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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023139162
(43)【公開日】2023-10-03
(54)【発明の名称】メチローム解析を用いる癌の検出及び分類
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6886 20180101AFI20230926BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230926BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20230926BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230926BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6886 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/68 100Z
C12N15/11 Z
【審査請求】有
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023119203
(22)【出願日】2023-07-21
(62)【分割の表示】P 2020501564の分割
【原出願日】2018-07-11
(31)【優先権主張番号】62/531,527
(32)【優先日】2017-07-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】507148294
【氏名又は名称】ユニバーシティー ヘルス ネットワーク
(71)【出願人】
【識別番号】517304738
【氏名又は名称】シナイ ヘルス システム
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】デ カルヴァルホ ダニエル ディニズ
(72)【発明者】
【氏名】ブラットマン スコット ビクター
(72)【発明者】
【氏名】シンガニア ラジャット
(72)【発明者】
【氏名】チャクラヴァルシー アンクール ラヴィナラヤナ
(72)【発明者】
【氏名】シェン シュー イー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】対象が癌を有するか又は癌を有するリスクがあることを判定する方法を提供する。
【解決手段】（ａ）対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程であって、前記配列決定が亜硫酸水素塩変換を伴わない工程と、（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９４％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記癌を有するか又は前記癌を有するリスクがあることを判定する工程とを備える方法である。前記癌が、肺癌、乳癌、結直腸癌、急性骨髄性白血病、及び多形神経膠芽腫からなる群から選択される。
【選択図】図１（１）
【解決手段】（ａ）対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程であって、前記配列決定が亜硫酸水素塩変換を伴わない工程と、（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９４％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記癌を有するか又は前記癌を有するリスクがあることを判定する工程とを備える方法である。前記癌が、肺癌、乳癌、結直腸癌、急性骨髄性白血病、及び多形神経膠芽腫からなる群から選択される。
【選択図】図１（１）
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、
（ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、引き続く前記セルフリーのメチル化ＤＮＡ
の配列決定を可能にする工程と、
（ｃ）第１量のフィラーＤＮＡを前記試料に加え、次いで任意選択的に前記試料を変性
する工程であって、前記フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と
、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化
ＤＮＡを捕捉する工程と、
（ｅ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体
由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
（ｇ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセ
ルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来
のＤＮＡの存在を特定する工程と
を備える方法。
（ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、引き続く前記セルフリーのメチル化ＤＮＡ
の配列決定を可能にする工程と、
（ｃ）第１量のフィラーＤＮＡを前記試料に加え、次いで任意選択的に前記試料を変性
する工程であって、前記フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と
、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化
ＤＮＡを捕捉する工程と、
（ｅ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体
由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
（ｇ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセ
ルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来
のＤＮＡの存在を特定する工程と
を備える方法。
【請求項2】
前記試料が、前記対象の血液又は血漿に由来する請求項１に記載の方法。
【請求項3】
比較工程（ｆ）が、統計的分類器を使用するフィットに基づく請求項１又は請求項２に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項4】
前記分類器が機械学習由来である請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記分類器が、エラスティックネット分類器、ｌａｓｓｏ、サポートベクターマシン、
ランダムフォレスト、又はニューラルネットワークである請求項４に記載の方法。
ランダムフォレスト、又はニューラルネットワークである請求項４に記載の方法。
【請求項6】
健康な個体及び癌性個体由来の前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、健康な
個体と癌性個体との間の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる請求項１
から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
個体と癌性個体との間の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる請求項１
から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
健康な個体及び癌性個体由来の前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、セルフ
リーＤＮＡ由来のＤＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されて
いる対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列に限定される請求項１から請求項６のいずれ
か一項に記載の方法。
リーＤＮＡ由来のＤＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されて
いる対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列に限定される請求項１から請求項６のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項8】
前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、血漿由来のＤＮＡにおいて健康な個体
と癌性個体との間で差次的にメチル化されている請求項７に記載の方法。
と癌性個体との間で差次的にメチル化されている請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記試料が、１００ｎｇ未満、７５ｎｇ未満、又は５０ｎｇ未満のセルフリーＤＮＡを
有する請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
有する請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記第１量のフィラーＤＮＡが、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、
５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含
み、残部が非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％
、又は１５％～３０％がメチル化フィラーＤＮＡである請求項１から請求項９のいずれか
一項に記載の方法。
５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含
み、残部が非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％
、又は１５％～３０％がメチル化フィラーＤＮＡである請求項１から請求項９のいずれか
一項に記載の方法。
【請求項11】
前記第１量のフィラーＤＮＡが２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１００ｎ
ｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである請求項１から請求項９のいずれか一項に
記載の方法。
ｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである請求項１から請求項９のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項12】
前記試料由来のセルフリーＤＮＡ及び前記第１量のフィラーＤＮＡが、合わせて少なく
とも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む請求項１か
ら請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
とも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む請求項１か
ら請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記フィラーＤＮＡが５０ｂｐ～８００ｂｐ長、好ましくは１００ｂｐ～６００ｂｐ長
、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐ長である請求項１から請求項１２のいずれか一
項に記載の方法。
、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐ長である請求項１から請求項１２のいずれか一
項に記載の方法。
【請求項14】
前記フィラーＤＮＡが二本鎖である請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の方
法。
法。
【請求項15】
前記フィラーＤＮＡがジャンクＤＮＡである請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項16】
前記フィラーＤＮＡが内在ＤＮＡ又は外来ＤＮＡである請求項１から請求項３のいずれ
か一項に記載の方法。
か一項に記載の方法。
【請求項17】
前記フィラーＤＮＡが非ヒトＤＮＡ、好ましくはλＤＮＡである請求項１６に記載の方
法。
法。
【請求項18】
前記フィラーＤＮＡがヒトＤＮＡに対するアラインメントを有しない請求項１から請求
項１７のいずれか一項に記載の方法。
項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記結合剤が、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である請求項１から請求項
１８のいずれか一項に記載の方法。
１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である請求項１から請求項１９のいずれか一項に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項21】
工程（ｄ）が、抗体を使用して前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを免疫沈降させること
を含む請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
を含む請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
免疫沈降のために少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１６μｇの前記
抗体を前記試料に加えることを含む請求項２１に記載の方法。
抗体を前記試料に加えることを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記免疫沈降反応を確認するために、工程（ｃ）後に第２量の対照ＤＮＡを前記試料に
加える工程をさらに備える請求項２１に記載の方法。
加える工程をさらに備える請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
セルフリーのメチル化ＤＮＡの捕捉を確認するために、工程（ｃ）後に第２量の対照Ｄ
ＮＡを前記試料に加える工程をさらに備える請求項１から請求項２３のいずれか一項に記
載の方法。
ＮＡを前記試料に加える工程をさらに備える請求項１から請求項２３のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項26】
癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程が、原発癌細胞組織を特定することをさらに
備える請求項１から請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
備える請求項１から請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記原発癌細胞組織を特定することが、癌亜型を特定することをさらに備える請求項２
６に記載の方法。
６に記載の方法。
【請求項28】
前記癌亜型が、ステージ、組織学、遺伝子発現パターン、コピー数異常、再構成、又は
点変異状態に基づいて前記癌を識別する請求項２７に記載の方法。
点変異状態に基づいて前記癌を識別する請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
工程（ｆ）の比較が全ゲノムにわたって実施される請求項１から請求項２８のいずれか
一項に記載の方法。
一項に記載の方法。
【請求項30】
工程（ｆ）の比較が全ゲノムから特定の調節領域に限定される請求項１から請求項２８
のいずれか一項に記載の方法。
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記調節領域が、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、Ｃ
ｐＧシェルフ、又はこれらのいずれかの組み合わせである請求項３０に記載の方法。
ｐＧシェルフ、又はこれらのいずれかの組み合わせである請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
工程（ｆ）及び工程（ｇ）がコンピュータプロセッサにより実施される請求項１から請
求項３１のいずれか一項に記載の方法。
求項３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定する方法であって、
ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と
、
ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来
の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセ
ルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来
のＤＮＡの存在を特定する工程と、
ｄ． 工程ｃ．からの癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて
、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程と
を備える方法。
ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と
、
ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来
の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセ
ルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来
のＤＮＡの存在を特定する工程と、
ｄ． 工程ｃ．からの癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて
、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程と
を備える方法。
【請求項34】
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定するコンピュータ実装方法であって
、
ａ． 少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの
配列決定データを受け取る工程と、
ｂ． 前記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの
配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較す
る工程と、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセ
ルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、前記少なく
とも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、工程ｃ．からの癌細胞由
来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさ
らに特定する工程と
を備える方法。
、
ａ． 少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの
配列決定データを受け取る工程と、
ｂ． 前記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの
配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較す
る工程と、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセ
ルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、前記少なく
とも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、工程ｃ．からの癌細胞由
来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさ
らに特定する工程と
を備える方法。
【請求項35】
プロセッサ及び前記プロセッサに接続されたメモリを有する汎用性コンピュータと組み
合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータメカニズム
がエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、前記コンピュータプログラムメカ
ニズムが前記コンピュータの前記メモリにローディングされ、前記コンピュータに請求項
３４に記載の方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品。
合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータメカニズム
がエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、前記コンピュータプログラムメカ
ニズムが前記コンピュータの前記メモリにローディングされ、前記コンピュータに請求項
３４に記載の方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品。
【請求項36】
請求項３５に記載のコンピュータプログラム製品を保存するためのデータ構造が保存さ
れたコンピュータ可読媒体。
れたコンピュータ可読媒体。
【請求項37】
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して癌亜型を特定するためのデバイスであって、
少なくとも１つのプロセッサと、
前記少なくとも１つのプロセッサと通信している電子メモリと
を備え
前記電子メモリは、前記少なくとも１つのプロセッサで実行される場合に、前記少なく
とも１つのプロセッサに、
ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取ることと
、
ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来
の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較することと、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセ
ルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来
のＤＮＡの存在を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、工程ｂの比較に基づ
いて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することと
を実行させるプロセッサ実行可能なコードを保存するデバイス。
少なくとも１つのプロセッサと、
前記少なくとも１つのプロセッサと通信している電子メモリと
を備え
前記電子メモリは、前記少なくとも１つのプロセッサで実行される場合に、前記少なく
とも１つのプロセッサに、
ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取ることと
、
ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来
の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較することと、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセ
ルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来
のＤＮＡの存在を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、工程ｂの比較に基づ
いて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することと
を実行させるプロセッサ実行可能なコードを保存するデバイス。
【請求項38】
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して、２以上の可能性のある器官から前記癌細胞が発
生した前記癌の場所を決定する方法であって、
（ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
（ｂ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、前記試料由来のセルフ
リーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、
（ｃ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列パターンを対照個体の２以上
の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、前記２以上の母集団の各々は、
異なる器官に限局性癌を有する工程と、
（ｅ）前記セルフリーＤＮＡのメチル化のパターンと前記２以上の母集団のうちの１つ
のメチル化のパターンとの間の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で前記癌細胞
が発生したかを決定する工程と
を備える方法。
生した前記癌の場所を決定する方法であって、
（ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
（ｂ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、前記試料由来のセルフ
リーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、
（ｃ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列パターンを対照個体の２以上
の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、前記２以上の母集団の各々は、
異なる器官に限局性癌を有する工程と、
（ｅ）前記セルフリーＤＮＡのメチル化のパターンと前記２以上の母集団のうちの１つ
のメチル化のパターンとの間の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で前記癌細胞
が発生したかを決定する工程と
を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０１７年７月１２日出願の米国仮特許出願第６２／５３１５２７号に基づく
優先権を主張する。この米国仮特許出願は、参照により本願明細書に援用される。
本願は、２０１７年７月１２日出願の米国仮特許出願第６２／５３１５２７号に基づく
優先権を主張する。この米国仮特許出願は、参照により本願明細書に援用される。
