診断及び入院等の支出は約５０億台湾元であり、市場の可能性はかなり大きい。現在、変形性関節症の治療法は、主に疼痛管理であるが、さらなる変性を予防することができない。痛みが日常生活を妨げる又は明らかな機能低下がある場合には、人工膝関節全置換術（Ｔｏｔａｌ Ｋｎｅｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＴＫＲ）等の外科手術が行われる。そのため、骨関節の持続的な変性の予防及び軟骨組織の再生は、変形性関節症の治療の究極の目標である。

【0005】

現在、変形性関節症の治療法は、アーチパッドによる矯正、機能性膝パッド、リハビリ電気療法、グルコサミン（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、コンドロイチン（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、非ステロイド性抗炎症薬（Ｎｏｎ－Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ Ａｎｔｉ－Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ、ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）の関節内注射、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）の関節内注射、多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ）の注射、自家培養軟骨細胞移植（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＡＣＩ）、局部人工膝関節置換術（Ｐａｒｔｉａｌ ｋｎｅｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、及び人工膝関節全置換術（Ｔｏｔａｌ Ｋｎｅｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＴＫＲ）等が挙げられる。米国整形外科学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ、ＡＡＯＳ）が発表した変形性関節症の治療ガイドライン第2版には、まず、非ステロイド性抗炎症薬で治療し、失敗した場合に、外科手術で治療するという治療ガイドラインが記載されている。関節置換術を受けたら約１０～３０年使用できるが、ほとんどの変形性関節症の患者が手術を受け入れない。なお、現在、変形性関節症の治療法は、主に疼痛管理であり、さらなる変性を予防することができない。

【0006】

上記の問題を解決するために、新規且つ有効な関節炎治療用医薬品が求められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、関節炎を治療する医薬品を製造するための幹細胞製剤の使用を提供する。前記幹細胞製剤は、幹細胞塊（ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅ）を含む。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の１つの実施例において、前記関節炎は、変性性関節炎である。

【0009】

本発明の１つの実施例において、前記幹細胞塊は、０μｍを超えてかつ５０μｍ未満の大きさを有する。

【0010】

本発明の１つの実施例において、前記幹細胞塊は、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＡＤＭＳＣ）、臍帯間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種の幹細胞を含む。

【0011】

本発明の１つの実施例において、前記脂肪由来間葉系幹細胞は、ヒト初代脂肪由来間葉系幹細胞である。

【0012】

本発明の１つの実施例において、前記幹細胞製剤は、足場に前記ヒト初代脂肪由来間葉系幹細胞を接種して細胞足場複合体を形成し、前記細胞足場複合体に対して順に静的な培養及び動的な培養を行うことで得られるものである。

【0013】

本発明の他の目的は、幹細胞製剤を製造するための方法を提供する。前記幹細胞製剤を製造するための方法は、足場にヒト初代脂肪由来間葉系幹細胞を接種して細胞足場複合体を形成し、前記細胞足場複合体に対して順に静的な培養及び動的な培養を行う工程を含む。

【0014】

本発明の１つの実施例において、前記ヒト初代脂肪由来間葉系幹細胞は、１×１０^６細胞／足場以上の濃度で前記足場に接種される。

【0015】

本発明の１つの実施例において、前記静的な培養の時間は、２日である。

【0016】

本発明の１つの実施例において、前記動的な培養の時間は、１４日である。

【0017】

本発明の１つの実施例において、前記幹細胞製剤における前記幹細胞塊の濃度は、１×１０^６細胞／５０μＬ以上である。

【0018】

本発明の１つの実施例において、前記幹細胞製剤における前記幹細胞塊は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる1種の表面マーカーを発現する。

【0019】

本発明の１つの実施例において、前記幹細胞製剤における前記幹細胞塊は、トランスフォーミング増殖因子－β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１、ＴＧＦ－β１）遺伝子、骨形成タンパク質－２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－２、ＢＭＰ－２）遺伝子、Ｓｏｘ９遺伝子、アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）遺伝子、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＯＭＰ）遺伝子、ＩＩ型コラーゲンα１鎖（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ａｌｐｈａ １ ｃｈａｉｎ、Ｃｏｌ２ａ１）遺伝子、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる1種の軟骨関連遺伝子を発現する。

