特開 2023-140055 ヘモグロビンＦの測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023140055

(43)【公開日】2023-10-04

(54)【発明の名称】ヘモグロビンＦの測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20230927BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20230927BHJP

   G01N 30/02 20060101ALI20230927BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 Q

G01N30/86 J

G01N30/02 Z

G01N30/02 B

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022045898

(22)【出願日】2022-03-22

(71)【出願人】

【識別番号】000141897

【氏名又は名称】アークレイ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】石川 一輝

(57)【要約】

【課題】血液検体を液体クロマトグラフィーに供して得られるクロマトグラフから、ＨｂＦをより正確に測定する。
【解決手段】血液検体を液体クロマトグラフィーに付して得られるクロマトグラムから、ヘモグロビンピーク全体のピーク値に対するＨｂＦピークのピーク値の割合を算出し、前記割合に所定の係数を乗じて、ヘモグロビンピーク全体に対するＨｂＦピークの修正値を算出する。
【選択図】図１２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液検体を液体クロマトグラフィーに付して得られるクロマトグラムから、ヘモグロビンピーク全体のピーク値に対するヘモグロビンＦピークのピーク値の割合を算出し、
前記割合に所定の係数を乗じて、ヘモグロビンピーク全体に対するヘモグロビンＦピークの修正値を算出する、ヘモグロビンＦの測定方法。

【請求項2】

前記係数は１．１５以上１．２５未満である、請求項１に記載のヘモグロビンＦの測定方法。

【請求項3】

前記係数は１．２である、請求項２に記載のヘモグロビンＦの測定方法。

【請求項4】

前記液体クロマトグラフィーは陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のヘモグロビンＦの測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液検体中のヘモグロビンＦの測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

血液検体中の各種ヘモグロビンは、高速液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動などの分離分画法において測定することが可能である。ヘモグロビンの一種であるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）の測定値は、異常ヘモグロビン症やサラセミア症の診断材料となるため、高い正確性が求められている。ＨｂＦの測定はキャピラリー電気泳動で行われることが多く、キャピラリー電気泳動で測定されたＨｂＦの測定値が診断材料として用いられることが多い。液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビンＦの測定方法としては、下記特許文献１に開示されている方法が挙げられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１４－２３５０２３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

液体クロマトグラフィーで得られるヘモグロビンのクロマトグラムで見られる成分ピークは、キャピラリー電気泳動で得られるヘモグロビンの分析チャートで見られる成分ピークと概ね比率が一致するが、ＨｂＦピークのみ、両者の間で乖離が見られる。具体的には、液体クロマトグラフィーでのＨｂＦピークの比率は、キャピラリー電気泳動でのＨｂＦピークの比率より小さい。

【0005】

そこで本開示の実施態様は、血液検体を液体クロマトグラフィーに供して得られるクロマトグラムから、ＨｂＦをより正確に測定することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示の一態様のＨｂＦの測定方法は、血液検体を液体クロマトグラフィーに付して得られるクロマトグラムから、ヘモグロビンピーク全体に対するＨｂＦピークの割合を算出し、前記割合に所定の係数を乗じて、ヘモグロビンピーク全体に対するＨｂＦピークの修正値を算出する。

【発明の効果】

【0007】

本発明の実施態様によれば、血液検体を液体クロマトグラフィーに供して得られるクロマトグラフから、ＨｂＦをより正確に測定することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】血液検体を高速液体クロマトグラフィーに供して得られるヘモグロビンのクロマトグラフの例を模式的に示す。