【0002】
技術分野
本発明は、癌の検出及び分類、より具体的には癌の検出及び分類のためのメチローム解
析の使用に関する。
本発明は、癌の検出及び分類、より具体的には癌の検出及び分類のためのメチローム解
析の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
バイオマーカーのソースとしての循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の使用は、腫瘍
学において急速に勢いを持ってきている［１］。バイオマーカーとしてのｃｆＤＮＡのＤ
ＮＡメチル化マッピングの使用は、液体細胞診の分野で大きなインパクトを有することが
できよう。というのも、ｃｆＤＮＡのＤＮＡメチル化マッピングの使用により、低侵襲的
に、原発組織の特定を可能にし［２］、癌の型及び亜型の分類を可能にし、そして癌患者
を階層化することができると思われるからである［３］。さらには、ｃｆＤＮＡの全ゲノ
ムＤＮＡメチル化マッピングを使用することで、疾患の証拠となるＸ線像がないステージ
Ｉ～ＩＩＩの癌を有する患者において循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出する際の重大
な感度の問題を克服することができよう。既存のｃｔＤＮＡ検出方法は、変異を配列決定
することに基づいており、腫瘍と健常な循環ｃｆＤＮＡとの間を見分けるために利用可能
な反復突然変異の数が限られていることに一部は起因して、感度に限界がある［４、５］
。他方、全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を健常な
循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）から見分けるために使用されてもよい多くのエピジ
ェネティックな変異を活用する。例えば、上衣腫等のいくつかの腫瘍型は、何ら顕著な再
発性体細胞変異もなく広範なＤＮＡメチル化異常を有することができる［６］。
学において急速に勢いを持ってきている［１］。バイオマーカーとしてのｃｆＤＮＡのＤ
ＮＡメチル化マッピングの使用は、液体細胞診の分野で大きなインパクトを有することが
できよう。というのも、ｃｆＤＮＡのＤＮＡメチル化マッピングの使用により、低侵襲的
に、原発組織の特定を可能にし［２］、癌の型及び亜型の分類を可能にし、そして癌患者
を階層化することができると思われるからである［３］。さらには、ｃｆＤＮＡの全ゲノ
ムＤＮＡメチル化マッピングを使用することで、疾患の証拠となるＸ線像がないステージ
Ｉ～ＩＩＩの癌を有する患者において循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出する際の重大
な感度の問題を克服することができよう。既存のｃｔＤＮＡ検出方法は、変異を配列決定
することに基づいており、腫瘍と健常な循環ｃｆＤＮＡとの間を見分けるために利用可能
な反復突然変異の数が限られていることに一部は起因して、感度に限界がある［４、５］
。他方、全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を健常な
循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）から見分けるために使用されてもよい多くのエピジ
ェネティックな変異を活用する。例えば、上衣腫等のいくつかの腫瘍型は、何ら顕著な再
発性体細胞変異もなく広範なＤＮＡメチル化異常を有することができる［６］。
【0004】
セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する特定の方法が国際公開第２０１７／１９０２１
５号パンフレットに記載されており、この特許文献は、参照により援用される。
５号パンフレットに記載されており、この特許文献は、参照により援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１７／１９０２１５号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、対象由
来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、上記試料をライブラリ調製に供して、引
き続く上記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、第１量のフィラ
ーＤＮＡを上記試料に加え、次いで任意選択的に上記試料を変性する工程であって、上記
フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、メチル化ポリヌクレオ
チドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉
された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル
化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の
配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性が
ある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程とを備える方法が提供される。
来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、上記試料をライブラリ調製に供して、引
き続く上記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、第１量のフィラ
ーＤＮＡを上記試料に加え、次いで任意選択的に上記試料を変性する工程であって、上記
フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、メチル化ポリヌクレオ
チドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉
された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル
化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の
配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性が
ある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程とを備える方法が提供される。
【0007】
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定する方法であって、対
象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、捕捉され
たセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡ
の１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意
な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、癌細胞由来のＤＮ
Ａが特定される場合に、上記比較に基づいて原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する
工程とを備える方法が提供される。
象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、捕捉され
たセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡ
の１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意
な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、癌細胞由来のＤＮ
Ａが特定される場合に、上記比較に基づいて原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する
工程とを備える方法が提供される。
【0008】
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定するコンピュータ実装
方法であって、少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化Ｄ
ＮＡの配列決定データを受け取る工程と、上記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉され
たセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡ
の１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意
な類似性がある場合に、上記少なくとも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在
を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、上記比較に基づいて原発癌細胞組織
及び癌亜型をさらに特定する工程とを備える方法が提供される。
方法であって、少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化Ｄ
ＮＡの配列決定データを受け取る工程と、上記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉され
たセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡ
の１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意
な類似性がある場合に、上記少なくとも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在
を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、上記比較に基づいて原発癌細胞組織
及び癌亜型をさらに特定する工程とを備える方法が提供される。
【0009】
一態様では、プロセッサ及びこのプロセッサに接続されたメモリを有する汎用性コンピ
ュータと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュー
タメカニズムがエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、上記コンピュータプ
ログラムメカニズムが上記コンピュータの上記メモリにローディングされ、上記コンピュ
ータに本願明細書に記載される方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品が提
供される。
ュータと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュー
タメカニズムがエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、上記コンピュータプ
ログラムメカニズムが上記コンピュータの上記メモリにローディングされ、上記コンピュ
ータに本願明細書に記載される方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品が提
供される。
【0010】
一態様では、本願明細書に記載されるコンピュータプログラム製品を保存するためのデ
ータ構造が保存されたコンピュータ可読媒体が提供される。
ータ構造が保存されたコンピュータ可読媒体が提供される。
【0011】
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して癌亜型を特定するためのデバイスで
あって、少なくとも１つのプロセッサと、上記少なくとも１つのプロセッサと通信してい
る電子メモリとを備え、上記電子メモリは、上記少なくとも１つのプロセッサで実行され
る場合に、上記少なくとも１つのプロセッサに、対象試料由来のセルフリーのメチル化Ｄ
ＮＡの配列決定データを受け取ることと、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列
を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較するこ
とと、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセル
フリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来の
ＤＮＡの存在を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、上記比較に基づいて、原
発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することとを実行させるプロセッサ実行可能なコー
ドを保存するデバイスが提供される。
あって、少なくとも１つのプロセッサと、上記少なくとも１つのプロセッサと通信してい
る電子メモリとを備え、上記電子メモリは、上記少なくとも１つのプロセッサで実行され
る場合に、上記少なくとも１つのプロセッサに、対象試料由来のセルフリーのメチル化Ｄ
ＮＡの配列決定データを受け取ることと、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列
を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較するこ
とと、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセル
フリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来の
ＤＮＡの存在を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、上記比較に基づいて、原
発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することとを実行させるプロセッサ実行可能なコー
ドを保存するデバイスが提供される。
【0012】
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して、２以上の可能性のある器官から上
記癌細胞が発生した上記癌の場所を決定する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡ
の試料を準備する工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、上記
試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーの
メチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配
列パターンを対照個体の２以上の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、
上記２以上の母集団の各々は、異なる器官に限局性癌を有する工程と、上記セルフリーＤ
ＮＡのメチル化のパターンと上記２以上の母集団のうちの１つのメチル化のパターンとの
間の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で上記癌細胞が発生したかを決定する工
程とを備える方法が提供される。
記癌細胞が発生した上記癌の場所を決定する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡ
の試料を準備する工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、上記
試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーの
メチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配
列パターンを対照個体の２以上の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、
上記２以上の母集団の各々は、異なる器官に限局性癌を有する工程と、上記セルフリーＤ
ＮＡのメチル化のパターンと上記２以上の母集団のうちの１つのメチル化のパターンとの
間の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で上記癌細胞が発生したかを決定する工
程とを備える方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
本発明の好ましい実施形態のこれらの特徴及び他の特徴は、添付の図面が参照される以
下の詳細な説明においてより明らかとなるであろう。
下の詳細な説明においてより明らかとなるであろう。
【0014】
【図1(1)】図１は、ｃｆＤＮＡのメチローム解析が少ない量のインプットＤＮＡの中のｃｔＤＮＡを濃縮し検出するための高感度の手法であることを示す。Ａ）ｃｔＤＮＡの濃度（列）、調べられたＤＭＲ数（行）、及びシークエンシング深度（ｘ軸）の関数としての少なくとも１つのエピ変異を検出する確率のコンピュータシミュレーション。Ｂ）血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化されたＨＣＴ１１６細胞系由来の１～１００ｎｇのインプットＤＮＡに対するＤＮＡメチル化シグナル間の全ゲノムピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関。各濃度は、２つの生物的複製物を有する。
【図1(2)】図１は、ｃｆＤＮＡのメチローム解析が少ない量のインプットＤＮＡの中のｃｔＤＮＡを濃縮し検出するための高感度の手法であることを示す。Ｃ）ＨＣＴ１１６由来の異なる濃度のインプットＤＮＡからのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑから得られるＤＮＡメチル化プロファイル（緑色のトラック）、並びにＥＮＣＯＤＥ（ＥＮＣＳＲ０００ＤＦＳ）から得られるＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ＨＣＴ１１６データ及びＧＥＯ（ＧＳＭ１４６５０２４）から得られるＷＧＢＳ（Ｗｈｏｌｅ－Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ＨＣＴ１１６データ。ヒートマップ（ＲＲＢＳトラック）について、黄色はメチル化を意味し、青色は非メチル化を意味し、灰色はカバレッジなしを意味する。
【図1(3)】図１は、ｃｆＤＮＡのメチローム解析が少ない量のインプットＤＮＡの中のｃｔＤＮＡを濃縮し検出するための高感度の手法であることを示す。Ｄ～Ｅ）多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系ＭＭ１．Ｓ中へのＣＲＣ細胞系ＨＣＴ１１６の段階希釈。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑが純粋ＨＣＴ１１６ ＤＮＡ（１００％ＣＲＣ）、純粋ＭＭ１．Ｓ ＤＮＡ（１００％ＭＭ）並びにＭＭ ＤＮＡ中に希釈された１０％、１％、０．１％、０．０１％、及び０．００１％ＣＲＣ ＤＮＡにおいて実施された。すべてのＤＮＡが血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化された。本発明者らは、実測と予測の（Ｄ）ＤＭＲ数及び（Ｅ）これらのＤＭＲ内のＤＮＡメチル化シグナル（ＲＰＫＭ単位）にほぼ完全な線形相関（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）を認めた。
【図1(4)】図１は、ｃｆＤＮＡのメチローム解析が少ない量のインプットＤＮＡの中のｃｔＤＮＡを濃縮し検出するための高感度の手法であることを示す。Ｆ）同じ希釈系列において、既知の体細胞変異は、バックグラウンドシークエンサー及びポリメラーゼエラー率を超える超深度（＞１０，０００×）標的配列決定によって１／１００対立遺伝子割合においてのみ検出可能である。ＣＲＣ細胞系における各変異の部位に各塩基又は挿入／欠失を含むリードの割合が示されている。Ｇ）２人の結直腸癌患者からの患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）を有するマウスの血漿中の総ｃｆＤＮＡ（ヒト＋マウス）に対する百分率としてのｃｔＤＮＡ（ヒト）の頻度。
【図2B】図２は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍の分類を可能にすることを示す。Ｂ）多クラスエラスティックネット機械学習分類器内に含まれるＤＭＲのヒートマップ。これらの分類器は、健康な提供者由来の血漿ＤＮＡ試料（ｎ＝２４）、肺癌（ｎ＝２５）、乳癌（ｎ＝２５）、結直腸癌（ｎ＝２３）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（ｎ＝２８）、及び多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）（ｎ＝７１）由来の血漿ＤＮＡ試料で訓練された。階層的クラスタ分析方法：Ｗａｒｄ。
【図2C】図２は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍の分類を可能にすることを示す。Ｃ）モデルの１０％又は２５％において特定された癌種関連ＤＭＲのｔＳＮＥ（ｔ－Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ：ｔ分布型確率的近傍埋め込み）による２Ｄ視覚化。
【図2D】図２は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍の分類を可能にすることを示す。Ｄ）血漿ｃｆＤＮＡメチル化ベースの多癌分類器についての性能測定基準。受信者オペレータ曲線下部面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｕｒｖｅ：ａｕＲＯＣ）が、エラスティックネット機械学習分類器の５０分割生成の後の各癌種及び健康な提供者についてｙ軸に示されている。
【図3A】図３は、独立のコホートにおける多癌分類器の検証を示す。Ａ）肺癌（ＬＵＣ）（ｎ＝５５ＬＵＣ対ｎ＝９７その他）、ＡＭＬ（ｎ＝３５ＡＭＬ対ｎ＝１１７その他）、及び健康な提供者（ｎ＝６２健康な提供者対ｎ＝９０その他）のコホートでの多癌分類器の独立の検証についてＲＯＣ曲線が示されている。
【図3B】図３は、独立のコホートにおける多癌分類器の検証を示す。Ｂ）早期ＬＵＣ（ｎ＝３２ステージＩ～ＩＩのＬＵＣ対ｎ＝９７その他）及び末期ＬＵＣ（ｎ＝２３ステージＩＩＩ～ＩＶ ＬＵＣ対ｎ＝９７その他）での多癌分類器の独立の検証についてのＲＯＣ曲線が示されている。
【図4A】図４は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍亜型の分類を可能にすることを示す。Ａ）癌亜型関連ＤＭＲのｔＳＮＥ（ｔ分布型確率的近傍埋め込み）による２Ｄ視覚化。乳癌亜型は、別個の遺伝子発現パターン及び転写因子活性（ＥＲ状態）並びに別個の腫瘍コピー数異常（ＨＥＲ２状態）を有する腫瘍を有する患者を見分ける能力を示す。ＡＭＬ亜型は、別個の再構成（ＦＬＴ３状態）を有する腫瘍を有する患者を見分ける能力を示す。多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）亜型は、別個の点変異（ＩＤＨ遺伝子変異状態）を有する腫瘍を有する患者を見分ける能力を示す。肺癌亜型は、予後的及び治療上の影響を有する別個の組織学（腺癌対扁平上皮癌対小細胞癌）を有する腫瘍を有する患者を見分ける能力を示す。
【図4D】図４は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍亜型の分類を可能にすることを示す。Ｄ）多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）患者血漿試料においてＩＤＨ遺伝子変異状態の正確な区別を可能にする上位ＤＭＲを示すヒートマップ。
【図5】図５は、本願明細書に記載される１以上の実施形態を実行するためのプラットフォームを提供するように好適に構成されたコンピュータデバイス、並びに関連する通信ネットワーク、デバイス、ソフトウェア及びファームウェアを示す。
【図6(1)】図６は、配列決定飽和分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）及び品質管理を示す。Ａ）この図は、血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化されたＨＣＴ１１６ ＤＮＡからの各インプット濃度に対する各複製物からのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑデータを分析するＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＭＥＤＩＰＳの飽和分析の結果を示す。
【図6(6)】図６は、配列決定飽和分析及び品質管理を示す。Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞系の４つの開始ＤＮＡ濃度（１００ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、及び１ｎｇ）の２つの複製物においてプロトコルが試験された。反応特異度は、メチル化及び非メチル化添加シロイヌナズナＤＮＡを使用して計算された。濃縮倍率比は、断片化ＨＣＴ１１６ ＤＮＡのゲノム領域（メチル化精巣特異的Ｈ２Ｂ、ＴＳＨ２Ｂ０及び非メチル化ヒトＤＮＡ領域（ＧＡＰＤＨプロモーター）のプライマー）を用いて計算された。水平の点線は２５の濃縮倍率比閾値を示す。エラーバーは、±１ｓ．ｅ．ｍを表す。Ｃ）配列決定試料のＣｐＧ濃縮スコアは、インプット対照と比べて免疫沈降試料からのゲノム領域内のＣｐＧの堅牢な濃縮を示す。ＣｐＧ濃縮スコアは、上記領域のＣｐＧの相対頻度をヒトゲノムのＣｐＧの相対頻度で除算することにより得られた。エラーバーは、±１ｓ．ｅ．ｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下の説明では、本発明の十分な理解を提供するために、多くの特定の細部が提示され
る。しかしながら、本発明はこれらの特定の細部なしで実施されてもよいということは理
解される。
る。しかしながら、本発明はこれらの特定の細部なしで実施されてもよいということは理
解される。
【0016】
ＤＮＡメチル化プロファイルは、細胞型特異的であり、癌では乱れている。最少量の循
環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のメチローム解析のために設計された堅牢で高感度の
方法を使用して、本発明者らは、複数の腫瘍型を互いから、及び健康な個体から見分ける
数千の可変メチル化領域（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｒｅ
ｇｉｏｎｓ：ＤＭＲ）を特定した。ｃｆＤＮＡのメチローム解析は、高感度であり、早期
患者において循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出することに好適である。ｃｆＤＮＡメ
チロームを使用する機械学習由来の分類器は、交差検証に基づいて、５つの癌種を有する
患者及び健康な提供者由来の１９６個の血漿試料を正しく分類することができた。独立の