【0020】

本発明の１つの実施例において、前記医薬品は、非経口投与の剤形である。

【発明の効果】

【0021】

本発明の幹細胞製剤によれば、ラットのヨード酢酸ナトリウム（ｍｏｎｏ－ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ、ＭＩＡ）誘発関節炎を治療し、そして、歩行分析装置、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）及びトルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）の染色によって治療効果を評価し、かつ、幹細胞製剤を関節炎の治療に応用する可能性を評価する。結果として、本発明の幹細胞製剤は、関節炎（特に変性性関節炎）による軟骨変性を有効に遅らせることができる。また、全血分析及び血液生化学的分析によって三次元幹細胞塊であることが証明された幹細胞製剤は、関節炎（特に変性性関節炎）に応用する安全な治療を提供することができる。なお、現在の細胞治療製品は、主に二次元細胞を利用するが、生体内の生理学的条件に比べ、二次元培養系における細胞形態、分化、細胞間の作用、及び細胞とマトリックスとの間の作用が明らかな差異がある。本発明は、三次元幹細胞スフィア（即ち、幹細胞塊）の幹細胞製剤を関節炎（特に変性性関節炎）の治療に利用する。医薬品の製造基準を考えて閉鎖的な生物反応系及び三次元多孔質生物足場を利用すると、無菌、マルチバッチ、安定に生産できる等の利点を有する。そのため、治療の成功率を向上させ、関節炎（特に変性性関節炎）の新規治療方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】本発明に係る三次元幹細胞塊である幹細胞製剤の大きさを示すグラフである。

【図2】歩行分析を示す模式図である。

【図3】変性性関節炎を罹患する実験動物に本発明に係る三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤を投与した後、その歩行分析の結果を示すグラフである。

【図4】手術４週間後のヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）の染色結果を示す組織切片の染色画像である。

【図5】手術８週間後のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）の染色結果を示す組織切片の染色画像である。

【図6】手術４週間後のトルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ Ｂｌｕｅ）の染色結果を示す組織切片の染色画像である。

【図7】手術８週間後のトルイジンブルーの染色結果を示す組織切片の染色画像である。

【図8】三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤が投与された変性性関節炎を罹患する実験動物の手術４週間後の変性性関節炎スコア（ＯＡ ｓｃｏｒｅ）を示すグラフである。

【図9】三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤が投与された変性性関節炎を罹患する実験動物の手術８週間後の変性性関節炎スコアを示すグラフである。

【図10】ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｈＡＤＭＳＣ）を１４日の二次元培養及び三次元培養（即ち、本発明の三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤）を経た後、その細胞のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。

【図11】図１１Ａは、ヒト臍帯間葉系幹細胞を１４日の二次元培養及び三次元培養（即ち、実施例１に記載の方法を参照して得られた本発明の三次元幹細胞塊である幹細胞製剤）を経た後、その細胞のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。図１１Ｂは、ヒト臍帯間葉系幹細胞を１４日の二次元培養及び三次元培養（即ち、実施例１に記載の方法を参照して得られた本発明の三次元幹細胞塊である幹細胞製剤）を経た後、その細胞のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、本発明の実施形態について説明する。後述する実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定するためのものではない。本発明の主旨及び範囲において、当業者が本発明を変更や修飾することができる。よって、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲によって定義すべくものです。

【0024】

本明細書に記載の数値は、近似値である。全ての実験データは、その数値の±２０％、好ましいくは±１０％、より好ましくは±５％の範囲内にあることを示す。

【0025】

本明細書において、「脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＡＤＭＳＣ）」は、脂肪から分離された1種類の間葉幹細胞であり、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に属し、高い可塑性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有し、誘導によって異なる組織の細胞に分化できる。

【0026】

本明細書において、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）又は障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の１つ又は複数の臨床徴候（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎ）を軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）、減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、緩和（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、控制（ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ）させること、及び治療中の病態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）又は症状（ｓｙｍｐｔｏｍ）の重症度（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）の進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を低下（ｌｏｗｅｒｉｎｇ）、停止（ｓｔｏｐｐｉｎｇ）又は逆転（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）させることを示す。

