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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023139092
(43)【公開日】2023-10-03
(54)【発明の名称】タンパク質生成に対するキメラシグナルペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230926BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20230926BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230926BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230926BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230926BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20230926BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230926BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C07K7/08 ZNA
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N5/10
C07K14/00
C07K16/18
【審査請求】有
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023116486
(22)【出願日】2023-07-18
(62)【分割の表示】P 2021536798の分割
【原出願日】2019-12-23
(31)【優先権主張番号】62/784,497
(32)【優先日】2018-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】523255893
【氏名又は名称】臺灣生物醫藥製造股▲フン▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｔａｉｗａｎ Ｂｉｏ－Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】３Ｆ．， Ｎｏ． ３３５， Ｒｕｉｇｕａｎｇ Ｒｄ．， Ｎｅｉｈｕ Ｄｉｓｔ．， Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ １１４０６３， Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】テング， チャオ・イー
(72)【発明者】
【氏名】チェン， イング・ジュー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】治療的タンパク質の調製において、タンパク質発現を最適化する、人工的なシグナルペプチドを提供する。
【解決手段】タンパク質発現のためのキメラシグナルペプチドは、Ｎ領域と、疎水性領域と、Ｃ領域とを含み、Ｎ領域及びＣ領域が第１のタンパク質の同一のシグナルペプチドによるものであり、疎水性領域が第２のタンパク質のシグナルペプチドによるものであり、第１のタンパク質は第２のタンパク質と異なる。第１及び第２のタンパク質は、ＢＭ４０、ＩＬ２、ＨＡ、インスリン、ＣＤ３３、ＩＦＮＡ２、ＩｇＧＫリーダ、ＡＺＵ及びＳＥＡＰからなる群から独立して選択され得る。
【選択図】図６
【解決手段】タンパク質発現のためのキメラシグナルペプチドは、Ｎ領域と、疎水性領域と、Ｃ領域とを含み、Ｎ領域及びＣ領域が第１のタンパク質の同一のシグナルペプチドによるものであり、疎水性領域が第２のタンパク質のシグナルペプチドによるものであり、第１のタンパク質は第２のタンパク質と異なる。第１及び第２のタンパク質は、ＢＭ４０、ＩＬ２、ＨＡ、インスリン、ＣＤ３３、ＩＦＮＡ２、ＩｇＧＫリーダ、ＡＺＵ及びＳＥＡＰからなる群から独立して選択され得る。
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳類宿主細胞におけるタンパク質発現のためのキメラシグナルペプチドであって、Ｎ領域と、疎水性領域（Ｈ領域）と、Ｃ領域とを備え、前記Ｎ領域及び前記Ｃ領域が第１のタンパク質のシグナルペプチドによるものであり、前記疎水性領域（Ｈ領域）が第２のタンパク質のシグナルペプチドによるものであり、前記第１のタンパク質は前記第２のタンパク質と異なり、前記キメラシグナルペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、キメラシグナルペプチド。
【請求項2】
請求項１に記載の哺乳類宿主細胞におけるタンパク質発現のための前記キメラシグナルペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列であって、配列番号２３に記載のＤＮＡ配列を含む単離されたＤＮＡ配列。
【請求項3】
哺乳類宿主細胞から標的タンパク質を生成するための発現ベクターであって、請求項２に記載の前記単離されたＤＮＡ配列に機能的に連結されるプロモーターであって、前記標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列にインフレームで連結されるプロモーターを備える発現ベクター。
【請求項4】
標的タンパク質を生成する方法であって、
ａ）請求項３に記載の前記発現ベクターで哺乳類宿主細胞をトランスフェクションするステップと、
ｂ）前記哺乳類宿主細胞を培養して前記標的タンパク質を発現させるステップと、
ｃ）前記標的タンパク質を採取するステップと、
を備える方法。
ａ）請求項３に記載の前記発現ベクターで哺乳類宿主細胞をトランスフェクションするステップと、
ｂ）前記哺乳類宿主細胞を培養して前記標的タンパク質を発現させるステップと、
ｃ）前記標的タンパク質を採取するステップと、
を備える方法。
【請求項5】