検証では、血漿ｃｆＤＮＡ中で特定された同じＤＭＲを使用して、上記分類器は、ＡＭＬ
、肺癌、及び健康な提供者、並びに早期及び末期の肺癌の両方を正しく分類することがで
きた。それゆえ、ｃｆＤＮＡのメチローム解析は、ｃｔＤＮＡの非侵襲性の早期検出のた
めに使用することができ、癌種を堅牢に分類することができる。
環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のメチローム解析のために設計された堅牢で高感度の
方法を使用して、本発明者らは、複数の腫瘍型を互いから、及び健康な個体から見分ける
数千の可変メチル化領域（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｒｅ
ｇｉｏｎｓ：ＤＭＲ）を特定した。ｃｆＤＮＡのメチローム解析は、高感度であり、早期
患者において循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出することに好適である。ｃｆＤＮＡメ
チロームを使用する機械学習由来の分類器は、交差検証に基づいて、５つの癌種を有する
患者及び健康な提供者由来の１９６個の血漿試料を正しく分類することができた。独立の
検証では、血漿ｃｆＤＮＡ中で特定された同じＤＭＲを使用して、上記分類器は、ＡＭＬ
、肺癌、及び健康な提供者、並びに早期及び末期の肺癌の両方を正しく分類することがで
きた。それゆえ、ｃｆＤＮＡのメチローム解析は、ｃｔＤＮＡの非侵襲性の早期検出のた
めに使用することができ、癌種を堅牢に分類することができる。
【0017】
一態様では、対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、対象由
来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、上記試料をライブラリ調製に供して、引
き続く上記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、第１量のフィラ
ーＤＮＡを上記試料に加え、次いで任意選択的に上記試料を変性する工程であって、上記
フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、メチル化ポリヌクレオ
チドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉
された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル
化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の
配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性が
ある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程とを備える方法が提供される。
来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、上記試料をライブラリ調製に供して、引
き続く上記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、第１量のフィラ
ーＤＮＡを上記試料に加え、次いで任意選択的に上記試料を変性する工程であって、上記
フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、メチル化ポリヌクレオ
チドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉
された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル
化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の
配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性が
ある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程とを備える方法が提供される。
【0018】
出願人の共有に係る出願である、２０１６年５月３日出願の米国仮特許出願第６２／３
３１，０７０号及び２０１７年５月３日出願の国際特許、出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１７／
０００１０８号は、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉するための方法を記載しており、
これらは、参照により本願明細書に援用したものとする。
３１，０７０号及び２０１７年５月３日出願の国際特許、出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１７／
０００１０８号は、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉するための方法を記載しており、
これらは、参照により本願明細書に援用したものとする。
【0019】
癌は、慣例で起源組織によって、例えば、結直腸癌、乳癌、肺癌等と分類されてきた。
臨床腫瘍学の現在の実務では、癌の亜型を種々の分子的、発生的及び機能的基礎によって
見分けることができることが、ますます重要になってきている。治療上の決定は正確な癌
の亜型に依ることが多く、臨床医が、治療の開始に先立って亜型を特定することが必要で
ある場合がある。治療上の決定に影響を及ぼしうる癌の細分類の例としては、ステージ（
例えば、外科手術で処置される早期肺癌対化学療法で処置される末期肺癌）、組織学（組
織像）（例えば、肺癌における小細胞癌対腺癌対扁平上皮癌）、遺伝子発現パターン又は
転写因子活性（例えば、乳癌におけるＥＲ状態）、コピー数異常（例えば、乳癌における
ＨＥＲ２状態）、特異的再構成（例えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３）、特異的遺伝子点変
異状態（例えば、ＩＤＨ遺伝子点変異）、及びＤＮＡメチル化パターン（例えば、脳癌に
おけるＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化）が挙げられる（しかしこれらに限定され
ない）。
臨床腫瘍学の現在の実務では、癌の亜型を種々の分子的、発生的及び機能的基礎によって
見分けることができることが、ますます重要になってきている。治療上の決定は正確な癌
の亜型に依ることが多く、臨床医が、治療の開始に先立って亜型を特定することが必要で
ある場合がある。治療上の決定に影響を及ぼしうる癌の細分類の例としては、ステージ（
例えば、外科手術で処置される早期肺癌対化学療法で処置される末期肺癌）、組織学（組
織像）（例えば、肺癌における小細胞癌対腺癌対扁平上皮癌）、遺伝子発現パターン又は
転写因子活性（例えば、乳癌におけるＥＲ状態）、コピー数異常（例えば、乳癌における
ＨＥＲ２状態）、特異的再構成（例えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３）、特異的遺伝子点変
異状態（例えば、ＩＤＨ遺伝子点変異）、及びＤＮＡメチル化パターン（例えば、脳癌に
おけるＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化）が挙げられる（しかしこれらに限定され
ない）。
【0020】
本願明細書に記載される方法は、実に様々な癌に適用可能であり、それら癌としては、
副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ｃｎｓ腫瘍、乳癌、キャッスルマン病、子
宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カ
ルチノイド、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫
、腎癌、咽頭癌及び下咽頭癌、白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リ
ンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病）、肝癌、肺癌（非小細胞、小
細胞、肺カルチノイド）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄
異形成症候群、鼻腔癌及び副鼻腔癌、上咽頭（鼻咽頭）癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリ
ンパ腫、口腔癌及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜
芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織癌（成人軟部肉腫）、皮膚癌（基底細胞
癌及び扁平上皮癌、黒色腫、メルケル細胞癌）、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺
癌、子宮肉腫、膣内癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルム
ス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ｃｎｓ腫瘍、乳癌、キャッスルマン病、子
宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カ
ルチノイド、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫
、腎癌、咽頭癌及び下咽頭癌、白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リ
ンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病）、肝癌、肺癌（非小細胞、小
細胞、肺カルチノイド）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄
異形成症候群、鼻腔癌及び副鼻腔癌、上咽頭（鼻咽頭）癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリ
ンパ腫、口腔癌及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜
芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織癌（成人軟部肉腫）、皮膚癌（基底細胞
癌及び扁平上皮癌、黒色腫、メルケル細胞癌）、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺
癌、子宮肉腫、膣内癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルム
ス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【0021】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びそれに続くＳａｎｇｅｒ（サンガー）シークエン
シング等、種々の配列決定技法が当業者に知られている。高スループット配列決定として
も知られる次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技法も利用可能であり、次世代シークエン
シング（ＮＧＳ）技法としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、
Ｒｏｃｈｅ ４５４シークエンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭ
シークエンシング、ＳＯＬｉＤシークエンシング等、種々の配列決定技術が挙げられる。
ＮＧＳは、従来使用されているＳａｎｇｅｒシークエンシングよりもはるかに速くて安価
に、ＤＮＡ及びＲＮＡの配列決定を可能にする。いくつかの実施形態では、上記配列決定
は、ショートリード配列決定のために最適化されている。
シング等、種々の配列決定技法が当業者に知られている。高スループット配列決定として
も知られる次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技法も利用可能であり、次世代シークエン
シング（ＮＧＳ）技法としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、
Ｒｏｃｈｅ ４５４シークエンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭ
シークエンシング、ＳＯＬｉＤシークエンシング等、種々の配列決定技術が挙げられる。
ＮＧＳは、従来使用されているＳａｎｇｅｒシークエンシングよりもはるかに速くて安価
に、ＤＮＡ及びＲＮＡの配列決定を可能にする。いくつかの実施形態では、上記配列決定
は、ショートリード配列決定のために最適化されている。
【0022】
用語「対象」は、本願明細書で使用する場合、動物界の任意のメンバー、好ましくはヒ
ト、最も好ましくは前立腺癌を有しているか、前立腺癌を有していたか、又は前立腺癌を
有していると疑われるヒトを指す。
ト、最も好ましくは前立腺癌を有しているか、前立腺癌を有していたか、又は前立腺癌を
有していると疑われるヒトを指す。
【0023】
セルフリーのメチル化ＤＮＡは、血流の中を自由に循環しているＤＮＡであって、ＤＮ
Ａの種々の既知の領域でメチル化されているＤＮＡである。セルフリーのメチル化ＤＮＡ
を分析するために、試料、例えば、血漿試料が採取されてもよい。従って、いくつかの実
施形態では、上記試料は、対象の血液又は血漿である。
Ａの種々の既知の領域でメチル化されているＤＮＡである。セルフリーのメチル化ＤＮＡ
を分析するために、試料、例えば、血漿試料が採取されてもよい。従って、いくつかの実
施形態では、上記試料は、対象の血液又は血漿である。
【0024】
本願明細書で使用する場合、「ライブラリ調製」は、リスト末端修復（ｌｉｓｔ ｅｎ
ｄ－ｒｅｐａｉｒ）、Ａテーリング、アダプターライゲーション、又は後続のＤＮＡ配列
決定を可能にするためにセルフリーＤＮＡ上で行われる任意の他の調製を含む。
ｄ－ｒｅｐａｉｒ）、Ａテーリング、アダプターライゲーション、又は後続のＤＮＡ配列
決定を可能にするためにセルフリーＤＮＡ上で行われる任意の他の調製を含む。
【0025】
本願明細書で使用する場合、「フィラーＤＮＡ」は非コードＤＮＡとすることができ、
又はフィラーＤＮＡは増幅産物（アプリコン）からなることができる。
又はフィラーＤＮＡは増幅産物（アプリコン）からなることができる。
【0026】
ＤＮＡ試料は、例えば、十分な熱を使用して変性されていてもよい。
【0027】
いくつかの実施形態では、上記比較工程は、統計的分類器を使用するフィットに基づく
。ＤＮＡメチル化データを使用する統計的分類器が、試料を癌種又は亜型等の特定の病状
に振り分けるために使用されてもよい。癌種又は亜型の分類の目的では、分類器は、統計
モデル内で１以上のＤＮＡメチル化変数（すなわち、特徴量）からなるであろうし、統計
モデルの出力は、別個の病状を見分けるための１以上の閾値を有することになろう。統計
的分類器で使用される特定の特徴量（１若しくは複数）及び閾値（１若しくは複数）は、
癌種若しくは亜型の先行知識に、最も情報が豊富であると思われる特徴量の先行知識に、
機械学習に、又はこれらの手法のうちの２以上のものの組み合わせに由来することができ
る。
。ＤＮＡメチル化データを使用する統計的分類器が、試料を癌種又は亜型等の特定の病状
に振り分けるために使用されてもよい。癌種又は亜型の分類の目的では、分類器は、統計
モデル内で１以上のＤＮＡメチル化変数（すなわち、特徴量）からなるであろうし、統計
モデルの出力は、別個の病状を見分けるための１以上の閾値を有することになろう。統計
的分類器で使用される特定の特徴量（１若しくは複数）及び閾値（１若しくは複数）は、
癌種若しくは亜型の先行知識に、最も情報が豊富であると思われる特徴量の先行知識に、
機械学習に、又はこれらの手法のうちの２以上のものの組み合わせに由来することができ
る。
【0028】
いくつかの実施形態では、上記分類器は機械学習由来である。好ましくは、上記分類器
は、エラスティックネット（ｅｌａｓｔｉｃ ｎｅｔ）分類器、ｌａｓｓｏ、サポートベ
クターマシン、ランダムフォレスト、又はニューラルネットワークである。
は、エラスティックネット（ｅｌａｓｔｉｃ ｎｅｔ）分類器、ｌａｓｓｏ、サポートベ
クターマシン、ランダムフォレスト、又はニューラルネットワークである。
【0029】
分析されるゲノム空間は、全ゲノムであってもよく、又は好ましくは調節領域（すなわ
ち、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー（ＦＡＮＴＯＭ５ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、ＣｐＧアイラ
ンド（ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄ）、ＣｐＧショア（ＣｐＧ ｓｈｏｒｅ）及びＣｐＧシェル
フ（ＣｐＧ Ｓｈｅｌｆ））に限定されてもよい。
ち、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー（ＦＡＮＴＯＭ５ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、ＣｐＧアイラ
ンド（ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄ）、ＣｐＧショア（ＣｐＧ ｓｈｏｒｅ）及びＣｐＧシェル
フ（ＣｐＧ Ｓｈｅｌｆ））に限定されてもよい。
【0030】
好ましくは、回収された添加メチル化ＤＮＡの百分率は、プルダウン効率変数を制御す
るための共変量として含まれる。
るための共変量として含まれる。
【0031】
複数の癌種（又は亜型）を互いから見分けることができる分類器のために、分類器は、
好ましくは、注目する各種（又は亜型）の一対比較からの可変メチル化領域からなるであ
ろう。
好ましくは、注目する各種（又は亜型）の一対比較からの可変メチル化領域からなるであ
ろう。
【0032】
いくつかの実施形態では、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化
ＤＮＡ配列は、健康な個体と癌性個体との間の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベー
スに含まれる。
ＤＮＡ配列は、健康な個体と癌性個体との間の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベー
スに含まれる。
【0033】
いくつかの実施形態では、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化
ＤＮＡ配列は、血清、脳脊髄液、尿糞便、痰、胸水、腹水、涙、汗、パップスメア液、内
視鏡検査ブラッシング液等の体液から、好ましくは血漿からのセルフリーＤＮＡ由来のＤ
ＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されている対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列に限定される。
ＤＮＡ配列は、血清、脳脊髄液、尿糞便、痰、胸水、腹水、涙、汗、パップスメア液、内
視鏡検査ブラッシング液等の体液から、好ましくは血漿からのセルフリーＤＮＡ由来のＤ
ＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されている対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列に限定される。
【0034】
いくつかの実施形態では、上記試料は、１００ｎｇ未満、７５ｎｇ未満、又は５０ｎｇ
未満のセルフリーＤＮＡを有する。
未満のセルフリーＤＮＡを有する。
【0035】
いくつかの実施形態では、上記第１量のフィラーＤＮＡは、約５％、１０％、１５％、
２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のメ
チル化フィラーＤＮＡを含み、残部は非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％
～５０％、１０％～４０％、又は１５％～３０％がメチル化フィラーＤＮＡである。
２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のメ
チル化フィラーＤＮＡを含み、残部は非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％
～５０％、１０％～４０％、又は１５％～３０％がメチル化フィラーＤＮＡである。
【0036】
いくつかの実施形態では、上記第１量のフィラーＤＮＡは、２０ｎｇ～１００ｎｇ、好
ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである。
ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである。
【0037】
いくつかの実施形態では、上記試料由来のセルフリーＤＮＡ及び上記第１量のフィラー
ＤＮＡは、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの
総ＤＮＡを含む。
ＤＮＡは、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの
総ＤＮＡを含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、上記フィラーＤＮＡは、５０ｂｐ～８００ｂｐ長、好ましく
は１００ｂｐ～６００ｂｐ長、及びより好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐ長である。
は１００ｂｐ～６００ｂｐ長、及びより好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐ長である。
【0039】
いくつかの実施形態では、上記フィラーＤＮＡは二本鎖である。上記フィラーＤＮＡは
二本鎖である。例えば、フィラーＤＮＡは、ジャンクＤＮＡであってもよい。また、フィ
ラーＤＮＡは、内在ＤＮＡでも外来ＤＮＡでもよい。例えば、フィラーＤＮＡは非ヒトＤ
ＮＡであり、好ましい実施形態では、λＤＮＡである。本願明細書で使用する場合、「λ
ＤＮＡ」は腸内細菌ファージλＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ
は、ヒトＤＮＡに対するアラインメントを有しない。
二本鎖である。例えば、フィラーＤＮＡは、ジャンクＤＮＡであってもよい。また、フィ
ラーＤＮＡは、内在ＤＮＡでも外来ＤＮＡでもよい。例えば、フィラーＤＮＡは非ヒトＤ
ＮＡであり、好ましい実施形態では、λＤＮＡである。本願明細書で使用する場合、「λ
ＤＮＡ」は腸内細菌ファージλＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ
は、ヒトＤＮＡに対するアラインメントを有しない。
【0040】
いくつかの実施形態では、上記結合剤は、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質
である。１つのこのような例示的タンパク質はＭＢＤ２タンパク質である。本願明細書で
使用する場合、「メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）」は、およそ７０残基長でありか
つ１以上の対称的メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡに結合するタンパク質及び酵素の特定のド
メインを指す。ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ４及びＢＡＺ２のＭＢＤは、Ｄ
ＮＡへの結合を媒介し、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１及びＭＢＤ２の場合には、メチル化ＣｐＧ
への結合を優先的に媒介する。ヒトタンパク質ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ
３及びＭＢＤ４は、メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）の各々における存在によって関
連づけられる核タンパク質のファミリーを含む。これらのタンパク質の各々は、ＭＢＤ３
を除いて、メチル化ＤＮＡに特異的に結合することができる。
である。１つのこのような例示的タンパク質はＭＢＤ２タンパク質である。本願明細書で
使用する場合、「メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）」は、およそ７０残基長でありか
つ１以上の対称的メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡに結合するタンパク質及び酵素の特定のド
メインを指す。ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ４及びＢＡＺ２のＭＢＤは、Ｄ
ＮＡへの結合を媒介し、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１及びＭＢＤ２の場合には、メチル化ＣｐＧ
への結合を優先的に媒介する。ヒトタンパク質ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ
３及びＭＢＤ４は、メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）の各々における存在によって関
連づけられる核タンパク質のファミリーを含む。これらのタンパク質の各々は、ＭＢＤ３
を除いて、メチル化ＤＮＡに特異的に結合することができる。
【0041】
他の実施形態では、上記結合剤は抗体であり、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する
ことは、その抗体を使用してセルフリーのメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む。
本願明細書で使用する場合、「免疫沈降」は、特定の抗原（ポリペプチド及びヌクレオチ
ド等）に特異的に結合する抗体を使用してその抗原を溶液から沈降させる技法を指す。こ
のプロセスは、特定のタンパク質又はＤＮＡを試料から単離及び濃縮するために使用する
ことができ、そして抗体がその手順のある時点で固体基質に結合されることを必要とする
。固体基質としては、例えばビーズ、例えば磁気ビーズが挙げられる。他の種類のビーズ
及び固体基質は当該技術分野で公知である。
ことは、その抗体を使用してセルフリーのメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む。
本願明細書で使用する場合、「免疫沈降」は、特定の抗原（ポリペプチド及びヌクレオチ
ド等）に特異的に結合する抗体を使用してその抗原を溶液から沈降させる技法を指す。こ
のプロセスは、特定のタンパク質又はＤＮＡを試料から単離及び濃縮するために使用する
ことができ、そして抗体がその手順のある時点で固体基質に結合されることを必要とする
。固体基質としては、例えばビーズ、例えば磁気ビーズが挙げられる。他の種類のビーズ
及び固体基質は当該技術分野で公知である。
【0042】
１つの例示的抗体は５－ＭｅＣ抗体である。免疫沈降手順については、いくつかの実施
形態では、少なくとも０．０５μｇのこの抗体が試料に加えられ、より好ましい実施形態