【0027】

本発明に係る医薬品は、当業者の公知技術によって非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）投与に適した剤形（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）に製造され得る。前記剤形は、例えば、注射剤（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（例えば、無菌水溶液（ｓｔｅｒｉｌｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）又は分散液（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ））、無菌散剤（ｓｔｅｒｉｌｅ ｐｏｗｄｅｒ）、錠剤（ｔａｂｌｅｔ）、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅ）、ロゼンジ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）、丸剤（ｐｉｌｌ）、カプセル剤（ｃａｐｓｕｌｅ）、分散性散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ）や顆粒剤（ｇｒａｎｕｌｅ）、溶液、懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、乳剤（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、シロップ剤（ｓｙｒｕｐ）、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒ）、スラリー剤（ｓｌｕｒｒｙ）、及びそれらに類似するものが挙げられる。

【0028】

本発明に係る医薬品は、腹腔内注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、表皮内注射（ｉｎｔｒａｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮内注射（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、静脈内注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、及び病巣内注射（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）からなる群から選ばれる非経腸経路（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｒｏｕｔｅｓ）で投与されることができる。

【0029】

本発明に係る医薬品は、医薬品製造技術に広く使用されている薬学的に許容される担体を含んでもよい。前記薬学的に許容される担体は、溶剤（ｓｏｌｖｅｎｔ）、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、懸濁化剤（ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、分解剤（ｄｅｃｏｍｐｏｓｅｒ）、結着剤（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、キレート剤（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、ゲル化剤（ｇｅｌｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、防腐剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）、潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）、吸収遅延剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、リポソーム剤（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、及びそれらに類似するものからなる群から選ばれる１種類以上の試剤を含んでもよい。当業者は、前記試薬の選択及び使用量を適宜設定することができる。

【0030】

本発明に係る前記薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水（ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）、糖液、アルコール水溶液（ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｌｃｏｈｏｌ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる溶剤を含む。

【0031】

下記の実施例で使用される実験動物は、ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）のオスのラットである。実験の前日、実験ラットに術前鎮痛剤（ケトプロフェン（Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、５ｍｇ／ｋｇ）を注射する。各ラットをイソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔し、剃毛部をヨードチンキで消毒した後、７５％のアルコールで２次消毒する。そして、２７Ｇの針で５０μＬのヨード酢酸ナトリウム（ｍｏｎｏ－ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ、ＭＩＡ）（６ ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ａ２５１２）を左膝関節腔に注射して変性性関節炎を誘発させる。偽対照群（Ｓｈａｍ群）に対しては、生理食塩水（Ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ）（５０μＬ）を注射する。術後の痛みを軽くするために、手術後の３日間毎日にケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を投与する。

【0032】

下記の実施例において、幹細胞として脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＡＤＭＳＣ）を使用する例について説明する。また、他の実施例において、幹細胞として臍帯間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、又は脂肪由来間葉系幹細胞と臍帯間葉系幹細胞との組み合わせを使用してもよい。

【0033】

下記の実施例において、関節炎として変性性関節炎を選択する例について説明する。また、他の実施例において、関節炎は他の原因による関節炎であってもよい。

【0034】

実施例１．三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＡＤＭＳＣｓ）製剤の製造及びその大きさ
本発明の実施例に使用したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＡＤＭＳＣｓ）は、台湾食品医薬品局が公開している「ヒト細胞治療品のドナーの適合性判定基準」に基づいて、腹部手術の間に、書面同意を得られた提供者の腹壁の皮下脂肪から２～５ｇの脂肪組織を採取する。ヒト脂肪組織をＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋を含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に置いて、直ちにＧＴＰ（Ｇｏｏｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）基準の実験室に移送する。ＧＴＰ実験室において、ヒト脂肪組織を輸送培地から取り出して培養ディッシュに入れて、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋を含まないＰＢＳが存在する状態で小片（約１～２ｍｍ^３）に切断し、組織を０．１％のコラゲナーゼで分解して３７℃で６０分間培養する。コラゲナーゼで消化した後、得られた細胞を収集して増殖培地で培養する。前記増殖培地は、無血清培地であり、通常、少なくとも１０％のウシ胎児血清、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｌ２アスコルビン酸、及びリン酸塩を含む表皮角化細胞無血清培地である。２日間培養した後、培養ディッシュ から上澄み液及び破片を除去し、初代培養脂肪由来間葉系幹細胞を得る。

