特開 2023-142921 細胞牽引エネルギー測定システム、細胞牽引エネルギー測定方法、及び液－液界面観察用容器

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023142921

(43)【公開日】2023-10-06

(54)【発明の名称】細胞牽引エネルギー測定システム、細胞牽引エネルギー測定方法、及び液－液界面観察用容器

(51)【国際特許分類】

   G01N 13/02 20060101AFI20230928BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230928BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230928BHJP

   C07K 4/00 20060101ALN20230928BHJP

【ＦＩ】

G01N13/02

C12Q1/02

C12M1/34 A

C07K4/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】18

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022050055

(22)【出願日】2022-03-25

(71)【出願人】

【識別番号】301023238

【氏名又は名称】国立研究開発法人物質・材料研究機構

(72)【発明者】

【氏名】中西 淳

(72)【発明者】

【氏名】陸 洲

(72)【発明者】

【氏名】天神林 瑞樹

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA08

4B029BB11

4B029FA15

4B063QA05

4B063QQ08

4B063QR77

4H045AA30

4H045AA40

4H045EA50

(57)【要約】      （修正有）

【課題】細胞が周辺環境に及ぼす力学的作用を仕事（細胞牽引エネルギー）として、簡易な方法により、精度よく測定可能な細胞牽引エネルギー測定システムを提供する。
【解決手段】細胞牽引エネルギー測定システム１００であって、容器１０と、前記容器内に存在する培養液２０と、前記容器内において、前記培養液と接触して界面ＩＦを形成している疎水性液体３０と、前記界面に形成されている両親媒性化合物を含む膜４０と、細胞が接着したことにより引き起こされる前記界面の変形量を検出するように構成されている検出器５０と、を備える。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞牽引エネルギー測定システムであって、
容器と、
前記容器内に存在する培養液と、
前記容器内において、前記培養液と接触して界面を形成している疎水性液体と、
前記界面に形成されている両親媒性化合物を含む膜と、
細胞が接着したことにより引き起こされる前記界面の変形量を検出するように構成されている検出器と、を備える細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項2】

前記膜の厚さが１ｎｍ～１０００ｎｍである、請求項１に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項3】

前記膜が前記両親媒性化合物の単分子層である、請求項１又は２に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項4】

前記両親媒性化合物がリン脂質である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項5】

前記膜が、ゲル相である請求項４に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項6】

前記リン脂質は、３０～５０℃においてゲル相である請求項４又は５に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項7】

前記膜が、蛍光性両親媒性化合物を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項8】

前記検出器が、蛍光顕微鏡を含む請求項７に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項9】

前記膜が、細胞接着性ペプチドを有する両親媒性化合物を含む請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項10】

前記疎水性液体の比重が、前記培養液の比重より大きい、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項11】

前記疎水性液体が、フルオロカーボンである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項12】

前記両親媒性化合物の膜は、前記界面の変形に対応して変形するように構成されており、
前記検出器は、前記両親媒性化合物の膜の変形量を検出するように構成されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項13】

前記容器の内面の少なくとも一部が疎水性面である請求項１～１２のいずれか一項に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。

【請求項14】

細胞牽引エネルギー測定方法であって、
請求項１～１３のいずれか一項に記載の前記細胞牽引エネルギー測定システムを用意することと、
前記両親媒性化合物を含む膜が形成されている前記界面の液－液界面張力を測定又は計算することと、
前記両親媒性化合物の膜に細胞を播種することと、
前記細胞が接着したことによる前記界面の変形量を検出することと、
前記液－液界面張力、及び前記界面の変形量に基づいて、細胞牽引エネルギーを算出することを含む細胞牽引エネルギー測定方法。

【請求項15】

それの中に形成された液－液界面を観察するための液－液界面観察用容器であって、前記容器の内面の少なくとも一部が疎水性面である、液－液界面観察用容器。

【請求項16】

前記容器が、
容器本体と、
前記容器本体の内面の少なくとも一部において前記疎水性面を形成する疎水性層と、を有する請求項１５に記載の容器。

【請求項17】

前記疎水性層が、フルオロカーボン層である、請求項１６に記載の容器。

【請求項18】

前記容器は、前記容器内に前記液―液界面が形成されたとき、前記液―液界面と対向する底面を有する底部材を有し、
前記底部材がガラスで形成されている、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の容器。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞牽引エネルギー測定システム、細胞牽引エネルギー測定方法、及び液－液界面観察用容器に関する。

【背景技術】

【0002】

生命現象における物理的な「力」の役割を調べる学問分野をメカノバイオロジーと呼ぶ。例えば、細胞は近接する基質や細胞に対して物理的な力を印加し、基質の力学的特徴及び反作用を感知して自身の機能や運命決定に還元させている。

【0003】

細胞が基質に印加する力・応力を計測する方法としては、（１）牽引力顕微鏡を用いる方法（ＴＦＭ：Ｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（非特許文献１）、（２）マイクロピラー法（非特許文献２）、（３）ＤＮＡ張力プローブを用いる方法（非特許文献３）、等が挙げられる。

【0004】

（１）ＴＦＭでは、まず、蛍光ビーズを包埋したハイドロゲル（弾性体）の上に細胞を付着させ、細胞が基質に印加する牽引力によるハイドロゲルの変形を蛍光ビーズの変位から求め、そして、ゲルのヤング率を基に有限要素解析から応力を換算する。
（２）マイクロピラー法では、シリコーン製（ＰＤＭＳ：Ｐｏｌｙ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）のミクロンスケールの剣山状の構造体（マイクロピラー、マイクロポスト）の上に細胞を付着させ、ピラーの撓みとその幾何学形状・弾性率より定まるばね定数を基に、細胞が各ピラーに印加する力を求める。
（３）ＤＮＡ張力プローブは、基板上に固定化したＳｔｅｍ－ｌｏｏｐ構造のＤＮＡの末端に細胞接着性リガンドを修飾し、ＤＮＡ配列中には蛍光基と消光基がラベル化された構造を有する。そして、細胞の牽引に伴うＤＮＡのループ構造の崩壊によって蛍光基と消光基との間の距離が離れ、当初は消光していた蛍光が回復するため、ＤＮＡ１分子にかかる力を検出できる。この方法はデジタルな計測方法で、ある閾値を超えてループ構造が崩壊するか否かを判定する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ２０１４，１０（２３），４０４７－４０５５．