では、少なくとも０．１６μｇのこの抗体が試料に加えられる。免疫沈降反応を確認する
ために、いくつかの実施形態では、本願明細書に記載される方法は、第２量の対照ＤＮＡ
を上記試料に加える工程をさらに備える。
形態では、少なくとも０．０５μｇのこの抗体が試料に加えられ、より好ましい実施形態
では、少なくとも０．１６μｇのこの抗体が試料に加えられる。免疫沈降反応を確認する
ために、いくつかの実施形態では、本願明細書に記載される方法は、第２量の対照ＤＮＡ
を上記試料に加える工程をさらに備える。
【0043】
いくつかの実施形態では、当該方法は、免疫沈降反応を確認するために、第２量の対照
ＤＮＡを上記試料に加える工程をさらに備える。
ＤＮＡを上記試料に加える工程をさらに備える。
【0044】
本願明細書で使用する場合、「対照」は陽性対照及び陰性対照の両方、又は少なくとも
陽性対照を含んでもよい。
陽性対照を含んでもよい。
【0045】
いくつかの実施形態では、当該方法は、セルフリーのメチル化ＤＮＡの捕捉を確認する
ために、第２量の対照ＤＮＡを上記試料に加える工程をさらに備える。
ために、第２量の対照ＤＮＡを上記試料に加える工程をさらに備える。
【0046】
いくつかの実施形態では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定することは、上記原発癌細
胞組織を特定することをさらに備える。
胞組織を特定することをさらに備える。
【0047】
いくつかの例では、腫瘍組織サンプリングは、困難である場合があり、又は重大なリス
クを伴う場合があり、いずれの場合も、腫瘍組織サンプリングの必要なしに癌を診断及び
／又は細分類することが所望される可能性がある。例えば、肺腫瘍組織サンプリングは、
縦隔鏡検査、開胸術、又は経皮の針生検等の侵襲的手技を必要とする可能性があり、これ
らの手技・手順は、入院、胸腔チューブ、人工呼吸、抗生物質、又は他の医療行為の必要
を生じる可能性がある。一部の個体は、併存疾患のため、又は好みによって腫瘍組織サン
プリングのために必要な侵襲的手技を受けない可能性がある。いくつかの例では、腫瘍組
織の調達のための現実の手順は、疑われる癌亜型に依存する可能性がある。他の例では、
癌亜型は、同じ個体の中で経時的に発生する可能性があり、侵襲的腫瘍組織サンプリング
手法を用いる連続的な評価は、実施不可能であることが多く、患者に十分に許容されるも
のではない。従って、血液検査による非侵襲的な癌の細分類は、臨床腫瘍学の実務におい
て多くの有利な応用例を有することができよう。
クを伴う場合があり、いずれの場合も、腫瘍組織サンプリングの必要なしに癌を診断及び
／又は細分類することが所望される可能性がある。例えば、肺腫瘍組織サンプリングは、
縦隔鏡検査、開胸術、又は経皮の針生検等の侵襲的手技を必要とする可能性があり、これ
らの手技・手順は、入院、胸腔チューブ、人工呼吸、抗生物質、又は他の医療行為の必要
を生じる可能性がある。一部の個体は、併存疾患のため、又は好みによって腫瘍組織サン
プリングのために必要な侵襲的手技を受けない可能性がある。いくつかの例では、腫瘍組
織の調達のための現実の手順は、疑われる癌亜型に依存する可能性がある。他の例では、
癌亜型は、同じ個体の中で経時的に発生する可能性があり、侵襲的腫瘍組織サンプリング
手法を用いる連続的な評価は、実施不可能であることが多く、患者に十分に許容されるも
のではない。従って、血液検査による非侵襲的な癌の細分類は、臨床腫瘍学の実務におい
て多くの有利な応用例を有することができよう。
【0048】
従って、いくつかの実施形態では、上記原発癌細胞組織を特定することは、癌亜型を特
定することをさらに備える。好ましくは、癌亜型は、ステージ（例えば、外科手術で処置
される早期肺癌対化学療法で処置される末期肺癌）、組織学（例えば、肺癌における小細
胞癌対腺癌対扁平上皮癌）、遺伝子発現パターン又は転写因子活性（例えば、乳癌におけ
るＥＲ状態）、コピー数異常（例えば、乳癌におけるＨＥＲ２状態）、特異的再構成（例
えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３）、特異的遺伝子点変異状態（例えば、ＩＤＨ遺伝子点変
異）、及びＤＮＡメチル化パターン（例えば、脳癌におけるＭＧＭＴ遺伝子プロモーター
のメチル化）に基づいて癌を識別する。
定することをさらに備える。好ましくは、癌亜型は、ステージ（例えば、外科手術で処置
される早期肺癌対化学療法で処置される末期肺癌）、組織学（例えば、肺癌における小細
胞癌対腺癌対扁平上皮癌）、遺伝子発現パターン又は転写因子活性（例えば、乳癌におけ
るＥＲ状態）、コピー数異常（例えば、乳癌におけるＨＥＲ２状態）、特異的再構成（例
えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３）、特異的遺伝子点変異状態（例えば、ＩＤＨ遺伝子点変
異）、及びＤＮＡメチル化パターン（例えば、脳癌におけるＭＧＭＴ遺伝子プロモーター
のメチル化）に基づいて癌を識別する。
【0049】
いくつかの実施形態では、工程（ｆ）の比較は全ゲノムにわたって実施される。
【0050】
他の実施形態では、工程（ｆ）の比較は、全ゲノムから、特定の調節領域へ、例えば、
限定されないが、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、Ｃｐ
Ｇシェルフ、又はこれらのいずれかの組み合わせに限定される。
限定されないが、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、Ｃｐ
Ｇシェルフ、又はこれらのいずれかの組み合わせに限定される。
【0051】
いくつかの実施形態では、特定の工程は、コンピュータプロセッサにより実施される。
【0052】
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定する方法であって、対
象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、捕捉され
たセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡ
の１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意
な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、癌細胞由来のＤＮ
Ａが特定される場合に、上記比較工程に基づいて原発の上記癌細胞組織及び癌亜型をさら
に特定する工程とを備える方法が提供される。
象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、捕捉され
たセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡ
の１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意
な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、癌細胞由来のＤＮ
Ａが特定される場合に、上記比較工程に基づいて原発の上記癌細胞組織及び癌亜型をさら
に特定する工程とを備える方法が提供される。
【0053】
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して、２以上の可能性のある器官から上
記癌細胞が発生した上記癌の場所を決定する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡ
の試料を準備する工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、上記
試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーの
メチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配
列パターンを対照個体の２以上の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、
上記２以上の母集団の各々は、異なる器官に限局性癌を有する工程と、上記セルフリーＤ
ＮＡのメチル化のパターンと上記２以上の母集団うちの１つのメチル化のパターンとの間
の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で上記癌細胞が発生したかを決定する工程
とを備える方法が提供される。
記癌細胞が発生した上記癌の場所を決定する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡ
の試料を準備する工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、上記
試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーの
メチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配
列パターンを対照個体の２以上の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、
上記２以上の母集団の各々は、異なる器官に限局性癌を有する工程と、上記セルフリーＤ
ＮＡのメチル化のパターンと上記２以上の母集団うちの１つのメチル化のパターンとの間
の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で上記癌細胞が発生したかを決定する工程
とを備える方法が提供される。
【0054】
本発明のシステム及び方法は種々の実施形態で実施されてよい。好適に構成されたコン
ピュータデバイス、及び関連する通信ネットワーク、デバイス、ソフトウェア及びファー
ムウェアは、１以上の上記の実施形態を実行するためのプラットフォームを提供してもよ
い。例として、図５は、記憶装置１０４に、及びランダムアクセスメモリ１０６に接続さ
れた中央処理装置（「ＣＰＵ」）１０２を備えてもよい一般的なコンピュータデバイス１
００を示す。ＣＰＵ１０２は、オペレーティングシステム１０１、アプリケーション・プ
ログラム１０３、及びデータ１２３を処理してもよい。オペレーティングシステム１０１
、アプリケーション・プログラム１０３、及びデータ１２３は、記憶装置１０４に保存さ
れ、必要に応じてメモリ１０６にロードされてもよい。コンピュータデバイス１００は、
ＣＰＵ１０２から集中的な画像処理計算の負荷を減らしてこれらの計算をＣＰＵ１０２と
並行して実行するために、ＣＰＵ１０２に、及びメモリ１０６に作動可能に接続されてい
るグラフィック処理装置（ＧＰＵ）１２２をさらに備えてもよい。操作者１０７は、ビデ
オインターフェース１０５によって接続されたビデオディスプレー１０８、並びにＩ／Ｏ
インターフェース１０９によって接続されたキーボード１１５、マウス１１２、及びディ
スクドライブ又は半導体ドライブ１１４等の種々の入／出力装置を使用して、コンピュー
タデバイス１００と対話してもよい。公知のように、マウス１１２は、ビデオディスプレ
ー１０８におけるカーソルの移動を制御し、ビデオディスプレー１０８に現れる種々のグ
ラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）コントロールをマウスボタンで操作する
ように構成されていてもよい。ディスクドライブ又は半導体ドライブ１１４は、コンピュ
ータ可読媒体１１６を受け入れるように構成されていてもよい。コンピュータデバイス１
００は、ネットワークインターフェース１１１を介してネットワークの一部を形成して、
コンピュータデバイス１００が他の好適に構成されたデータ処理システム（図示せず）と
通信することを可能にしてもよい。種々のソースからの入力を受信するために、１以上の
異なる種類のセンサ１３５が使用されてもよい。
ピュータデバイス、及び関連する通信ネットワーク、デバイス、ソフトウェア及びファー
ムウェアは、１以上の上記の実施形態を実行するためのプラットフォームを提供してもよ
い。例として、図５は、記憶装置１０４に、及びランダムアクセスメモリ１０６に接続さ
れた中央処理装置（「ＣＰＵ」）１０２を備えてもよい一般的なコンピュータデバイス１
００を示す。ＣＰＵ１０２は、オペレーティングシステム１０１、アプリケーション・プ
ログラム１０３、及びデータ１２３を処理してもよい。オペレーティングシステム１０１
、アプリケーション・プログラム１０３、及びデータ１２３は、記憶装置１０４に保存さ
れ、必要に応じてメモリ１０６にロードされてもよい。コンピュータデバイス１００は、
ＣＰＵ１０２から集中的な画像処理計算の負荷を減らしてこれらの計算をＣＰＵ１０２と
並行して実行するために、ＣＰＵ１０２に、及びメモリ１０６に作動可能に接続されてい
るグラフィック処理装置（ＧＰＵ）１２２をさらに備えてもよい。操作者１０７は、ビデ
オインターフェース１０５によって接続されたビデオディスプレー１０８、並びにＩ／Ｏ
インターフェース１０９によって接続されたキーボード１１５、マウス１１２、及びディ
スクドライブ又は半導体ドライブ１１４等の種々の入／出力装置を使用して、コンピュー
タデバイス１００と対話してもよい。公知のように、マウス１１２は、ビデオディスプレ
ー１０８におけるカーソルの移動を制御し、ビデオディスプレー１０８に現れる種々のグ
ラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）コントロールをマウスボタンで操作する
ように構成されていてもよい。ディスクドライブ又は半導体ドライブ１１４は、コンピュ
ータ可読媒体１１６を受け入れるように構成されていてもよい。コンピュータデバイス１
００は、ネットワークインターフェース１１１を介してネットワークの一部を形成して、
コンピュータデバイス１００が他の好適に構成されたデータ処理システム（図示せず）と
通信することを可能にしてもよい。種々のソースからの入力を受信するために、１以上の
異なる種類のセンサ１３５が使用されてもよい。
【0055】
本発明のシステム及び方法は、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ
、タブレットコンピュータ又はワイヤレスの手持ち式のものを含めた事実上任意の態様の
コンピュータデバイスで実施されてよい。本発明のシステム及び方法は、１以上のコンピ
ュータデバイスに本発明に係る方法における種々の工程の各々を実行することを可能にす
るためのコンピュータプログラムコードを備えるコンピュータ可読／可用媒体として実行
されてもよい。複数のコンピュータデバイスが全体のオペレーションを実施する場合には
、このオペレーションの種々の工程を分散させるために、それらのコンピュータデバイス
はネットワーク化される。コンピュータ可読媒体又はコンピュータ可用媒体という用語は
、プログラムコードの物理的実施形態の任意のタイプの１以上を含むということは理解さ
れる。特に、このコンピュータ可読／可用媒体は、１以上の携帯用の記憶用製品（例えば
光ディスク、磁気ディスク、テープ等）に、コンピュータ及び／又は記憶システムに付随
したメモリ等の計算装置の１以上のデータ記憶部分に内蔵されたプログラムコードを含む
ことができる。
、タブレットコンピュータ又はワイヤレスの手持ち式のものを含めた事実上任意の態様の
コンピュータデバイスで実施されてよい。本発明のシステム及び方法は、１以上のコンピ
ュータデバイスに本発明に係る方法における種々の工程の各々を実行することを可能にす
るためのコンピュータプログラムコードを備えるコンピュータ可読／可用媒体として実行
されてもよい。複数のコンピュータデバイスが全体のオペレーションを実施する場合には
、このオペレーションの種々の工程を分散させるために、それらのコンピュータデバイス
はネットワーク化される。コンピュータ可読媒体又はコンピュータ可用媒体という用語は
、プログラムコードの物理的実施形態の任意のタイプの１以上を含むということは理解さ
れる。特に、このコンピュータ可読／可用媒体は、１以上の携帯用の記憶用製品（例えば
光ディスク、磁気ディスク、テープ等）に、コンピュータ及び／又は記憶システムに付随
したメモリ等の計算装置の１以上のデータ記憶部分に内蔵されたプログラムコードを含む
ことができる。
【0056】
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定するコンピュータ実装
方法であって、少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化Ｄ
ＮＡの配列決定データを受け取る工程と、上記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉され
たセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡ
の１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意
な類似性がある場合に、上記少なくとも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在
を特定する工程と、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、上記比較工程に基づいて上記
原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程とを備える方法が提供される。
方法であって、少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化Ｄ
ＮＡの配列決定データを受け取る工程と、上記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉され
たセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡ
の１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意
な類似性がある場合に、上記少なくとも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在
を特定する工程と、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、上記比較工程に基づいて上記
原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程とを備える方法が提供される。
【0057】
一態様では、プロセッサ及びこのプロセッサに接続されたメモリを有する汎用性コンピ
ュータと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュー
タメカニズムがエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、上記コンピュータプ
ログラムメカニズムが上記コンピュータの上記メモリにローディングされ、上記コンピュ
ータに、本願明細書に記載される方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品が
提供される。
ュータと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュー
タメカニズムがエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、上記コンピュータプ
ログラムメカニズムが上記コンピュータの上記メモリにローディングされ、上記コンピュ
ータに、本願明細書に記載される方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品が
提供される。
【0058】
一態様では、本願明細書に記載されるコンピュータプログラム製品を保存するためのデ
ータ構造が保存されたコンピュータ可読媒体が提供される。
ータ構造が保存されたコンピュータ可読媒体が提供される。
【0059】
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して癌亜型を特定するためのデバイスで
あって、少なくとも１つのプロセッサと、上記少なくとも１つのプロセッサと通信してい
る電子メモリとを備え、上記電子メモリは、上記少なくとも１つのプロセッサで実行され
る場合に、上記少なくとも１つのプロセッサに、対象試料由来のセルフリーのメチル化Ｄ
ＮＡの配列決定データを受け取ること、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を
、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較すること
、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮ
Ａの存在を特定すること、並びに癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、上記比較工程
に基づいて、上記原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することを実行させるプロセッ
サ実行可能なコードを保存するデバイスが提供される。
あって、少なくとも１つのプロセッサと、上記少なくとも１つのプロセッサと通信してい
る電子メモリとを備え、上記電子メモリは、上記少なくとも１つのプロセッサで実行され
る場合に、上記少なくとも１つのプロセッサに、対象試料由来のセルフリーのメチル化Ｄ
ＮＡの配列決定データを受け取ること、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を
、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較すること
、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリ
ーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮ
Ａの存在を特定すること、並びに癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、上記比較工程
に基づいて、上記原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することを実行させるプロセッ
サ実行可能なコードを保存するデバイスが提供される。
【0060】
本願明細書で使用する場合、「プロセッサ」は、いずれのタイプのプロセッサ、例えば
、いずれのタイプの汎用性マイクロプロセッサ又はマイクロコントローラ（例えば、Ｉｎ
ｔｅｌ（商標）ｘ８６、ＰｏｗｅｒＰＣ（商標）、ＡＲＭ（商標）プロセッサ等）、デジ
タル信号処理（ＤＳＰ）プロセッサ、集積回路、フィールドプログラマブルゲートアレイ
（ＦＰＧＡ）、又はこれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
、いずれのタイプの汎用性マイクロプロセッサ又はマイクロコントローラ（例えば、Ｉｎ
ｔｅｌ（商標）ｘ８６、ＰｏｗｅｒＰＣ（商標）、ＡＲＭ（商標）プロセッサ等）、デジ
タル信号処理（ＤＳＰ）プロセッサ、集積回路、フィールドプログラマブルゲートアレイ
（ＦＰＧＡ）、又はこれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
【0061】
本願明細書で使用する場合、「メモリ」は、内部に又は外部に置かれるいずれのタイプ
のコンピュータメモリ、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモ
リ（ＲＯＭ）、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤＲＯＭ）、電気光学メモリ
、磁気光学メモリ、消去可能なプログラマブル読み出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、及び
電気的消去可能プログラム可能読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）等のうちの好適な組
み合わせを含んでもよい。メモリ１０２の一部分は、従来のファイルシステムを使用して
組織化され、デバイスの動作全体を支配するオペレーティングシステムにより制御され管
理されてもよい。
のコンピュータメモリ、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモ
リ（ＲＯＭ）、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤＲＯＭ）、電気光学メモリ
、磁気光学メモリ、消去可能なプログラマブル読み出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、及び
電気的消去可能プログラム可能読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）等のうちの好適な組
み合わせを含んでもよい。メモリ１０２の一部分は、従来のファイルシステムを使用して
組織化され、デバイスの動作全体を支配するオペレーティングシステムにより制御され管
理されてもよい。
【0062】
本願明細書で使用する場合、「コンピュータ可読記憶媒体」（コンピュータ可読プログ
ラムコードが内蔵された機械可読媒体、プロセッサ可読媒体又はコンピュータ可用媒体と
も呼ばれる）は、コンピュータ又は機械によって可読のフォーマットでデータを保存する
ことができる媒体である。機械可読媒体は、磁気的、光学的又は電気的な記憶媒体を含め
たいずれの好適な有形の、非一過性の媒体、例えばディスケット、コンパクトディスク読
み出し専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、メモリ素子（揮発性又は不揮発性）、又は類似の保
存メカニズムであってよい。このコンピュータ可読記憶媒体は、実行されるときに、プロ
セッサに本開示の一実施形態に係る方法における工程を実行させる種々のセットの命令、
コード配列、構成情報、又は他のデータを内蔵することができる。当業者は、記載された
実行形態を実行するために必要な他の命令及びオペレーション（操作）は、コンピュータ
可読記憶媒体に保存されることも可能であるということはわかるであろう。コンピュータ
可読記憶媒体に保存された命令は、プロセッサ又は他の好適な処理装置によって実施され
てよく、記載されたタスクを実行するための電気回路と整合されることが可能である。
ラムコードが内蔵された機械可読媒体、プロセッサ可読媒体又はコンピュータ可用媒体と
も呼ばれる）は、コンピュータ又は機械によって可読のフォーマットでデータを保存する
ことができる媒体である。機械可読媒体は、磁気的、光学的又は電気的な記憶媒体を含め
たいずれの好適な有形の、非一過性の媒体、例えばディスケット、コンパクトディスク読
み出し専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、メモリ素子（揮発性又は不揮発性）、又は類似の保
存メカニズムであってよい。このコンピュータ可読記憶媒体は、実行されるときに、プロ
セッサに本開示の一実施形態に係る方法における工程を実行させる種々のセットの命令、
コード配列、構成情報、又は他のデータを内蔵することができる。当業者は、記載された
実行形態を実行するために必要な他の命令及びオペレーション（操作）は、コンピュータ
可読記憶媒体に保存されることも可能であるということはわかるであろう。コンピュータ
可読記憶媒体に保存された命令は、プロセッサ又は他の好適な処理装置によって実施され
てよく、記載されたタスクを実行するための電気回路と整合されることが可能である。
【0063】
本願明細書で使用する場合、「データ構造」は、データが効率的に使用することができ