【0035】

また、対照群として二次元培養した幹細胞製剤（２Ｄ）を製造する。動物実験の前日に、２本の７５Ｔ培養フラスコ（７５Ｔ－ｆｌａｓｋ）のヒト初代培養脂肪由来間葉系幹細胞（番号：１３Ａ００１、世帯数：第６世代（ｐａｓｓａｇｅ ６））を準備し、動物実験の当日に、トリプシン溶液（０．２５％のトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）と、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｓｉｇｍａ、製品番号３４５４９－１ＫＧ）とを含み、Ｇｉｂｃｏ社から購入、製品番号２５２００－０７２）で細胞を収集した後、血球計算盤を用いて細胞数をカウントし、生体内注射用の二次元培養した幹細胞製剤を製造する。

【0036】

そして、実験群として本発明の三次元幹細胞塊である幹細胞製剤（３Ｄ）を製造する。それぞれ２本の７５Ｔ培養フラスコのヒト初代培養脂肪由来間葉系幹細胞（番号：１３Ａ００１、世帯数：第５世代及び第６世代）を準備し、細胞をトリプシン溶液で収集して足場に接種する。接種した細胞数は、１×１０^６細胞／足場以上であり、本発明の実施例では１×１０^６細胞／足場である。細胞足場複合体を２４ウェルプレートで２４時間培養して細胞を安定させた後、細胞足場複合体を５０ｍＬの遠心分離管に移して４８時間静的に培養し、その後、バイオリアクターに移して、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ）内で１４日動的に培養する。

【0037】

１４日動的に培養した後、ＥＤＴＡ／ＰＢＳで足場を溶解して細胞塊を収集し、細胞カウンター（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標） Ａｕｔｏ Ｔ４）を用いて細胞塊の大きさを計算したところ、生成された細胞塊がいずれも５０μｍ以下である。実験結果を図１に示す。

【0038】

実施例２．三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤の細胞数の検出及び投与量
市販の細胞生存率測定キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ３Ｄ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ、製品番号Ｇ９６８２）で既知の細胞数のミトコンドリア活性を検出することにより、細胞の平均ミトコンドリア活性を計算して参考基準とする。計算した基準値を用いて換算すると、１４日動的な培養後の細胞増殖数は２．３５×１０^６細胞／足場となる。この結果を利用して動物実験の細胞塊群の細胞数を計算する。

【0039】

さらに、二次元培養細胞顆粒（即ち、実施例１に記載の二次元培養した幹細胞製剤）及び三次元幹細胞塊である幹細胞製剤の投与量をそれぞれ調べる。二次元培養細胞顆粒の投与量としては、１匹の動物に注射した細胞治療用の細胞数が１×１０^６細胞／５０μＬであり、かつ、実験動物が１群で８匹なので、最低必要量が８×１０^６細胞であり、実験の全必要量が２×１０^７細胞／ｍＬである。血球計算盤で計算した細胞数（３．０８×１０^７細胞／ｍＬ）を２×１０^７細胞／ｍＬで割って、細胞を含む細胞注射液の体積が１．５４ｍＬであると算出できる。本実施例において、１．５４ｍＬの細胞注射液を１．２×１０^７細胞／６００μＬで１ｍＬの注射器（２７Ｇ）に分注し、後の動物実験に利用する（各実験動物に５０μＬの細胞液を注射し、即ち、細胞の投与量が１×１０^６細胞／５０μＬである）。

【0040】

三次元幹細胞塊である幹細胞製剤の投与量としては、１匹の動物に注射した細胞治療用の細胞数が１×１０^６細胞／５０μＬであり、かつ、実験動物が１群で８匹なので、最低必要量が８×１０^６細胞であり、実験の全必要量が２×１０^７細胞／ｍＬである。２．３５×１０^６（各足場の細胞数）を１０（足場数）に掛けて、総細胞数が２．３５×１０^７個であると計算できる。さらに、総細胞数（２．３５×１０^７個）を実験の全必要量（２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で割って、細胞を含む細胞注射液の体積が１．１７ｍＬであると算出できる。本実施例において、１．１７ｍＬの細胞注射液を１×１０^７細胞／５００μＬで１ｍＬの注射器（２７Ｇ）に分注し、動物実験に利用する（各実験動物に５０μＬ細胞液を注射し、即ち、細胞の投与量が１×１０^６細胞／５０μＬである）。