【非特許文献2】Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５，１２５，２８９－３０８．

【非特許文献3】Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２０１７，５０（１２），２９１５－２９２４．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかし、従来の細胞が基質印加する力・応力を計測する方法では、様々な要素（例えば、ｏｕｔ－ｏｆ－ｐｌａｎｅ応力、ゲルの応力緩和、力の不均質な作用等）が除外・無視されているために、算出される値が不正確であった。更に、（１）ＴＦＭでは、有限要素解析などの計算負荷の大きい演算が必要であった。また、一連の観察後に細胞を剥離して蛍光ビーズのゼロ点を求める必要があるが、一般的なゲルは時間とともに膨潤率が変化するため、その精度に疑問が残った。また、（２）マイクロピラー法では、細胞の基質への接着がピラー部のみに限定されるというデメリットがあった。

【0007】

本発明は上記課題を解決するものであり、細胞が周辺環境に及ぼす力学的作用を仕事（細胞牽引エネルギー）として、簡易な方法により、精度よく測定可能な測定システムを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。

【0009】

［１］ 細胞牽引エネルギー測定システムであって、
容器と、
前記容器内に存在する培養液と、
前記容器内において、前記培養液と接触して界面を形成している疎水性液体と、
前記界面に形成されている両親媒性化合物を含む膜と、
細胞が接着したことにより引き起こされる前記界面の変形量を検出するように構成されている検出器と、を備える細胞牽引エネルギー測定システム。
［２］ 前記膜の厚さが１ｎｍ～１０００ｎｍである、［１］に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［３］ 前記膜が前記両親媒性化合物の単分子層である、［１］又は［２］に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［４］ 前記両親媒性化合物がリン脂質である、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［５］ 前記膜が、ゲル相である［４］に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［６］ 前記リン脂質は、３０～５０℃においてゲル相である［４］又は［５］に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［７］ 前記膜が、蛍光性両親媒性化合物を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［８］ 前記検出器が、蛍光顕微鏡を含む［７］に記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［９］ 前記膜が、細胞接着性ペプチドを有する両親媒性化合物を含む［１］～［８］のいずれかに記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［１０］ 前記疎水性液体の比重が、前記培養液の比重より大きい、［１］～［９］のいずれかに記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［１１］ 前記疎水性液体が、フルオロカーボンである、［１］～［１０］のいずれかに記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［１２］ 前記両親媒性化合物の膜は、前記界面の変形に対応して変形するように構成されており、
前記検出器は、前記両親媒性化合物の膜の変形量を検出するように構成されている、［１］～［１１］のいずれかに記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［１３］ 前記容器の内面の少なくとも一部が疎水性面である［１］～［１２］のいずれかに記載の細胞牽引エネルギー測定システム。
［１４］ 細胞牽引エネルギー測定方法であって、
［１］～［１３］のいずれかに記載の前記細胞牽引エネルギー測定システムを用意することと、
前記両親媒性化合物を含む膜が形成されている前記界面の液－液界面張力を測定又は計算することと、
前記両親媒性化合物の膜に細胞を播種することと、
前記細胞が接着したことによる前記界面の変形量を検出することと、
前記液－液界面張力、及び前記界面の変形量に基づいて、細胞牽引エネルギーを算出することを含む細胞牽引エネルギー測定方法。
［１５］ それの中に形成された液－液界面を観察するための液－液界面観察用容器であって、前記容器の内面の少なくとも一部が疎水性面である、液－液界面観察用容器。
［１６］ 前記容器が、
容器本体と、
前記容器本体の内面の少なくとも一部において前記疎水性面を形成する疎水性層と、を有する［１５］に記載の容器。
［１７］ 前記疎水性層が、フルオロカーボン層である、［１６］に記載の容器。
［１８］ 前記容器は、前記容器内に前記液―液界面が形成されたとき、前記液―液界面と対向する底面を有する底部材を有し、
前記底部材がガラスで形成されている、［１５］～［１７］のいずれかに記載の容器。

【発明の効果】

【0010】

細胞が周辺環境に及ぼす力学的作用を仕事（細胞牽引エネルギー）として、簡易な方法により、精度よく測定可能な測定システムを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】第１実施形態の細胞牽引エネルギー測定システムの模式図である。

【図1B】第１実施形態における、両親媒性化合物が形成する膜の模式図である。

【図2A】実施例１で用いた容器の写真である。

【図2B】液－液界面形成ユニットの疎水処理していない底面付近の写真である。

【図2C】液－液界面形成ユニットの疎水処理している底面付近の写真である。

【図3】第１実施形態における、細胞牽引エネルギー測定方法を説明するフローチャートである。

【図4】両親媒性化合物の膜の形成過程を示す模式図である。

【図5】実施例における、ペンダントドロップ法を用いた動的界面張力モニターによる、液－液界面張力の測定結果を示す図である。

【図6】共焦点顕微鏡を用いて界面への細胞の接着挙動の観測をする方法を説明する図である。

【図7】実施例１～３で用いた３種類のリン脂質の化学構造式を示す図である。

【図8】実施例１における、液－液界面上への細胞接着挙動の共焦点観察結果を示す図である（上段：鳥観図、中段：断面図、下段：概念図）。

【図9】実施例３における、液－液界面上への細胞接着挙動の共焦点観察結果を示す図である（上段：鳥観図、中段：断面図、下段：概念図）。

【図10】実施例１～３で測定した細胞牽引エネルギーを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。

【0013】

本明細書における基（原子群）の表記において、置換及び無置換を記していない表記は、本発明の効果を損ねない範囲で、置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば、「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。このことは、各化合物についても同義である。

