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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023139192
(43)【公開日】2023-10-03
(54)【発明の名称】ＣＲＭ１９７タンパク質発現方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230926BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20230926BHJP
C12N 15/71 20060101ALI20230926BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230926BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230926BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20230926BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/31
C12N15/71 Z
C12P21/02 A
C12N1/21
C07K14/00
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023120482
(22)【出願日】2023-07-25
(62)【分割の表示】P 2022514680の分割
【原出願日】2019-10-02
(31)【優先権主張番号】10-2019-0108892
(32)【優先日】2019-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】516353272
【氏名又は名称】ジェノフォーカス カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＯＦＯＣＵＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(71)【出願人】
【識別番号】522084256
【氏名又は名称】イーユーバイオロジクス カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＥＵＢＩＯＬＯＧＩＣＳ．ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】キム ジョンヒョン
(72)【発明者】
【氏名】キム ヒョンド
(72)【発明者】
【氏名】パク ウネ
(72)【発明者】
【氏名】カン ジョンヒョン
(72)【発明者】
【氏名】パン ジェグ
(72)【発明者】
【氏名】キム ウィジュン
(72)【発明者】
【氏名】イ チャンキュ
(72)【発明者】
【氏名】パク ミンチョル
(57)【要約】 （修正有）
【課題】効率的で、且つ費用効果の良い方式でＣＲＭ１９７タンパク質を生産する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列、前記シグナル配列をコードする核酸、前記核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質遺伝子を含む核酸構造体又は発現ベクター、前記核酸構造体又は発現ベクターが導入された組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養する段階を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法を提供する。本発明によると、酸化還元電位を調節していない一般の大腸菌でも、親型菌から分離されたタンパク質と理化学的／免疫学的性質が同一であるＣＲＭ１９７タンパク質を発現させることができ、周辺細胞質への分泌増加のための培地のｐＨ変化がなくても周辺細胞質への分泌効率が高いＣＲＭ１９７タンパク質の製造が可能であるので、ＣＲＭ１９７タンパク質の生産において非常に有用である。
【選択図】図４
【解決手段】本発明は、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列、前記シグナル配列をコードする核酸、前記核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質遺伝子を含む核酸構造体又は発現ベクター、前記核酸構造体又は発現ベクターが導入された組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養する段階を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法を提供する。本発明によると、酸化還元電位を調節していない一般の大腸菌でも、親型菌から分離されたタンパク質と理化学的／免疫学的性質が同一であるＣＲＭ１９７タンパク質を発現させることができ、周辺細胞質への分泌増加のための培地のｐＨ変化がなくても周辺細胞質への分泌効率が高いＣＲＭ１９７タンパク質の製造が可能であるので、ＣＲＭ１９７タンパク質の生産において非常に有用である。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１３～２１のいずれか一つのアミノ酸配列で表される、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列。
【請求項2】
請求項１に記載のＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸。
【請求項3】
前記核酸は、配列番号４～１２のいずれか一つの塩基配列で表されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸。
【請求項4】
前記核酸は、配列番号６又は配列番号８の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸。
【請求項5】
請求項２に記載の核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む核酸構造体。
【請求項6】
前記ＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項５に記載の核酸構造体。
【請求項7】
請求項２に記載の核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項8】
前記ＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項9】
Ｔｒｃプロモーターをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項10】
請求項５に記載の核酸構造体又は請求項７に記載の発現ベクターが導入されている組換え微生物。
【請求項11】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項12】
次の段階を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法：
（ａ）請求項１０に記載の組換え微生物を培養し、ＣＲＭ１９７タンパク質を生成する段階；及び
（ｂ）前記生成されたＣＲＭ１９７タンパク質を回収する段階。
（ａ）請求項１０に記載の組換え微生物を培養し、ＣＲＭ１９７タンパク質を生成する段階；及び
（ｂ）前記生成されたＣＲＭ１９７タンパク質を回収する段階。
【請求項13】
前記（ｂ）段階は、周辺細胞質に分泌されたＣＲＭ１９７タンパク質を回収することを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＲＭ１９７タンパク質を大腸菌で発現し、周辺細胞質（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）に分泌させるためのシグナル配列及びその用途に関し、より具体的には、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列、前記シグナル配列をコードする核酸、前記核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質遺伝子を含む核酸構造体又は発現ベクター、前記核酸構造体又は発現ベクターが導入された組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養する段階を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ、ＤＴ）は、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）の病原性菌株から合成及び分泌されるタンパク質性外毒素である。ジフテリア毒素は、５３５個の残基からなる前酵素（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）として分泌され、トリプシン－類似プロテアーゼによって処理されることによって２個の断片（ＡとＢ）に分離される、ＡＤＰ－リボシル化酵素（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）である。断片Ａは、触媒的に活性である部位で、特異的にタンパク質合成因子ＥＦ－２をターゲットとするＮＡＤ－依存性ＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼであって、これによってＥＦ－２を不活性化させ、細胞内でのタンパク質の合成を中断させる。