【0041】

実施例３．変性性関節炎を罹患する実験動物に三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤を使用した後、その歩行分析の結果
本実施例及び下記の実施例の実験動物は、偽対照群（Ｓｈａｍ群）、ヨード酢酸ナトリウム（ｍｏｎｏ－ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ、ＭＩＡ）群、２Ｄ群（即ち、対照群）、及び３Ｄ群（即ち、実験群）を含む４つの群に分けられる。各群の処理方法を表１に示す。

【表1】

【0042】

術後３日に、ラットをイソフルランで麻酔し、かつ左膝の表面を消毒する。二次元培養した幹細胞製剤（２Ｄ）（１×１０^６細胞／５０μＬ）、三次元幹細胞塊である幹細胞製剤（３Ｄ）（１×１０^６細胞／５０μＬ）、及び生理食塩水（５０μＬ）を２７Ｇの針でそれぞれ２Ｄ群、３Ｄ群、及びＭＩＡ群のラットの左膝関節腔に注射する。また、Ｓｈａｍ群に対しては、再度に生理食塩水を注射する。術後４週間後、歩行分析装置（Ｃｌｅｖｅｒ Ｓｙｓ Ｉｎｃ．）によって分析する。

【0043】

歩行分析の操作プロセスは以下のとおりである。手術４週間後、ＳＤラットを歩行分析装置の無端ベルトに乗せて、２３ｃｍ／秒の速度で試験を行って、ＴｒｅａｄＳｃａｎ^ＴＭ ２．０でスタンス（Ｓｔａｎｃｅ）、ブレーキ（Ｂｒａｋｅ）、及びプロパルジョン（Ｐｒｏｐｕｌｓｉｏｎ）の反応時間（図２参照）を測定する。

【0044】

歩行分析の結果（表２参照）から分かるように、Ｓｈａｍ群（ＭＩＡ誘発を行われず、且ついずれの治療も受けなかった）と比べて、いずれの治療も受けなかったＭＩＡ誘発ラット（ＭＩＡ群）は、スタンス、ブレーキ、及びプロパルジョンの反応時間が長くなる（図３参照）。ＭＩＡ群と比べて、２Ｄ及び３Ｄ治療を受けたＭＩＡ誘発ラットは、スタンス、ブレーキ、及びプロパルジョンの反応時間が短くなる。また、３Ｄ群の反応時間が２Ｄ群より低いことから分かるように、本発明の三次元幹細胞塊である幹細胞製剤は、ＭＩＡ誘発変性性関節炎の歩行表現（ｗａｌｋｉｎｇ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を改善することができる。なお、歩行分析から分かるように、３Ｄ群の予後が２Ｄ群より優れ、そのうち、スタンス時間が３９．８４％減少し、ブレーキ時間が４３．６２％減少し、及びプロパルジョン時間が３６．３９％減少する。

【表2】

【0045】

実施例４．変性性関節炎を罹患する実験動物に三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤を使用した後、組織切片をヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）で染色した結果
実験動物の組み分け及び処理は、実施例３と同じである。各群の実験動物をそれぞれ手術４週間後と８週間後に安楽死させ、サンプリングした組織を１０％のホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（Ｍａｃｒｏｎ）（製品番号Ｈ１２１－０８）溶液に浸漬して３日間固定した後、５％硝酸溶液で２週間脱灰し、そして、ホルマリン溶液に置換し、財団法人国家衛生研究院コアラボに送って脱水、パラフィン包埋、及び組織切片を行った後、パラフィン切片を染色する。