【0014】

［第１の実施形態］
第１の実施形態として、細胞牽引エネルギー測定システム及び、それを用いた細胞牽引エネルギー測定方法について説明する。

【0015】

［細胞牽引エネルギー測定システム］
図１Ａに示す細胞牽引エネルギー測定システム１００について説明する（以下、単に「システム１００」と記載する場合もある）。「細胞牽引エネルギー」とは、細胞が周辺環境に及ぼす仕事である。上述したように、従来技術として、細胞が周辺環境に及ぼす力・応力の測定は報告されている（例えば、非引用文献１～３）。一方で、細胞が周辺環境に及ぼす仕事（細胞牽引エネルギー）を直接的に測定した報告は、本願発明者らが認識する範囲において皆無である。細胞が周辺環境に及ぼす力を測定し、それから仕事（エネルギー）を算出することは原理的には可能である。しかし、上述のように従来の技術は、計算負荷が大きい、近似や仮定が多く含まれるため精度が低い等様々な課題を有していた。
以下に説明する細胞牽引エネルギー測定システム１００では、従来技術（細胞が周辺環境に及ぼす力の測定方法）を利用せずに、細胞牽引エネルギーを直接的に、簡易な方法によって精度よく測定できる。

【0016】

本実施形態の細胞牽引エネルギー測定システム１００は、容器１０と、容器１０内に存在する培養液２０と、容器１０内において、培養液２０と接触して界面（液－液界面）ＩＦを形成している疎水性液体３０と、界面ＩＦに形成されている両親媒性化合物４１の膜４０と、細胞が接着したことにより引き起こされる界面ＩＦの変形量を検出するように構成されている検出器５０と、を主に備える。容器１０と、培養液２０と、疎水性液体３０と、界面ＩＦに形成されている膜４０とは、液－液界面形成ユニット１０１を構成している。

【0017】

＜容器＞
容器１０は、容器本体１１を有する。容器本体１１は、主に、中空の柱状体を形成する側壁１２と、側壁１２と接続して容器本体１１の底を形成する底部材（底板）１３とにより構成される。

【0018】

側壁１２の形状は特に限定されず、中空の円柱状でもよいし、中空の多角柱状でもよい。界面ＩＦの変形に影響を与え難いという観点からは、側壁１２の形状は中空の円柱状が好ましい。側壁１２の材料は、特に限定されず、例えば、ガラス、プラスチック、金属、陶磁器等を用いることができる。

【0019】

底部材１３は、中空の柱状体（側壁１２）の一方端を塞いで底を形成できれば、特に形状は限定されない。本実施形態の細胞牽引エネルギー測定システム１００では、容器１０の下側から底部材１３を介して界面ＩＦの変形量を検出器５０により検出する。このため、底部材１３に用いられる材料は、界面ＩＦの変形が検出し易い材料が好ましい。例えば、界面ＩＦの変形量を光学的（例えば、蛍光、干渉、等）に検出する場合、底部材１３は可視光域における透過率が高いガラスが好ましい。

【0020】

容器本体１１において、側壁１２と、底部材１３とは異なる材料で形成されていてもよいし、同じ材料で形成されていてもよい。また、側壁１２と底部材１３とは、一体に形成されていてもよいし、別々の部材を接着剤等により接着されていてもよい。側壁１２と底部材１３とが別部材である場合、接着強度を強める観点からは、側壁１２と底部材１３とは、同一の材料、例えば、共にガラスであることが好ましい。

【0021】

容器１０の大きさは、特に限定されず、細胞牽引エネルギー測定という目的を考慮した上で、適宜設計可能である。例えば、容器１０の内面１１ａの一部を形成している底面１３ａの面積は、広過ぎると容器１０内に形成される２液の層構造（相構造）が不安定になり、狭過ぎると界面ＩＦを観察しづらくなる。このような観点から、底面１３ａの面積は、１０～１０００ｍｍ^２、又は１００～８００ｍｍ^２としてよい。底面１３ａは、界面ＩＦと対向する面であり、底部材１３の上面により形成されている。また、容器１０の高さは、特に限定されないが、例えば、１ｍｍ～３０ｍｍ、又は５ｍｍ～２０ｍｍとしてよい。また、検出器５０から界面ＩＦまでの距離は短い方が正確な検出が可能となるため、底部材１３は薄い方が好ましい。容器本体１１内に試料を保持可能な強度を有し、且つ高い検出感度を得る観点から、底部材１３の厚さは、一般的なカバーガラスの厚みである、０．１２ｍｍ～０．１８ｍｍ、又は０．５０～１．５ｍｍとしてよい。

【0022】

容器１０の内面の少なくとも一部は、疎水性面であることが好ましい。疎水性面とは、例えば、室温における水の接触角が３０°以上、６０°以上、又は９０°以上の表面である。疎水性面の疎水性の程度（接触角の大きさ）は、使用する疎水性液体３０の種類により適宜調整してもよい。本実施形態では、容器本体１１の内面１１ａに疎水性層１４が形成されており、疎水性層１４が疎水性面を形成している。本実施形態の細胞牽引エネルギー測定システム１００では、検出器５０によって、容器１０の下側から疎水性液体３０の層（疎水性液体相３１）を介して界面ＩＦの変形量を検出する。検出器５０から界面ＩＦまでの距離は短い方が検出感度が向上するため、疎水性液体相３１は薄く均一である方が好ましい。底面１３ａ上に疎水性層１４が形成されることにより、底面１３ａは疎水性液体３０に濡れ易くなる。これにより、底面１３ａ上に疎水性液体相３１を薄く均一に形成し易くなり、結果として検出感度が向上する。