るように、コンピュータにおいてデータを組織化する特定の方法である。データ構造は、
データ構造上で実行することができるオペレーション及びそれらのオペレーションの計算
複雑性を特定する１以上の特定の抽象データ型（ＡＤＴ）を実行することができる。比較
で、データ構造は、ＡＤＴによって与えられる仕様の具体的な実行形態である。
るように、コンピュータにおいてデータを組織化する特定の方法である。データ構造は、
データ構造上で実行することができるオペレーション及びそれらのオペレーションの計算
複雑性を特定する１以上の特定の抽象データ型（ＡＤＴ）を実行することができる。比較
で、データ構造は、ＡＤＴによって与えられる仕様の具体的な実行形態である。
【0064】
本発明の利点は、以下の実施例によりさらに例証される。本明細書中に示される実施例
及びそれらの特定の詳細は、例証のためにのみ提示されており、本発明の特許請求の範囲
に対する限定と解釈されるべきではない。
及びそれらの特定の詳細は、例証のためにのみ提示されており、本発明の特許請求の範囲
に対する限定と解釈されるべきではない。
【実施例0065】
方法及び材料
提供者募集及び試料入手
ＣＲＣ、乳癌、及びＧＢＭの試料をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏ
ｒｋ ＢｉｏＢａｎｋから得て、ＡＭＬ試料をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎ
ｅｔｗｏｒｋ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＢｉｏＢａｎｋから得て、最後に、健康な対照をカナ
ダ、トロントのＭｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＳＨ；マウントサイナイ
病院）のＦａｍｉｌｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｒｅを通して募集した。すべての試
料を患者の承諾を得て集め、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄ（研究倫理委
員会）から、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ及びカナダ、トロン
トのＭｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌから、機関承認を得て入手した。
提供者募集及び試料入手
ＣＲＣ、乳癌、及びＧＢＭの試料をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏ
ｒｋ ＢｉｏＢａｎｋから得て、ＡＭＬ試料をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎ
ｅｔｗｏｒｋ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＢｉｏＢａｎｋから得て、最後に、健康な対照をカナ
ダ、トロントのＭｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＳＨ；マウントサイナイ
病院）のＦａｍｉｌｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｒｅを通して募集した。すべての試
料を患者の承諾を得て集め、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄ（研究倫理委
員会）から、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ及びカナダ、トロン
トのＭｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌから、機関承認を得て入手した。
【0066】
検査試料加工－ｃｆＤＮＡ
ＥＤＴＡ及びＡＣＤ血漿試料は、ＢｉｏＢａｎｋｓから、及びカナダ、トロントのＭｏ
ｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＳＨ）のＦａｍｉｌｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｃｅｎｔｒｅから得た。すべての試料を、使用まで－８０℃で、又は気相液体窒素中で保
存した。セルフリーＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン））を使用して０．５～３．５ｍｌの血漿
から抽出した。抽出したＤＮＡは、使用に先立ってＱｕｂｉｔにより定量した。
ＥＤＴＡ及びＡＣＤ血漿試料は、ＢｉｏＢａｎｋｓから、及びカナダ、トロントのＭｏ
ｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＳＨ）のＦａｍｉｌｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｃｅｎｔｒｅから得た。すべての試料を、使用まで－８０℃で、又は気相液体窒素中で保
存した。セルフリーＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン））を使用して０．５～３．５ｍｌの血漿
から抽出した。抽出したＤＮＡは、使用に先立ってＱｕｂｉｔにより定量した。
【0067】
検査試料加工－ＰＤＸ ｃｆＤＮＡ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ ＮｅｔｗｏｒｋのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉ
ｃｓ Ｂｏａｒｄにより承認されたとおり、患者の同意を得てＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈ
ｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｂｉｏｂａｎｋから得たヒト結直腸腫瘍組織を、コラゲナ
ーゼＡを使用して単一細胞へと消化した。単一細胞を、４～６週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ雄
マウスに皮下注射した。心臓穿刺による採血の前にＣＯ２吸入によりマウスを安楽死させ
、採取した血液をＥＤＴＡ採血管に保存した。採取した血液試料から血漿を単離し、－８
０Ｃで保存した。セルフリーＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して０．３～０．７ｍｌの血漿から
抽出した。すべての動物研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ
のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物管理委員会）によって承認された
倫理規制を遵守して実施した。
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ ＮｅｔｗｏｒｋのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉ
ｃｓ Ｂｏａｒｄにより承認されたとおり、患者の同意を得てＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈ
ｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｂｉｏｂａｎｋから得たヒト結直腸腫瘍組織を、コラゲナ
ーゼＡを使用して単一細胞へと消化した。単一細胞を、４～６週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ雄
マウスに皮下注射した。心臓穿刺による採血の前にＣＯ２吸入によりマウスを安楽死させ
、採取した血液をＥＤＴＡ採血管に保存した。採取した血液試料から血漿を単離し、－８
０Ｃで保存した。セルフリーＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して０．３～０．７ｍｌの血漿から
抽出した。すべての動物研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ
のＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物管理委員会）によって承認された
倫理規制を遵守して実施した。
【0068】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコルの概略図は、国際公開第２０１７／１９０２１５号
パンフレットに記載されている。ｃｆＭｅＤＩＰに先立って、上記ＤＮＡ試料をＫａｐａ
Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するライブ
ラリ調製に供した。製造業者のプロトコルにいくらか変更を加えてそのプロトコルに従っ
た。手短に言えば、注目するＤＮＡを０．２ｍＬのＰＣＲチューブに加え、末端修復（エ
ンドリペア）及びＡ－テーリングに供した。その後に、ＮＥＢＮｅｘｔアダプター（Ｉｌ
ｌｕｍｉｎａキット用ＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ、Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、から）を０．１８１μＭの最終濃度で使用してアダプタ
ーライゲーションを行い、２０℃で２０分間インキュベーションし、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ
ビーズで精製した。溶出したライブラリを、ＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ Ｃａｎａｄａ）を使用して消化し、その後、ＭｅＤＩＰに先立ってＱｉａ
ｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し
た。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコルの概略図は、国際公開第２０１７／１９０２１５号
パンフレットに記載されている。ｃｆＭｅＤＩＰに先立って、上記ＤＮＡ試料をＫａｐａ
Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するライブ
ラリ調製に供した。製造業者のプロトコルにいくらか変更を加えてそのプロトコルに従っ
た。手短に言えば、注目するＤＮＡを０．２ｍＬのＰＣＲチューブに加え、末端修復（エ
ンドリペア）及びＡ－テーリングに供した。その後に、ＮＥＢＮｅｘｔアダプター（Ｉｌ
ｌｕｍｉｎａキット用ＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ、Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、から）を０．１８１μＭの最終濃度で使用してアダプタ
ーライゲーションを行い、２０℃で２０分間インキュベーションし、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ
ビーズで精製した。溶出したライブラリを、ＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ Ｃａｎａｄａ）を使用して消化し、その後、ＭｅＤＩＰに先立ってＱｉａ
ｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し
た。
【0069】
調製したライブラリを、１００ｎｇの最終ＤＮＡ量に、プールしたメチル化／非メチル
化λＰＣＲ産物と合わせ、Ｔａｉｗｏら、２０１２［７］からのプロトコルをいくらか変
更を加えて使用してＭｅＤＩＰに供した。手短に言えば、ＭｅＤＩＰのために、Ｄｉａｇ
ｅｎｏｄｅ ＭａｇＭｅＤＩＰキット（カタログ番号Ｃ０２０１００２１）を、製造業者
のプロトコルにいくらか変更を加えてそのプロトコルに従って使用した。０．３ｎｇの対
照メチル化シロイヌナズナＤＮＡ及び０．３ｎｇの対照非メチル化シロイヌナズナＤＮＡ
、フィラーＤＮＡ（ＤＮＡの全量［ｃｆＤＮＡ＋フィラー＋対照］を１００ｎｇにするた
め）及び緩衝液を、アダプターライゲーションしたＤＮＡが入っているＰＣＲチューブに
添加した後、この試料を９５℃に１０分間加熱し、直後に氷水浴の中へ１０分間入れた。
各試料を、２つの０．２ｍＬのＰＣＲチューブに小分けし、一方は、１０％インプット対
照のためのものであり、他方は、免疫沈降にかけることになる試料のためのものであった
。ＭａｇＭｅＤＩＰキットからの含まれた５－ｍＣモノクローナル抗体３３Ｄ３（カタロ
グ番号Ｃ１５２０００８１）を、希釈した抗体混合物を生成する前に１：１５に希釈し、
上記試料に加えた。洗浄した磁気ビーズ（製造業者の使用説明書に従った）も加え、その
後に４℃で１７時間インキュベーションした。この試料を、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ ｉＰｕ
ｒｅ Ｋｉｔを使用して精製し、５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ｃで溶出した。反応（ＱＣ１
）の成功は、添加したシロイヌナズナＤＮＡの存在を検出するためのｑＰＣＲにより検証
し、非メチル化添加ＤＮＡの％回収＜１％及び反応の％特異度＞９９％（１－［添加非メ
チル化対照ＤＮＡの回収／添加メチル化対照ＤＮＡの回収］として算出）を確認して、そ
の後で次の工程に進んだ。各ライブラリを増幅するための最適サイクル数は、ｑＰＣＲの
使用により決定し、この後でＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒｍｉ
ｘを使用して試料を増幅し、０．３μＭの最終濃度までＮＥＢＮｅｘｔ ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅｘ ｏｌｉｇｏｓを加えた。このライブラリを増幅するために使用したＰＣＲ設定は以
下のとおりであった：９５℃で３分間の活性化、次いで９８℃で２０秒間、６５℃で１５
秒間及び７２℃で３０秒間及び７２℃で１分間の最終伸長の所定のサイクル。増幅したラ
イブラリは、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製カラムを使用して精製し、次いで、ゲルサイ
ズを３％ Ｎｕｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロースゲルを用いて選択して、アダプター二量体
があればそれを除去した。配列決定に供する前に、メチル化ヒトＤＮＡ領域（精巣特異的
Ｈ２Ｂ、ＴＳＨ２Ｂ）及び非メチル化ヒトＤＮＡ領域（ＧＡＰＤＨプロモーター）の濃縮
倍率を、セルフリーＤＮＡ（ＡＴＣＣから得られる細胞系、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイ
コプラズマ）フリー）を模倣するように剪断されたＨＣＴ１１６細胞系ＤＮＡから生成さ
れるＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ及びｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリについて測定した。最終
ライブラリをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ分析に供した後、ＵＨＮ Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａ
ｒｇａｒｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＣｅｎｔｒｅにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ
２０００で配列決定した。
化λＰＣＲ産物と合わせ、Ｔａｉｗｏら、２０１２［７］からのプロトコルをいくらか変
更を加えて使用してＭｅＤＩＰに供した。手短に言えば、ＭｅＤＩＰのために、Ｄｉａｇ
ｅｎｏｄｅ ＭａｇＭｅＤＩＰキット（カタログ番号Ｃ０２０１００２１）を、製造業者
のプロトコルにいくらか変更を加えてそのプロトコルに従って使用した。０．３ｎｇの対
照メチル化シロイヌナズナＤＮＡ及び０．３ｎｇの対照非メチル化シロイヌナズナＤＮＡ
、フィラーＤＮＡ（ＤＮＡの全量［ｃｆＤＮＡ＋フィラー＋対照］を１００ｎｇにするた
め）及び緩衝液を、アダプターライゲーションしたＤＮＡが入っているＰＣＲチューブに
添加した後、この試料を９５℃に１０分間加熱し、直後に氷水浴の中へ１０分間入れた。
各試料を、２つの０．２ｍＬのＰＣＲチューブに小分けし、一方は、１０％インプット対
照のためのものであり、他方は、免疫沈降にかけることになる試料のためのものであった
。ＭａｇＭｅＤＩＰキットからの含まれた５－ｍＣモノクローナル抗体３３Ｄ３（カタロ
グ番号Ｃ１５２０００８１）を、希釈した抗体混合物を生成する前に１：１５に希釈し、
上記試料に加えた。洗浄した磁気ビーズ（製造業者の使用説明書に従った）も加え、その
後に４℃で１７時間インキュベーションした。この試料を、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ ｉＰｕ
ｒｅ Ｋｉｔを使用して精製し、５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ｃで溶出した。反応（ＱＣ１
）の成功は、添加したシロイヌナズナＤＮＡの存在を検出するためのｑＰＣＲにより検証
し、非メチル化添加ＤＮＡの％回収＜１％及び反応の％特異度＞９９％（１－［添加非メ
チル化対照ＤＮＡの回収／添加メチル化対照ＤＮＡの回収］として算出）を確認して、そ
の後で次の工程に進んだ。各ライブラリを増幅するための最適サイクル数は、ｑＰＣＲの
使用により決定し、この後でＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒｍｉ
ｘを使用して試料を増幅し、０．３μＭの最終濃度までＮＥＢＮｅｘｔ ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅｘ ｏｌｉｇｏｓを加えた。このライブラリを増幅するために使用したＰＣＲ設定は以
下のとおりであった：９５℃で３分間の活性化、次いで９８℃で２０秒間、６５℃で１５
秒間及び７２℃で３０秒間及び７２℃で１分間の最終伸長の所定のサイクル。増幅したラ
イブラリは、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製カラムを使用して精製し、次いで、ゲルサイ
ズを３％ Ｎｕｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロースゲルを用いて選択して、アダプター二量体
があればそれを除去した。配列決定に供する前に、メチル化ヒトＤＮＡ領域（精巣特異的
Ｈ２Ｂ、ＴＳＨ２Ｂ）及び非メチル化ヒトＤＮＡ領域（ＧＡＰＤＨプロモーター）の濃縮
倍率を、セルフリーＤＮＡ（ＡＴＣＣから得られる細胞系、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイ
コプラズマ）フリー）を模倣するように剪断されたＨＣＴ１１６細胞系ＤＮＡから生成さ
れるＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ及びｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリについて測定した。最終
ライブラリをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ分析に供した後、ＵＨＮ Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａ
ｒｇａｒｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＣｅｎｔｒｅにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ
２０００で配列決定した。
【0070】
点変異検出のための超深度標的配列決定
本発明者らは、ＱＩＡｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキ
ットを使用して、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅに
おいて初期臨床試験での登録前に作成された対応腫瘍組織分子プロファイリングデータを
有する患者由来の約２０ｍＬの血漿（４～５×１０ｍＬのＥＤＴＡ採血管）からセルフリ
ーＤＮＡを単離した。細胞系（ＣＲＣ及びＭＭ細胞系の希釈）からＰｕｒｅＧｅｎｅ Ｇ
ｅｎｔｒａキットを使用してＤＮＡを抽出し、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理器を使用して約
１８０ｂｐに断片化し、より大きいサイズの断片をＡｍｐｕｒｅビーズを使用して排除し
て、セルフリーＤＮＡの断片サイズを模倣した。ＤＮＡ配列決定ライブラリを、ＮＥＸＴ
ｆｌｅｘ－９６ ＤＮＡ Ｂａｒｃｏｄｅアダプター（Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、
オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）、テキサス州）アダプターを利用するＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ
Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ）、マサチューセッツ州）を使用して８３ｎｇの断片化ＤＮＡから構築した。既
知の変異を含むＤＮＡ断片を単離するために、本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｔｒｕ
Ｓｅｑ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌを使用して臨床検査室によって試
験された４８の遺伝子から変異ホットスポットを標的にしたビオチン化ＤＮＡ捕捉プロー
ブ（ｘＧｅｎ Ｌｏｃｋｄｏｗｎ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｎｉ Ｐｏｏｌ、Ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、コーラルビル（Ｃｏｒａｌｖ
ｉｌｌｅ）、アイオワ州）を設計した。バーコードライブラリをプールし、次いでカスタ
ムハイブリッド捕捉ライブラリを製造業者の使用説明書（ＩＤＴ ｘＧＥＮ Ｌｏｃｋｄ
ｏｗｎプロトコルバージョン２．１）に従って適用した。これらの断片を、Ｉｌｌｕｍｉ
ｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００機器を使用して＞１０，０００×リードカバレッジまで配列
決定した。得られたリードをｂｗａ－ｍｅｍを使用して整列（配列比較）し、変異をｓａ
ｍｔｏｏｌｓ及びｍｕＴｅｃｔバージョン１．１．４を使用して検出した。
本発明者らは、ＱＩＡｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキ
ットを使用して、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅに
おいて初期臨床試験での登録前に作成された対応腫瘍組織分子プロファイリングデータを
有する患者由来の約２０ｍＬの血漿（４～５×１０ｍＬのＥＤＴＡ採血管）からセルフリ
ーＤＮＡを単離した。細胞系（ＣＲＣ及びＭＭ細胞系の希釈）からＰｕｒｅＧｅｎｅ Ｇ
ｅｎｔｒａキットを使用してＤＮＡを抽出し、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理器を使用して約
１８０ｂｐに断片化し、より大きいサイズの断片をＡｍｐｕｒｅビーズを使用して排除し
て、セルフリーＤＮＡの断片サイズを模倣した。ＤＮＡ配列決定ライブラリを、ＮＥＸＴ
ｆｌｅｘ－９６ ＤＮＡ Ｂａｒｃｏｄｅアダプター（Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、
オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）、テキサス州）アダプターを利用するＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ
Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎ
ｇｔｏｎ）、マサチューセッツ州）を使用して８３ｎｇの断片化ＤＮＡから構築した。既
知の変異を含むＤＮＡ断片を単離するために、本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｔｒｕ
Ｓｅｑ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌを使用して臨床検査室によって試
験された４８の遺伝子から変異ホットスポットを標的にしたビオチン化ＤＮＡ捕捉プロー
ブ（ｘＧｅｎ Ｌｏｃｋｄｏｗｎ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｎｉ Ｐｏｏｌ、Ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、コーラルビル（Ｃｏｒａｌｖ
ｉｌｌｅ）、アイオワ州）を設計した。バーコードライブラリをプールし、次いでカスタ
ムハイブリッド捕捉ライブラリを製造業者の使用説明書（ＩＤＴ ｘＧＥＮ Ｌｏｃｋｄ
ｏｗｎプロトコルバージョン２．１）に従って適用した。これらの断片を、Ｉｌｌｕｍｉ
ｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００機器を使用して＞１０，０００×リードカバレッジまで配列
決定した。得られたリードをｂｗａ－ｍｅｍを使用して整列（配列比較）し、変異をｓａ
ｍｔｏｏｌｓ及びｍｕＴｅｃｔバージョン１．１．４を使用して検出した。
【0071】
腫瘍特異的特徴の数とシークエンシング深度による検出確率との間の関係のモデル化
本発明者らは、１４５，０００個のシミュレートされたゲノムを作成した。癌特異的メ
チル化ＤＭＲの割合は、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％及び１０％に設定し
、それぞれ１、１０、１００、１０００及び１００００個の独立したＤＭＲからなった。
本発明者らは、１４，５００個の二倍体ゲノム（１００ｎｇのＤＮＡに相当する）をこれ
らの最初の混合物から採取し、１０、１００、１０００及び１００００リード／遺伝子座
をさらに採取して、これらの深さにおける配列決定カバレッジを表した。このプロセスを
、カバレッジ、存在量及び特徴数の各組み合わせで１００回繰り返した。本発明者らは、
パラメータの各組み合わせで少なくとも１つのＤＭＲの検出成功頻度を推定し、確率曲線
をプロットして（図１Ａ）、シークエンシング深度を条件とする検出成功確率に対する特
徴数の影響を視覚的に評価した。
本発明者らは、１４５，０００個のシミュレートされたゲノムを作成した。癌特異的メ
チル化ＤＭＲの割合は、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％及び１０％に設定し
、それぞれ１、１０、１００、１０００及び１００００個の独立したＤＭＲからなった。
本発明者らは、１４，５００個の二倍体ゲノム（１００ｎｇのＤＮＡに相当する）をこれ
らの最初の混合物から採取し、１０、１００、１０００及び１００００リード／遺伝子座