【0046】

そして、パラフィン切片をキシレン（Ｘｙｌｅｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）（製品番号５３４０５６）で脱パラフィンして再水和し、そして、ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）（製品番号ＧＨＳ３）溶液に浸漬して５分間染色する。その後、切片を流水で２分間洗浄し、さらに脱イオン水でリンスし、そして、エオジン（Ｅｏｓｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）（製品番号Ｅ４３８２）溶液に浸漬して３分間染色する。その後、切片を９９％のアルコール（Ａｂｓｏｌｕｔｅ ａｌｃｏｈｏｌ）で３分間脱水し、前記脱水処理を２回行う。最後、切片をキシレンに浸漬し、そして、封入剤で密封する。

【0047】

術後４週のＨ＆Ｅ染色結果を図４に示す。ＭＩＡ誘発軟骨切片から分かるように、軟骨細胞が破壊され、関節軟骨に明らかなラクナ（ｌａｃｕｎａｅ）がないため、前記動物モデルにおいて変性性関節炎が成功に誘発されたと証明できる。Ｓｈａｍ群は、正常な軟骨形態を維持し、かつ、軟骨細胞がラクナで覆われている。二次元培養した幹細胞製剤（２Ｄ）及び三次元幹細胞塊である幹細胞製剤（３Ｄ）で治療したラットの切片から分かるように、ＭＩＡ群と比べて、その軟骨形態が正常である。そのうち、３Ｄ群及びＳｈａｍ群は、軟骨形態について明らかな差異が見られない。

【0048】

術後８週のＨ＆Ｅ染色結果を図５に示す。Ｓｈａｍ群は、正常な軟骨形態を維持している。しかし、ＭＩＡ群は、軟骨が破壊される。２Ｄ及び３Ｄで８週間治療した切片から分かるように、ＭＩＡ群と比べて、軟骨形態が明らかに改善される。そのうち、３Ｄ群及びＳｈａｍ群は、軟骨形態について明らかな差異が見られない。Ｈ＆Ｅ染色結果から分かるように、４週間のラットであっても８週間のラットであっても、本発明の三次元幹細胞塊である幹細胞製剤（３Ｄ）は、変性性関節炎を遅らせる効果がより優れている。

【0049】

実施例５．変性性関節炎を罹患する実験動物に三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤を使用した後、組織切片をトルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ Ｂｌｕｅ）で染色した結果
実験動物の組み分け及び処理は、実施例３と同じである。各群の実験動物をそれぞれ手術４週間後と８週間後に安楽死させ、サンプリングした組織を１０％のホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（Ｍａｃｒｏｎ）（製品番号Ｈ１２１－０８）溶液に浸漬して３日間固定した後、５％硝酸溶液で２週間脱灰し、そして、ホルマリン溶液に置換し、財団法人国家衛生研究院コアラボに送って脱水、パラフィン包埋、及び組織切片を行った後、パラフィン切片を染色する。

【0050】

そして、パラフィン切片をキシレンで脱パラフィンして再水和し、さらに０．０４％のトルイジンブルー（Ｓｉｇｍａ）（製品番号Ｔ３２６０）溶液に浸漬して１０分間染色する。その後、切片を流水で１分間洗浄した後、１０分間静置して乾燥させる。最後、切片をキシレンに浸漬し、そして、封入剤で密封する。

【0051】

術後４週のトルイジンブルー染色結果を図６に示す。軟骨の表面からタイドマーク（Ｔｉｄｅｍａｒｋ）までの長さを測定したところ、Ｓｈａｍ群、ＭＩＡ群、２Ｄ群、及び３Ｄ群は、それぞれ１３１．８１、６４．４７、５１．３２、及び１５３．９５μｍである。そのうち、２Ｄ群と比べて、３Ｄ群の長さが２９９．９８％増加する。ＭＩＡ誘発ラットの軟骨がトルイジンブルー陰性であり、Ｓｈａｍ群及び３Ｄ群がトルイジンブルー陽性であり、２Ｄ群がトルイジンブルー陰性である。

【0052】

術後８週のトルイジンブルー染色結果を図７に示す。軟骨の表面からタイドマークまでの長さを測定したところ、Ｓｈａｍ群、ＭＩＡ群、２Ｄ群、及び３Ｄ群は、それぞれ１９２．１０、７３．６９、６３．１６、及び１８４．８７μｍである。そのうち、２Ｄ群と比べて、３Ｄ群の長さが２９２．７％増加する。Ｓｈａｍ群及び３Ｄ群の軟骨は、トルイジンブルー陽性である。トルイジンブルー染色結果から分かるように、本発明の三次元幹細胞塊である幹細胞製剤（３Ｄ）は、変性性関節炎による軟骨変性を有効に遅らせることができる。