【0023】

疎水性層１４は特に限定されず、使用する疎水性液体３０の種類により適宜選択してよい。疎水性層１４は、例えば、フルオロカーボン層であってもよい。フルオロカーボン層は、例えば、フルオロカーボン基を有するシランカップリング剤により内面１１ａをシランカップリング処理することにより形成されるシランカップリング層であってもよい。また、疎水性層１４は、アルキル基を有するシランカップリング剤により形成される炭化水素層（シランカップリング層）であってもよい。その他の疎水性層１４としては、ＤＯＰＡ（アミノ酸３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン）含有疎水性高分子等が挙げられ、汎用の方法（疎水化処理）により形成可能である。疎水性層１４の厚さも特に限定されず、疎水性液体３０に対する濡れ性を高め、且つ界面ＩＦの変形の検出感度を損なわない厚さに設計してよい。疎水性層１４の厚さは、例えば、１ｎｍ～１０００ｎｍ、又は１００ｎｍ～５００ｎｍとしてよい。

【0024】

疎水性層１４は、底面１３ａ上のみに形成してもよいし、更に底面１３ａ以外の内面１１ａにも形成してもよい。また、容器本体１１はサイズが小さいため、底面１３ａのみを選択的に疎水化するよりも、内面１１ａ全面を疎水化した方が効率的である。したがって、製造効率の観点からは、疎水性層１４は、内面１１ａ全面に形成されていることが好ましい。

【0025】

以上説明した容器１０は、例えば、図２Ａに示すように、所定のサイズ切断したガラス管（側壁１２）の一方端をカバーガラス（底部材１３）で塞いで構成された容器本体１１と、シランカップリング処理により、容器本体１１の内面１１ａ全面に形成されたフルオロカーボン層（疎水性層１４）とから構成されてもよい。この構成の容器１０を後述する実施例で用いた。

【0026】

＜培養液＞
培養液２０は、主成分として水を含む水系液体（親水性液体）である。培養液２０としては、細胞培養地として用いられる液体であれば、特に限定されない。例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ １６４０培地、ＭＥＭ（最小必須培地）、Ｆ－１０及びＦ－１２ハム培地、１９９培地（Ｍ１９９）等が挙げられる。培養液２０は、１種類の培養液のみから構成されてもよいし、２種類以上の培養液の混合物であってもよい。また、培養液２０は、容器１０内において培養液２０の層（親水性液体相２１）を形成するが、親水性液体相２１は培養液２０のみから構成されてもよいし、本発明の効果を奏する範囲において培養液２０以外の成分を含んでもよい。親水性液体相２１中における、培養液２０以外の成分の含有量は、例えば、１０質量％以下、５質量％以下、又は０質量％である。

【0027】

容器１０内において親水性液体相２１の高さ（界面ＩＦから親水性液体相２１の表面（上面）までの距離）は、特に限定されないが、例えば１ｍｍ～２０ｍｍ、又は５ｍｍ～１０ｍｍとしてよい。親水性液体相２１の高さが上記範囲内であれば、親水性液体相２１が分割（Ｓｐｌｉｔ）して疎水性液体相３１が露出することを防ぐことができる。

【0028】

＜疎水性液体＞
疎水性液体３０は、培養液２０よりも疎水性が高く、培養液２０と分離して界面ＩＦを形成するものであれば特に限定されない。疎水性液体３０は、細胞毒性を示さないものが好ましい。また、疎水性液体３０の比重は培養液２０の比重より大きい方が好ましい。これにより、疎水性液体相３１が親水性液体相２１の下側に配置され、また培養液２０と分離し易くなり安定な界面ＩＦを形成できる。

【0029】

疎水性液体３０としては、例えば、フルオロカーボン、シリコーンオイル、疎水性イオン液体等を用いることができる。疎水性液体３０は、一種類の化合物であってもよいし、複数の化合物の混合物であってもよい。また、疎水性液体相３１は疎水性液体３０のみから構成されてもよいし、本発明の効果を奏する範囲において疎水性液体３０以外の成分を含んでもよい。疎水性液体相３１中における、疎水性液体３０以外の成分の含有量は、例えば、１０質量％以下、５質量％以下、又は０質量％である。

【0030】

フルオロカーボンとしては、例えば、パーフルオロトリブチルアミン、パーフルオロジブチルメチルアミン、パーフルオロトリペンチルアミン、又はこれらの混合物を用いることができ、また、市販品を用いてもよい。フルオロカーボンの市販品としては、例えば、スリーエムジャパン株式会社製のフロリナート（登録商標）ＦＣ－４０（パーフルオロトリブチルアミンと、パーフルオロジブチルメチルアミンとの混合物）、フロリナート（登録商標）ＦＣ－７０（パーフルオロトリペンチルアミン）、等が挙げられる。

【0031】

疎水性液体相３１の高さ（容器１０の底面１３ａから界面ＩＦまでの距離）は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍｍ～５ｍｍ、又は０．５ｍｍ～３ｍｍが好ましい。疎水性液体相３１の高さが上記範囲の下限値以上であれば、疎水性液体相３１の分割（Ｓｐｌｉｔ）を防ぎ、界面ＩＦを安定に形成することができ、上記範囲の上限値以下であれば、界面ＩＦの変形の検出感度を高められる。

【0032】

＜両親媒性化合物を含む膜＞
図１Ｂに示すように、膜４０を形成する両親媒性化合物４１は、分子内に親水部４１ａと疎水部４１ｂとを有しする。培養液２０と疎水性液体３０との界面ＩＦにおいて、両親媒性化合物４１は、親水部４１ａを培養液２０側（上側）、疎水部４１ｂを疎水性液体３０側（下側）に向けて配列する。