【0003】
ジフテリア毒素の多様な無毒性形態と、部分毒性の免疫学的に交差反応する形態（ＣＲＭ又は交差反応する各物質）との分離を通じてＣＲＭ１９７が発見された（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４８，３８４５－３８５０，１９７３）。好ましくは、ＣＲＭは、ＤＴ全体又はその一部を含む任意の大きさ及び組成であり得る。
【0004】
ＣＲＭ１９７は、一つのアミノ酸置換Ｇ５２Ｅが存在する、酵素学的に高度に非活性的で、且つ無毒性である形態のジフテリア毒素である。この突然変異は、ＮＡＤ－結合部位の前側に位置した活性－部位ループに固有の柔軟性を付与することによって、ＮＡＤに対するＣＲＭ１９７の結合性を低下させ、ＤＴの毒性をなくす（Ｍａｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（１４）：５２２９－３４２０１２）。ＣＲＭ１９７は、ＤＴと同様に、二硫化結合を２個保有している。二硫化結合の一つは、Ｃｙｓ１８６をＣｙｓ２０１と連結し、断片Ａを断片Ｂと連結する。２番目の二硫化結合は、断片Ｂ内でＣｙｓ４６１をＣｙｓ４７１と連結する。ＤＴ及びＣＲＭ１９７は、断片Ａに起因したヌクレアーゼ活性を有している（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，２９９５－８，１９９０）。
【0005】
多数の抗原は、タンパク質に化学的に連結されていない限り、特に幼児において免疫原性が低いので、接合体又は接合ワクチンに製造される。このような接合ワクチンでは、タンパク質成分を「運搬タンパク質（ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とも言う。ＣＲＭ１９７は、タンパク質－炭水化物接合及びハプテン－タンパク質接合で運搬タンパク質として頻繁に使用される。ＣＲＭ１９７は、運搬タンパク質として、ジフテリアトキソイドのみならず、他のトキソイドタンパク質を凌ぐ多くの長所を有している（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ Ｖａｃｃｉｎｅ，２８：４３３５，２０１０）。
【0006】
ジフテリア毒素（ＤＴ）の製造方法は、当業界によく知られている。例えば、ＤＴは、コリネバクテリウムジフテリアの培養物からトキシンの精製後の化学的無毒化（ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって生産され得るか、組換え体又は遺伝的に無毒化されたトキシンの類似体の精製によって製造され得る。
【0007】
タンパク質の存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）により、ワクチンに使用するためのＣＲＭ１９７などのジフテリア毒素の大量生産が不可能であった。このような問題点は、以前に大腸菌でＣＲＭ１９７を発現させることによって取り扱われており（Ｂｉｓｈａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５１４０－５１５１）、Ｂｉｓｈａｉ等は、分解されたタンパク質の生産をもたらすジフテリア毒素（ｔｏｘシグナル配列を含む）を含有する組換え融合タンパク質の発現を記述した。
【0008】
周辺細胞質でのバクテリア毒素の生産は、細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）の生産に比べて、ｉ）たんぱく質が信号ペプチドの切断後に成熟型で生産されたり、ｉｉ）大腸菌の周辺細胞質が二硫化結合の形成を許容する酸化環境であるので、可溶性の、確実にフォルディングされたタンパク質の生産を促進することができ、ｉｉｉ）大腸菌の周辺細胞質が細胞質より少ないプロテアーゼを含有し、発現されたタンパク質のタンパク質分解性切断を避けるように促進することができ、ｉｖ）周辺細胞質がさらに少ないタンパク質を含有し、より純度の高い組換えタンパク質が収得されることを許容する。
【0009】
一般に、タンパク質上のシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の存在は、周辺細胞質へのタンパク質の輸送（原核宿主）又は分泌（真核宿主）を促進する。原核宿主におけるシグナル配列は、新生タンパク質を内膜を横切って周辺細胞質に調整し、その後、シグナル配列は切断される。すなわち、商業的に重要なタンパク質をより効率的に大量生産できるシグナル配列の探索が重要であり、組換え微生物の開発が要求されている実情である。
【0010】
そこで、本発明者等は、効率的で、且つ費用効果の良い方式でＣＲＭ１９７タンパク質を生産する方法を開発しようと鋭意努力した結果、特定のシグナル配列を選択し、大腸菌での翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を最適化するためにコドンコンテキスト（ｃｏｄｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ）と２次構造を複合し、塩基配列をデザインしており、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするＣＲＭ１９７塩基配列も大腸菌での発現を最適化しており、これらを用いる場合、大腸菌でＣＲＭ１９７が効率的に発現され、ｐＨ変化がなくてもＣＲＭ１９７の周辺細胞質への分泌が効率的に行われることを確認し、本発明を完成した。
【0011】
本背景技術部分に記載した前記情報は、本発明の背景に対する理解を向上させるためのものに過ぎなく、よって、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者に既に知られている先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の目的は、ＣＲＭ１９７タンパク質を大腸菌の周辺細胞質に分泌し、ＣＲＭ１９７タンパク質の大腸菌に対する毒性を最小化し、発現を極大化させるために、特定配列のＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列、前記シグナル配列をコードする核酸、及び前記核酸を用いたＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0013】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１３乃至配列番号２１のいずれか一つのアミノ酸配列で表される、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列を提供する。
【0014】
また、本発明は、前記ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸を提供する。
【0015】
また、本発明は、前記核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む核酸構造体又は発現ベクター、前記核酸構造体又は発現ベクターが導入されている組換え微生物、及び前記組換え微生物を培養する段階を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】発現モジュールＴＰＢ１Ｔｖ１．３の模式図あって、Ｐｔｒｃはｔｒｃプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を、ＲＢＳはＡ／Ｕリッチエンハンサー（ｒｉｃｈ ｅｎｈａｎｃｅｒ）＋ＳＤ、λｔＲ２ ＆ Ｔ７Ｔｅを意味し、ｒｒｎＢ Ｔ１Ｔ２は転写ターミネーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）を意味し、ＢｓａＩ及びＤｒａＩは、クローニング時に使用された制限酵素部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅ）を意味する。