前記哺乳類宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記標的タンパク質が抗体である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概略として、治療的タンパク質の調製に関する。具体的には、本発明は、タンパク質発現を最適化する人工的なシグナルペプチドの適用に関する。
【背景技術】
【0002】
高レベルのタンパク質又は抗体を生成するＣＨＯなどの安定した細胞株を開発することが、業界の動向となっている。これまで、哺乳類発現系の最適化は、主にダウンストリームプロセス及び媒体開発に焦点を合わせている。しかし、高収率、より迅速な開発及びより低い生産コストに対するニーズを満たすためには、発現ベクター及び他の構成要素の最適化も同様に考慮する必要がある。分泌タンパク質を生成する場合、タンパク質分泌に影響する律速ステップは、小胞体の内腔へのタンパク質の移行のステップである。これは、分泌シグナル、すなわち、シグナルペプチド（ＳＰ）の配列によって決定される。多数の研究は、元来のタンパク質又は抗体の内因性ＳＰが通常は最適化されていないことを示し、満たされていない改善のニーズが未だに存在する。
【0003】
シグナルペプチドは、新規に合成されるタンパク質のほとんどのＮ末端に存在する、一般に５～３０アミノ酸長の短いペプチドであり、細胞から分泌され、特定の細胞小器官（ゴルジ体又は小胞体）内に存在し、又は細胞膜中に挿入されるものを含む。
【0004】
シグナルペプチドは、Ｎ領域、疎水性領域（Ｈ領域）及びＣ領域からなる。シグナルペプチドのＨ領域は、単一のアルファヘリックスを形成しやすい疎水性アミノ酸（約５～１６残基長）のストレッチを含む。多数のシグナルペプチドのＮ領域は、ポジティブインサイドルールとして知られるものにより移行中のポリペプチドの適切なトポロジーを強化するのに役立ち得る、正に帯電したアミノ酸の短いストレッチを含む。シグナルペプチドのＣ領域には、通常、シグナルペプチダーゼによる切断のために認識されるアミノ酸のストレッチが存在する。しかし、プロテアーゼ切断部位は、シグナルアンカー配列ともいわれるシグナルペプチドとして作用する膜貫通ドメインには存在しない。
【0005】
多数の研究は、タンパク質のほとんどの天然のシグナルペプチド（ＳＰ）が最適ではなく、ＳＰを最適化すること又は天然のＳＰを代替のＳＰで置換することが、標的タンパク質の生成の増加につながり得ることを見出した。例えば、Ｌ Ｋｏｂｅｒ他は、ヒトアルブミン及びヒトアズロシジン（ＡＺＵ）由来の天然のシグナルペプチドによってより良好な抗体発現が得られたことを示した（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２０１３ Ａｐｒ；１１０（４）：１１６４－７３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２４７７６）。
【発明の概要】
【0006】
本発明の実施形態は、キメラシグナルペプチドに関する。タンパク質発現のためのキメラシグナルペプチドは、Ｎ領域、疎水性領域及びＣ領域を含み、Ｎ領域及びＣ領域が第１のタンパク質のシグナルペプチドによるものであり、疎水性領域が第２のタンパク質のシグナルペプチドによるものであり、第１のタンパク質は第２のタンパク質とは異なる。
【0007】
本発明のある実施形態によれば、第１及び第２のタンパク質は、ＢＭ４０、ＩＬ２、ＨＡ、インスリン、ＣＤ３３、ＩＦＮＡ２、ＩｇＫ、ＡＺＵ及びＳＥＡＰからなる群から独立して選択され得る。
【0008】
本発明の一態様は、本発明のキメラシグナルペプチドを使用して標的タンパク質又は抗体を生成する方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、本発明のキメラシグナルペプチドを含む発現カセットで哺乳類宿主細胞をトランスフェクションするステップと、哺乳類宿主細胞を培養して標的タンパク質を発現させるステップと、標的タンパク質を採取するステップとを備える。
【0009】
本発明の他の態様及び効果は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図3A】図３Ａは、キメラＣＤ３３＿ＩｇＫシグナルペプチドのＳｉｇｎａｌＰ４．０予測の結果を示す。ＳｉｇｎａｌＰ４．０は、Ｃ、Ｓ、Ｙスコアを予測する。Ｃスコアは、シグナルペプチダーゼがＭＰＬＬＬＷＶＬＬＬＷＡＧＡＬＡ－ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：（配列番号）１１）の配列においてアラニン（Ａ）の後かつグルタミン酸（Ｅ）の前を切断するはずであることを予測する。
【図3B】図３Ｂは、キメラＣＤ３３＿ＩｇＫシグナルペプチドのＳｉｇｎａｌＰ－ＨＭＭ予測の結果を示す。ＳｉｇｎａｌＰ－ＨＭＭは、シグナルペプチドのＮ領域、Ｈ領域及びＣ領域を予測する。Ｓｉｇｎａｌ－ＨＭＭはまた、シグナルペプチダーゼがＭＰＬＬＬＷＶＬＬＬＷＡＧＡＬＡ－ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ（配列番号１１）においてアラニン（Ａ）の後かつグルタミン酸（Ｅ）の前を切断するはずであることを予測する。
【図3C】図３Ｃは、キメラＣＤ３３＿ＩｇＫシグナルペプチドのＰｒｅｄｉＳｉ予測の結果を示す。ＰｒｅｄｉＳｉもまた、シグナルペプチダーゼがＭＰＬＬＬＷＶＬＬＬＷＡＧＡＬＡ－ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ（配列番号１１）においてアラニン（Ａ）の後かつグルタミン酸（Ｅ）の前を切断するはずであることを予測する。
【図3D】図３Ｄは、キメラＣＤ３３＿ＩｇＫシグナルペプチドのＢＬＡＳＴ予測の結果を示す。配列相同性の比較によって、ＢＬＡＳＴもまた、シグナルペプチダーゼがＭＰＬＬＬＷＶＬＬＬＷＡＧＡＬＡ－ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ（配列番号１１）においてアラニン（Ａ）の後かつグルタミン酸（Ｅ）の前を切断するはずであることを予測する。
【図4】図４は、キメラシグナルペプチドＢＭＣＤ及びＣＤＢＭの双方が明確に定義されたシグナルペプチダーゼ切断部位を有することを示し、そのようなシグナルペプチドは恐らくその機能を保存されるはずであることを示す。