【0033】

本実施形態の細胞牽引エネルギー測定システム１００では、細胞が接着したことによって引き起こされる界面ＩＦの変形を、膜４０の変形を介して検出する。このため、膜４０は、界面ＩＦの変形に追随して変形し易い方が好ましい。この観点からは、膜４０の厚さは薄い方が好ましく、例えば、１ｎｍ～１０００ｎｍ、又は１０ｎｍ～１００ｎｍとしてよい。また、図１Ｂには、膜４０として両親媒性化合物４１の単分子層を示すが、本実施形態はこれに限定されない。膜４０は、例えば、上記厚さを満たす範囲において、単分子層であってもよいし、数分子層膜（例えば、２分子層～１０分子層）であってもよい。

【0034】

両親媒性化合物４１は、界面ＩＦの可変形性を大きく損なうものでなければ特に限定されず、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、ノニオン性両性界面活性剤、両性界面活性剤等を用いることができる。両親媒性化合物４１は、低分子化合物でもよいし、例えば、両親媒性ブロック共重合体、ゆるく架橋した（架橋度の低い）界面活性剤等の高分子化合物でもよい。両親媒性化合物４１は、細胞との親和性が高いという観点からはリン脂質が好ましい。

【0035】

界面ＩＦに膜４０が存在しない場合、培養液中２０に含まれるタンパク質が固体状の非常に硬いナノ薄膜を界面ＩＦに形成する（Ｓｍａｌｌ，２０１９，１５：１８０４６４０）。この状態の界面ＩＦは本来の非常に軟らかい性質を失ってしまい、界面に細胞が接着しても細胞の印加する牽引力に対して鋭敏に変形できない。本発明者らは、界面ＩＦに両親媒性化合物４１の膜４０を形成することで、界面ＩＦへのタンパク質の吸着を防ぎ、界面ＩＦは本来の非常に軟らかい性質を維持でいることを見出した。この効果は、両親媒性化合物４１としてリン脂質を用いた場合に特に顕著である。

【0036】

両親媒性化合物４１がリン脂質である場合、本実施形態のシステム１００を使用する温度（測定温度、例えば、３７℃付近）において、膜４０はゲル相であることが好ましい。液晶相であるよりもゲル相である方が界面ＩＦの変形に追随して変形し易く、これにより検出感度が向上する。したがって、両親媒性化合物４１は、例えば、３０～５０℃、２０℃～１００℃、又は２０℃以上においてゲル相であることが好ましい。また、両親媒性化合物４１のゲル－液晶相転移温度は、例えば２０℃以上、又は２０℃～１００℃であることが好ましい。ゲル－液晶相転移温度がこの範囲であれば、システム１００を使用する温度（測定温度）において、両親媒性化合物（リン脂質）４１をゲル相に調整しやすい

【0037】

リン脂質の種類は特に限定されないが、例えば、ホスファチジルコリン等のグリセロリン脂質が好ましい。グリセロリン脂質は、グリセリンの３つのヒドロキシル基のうち１つにリン酸基が結合し、残り２つに炭化水素鎖がエステル結合またはエーテル結合している。２つ炭化水素鎖は、それぞれ、炭素数１２～２４の飽和又は不飽和の炭化水素鎖であってよく、同一であっても異なっていてもよいが、測定温度（例えば、３７℃付近）においてゲル相とする観点からは、上記２つ炭化水素鎖は飽和炭化水素鎖であることが好ましい。リン脂質（グリセロリン脂質）は、２つ炭化水素鎖に不飽和結合を含むもの（不飽和リン脂質）と、不飽和結合を含まないもの（飽和リン脂質）との混合物であってもよいが、測定温度においてゲル相とする観点からは、飽和リン脂質が主成分であることが好ましい。混合物中における飽和リン脂質の含有量は、例えば、７０ｍｏｌ％以上、９５ｍｏｌ％以上、又は１００ｍｏｌ％であってよい。

【0038】

両親媒性化合物４１は、膜４０に細胞が接着し易いように、その分子内に細胞接着性ペプチドを有していてもよい。細胞接着性ペプチドとしては、例えば、ＲＧＤ、環状ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、ＧＦＯＧＥＲ、ＨＡＶＤＩ等が挙げられる。例えば、両親媒性化合物４１がリン脂質である場合、両親媒性化合物４１の親水基（リン酸基）に細胞接着性のペプチドが結合されていてもよい。以下、細胞接着性ペプチドを有する両親媒性化合物を「両親媒性化合物４１Ａ」と記載する。両親媒性化合物４１は両親媒性化合物４１Ａを含まなくてもよいし、反対に両親媒性化合物４１の全てが両親媒性化合物４１Ａであってもよいし、又は両親媒性化合物４１の一部のみが両親媒性化合物４１Ａであってもよい。十分な量の細胞を効率的に膜４０に吸着させる観点から、両親媒性化合物４１全量中における、両親媒性化合物４１Ａの割合は、例えば、０．２ｍｏｌ％～４．０ｍｏｌ％、又は０．５ｍｏｌ％～２．５ｍｏｌ％としてもよい。

【0039】

また、両親媒性化合物４１は、蛍光性両親媒性化合物であってもよい。両親媒性化合物４１が蛍光性両親媒性化合物である場合、膜４０の変形量を蛍光顕微鏡により検出することができる。例えば、両親媒性化合物４１がリン脂質である場合、両親媒性化合物４１の親水基（リン酸基）が蛍光性官能基により修飾されていてもよい。蛍光性官能基としては、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ類、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ類、ＢＯＤＩＰＹ類、ＮＢＤ、Ｐｙｒｅｎｅ、Ｄａｎｓｙｌ、Ｃｙ５などＣｙａｎｉｎｅ類、ＴｏｐＦｌｕｏｒ類が挙げられる。以下、蛍光性両親媒性化合物を「蛍光性両親媒性化合物４１Ｂ」と記載する。両親媒性化合物４１は蛍光性両親媒性化合物４１Ｂを含まなくてもよいし、反対に両親媒性化合物４１の全てが蛍光性両親媒性化合物４１Ｂであってもよいし、又は両親媒性化合物４１の一部のみが蛍光性両親媒性化合物４１Ｂであってもよい。界面ＩＦの変形検出を効率的に行う観点から、両親媒性化合物４１全量中における、蛍光性両親媒性化合物４１Ｂの割合は、例えば、０．２ｍｏｌ％～４．０ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％～２．５ｍｏｌ％としてもよい。