【0053】

実施例６．変性性関節炎を罹患する実験動物に三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤を使用した後、その全血分析及び血液生化学的分析
実験動物の組み分け及び処理は、実施例３と同じである。各群の実験動物をそれぞれ手術４週間後と８週間後に採血して安楽死させ、血液を全血分析及び血液生化学的分析に供する。手術の４週間後と８週間後、尾静脈から血液サンプルを採取し、全血分析及び血液生化学的分析を行う。全血分析の項目は、赤血球（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ、ＲＢＣ）、白血球（Ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ、ＷＢＣ）、血小板（Ｐｌａｔｅｌｅｔ、ＰＬＴ）、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、及びリンパ球（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を含む。血液生化学的分析項目は、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ｐｙｒｕｖｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、ＧＰＴ）、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＬＰ）、血中尿素窒素（Ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ、ＢＵＮ）、及びクレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ、ＣＲＥ）を含む。結果から分かるように、４週間と８週間後の各群の間に顕著な差異が見られない（表３～表６参照）。この結果から、二次元培養した幹細胞製剤（２Ｄ）及び本発明の三次元幹細胞塊である幹細胞製剤（３Ｄ）をラットの関節腔に注射しても、明らかな炎症反応が起らず、肝臓及び腎臓の毒性がないことを実証できる。

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【0054】

実施例７．三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤が投与された変性性関節炎を罹患する実験動物の変性性関節炎スコア（ＯＡ ｓｃｏｒｅ）
実験動物の組み分け及び処理は、実施例３と同じである。各群の実験動物をそれぞれ手術４週間後と８週間後に安楽死させ、サンプリングした組織を１０％のホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（Ｍａｃｒｏｎ）（製品番号Ｈ１２１－０８）溶液に浸漬して３日間固定した後、５％の硝酸溶液で２週間脱灰し、そして、ホルマリン溶液に置換し、財団法人国家衛生研究院コアラボに送って脱水、パラフィン包埋、及び組織切片を行った後、パラフィン切片を染色する。

【0055】

そして、パラフィン切片をキシレンで脱パラフィンして再水和し、さらに０．０４％のトルイジンブルー（Ｓｉｇｍａ）（製品番号Ｔ３２６０）溶液に浸漬して１０分間染色する。その後、切片を流水で１分間洗浄した後、１０分間静置して乾燥させる。最後、切片をキシレンに浸漬し、そして、封入剤で密封する。

【0056】

トルイジンブルー染色切片を国際変形性関節症学会（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）が公開している採点方法に従って変性性関節炎を評価し、その点数は、グレード（Ｇｒａｄｅ）×ステージ（Ｓｔａｇｅ）の積である。

【0057】

４週後及び８週後のトルイジンブルー染色切片を使用して変性性関節炎スコアを評価する。術後４週のスコアについて、Ｓｈａｍ群、ＭＩＡ群、２Ｄ群、及び３Ｄ群は、それぞれ０±０、１４±２．３１、１１．５±６．４０、及び０．７５±０．９６（図８参照）である。術後８週のスコアについて、Ｓｈａｍ群、ＭＩＡ群、２Ｄ群、及び３Ｄ群は、それぞれ０±０、１６±１．６３、１２．５±５．７４、及び０．５±０．５７（図９参照）である。本実施例の結果から分かるように、本発明の三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤は、変性性関節炎を有効に遅らせることができる。

【0058】

実施例８．三次元幹細胞塊である幹細胞製剤の軟骨に関連する遺伝子の発現
本実施例で使用したヒト臍帯間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ）は、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ）から購入する。