【図6】図６は、本発明の種々のキメラシグナルペプチドの結果を示す。これらのキメラシグナルペプチドの幾つかは、ＡＺＵと同等又はより良好なレベルでタンパク質発現をもたらすことが可能である。より良好なキメラシグナルペプチドの中でＢＭＣＤが最良な結果を示す。
【図7】図７は、ＢＭＣＤキメラシグナルペプチドがＡＺＵよりも有意に良好であることを示す。ＢＭＣＤによる発現レベルは、ＡＺＵの約１．５倍である。図７は、キメラシグナルペプチドの適切な配列が重要であることも示す。例えば、最後の２残基（ＬＡ）を欠損したＢＭＣＤ変異体は、発現レベルが一層弱いシグナルペプチドである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明の実施形態は、標的タンパク質の真核細胞系からの生成を増強するキメラシグナルペプチド及びその使用に関する。本発明の実施形態によれば、キメラシグナルペプチドは、真核宿主細胞において発現される標的タンパク質の発現及び／又は分泌を増強するように設計される。シグナルペプチドは、通常、５～３０アミノ酸長を含み、Ｎ領域、Ｈ領域（疎水性領域）及びＣ領域に分割可能である。本発明のキメラシグナルペプチドは、例えば、第１のシグナルペプチドの疎水性領域を第２のシグナルペプチドによる疎水性領域と交換することにより構築され得る。
【0012】
本発明のキメラシグナルペプチドは、既知のシグナルペプチドに基づいてもよい。一般的に使用されるシグナルペプチドは、ＢＭ４０（基底膜タンパク質４０）、ＩＬ－２（インターロイキン２）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、インスリン、ＣＤ３３、ＩＦＮＡ２（インターフェロン アルファ２）、ＩｇＫ（免疫グロブリン カッパ鎖）、ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）及びＡＺＵ（アズロシジン）タンパク質によるものを含む。以下の説明では、これらのタンパク質の名称は、それらのシグナルペプチド（ＳＰ）のことをいうのにも使用され得る。これらの天然のシグナルペプチドから、より良好なものが更なる最適化のために選択される。タンパク質生成の増強におけるこれらのシグナルペプチドの効率を評価するために、シグナルペプチドを含む発現ベクターを構築し、例えばＥＬＩＳＡ又は他のアッセイを使用してタンパク質発現のレベルをアッセイすることが可能である。以下の実施例は、標的タンパク質の例として抗体を使用する。しかし、当業者は、本発明の実施形態が、抗体だけでなく任意のタンパク質を発現するのに使用され得ることを理解するはずである。
【0013】
抗体を標的タンパク質として使用して、抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ含む２個のベクターをクローニングする。代替的に、重鎖及び軽鎖の双方を含む発現ベクターが使用されてもよい。アッセイを容易にするために、これらのベクターは、タグ（例えば、それぞれ、赤色及び緑色蛍光タグ）も含み得る。試験シグナルペプチドを、抗体重鎖又は軽鎖の翻訳開始コドンＡＴＧの前に組み込む。そして抗体生成の効率を、これらのベクターの適切な宿主細胞へのコトランスフェクションにより評価した。アルブミン（ＡＬＢ）、アズロシジン（ＡＺＵ）、Ｈ５Ｌ１及びＨ７Ｎ１のような、効率の良いタンパク質生成を支援することが知られているいくつかのシグナルペプチドが、陽性コントロールとして使用され得る。
【0014】
タンパク質生成について、本発明のシグナルペプチドを含む構築物は、タンパク質発現系（例えば、大腸菌、酵母細胞、ＣＨＯなど）に適した任意の適切な発現ベクター内に構築され得る。例えば、我々の以前の研究では、（ｐＴＣＡＥ８．３に基づく）適切な発現ベクターＪ１．０ｄｅｌｔａ及びＪ１．０．２を、ハーセプチン及びアバスチンの生成のために構築した。各ベクターのシグナルペプチドは、ＡＺＵ（アズロシジン）又はＯｒｉ（元来のもの）である。より良好なシグナルペプチドを見出すために、重鎖又は軽鎖の核酸配列をそれぞれ含む別個のベクター中のＡＺＵ及びＯｒｉが、他のシグナルペプチドと置換され得る。一実施例では、全部で３２個のベクターが構築され、各々が異なるシグナルペプチドと共に抗体（例えば、ハーセプチン又はアバスチン）の軽鎖又は重鎖を含む。
【0015】
これらの発現ベクターを、異なる重鎖（ＨＣ）対軽鎖（ＬＣ）の比率（１：１又は１：４）で、ＣＨＯ細胞（例えば、ＤＸＢ１１細胞又はＣＨＯＫ１（ＣＣＬ６１－Ｓ１）細胞）に一過性にトランスフェクションし、トランスフェクション／発現効率を評価した。そして抗体の発現レベルを、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。
【0016】
図１に示すように、標的タンパク質としてハーセプチンを使用して、シグナルペプチドとしてＢＭ４０及びＣＤ３３を有する構築物は、シグナルペプチドとしてＡＺＵを使用する陽性コントロールと同等又はより良好な収率を得た。加えて、図１は、力価が、１：１のＨＣ／ＬＣ比率で８～９μｇ／ｍｌに到達可能であり、１：４のＨＣ／ＬＣ比率で４～５．５μｇ／ｍｌに到達可能であったことを示す。したがって、この実施例では、１：１のＨＣ／ＬＣ比率でより高い収率が得られる。
【0017】
次に、我々は、異なるシグナルペプチドを適用してアバスチンを生成した。図２に示すように、ＢＭ４０、ＣＤ３３及びＩｇＫシグナルペプチドを有する構築物は、元来のシグナルペプチド（ＯＲＩ）を有する構築物よりもより高い収率を得た。ＢＭ４０、ＣＤ３３及びＩｇＫシグナルペプチドによるタンパク質発現レベルは、陽性コントロール（ＡＺＵ）と同等又はより良好である。異なるトランスフェクション比率（ＨＣ／ＬＣ＝１：１又は１：４）は、収率において差を生じた。ＨＣ／ＬＣ＝１：１の場合の力価は２００～２５０ｎｇ／ｍｌであり、ＨＣ／ＬＣ＝１：４の場合の力価は３００～５５０ｎｇ／ｍｌに到達する。したがって、この実施例では、１：４の比率がより多くのタンパク質を生成した。
【0018】
これら及び類似の試験に基づいて、幾つかのシグナルペプチドが、陽性コントロールのＡＺＵと比較してタンパク質発現を増強するのに同様又はより良好な能力を有することが見出された。これらのシグナルペプチドを、さらなる最適化のために選択する。これらの選択されたシグナルペプチドは、ＣＤ３３、ＩｇＫ、ＢＭ４０、ＡＺＵ及びＳＥＡＰシグナルペプチドを含む。
【0019】