をさらに採取して、これらの深さにおける配列決定カバレッジを表した。このプロセスを
、カバレッジ、存在量及び特徴数の各組み合わせで１００回繰り返した。本発明者らは、
パラメータの各組み合わせで少なくとも１つのＤＭＲの検出成功頻度を推定し、確率曲線
をプロットして（図１Ａ）、シークエンシング深度を条件とする検出成功確率に対する特
徴数の影響を視覚的に評価した。
【0072】
組織特有の特徴の誘導、多組織分類器の開発及び４５０ｋデータでの検証
ｃｆＤＮＡ ＭｅＤＩＰプロファイルを、ＭＥＤＩＰＳ Ｒパッケージ［８］を使用し
て定量し、ＲＰＫＭに換算し、その後、ｌｏｇ２カウントパーミリオン（ｃｏｕｎｔｓ－
ｐｅｒ－ｍｉｌｌｉｏｎ）に変換した。その後、線形モデルを、ＦＡＮＴＯＭ５エンハン
サー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア及びＣｐＧシェルフにマッピングした特徴のマト
リクス上でｌｉｍｍａ－ｔｒｅｎｄ［９］を使用してフィッティングした。回収した添加
メチル化ＤＮＡの百分率は、プルダウン効率変動量を制御するための共変量として含めた
。ペアワイズ対比を組織種の各対について評価し、上位１５０及び下位１５０のＤＭＲを
エラスティックネット分類器訓練及び癌種特異性の検証のために選択した。性能測定基準
は、交差検証における最高κ値を有するモデル、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙらにおいて以
前に用いられたヒューリスティクス［１０］から、ｏｕｔ－ｏｆ－ｆｏｌｄ（データ外の
データ）のコールについてのクラス多数決（ｍａｊｏｒｉｔｙ ｃｌａｓｓ ｖｏｔｅ）
によって導かれた。
ｃｆＤＮＡ ＭｅＤＩＰプロファイルを、ＭＥＤＩＰＳ Ｒパッケージ［８］を使用し
て定量し、ＲＰＫＭに換算し、その後、ｌｏｇ２カウントパーミリオン（ｃｏｕｎｔｓ－
ｐｅｒ－ｍｉｌｌｉｏｎ）に変換した。その後、線形モデルを、ＦＡＮＴＯＭ５エンハン
サー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア及びＣｐＧシェルフにマッピングした特徴のマト
リクス上でｌｉｍｍａ－ｔｒｅｎｄ［９］を使用してフィッティングした。回収した添加
メチル化ＤＮＡの百分率は、プルダウン効率変動量を制御するための共変量として含めた
。ペアワイズ対比を組織種の各対について評価し、上位１５０及び下位１５０のＤＭＲを
エラスティックネット分類器訓練及び癌種特異性の検証のために選択した。性能測定基準
は、交差検証における最高κ値を有するモデル、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙらにおいて以
前に用いられたヒューリスティクス［１０］から、ｏｕｔ－ｏｆ－ｆｏｌｄ（データ外の
データ）のコールについてのクラス多数決（ｍａｊｏｒｉｔｙ ｃｌａｓｓ ｖｏｔｅ）
によって導かれた。
【0073】
分類精度の評価のための機械学習分析
モデル訓練及び発見コホート上での評価
高い計算コストをかけずに腫瘍分類におけるｃｆＭｅＤＩＰデータの性能を評価するた
めに、本発明者らは、可能性のある候補特徴量の初期セットを、ＣｐＧアイランド、ショ
ア、シェルフ及びＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー（本明細書中では「規制特徴量」とラベル
する）を包含するウィンドウ（範囲）に限縮し、１９６個の試料及び５０５，０２７個の
特徴量のマトリクスを得た。本発明者らは、次に、ｃａｒｅｔ Ｒパッケージを使用して
、発見コホートデータを８０％－２０％方式で５０の独立の訓練セット及びテストセット
に分割した（図２Ａ）。この分割を行ったが、発見コホートにわたるクラス割合を維持し
た。次いで、本発明者らは、各クラス対他クラスについてｌｉｍｍａ－ｔｒｅｎｄを使用
して、訓練データパーティションでの調整ｔ統計量（１５０過剰メチル化、１５０低メチ
ル化）により上位３００のＤＭＲを選択した。次に、Ｃｏｈｅｎ（コーエン）のκ（カッ
パ）を性能測定基準として使用して、混合パラメータの値（α（アルファ）、値＝０、０
．２、０．５、０．８及び１）及びペナルティ（λ（ラムダ）、値＝０．０１の増分で０
～０．０５）を最適化するために、これらのＤＭＲを使用して（最大３００ＤＭＲ×７個
の他クラス＝２１００特徴量）、１０分割交差検証（ＣＶ）の３回の反復の使用により二
項ＧＬＭｎｅｔを訓練した。各訓練セットについて、これは、一群の６つの１クラス対他
クラスの二項分類器を与えた。
モデル訓練及び発見コホート上での評価
高い計算コストをかけずに腫瘍分類におけるｃｆＭｅＤＩＰデータの性能を評価するた
めに、本発明者らは、可能性のある候補特徴量の初期セットを、ＣｐＧアイランド、ショ
ア、シェルフ及びＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー（本明細書中では「規制特徴量」とラベル
する）を包含するウィンドウ（範囲）に限縮し、１９６個の試料及び５０５，０２７個の
特徴量のマトリクスを得た。本発明者らは、次に、ｃａｒｅｔ Ｒパッケージを使用して
、発見コホートデータを８０％－２０％方式で５０の独立の訓練セット及びテストセット
に分割した（図２Ａ）。この分割を行ったが、発見コホートにわたるクラス割合を維持し
た。次いで、本発明者らは、各クラス対他クラスについてｌｉｍｍａ－ｔｒｅｎｄを使用
して、訓練データパーティションでの調整ｔ統計量（１５０過剰メチル化、１５０低メチ
ル化）により上位３００のＤＭＲを選択した。次に、Ｃｏｈｅｎ（コーエン）のκ（カッ
パ）を性能測定基準として使用して、混合パラメータの値（α（アルファ）、値＝０、０
．２、０．５、０．８及び１）及びペナルティ（λ（ラムダ）、値＝０．０１の増分で０
～０．０５）を最適化するために、これらのＤＭＲを使用して（最大３００ＤＭＲ×７個
の他クラス＝２１００特徴量）、１０分割交差検証（ＣＶ）の３回の反復の使用により二
項ＧＬＭｎｅｔを訓練した。各訓練セットについて、これは、一群の６つの１クラス対他
クラスの二項分類器を与えた。
【0074】
次に、本発明者らは、ＡＵＲＯＣ（受信者動作特性曲線下部面積）を使用して、ホール
ドアウトテストセットで分類性能を推定した。これらの推定値は、分類の不偏尺度を表す
。というのも、このホールドアウトテストセット試料は、ＤＭＲ事前選択にもＧＬＭｎｅ
ｔの訓練及びチューニングにも使用されなかったからである。上記５０個の独立の訓練セ
ット及びテストセットも、訓練セットバイアスに起因して楽観的推定の最小化を可能にし
た。
ドアウトテストセットで分類性能を推定した。これらの推定値は、分類の不偏尺度を表す
。というのも、このホールドアウトテストセット試料は、ＤＭＲ事前選択にもＧＬＭｎｅ
ｔの訓練及びチューニングにも使用されなかったからである。上記５０個の独立の訓練セ
ット及びテストセットも、訓練セットバイアスに起因して楽観的推定の最小化を可能にし
た。
【0075】
検証コホートでのモデル評価
各検証コホートｃｆＭｅＤＩＰ試料について、本発明者らは、上記発見コホート内の上
記５０個の異なる訓練セットで訓練したＡＭＬ、ＬＵＣ及び健常の一対他の二項分類器に
ついてクラス確率を推定した。上記５０個のモデルからの確率を平均して単一スコアを生
成し、この単一スコアを次にＡＵＲＯＣ推定のために使用した。本発明者らは、早期ＬＵ
Ｃ試料（ステージＩ及びＩＩ）又は末期ＬＵＣ試料（ステージＩＩＩ及びＩＶ）のいずれ
かが一対他分類器のために残されたときにＡＵＲＯＣを推定することにより、疾患のステ
ージが性能に影響を及ぼすかも評価した。
各検証コホートｃｆＭｅＤＩＰ試料について、本発明者らは、上記発見コホート内の上
記５０個の異なる訓練セットで訓練したＡＭＬ、ＬＵＣ及び健常の一対他の二項分類器に
ついてクラス確率を推定した。上記５０個のモデルからの確率を平均して単一スコアを生
成し、この単一スコアを次にＡＵＲＯＣ推定のために使用した。本発明者らは、早期ＬＵ
Ｃ試料（ステージＩ及びＩＩ）又は末期ＬＵＣ試料（ステージＩＩＩ及びＩＶ）のいずれ
かが一対他分類器のために残されたときにＡＵＲＯＣを推定することにより、疾患のステ
ージが性能に影響を及ぼすかも評価した。
【0076】
結果と考察
本発明者らは、０．００１％～１０％まで異なる割合のｃｔＤＮＡを有する混合物を生
物情報学的にシミュレーションした（図１Ａ、列の面）。本発明者らは、ｃｔＤＮＡが１
、１０、１００、１０００、又は１００００のＤＭＲ（可変メチル化領域）を有する状況
も健常のｃｆＤＮＡと比べてシミュレーションした（図１Ａ、行の面）。次いで、リード
を様々なシークエンシング深度で各遺伝子座においてサンプリングした（１０×、１００
×、１０００×、及び１００００×）（図１Ａ、ｘ軸）。本発明者らは、癌ｃｔＤＮＡの
存在量が少なく、カバレッジが浅いときでも、ＤＭＲ数が増加すると少なくとも１つの癌
特異的イベントの検出確率が高くなることを見出した（図１Ａ）。
本発明者らは、０．００１％～１０％まで異なる割合のｃｔＤＮＡを有する混合物を生
物情報学的にシミュレーションした（図１Ａ、列の面）。本発明者らは、ｃｔＤＮＡが１
、１０、１００、１０００、又は１００００のＤＭＲ（可変メチル化領域）を有する状況
も健常のｃｆＤＮＡと比べてシミュレーションした（図１Ａ、行の面）。次いで、リード
を様々なシークエンシング深度で各遺伝子座においてサンプリングした（１０×、１００
×、１０００×、及び１００００×）（図１Ａ、ｘ軸）。本発明者らは、癌ｃｔＤＮＡの
存在量が少なく、カバレッジが浅いときでも、ＤＭＲ数が増加すると少なくとも１つの癌
特異的イベントの検出確率が高くなることを見出した（図１Ａ）。
【0077】
さらに、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からのｐａｎ
－ｃａｎｃｅｒデータは、事実上すべての腫瘍型にわたって腫瘍組織と健常組織との間に
多くのＤＭＲを示した［１１］。それゆえ、これらの知見は、癌特異的ＤＮＡメチル化異
常をｃｔＤＮＡから成功裏に回収するアッセイが、低配列決定関連コストで悪性疾患を検
出、分類及び追跡するための非常に感度が高いツールとして役立つことができることを強
調した。
－ｃａｎｃｅｒデータは、事実上すべての腫瘍型にわたって腫瘍組織と健常組織との間に
多くのＤＭＲを示した［１１］。それゆえ、これらの知見は、癌特異的ＤＮＡメチル化異
常をｃｔＤＮＡから成功裏に回収するアッセイが、低配列決定関連コストで悪性疾患を検
出、分類及び追跡するための非常に感度が高いツールとして役立つことができることを強
調した。
【0078】
しかしながら、血漿ｃｆＤＮＡ中のＤＮＡメチル化の全ゲノムマッピングは、循環中の
ＤＮＡの非常に少ない量及び断片化に起因して困難である［１２］。結果として、ｃｆＤ
ＮＡのメチル化プロファイリングに向けたこれまで試みは、結直腸癌スクリーニングのた
めのＦＤＡ承認のＳＥＰＴ９メチル化アッセイ［１３］等、主に遺伝子座特異的なＰＣＲ
ベースのアッセイに限られてきた［２、３］。最近の試みは、断片化されたｃｆＤＮＡの
ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを実施するため
になされているが［１４～１６］、ＣｐＧの低い全ゲノム存在量は、配列決定から入手で
きる有用なメチル化関連情報の量を減らす可能性が高い。それゆえ、血漿ＤＮＡに対する
ＷＧＢＳに関する主な問題は、高コストであり、低効率であり、そして亜硫酸水素塩変換
に伴うＤＮＡの損失である。他方、メチル化しやすいＣｐＧリッチな特徴を選択的に濃縮
する方法は、リードあたりに利用可能な有用な情報の量を最大にし、コストを下げ、ＤＮ
Ａ損失を減らす可能性が高い。
ＤＮＡの非常に少ない量及び断片化に起因して困難である［１２］。結果として、ｃｆＤ
ＮＡのメチル化プロファイリングに向けたこれまで試みは、結直腸癌スクリーニングのた
めのＦＤＡ承認のＳＥＰＴ９メチル化アッセイ［１３］等、主に遺伝子座特異的なＰＣＲ
ベースのアッセイに限られてきた［２、３］。最近の試みは、断片化されたｃｆＤＮＡの
ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを実施するため
になされているが［１４～１６］、ＣｐＧの低い全ゲノム存在量は、配列決定から入手で
きる有用なメチル化関連情報の量を減らす可能性が高い。それゆえ、血漿ＤＮＡに対する
ＷＧＢＳに関する主な問題は、高コストであり、低効率であり、そして亜硫酸水素塩変換
に伴うＤＮＡの損失である。他方、メチル化しやすいＣｐＧリッチな特徴を選択的に濃縮
する方法は、リードあたりに利用可能な有用な情報の量を最大にし、コストを下げ、ＤＮ
Ａ損失を減らす可能性が高い。
【0079】
ｃｆＤＮＡメチル化マッピングに好適な全ゲノム方法
本発明者らは、セルフリーＤＮＡを使用して全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングを行う
ための、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ（セルフリーのメチル化ＤＮＡ免疫沈降及び高スループ
ット配列決定）と呼ぶ新しい方法を開発した。ここで記載するｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ方
法は、本発明者らの経験では１００ｎｇのインプットＤＮＡまで非常に堅牢である既存の
低インプットＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコル［７］の改変によって開発された。しかしな
がら、血漿試料の大部分は、１００ｎｇよりはるかに少ないＤＮＡを与える。この難題を
克服するために、本発明者らは、開始ＤＮＡの量を１００ｎｇまで人為的に高めるために
、外来λＤＮＡ（フィラーＤＮＡ）をアダプターライゲーションしたｃｆＤＮＡライブラ
リに添加した。これは、抗体による非特異的結合の量を最少にし、プラスチック製品との
結合のために失われるＤＮＡの量も最少にする。フィラーＤＮＡは、アダプターライゲー
ションしたｃｆＤＮＡライブラリにサイズが類似した増幅産物からなり、異なるＣｐＧ密
度の非メチル化ＤＮＡ及びインビトロメチル化ＤＮＡで構成された。異なる患者は異なる
量のｃｆＤＮＡを与えることになるので、このフィラーＤＮＡの添加は実用にも役立ち、
インプットＤＮＡ量を１００ｎｇに規準化することが可能になる。これによって、利用可
能なｃｆＤＮＡの量にかかわらず、すべての試料について下流のプロトコルが全く同じの
ままであるということが確保される。
本発明者らは、セルフリーＤＮＡを使用して全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングを行う
ための、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ（セルフリーのメチル化ＤＮＡ免疫沈降及び高スループ
ット配列決定）と呼ぶ新しい方法を開発した。ここで記載するｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ方
法は、本発明者らの経験では１００ｎｇのインプットＤＮＡまで非常に堅牢である既存の
低インプットＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコル［７］の改変によって開発された。しかしな
がら、血漿試料の大部分は、１００ｎｇよりはるかに少ないＤＮＡを与える。この難題を
克服するために、本発明者らは、開始ＤＮＡの量を１００ｎｇまで人為的に高めるために
、外来λＤＮＡ（フィラーＤＮＡ）をアダプターライゲーションしたｃｆＤＮＡライブラ
リに添加した。これは、抗体による非特異的結合の量を最少にし、プラスチック製品との
結合のために失われるＤＮＡの量も最少にする。フィラーＤＮＡは、アダプターライゲー
ションしたｃｆＤＮＡライブラリにサイズが類似した増幅産物からなり、異なるＣｐＧ密
度の非メチル化ＤＮＡ及びインビトロメチル化ＤＮＡで構成された。異なる患者は異なる
量のｃｆＤＮＡを与えることになるので、このフィラーＤＮＡの添加は実用にも役立ち、
インプットＤＮＡ量を１００ｎｇに規準化することが可能になる。これによって、利用可
能なｃｆＤＮＡの量にかかわらず、すべての試料について下流のプロトコルが全く同じの
ままであるということが確保される。
【0080】
本発明者らは、まず、ｃｆＤＮＡで認められたものと類似の断片サイズに剪断されたヒ
ト結直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６からのＤＮＡを使用して、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロト
コルを検証した。公的なＤＮＡメチル化データが利用可能であるため、ＨＣＴ１１６を選
んだ。本発明者らは、１００ｎｇの剪断細胞系ＤＮＡを使用する至適基準（ゴールドスタ
ンダード）ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコル［７］と１０ｎｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの同じ剪
断細胞系ＤＮＡを使用するｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコルを同時に実施した。これを
２つの生物的複製物において実施した。すべての条件で、本発明者らは、９９％超の反応
特異度（１－［添加非メチル化対照ＤＮＡの回収／添加メチル化対照ＤＮＡの回収］）、
及び非メチル化領域（ＧＡＰＤＨ）に対する既知のメチル化領域（ＴＳＨ２Ｂ０）の非常
に高い濃縮を得た（図６Ｂ）。
ト結直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６からのＤＮＡを使用して、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロト
コルを検証した。公的なＤＮＡメチル化データが利用可能であるため、ＨＣＴ１１６を選
んだ。本発明者らは、１００ｎｇの剪断細胞系ＤＮＡを使用する至適基準（ゴールドスタ
ンダード）ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコル［７］と１０ｎｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの同じ剪
断細胞系ＤＮＡを使用するｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコルを同時に実施した。これを
２つの生物的複製物において実施した。すべての条件で、本発明者らは、９９％超の反応
特異度（１－［添加非メチル化対照ＤＮＡの回収／添加メチル化対照ＤＮＡの回収］）、
及び非メチル化領域（ＧＡＰＤＨ）に対する既知のメチル化領域（ＴＳＨ２Ｂ０）の非常
に高い濃縮を得た（図６Ｂ）。
【0081】
上記ライブラリを、約３０００～７０００万リード／ライブラリ（補遺の表１）で飽和
まで配列決定した（図６Ａ）。生のリードをヒトゲノム及び上記λゲノムの両方と整列さ
せ、λゲノムと事実上アラインメントがないことが判明した（補遺の表１）。それゆえ、
フィラーＤＮＡとしての外来λＤＮＡの添加は、配列決定データの生成を妨げなかった。
最後に、本発明者らは、免疫沈降工程の品質管理手段としてＣｐＧ濃縮スコアを計算する
［８］。すべてのライブラリはＣｐＧに対して類似の濃縮を示したが、インプット対照は
、予想通り、濃縮を示さず（図６Ｃ）、極低インプット（１ｎｇ）でも本発明者らの免疫
沈降の有効性を確認した。
まで配列決定した（図６Ａ）。生のリードをヒトゲノム及び上記λゲノムの両方と整列さ
せ、λゲノムと事実上アラインメントがないことが判明した（補遺の表１）。それゆえ、
フィラーＤＮＡとしての外来λＤＮＡの添加は、配列決定データの生成を妨げなかった。
最後に、本発明者らは、免疫沈降工程の品質管理手段としてＣｐＧ濃縮スコアを計算する
［８］。すべてのライブラリはＣｐＧに対して類似の濃縮を示したが、インプット対照は
、予想通り、濃縮を示さず（図６Ｃ）、極低インプット（１ｎｇ）でも本発明者らの免疫
沈降の有効性を確認した。
【0082】
異なるインプットＤＮＡレベルを比較する全ゲノム相関推定によれば、ＭｅＤＩＰ－ｓ
ｅｑ（１００ｎｇ）法とｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ（１０、５及び１ｎｇ）法の両方が極め
て堅牢であり、ピアソン相関が任意の２つの生物的複製物間で少なくとも０．９４であっ
た（図１Ｂ）。この分析の更に示すところによれば、５ｎｇ及び１０ｎｇのインプットＤ
ＮＡにおけるｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑは、従来のＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって１００ｎｇ
で得られるメチル化プロファイルを堅牢に再現することができる（少なくとも０．９のペ
アワイズピアソン相関）（図１Ｂ）。１ｎｇのインプットＤＮＡにおけるｃｆＭｅＤＩＰ
－ｓｅｑの性能は、１００ｎｇにおけるＭｅＤＩＰ－ｓｅｑと比べて低下するが、それで
も＞０．７の強いピアソン相関を示す（図１Ｂ）。本発明者らは、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅ
ｑプロトコルが、至適基準であるＲｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉ
ｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）及びＷｈｏｌｅ－Ｇｅｎｏｍｅ Ｂ
ｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＷＧＢＳ）を用いたＨＣＴ１１６のＤＮＡメ
チル化プロファイルを再現することも認めた（図１Ｃ）。要するに、本発明者らのデータ
が示唆するところによれば、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑは、循環ｃｆＤＮＡ等の断片化され
た低インプットＤＮＡ材料の全ゲノムメチル化マッピングの堅牢なプロトコルである。
ｅｑ（１００ｎｇ）法とｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ（１０、５及び１ｎｇ）法の両方が極め
て堅牢であり、ピアソン相関が任意の２つの生物的複製物間で少なくとも０．９４であっ
た（図１Ｂ）。この分析の更に示すところによれば、５ｎｇ及び１０ｎｇのインプットＤ
ＮＡにおけるｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑは、従来のＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって１００ｎｇ
で得られるメチル化プロファイルを堅牢に再現することができる（少なくとも０．９のペ
アワイズピアソン相関）（図１Ｂ）。１ｎｇのインプットＤＮＡにおけるｃｆＭｅＤＩＰ
－ｓｅｑの性能は、１００ｎｇにおけるＭｅＤＩＰ－ｓｅｑと比べて低下するが、それで
も＞０．７の強いピアソン相関を示す（図１Ｂ）。本発明者らは、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅ
ｑプロトコルが、至適基準であるＲｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉ
ｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）及びＷｈｏｌｅ－Ｇｅｎｏｍｅ Ｂ
ｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＷＧＢＳ）を用いたＨＣＴ１１６のＤＮＡメ
チル化プロファイルを再現することも認めた（図１Ｃ）。要するに、本発明者らのデータ
が示唆するところによれば、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑは、循環ｃｆＤＮＡ等の断片化され
た低インプットＤＮＡ材料の全ゲノムメチル化マッピングの堅牢なプロトコルである。
【0083】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑは、腫瘍由来のｃｔＤＮＡの検出で高感度を示す
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコルの感度を評価するために、本発明者らは、結直腸癌
（ＣＲＣ）ＨＣＴ１１６細胞系ＤＮＡを多発性骨髄腫（ＭＭ）ＭＭ１．Ｓ細胞系ＤＮＡに
段階希釈した。どちらもｃｆＤＮＡサイズを模倣するように剪断した。本発明者らは、Ｃ
ＲＣ ＤＮＡを１００％、１０％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％から０％
に希釈し、これらの希釈物の各々についてｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを行った。本発明者ら
は、同じ試料における３点変異の検出のために超深度（１０，０００×中央値（メジアン
）カバレッジ）標的配列決定も行った。５％偽陽性率（ＦＤＲ：Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏ
ｖｅｒｙ ｒａｔｅ）閾値を用いた、純粋ＭＭ ＤＮＡに対する各ＣＲＣ希釈ポイントで
特定されたＤＭＲの観察数は、希釈倍率に基づくＤＭＲの予想数と０．００１％希釈まで
ほぼ完全に線形（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）であった（図１Ｄ）。さらに、こ
れらのＤＭＲ内のＤＮＡメチル化シグナルも、観察対予想シグナルでほぼ完全な線形性を
示す（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）（図１Ｅ；補遺の表２Ｂ）。それに対して、
１％希釈を超えると、超深度標的配列決定は、ＰＣＲ又は配列決定誤差のために、ＣＲＣ
特異的変異体と偽変異体を確実に見分けることができなかった（図１Ｆ；補遺の表２Ａ）
。従って、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑは、癌由来のＤＮＡの検出感度に優れ、標準プロトコ
ルを用いた超深度標的配列決定による変異体検出の性能を超える。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコルの感度を評価するために、本発明者らは、結直腸癌
（ＣＲＣ）ＨＣＴ１１６細胞系ＤＮＡを多発性骨髄腫（ＭＭ）ＭＭ１．Ｓ細胞系ＤＮＡに
段階希釈した。どちらもｃｆＤＮＡサイズを模倣するように剪断した。本発明者らは、Ｃ
ＲＣ ＤＮＡを１００％、１０％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％から０％
に希釈し、これらの希釈物の各々についてｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを行った。本発明者ら
は、同じ試料における３点変異の検出のために超深度（１０，０００×中央値（メジアン
）カバレッジ）標的配列決定も行った。５％偽陽性率（ＦＤＲ：Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏ
ｖｅｒｙ ｒａｔｅ）閾値を用いた、純粋ＭＭ ＤＮＡに対する各ＣＲＣ希釈ポイントで
特定されたＤＭＲの観察数は、希釈倍率に基づくＤＭＲの予想数と０．００１％希釈まで
ほぼ完全に線形（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）であった（図１Ｄ）。さらに、こ
れらのＤＭＲ内のＤＮＡメチル化シグナルも、観察対予想シグナルでほぼ完全な線形性を