【0017】
【0018】
【0019】
【図4】多様な大腸菌の菌株でＬ３、Ｌ５融合ＣＲＭ１９７の発現様相を示した図であって、大腸菌の総細胞（ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ）のＳＤＳ＿ＰＡＧＥ後のクマシー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）（左）及びウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）（右）を示す。ＣはＣ２８９４Ｈを意味し、ＢはＢＬ２１（ＤＥ３）を意味し、ＷはＷ３１１０－１を意味し、ＯはＯｒｉｇａｍｉＴＭ２を意味し、Ｓはシャッフル（Ｓｈｕｆｆｌｅ）を意味する。Ｃ－ｖは、ネガティブコントロール（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用されたｐＨｅｘ１．３を含有するＣ２９８４Ｈを示し、Ｌ３、Ｌ５は、融合されたシグナル配列を示し、ＣＲＭ１９７はレファレンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）ＣＲＭ１９７を示す。クマシー染色のためには、１ウェル当たり０．０２５ ＯＤ６００に該当する細胞をローディングし、ウェスタンブロッティングの場合は、０．０００５ ＯＤ６００に該当する細胞をローディングした。
【0020】
【0021】
【図6】Ｌ５融合によって誘導されるＣＲＭ１９７タンパク質の位置を示した図であって、上側は、ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ後のクマシー染色を示し、下側はウェスタンブロッティングを示す。ＣｒはレファレンスＣＲＭ１９７を示し、矢印は成熟（ｍａｔｕｒｅｄ）ＣＲＭ１９７の位置を示す。Ｐ１は、原形質膜誘導緩衝溶液の処理後の上澄み液を意味し、Ｐ２は周辺細胞質画分（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を意味し、Ｃｙは細胞質画分（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｆａｃｔｉｏｎ）を意味する。
【0022】
【図7】インデューサーの種類及び濃度がＬ３によって誘導されるＣＲＭ１９７発現に及ぼす影響を示した図であって、（Ａ）は２５℃培養で、（Ｂ）は３０℃培養である。
【0023】
【図8】Ｌ３融合によって誘導されるＣＲＭ１９７タンパク質の位置を示した図である。
【0024】
【図9】Ｌ３菌株のｐＨ、温度、インペラー速度、溶存酸素量（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ、ＤＯ）の変化及び発現誘導剤の投入時間を示した図であって、（Ａ）は、温度を３０℃に維持し、（Ｂ）は、発現誘導前に温度を２５℃に下げた。
【0025】
【図10】Ｌ５菌株のｐＨ、温度、インペラー速度、溶存酸素量（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ、ＤＯ）の変化及び発現誘導剤の投入時間を示した図である。
【0026】
【図11】培養中における発現誘導剤の投入前後のＣＲＭ１９７タンパク質発現の変化を示した図であって、（Ａ）は、３０℃でＬ３菌株の発現を誘導し、（Ｂ）は、２５℃でＬ３菌株の発現を誘導し、（Ｃ）は、２５℃でＬ５菌株を発現を誘導した。（Ａ）のｌｉｎｅ ３、１０、（Ｂ）のｌｉｎｅ ４、１０、及び（Ｃ）のｌｉｎｅ ３及び９は、レファレンスＣＲＭ１９７ ２００ｎｇをローディングした。（Ａ）のｌｉｎｅ １、２、（Ｂ）のｌｉｎｅ １、２、３、及び（Ｃ）のｌｉｎｅ１、２は、発現誘導剤の投入前の細胞培養液で、（Ａ）と（Ｃ）のｌｉｎｅ １６は、培養終了後の上澄み液で、以降のｌｉｎｅは、誘導剤の投入後、２時間単位でサンプリングされた細胞培養液である。ローディング量は図４と同一である。
【0027】
【図12】Ｌ３／Ｌ５菌株でのＣＲＭ１９７タンパク質の発現及び分離挙動を示した図であって、（Ａ）は、Ｌ３を用いた培養でのタンパク質の分離挙動で、（Ｂ）は、Ｌ５を用いた培養でのタンパク質の分離挙動である。Ｌｉｎｅ １は、レファレンスＣＲＭ１９７ ２００ｎｇをローディングし、Ｌｉｎｅ ２は、培養終了後の細胞培養液（ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ）で、Ｌｉｎｅ ３は、原形質膜誘導緩衝溶液の処理後の上澄み液で、Ｌｉｎｅ ４と７は、周辺細胞質画分（Ｌｉｎｅ ７は、ｌｉｎｅ ４より４倍のタンパク質をローディングした）を示し、Ｌｉｎｅ ５と６は細胞質画分を示す。
【0028】
【図13】ＤＥＡＥクロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ａ）とＨＡクロマトグラフィー（Ｂ）の精製サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果である。（Ａ）のＬｉｎｅ １は、コリネバクテリアで生産したＣＲＭ１９７で、Ｌｉｎｅ ２は、回収された周辺細胞質画分に存在するタンパク質を意味する。Ｌｉｎｅ ３は、限外ろ過後、２倍濃縮されたＤＥＡＥクロマトグラフィーのローディング前のサンプルで、Ｌｉｎｅ ４と５は、ＤＥＡＥクロマトグラフィーのフロースルー（Ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）モード及び洗浄液でＣＲＭ１９７を除外した不純物タンパク質を確認することができる。Ｌｉｎｅ ６は、不純物が除去された溶出サンプルで、Ｌｉｎｅ ７は、レジンに結合されている全てのタンパク質を除去するために高濃度の塩を用いて溶出したサンプルである。（Ｂ）のＨＡ Ｅｌｕは、ＨＡレジンに結合されていないタンパク質を除去した後で溶出したＣＲＭ１９７である。
【0029】
【図14】最終精製ＣＲＭ１９７をＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析した結果であって、純度は９９％以上であった。
【0030】
【図15】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及びウェスタンブロット（右）結果である。Ｌｉｎｅ １は、コリネバクテリウムで生産したＣＲＭ１９７で、Ｌｉｎｅ ２は、大腸菌（Ｌ３）で生産したＣＲＭ１９７である。二つのＣＲＭ１９７は、同一の位置でバンドが確認された。
【0031】
【図16】ＬＣ／ＭＳを用いたインタクトタンパク質の分子量（Ｉｎｔａｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ）の分析結果であって、分子量は、５８，４０９Ｄａであって理論的分子量と一致した。
【0032】
【図17】ＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分析結果であって、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７（●）と大腸菌ｐＨｅｘ－Ｌ３生産ＣＲＭ１９７（Χ）との間に高次構造の差がないことを確認した。
【0033】
【図18】蛍光スペクトル分析結果であって、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７（●）と大腸菌ｐＨｅｘ－Ｌ３生産ＣＲＭ１９７（実線）は、最大放出波長が同一に３３８ｎｍであった。
【発明を実施するための形態】
【0034】
他の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるのと同一の意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
【0035】
本発明の一実施例では、９個のシグナル配列をＣＲＭ１９７タンパク質と融合させることによって発現を試みた。各シグナル配列は、コドンコンテキストとｍＲＮＡの２次構造を考慮した上で、翻訳に最適化した塩基配列（配列番号４乃至配列番号１２）をデザインした。この構造物を発現プラスミドｐＨｅｘ１．３に挿入し、各構造物の最適な大腸菌の菌株を探すために５種の大腸菌の菌株でのＣＲＭ１９７の発現を調査した。また、選定された大腸菌で培養温度、インデューサーの種類及び濃度を設定した。結果的に、前記各構造物を多様な大腸菌の菌株に形質転換させた結果、酸化還元電位（ｒｅｄｏｘ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）に関連する遺伝子（ｔｒｘＢ、ｇｏｒ）を操作していない菌株でもＣＲＭ１９７タンパク質を可溶型（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍ）で発現させることができ、これを周辺細胞質に分泌させることができた。
