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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023143788
(43)【公開日】2023-10-06
(54)【発明の名称】ＧＡＢＡ産生促進剤
(51)【国際特許分類】
A23L 33/135 20160101AFI20230928BHJP
A23L 33/125 20160101ALI20230928BHJP
A61K 35/68 20060101ALI20230928BHJP
A61K 31/716 20060101ALI20230928BHJP
A61P 25/20 20060101ALI20230928BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20230928BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20230928BHJP
【ＦＩ】
A23L33/135
A23L33/125
A61K35/68
A61K31/716
A61P25/20
A61P3/06
A61P9/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023038820
(22)【出願日】2023-03-13
(31)【優先権主張番号】P 2022050885
(32)【優先日】2022-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000192590
【氏名又は名称】株式会社神鋼環境ソリューション
(71)【出願人】
【識別番号】508042869
【氏名又は名称】学校法人 大妻学院
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】河野 高▲徳▼
(72)【発明者】
【氏名】西田 典永
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼橋 円
(72)【発明者】
【氏名】青江 誠一郎
【テーマコード（参考）】
4B018
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB04
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB09
4B018LB10
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018LE04
4B018LE05
4B018LE06
4B018MD33
4B018MD89
4B018ME04
4B018ME14
4B018MF01
4B018MF03
4B018MF06
4B018MF12
4B018MF14
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA20
4C086GA17
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZA03
4C086ZA05
4C086ZA42
4C086ZA89
4C086ZA94
4C086ZC04
4C086ZC33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB01
4C087CA14
4C087MA52
4C087NA14
4C087ZA03
4C087ZA05
4C087ZA42
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZC04
4C087ZC33
(57)【要約】
【課題】GABA産生促進剤を提供すること。
【解決手段】ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、GABA産生促進剤。
【選択図】なし
【解決手段】ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、GABA産生促進剤。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、GABA産生促進剤。
【請求項2】
ユーグレナ、パラミロン、及びパラミロン加工物からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、請求項１に記載のGABA産生促進剤。
【請求項3】
ユーグレナ及び／又はパラミロンを含有し、且つ
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである且つ／或いは前記パラミロンがユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンである、
請求項１に記載のGABA産生促進剤。
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである且つ／或いは前記パラミロンがユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンである、
請求項１に記載のGABA産生促進剤。
【請求項4】
前記ユーグレナ及び／又はパラミロンを含有し、且つ
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である且つ／或いは前記パラミロンがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンである、
請求項１に記載のGABA産生促進剤。
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である且つ／或いは前記パラミロンがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンである、
請求項１に記載のGABA産生促進剤。
【請求項5】
脂質代謝向上、血圧改善、ストレス緩和、疲労感の軽減、睡眠の改善、肌弾力の改善、認知機能の改善、リラクゼーション誘導、α波放出促進、成長ホルモン分泌促進、筋肉量の増加、活力の改善、及び心の健康の改善からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための、請求項１～４のいずれかに記載のGABA産生促進剤。
【請求項6】
食品組成物、栄養補助食品、食品添加剤、又は医薬である、請求項１～４のいずれかに記載のGABA産生促進剤。
【請求項7】
経口組成物である、請求項１～４のいずれかに記載のGABA産生促進剤。
【請求項8】
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、GAD活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、GABA産生促進剤等に関する。
【背景技術】
【0002】
GABA（gamma-Aminobutyric acid（γ－アミノ酪酸））は、各種食物に含まれているアミノ酸の一種である。GABAは神経伝達物質として作用することが知られており、また、GABAは、種々の有用作用、例えば脂質代謝向上、血圧改善、ストレス緩和等を有することが報告されている。このため、これらの作用を期待したGABA高含有食品が、各種市販されている。
【0003】
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、食品材料として利用されている。また、ユーグレナ抽出物を皮膚に適用することも行われている（特許文献１）。また、パラミロンは、ミドリムシが産生するβ－1,3－グルカンであり、創傷治療やアレルギー抑制などに有用であることが報告されている。しかしながら、ユーグレナやβ－1,3－グルカンとGABAとの関連については未だしられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表2008－526954号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、GABA産生促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、GABA産生促進剤、であれば、上記課題を解決できることを見出した。また、上記成分が、GABA合成酵素であるGAD（glutamic acid decarboxylase、グルタミン酸脱炭酸酵素）を活性化することも見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【0007】