示す（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）（図１Ｅ；補遺の表２Ｂ）。それに対して、
１％希釈を超えると、超深度標的配列決定は、ＰＣＲ又は配列決定誤差のために、ＣＲＣ
特異的変異体と偽変異体を確実に見分けることができなかった（図１Ｆ；補遺の表２Ａ）
。従って、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑは、癌由来のＤＮＡの検出感度に優れ、標準プロトコ
ルを用いた超深度標的配列決定による変異体検出の性能を超える。
【0084】
癌ＤＮＡは、ＣｐＧリッチ領域において頻繁に過剰メチル化される［１７］。ｃｆＭｅ
ＤＩＰ－ｓｅｑはメチル化ＣｐＧリッチ配列を特異的に標的にするので、本発明者らは、
ｃｔＤＮＡが免疫沈降手順中に優先的に濃縮されると仮定した。これを試験するために、
本発明者らは、２人の結直腸癌患者から患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）を生成し、マウ
ス血漿を収集した。腫瘍由来のヒトｃｆＤＮＡは、インプット試料中の総ｃｆＤＮＡプー
ル内で１％未満の頻度で存在し、免疫沈降後２倍の存在量で存在した（図１Ｇ；補遺の表
３）。これらの結果の示唆するところによれば、ｃｔＤＮＡの偏りのある配列決定によっ
て、ｃｆＭｅＤＩＰ手順は、ｃｔＤＮＡ検出感度を更に増加させることができた。
ＤＩＰ－ｓｅｑはメチル化ＣｐＧリッチ配列を特異的に標的にするので、本発明者らは、
ｃｔＤＮＡが免疫沈降手順中に優先的に濃縮されると仮定した。これを試験するために、
本発明者らは、２人の結直腸癌患者から患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）を生成し、マウ
ス血漿を収集した。腫瘍由来のヒトｃｆＤＮＡは、インプット試料中の総ｃｆＤＮＡプー
ル内で１％未満の頻度で存在し、免疫沈降後２倍の存在量で存在した（図１Ｇ；補遺の表
３）。これらの結果の示唆するところによれば、ｃｔＤＮＡの偏りのある配列決定によっ
て、ｃｆＭｅＤＩＰ手順は、ｃｔＤＮＡ検出感度を更に増加させることができた。
【0085】
循環血漿ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルは複数の癌種と健康な提供者とを見分けるこ
とができる
ＤＮＡメチル化パターンは、組織特異的であり、多くの他の癌種の中でもとりわけ、神
経膠芽腫［１８］、上衣腫［６］、結直腸癌［１９］、及び乳癌［２０、２１］において
癌患者を臨床的に関連する疾患部分群へと階層化するために使用されてきた。本発明者ら
は、ｃｆＤＮＡ関連プロファイルが複数の腫瘍型に対して原発組織を特定するために使用
することができるのではないかと疑問を持った。この目的のために、本発明者らは、５つ
の異なる腫瘍型由来の１９６個の試料及び早期及び末期の腫瘍由来の健常対照の特性を明
らかにした。本発明者らは、線形モデル化を使用して、各一対比較のために、ＣｐＧショ
ア、シェルフ、アイランド及びＦＡＮＴＯＭ５エンハンサーへの上位３００のＤＭＲのマ
ッピングを特定し、全体で２，１００個のユニークなＤＭＲを導いた（図２Ａ）。これら
の特徴量のメチル化状態に基づく上記１９６個の血漿試料のｔ分布型確率的近傍埋め込み
（ｔＳＮＥ）［２２］に基づく密度クラスタ分析により、原発組織及び腫瘍型に基づく試
料の別個のクラスタリングが明らかになった（図２Ｂ、図２Ｃ）。これらの特徴量とのエ
ラスティックネット多癌分類器フィット（図２Ａ）を使用して、本発明者らは、異なる腫
瘍型の間の非常に正確な区別を観察した（図２Ｄ）。
とができる
ＤＮＡメチル化パターンは、組織特異的であり、多くの他の癌種の中でもとりわけ、神
経膠芽腫［１８］、上衣腫［６］、結直腸癌［１９］、及び乳癌［２０、２１］において
癌患者を臨床的に関連する疾患部分群へと階層化するために使用されてきた。本発明者ら
は、ｃｆＤＮＡ関連プロファイルが複数の腫瘍型に対して原発組織を特定するために使用
することができるのではないかと疑問を持った。この目的のために、本発明者らは、５つ
の異なる腫瘍型由来の１９６個の試料及び早期及び末期の腫瘍由来の健常対照の特性を明
らかにした。本発明者らは、線形モデル化を使用して、各一対比較のために、ＣｐＧショ
ア、シェルフ、アイランド及びＦＡＮＴＯＭ５エンハンサーへの上位３００のＤＭＲのマ
ッピングを特定し、全体で２，１００個のユニークなＤＭＲを導いた（図２Ａ）。これら
の特徴量のメチル化状態に基づく上記１９６個の血漿試料のｔ分布型確率的近傍埋め込み
（ｔＳＮＥ）［２２］に基づく密度クラスタ分析により、原発組織及び腫瘍型に基づく試
料の別個のクラスタリングが明らかになった（図２Ｂ、図２Ｃ）。これらの特徴量とのエ
ラスティックネット多癌分類器フィット（図２Ａ）を使用して、本発明者らは、異なる腫
瘍型の間の非常に正確な区別を観察した（図２Ｄ）。
【0086】
疾患亜型の区別
本発明者らは、ｃｆＤＮＡ ＭｅＤＩＰプロファイルが、５つの別個のケース － 遺
伝子発現パターン（乳癌におけるＥＲ状態）、コピー数異常（乳癌におけるＨＥＲ２状態
）、再構成（ＡＭＬにおけるＦＬＴ３ ＩＴＤ状態）、点変異（ＧＢＭにおけるＩＤＨ変
異）、及び最後に肺癌における組織学 － における疾患亜型を区別する能力を評価した
。いずれの場合も、線形モデルを使用して、これまでに記載したように特徴を選択しラン
ク付けした。いずれの場合も、階層的クラスタ分析を使用して、試料のグループ分けを評
価した。選択した特徴量のメチル化状態に基づくｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ
）［２２］に基づく密度クラスタ分析により、癌亜型分類のこれらの５つの別個の例の各
々に基づく試料の別個のクラスタリングが明らかになった。
本発明者らは、ｃｆＤＮＡ ＭｅＤＩＰプロファイルが、５つの別個のケース － 遺
伝子発現パターン（乳癌におけるＥＲ状態）、コピー数異常（乳癌におけるＨＥＲ２状態
）、再構成（ＡＭＬにおけるＦＬＴ３ ＩＴＤ状態）、点変異（ＧＢＭにおけるＩＤＨ変
異）、及び最後に肺癌における組織学 － における疾患亜型を区別する能力を評価した
。いずれの場合も、線形モデルを使用して、これまでに記載したように特徴を選択しラン
ク付けした。いずれの場合も、階層的クラスタ分析を使用して、試料のグループ分けを評
価した。選択した特徴量のメチル化状態に基づくｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ
）［２２］に基づく密度クラスタ分析により、癌亜型分類のこれらの５つの別個の例の各
々に基づく試料の別個のクラスタリングが明らかになった。
【0087】
機械学習を用いる癌の検出及び癌種の分類
ｃｆＭｅＤＩＰプロファイルが癌を検出しさらに癌種を分類する能力を厳密に評価する
ために、本発明者らは、次に、本発明者らの発見コホートで一連の機械学習分析を行った
。高速の計算解析を可能にするために、本発明者らは、最初に、本発明者らのｃｆＭｅＤ
ＩＰ発見コホートをＣｐＧアイランド、ショア、シェルフ及びＦＡＮＴＯＭ５エンハンサ
ー（ｎ＝５０５，０２７ウィンドウ）への特徴量マッピングに限縮した。本発明者らは、
次に、本発明者らの発見コホート試料で、訓練セットバイアスを考慮しつつ、性能の不偏
推定量を誘導するための戦略を実行した。
ｃｆＭｅＤＩＰプロファイルが癌を検出しさらに癌種を分類する能力を厳密に評価する
ために、本発明者らは、次に、本発明者らの発見コホートで一連の機械学習分析を行った
。高速の計算解析を可能にするために、本発明者らは、最初に、本発明者らのｃｆＭｅＤ
ＩＰ発見コホートをＣｐＧアイランド、ショア、シェルフ及びＦＡＮＴＯＭ５エンハンサ
ー（ｎ＝５０５，０２７ウィンドウ）への特徴量マッピングに限縮した。本発明者らは、
次に、本発明者らの発見コホート試料で、訓練セットバイアスを考慮しつつ、性能の不偏
推定量を誘導するための戦略を実行した。
【0088】
本実施例では、本発明者らは、発見コホートをバランスよく訓練セット及びテストセッ
トに分割した（８０％訓練セット、２０％テストセット）。上記訓練セットの試料のみを
使用して、本発明者らは、ｌｉｍｍａ－ｔｒｅｎｄ検定統計量に基づいて、各クラス（試
料の種類）対他クラスに対して上位３００のＤＭＲを選択し、上記訓練セットのデータ上
でこれらの特徴量を使用して一連の一対他クラスＧＬＭｎｅｔを訓練した。訓練手順は、
Ｃｏｈｅｎのκに対して最適化したα及びλの値のグリッドにわたる３ラウンドの１０分
割交差検証（ＣＶ）からなっていた。多ラウンドの１０分割ＣＶの使用は、より一般化可
能なモデルチューニングのためにさらなるランダム化を活用したいという考えに動機づけ
られたものであった。
トに分割した（８０％訓練セット、２０％テストセット）。上記訓練セットの試料のみを
使用して、本発明者らは、ｌｉｍｍａ－ｔｒｅｎｄ検定統計量に基づいて、各クラス（試
料の種類）対他クラスに対して上位３００のＤＭＲを選択し、上記訓練セットのデータ上
でこれらの特徴量を使用して一連の一対他クラスＧＬＭｎｅｔを訓練した。訓練手順は、
Ｃｏｈｅｎのκに対して最適化したα及びλの値のグリッドにわたる３ラウンドの１０分
割交差検証（ＣＶ）からなっていた。多ラウンドの１０分割ＣＶの使用は、より一般化可
能なモデルチューニングのためにさらなるランダム化を活用したいという考えに動機づけ
られたものであった。
【0089】
次に、（ＤＭＲ選択工程及びその後のＧＬＭｎｅｔ訓練／チューニング工程のあいだホ
ールドアウトした）テストセット試料に由来するＡＵＲＯＣ（受信者動作特性曲線下部面
積）を使用して性能を評価した。訓練セットバイアスの影響を緩和するために、このプロ
セスを、発見コホートの訓練セット及びテストセットへの５０個の異なる分割を用いて繰
り返した。これは、結果的に、各一対他クラス比較に対して５０個のモデル（全部で４８
０個のモデル）のコレクションを生じた。ここでは、本発明者らは、このモデルのコレク
ションをＥ５０と称する。
ールドアウトした）テストセット試料に由来するＡＵＲＯＣ（受信者動作特性曲線下部面
積）を使用して性能を評価した。訓練セットバイアスの影響を緩和するために、このプロ
セスを、発見コホートの訓練セット及びテストセットへの５０個の異なる分割を用いて繰
り返した。これは、結果的に、各一対他クラス比較に対して５０個のモデル（全部で４８
０個のモデル）のコレクションを生じた。ここでは、本発明者らは、このモデルのコレク
ションをＥ５０と称する。
【0090】
その後、本発明者らは、追加の１５２の血漿試料：ＡＭＬ（ｎ＝３５）、肺癌（ｎ＝５
５）及び健康な対照（ｎ＝６２）の試料の検証コホート、を生成することによりバッチ間
で性能を評価した。各クラスに対して、本発明者らは、Ｅ５０において上記モデルにより
出力されたクラス確率を平均し、１クラス対すべての他クラスに対するＡＵＲＯＣを推定
した（図３Ａ）。この分類器は、ＡＭＬ対その他（０．９９３）、ＬＵＣ対その他（０．
９４３）及び健常対その他（１．０００）の分類に対して高いＡＵＲＯＣ値を示した。こ
のことは、機械学習手法と組み合わせたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑが腫瘍型を正確に検出し
分類する能力をさらに裏付けた。最後に、本発明者らは、この分類器が早期試料（０．９
５０）において末期試料（０．９３４）と同程度に正確であること（図３Ｂ）を観察し、
このことは、この手法が癌の早期検出並びに早期及び末期の両方で癌の検出に応用可能で
あるということを示唆した。
５）及び健康な対照（ｎ＝６２）の試料の検証コホート、を生成することによりバッチ間
で性能を評価した。各クラスに対して、本発明者らは、Ｅ５０において上記モデルにより
出力されたクラス確率を平均し、１クラス対すべての他クラスに対するＡＵＲＯＣを推定
した（図３Ａ）。この分類器は、ＡＭＬ対その他（０．９９３）、ＬＵＣ対その他（０．
９４３）及び健常対その他（１．０００）の分類に対して高いＡＵＲＯＣ値を示した。こ
のことは、機械学習手法と組み合わせたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑが腫瘍型を正確に検出し
分類する能力をさらに裏付けた。最後に、本発明者らは、この分類器が早期試料（０．９
５０）において末期試料（０．９３４）と同程度に正確であること（図３Ｂ）を観察し、
このことは、この手法が癌の早期検出並びに早期及び末期の両方で癌の検出に応用可能で
あるということを示唆した。
【0091】
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを用いるｃｆＤＮＡメチロームプロファイリングのさらなる利
点
ｃｆＤＮＡメチル化パターンが原発組織を正確に表す能力は、変異ベースのアッセイの
限界も克服し、原発組織に対する特異性は、異なる組織における癌にわたる多くの潜在的
なドライバー変異の再発性に起因して低い可能性がある［２３］。変異ベースのアッセイ
も、腫瘍のクローン構造により低感度になる可能性があり、サブクローナルドライバーは
ｃｔＤＮＡ中の低存在量のために検出しにくい可能性がある［２４］。変異ベースのｃｔ
ＤＮＡ手法は、良性組織におけるドライバー変異による潜在的な交絡に対しても脆弱であ
り、このことは観察されており［２５］、正の選択の根拠を提示すると文献に記載されて
いる［２６］。
点
ｃｆＤＮＡメチル化パターンが原発組織を正確に表す能力は、変異ベースのアッセイの
限界も克服し、原発組織に対する特異性は、異なる組織における癌にわたる多くの潜在的
なドライバー変異の再発性に起因して低い可能性がある［２３］。変異ベースのアッセイ
も、腫瘍のクローン構造により低感度になる可能性があり、サブクローナルドライバーは
ｃｔＤＮＡ中の低存在量のために検出しにくい可能性がある［２４］。変異ベースのｃｔ
ＤＮＡ手法は、良性組織におけるドライバー変異による潜在的な交絡に対しても脆弱であ
り、このことは観察されており［２５］、正の選択の根拠を提示すると文献に記載されて
いる［２６］。
【0092】
これらを合わせると、－ これまでに誘導されたうちで癌ｃｆＤＮＡメチロームの最大
のコレクションに基づく － 本発明者らの知見は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを、癌の管
理及び早期検出に影響を及ぼす潜在能力を有する効率的で費用効率が高いツールとして確
立する。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑの精度及び多用途性は、耐性がエピジェネティックな変
異に相関する状況、例えば前立腺癌におけるアンドロゲン受容体阻害への感受性［２７］
等における治療上の決定を伝えるために有用でありうる。早期の診断及びスクリーニング
に対する潜在的な機会は、肺癌において特に明らかである可能性がある。というのも、こ
の肺癌は、スクリーニングがすでに臨床上の有用性を示している疾患であり、既存のスク
リーニング試験（すなわち、低線量ＣＴスキャン）が電離放射線曝露及び高偽陽性率等の
重大な制限を有する疾患であるからである。
のコレクションに基づく － 本発明者らの知見は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを、癌の管
理及び早期検出に影響を及ぼす潜在能力を有する効率的で費用効率が高いツールとして確
立する。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑの精度及び多用途性は、耐性がエピジェネティックな変
異に相関する状況、例えば前立腺癌におけるアンドロゲン受容体阻害への感受性［２７］
等における治療上の決定を伝えるために有用でありうる。早期の診断及びスクリーニング
に対する潜在的な機会は、肺癌において特に明らかである可能性がある。というのも、こ
の肺癌は、スクリーニングがすでに臨床上の有用性を示している疾患であり、既存のスク
リーニング試験（すなわち、低線量ＣＴスキャン）が電離放射線曝露及び高偽陽性率等の
重大な制限を有する疾患であるからである。
【0093】
結論として、本発明者らの知見は、非侵襲性の、費用効率が高い、高感度の、非常に正
確な早期の腫瘍検出、多癌分類、及び癌亜型分類のための基礎としてのｃｆＤＮＡメチル
化プロファイルの有用性を強調する。
確な早期の腫瘍検出、多癌分類、及び癌亜型分類のための基礎としてのｃｆＤＮＡメチル
化プロファイルの有用性を強調する。
【0094】
本発明の好ましい実施形態が本願明細書に記載されたが、本発明の趣旨又は添付の特許
請求の範囲から逸脱せずに上記の実施形態に変更がなされてもよいことは当業者に理解さ
れよう。以下の参考文献リストにあるものを含め、本願明細書に開示されるすべての文献
は、参照により援用される。
請求の範囲から逸脱せずに上記の実施形態に変更がなされてもよいことは当業者に理解さ
れよう。以下の参考文献リストにあるものを含め、本願明細書に開示されるすべての文献
は、参照により援用される。
【0095】
【表1】
【0096】
【表2A】
【0097】
【表2B】
【0098】
【表3】
【0099】
参考文献リスト
１． Ｄｉａｚ，Ｌ．Ａ．，Ｊｒ．及びＡ．Ｂａｒｄｅｌｌｉ， Ｌｉｑｕｉｄ ｂｉ
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Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｍｅｔａ
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Ｏ２０１５６６２０８０頁。
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Ａ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ，２
０１４．２０（５）：５４８－５４頁。
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ｎ ｓｋｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５．３４８（６２３７）：８８０－６頁。
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ｉｎｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． ２０１６．２２（３）：２９８－３０５頁
。
【図1(1)】
【図1(2)】
【図1(3)】
【図1(4)】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5】
【図6(1)】
【図6(2)】
【図6(3)】
【図6(4)】
【図6(5)】
【図6(6)】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象が癌を有するか又は癌を有するリスクがあることを判定する方法であって、
（ａ）前記対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程であって、前記配列決定が亜硫酸水素塩変換を伴わない工程と、
（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、
（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９４％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記癌を有するか又は前記癌を有するリスクがあることを判定する工程と
を備える方法。
（ａ）前記対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程であって、前記配列決定が亜硫酸水素塩変換を伴わない工程と、
（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、
（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９４％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記癌を有するか又は前記癌を有するリスクがあることを判定する工程と
を備える方法。
【請求項2】
前記癌が、肺癌、乳癌、結直腸癌、急性骨髄性白血病、及び多形神経膠芽腫からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記癌が急性骨髄性白血病である請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＡＵＲＯＣが少なくとも９９％である請求項３に記載の方法。
【請求項5】
対象が特定のステージの癌を有するか又は特定のステージの癌を有するリスクがあることを判定する方法であって、
（ａ）前記対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程であって、前記配列決定が亜硫酸水素塩変換を伴わない工程と、
（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、
（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９３％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記特定のステージの前記癌を有するか又は前記特定のステージの前記癌を有するリスクがあることを判定する工程とを備える方法。
（ａ）前記対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程であって、前記配列決定が亜硫酸水素塩変換を伴わない工程と、
（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、
（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９３％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記特定のステージの前記癌を有するか又は前記特定のステージの前記癌を有するリスクがあることを判定する工程とを備える方法。
【請求項6】
前記癌が肺癌である請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記特定のステージが肺癌の早期である請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＡＵＲＯＣが少なくとも９５％である請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記特定のステージが肺癌の後期である請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記ＡＵＲＯＣが少なくとも９３％である請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記メチル化プロファイルが、前記複数の核酸分子の複数の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のメチル化レベルを含む請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項12】
前記ＤＭＲが過剰メチル化又は低メチル化を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ｃｆＤＮＡ試料をある量のフィラーＤＮＡと混合して、ＤＮＡ混合物試料を生成する工程をさらに備える請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項14】
前記ＤＮＡ混合物試料が、少なくとも５０ナノグラム（ｎｇ）である少なくともある量の総ＤＮＡを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記フィラーＤＮＡが少なくとも部分的にメチル化されており、５０ｂｐ～８００ｂｐの長さを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記ＤＮＡ混合物をインキュベーションして、前記ｃｆＤＮＡ試料の前記複数の核酸分子の少なくとも１以上のメチル化領域の濃縮倍率比を高める工程をさらに備える請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合するように構成された結合剤とともにインキュベーションする工程をさらに備え、前記結合剤が、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合するように構成された結合剤とともにインキュベーションする工程をさらに備え、前記結合剤が抗体を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理することが、健康な対照のメチル化プロファイルと比較すること、又は訓練された機械学習アルゴリズムを使用することを含む請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項20】
前記訓練された機械学習アルゴリズムが線形回帰を含む請求項１９に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0017】
一態様では、対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、上記試料をライブラリ調製に供して、引き続く上記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、第１量のフィラーＤＮＡを上記試料に加え、次いで任意選択的に上記試料を変性する工程であって、上記フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程とを備える方法が提供される。
一態様では、以下が提供される。
[項目１]
対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、
（ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、引き続く前記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、
（ｃ）第１量のフィラーＤＮＡを前記試料に加え、次いで任意選択的に前記試料を変性する工程であって、前記フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、
（ｅ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
（ｇ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と
を備える方法。
[項目２]
前記試料が、前記対象の血液又は血漿に由来する項目１に記載の方法。
[項目３]
比較工程（ｆ）が、統計的分類器を使用するフィットに基づく項目１又は項目２に記載の方法。
[項目４]
前記分類器が機械学習由来である項目３に記載の方法。
[項目５]
前記分類器が、エラスティックネット分類器、ｌａｓｓｏ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、又はニューラルネットワークである項目４に記載の方法。[項目６]
健康な個体及び癌性個体由来の前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、健康な個体と癌性個体との間の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる項目１から項目５のいずれか一項に記載の方法。
[項目７]