【0040】

両親媒性化合物４１は、一種類の化合物であってもよいし、複数種類の化合物の混合物であってもよい。例えば、両親媒性化合物４１は、上述の両親媒性化合物４１Ａ及び蛍光性両親媒性化合物４１Ｂの両方を含有してもよい。また、膜４０は、両親媒性化合物４１のみから構成されてもよいし、本発明の効果を奏する範囲において、両親媒性化合物４１以外の化合物を含んでもよい。膜４０における両親媒性化合物４１の含有量は、例えば、１００質量％としてもよく、８０質量％以上、又は９０質量％以上としてよく、また、９８質量％以下、又は９５質量％以下としてもよい。

【0041】

＜液－液界面形成ユニットの作製方法＞
容器１０と、培養液２０と、疎水性液体３０と、膜４０とから構成される液－液界面形成ユニット１０１の作製方法は特に限定されないが、例えば、以下に説明する方法により作製してもよい。

【0042】

まず、両親媒性化合物４１の分散液（両親媒性化合物分散液）を調製する。分散液の溶媒は、水、生化学用の汎用の緩衝液（リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、等）等の親水性溶媒であることが好ましい。また、両親媒性化合物４１がリン脂質である場合、分散液中にリン脂質は１枚膜リポソーム４３（ユニラメラベシクル）として分散していることが好ましい（図４参照）。１枚膜リポソーム４３の調製方法は特に限定されないが、例えば、まず、多層のリポソーム（マルチラメラベシクル）を含む分散液を調製し、それをゲル－液晶相転移温度以上の温度で超音波処理することにより、１枚膜リポソーム４３を調製してよい。さらに，その後にエクストルーダーによる濾過処理をして粒径を制御しても良い。

【0043】

容器１０を用意し、疎水性液体３０を注いで疎水性液体相３１を形成し、その上に、ゲル－液晶相転移温度以上の両親媒性化合物分散液を注ぐ。これにより、分散液中の１枚膜リポソーム４３を構成する両親媒性化合物（リン脂質）４１は、疎水性液体相３１と分散液を含む水相４４との界面ＩＦ１に、例えば、単分子層として配列して膜４０を形成する（図４参照）。

【0044】

膜４０の形成後、水相４４をＰＢＳ等の親水性溶媒で複数回置換後、最後に培養液２０を注ぐ。これにより、疎水性液体相３０と培養液２０との界面ＩＦが形成され、液－液界面形成ユニット１０１が得られる。

【0045】

＜検出器＞
検出器５０は、細胞が接着したことにより引き起こされる界面ＩＦの変形量を検出できるものであれば特に限定されない。検出器５０は、例えば、検出器界面ＩＦの変形量を光学的に検出する共焦点レーザー顕微鏡、反射干渉顕微鏡等であってもよい。検出器５０に蛍光顕微鏡等を用いる場合、膜５０は、蛍光性両親媒性化合物４１Ｂ、及び／又は両親媒性化合物以外蛍光性化合物を含有することが好ましい。

【0046】

図６は、検出器５０として共焦点観察が可能な蛍光顕微鏡（共焦点蛍光顕微鏡）を用いた場合における、界面ＩＦ上への細胞Ｃの接着挙動の観測を説明する模式図である。図６に示すように、細胞Ｃの接着に伴う界面ＩＦのｚ軸スキャニング画像をコンピュータプログラムを用いて三次元画像に再構成し、そこから界面ＩＦの変形量、例えば、面積の増加量（ΔＡ）を求めることできる。

【0047】

［細胞牽引エネルギー測定方法］
図３のフローチャートに従って、細胞牽引エネルギー測定方法について説明する。まず、図１Ａに示す細胞牽引エネルギー測定システム１００を用意する（図３のステップＳ１）。

【0048】

別途、膜４０が形成されている界面ＩＦの液－液界面張力（γ）を求める（図３のステップＳ２）。界面ＩＦの液－液界面張力は、両親媒性化合物４１が界面活性剤として働くため、両親媒性化合物４１が存在しない場合と比較して低下する。界面ＩＦの液－液界面張力は、培養液２０の特性、疎水性液体３０の特性、及び両親媒性化合物４１の特性の３つに基づいて決定される。したがって、液－液界面張力の値は、これらの化合物を適宜選択することにより調整できる。界面ＩＦの液－液界面張力は、例えば、汎用の界面張力計等により測定してもよいし、又は、シミュレーション（計算）で求めてもよい。図５に、ペンダントドロップ法を用いた動的界面張力モニターによる、液－液界面張力の測定結果を示す。図５に示すように、液－液界面張力は時間共に低下して平衡に達するので、平衡値を液－液界面張力として用いることが好ましい。

【0049】

用意したシステム１００の膜４０に細胞を播種し（図３のステップＳ３）、細胞が接着したことによる界面ＩＦの変形量を検出する（図３のステップＳ４）。そして、先に求めた液－液界面張力、及び検出した界面の変形量に基づいて、播種された細胞の細胞牽引エネルギーを算出する（図３のステップＳ５）。