項１． ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、GABA産生促進剤。
【0008】
項２． ユーグレナ、パラミロン、及びパラミロン加工物からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、項１に記載のGABA産生促進剤。
【0009】
項３． ユーグレナ及び／又はパラミロンを含有し、且つ
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである且つ／或いは前記パラミロンがユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンである、
項１又は２に記載のGABA産生促進剤。
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである且つ／或いは前記パラミロンがユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンである、
項１又は２に記載のGABA産生促進剤。
【0010】
項４． 前記ユーグレナ及び／又はパラミロンを含有し、且つ
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である且つ／或いは前記パラミロンがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンである、
項１又は２に記載のGABA産生促進剤。
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である且つ／或いは前記パラミロンがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンである、
項１又は２に記載のGABA産生促進剤。
【0011】
項５． 脂質代謝向上、血圧改善、ストレス緩和、疲労感の軽減、睡眠の改善、肌弾力の改善、認知機能の改善、リラクゼーション誘導、α波放出促進、成長ホルモン分泌促進、筋肉量の増加、活力の改善、及び心の健康の改善からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための、項１～４のいずれかに記載のGABA産生促進剤。
【0012】
項６． 食品組成物、栄養補助食品、食品添加剤、又は医薬である、項１～５のいずれかに記載のGABA産生促進剤。
【0013】
項７． 経口組成物である、項１～６のいずれかに記載のGABA産生促進剤。
【0014】
項８． ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、GAD活性化剤。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、GABA産生促進剤及びGAD活性化剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】試験例1の血中のGABA量の測定結果を示すグラフである。横軸中、対照群は、ラードを添加した高脂肪食を摂取させた群であり、試験群は、高脂肪食に含まれるセルロースに代えてパラミロンを添加した高脂肪食を摂取させた群である。縦軸は、CE-TOFMSで測定されたGABAの相対面積値を示す。
【図2】試験例2の空腸のGAD遺伝子発現量の測定結果を示すグラフである。対照群は、ラードを添加した高脂肪食を摂取させた群であり、試験群は、高脂肪食に含まれるセルロースに代えてパラミロンを添加した高脂肪食を摂取させた群である。縦軸は、GAD遺伝子発現量をコントロール（36B4遺伝子）発現量で除してなる値について、対照群の値を1とした場合の相対値を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【0018】
本発明は、その一態様において、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、GABA産生促進剤／GAD活性化剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【0019】
1．ユーグレナ
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、その限りにおいて特に制限されない。ユーグレナとして、具体的には、例えばEuglena gracilis（ユーグレナ・グラシリス）、Euglena longa、Euglena caudata、Euglena oxyuris、Euglena tripteris、Euglena proxima、Euglena viridis、Euglena sociabilis、Euglena ehrenbergii、Euglena deses、Euglena pisciformis、Euglena spirogyra、Euglena acus、Euglena geniculata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena sanguinea、Euglena stellata、Euglena terricola、Euglena klebsi、Euglena rubra、Euglena cyclopicolaなどが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点から、好ましくはユーグレナ・グラシリスが挙げられ、より好ましくはユーグレナ・グラシリスEOD-1株［2013年6月28日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター｛NITE-IPOD（郵便番号292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）｝にブダペスト条約の規定下で、受託番号FERM BP-11530として国際寄託済み］が挙げられる。
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、その限りにおいて特に制限されない。ユーグレナとして、具体的には、例えばEuglena gracilis（ユーグレナ・グラシリス）、Euglena longa、Euglena caudata、Euglena oxyuris、Euglena tripteris、Euglena proxima、Euglena viridis、Euglena sociabilis、Euglena ehrenbergii、Euglena deses、Euglena pisciformis、Euglena spirogyra、Euglena acus、Euglena geniculata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena sanguinea、Euglena stellata、Euglena terricola、Euglena klebsi、Euglena rubra、Euglena cyclopicolaなどが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点から、好ましくはユーグレナ・グラシリスが挙げられ、より好ましくはユーグレナ・グラシリスEOD-1株［2013年6月28日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター｛NITE-IPOD（郵便番号292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）｝にブダペスト条約の規定下で、受託番号FERM BP-11530として国際寄託済み］が挙げられる。