【図2】通常検体におけるＨｂＦピークと合成ピークとの関係を模式的に示す。

【図3】高ＨｂＦ検体におけるＨｂＦピークと合成ピークとの関係を模式的に示す。

【図4】通常検体をキャピラリー電気泳動に供して得られるヘモグロビンの分析チャートを模式的に示す。

【図5】高ＨｂＦ検体をキャピラリー電気泳動に供して得られるヘモグロビンの分析チャートを模式的に示す。

【図6】装置１を第一モードで使用して得られたクロマトグラムの例を示す。

【図7】装置１を第二モードで使用して得られたクロマトグラムの例を示す。

【図8】装置２を使用して得られた血液検体のクロマトグラムの例を示す。

【図9】装置３を第一モードで使用して得られた血液検体のクロマトグラムの例を示す。

【図10】装置３を第二モードで使用して得られた血液検体のクロマトグラムの例を示す。

【図11】キャピラリー電気泳動装置を使用して得られた血液検体の分析チャートの例を示す。

【図12】液体クロマトグラフィーで得られたＨｂＦピーク値と、キャピラリー電気泳動で得られたＨｂＦピーク値との相関関係を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、本開示における実施形態を、図面を参照しつつ説明する。各図において共通する符号は、特段の説明がなくとも同一の部分を指し示す。なお、本開示における「ピーク値」とは、クロマトグラムで認められる各ピークの高さ又は面積であり、相対値を用いることができ、絶対値を用いることもできる。この相対値は、クロマトグラムの面積の全体に帯する比率であってもよいし、クロマトグラムに占めるヘモグロビンに関するピーク面積の全体に対する比率であってもよいし、あるいは、特定のピーク（たとえば、ＨｂＡ０ピーク）の面積に対する比率であってもよい。

【0010】

血液検体を液体クロマトグラフィーに供すると、たとえば図１に模式的に示すようなヘモグロビンのクロマトグラフが得られる。このクロマトグラフでは、カラムからの溶出速度の速い順に、ＨｂＡ１ａピーク１１及びＨｂＡ１ｂピーク１２（図２及び図３参照）を含む合成ピーク１０、ＨｂＦピーク２０、不安定型ＨｂＡ１ｃピーク３０、ＨｂＡ１ｃピーク４０、ＨｂＡ０ピーク５０及びＨｂＡ２ピーク６０（図８を参照）が認められる。

【0011】

ＨｂＦピーク値が１％未満である通常の血液検体のクロマトグラフを図２に、また、高ＨｂＦ血症患者の血液検体のクロマトグラフを図３に、それぞれ模式的に示す。両図でほぼ同じ大きさのＨｂＡ１ｃピーク３０と比較して分かるように、図３のクロマトグラフのＨｂＦピーク２０は、図２のクロマトグラフのＨｂＦピーク２０より高くなっている。このとき、図３のクロマトグラフの合成ピーク１０もまた、図２のクロマトグラフの合成ピーク１０よりも高くなっている。

【0012】

ここで、合成ピーク１０には、ＨｂＡの糖化物であるＨｂＡ１のうち、図２に示すように、ＨｂＡ１ａピーク１１及びＨｂＡ１ｂピーク１２が含まれている。そして、図３に示すようにＨｂＦピーク２０が増大すると合成ピーク１０が増大する。この合成ピーク１０は糖化物であるＨｂＡ１ａピーク１１及びＨｂＡ１ｂピーク１２が含まれているため、この合成ピーク１０の増大分は、図３に示すように、ＨｂＦの修飾物である修飾ＨｂＦピーク１３の増大によるものと考えられる。一方、図２に示す通常検体では修飾ＨｂＦピーク１３はごくわずかであり、合成ピーク１０の大部分はＨｂＡ１ａピーク１１及びＨｂＡ１ｂピーク１２で占められていると考えられる。

【0013】

次に、ＨｂＦピーク値が１％未満である通常の血液検体をキャピラリー電気泳動に供して得られた分析チャートを図４に、また、高ＨｂＦ血症患者の血液検体をキャピラリー電気泳動に供して得られた分析チャートを図５に、それぞれ模式的に示す。両図に示すように、ＨｂＡピーク１００、ＨｂＦピーク１２０、ＨｂＡ２ピーク１６０の順番に分析チャートにピークが出現する。両図を比較して分かるように、図５のクロマトグラフのＨｂＦピーク１２０は、図４のクロマトグラフのＨｂＦピーク１２０より高くなっている。しかし、図４のＨｂＡピーク１００とＨｂＡ２ピーク１６０の大きさは、図５のＨｂＡピーク１００とＨｂＡ２ピーク１６０の大きさとほぼ同じである。このことから、キャピラリー電気泳動のＨｂＦピーク１２０には、修飾ＨｂＦピーク値も含まれていることが推測される。