健康な個体及び癌性個体由来の前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、セルフリーＤＮＡ由来のＤＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されている対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列に限定される項目１から項目６のいずれか一項に記載の方法。
[項目８]
前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、血漿由来のＤＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されている項目７に記載の方法。
[項目９]
前記試料が、１００ｎｇ未満、７５ｎｇ未満、又は５０ｎｇ未満のセルフリーＤＮＡを有する項目１から項目８のいずれか一項に記載の方法。
[項目１０]
前記第１量のフィラーＤＮＡが、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み、残部が非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％、又は１５％～３０％がメチル化フィラーＤＮＡである項目１から項目９のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１]
前記第１量のフィラーＤＮＡが２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである項目１から項目９のいずれか一項に記載の方法。
[項目１２]
前記試料由来のセルフリーＤＮＡ及び前記第１量のフィラーＤＮＡが、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む項目１から項目１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１３]
前記フィラーＤＮＡが５０ｂｐ～８００ｂｐ長、好ましくは１００ｂｐ～６００ｂｐ長、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐ長である項目１から項目１２のいずれか一項に記載の方法。
[項目１４]
前記フィラーＤＮＡが二本鎖である項目１から項目１３のいずれか一項に記載の方法。
[項目１５]
前記フィラーＤＮＡがジャンクＤＮＡである項目１又は項目２に記載の方法。[項目１６]
前記フィラーＤＮＡが内在ＤＮＡ又は外来ＤＮＡである項目１から項目３のいずれか一項に記載の方法。
[項目１７]
前記フィラーＤＮＡが非ヒトＤＮＡ、好ましくはλＤＮＡである項目１６に記載の方法。
[項目１８]
前記フィラーＤＮＡがヒトＤＮＡに対するアラインメントを有しない項目１から項目１７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１９]
前記結合剤が、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である項目１から項目１８のいずれか一項に記載の方法。
[項目２０]
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である項目１から項目１９のいずれか一項に記載の方法。
[項目２１]
工程（ｄ）が、抗体を使用して前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む項目１から項目２０のいずれか一項に記載の方法。
[項目２２]
免疫沈降のために少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１６μｇの前記抗体を前記試料に加えることを含む項目２１に記載の方法。
[項目２３]
前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である項目２１に記載の方法。
[項目２４]
前記免疫沈降反応を確認するために、工程（ｃ）後に第２量の対照ＤＮＡを前記試料に加える工程をさらに備える項目２１に記載の方法。
[項目２５]
セルフリーのメチル化ＤＮＡの捕捉を確認するために、工程（ｃ）後に第２量の対照ＤＮＡを前記試料に加える工程をさらに備える項目１から項目２３のいずれか一項に記載の方法。
[項目２６]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程が、原発癌細胞組織を特定することをさらに備える項目１から項目２５のいずれか一項に記載の方法。
[項目２７]
前記原発癌細胞組織を特定することが、癌亜型を特定することをさらに備える項目２６に記載の方法。
[項目２８]
前記癌亜型が、ステージ、組織学、遺伝子発現パターン、コピー数異常、再構成、又は点変異状態に基づいて前記癌を識別する項目２７に記載の方法。
[項目２９]
工程（ｆ）の比較が全ゲノムにわたって実施される項目１から項目２８のいずれか一項に記載の方法。
[項目３０]
工程（ｆ）の比較が全ゲノムから特定の調節領域に限定される項目１から項目２８のいずれか一項に記載の方法。
[項目３１]
前記調節領域が、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧシェルフ、又はこれらのいずれかの組み合わせである項目３０に記載の方法。[項目３２]
工程（ｆ）及び工程（ｇ）がコンピュータプロセッサにより実施される項目１から項目３１のいずれか一項に記載の方法。
[項目３３]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定する方法であって、
ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、
ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、
ｄ． 工程ｃ．からの癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程と
を備える方法。
[項目３４]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定するコンピュータ実装方法であって、
ａ． 少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、
ｂ． 前記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、前記少なくとも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、工程ｃ．からの癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程と
を備える方法。
[項目３５]
プロセッサ及び前記プロセッサに接続されたメモリを有する汎用性コンピュータと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータメカニズムがエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、前記コンピュータプログラムメカニズムが前記コンピュータの前記メモリにローディングされ、前記コンピュータに項目３４に記載の方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品。
[項目３６]
項目３５に記載のコンピュータプログラム製品を保存するためのデータ構造が保存されたコンピュータ可読媒体。
[項目３７]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して癌亜型を特定するためのデバイスであって、
少なくとも１つのプロセッサと、
前記少なくとも１つのプロセッサと通信している電子メモリと
を備え
前記電子メモリは、前記少なくとも１つのプロセッサで実行される場合に、前記少なくとも１つのプロセッサに、
ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取ることと、
ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較することと、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することと
を実行させるプロセッサ実行可能なコードを保存するデバイス。
[項目３８]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して、２以上の可能性のある器官から前記癌細胞が発生した前記癌の場所を決定する方法であって、
（ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
（ｂ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、前記試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、
（ｃ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列パターンを対照個体の２以上の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、前記２以上の母集団の各々は、異なる器官に限局性癌を有する工程と、
（ｅ）前記セルフリーＤＮＡのメチル化のパターンと前記２以上の母集団のうちの１つのメチル化のパターンとの間の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で前記癌細胞が発生したかを決定する工程と
を備える方法。
一態様では、以下が提供される。
[項目１]
対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、
（ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、引き続く前記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、
（ｃ）第１量のフィラーＤＮＡを前記試料に加え、次いで任意選択的に前記試料を変性する工程であって、前記フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、
（ｅ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
（ｇ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と
を備える方法。
[項目２]
前記試料が、前記対象の血液又は血漿に由来する項目１に記載の方法。
[項目３]
比較工程（ｆ）が、統計的分類器を使用するフィットに基づく項目１又は項目２に記載の方法。
[項目４]
前記分類器が機械学習由来である項目３に記載の方法。
[項目５]
前記分類器が、エラスティックネット分類器、ｌａｓｓｏ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、又はニューラルネットワークである項目４に記載の方法。[項目６]
健康な個体及び癌性個体由来の前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、健康な個体と癌性個体との間の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる項目１から項目５のいずれか一項に記載の方法。
[項目７]
健康な個体及び癌性個体由来の前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、セルフリーＤＮＡ由来のＤＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されている対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列に限定される項目１から項目６のいずれか一項に記載の方法。
[項目８]
前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、血漿由来のＤＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されている項目７に記載の方法。
[項目９]
前記試料が、１００ｎｇ未満、７５ｎｇ未満、又は５０ｎｇ未満のセルフリーＤＮＡを有する項目１から項目８のいずれか一項に記載の方法。
[項目１０]
前記第１量のフィラーＤＮＡが、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み、残部が非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％、又は１５％～３０％がメチル化フィラーＤＮＡである項目１から項目９のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１]
前記第１量のフィラーＤＮＡが２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである項目１から項目９のいずれか一項に記載の方法。
[項目１２]
前記試料由来のセルフリーＤＮＡ及び前記第１量のフィラーＤＮＡが、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む項目１から項目１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１３]
前記フィラーＤＮＡが５０ｂｐ～８００ｂｐ長、好ましくは１００ｂｐ～６００ｂｐ長、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐ長である項目１から項目１２のいずれか一項に記載の方法。
[項目１４]
前記フィラーＤＮＡが二本鎖である項目１から項目１３のいずれか一項に記載の方法。
[項目１５]
前記フィラーＤＮＡがジャンクＤＮＡである項目１又は項目２に記載の方法。[項目１６]
前記フィラーＤＮＡが内在ＤＮＡ又は外来ＤＮＡである項目１から項目３のいずれか一項に記載の方法。
[項目１７]
前記フィラーＤＮＡが非ヒトＤＮＡ、好ましくはλＤＮＡである項目１６に記載の方法。
[項目１８]
前記フィラーＤＮＡがヒトＤＮＡに対するアラインメントを有しない項目１から項目１７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１９]
前記結合剤が、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である項目１から項目１８のいずれか一項に記載の方法。
[項目２０]
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である項目１から項目１９のいずれか一項に記載の方法。
[項目２１]
工程（ｄ）が、抗体を使用して前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む項目１から項目２０のいずれか一項に記載の方法。
[項目２２]
免疫沈降のために少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１６μｇの前記抗体を前記試料に加えることを含む項目２１に記載の方法。
[項目２３]
前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である項目２１に記載の方法。
[項目２４]
前記免疫沈降反応を確認するために、工程（ｃ）後に第２量の対照ＤＮＡを前記試料に加える工程をさらに備える項目２１に記載の方法。
[項目２５]
セルフリーのメチル化ＤＮＡの捕捉を確認するために、工程（ｃ）後に第２量の対照ＤＮＡを前記試料に加える工程をさらに備える項目１から項目２３のいずれか一項に記載の方法。
[項目２６]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程が、原発癌細胞組織を特定することをさらに備える項目１から項目２５のいずれか一項に記載の方法。
[項目２７]
前記原発癌細胞組織を特定することが、癌亜型を特定することをさらに備える項目２６に記載の方法。
[項目２８]
前記癌亜型が、ステージ、組織学、遺伝子発現パターン、コピー数異常、再構成、又は点変異状態に基づいて前記癌を識別する項目２７に記載の方法。
[項目２９]
工程（ｆ）の比較が全ゲノムにわたって実施される項目１から項目２８のいずれか一項に記載の方法。
[項目３０]
工程（ｆ）の比較が全ゲノムから特定の調節領域に限定される項目１から項目２８のいずれか一項に記載の方法。
[項目３１]
前記調節領域が、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧシェルフ、又はこれらのいずれかの組み合わせである項目３０に記載の方法。[項目３２]
工程（ｆ）及び工程（ｇ）がコンピュータプロセッサにより実施される項目１から項目３１のいずれか一項に記載の方法。
[項目３３]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定する方法であって、
ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、
ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、
ｄ． 工程ｃ．からの癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程と
を備える方法。
[項目３４]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定するコンピュータ実装方法であって、
ａ． 少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、
ｂ． 前記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、前記少なくとも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、工程ｃ．からの癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程と
を備える方法。
[項目３５]
プロセッサ及び前記プロセッサに接続されたメモリを有する汎用性コンピュータと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータメカニズムがエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、前記コンピュータプログラムメカニズムが前記コンピュータの前記メモリにローディングされ、前記コンピュータに項目３４に記載の方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品。
[項目３６]
項目３５に記載のコンピュータプログラム製品を保存するためのデータ構造が保存されたコンピュータ可読媒体。
[項目３７]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して癌亜型を特定するためのデバイスであって、
少なくとも１つのプロセッサと、
前記少なくとも１つのプロセッサと通信している電子メモリと
を備え
前記電子メモリは、前記少なくとも１つのプロセッサで実行される場合に、前記少なくとも１つのプロセッサに、
ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取ることと、
ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較することと、
ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することと
を実行させるプロセッサ実行可能なコードを保存するデバイス。
[項目３８]
癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して、２以上の可能性のある器官から前記癌細胞が発生した前記癌の場所を決定する方法であって、
（ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
（ｂ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、前記試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、
（ｃ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列パターンを対照個体の２以上の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、前記２以上の母集団の各々は、異なる器官に限局性癌を有する工程と、
（ｅ）前記セルフリーＤＮＡのメチル化のパターンと前記２以上の母集団のうちの１つのメチル化のパターンとの間の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で前記癌細胞が発生したかを決定する工程と
を備える方法。
【手続補正書】
【提出日】2023-08-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象が癌を有するか又は癌を有するリスクがあることを判定する方法であって、
（ａ）前記対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程と、
（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、
（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９４％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記癌を有するか又は前記癌を有するリスクがあることを判定する工程と
を備える方法（配列決定において亜硫酸水素塩変換を伴う方法を除く）。
（ａ）前記対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程と、
（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、
（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９４％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記癌を有するか又は前記癌を有するリスクがあることを判定する工程と
を備える方法（配列決定において亜硫酸水素塩変換を伴う方法を除く）。
【請求項2】
前記癌が、肺癌、乳癌、結直腸癌、急性骨髄性白血病、及び多形神経膠芽腫からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記癌が急性骨髄性白血病である請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＡＵＲＯＣが少なくとも９９％である請求項３に記載の方法。
【請求項5】
対象が特定のステージの癌を有するか又は特定のステージの癌を有するリスクがあることを判定する方法であって、
（ａ）前記対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程と、
（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、
（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９３％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記特定のステージの前記癌を有するか又は前記特定のステージの前記癌を有するリスクがあることを判定する工程とを備える方法（配列決定において亜硫酸水素塩変換を伴う方法を除く）。
（ａ）前記対象のセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）試料から生成された複数の核酸分子を配列決定に供して、複数の配列決定リードを得る工程と、
（ｂ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子についてのメチル化プロファイルを生成する工程と、
（ｃ）前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理して、少なくとも９３％の受信者動作特性曲線下部面積（ＡＵＲＯＣ）において、前記対象が前記特定のステージの前記癌を有するか又は前記特定のステージの前記癌を有するリスクがあることを判定する工程とを備える方法（配列決定において亜硫酸水素塩変換を伴う方法を除く）。
【請求項6】
前記癌が肺癌である請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記特定のステージが肺癌の早期である請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＡＵＲＯＣが少なくとも９５％である請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記特定のステージが肺癌の後期である請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記ＡＵＲＯＣが少なくとも９３％である請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記メチル化プロファイルが、前記複数の核酸分子の複数の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のメチル化レベルを含む請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項12】
前記ＤＭＲが過剰メチル化又は低メチル化を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ｃｆＤＮＡ試料をある量のフィラーＤＮＡと混合して、ＤＮＡ混合物試料を生成する工程をさらに備える請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項14】
前記ＤＮＡ混合物試料が、少なくとも５０ナノグラム（ｎｇ）である少なくともある量の総ＤＮＡを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記フィラーＤＮＡが少なくとも部分的にメチル化されており、５０ｂｐ～８００ｂｐの長さを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記ＤＮＡ混合物をインキュベーションして、前記ｃｆＤＮＡ試料の前記複数の核酸分子の少なくとも１以上のメチル化領域の濃縮倍率比を高める工程をさらに備える請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合するように構成された結合剤とともにインキュベーションする工程をさらに備え、前記結合剤が、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合するように構成された結合剤とともにインキュベーションする工程をさらに備え、前記結合剤が抗体を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記メチル化プロファイルをコンピュータ処理することが、健康な対照のメチル化プロファイルと比較すること、又は訓練された機械学習アルゴリズムを使用することを含む請求項１又は請求項５に記載の方法。
【請求項20】
前記訓練された機械学習アルゴリズムが線形回帰を含む請求項１９に記載の方法。
【外国語明細書】