【0020】
ユーグレナの形態は、ユーグレナの細胞体又はその成分の大半を含むものである限り、特に制限されない。ユーグレナの形態としては、例えばユーグレナの乾燥粉末形態、ユーグレナの懸濁液、ユーグレナエキス等が挙げられ、中でも、好ましくはユーグレナの乾燥粉末形態が挙げられる。
【0021】
ユーグレナの乾燥状態におけるパラミロン含有率は、例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上である。
【0022】
ユーグレナは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【0023】
2．β－1,3－グルカン、パラミロン
β－1,3－グルカンは、グルコースがβ1,3結合のみで連結してなる1本の糖鎖（又は糖鎖構造）を主鎖として有するものであれば特に制限されない。β－1,3－グルカンは、直鎖状のものに限らず、分枝鎖を有するものも包含する。
β－1,3－グルカンは、グルコースがβ1,3結合のみで連結してなる1本の糖鎖（又は糖鎖構造）を主鎖として有するものであれば特に制限されない。β－1,3－グルカンは、直鎖状のものに限らず、分枝鎖を有するものも包含する。
【0024】
β－1,3－グルカン誘導体の重量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104～2×106、好ましくは5×104～1×106、更に好ましくは1×105～1×106ある。なお、重量平均分子量は、GPC法により測定することができる。
【0025】
β－1,3－グルカンは、化学合成により得られたものであってもよいが、入手容易性等の観点から、各種生物が産生する天然β－1,3－グルカンが好ましい。天然β－1,3－グルカンとしては、例えばパラミロン、カードラン、ラミナラン、カロース、レンチナン、シゾフィラン等が挙げられる。これらの中でも、特に好ましくはパラミロンが挙げられる。以下、パラミロンについて説明する。
【0026】
パラミロンは、ユーグレナ由来のβ－1,3－グルカンであり、その限りにおいて特に制限されない。
【0027】
パラミロンが由来するユーグレナについては、上記「1．ユーグレナ」における説明と同様である。
【0028】
パラミロンの質量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104～5×106、好ましくは2×104～1×106、より好ましくは5×104～1×106、さらに好ましくは1×105～5×105である。
【0029】
なお、質量平均分子量は、SEC-MALS分析により、以下の条件で測定 することができる：
検出器：多角度散乱検出器（Wyatt Technology製DAWN HELEOS II）
示差屈折計検出器（Wyatt Technology製Optilab T-rEX）
使用カラム：TSKgel α-M 2本（東ソー製）
移動相：0.05M臭化カリウム添加DMSO
流 速：0.5 mL/min。
検出器：多角度散乱検出器（Wyatt Technology製DAWN HELEOS II）
示差屈折計検出器（Wyatt Technology製Optilab T-rEX）
使用カラム：TSKgel α-M 2本（東ソー製）
移動相：0.05M臭化カリウム添加DMSO
流 速：0.5 mL/min。
【0030】
パラミロンは、ユーグレナの細胞内において、通常、β－1,3－グルカン鎖が形成する3重螺旋構造体が一定の規則性の基に高度に集積してなるパラミロン粒子として存在している。
【0031】
パラミロン粒子の形状は、特に制限されないが、通常は、偏平な回転楕円体状である。
【0032】
パラミロン粒子の粒子径分布は、特に制限されないが、例えば0.5～15μm、好ましくは1～6μmである。また、パラミロン粒子の平均粒子径も特に制限されないが、例えば1～10、好ましくは2～4μmである。
【0033】
パラミロンの形態は、パラミロンを含むものである限り、特に制限されない。ユーグレナの形態としては、例えばパラミロンの乾燥粉末形態、パラミロンの懸濁液等が挙げられ、中でも、好ましくはパラミロンの乾燥粉末形態が挙げられる。
【0034】
本発明の剤は、その一態様において、精製パラミロンを含有することが好ましい。
【0035】
パラミロンは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【0036】
3．ユーグレナ及びパラミロンの製造方法
ユーグレナは、液体に含まれたユーグレナを培養する工程（培養工程）を含む方法により、大量に調製することが可能である。培養工程は、例えば公知の方法（例えば、特許第5883532号公報に記載の方法）に従って行うことができる。該培養工程では、典型的には、水と、ユーグレナと、ユーグレナが利用できる栄養素とを含む液体（培養液）を撹拌しつつ好気条件でユーグレナ属微細藻類を培養する。
ユーグレナは、液体に含まれたユーグレナを培養する工程（培養工程）を含む方法により、大量に調製することが可能である。培養工程は、例えば公知の方法（例えば、特許第5883532号公報に記載の方法）に従って行うことができる。該培養工程では、典型的には、水と、ユーグレナと、ユーグレナが利用できる栄養素とを含む液体（培養液）を撹拌しつつ好気条件でユーグレナ属微細藻類を培養する。
【0037】
栄養素としては、糖類（グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）などの単糖類）、ミネラル類（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、モリブデン、銅、リン、窒素、硫黄、又は、ホウ素など）、ビタミンB類（例えばビタミンB1（チアミン）、ビタミンB2（リボフラビン）、ナイアシン、パントテン酸、ビタミンB6（ピリドキシン、ピリドキサール、又はピリドキサミン）、ビタミンB12（シアノコバラミン）、葉酸、ビオチンなど）などが挙げられる。培養液中の栄養素の濃度は、ユーグレナの生存、増殖等が可能な濃度である限り特に制限されない。
【0038】
培養工程の光条件は特に制限されず、培養工程は明条件と暗条件のいずれで行われてもよい。従属栄養培養にて培養する際には暗条件で培養される。明条件としては、藻類を増殖させるための通常の光強度を採用することができる。暗条件としては、例えば10μmol/m2/s未満、好ましくは光が全く当たらない完全な暗所条件が挙げられる。
【0039】
培養工程における培養温度は、ユーグレナが増殖できる温度であれば、特に限定されない。該培養温度（培養液の温度）としては、例えば、20℃～35℃が採用される。
【0040】
培養工程における液体のpHは、ユーグレナが増殖できるpHであれば、特に限定されない。ユーグレナが増殖できるpHとしては、例えば3.0～5.5が採用される。
【0041】
培養工程の後に、液体の遠心分離や重力分離などによってユーグレナを濃縮することが好ましい。得られたユーグレナは、所望の形態に応じて、追加の処理（例えば、液体への懸濁、水中又は油中への分散、エキス抽出、乾燥粉末化等）に供することができる。
【0042】
パラミロン粒子は、公知の方法（例えば特許第5883532号公報に記載の方法）に従って又は準じて、ミドリムシから分離、単離、又は精製することによって製造することができる。パラミロン粒子は、例えばミドリムシの細胞膜を破壊することによって得られる細胞内容成分を回収することによって、容易に得ることができる。また、必要に応じて、パラミロン粒子を精製してもよい。パラミロン粒子の精製については各種知られており（例えば、特許第5883532号公報）、それらの方法に従って行うことができる。精製工程としては、例えば、界面活性剤処理工程、洗浄工程などが挙げられる。得られたユーグレナは、所望の形態に応じて、追加の処理（例えば、液体への懸濁、水中又は油中への分散、乾燥粉末化等）に供することができる。
【0043】