上記のように、シグナルペプチドは、Ｎ領域、Ｈ領域（疎水性領域）及びＣ領域の３つの領域に分割され得る。シグナルペプチドの疎水性領域（Ｈ領域）は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）との相互作用に重要なヘリックスを形成する。そのような相互作用は、ＳＲＰが新生タンパク質に結合することを可能とし、ＥＲ膜を越えるタンパク質の移行を促進する。Ｈ領域がそのような重要な機能を果たすので、我々はＨ領域の変化がシグナルペプチドの効率を改善し得るか否かを調査することにした。
【0020】
本発明の１つのアプローチは、第１のシグナルペプチドのＨ領域が第２のシグナルペプチドによる対応するＨ領域で置換されるキメラシグナルペプチドを創出することである。そのようなＨ領域の交換を行うために、我々はまずシグナルペプチドを分析し、各領域の境界及びシグナルプロテアーゼ切断部位を特定した。多数の方法／プログラム、例えばＳｉｇｎａｌＰ４．０、ＳｉｇｎａｌＰ－ＨＭＭ、ＰｒｅｄｉＳｉ及びＳｉｇｎａｌ Ｂｌａｓｔが、そのような分析に対して当技術分野では利用可能である。
【0021】
例えば、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＤｅｎｍａｒｋのＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＡｎａｌｙｓｉｓがホストとなるＳｉｇｎａｌＰサーバは、アミノ酸配列におけるシグナルペプチド切断部位の存在及び位置を予測する。方法は、幾つかの人工ニューラルネットワークの組合せに基づいて、切断部位の予測及びシグナルペプチド／非シグナルペプチドの予測を包含する。さらに、サーバはＮ領域、Ｈ領域及びＣ領域を予測する方法を提供する。
【0022】
例としてＣＤ３３＿ＩｇＫキメラシグナルペプチド、ＭＰＬＬＬＷＶＬＬＬＷＡＧＡＬＡ－ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ（配列番号１１）を使用して、ＳｉｇｎａｌＰ４．０はＣ、Ｓ、Ｙスコアを予測する。Ｃスコアは、シグナルペプチダーゼがＭＰＬＬＬＷＶＬＬＬＷＡＧＡＬＡ－ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ（配列番号１１）の配列においてアラニン（Ａ）の後かつグルタミン酸（Ｅ）の前を切断するはずであることを予測する。Ｓスコアは、配列がシグナルペプチドである可能性を示し、スコアが高いほどそれがシグナルペプチドである可能性が高いことを意味する。Ｙスコアは、Ｃ及びＢスコアの組合せに基づく。Ｙスコアは、ペプチダーゼがグルタミン酸残基の前を切断するはずであることをさらに確認する（図３Ａ参照）。
【0023】
同様のプログラム、ＳｉｇｎａｌＰ－ＨＭＭ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＭＢ６）、ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ、メンローパーク、カリフォルニア州、ｐｐ．１２２－１３０（１９９８）における隠れマルコフモデル、Ｈｅｎｒｉｋ Ｎｉｅｌｓｅｎ及びＡｎｄｅｒｓ Ｋｒｏｇｈに基づく）は、シグナルペプチダーゼ切断部位と同様にＮ領域、Ｈ領域及びＣ領域も予測する（図３Ｂ）。プログラムは、ＳｉｇｎａｌＰ４．０の予測と一致して、ペプチダーゼがグルタミン酸の前を切断することも予測する。
【0024】
他のプログラム、ＰｒｅｄｉＳｉ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｋａｒｓｔｅｎ Ｈｉｌｌｅｒ他、“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，”、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００４、Ｊｕｌｙ １、３２：：Ｗ３７５－Ｗ３７９、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ３７８）もまた、ペプチダーゼがアラニン（Ａ）とグルタミン酸（Ｅ）の間を切断することを予測する（図３Ｃ）。最後に、ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、他の既知のシグナルペプチド切断部位との相同性比較によって切断部位を予測することも可能である（図３Ｄ）。
【0025】
これらの方法のいずれかは、シグナルペプチド及びそれらの対応するＮ領域、Ｈ領域及びＣ領域を予測し得るように使用され得る。それらは、一般に、一致した結果を生成する。仮に、わずかな不一致があるとしても、Ｎ領域、Ｈ領域及びＣ領域の間の境界の正確な区分は、本発明の実施形態に対して重大ではない。上記のように、Ｈ領域はαヘリックスを形成しやすい疎水性のストレッチである。シグナル認識粒子（ＳＲＰ）のＭドメインは、そのＨ領域に対してポリ－ロイシン（ｐｏｌｙ－Ｌｅｕ）を有する合成ペプチドを含む、Ｈ領域における多くの配列多様性によってシグナルペプチドに結合することが知られている（Ｋｅｎｄａｌｌ他、“Ｉｄｅａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ，” Ｎａｔｕｒｅ、１９８６；３２１：７０６－７０８）。したがって、あるαヘリックスを他のものと交換しても、αヘリックスに対する厳密な境界には影響されないはずである。
【0026】
本発明の実施形態によれば、上述の予測方法又は他の同様の方法に基づいて、Ｈ領域の交換を設計してキメラシグナルペプチドを創出することができる。例えば、第１のシグナルペプチドのＨ領域を、第２のシグナルペプチドによるＨ領域と交換してもよい。有望な上述のシグナルペプチド、例えば、ＣＤ３３、ＩｇＫ、ＢＭ４０、ＡＺＵ及びＳＥＡＰシグナルペプチドに基づいて、種々のキメラシグナルペプチドを創出することができる。
【0027】
この説明では、以下の表記がキメラシグナルペプチドに採用され、Ｎ領域及びＣ領域を提供する第１のシグナルペプチドを最初に記載し、その後にＨ領域を提供する第２のシグナルペプチドの名称を続ける。例えば、ＢＭ４０＿ＣＤ３３（又はＢＭ－ＣＤ若しくはＢＭＣＤ）キメラシグナルペプチドは、ＢＭ４０によるＮ領域及びＣ領域並びにＣＤ３３によるＨ領域を含む。同様に、ＣＤ３３＿ＢＭ４０（又はＣＤ＿ＢＭ若しくはＣＤＢＭ）キメラシグナルペプチドは、ＣＤ３３によるＮ領域及びＣ領域並びにＢＭ４０によるＨ領域を含む。他の実施例は、ＣＤ３３＿ＩｇＫ（ＩｇＫリーダの疎水性領域を有するＣＤ３３）、ＩｇＫ＿ＣＤ３３（ＣＤ３３の疎水性領域を有するＩｇＫリーダ）、ＳＥＡＰ＿ＡＺＵ（ＡＺＵの疎水性領域を有するＳＥＡＰ）、ＡＺＵ＿ＳＥＡＰ（ＳＥＡＰの疎水性領域を有するＡＺＵ）を含む。これらのキメラシグナルペプチドの幾つかに対する核酸及びペプチドの配列を以下の表１に示す。