【0059】

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｈＡＤＭＳＣ）及びヒト臍帯間葉系幹細胞を実施例１と同じ製造方法で１４日培養した後、ｍＲＮＡ分離キット（Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ^TM ＭｉｎｉＰｒｅｐ、ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を使用して細胞のｍＲＮＡを分離する。そして、逆転写キット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^TM ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、Ｔａｋａｒａ）使用して分離したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。ＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ^TM ＩＩ（Ｔａｋａｒａ）を利用して１００ｎｇのｃＤＮＡサンプルを混合し、トランスフォーミング増殖因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ－β１）遺伝子、骨形成タンパク質－２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－２、ＢＭＰ－２）遺伝子、Ｓｏｘ９遺伝子、アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）遺伝子、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＯＭＰ）遺伝子、及びコラーゲンＩＩ型α－１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ａｌｐｈａ １、Ｃｏｌ２ａｌ）遺伝子に適したプライマーを選択し、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を行う。各遺伝子のプライマー配列を表７に示す。

【表7】

【0060】

実施例１で製造した三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤のｍＲＮＡを分離した後、ｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行う。各遺伝子の発現量を分析して記録し、その結果を表８及び図１０に示す。表８及び図１０には、ｈＡＤＭＳＣが１４日間の二次元（２Ｄ）及び三次元培養（３Ｄ）を経た（即ち、本発明の三次元幹細胞塊である脂肪由来間葉系幹細胞製剤）後の細胞のｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【表8】

【0061】

表８及び図１０に示すように、ｈＡＤＭＳＣを１４日培養した後、二次元培養細胞と比べ、三次元培養細胞におけるＴＧＦ－β１遺伝子、ＢＭＰ－２遺伝子、Ｓｏｘ９遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、ＣＯＭＰ遺伝子、及びＣｏｌ２ａｌ遺伝子の発現が約２～２５倍顕著に増加した。

【0062】

表９、図１１Ａ及び図１１Ｂには、ヒト臍帯間葉系幹細胞が１４日間の二次元（２Ｄ）及び三次元培養（３Ｄ）を経た（即ち、実施例１の方法で製造した本発明の三次元幹細胞塊である幹細胞製剤）後の細胞のｍＲＮＡ発現レベルを示す。そのうち、二次元培養群のｍＲＮＡ発現を１とし、相対的なｍＲＮＡ発現を計算する。なお、図１１Ｂにおいて、２つの群の間の相対的なｍＲＮＡ発現の差が大きく、Ｙ軸の間隔も大きくなるため、二次元培養群のｍＲＮＡ発現がはっきり認められないが、ＣＯＭＰ遺伝子を発現しなかったという意味ではない。

【表9】

【0063】

表９、図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように、ヒト臍帯間葉系幹細胞を１４日培養した後、二次元培養細胞と比べて、三次元培養細胞におけるＴＧＦ－β１遺伝子、Ａｇｇｒｅｃａｎ遺伝子、ＣＯＭＰ遺伝子の発現が約２．４～１５７２倍顕著に増加した。

【0064】

上記をまとめると、本発明に係る幹細胞製剤をヨード酢酸ナトリウム（ｍｏｎｏ－ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ、ＭＩＡ）誘発関節炎ラットの治療に使用し、歩行分析装置及びヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）の染色とトルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）の染色によって治療効果を評価することにより、幹細胞製剤を関節炎の治療に利用する可能性を評価する。結果として、本発明に係る幹細胞製剤は、関節炎（特に変性性関節炎）による軟骨変性を有効に遅らせることができる。また、全血分析及び血液生化学的分析により、三次元幹細胞塊である幹細胞製剤が関節炎（特に変性性関節炎）の安全な治療法を提供できることが証明された。なお、現在の細胞治療製品は、主に二次元細胞を利用するが、生体内の生理学的条件に比べ、二次元培養系における細胞形態、分化、細胞間の作用、及び細胞とマトリックスとの間の作用が明らかな差異がある。本発明は、三次元幹細胞スフィア（即ち、幹細胞塊）の幹細胞製剤を関節炎（特に変性性関節炎）の治療に利用する。医薬品の製造基準を考えて閉鎖的な生物反応系及び三次元多孔質生物足場を利用すると、無菌、マルチバッチ、安定に生産できる等の利点を有する。そのため、治療の成功率を向上させ、関節炎（特に変性性関節炎）の新規治療方法を提供できる。

【0065】

本発明は、上記の内容に限定されない。本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく均等的な変更や変化は、いずれも添付の特許請求の範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【配列表】

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