4．パラミロン加工物
パラミロン加工物は、パラミロンに対して加工処理、例えば物理処理、化学処理等することによって得られるものであり、その限りにおいて特に制限されない。パラミロン加工物としては、例えば、繊維化パラミロン、アモルファスパラミロン等が挙げられる。アモルファスパラミロンは、公知の方法に従って又は準じて、例えば特開2011－184592号公報に記載の方法を用いて化学的に処理することにより、得ることができる。
パラミロン加工物は、パラミロンに対して加工処理、例えば物理処理、化学処理等することによって得られるものであり、その限りにおいて特に制限されない。パラミロン加工物としては、例えば、繊維化パラミロン、アモルファスパラミロン等が挙げられる。アモルファスパラミロンは、公知の方法に従って又は準じて、例えば特開2011－184592号公報に記載の方法を用いて化学的に処理することにより、得ることができる。
【0044】
パラミロン加工物としては、繊維化パラミロンが好ましい。以下に、繊維化パラミロンについて説明する。
【0045】
繊維化パラミロンは、ユーグレナ由来のβ－1,3－グルカンであり、繊維状の形態のものである限りにおいて特に制限されない。これまで、パラミロン粒子を化学処理（アルカリ処理等）して得られたアモルファスパラミロンが報告されているが、これは、電子顕微鏡で観察すると繊維化であるとは認められず、形や大きさが不定形の塊であるため、繊維化パラミロンには包含されない。
【0046】
繊維化パラミロンの重量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104～2×107、好ましくは1×105～5×105である。
【0047】
なお、重量平均分子量は、SEC-MALS分析により、以下の方法で測定することができる：検出器：多角度散乱検出器（Wyatt Technology製DAWN HELEOS II）
示差屈折計検出器（Wyatt Technology製Optilab T-rEX）
使用カラム：TSKgel α-M 2本（東ソー製）
移動相：0.05M臭化カリウム添加DMSO
流 速：0.5 mL/min。
示差屈折計検出器（Wyatt Technology製Optilab T-rEX）
使用カラム：TSKgel α-M 2本（東ソー製）
移動相：0.05M臭化カリウム添加DMSO
流 速：0.5 mL/min。
【0048】
繊維化パラミロンの繊維の直径は、特に制限されないが、例えば10～500 nm、好ましくは20～300 nm、より好ましくは50～200 nmである。繊維化パラミロンの繊維の直径は、通常、繊維化パラミロンの電子顕微鏡像に基づいて測定することができる。
【0049】
繊維化パラミロンの水中沈定体積は、特に制限されないが、例えば30～300 mL/g、好ましくは50～250 mL/g、より好ましくは70～200 mL/gである。
【0050】
水中沈定体積は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
「日本食物繊維学会監修、日本食物繊維学会編集委員会編（２００８）食物繊維 ‐基礎と応用‐ 第３版, ｐ．１１１ 第一出版, 東京」に記載されている方法に準じて測定を行う。具体的には、次の通りである。サンプルのスラリー状の試験試料を、25 mL容積のプラスチックチューブに、乾燥質量換算で125 mg計り取り、プラスチックチューブを手で激しく振って、内容物を撹拌する。その後、25 mL容積のメスシリンダーに内容物を移し、25 mLになるまで純水を加える。メスシリンダー内の液体を撹拌した後、37℃で24時間静置する。これによりサンプルが沈殿し、界面を介して分けられる2つの層（沈殿したサンプルを主に含む層（下層）、及び水を主に含む層（上層））が生じる。下層の体積をメスシリンダーの目盛から求め、得られた体積をサンプル質量（乾燥質量）で除して、水中沈定体積（mL/g）を算出する。試験は3回又は4回行い、平均値及び標準偏差を算出する。
「日本食物繊維学会監修、日本食物繊維学会編集委員会編（２００８）食物繊維 ‐基礎と応用‐ 第３版, ｐ．１１１ 第一出版, 東京」に記載されている方法に準じて測定を行う。具体的には、次の通りである。サンプルのスラリー状の試験試料を、25 mL容積のプラスチックチューブに、乾燥質量換算で125 mg計り取り、プラスチックチューブを手で激しく振って、内容物を撹拌する。その後、25 mL容積のメスシリンダーに内容物を移し、25 mLになるまで純水を加える。メスシリンダー内の液体を撹拌した後、37℃で24時間静置する。これによりサンプルが沈殿し、界面を介して分けられる2つの層（沈殿したサンプルを主に含む層（下層）、及び水を主に含む層（上層））が生じる。下層の体積をメスシリンダーの目盛から求め、得られた体積をサンプル質量（乾燥質量）で除して、水中沈定体積（mL/g）を算出する。試験は3回又は4回行い、平均値及び標準偏差を算出する。
【0051】
繊維化パラミロンは、酵素による分解に対して、比較的高い耐性を有する。例えば、βグルカナーゼの分解により生成されるモノマー（グルコース）の量は、繊維化パラミロン1 g当たり、例えば0.1～50 mg、好ましくは1～10 mgである。
【0052】
この量は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
反応液［被検物質30 mg（乾燥重量）、緩衝液（東京化成工業社製 B0156、フタル酸水素カリウム-水酸化ナトリウムバッファー (pH4.0)）5 mL、酵素液（日本バイオコン社製 endo-1,3-β-Glucanase (酵素含有量：50 units/mL)）0.1 mL、純水、反応液量 10 mL］を調製し、40℃で24時間、45 rpmで水平振盪する。振盪後、直ちに凍結保存し、濃縮のために凍結乾燥する。凍結乾燥後、各試料に純水を0.5 mLずつ加え、攪拌する（20倍濃縮）。遠心分離（10000G、5分間、4℃）し、上澄を回収する作業を2回繰り返す。回収した上澄中のグルコース濃度を、測定キット（和光純薬工業社製、グルコースCII-テストワコー）を用いて測定する。測定値に基づいて、被検物質1 g当たりのグルコース生成量（mg）を算出する。
反応液［被検物質30 mg（乾燥重量）、緩衝液（東京化成工業社製 B0156、フタル酸水素カリウム-水酸化ナトリウムバッファー (pH4.0)）5 mL、酵素液（日本バイオコン社製 endo-1,3-β-Glucanase (酵素含有量：50 units/mL)）0.1 mL、純水、反応液量 10 mL］を調製し、40℃で24時間、45 rpmで水平振盪する。振盪後、直ちに凍結保存し、濃縮のために凍結乾燥する。凍結乾燥後、各試料に純水を0.5 mLずつ加え、攪拌する（20倍濃縮）。遠心分離（10000G、5分間、4℃）し、上澄を回収する作業を2回繰り返す。回収した上澄中のグルコース濃度を、測定キット（和光純薬工業社製、グルコースCII-テストワコー）を用いて測定する。測定値に基づいて、被検物質1 g当たりのグルコース生成量（mg）を算出する。
【0053】
繊維化パラミロンは、アルカリ溶液への溶解性が、比較的低い。例えば、繊維化パラミロンは、0.1～0.3Mの水酸化ナトリウム水溶液に対して溶解しない。ここで、「溶解しない」とは、例えば、当該水溶液に繊維化パラミロンを懸濁した後（例えば、直後～1時間経過後）の溶液の吸光度（660 nm）が、例えば0.1以上、好ましくは1.0以上であることを意味する。
【0054】
溶解性は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
被検物質250 mg（乾燥重量）をバイアル中の試験液（純水、0.1M NaOH水溶液、0.3M NaOH水溶液）10 mLに懸濁する。バイアルを20秒間、手で激しく振った後、およびシェーカーで80 rpmで1時間振盪した後に、それぞれバイアル中の液の660 nmにおける吸光度を測定する。なお、吸光度の測定は、日本分光株式会社製分光光度計 V-730を用いて行う。