下線部は、キメラシグナルペプチドにおける疎水性領域を示す。
【表1】
【0028】
以下の章は、限定された数の特異的なキメラシグナルペプチドを実施例として使用して本発明の実施形態を説明する。しかし、当業者は、これらの限定された実施例が説明のみのためのものであり、本発明の範囲を限定することを意味しないことを理解するはずである。
【0029】
これらのキメラシグナルペプチドは、まずＳｉｇｎａｌＰサーバ（又は他の同様なサービス）を使用してインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で分析され、それらが依然としてシグナルペプチドとして機能することができ、それらが依然としてシグナルペプチダーゼ切断部位を有していることを確認することができる。以下の実施例は、シグナルペプチドとしてＢＭＣＤ及びＣＤＢＭキメラを使用して本発明の実施例を説明する。しかし、その説明は、本発明の他のキメラシグナルペプチドにも同様に適用可能である。
【0030】
図４に示すように、キメラシグナルペプチドであるＢＭＣＤ及びＣＤＢＭの双方は、明確に定義されたシグナルペプチダーゼ切断部位を有し、そのようなキメラシグナルペプチドは恐らくその機能を保存されるはずであることを示す。他の全てのキメラ、ＣＤＩｇＫ、ＩｇＫＣＤ、ＳＥＡＰＡＺＵ及びＡＺＵＳＥＡＰは、同様に保存されたシグナルペプチダーゼ切断部位を有することが見出されている。
【0031】
そして、これらのキメラシグナルペプチドを、シグナルペプチドとして作用するそれらの能力について試験し、タンパク質の発現／分泌を支援及び増強するそれらの能力について評価するように試験する。図５に示す例示の構築物を使用して試験を行う。
【0032】
図５に示すように、キメラシグナルペプチドは、抗体の重鎖（ＨＣ）に対する発現ベクター及び抗体の軽鎖（ＬＣ）に対する他の発現ベクターに、シグナルペプチド（ＳＰ）位置でクローニングされ得る。この実施例では、発現ベクターは、適切なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の制御下にあり、リボソーム進入のための内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む。ＨＣベクター及びＬＣベクターは、分析を容易にするように、それぞれ増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）及びイソギンチャク赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）でタグ付けされ得る。そして２種の発現ベクターを、タンパク質生成のための宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）にコトランスフェクションする。生成されるタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡのような任意の適した方法で分析され得る。
【0033】
標的タンパク質としてハーセプチンを使用して、図６は、種々のキメラシグナルペプチド（例えば、ＣＤ－ＩｇＫ、ＩｇＫ－ＣＤ、ＳＥＡＰ－ＡＺＵ、ＡＺＵ－ＳＥＡＰ、ＢＭ－ＣＤ及びＣＤ－ＢＭ）からの結果を示す。確かに、幾つかのキメラシグナルペプチドは、ＡＺＵ（陽性コントロール）の場合と同等又はより良好なレベルでのタンパク質発現をもたらすことができる。より良好なキメラシグナルペプチドの中で、ＢＭＣＤが最良の結果を示す。
【0034】
上記の結果は、ハーセプチンのＨＣ及びＬＣ鎖の生成に対する２種の個別のベクターのコトランスフェクションからのものである。代替の方法は、同一のベクターからＨＣ及びＬＣの双方を生成する発現ベクターを構築することである。１つのベクターによるベクター発現システムがより効果的であるか否かを試験するために、ＢＭＣＤを含むＨＣベクター及びＢＭＣＤを含むＬＣベクターを適切な発現ベクター（例えば、ｐＴＣＡＥ８．３に基づくＪ２．０－ＰＤＳＺ）にサブクローニングする。このベクターを使用するハーセプチンの発現を、ＣＨＯ細胞において試験する。図７に示すように、ＢＭＣＤキメラシグナルペプチドは、ＡＺＵ（陽性コントロール）よりも有意に良好である。ＢＭＣＤによる発現レベルは、ＡＺＵの場合の約１．５倍である。
【0035】
図７も、キメラシグナルペプチドの適切な配列が重要であることを示す。例えば、末尾の２残基（ＬＡ）が欠損したＢＭＣＤ欠失変異体（配列番号１２）は、恐らくこの欠損がシグナルペプチド切断を妨げるために、いくつかのシグナルペプチド機能を失っている。シグナルペプチドのＣ領域はより極性の高いカルボキシル末端を含むことが知られており、そこでは、（シグナルペプチダーゼ切断部位から数えて）－３及び－１位は、通常、アラニンのような小さい脂肪族残基を含み、芳香族又は荷電された残基であることはまれである。したがって、ＢＭＣＤのＣ末端からのロイシン－アラニンの欠損は、シグナルペプチダーゼ切断を損ね、それによりタンパク質分泌を妨げ得る。
【0036】
上記の結果は標的タンパク質／抗体としてハーセプチンを使用するが、他のタンパク質（例えば、アバスチン、デノスマブなど）も試験されており、同様の結果を有することが見出される。例えば、図８は、ＳＥＡＰ＿ＡＺＵキメラシグナルペプチドがデノスマブの生成を約４０％増加することを示す。
【0037】
キメラシグナルペプチド自体に加えて、これらのキメラシグナルペプチドの状況／環境もまた、タンパク質生成の効率に影響を有し得る。すなわち、異なるベクターは、これらのキメラシグナルペプチドの効率をさらに増強し得る。例えば、我々は、発現ベクターＪ２．０．２がＪ２．０ベクターと比較して約２倍のレベルのデノスマブを生成することを見出した。同様に、アバスチンも、Ｊ２．０．２ベクターを使用してより良好に生成する。一方、ハーセプチン及びＴｉｍ３抗体に対して、ベクターＪ２．０はより高い収率を得る。図９に示すように、Ｊ２．０．２ベクターは、ＨＣ及びＬＣ鎖に対して異なるプロモーターを有する。したがって、タンパク質生成を増強するキメラシグナルペプチドの能力は、より良好なベクターの選択によってさらに増加可能である。