【0050】

細胞は特に限定されず、例えば、多細胞生物（動植物）の細胞や，細菌・原生生物等の単細胞も含む。

【0051】

本システムでは、界面ＩＦの変形に追随して膜４０が変形し、膜４０の変形量を検出することで界面ＩＦの変形量を検出する。膜の変形量（変位量）は、検出器５０を用いて光学的に検出してもよい（例えば、蛍光、干渉、等）。また、所定時間に亘って界面ＩＦの変形をモニターし、その結果に基づいて、細胞の時間依存的な仕事の追跡（モニタリング）を行ってもよい。

【0052】

界面ＩＦの変形量は、例えば、界面ＩＦの面積の増加量（ΔＡ）として検出してもよい。液体はそれ自身が界面エネルギー（液－液界面張力γ）を最小化する性質がある。それ故、下記式（Ｉ）に示すように、細胞が基質（この場合、界面ＩＦ）に与える仕事（エネルギー）（Ｗ）を容易に算出できる。

Ｗ＝ΔＡ×γ ・・・ （Ｉ）

Ｗ：細胞牽引エネルギー
ΔＡ：細胞が接着したことにより引き起こされる界面ＩＦの面積の増加量
γ：膜５０が形成されている界面ＩＦの液－液界面張力

【0053】

以上説明した本実施形態の細胞牽引エネルギー測定システム１００及びこれを用いた細胞牽引エネルギー測定方法は以下の利点を有する。細胞牽引エネルギー測定システム１００は、単純な構成の液－液界面形成ユニット１０１と、一般的な共焦点蛍光顕微鏡等の検出器５０との組み合わせで構成できる。液－液界面形成ユニット１０１の培養液２０、疎水性液体３０、膜４０も、簡単に入手可能な材料で構成できる。したがって、本実施形態の細胞牽引エネルギー測定システム１００は、低コストで作製が容易であり、また壊れ難く、特に特殊なメンテナンスも不要である。そして、細胞牽引エネルギー測定システム１００を用いることで、界面ＩＦの面積の増加量（ΔＡ）と液－液界面張力（γ）の値に基づく簡易な方法により、精度よく細胞牽引エネルギー（仕事）を算出できる。
本実施形態の細胞牽引エネルギー測定システム１００は、細胞が周辺環境に及ぼす仕事（細胞牽引エネルギー）を直接的に測定する初めてのシステムである。細胞牽引エネルギー測定システム１００により、今まで考慮されてこなかった細胞の力学作用（エネルギー動態）の観察及び測定が初めて可能となった。

【0054】

［第２の実施形態］
第２の実施形態として、液－液界面観察用容器を説明する。本実施形態の液－液界面観察用容器は、第１の実施形態で説明した容器１０と同様の構成を有する。以下、図１Ａの参照番号を用いて本実施形態の容器について説明する。

【0055】

本実施形態の液－液界面観察用容器１０は、それの中に形成された液－液界面ＩＦを観察するための容器である。液－液界面観察用容器１０の内面の少なくとも一部は疎水性面である。液－液界面観察用容器１０は、疎水性液体３０（下相）と親水性液体２０（上相）とにより形成される界面ＩＦを観察することに適している。容器１０の下側から観察する場合、底面１３ａ上に疎水性液体相３１を薄く均一に形成できるため、検出器５０から界面ＩＦまでの距離を短くでき、観察感度を高められる。

【0056】

本実施形態の液－液界面観察用容器１０の用途は、第１の実施形態で説明した細胞牽引エネルギー測定に限定されない。例えば、界面ＩＦ上に付着した細胞の形態観察や動的挙動の観察，界面ＩＦ自体の各種刺激に対する変化の解析等に用いることができる。

【実施例0057】

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により制限されない。

【0058】

［実施例１］
１.細胞牽引エネルギー測定システムの作製
（１）容器の作製
図２Ａに示すように、約１．５ｃｍの長さに切断したガラス管の一方の端を、カバーガラス（Ｎｏ．１、厚さ：０．１３～０．１６ｍｍ）をポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）溶液で接着して塞ぎ、容器本体１１を作製した。容器本体１１内に、フルオロカーボン基を有するシランカップリング剤（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－パーフルオロオクチルトリエトキシシラン）のエタノール溶液（濃度０．５質量％）を１００μＬ添加して乾燥し、その後、１２０℃のオーブン中で３０分静置した。その後、エタノールで洗浄して容器１０を得た。容器本体１１の全内面は疎水化（パーフルオロ化）され、疎水性層（フルオロカーボン層）１４で覆われた。

【0059】

図２Ｂに示すように、パーフルオロカーボン層（疎水性層１４）を形成していない底面１３ａ（ガラス）は、疎水性液体３０（ＰＦＣＬ：パーフルオロカーボン液）に十分に濡れず、薄く均一な疎水性液体相３１が形成できなかった。一方、疎水化処理（フッ素化）した本実施例の容器１０では、図２Ｃに示すように、底面１３ａが疎水性液体３０に十分に濡れた。

【0060】

（２）液－液界面形成ユニットの作製
まず、両親媒性化合物の分散液（両親媒性化合物分散液）を調製した。両親媒性化合物として、図７に示す３種類のリン脂質（ｉ）～（ｉｉｉ）の混合物を用いた。リン脂質（ｉｉ）は、蛍光性両親媒性化合物であり、親水基が蛍光性官能基で修飾されている。リン脂質（ｉｉｉ）は、細胞接着性ペプチドを有する両親媒性化合物であり、親水基が細胞接着性ペプチドで修飾されている。

【0061】

バイヤル瓶中で３種類のリン脂質をモル比（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）＝９７．５：２．０：０．５で混合し、クロロホルムに溶解した。次に、室温でクロロホルムを蒸発させ、更に３時間真空下に静置することでクロロホルムを完全に除去して、バイヤル瓶にリン脂質の薄膜を形成した。リン脂質膜が形成されたバイヤル瓶内に、全リン脂質濃度が０．２ｍＭとなるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を添加した。次に、リン脂質（ｉ）のゲル－液晶相転移温度以上の７０℃で超音波処理を行い、両親媒性化合物分散液を得た。超音波処理前の分散液中のリン脂質は、多層リポソーム（マルチラメラベシクル）であったが、ゲル－液晶相転移温度以上で超音波処理を行ったことにより、１枚膜リポソーム４３（ユニラメラベシクル）となった（図４参照）。