被検物質250 mg（乾燥重量）をバイアル中の試験液（純水、0.1M NaOH水溶液、0.3M NaOH水溶液）10 mLに懸濁する。バイアルを20秒間、手で激しく振った後、およびシェーカーで80 rpmで1時間振盪した後に、それぞれバイアル中の液の660 nmにおける吸光度を測定する。なお、吸光度の測定は、日本分光株式会社製分光光度計 V-730を用いて行う。
【0055】
繊維化パラミロンの結晶化度の粒状パラミロンに対する相対値（繊維化パラミロンの結晶化度／粒状パラミロンの結晶化度）は、例えば0.60～0.90、好ましくは0.65～0.80である。
【0056】
結晶化度は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
被検物質について、XRD測定する。条件は次のとおりである。機器：PANalytical X’Pert3 Powder、管電圧：45kV、管電流：40mA、測定範囲：5.005～50.018°、測定間隔：0.013°、解析ソフト：HighScore。結晶化度は2θ=5～80°における非晶質部の強度と結晶部の強度の比により解析する。解析は各測定テ一夕から装置によるバックグラウンドを除去（バックグラウンド設定Auto、ベンティングファクター0、粒状度100）した後に実施し、非晶質部は2θ=14、29°を通る接線で決定する。それぞれの非晶質部を決定するペンディングファクターと粒状度の条件は、0/20とする。
被検物質について、XRD測定する。条件は次のとおりである。機器：PANalytical X’Pert3 Powder、管電圧：45kV、管電流：40mA、測定範囲：5.005～50.018°、測定間隔：0.013°、解析ソフト：HighScore。結晶化度は2θ=5～80°における非晶質部の強度と結晶部の強度の比により解析する。解析は各測定テ一夕から装置によるバックグラウンドを除去（バックグラウンド設定Auto、ベンティングファクター0、粒状度100）した後に実施し、非晶質部は2θ=14、29°を通る接線で決定する。それぞれの非晶質部を決定するペンディングファクターと粒状度の条件は、0/20とする。
【0057】
繊維化パラミロンは、水などの溶媒に分散した形態であってもよいし、乾燥形態であってもよい。繊維化パラミロンは、乾燥形態であっても、水に再分散することが可能である。
【0058】
なお、本明細書において、「乾燥形態」とは、水分含量が15質量％以下、好ましくは10質量％以下、より好ましくは5質量％以下であることを示す。
【0059】
繊維化パラミロンとしては、好ましくはこのパラミロン粒子を物理的に解繊処理して得られる、パラミロン粒子の解繊物を用いることができる。また、この解繊処理をユーグレナに適用することによって得られる、ユーグレナの解繊処理物を、繊維化パラミロンとして用いることもできる。
【0060】
解繊処理は、パラミロン粒子中に存在するβ-1,3グルカンの水素結合をほとんど切断せずに（例えば、β-1,3グルカンの水素結合の10％以下、5％以下、2％以下、1％以下しか切断せずに）解繊することができる処理、又はパラミロン粒子中に存在するβ－1,3－グルカン鎖又はこれが形成する3重螺旋構造体の一部又は全部を解くことができる処理である限り特に制限されない。好ましくはパラミロン粒子中に存在するβ-1,3グルカンの水素結合をほとんど切断せずに解繊処理し、繊維状とすることが好ましい。パラミロン粒子の様な微粒子を摩砕（せん断）又は粉砕（好ましくは摩砕（せん断））することができる公知の処理を、解繊処理として採用することができる。
【0061】
解繊処理は、公知の摩砕機（せん断機）、粉砕機などの装置を用いて行うことができる。解繊処理に用いる装置としては、例えば石臼式摩砕機、ジェットミル、二軸混練機、高圧ホモジナイザー、高圧乳化機、二軸押し出し機、ビーズミルなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくは石臼式摩砕機やビーズミルが挙げられる。
【0062】
解繊処理は、湿式で行うことも、乾式で行うこともできる。湿式で解繊処理を行う方が、繊維化パラミロンをより効率的に溶液中に分散させることが可能となり、好ましい。湿式で行う場合の溶媒としては、繊維化パラミロンを分散可能な溶媒である限り特に制限されず、水を好適に用いることができる。
【0063】
解繊処理は、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。また、一部が解繊処理されたパラミロンであってもよく、解繊処理されたパラミロンを含む限り本発明の意図するものである。
【0064】
5．用途
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種（以下、「本発明の有効成分」と示すこともある。）は、GABA産生促進作用、GAD活性化作用を有することから、GABA産生促進剤、GAD活性化剤の有効成分として利用することができる。
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ－1,3－グルカンからなる群より選択される少なくとも1種（以下、「本発明の有効成分」と示すこともある。）は、GABA産生促進作用、GAD活性化作用を有することから、GABA産生促進剤、GAD活性化剤の有効成分として利用することができる。
【0065】
「GABA産生促進」とは、体内でのGABA産生を促進することであり、これにより例えば体内（例えば血中）のGABA量を増加させることができる。
【0066】
「GAD活性化」とは、体内でのGAD活性を促進することであり、具体的には例えばGAD発現／産生促進を包含する。これにより、体内（例えば腸（好ましくは小腸（空腸、回腸等）））のGAD量を増加させることができ、GABA産生促進効果を得ることができる。
【0067】
本発明の有効成分は、上記作用に基づいて、脂質代謝向上（例えば、（血中の）中性脂肪抑制、（血中の）遊離脂肪酸抑制等）、血圧改善（具体的には、血圧抑制）、ストレス緩和、疲労感の軽減、睡眠の改善、肌弾力の改善、認知機能の改善、リラクゼーション誘導、α波放出促進、成長ホルモン分泌促進、筋肉量の増加、活力の改善、心の健康の改善等に利用することができる。
【0068】
本発明の有効成分は、好ましくは、上記の用途の内の複数（2つ以上、より好ましくは3つ以上、さらに好ましくは4つ以上、よりさらに好ましくは5つ以上、よりさらに好ましくは6つ以上）の用途を含む包括的な用途に利用することができる。
【0069】
なお、「改善」とは、症状又は状態の好転又は緩和、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、「抑制」とは、低下させることのみならず、増加又は悪化基調にあるものの増加又は悪化を抑える（増加幅又は悪化の程度を低下させる、増加又は悪化させない）ことを包含する。 さらに、「促進」とは、増加させることのみならず、低下基調にあるものの低下を抑える（低下幅の程度を低下させる、低下させない）ことを包含する。
また、「抑制」とは、低下させることのみならず、増加又は悪化基調にあるものの増加又は悪化を抑える（増加幅又は悪化の程度を低下させる、増加又は悪化させない）ことを包含する。 さらに、「促進」とは、増加させることのみならず、低下基調にあるものの低下を抑える（低下幅の程度を低下させる、低下させない）ことを包含する。
【0070】
さらには、本発明の有効成分は、以下に列挙する用途、目的、対象：
（a）中性脂肪を低下させる・改善する
（b）中性脂肪が高めの方に
（c）遊離脂肪酸を減らす
（d）血圧を下げる・改善する
（e）血圧が高めな方に
（f）事務作業を伴うストレスを緩和する
（g）ストレス改善
（h）デスクワークなどに伴う疲労感を軽減する
（i）精神的疲労感を軽減する
（j）睡眠の質を改善する・高める
（k）眠りの深さを改善する
（l）すっきりとした目覚めに
（m）睡眠サポート
（n）肌の弾力を維持する
（o）肌の健康を守るのを助ける
（p）加齢に伴って低下する認知機能を維持・改善する
（q）記憶力、空間認知力、論理的思考力、持続的注意力、ワーキングメモリ―（作業記憶）を維持・改善する
（r）見たり聞いたりしたことを思い出す力を維持・改善する