【0036】
したがって、本発明は、一観点において、配列番号１３乃至配列番号２１のいずれか一つのアミノ酸配列で表される、ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列に関する。
【0037】
本発明は、他の観点において、前記ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸に関する。
【0038】
本発明において、前記核酸は、配列番号４乃至配列番号１２のいずれか一つの塩基配列で表されることを特徴とすることができ、好ましくは、配列番号６又は配列番号８の塩基配列で表されることを特徴とすることができるが、これに制限されるのではない。
【0039】
本明細書において、「ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列」とは、ＣＲＭ１９７タンパク質の発現及び周辺細胞質への分泌のためのシグナル配列を意味する。
【0040】
本発明の一実施例において、ＣＲＭ１９７タンパク質を周辺細胞質に分泌させるために大腸菌の外膜（ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ）をターゲットとするタンパク質のシグナル配列及びＭ１３ファージ由来のシグナル配列を選択した（表３）。選択したシグナル配列の大腸菌での翻訳を最適化するために、コドンテキストと２次構造とを複合することによって塩基配列をデザインした（配列番号４乃至配列番号１２）。
【0041】
本発明は、更に他の観点において、前記ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む核酸構造体に関する。
【0042】
本発明は、更に他の観点において、前記ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナル配列をコードする核酸及びＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターに関する。
【0043】
本発明の一実施例において、ＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）をコードするＤＮＡ塩基配列も、大腸菌での発現を最適化した（配列番号２）。デザインされた各シグナル配列のＤＮＡ断片及び最適化されたＣＲＭ１９７ ＤＮＡ断片をプラスミドｐＨｅｘ１．３に挿入した（図３）。
【0044】
本発明において、前記ＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子としては、ＣＲＭ１９７タンパク質を暗号化する遺伝子であれば制限なく利用可能である。好ましくは、配列番号２の塩基配列で表されることを特徴とすることができるが、これに制限されるのではない。
【0045】
本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、特定の外来のＤＮＡ鎖を細胞外から細胞内に導入することを意味する。導入されたＤＮＡ鎖を含む宿主微生物は、「形質転換された微生物」という。ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体外因子として、又は染色体の統合完成によって複製可能になることを意味する「形質転換」は、標的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入したり、標的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に統合・完成させ、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドが暗号化するタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置する場合、及び染色体外に位置する場合のいずれであるのかと関係なく、これらの全てを含む。
【0046】
本発明において、前記「核酸構造体」は、宿主細胞内に発現できる限り、宿主細胞の染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）内に挿入されて位置する場合、及び染色体外に位置する場合のいずれであるのかと関係なく、これらの全てを含む。
【0047】
また、本明細書において、前記「ポリヌクレオチド」は、「核酸」と同一の意味で使用され、標的タンパク質を暗号化するＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いずれの形態で導入されても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入され得る。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター、転写終決信号、リボソーム結合部位及び翻訳終決信号を含む。前記発現カセットは、自体複製が可能な発現ベクターの形態であり得る。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
【0048】
本明細書において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、適切な宿主内でＤＮＡを発現できる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は、簡単には潜在的なゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製して機能できるか、又は、一部の場合にゲノム自体に統合され得る。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に使用される形態であるので、本発明の明細書において、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター」は、時々相互交換的に使用される。
【0049】
本発明の目的上、プラスミドベクターを用いることが好ましい。このような目的に使用され得る典型的なプラスミドベクターは、（ａ）１宿主細胞当たり数十個乃至数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選ばれるようにする抗生剤耐性遺伝子、及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入できるようにする制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しない場合にも、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用すると、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。
【0050】
併せて、前記遺伝子は、他の核酸配列と機能的な関係で配置されるとき、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合されるとき、遺伝子の発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、前配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又は、リボソーム結合部位は、配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。
【0051】
一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。
【0052】
本発明において、前記発現ベクターは、Ｔｒｃプロモーターをさらに含むことを特徴とすることができる。
【0053】
本発明において、前記発現ベクターは、ｐＨｅｘ１．３であることを特徴とすることができるが、これに限定されるのではない。
【0054】
ＣＲＭ１９７は、ヌクレアーゼ活性が存在し、大腸菌に非常に有毒なものとして知られている。したがって、所望でない条件でのＣＲＭ１９７発現は、大腸菌の成長に悪影響を及ぼし得る。大腸菌発現プラスミドｐＨｅｘ１．３は、ＬａｃＩ遺伝子を有しており、ｔｒｃプロモーターのバックグラウンド発現を抑制することができ、このプラスミドに挿入された発現モジュールＴＰＢ１Ｔｖ１．３（図１）は、発現されるＣＲＭ１９７遺伝子の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）にλファージ由来のｔＲ２転写ターミネーター及びＴ７ファージ由来のＴｅ転写ターミネーターが挿入され、下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に大腸菌由来のｒｒｎＢ Ｔ１Ｔ２転写ターミネーターが挿入され、プラスミド由来のプロモーターから転写されるＣＲＭ１９７の発現を抑制できるようにデザインされた。