【0038】
図１０Ａ～１０Ｃは、ＳＥＡＰ＿ＡＺＵキメラシグナルペプチドを使用してデノスマブを発現するようにＪ２．０．２ベクターを使用するという他の実施例を示す。図１０Ａは、細胞培養及びタンパク質発現の手法を示す。簡潔には、ＣＨＯ細胞（３×１０５細胞／ｍｌ）を、バッチ培養フラスコに播種する。５～６日間のバッチ培養の後、上清が回収され、ＥＬＩＳＡ又はＨＰＬＣを使用してタンパク質生成について分析され得る。図１０Ｂは、Ｊ２．０．２－ＰＤＳＢ－ＤｅｎｏＡＺＵｄ及びＪ２．０．２－ＰＤＳＢ－ＤｅｎｏＳＥＡＰＡＺＵに対するベクター構築物を示す。これらのベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子を欠失するＣＨＯ細胞からの細胞株のトランスフェクションを促進するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む。図１０Ｃは、双方のベクターについて５日及び６日目のデノスマブ生成を示す。生成レベルはこれらのベクター間で同様であり、ＳＥＡＰＡＺＵキメラシグナルペプチドが陽性コントロールＡＺＵと同等に効果的であることを示す。
【0039】
上記の実施例は種々の抗体の生成を示すが、本発明の実施形態は（目的とする融合タンパク質のような）他のタンパク質の生成に対しても使用され得る。図１１Ａは、融合タンパク質３Ｄ５Ｒの生成に対する発現ベクター構築物を示す。３つの構築物は、元来のシグナルペプチド（ＳＰ、ＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ、配列番号１０）、ＡＺＵｄ（配列番号９）及びＢＭＣＤ（配列番号５）をそれぞれ含む。図１１Ｂは、タンパク質発現の結果を示す。Ｃ領域から７個のアミノ酸残基を欠損したＡＺＵシグナルペプチドであり、ＡＺＵシグナルペプチドと同程度に良好であることが見出されたＡＺＵｄシグナルペプチドは、３Ｄ５Ｒ融合タンパク質の生成及び分泌において効率が良いことは明らかであり、生成レベルは元来のシグナルペプチドの場合の２．７倍である。同様に、キメラシグナルペプチドＢＭＣＤも、非常に効率が良く、元来のシグナルペプチドの１．９倍のレベルを生成する。
【0040】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、Ｊ２．０ベクター及びＢＭＣＤシグナルペプチドを使用する、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ３）の生成に対する他の実施例を示す。図１２Ａは、元来のシグナルペプチド（ｏｒｉ）又はＢＭＣＤシグナルペプチドのいずれかを含むベクター構築物を示す。図１２Ｂは、一過性のトランスフェクションの３日後又はトランスフェクションされた細胞のバッチ培養におけるフェーズＩ選択の６日後のＴＩＭ３の生成を示す。トランスフェクション－発現系の双方において、ＢＭＣＤは、元来のシグナルペプチドを使用するベクターと比較して、３倍及び２．６倍のタンパク質発現レベルを生成する。
【0041】
上記の実施例は、本発明のキメラシグナルペプチドが、抗体を含む組換えタンパク質の生成及び分泌を効率良く増強可能であることを示す。増強は、一過性のトランスフェクション、及びバッチ培養における安定したトランスフェクションされた細胞において見られた。
【0042】
本発明の実施形態は、当技術分野で知られている任意の適切な方法で実施され得る。以下の記述は、幾つかの実施例を提供する。当業者は、これらの実施例が例示のみを目的とするものであり、本発明の範囲から逸脱することなく他の変形例及び変更例が可能であることを理解するはずである。
【0043】
細胞培養及び培地
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＤＸＢ１１を、コロンビア大学のＬａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士より得た。（ＤＵＸ－Ｂ１１及びＤＵＫＸとしても知られる）ＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ ＤＸＢ１１細胞株は、歴史的に異種タンパク質の大規模生産に使用される最初のＣＨＯ細胞株であり、多くの複雑なタンパク質の生産に依然として使用される（Ｃ．Ｓ．Ｋａａｓ他、「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ＣＨＯ ＤＸＢ１１ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｈａｐｌｏｉｄｙ」 ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１６、Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｏ．１６０（２０１５））。細胞培養を、温度３７℃及び湿度９５％で、５％ＣＯ２下でインキュベーターにおいて行った。細胞培養の培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅ及び混合培地（５０％のＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ及び５０％のＡｃｔｉＣＨＯ）を含む。細胞のカウント及び生存率分析を、自動セルカウンターＴＣ１０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）を使用してトリパンブルーで染色した後に行った。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＤＸＢ１１を、コロンビア大学のＬａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士より得た。（ＤＵＸ－Ｂ１１及びＤＵＫＸとしても知られる）ＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ ＤＸＢ１１細胞株は、歴史的に異種タンパク質の大規模生産に使用される最初のＣＨＯ細胞株であり、多くの複雑なタンパク質の生産に依然として使用される（Ｃ．