（s）物の位置、形、向きなどを正確に把握する力を維持・改善する
（t）筋道を立てて物事を考え、答えを導き出す力を維持・改善する
（u）注意を持続させながら、作業を続ける力を維持・改善する
（v）作業に必要な情報を整理し、短期的に記憶する力を維持・改善する
（w）成長ホルモンの分泌を促す
（x）加齢に伴って低下する筋肉量を維持する、増加させる
（y）活力を維持・改善する
（z）心の健康を維持・改善する
（aa）リラックス作用があります
等に利用することもできる。
（a）中性脂肪を低下させる・改善する
（b）中性脂肪が高めの方に
（c）遊離脂肪酸を減らす
（d）血圧を下げる・改善する
（e）血圧が高めな方に
（f）事務作業を伴うストレスを緩和する
（g）ストレス改善
（h）デスクワークなどに伴う疲労感を軽減する
（i）精神的疲労感を軽減する
（j）睡眠の質を改善する・高める
（k）眠りの深さを改善する
（l）すっきりとした目覚めに
（m）睡眠サポート
（n）肌の弾力を維持する
（o）肌の健康を守るのを助ける
（p）加齢に伴って低下する認知機能を維持・改善する
（q）記憶力、空間認知力、論理的思考力、持続的注意力、ワーキングメモリ―（作業記憶）を維持・改善する
（r）見たり聞いたりしたことを思い出す力を維持・改善する
（s）物の位置、形、向きなどを正確に把握する力を維持・改善する
（t）筋道を立てて物事を考え、答えを導き出す力を維持・改善する
（u）注意を持続させながら、作業を続ける力を維持・改善する
（v）作業に必要な情報を整理し、短期的に記憶する力を維持・改善する
（w）成長ホルモンの分泌を促す
（x）加齢に伴って低下する筋肉量を維持する、増加させる
（y）活力を維持・改善する
（z）心の健康を維持・改善する
（aa）リラックス作用があります
等に利用することもできる。
【0071】
本発明の剤は、各種分野において、例えば食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、医薬、試薬、飼料などとして用いることができる。本発明の剤は、好ましくは経口組成物である。
【0072】
本発明の剤の形態は、特に限定されず、用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
【0073】
本発明の剤の形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳などの飲料、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、乳製品（例えば、粉末状、液状、ゲル状、固形状等）、パン、菓子（例えば、クッキー等）などが挙げられる。
【0074】
本発明の剤の形態としては、用途が化粧品である場合は、例えば乳液、化粧液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、ボディソープ、シャンプー、リンス、化粧用ゲル、パック、ファンデーション、リップクリーム、洗顔剤等が挙げられる。
【0075】
本発明の剤の形態としては、用途が医薬である場合は、例えば軟膏剤、外用液剤（リニメント剤、ローション剤等）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等）、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤（プラスター剤、硬膏剤等のテープ剤（リザーバー型、マトリックス型等）、パップ剤、パッチ剤、マイクロニードル等）、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤等の非経口摂取に適した製剤形態（特に、外用製剤形態）； 錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）が挙げられる。
【0076】
本発明の剤の形態としては、用途が添加剤、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などが挙げられる。
【0077】
本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、医薬、試薬、飼料などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
【0078】
本発明の剤における有効成分の含有量は、用途、使用態様、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100質量％、好ましくは0.001～50質量％とすることができる。
【0079】
本発明の剤の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、GABA産生促進作用を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の乾燥重量として、一般に1日あたり0.1～10000 mg/kg体重である。上記適用量は1日1回以上（例えば1～3回）に分けて適用するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【0080】
本発明の好ましい一態様において、ユーグレナ又はパラミロン適用量（乾燥重量）は、1日あたり、好ましくは100～10000mg、より好ましくは1000～7000mg、さらに好ましくは2000～5000mgである。適用期間は、好ましくは1週間以上、より好ましくは4週間以上、さらに好ましくは8週間以上である、さらに長期間（10週間以上、15週間以上、又は20週間以上）適用することも可能である。本発明の有効成分は天然由来であり安全性が高いので適用期間の上限は特に制限されないが、例えば3年間、1年間、6ヶ月間、4ヶ月間である。
【実施例0081】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【0082】
参考例1
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリスEOD-1株（独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（NITE-IPOD）の乾燥粉末（神鋼環境ソリューション製、パラミロン含有率70％以上）を準備した。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリスEOD-1株（独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（NITE-IPOD）の乾燥粉末（神鋼環境ソリューション製、パラミロン含有率70％以上）を準備した。
【0083】
参考例2
パラミロン粒子を以下のようにして調製した。
パラミロン粒子を以下のようにして調製した。
【0084】
準備したユーグレナ・グラシリスEOD-1株（培養後、乾燥前の状態のもの）を、5フラスコ分の液体を集め、集めた液体を遠心管内で遠心分離（500×g、4分間、室温）した。遠心管内の上澄み液をいったん取り除いて回収した。回収した上澄み液を遠心管に入れて遠心管内の沈殿物を分散させ、100 mL容積のメスシリンダーに全て移した。さらに、メスシリンダーに、回収した上澄み液を加えて、90 mLにメスアップした。
【0085】
［酵素処理工程］
90 mLにメスアップした液体を200 mLビーカーに移し、撹拌しながら塩酸水溶液を添加することによって液体のpHを3に調整した。タンパク質分解酵素（酸性プロテアーゼ 製品名「プロテアーゼＹＰ－ＳＳ」ヤクルト薬品工業社製 至適pH2.5~3.0）を5 g／L濃度となるように液体に添加した。液体を撹拌しつつ50℃にて2時間、酵素処理を施した。
90 mLにメスアップした液体を200 mLビーカーに移し、撹拌しながら塩酸水溶液を添加することによって液体のpHを3に調整した。タンパク質分解酵素（酸性プロテアーゼ 製品名「プロテアーゼＹＰ－ＳＳ」ヤクルト薬品工業社製 至適pH2.5~3.0）を5 g／L濃度となるように液体に添加した。液体を撹拌しつつ50℃にて2時間、酵素処理を施した。