【0055】
本発明は、更に他の観点において、前記核酸構造体又は発現ベクターが導入されている組換え微生物に関する。
【0056】
本発明において、前記組換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とすることができるが、これに限定されるのではない。
【0057】
前記組換え微生物としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主細胞が通常的に使用され、原核及び真核細胞を含む全ての微生物として、バクテリア、酵母、カビなどが利用可能であり、本発明の実施例では大腸菌を使用したが、これに限定されなく、前記ＣＲＭ１９７タンパク質が十分に発現できるものであればいずれの種類の微生物であっても構わない。
【0058】
もちろん、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現するのに全て同等に機能を発揮することはなく、同様に、全ての宿主が同一の発現システムに対して同一に機能を発揮することはない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担なしで、本発明の範囲を逸脱しない状態で、他の多様なベクター、発現調節配列及び宿主から適宜選択して適用することができる。例えば、ベクターを選択するにおいては宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその内部で複製されなければならないためであり、ベクターの複製数、複製数を調節できる能力、及び当該ベクターによってコーディングされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮しなければならない。
【0059】
前記形質転換された組換え微生物は、通常的に知られている任意の形質転換方法によって製造することができる。
【0060】
また、本発明において、前記遺伝子を宿主細胞の染色体上に挿入する方法としては、通常的に知られている遺伝子操作方法を使用することができ、一例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ－連関ウイルスベクター、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター、フォックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター又は非ウイルス性ベクターを用いる方法を挙げることができる。
【0061】
また、形質転換方法には、発現ベクターを用いた方法以外にも、前記核酸構造体を宿主細胞の染色体上に直接挿入する方法も利用され得る。
【0062】
一般に、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｎ）、リポフェクション、弾道的送達、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、多価陽イオン又は脂質：核酸接合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、化学物質促進ＤＮＡ流入、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが利用され得る。
【0063】
ソノポレーション、例えば、ソニトロン（Ｓｏｎｉｔｒｏｎ）２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を用いた方法も核酸の伝達に使用することができ、他の代表的な核酸伝達システムは、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）及びＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｅｔｅｍ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）の方法を含む。リポフェクション方法は、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号及び米国特許第４，８９７，３５５号に明示されている。また、リポフェクション試薬は商業的に市販されており、例えば、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭＴＭ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭが市販されている。ポリヌクレオチドの効果的なレセプター－認識リポフェクションに適当な陽イオン又は中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒの脂質を含み（ＷＯ９１／１７４２４及びＷＯ９１／１６０２４）、生体外導入を通じて細胞に、生体内導入を通じて標的組織に伝達することができる。免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の製造方法は、当該業界によく知られている（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２７０：４０４－４１０、１９９５；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２：２９１－２９７，１９９５；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：３８２３８９，１９９４；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：６４７－６５４，１９９４；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．，２：７１０－７２２，１９９５；Ａｈｍａｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：４８１７－４８２０，１９９２；米国特許第４，１８６，１８３号；米国特許第４，２１７，３４４号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，２６１，９７５号；米国特許第４，４８５，０５４号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，７７４，０８５号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９４６，７８７号）。
ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：４８１７－４８２０，１９９２；米国特許第４，１８６，１８３号；米国特許第４，２１７，３４４号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，２６１，９７５号；米国特許第４，４８５，０５４号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，７７４，０８５号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９４６，７８７号）。
【0064】
本発明の一実施例において、製造されたプラスミドベクターを多様な大腸菌の菌株（表４）に形質転換させた結果、Ｌ３融合の場合は、全ての菌株でＣＲＭ１９７が発現され、Ｌ５融合の場合は、ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２を除いた菌株でＣＲＭ１９７が発現された（図４）。Ｌ３、Ｌ５融合の全てが酸化還元電位に関連する遺伝子（ｔｒｘＢ、ｇｏｒ）を操作していない菌株でもＣＲＭ１９７タンパク質を可溶型で発現させることができ、前記タンパク質は、親型菌から分離されたタンパク質と理化学的／免疫学的性質が同一であった。また、Ｌ３融合の場合、２５℃のみならず、３０℃でもＣＲＭ１９７タンパク質を可溶型で発現させることができた（図７、図１２Ａ）。
【0065】