Ｓ．Ｋａａｓ他、「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ＣＨＯ ＤＸＢ１１ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｈａｐｌｏｉｄｙ」 ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１６、Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｏ．１６０（２０１５））。細胞培養を、温度３７℃及び湿度９５％で、５％ＣＯ２下でインキュベーターにおいて行った。細胞培養の培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅ及び混合培地（５０％のＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ及び５０％のＡｃｔｉＣＨＯ）を含む。細胞のカウント及び生存率分析を、自動セルカウンターＴＣ１０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）を使用してトリパンブルーで染色した後に行った。
【0044】
トランスフェクションの構築物は、ピューロマイシン耐性遺伝子を含む。安定したプールを、ピューロマイシン耐性に基づいて選択した。それが単一クローンになると、選択は必要ない。
【0045】
ベクター構築物
実施例では、シグナルペプチド配列を含む各ＨＣ又はＬＣペプチド断片は、ＰＣＲを使用して増幅され、そして高い効能のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＴａｋａｒａＢｉｏＵＳＡ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）などの当技術分野で知られている任意の技術を使用して発現ベクターに組み込まれ得る。本発明の発現ベクターを構築するために、選択されたシグナルペプチド配列を、発現させるタンパク質（例えば、標的抗体のＨＣ又はＬＣ鎖）を含む適切なベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐＴＣＡＥ型のベクター）にクローニングする。ベクターは、レポーター遺伝子（例えば、ＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ）を制御するＩＲＥＳ配列も含む。実施例としてＣＤ３３シグナルペプチドを使用して、ＣＭＶ－ＨＣＣＤ３３－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ及びＣＭＶ－ＬＣＣＤ３３－ＩＲＥＳ－ＤｓＲｅｄを得た。他のシグナルペプチドは、同様に構築され得る。例えば、以下のシグナルペプチド配列（表２）を、同様の態様で発現ベクターに構築した。
実施例では、シグナルペプチド配列を含む各ＨＣ又はＬＣペプチド断片は、ＰＣＲを使用して増幅され、そして高い効能のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＴａｋａｒａＢｉｏＵＳＡ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）などの当技術分野で知られている任意の技術を使用して発現ベクターに組み込まれ得る。本発明の発現ベクターを構築するために、選択されたシグナルペプチド配列を、発現させるタンパク質（例えば、標的抗体のＨＣ又はＬＣ鎖）を含む適切なベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐＴＣＡＥ型のベクター）にクローニングする。ベクターは、レポーター遺伝子（例えば、ＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ）を制御するＩＲＥＳ配列も含む。実施例としてＣＤ３３シグナルペプチドを使用して、ＣＭＶ－ＨＣＣＤ３３－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ及びＣＭＶ－ＬＣＣＤ３３－ＩＲＥＳ－ＤｓＲｅｄを得た。他のシグナルペプチドは、同様に構築され得る。例えば、以下のシグナルペプチド配列（表２）を、同様の態様で発現ベクターに構築した。
【表2-1】
【表2-2】
【0046】
これらのベクターの構築は、任意の従来のクローニング技術を使用し得る。ある特定の実施例では、オーバーラップＰＣＲ技術、例えば、ＰＣＲ増幅及び増幅されたオーバーラップ断片の結合が使用される。これらの技術は、日常的かつ従来のものである。
【0047】
ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
宿主細胞への構築物のトランスフェクションは、当技術分野で知られている任意の適切な方法及びセットアップを使用可能である。例えば、ＣＨＯＫ１細胞を、６－ウェルプレートにおいて培養した。各ウェルに、１×１０６個の細胞を８ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ社）を含む３ｍＬのＨｙｃｌｏｎｅ（商標）ＨｙＣｅｌｌ（商標）ＣＨＯ培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）において播種する。ハーセプチン構築物のＬＣ及びＨＣを含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）のトランスフェクションは、親油性薬剤のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ社）のような当技術分野で知られている任意の適切な試薬を使用して行われ得る。例えば、ハーセプチンＨＣＢＭ４０ＣＤ３３、ハーセプチンＬＣＢＭ４０ＣＤ３３及びトランスフェクション試薬Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｘｈｅｒ社）を、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｘｈｅｒ社）に個別に添加し、表３に示すようにベクター溶液を調製した。これらの溶液を、トランスフェクション試薬に添加する前に５分間静置し、十分に混合した。結果として得られる溶液を、細胞へのトランスフェクションの前に２０分間静置させた。そして、トランスフェクションの３日後に細胞を評価した。