【0062】

容器１０にアルミホイルでフタをし、１２０℃のオーブンで滅菌処理を行った。滅菌処理した容器１０に、パーフルオロカーボン（スリーエムジャパン株式会社、フロリナート（登録商標）ＦＣ－４０）、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）をこの順で添加して、液－液界面ＩＦ１を形成た（図４参照）。容器１０に更に、先に調製した７０℃の両親媒性化合物分散液（リン脂質のユニラメラベシクル分散液）を添加し、液－液界面ＩＦ１をリン脂質単分子層（膜）４０で被覆した。

【0063】

１時間～１時間半経過後、７０℃に温めたＰＢＳで上相（水相４４）を数回置換し、最後に培養液２０で置換した。培養液２０としては、以下の培地を用いた。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）， １００ Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ， １００ μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ， １％ ＭＥＭ ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， １％ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ， １％ Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅを含む（ｖ／ｖ）。

【0064】

以上説明した方法により、容器１０と、培養液２０と、疎水性液体３０と、膜４０により構成される液－液界面形成ユニット１０１を得た。

【0065】

液－液界面形成ユニット１０１の下側、即ち、容器１０の底部材（カバーガラス）１３側に、検出器５０としてディスク型共焦点ユニット（横河電機株式会社製、ＣＳＵ－１０）を装着した蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社製、ＩＸ－８１）を設置し、細胞牽引エネルギー測定システム１００を完成させた。

【0066】

２.細胞牽引エネルギーの測定
まず、膜５０が形成されている界面ＩＦの液－液界面張力（γ）を界面張力計により測定した。図５に、ペンダントドロップ法を用いた動的界面張力モニターによる、液－液界面張力の測定結果を示す。図５に示すように、時間と共に液－液界面張力は低下して平衡に達し、平衡値を液－液界面張力として用いた。

【0067】

次に、細胞牽引エネルギー測定システム１００の膜４０に、ｌｉｆｅａｃｔ－ＧＦＰを恒常発現させたイヌ腎臓尿細管由来のＭａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅy （ＭＤＣＫ）細胞を播種した。所定時間の間、検出器５０（蛍光顕微鏡）を用いて共焦点観察を行った。具体的には、膜５０の赤色の蛍光を検出することで膜５０の変形をモニタリングし、図６に示すように、細胞Ｃの接着に伴う界面ＩＦのｚ軸スキャニング画像をＩｍａｇｅＪ（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉ９９７－２０２１．、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ａ．Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｋ．Ｗ．“ＮＩＨ Ｉｍｇｅ ｔｏ ＩｍａｇｅＪ：２５ Ｙｅａｒｓ ｏｆ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９，６７１－６７５，２０１２参照）を用いて三次元画像に再構成した。三次元画像に再構築した結果を図８に示す。図８は、時間を追って、細胞Ｃが膜４０に着地（ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ）、接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）、浸潤（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）及び適合（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）する様子を示す。三次元画像に再構築した結果から、界面ＩＦの面積の増加量（ΔＡ）を求めた。そして、面積の増加量（ΔＡ）と、別途求めていた液－液界面張力（γ）とから、式（Ｉ）により細胞牽引エネルギー（Ｗ）を求めた。結果を図１０に示す。

【0068】

［実施例２］
本実施例では、１０ｎｇ／ｍＬのトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）を含む培地中で細胞を２４時間培養する、細胞の前処理を行った（ＴＧＦ－β処理）。前処理を行った細胞を用いた以外は、実施例１と同様の方法により、細胞牽引エネルギー（Ｗ）を求めた。結果を図１０に示す。

【0069】

［実施例３］
本実施例では、実施例２と同様の方法により細胞の前処理（ＴＧＦ－β処理）を行った。また、疎水性液体３０として、パーフルオロカーボン（スリーエムジャパン株式会社、フロリナート（登録商標）ＦＣ－７０）を用いた。それ以外は、実施例１と同様の方法により、細胞牽引エネルギー（Ｗ）を求めた。結果を図１０に示す。また、検出器５０（蛍光顕微鏡）を用いて共焦点観察した結果（３次元画像に再構成した結果）を図９に示す。

【0070】

液－液界面ＩＦへの細胞接着挙動の共焦点観察の結果、細胞Ｃが膜４０に着地（ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ）、接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）、浸潤（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）及び適合（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）と、時間と共に細胞の接着形態、及び界面ＩＦの形状が劇的に変化することが確認できた（図８及び図９参照）。そして、図１０に示すように、実施例１～３において、細胞牽引エネルギー測定システム１００を用いて細胞が基質（界面ＩＦ）に印加する仕事を測定することができた。細胞の播種から４～８時間後に観測される浸潤（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）段階において、条件の異なる実施例１～３の間で細胞牽引エネルギーに大きな差が出ることが確認できた。細胞は，ＴＧＦ―β処理による自身の牽引力の増大に加えて、外部の力学的性質（界面張力）に応じても、外部に印加する牽引エネルギーを変化させているものと考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0071】

本発明の細胞牽引エネルギー測定システムは、細胞が周辺環境に及ぼす仕事（細胞牽引エネルギー）を精度よく、且つ簡易な方法で測定できる。エネルギーは生命活動の本質であるため、そこに脚光を浴びせる本発明は、メカノバイオロジーの新評価軸となる可能性を秘める。細胞の仕事を指標にした薬剤試験や、それを基にした幹細胞エンジニアリングなどの再生医療的展開など、仕事（エネルギー）を標的とした新しい創薬・医療技術の創出が期待され、経済的なインパクトも望める。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】