【0014】

以上の観察に基づき、本開示の実施態様のＨｂＦの測定方法は、血液検体を液体クロマトグラフィーに付して得られるクロマトグラムから、ヘモグロビンピーク全体に対するヘモグロビンＦピークの割合を算出し、この割合に所定の係数を乗じて、ヘモグロビンピーク全体に対するヘモグロビンＦピークの修正値を算出する。この所定の係数は、具体的には、１．１５以上１．２５未満、望ましくは１．２である。この修正値の算出に当たっては、ヘモグロビンピーク全体に対するヘモグロビンＦピークの割合に所定の係数が結果的に乗じられていればよい。たとえば、ヘモグロビンＦのピーク値に所定の係数を乗じた修正値を求め、その後ヘモグロビンピーク全体のピーク値に対する修正値の割合を算出すれば、ヘモグロビンピーク全体に対するヘモグロビンＦピークの修正値を算出できる。

【実施例0015】

（１）液体クロマトグラフィー装置
液体クロマトグラフィー装置として、以下の装置１、装置２、装置３及び装置４の陽イオン交換クロマトグラフィー装置を用いた。

【0016】

（１－１）装置１
装置１として、ＡＤＡＭＳ ＨＡ－８１８０Ｖ（販売元：アークレイ）を使用した。この装置１には、充填剤としてメタクリル酸エステル共重合体からなる親水性ポリマーが０．３５ｍｌ充填されたカラムであるカラムユニット８０（販売元：アークレイ）を使用した。試薬として、カラムからヘモグロビンを溶出させる溶離液Ａとして８０Ａ（販売元：アークレイ）を、溶離液Ｂとして８０Ｂ（販売元：アークレイ）を、溶離液Ｃとして８０ＣＶ（販売元：アークレイ）をそれぞれ使用し、溶血・洗浄液として８０Ｈ（販売元：アークレイ）を使用した。８０Ａ、８０Ｂ、８０ＣＶ及び８０Ｈの組成及びｐＨは下記表１に示すとおりであった。これらの試薬は、流速１．７ｍｌ／ｍｉｎでカラムに流した。

【0017】

（１－２）装置２
装置２として、ＡＤＡＭＳ ＨＡ－８１８０Ｔ（販売元：アークレイ）を使用した。この装置２には、充填剤としてメタクリル酸エステル共重合体からなる親水性ポリマーが０．４５ｍｌ充填されたカラムであるカラムユニット８０Ｔ（販売元：アークレイ）を使用した。試薬として、カラムからヘモグロビンを溶出させる溶離液Ａとして８０Ａを、溶離液Ｂとして８０Ｂを、溶離液Ｃとして８０ＣＴ（販売元：アークレイ）をそれぞれ使用し、溶血・洗浄液として８０Ｈを使用した。８０Ａ、８０Ｂ、８０ＣＴ及び８０Ｈの組成及びｐＨは下記表１に示すとおりであった。これらの試薬は、流速１．７ｍｌ／ｍｉｎでカラムに流した。

【0018】

（１－３）装置３
装置３として、ＡＤＡＭＳ ＨＡ－８１９０Ｖ（販売元：アークレイ）を使用した。この装置３には、充填剤としてメタクリル酸エステル共重合体からなる親水性ポリマーが０．２５ｍｌ充填されたカラムであるカラムユニット９０（販売元：アークレイ）を使用した。試薬として、カラムからヘモグロビンを溶出させる溶離液Ａとして９０Ａ（販売元：アークレイ）を、溶離液Ｂとして９０Ｂ（販売元：アークレイ）を、溶離液Ｃとして９０ＣＶ（販売元：アークレイ）をそれぞれ使用し、溶血・洗浄液として９０Ｈ（販売元：アークレイ）を使用した。９０Ａ、９０Ｂ、９０ＣＶ及び９０Ｈの組成及びｐＨは下記表１に示すとおりであった。これらの試薬は、流速４．０ｍｌ／ｍｉｎでカラムに流した。

【0019】

【表1】

【0020】

なお、ヘモグロビンの溶出力は、溶離液Ａ～Ｃのうち溶離液Ａが最も小さく、溶離液Ｂが最も大きかった。

【0021】

（２）液体クロマトグラフィーの測定方法
装置１、装置２及び装置３を用いたＨｂＦの測定は、アークレイ社の添付資料に従って行った。なお、装置１及び装置３については、各々下記の第一モード及び第二モードの両方に従って測定した。