宿主細胞への構築物のトランスフェクションは、当技術分野で知られている任意の適切な方法及びセットアップを使用可能である。例えば、ＣＨＯＫ１細胞を、６－ウェルプレートにおいて培養した。各ウェルに、１×１０６個の細胞を８ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ社）を含む３ｍＬのＨｙｃｌｏｎｅ（商標）ＨｙＣｅｌｌ（商標）ＣＨＯ培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）において播種する。ハーセプチン構築物のＬＣ及びＨＣを含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）のトランスフェクションは、親油性薬剤のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ社）のような当技術分野で知られている任意の適切な試薬を使用して行われ得る。例えば、ハーセプチンＨＣＢＭ４０ＣＤ３３、ハーセプチンＬＣＢＭ４０ＣＤ３３及びトランスフェクション試薬Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｘｈｅｒ社）を、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｘｈｅｒ社）に個別に添加し、表３に示すようにベクター溶液を調製した。これらの溶液を、トランスフェクション試薬に添加する前に５分間静置し、十分に混合した。結果として得られる溶液を、細胞へのトランスフェクションの前に２０分間静置させた。そして、トランスフェクションの３日後に細胞を評価した。
【表3】
【0048】
タンパク質発現
試験ＣＨＯ細胞におけるタンパク質／抗体生成に対して、抗体／タンパク質発現構築物は、商業的供給源によるものあってもよいし、当技術分野で知られている手順に基づいて調製され、抗体又はタンパク質の一過性の発現に対して試験ＣＨＯ細胞にトランスフェクションされてもよい。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、適切な期間（例えば３日間）培養し、標的タンパク質を生成した。代替的に、トランスフェクションは、従来の培養又はバッチ培養においてタンパク質を生成するのに使用可能な安定した細胞株を生成してもよい。安定したトランスフェクタント細胞株の選択を容易にする当技術分野で知られている任意の方法が、使用され得る。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を含むベクター及びＤＨＦＲ遺伝子を欠失したＣＨＯ細胞を使用してもよい。トランスフェクションされたベクターを含むＣＨＯ細胞のみが、制限培地において生存するはずである。
試験ＣＨＯ細胞におけるタンパク質／抗体生成に対して、抗体／タンパク質発現構築物は、商業的供給源によるものあってもよいし、当技術分野で知られている手順に基づいて調製され、抗体又はタンパク質の一過性の発現に対して試験ＣＨＯ細胞にトランスフェクションされてもよい。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、適切な期間（例えば３日間）培養し、標的タンパク質を生成した。代替的に、トランスフェクションは、従来の培養又はバッチ培養においてタンパク質を生成するのに使用可能な安定した細胞株を生成してもよい。安定したトランスフェクタント細胞株の選択を容易にする当技術分野で知られている任意の方法が、使用され得る。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を含むベクター及びＤＨＦＲ遺伝子を欠失したＣＨＯ細胞を使用してもよい。トランスフェクションされたベクターを含むＣＨＯ細胞のみが、制限培地において生存するはずである。
【0049】
タンパク質発現レベルは、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ又は他の方法などの任意の適切な方法を使用して評価され得る。発現タンパク質が酵素的な活性を有する場合（例えば、ＳＥＡＰ）、活性を使用してタンパク質発現レベルを評価することもできる。例えば、ＳＥＡＰに対しては、ＧｒｅａｔＥｓｃＡＰｅ（商標）化学発光キットをＣｌｏｎｔｅｃｈ社から得てもよい。５×希釈バッファーをｄｄＨ２Ｏで１：５に希釈して１×希釈バッファーを調製する。タンパク質発現レベルを評価するために、トランスフェクションされた細胞又はモックトランスフェクションされた細胞からの２５μｌの細胞培養培地を、９６－ウェルマイクロタイタープレートに移す。必要に応じて、プレートを、封止して後の分析のために－２０℃で凍結することができる。９６－ウェルマイクロタイタープレート中の各サンプルに、７５μｌの１×希釈バッファーを添加する。接着性のアルミホイル又は通常の９６－ウェルの蓋でプレートを封止し、ヒートブロック又はウォーターバスを使用して、希釈したサンプルを６５℃で３０分間インキュベートする。
【0050】
サンプルを氷上で２～３分間冷却し、そして室温に平衡化する。各サンプルに１００μｌのＳＥＡＰ基質溶液を添加する。読取りの前に、室温で３０分間インキュベートする。９６－ウェルプレートリーダールミノメーター（例えば、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標））を使用し、化学発光信号を検出及び記録する。培養上清中の抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定した。細胞特異的生産性（Ｑｐ）を、力価を１日の生細胞密度の曲線下の積分面積で除算することによって計算した。
【0051】
限定された数の実施形態に関して本発明の実施形態を説明したが、本開示の利益を有する当業者は、ここに開示されるように本発明の範囲から逸脱しない他の実施形態が考案可能であることを理解するはずである。したがって、本発明の範囲は、添付される特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【配列表】