既存の報告によると、培養時、ｐＨ６．５～６．８で培養しながら、誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）時にｐＨ７．５に変化（ｓｈｉｆｔ）させると、ＣＲＭ１９７の周辺細胞質への分泌が改善される。これと異なり、本発明で製造された菌株の場合、培地のｐＨ変化なしでＣＲＭ１９７の周辺細胞質への効率的な分泌を確認した（図１２）。ｐＨ変化のない高濃度培養でのＬ５融合の場合、ＣＲＭ１９７の生産性は３．７ｇ／Ｌで、周辺細胞質に分泌されるＣＲＭ１９７は２ｇ／Ｌ以上であった。
【0066】
本発明は、更に他の観点において、（ａ）前記核酸構造体又は発現ベクターが導入されている組換え微生物を培養し、ＣＲＭ１９７タンパク質を生成する段階；及び（ｂ）前記生成されたＣＲＭ１９７タンパク質を回収する段階；を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法に関する。
【0067】
本発明において、前記（ｂ）段階は、周辺細胞質に分泌されたＣＲＭ１９７タンパク質を回収することを特徴とすることができる。
【0068】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【実施例0069】
実施例１：ＣＲＭ１９７過剰発現プラスミドの製造
【0070】
実施例１．１：プラスミドｐＨｅｘ１．３の製造
【0071】
大腸菌発現プラスミドｐＨｅｘ１．３は、次のように製作した。ｐｔｒｃ９９ａ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ．６９，３０１－１５，１９８８）をＳｓｐＩとＤｒａＩに二重に切断（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した後、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）電気泳動を用いて約３．２ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ）は、ＰＣＲを用いて増幅した。使用したテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）はプラスミドｐＣＲ２．１で、使用したプライマーはＫＦ２、ＫＲであった（表１）。
【0072】
【表1】
【0073】
ＰＣＲ反応液の条件は、ｄＮＴＰ各２．５ｍＭ、プライマー各１０ｐｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ～５００ｎｇ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）１．２５Ｕ、反応体積５０μｌとし、ＰＣＲ条件は、９８℃１０秒、６０℃５秒、７２℃分／ｋｂの３段階を３０回繰り返した。このようなＰＣＲ条件で生成された約０．８ｋｂのＤＮＡ断片をＢａｍ ＨｉとＨｉｎｄＩＩＩに二重に切断した後、クレノウ断片（ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を用いて平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）で充填した後、前過程で製造した３．２ｋｂのＤＮＡ断片とＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を用いてライゲーションした。この反応液をＥ．ｃｏｌｉ Ｃ２９８４Ｈに形質転換し、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）がＡｍｐからＫｍに置換されたｐＨｅｘ１．１を製造した。
【0074】
プロモーター、ＲＢＳ、及び転写ターミネーターを含む発現モジュールＴＰＢ１Ｂｖ１．３（図１）は、Ｂｉｏｎｅｅｒで合成した（配列番号１）。発現モジュールＴＰＢ１Ｂｖ１．３をｐＨｅｘ１．３に搭載する過程は、次の通りである。発現モジュールＴＰＢ１Ｂｖ１．３を鋳型として、ＴＰＢ＿Ｆ、ＴＰＢ＿Ｒをプライマー（表１）として用いてＰＣＲ増幅して得たＤＮＡ断片（１２５５ｂｐ）と、ｐＨｅｘ１．１を鋳型として、ｐＨｅｘ＿Ｆ、ｐＨｅｘ＿Ｒをプライマーとして用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片（４５６１ｂｐ）を表２のような条件でライゲーション独立クローニング（ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ）（ＬＩＣ；Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８，５４４０－３，２０１２）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てた後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ２９８４Ｈに形質転換することによってｐＨｅｘ１．３を製造した（図２）。
【0075】
【表2】
【0076】
ＬＩＣ反応条件：ベクターは、制限酵素で切ったり、ＰＣＲを用いてリニア（ｌｉｎｅａｒ）形態のＤＮＡ断片に作る。インサート（Ｉｎｓｅｒｔ）は、ＰＣＲを用いて製造する。ベクターとインサートは、上記の表のように混ぜた後、常温で２分３０秒間反応した。
【0077】
実施例１．２：ＣＲＭ１９７遺伝子の製造
【0078】
大腸菌で発現が最適化されたＣＲＭ１９７の塩基配列（ＣＲＭ１９７ｅｃ）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔで合成した（配列番号２）。ＣＲＭ１９７ｅｃがコードするアミノ酸配列は、配列番号３の通りである。
【0079】
実施例１．３：シグナル配列遺伝子の製造
【0080】
ＣＲＭ１９７タンパク質を大腸菌の周辺細胞質に分泌させるために使用されたシグナル配列は、下記の表３に示した（配列番号１３乃至配列番号２１）。大腸菌での発現を最適化するために、コドンテキストと２次構造を考慮した上で、配列番号４乃至配列番号１２のＤＮＡを合成した（表３）。
【0081】
【表3】
【0082】
実施例１．４：ＣＲＭ１９７過剰発現のためのプラスミドの製造
【0083】
ＣＲＭ１９７を大腸菌で過剰発現し、周辺細胞質に分泌させるためのプラスミドは、図３のように製造した。ｐＨｅｘ１．３をＢｓａＩとＤｒａＩに二重に切断した後、アガロース電気泳動を用いて約５ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。シグナル配列Ｌ１～Ｌ９は、表１のプライマーと鋳型を用いてＰＣＲ増幅した。ＬＩＣ方法を用いて各シグナル配列にＣＲＭ１９７遺伝子を融合するためのＣＲＭ１９７ ＤＮＡ断片は、表１のプライマーと鋳型を用いてＰＣＲ増幅した。ＢｓａＩとＤｒａＩに切断されたｐＨｅｘ１．３と各シグナル配列断片、及びこれと互換されるＣＲＭ１９７断片は、上述したＬＩＣ条件を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てた後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ２９８４Ｈに形質転換し、各シグナル配列と融合されたＣＲＭ１９７を含有するプラスミドｐＨｅｘ－Ｌ１－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ２－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ４－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ６－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ７－ＣＲＭ、ｐＨｅｘ－Ｌ８－ＣＲＭ、及びｐＨｅｘ－Ｌ９－ＣＲＭを製造した。
【0084】
実施例２：大腸菌でのＣＲＭ１９７タンパク質の発現
【0085】
実施例１で製造されたプラスミドのうち、発現量及び細胞の成長程度を考慮した上でｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭ及びｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを選択した。下記の表４の大腸菌の菌株に形質転換し、ＣＲＭ１９７タンパク質の発現及び発現位置を調査した。
【0086】
【表4】
【0087】