【0086】
［界面活性剤処理工程］
ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が3.0質量／容量（w／v）％となるように、酵素処理工程を経た液体に、ドデシル硫酸ナトリウムの水溶液を加えた。ドデシル硫酸ナトリウムを含む液体を撹拌しつつ、塩酸水溶液の添加によって液体のpHを3に調整した。さらに、液体をプロペラ撹拌機（回転速度200 rpm）で60℃にて30分間撹拌した。
ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が3.0質量／容量（w／v）％となるように、酵素処理工程を経た液体に、ドデシル硫酸ナトリウムの水溶液を加えた。ドデシル硫酸ナトリウムを含む液体を撹拌しつつ、塩酸水溶液の添加によって液体のpHを3に調整した。さらに、液体をプロペラ撹拌機（回転速度200 rpm）で60℃にて30分間撹拌した。
【0087】
［分離工程］
遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させ、界面活性剤処理工程を経た液体から、パラミロンを分離した。ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が1.0質量／容量％となるように変更した点、pHを調整しなかった点以外は、同様にしてさらに界面活性剤処理工程を行った。その後、上記と同様にして分離工程を行った。このようにして、界面活性剤処理工程及び分離工程をそれぞれ3回ずつ行った。
遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させ、界面活性剤処理工程を経た液体から、パラミロンを分離した。ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が1.0質量／容量％となるように変更した点、pHを調整しなかった点以外は、同様にしてさらに界面活性剤処理工程を行った。その後、上記と同様にして分離工程を行った。このようにして、界面活性剤処理工程及び分離工程をそれぞれ3回ずつ行った。
【0088】
［洗浄工程］
分離工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、純水によって懸濁させ、40℃にて10分間静置した。次に、遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させた。このような操作を合計3回行った。
分離工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、純水によって懸濁させ、40℃にて10分間静置した。次に、遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させた。このような操作を合計3回行った。
【0089】
［乾燥工程］
洗浄工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、50℃にて乾燥させて、パラミロン粒子を得た。得られたパラミロン粒子を、以下の試験例でパラミロン（精製パラミロン）として用いた。
洗浄工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、50℃にて乾燥させて、パラミロン粒子を得た。得られたパラミロン粒子を、以下の試験例でパラミロン（精製パラミロン）として用いた。
【0090】
試験例1．GABAに対する影響の解析
マウスを、パラミロン（参考例2）を含む飼料を餌として飼育し、血中のGABA量を測定した。具体的には以下のようにして行った。
マウスを、パラミロン（参考例2）を含む飼料を餌として飼育し、血中のGABA量を測定した。具体的には以下のようにして行った。
【0091】
＜1-1．試験方法＞
4週齢の雄C57BL/6Jマウス（日本チャールズ・リバー社製）を用いた。固形飼料（NMF、オリエンタル酵母工業社製）で1週間の予備飼育後、体重が均一になるように、1群10匹ずつ、2群分けした。
4週齢の雄C57BL/6Jマウス（日本チャールズ・リバー社製）を用いた。固形飼料（NMF、オリエンタル酵母工業社製）で1週間の予備飼育後、体重が均一になるように、1群10匹ずつ、2群分けした。
【0092】
試験に用いた飼料については次のとおりである。対照群及び試験群の飼料には、脂肪エネルギー比が50％になるようにラードを20％添加した。対照群の飼料には、食物繊維重量割合が5％になるようにセルロースを添加し、試験群の飼料には、食物繊維重量割合が5％になるようにパラミロンを添加した。各群の飼料組成を表１に示す。表１中の数値は、飼料1kg中の各成分重量（g）である。
【0093】
【表1】
【0094】
試験において、マウスには上記飼料と水を12週間自由摂取させた。なお、飼育環境は、温度22±1℃、湿度50±5％、12時間の明暗サイクル（明期：8時→20時、暗期：20時→8時）とした。試験最終日に、マウスより門脈血を採取し、当該門脈血から血清を得て、－80℃で凍結させた。
【0095】
解凍後の血清をCE-TOFMSに供し、血清中のGABA量を測定した。具体的には以下のようにして行った。
【0096】
＜前処理＞
内部標準物質（Cation mode：L-Methionine Sulfone, Anion mode：D-Camphor-10-sulfonic acid）の濃度が20μMとなるように調製した200μLのメタノール溶液に、50μLのマウス門脈血の血清を添加して撹拌した。これに150μLのMilli-Q水を加えて撹拌し、限外ろ過チューブ（ウルトラフリーMC PLHCC, HMT, 遠心式フィルターユニット 5kDa）に300μL移し取った。これを遠心（9,100 × g, 4℃, 120分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び50μLのMilli-Q水に溶解して測定に供した。
内部標準物質（Cation mode：L-Methionine Sulfone, Anion mode：D-Camphor-10-sulfonic acid）の濃度が20μMとなるように調製した200μLのメタノール溶液に、50μLのマウス門脈血の血清を添加して撹拌した。これに150μLのMilli-Q水を加えて撹拌し、限外ろ過チューブ（ウルトラフリーMC PLHCC, HMT, 遠心式フィルターユニット 5kDa）に300μL移し取った。これを遠心（9,100 × g, 4℃, 120分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び50μLのMilli-Q水に溶解して測定に供した。
【0097】
＜測定＞
本試験ではカチオンモード、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。得られたピーク強度、形状から判断して、測定にはカチオン1倍、アニオン5倍希釈にて測定を行った。
本試験ではカチオンモード、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。得られたピーク強度、形状から判断して、測定にはカチオン1倍、アニオン5倍希釈にて測定を行った。
【0098】
陽イオン性代謝物質（カチオンモード）
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社） 6号機Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm × 80 cm 測定条件
Run buffer: Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)Rinse buffer: Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)Sample injection: Pressure injection 50 mbar, 10 secCE voltage: Positive, 30 kV
MS ionization: ESI Positive