【0022】

（２－１）第一モード
溶離液Ａをカラムに流してＨｂＦ及びＨｂＡ１ｃを溶出した後、溶離液Ｂをカラムに流して残ったヘモグロビンを全て溶出した。

【0023】

（２－２）第二モード
溶離液Ａをカラムに流してＨｂＦ及びＨｂＡ１ｃを溶出し、次に溶離液Ｃをカラムに流してＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ及びＨｂＤを溶出した後、溶離液Ｂをカラムに流して残ったヘモグロビンを全て溶出した。

【0024】

（３）キャピラリー電気泳動装置
キャピラリー電気泳動装置として、Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２ Ｆｌｅｘｐｉｅｒｃｉｎｇ（Ｓｅｂｉａ）を用いた。キャピラリー電気泳動装置を用いたＨｂＦの測定は、Ｓｅｂｉａ社の添付資料に基づいて行った。

【0025】

（４）測定結果
上記装置１～装置３及びキャピラリー電気泳動装置を用いて、５１個の全血検体についてＨｂＦピーク値を測定した。

【0026】

液体クロマトグラフィー装置として、装置１を第一モードで測定した例を図６に、装置１を第二モードで測定した例を図７に、装置２で測定した例を図８に、装置３を第一モードで測定した例を図９に、装置３を第二モードで測定した例を図１０にそれぞれ示す。いずれの装置でも、ＨｂＦピーク２０と、ＨｂＡ１ａピーク及びＨｂＡ１ｂピークの合成ピーク１０とを分離することができることが示された。

【0027】

また、キャピラリー電気泳動装置で測定した例を図１１に示す。図１１の分析チャートでは、ヘモグロビンのピークの合計に対するＨｂＦピーク１２０の比率は、液体クロマトグラフィー装置での、ヘモグロビンのピークの合計に対するＨｂＦピーク２０の比率よりも明らかに大きいことが分かった。

【0028】

図１２は、同じ検体を各液体クロマトグラフィー装置で測定して得られたＨｂＦピーク値とキャピラリー電気泳動装置とで測定して得られたＨｂＦピーク値の相関関係を示すグラフである。グラフの横軸はキャピラリー電気泳動装置で得られたＨｂＦピーク値、グラフの縦軸は液体クロマトグラフィー装置で得られたＨｂＦピーク値を示す。なお、グラフ中の破線は、横軸をｘ、縦軸をｙとしたときの、
ｙ＝ｘ
で表される直線である。このグラフから、キャピラリー電気泳動装置で得られたＨｂＦピーク値は、液体クロマトグラフィー装置で得られたＨｂＦピーク値よりも大きいことが分かった。

【0029】

また、下記表２に、各液体クロマトグラフィー装置で得られたＨｂＦピーク値に対する、キャピラリー電気泳動装置で得られたＨｂＦピーク値の比率を示す。キャピラリー電気泳動装置で得られたＨｂＦピーク値は、液体クロマトグラフィー装置で得られたＨｂＦピーク値の１．１８倍～１．２３倍であることが分かった。

【0030】

【表2】

【0031】

以上より、キャピラリー電気泳動装置で得られたＨｂＦピーク値に、１．１５以上かつ１．２５未満の係数、望ましくは１．１８以上かつ１．２３以下の係数、より望ましくは１．２倍の係数を乗ずることで、キャピラリー電気泳動装置で得られるような、より正確なＨｂＦピーク値を測定することができることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0032】

本発明は、液体クロマトグラフィーを用いた血液検体中のＨｂＦの測定に利用可能である。

【符号の説明】

【0033】

１０ 合成ピーク
１１ ＨｂＡ１ａピーク
１２ ＨｂＡ１ｂピーク
１３ 修飾ＨｂＦピーク
２０ ＨｂＦピーク
３０ 不安定型ＨｂＡ１ｃピーク
４０ ＨｂＡ１ｃピーク
５０ ＨｂＡ０ピーク
６０ ＨｂＡ２ピーク
１００ ＨｂＡピーク（キャピラリー電気泳動）
１２０ ＨｂＦピーク（キャピラリー電気泳動）
１６０ ＨｂＡ２ピーク（キャピラリー電気泳動）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】