培養方法は、固体培地（ソイトン（ｓｏｙｔｏｎｅ）１０ｇ／Ｌ、酵母エキス（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、寒天（ａｇａｒ）１５ｇ／Ｌ）で生成されたコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を１００ｍＭのリン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ７．５）、ｋｍ ５０μｇ／ｍｌ、０．２％のラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）を含有するＬＢ液体培地で３０℃で１５時間にわたって振盪培養した後、総細胞にＳＤＳ ＰＡＧＥを行った後、クマシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）及びウェスタンブロッティングを用いてＣＲＭ１９７の発現を分析した（図４）。Ｌ３融合の場合は、使用した全ての菌株でＣＲＭ１９７タンパク質が発現されたが、Ｌ５融合の場合は、ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２に形質転換したとき、液体培地で成長することができなかった。これ以外の菌株では、ＣＲＭ１９７タンパク質の発現が観察された。
【0088】
実施例２．１：Ｌ５によるＣＲＭ１９７発現
【0089】
ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）を１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、ｋｍ ５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ液体培地（５０ｍＬ／５００ｍＬのバッフル付フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋ））でＯＤ６００が０．４～０．６に到逹するまで培養した後、インデューサーとしてラクトース０．２％、０．４％、０．６％、又はＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ）０．０２ｍＭ、０．２ｍＭ、２ｍＭを添加することによって発現を誘導した。培養温度は２５℃又は３０℃であった。培養後、細胞を回収した後、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を行い、細胞を破砕した。破砕後、遠心分離することによって上澄み液（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と沈殿物（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）とを分離した。各サンプルのＳＤＳ＿ＰＡＧＥ後、クマシー染色及びウェスタンブロッティングを用いてＣＲＭ１９７タンパク質の発現を分析した（図５）。インデューサー（ラクトース、ＩＰＴＧ）を添加した後、２５℃で培養した場合、発現されたＣＲＭ１９７タンパク質のほとんどは可溶型で存在し、レファレンスＣＲＭ１９７の分子量と同一であると見なし、発現されたタンパク質は、Ｌ５シグナル配列が除去された成熟ＣＲＭ１９７であると判断される（図５Ａ）。その一方で、３０℃で培養した場合、ラクトースをインデューサーとして使用すると、ＣＲＭ１９７タンパク質の約５０％は不溶性画分で発見され、ＩＰＴＧをインデューサーとして添加すると、ＣＲＭ１９７タンパク質のほとんどは不溶性画分で発見された（図５Ｂ）。
【0090】
ＣＲＭ１９７の発現位置を確認するために、浸透圧衝撃（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）を用いて周辺細胞質画分を回収した。過程は次の通りである。ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）を２５℃で培養した後、遠心分離することによって細胞を回収した。原形質膜誘導緩衝溶液［３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０％のスクロース、１ｍＭ又は１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）］で、細胞の濃度がＯＤ６００１０になるように再懸濁した後、常温で０．５時間～１時間にわたって撹拌した。その後、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離することによって細胞を採取し、同一の量の４℃以下の冷たい３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加し、常温で０．５時間～１時間にわたって撹拌した。その後、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離することによって上澄み液を得た（周辺細胞質画分、Ｐ２）。原形質膜誘導緩衝溶液の処理後、上澄み液（Ｐ１）、周辺細胞質画分（Ｐ２）、及び細胞質画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて展開した後、クマシー染色及びウェスタンブロッティングを用いてＣＲＭ１９７の発現及び発現位置を調査した（図５）。Ｌ５は、ＣＲＭ１９７を成功的に周辺細胞質に分泌できることを確認した（図６）。原形質膜誘導緩衝溶液として、ＥＤＴＡは、１ｍＭより１０ｍＭである場合に効果的であった。
【0091】
実施例２．２：Ｌ３によるＣＲＭ１９７発現
【0092】
ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）を実施例２．１と同一の条件で発現させた。Ｌ３によって誘導されるＣＲＭ１９７の場合、Ｌ５と異なり、全ての条件で可溶型で存在し（図７）、周辺細胞質に分泌されることを確認した（図８）。
【0093】
実施例３：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養
【0094】
ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭ又はｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を次のような方法で培養した。本培養時、流入（ｆｅｅｄｉｎｇ）はｐＨスタット（ｓｔａｔ）方法を用いて行い、流入溶液（Ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ブドウ糖６００ｇ／Ｌ、酵母エキス３０ｇ／Ｌ）及び塩基性溶液（Ａｌｋａｌｉ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：１４％～１５％のアンモニア）を用いてｐＨ７．３に維持した。培養に用いた溶液及び培地組成は、表５及び表６に示した。
【0095】
【表5】
【0096】
【表6】
【0097】
修正されたＬＢ寒天培地［Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天：ソイトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ］で形成された単一コロニーを種培養培地に接種し、３０℃で１８時間にわたって培養した。この種培養を再び本培養培地（３Ｌ／５Ｌの発酵槽）に１％（ｖ／ｖ）の比率で接種し、３０℃で培養した。本培養培地は、種培養培地に追加的に滅菌された消泡剤を０．１％添加した。培養液の吸光度が３０～４０の値を有した後、温度を２５℃に下げた。次に、ＩＰＴＧ １０ｍＭを添加し、培養液の吸光度が１００～１２０になった後で培養を終了した。
【0098】
ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の５Ｌの発酵槽での培養様相は図９に示し、ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養様相は図１０に示した。５Ｌの発酵槽での発酵時、発現されるＣＲＭ１９７の発現様相は図１１の通りであって、発現収率は、Ｌ３融合の場合は１．１ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌで、Ｌ５融合の場合は３．０ｇ／Ｌ～３．７ｇ／Ｌであった。ＣＲＭ１９７の定量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／クマシー染色後、デンシトメーター（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）（ＧＳ－９００ＴＭ、Ｂｉｏ－ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｓ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてレファレンスＣＲＭ１９７との相対量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ）を比較して定量した。
【0099】
実施例４：タンパク質の精製
【0100】
実施例４．１：細胞培養液から周辺細胞質画分の製造
【0101】