MS capillary voltage: 4,000 V
MS scan range: m/z 50-1,000
Sheath liquid: HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020) 陰イオン性代謝物質（アニオンモード）
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社） 12号機Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm × 80 cm 測定条件
Run buffer: Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)Rinse buffer: Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)Sample injection: Pressure injection 50 mbar, 10 secCE voltage: Positive, 30 kV
MS ionization: ESI Negative
MS capillary voltage: 3,500 V
MS scan range: m/z 50-1,000
Sheath liquid: HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)。
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社） 6号機Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm × 80 cm 測定条件
Run buffer: Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)Rinse buffer: Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)Sample injection: Pressure injection 50 mbar, 10 secCE voltage: Positive, 30 kV
MS ionization: ESI Positive
MS capillary voltage: 4,000 V
MS scan range: m/z 50-1,000
Sheath liquid: HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020) 陰イオン性代謝物質（アニオンモード）
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社） 12号機Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm × 80 cm 測定条件
Run buffer: Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)Rinse buffer: Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)Sample injection: Pressure injection 50 mbar, 10 secCE voltage: Positive, 30 kV
MS ionization: ESI Negative
MS capillary voltage: 3,500 V
MS scan range: m/z 50-1,000
Sheath liquid: HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)。
【0099】
＜データ処理＞
CE-TOFMSで検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.2.18.0.1（慶應義塾大学開発）を用いて、シグナル/ノイズ (S/N) 比が3以上のピークを自動抽出し、質量電荷比 (m/z)、ピーク面積値、泳動時間 (Migration time: MT) を得た。得られたピーク面積値は相対面積値に変換した。変換式は次のとおりである：相対面積値＝目的ピークの面積値／（内部標準物質の面積値×試料量）。また、これらのデータにはNa+やK+などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、m/zとMTの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。
CE-TOFMSで検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.2.18.0.1（慶應義塾大学開発）を用いて、シグナル/ノイズ (S/N) 比が3以上のピークを自動抽出し、質量電荷比 (m/z)、ピーク面積値、泳動時間 (Migration time: MT) を得た。得られたピーク面積値は相対面積値に変換した。変換式は次のとおりである：相対面積値＝目的ピークの面積値／（内部標準物質の面積値×試料量）。また、これらのデータにはNa+やK+などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、m/zとMTの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。
【0100】
＜1-2．結果＞
結果を図１に示す。パラミロン摂取により血中のGABA量が大きく増加したことから、パラミロン及びこれを含むユーグレナはGABA産生促進作用を有することが分かった。
結果を図１に示す。パラミロン摂取により血中のGABA量が大きく増加したことから、パラミロン及びこれを含むユーグレナはGABA産生促進作用を有することが分かった。
【0101】
試験例2．GADに対する影響の解析
マウスを、パラミロン（参考例1）を含む飼料を餌として飼育し、GABA合成酵素（GAD）遺伝子の発現量を測定した。具体的には以下のようにして行った。
マウスを、パラミロン（参考例1）を含む飼料を餌として飼育し、GABA合成酵素（GAD）遺伝子の発現量を測定した。具体的には以下のようにして行った。
【0102】
＜2-1．試験方法＞
対照群及び試験群の飼料の自由摂取期間を83日間とする以外は試験例1と同様にして、飼育した。試験最終日に8時間絶食させ、イソフルラン／炭酸ガスにて安楽死させた。空腸を摘出し、RNA later（キアゲン社）にて保存し、RNA抽出用試料とした。
対照群及び試験群の飼料の自由摂取期間を83日間とする以外は試験例1と同様にして、飼育した。試験最終日に8時間絶食させ、イソフルラン／炭酸ガスにて安楽死させた。空腸を摘出し、RNA later（キアゲン社）にて保存し、RNA抽出用試料とした。
【0103】
空腸より、RNeasy mini kit（キアゲン社）を用いてRNAを抽出後、GAD遺伝子（glutamic acid decarboxylase 2、NCBI Gene ID：14417） mRNA発現量を、マイクロアレイ法（アレイ：SurePrint G3 Mouse GE 8x60K（Agilent）、機器：GeneChi Scanner 3000 7Gシステム（Thermo Fisher Scientific）、解析ソフト：Transcriptome Viewer（クラボウ））により測定した。また、同様にして、コントロールとして、36B4遺伝子（acidic ribosomal phosphoprotein P0）のmRNA発現量も測定した。
【0104】
＜2-2．結果＞
結果を図２に示す。パラミロン摂取により空腸におけるGAD遺伝子の発現が増加した。このことから、パラミロン及びこれを含むユーグレナはGAD活性化作用、GAD発現促進作用を有することが分かった。
結果を図２に示す。パラミロン摂取により空腸におけるGAD遺伝子の発現が増加した。このことから、パラミロン及びこれを含むユーグレナはGAD活性化作用、GAD発現促進作用を有することが分かった。
【図1】
【図2】