５Ｌの発酵槽で培養した細胞から周辺細胞質画分を回収する過程は次の通りである。細胞培養液を４℃、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離し、細胞を沈澱させた。細胞沈殿物は、吸光度１００を基準にして修正されたタンパク質の原形質膜誘導緩衝溶液（表７）に再懸濁し、常温で０．５時間～１時間にわたって撹拌した。
【0102】
【表7】
【0103】
その後、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離することによって細胞を採取し、同一の量の４℃以下の冷たい３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］を添加し、常温で０．５時間～１時間にわたって撹拌した。その後、４，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離することによって上澄み液を採取し、ＭＦを用いて不純物を除去した。上記の過程を通じたｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で回収された周辺細胞質画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は図１２（Ａ）に示し、ｐＨｅｘ－Ｌ５－ＣＲＭを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で回収された周辺細胞質画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は図１２（Ｂ）に示した。周辺細胞質画分に存在するＣＲＭ１９７タンパク質の量は、Ｌ３菌株の場合は１．２ｇ／Ｌで、Ｌ５菌株の場合は２．３ｇ／Ｌであることが確認された（表８）。
【0104】
【表8】
【0105】
実施例４．２：ＣＲＭ１９７タンパク質の精製
【0106】
ｐＨｅｘ－Ｌ３－ＣＲＭ培養液の周辺細胞質画分を採取し、ＴＦＦシステムを用いて１０ｋＤａのカットオフ膜（ｃｕｔ－ｏｆｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ）で２倍濃縮し、１０倍体積の１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶媒（ｐＨ７．２）で限外ろ過を実施した。ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ（ＧＥヘルスケア）システムを用いて二つのカラム工程を経て精製を完了した。第一のカラム工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ｄｉｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｅｔｙｌ Ｓｅｐａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ、ＤＥＡＥ）であって、核酸及び不純物タンパク質を除去する目的で使用した。ＤＥＡＥレジン（Ｒｅｓｉｎ）は（－）電荷を帯びており、（＋）電荷のタンパク質が結合するようになる。限外ろ過を経た試料は、ＤＥＡＥクロマトグラフィーを経て結合されていないタンパク質及び不純物が１次的に抜け出て除去され、続いた洗浄工程を経て、塩の濃度によってＣＲＭ１９７を除いた結合力の低い不純物タンパク質を除去した。その後、塩の濃度を増加させ、ＣＲＭ１９７のみを溶出した。ＤＥＡＥクロマトグラフィーを用いて精製する過程中の試料に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を進行し、その結果を図１３（Ａ）に示した。ＤＥＡＥクロマトグラフィーを経た試料は、ＨＡ （Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）クロマトグラフィーを用いて１次的に結合されていない不純物及びタンパク質をフロースルーモードで除去し、最終１００ｍＭのリン酸カリウム及び１００ｍＭのＮａＣｌ溶媒でＣＲＭ１９７を溶出させた。溶出されたＣＲＭ１９７のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図１３（Ｂ）に示した。
【0107】
実施例５：コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７との比較
【0108】
最終精製したＣＲＭ１９７に対して品質及び特性を分析した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析した結果、純度は９９％以上であることを確認した（図１４）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を通じて、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７と同一の位置にバンドが現れることを確認した（図１５）。
【0109】
また、ＣＲＭ１９７を構成するアミノ酸５３５個の全体の配列を確認し、１００％一致することを確認した。また、分子量の測定結果、５８，４０９Ｄａの主なピークが確認され、理論的分子量値と一致した（図１６）。ＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分析を通じて高次構造を確認し、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７と高次構造に差がないことを確認した（図１７）。蛍光スペクトルの分析結果、最大放出波長は、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７と同一に３３８ｎｍであった（図１８）。
【0110】
前記結果を通じて、大腸菌ｐＨｅｘ－Ｌ３菌株を使用して生産したＣＲＭ１９７は、コリネバクテリウム生産ＣＲＭ１９７と物理化学的及び免疫学的に同一のタンパク質であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0111】
本発明によると、酸化還元電位を調節していない一般の大腸菌でも、親型菌から分離されたタンパク質と理化学的／免疫学的な性質が同一であるＣＲＭ１９７タンパク質を発現させることができ、周辺細胞質への分泌増加のための培地のｐＨ変化がなくても、周辺細胞質への分泌効率の高いＣＲＭ１９７タンパク質の製造が可能であるので、ＣＲＭ１９７タンパク質の生産において非常に有用である。
【0112】
以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項及びそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＲＭ１９７タンパク質発現用シグナルペプチドをコードする核酸であって、前記核酸は配列番号８の塩基配列で表されることを特徴とする核酸。
【請求項2】
請求項１に記載の核酸およびＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む核酸構造体。
【請求項3】
前記ＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸構造体。
【請求項4】
請求項１に記載の核酸およびＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項5】
前記ＣＲＭ１９７タンパク質の遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項6】
Ｔｒｃプロモーターをさらに含む、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項7】
請求項２に記載の核酸構造体または請求項４に記載の発現ベクターが導入されている組換え微生物。
【請求項8】
大腸菌（Escherichia coli）である、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項9】
以下の工程を含むＣＲＭ１９７タンパク質の製造方法：
（ａ）請求項７に記載の組換え微生物を培養してＣＲＭ１９７タンパク質を生成する段階；及び
（ｂ）前記生成したＣＲＭ１９７タンパク質を分離する段階。
（ａ）請求項７に記載の組換え微生物を培養してＣＲＭ１９７タンパク質を生成する段階；及び
（ｂ）前記生成したＣＲＭ１９７タンパク質を分離する段階。
【請求項10】
前記（ｂ）段階は、周辺細胞質（periplasm）に分泌されたＣＲＭ１９７タンパク質を分離することを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【外国語明細書】