特開 2023-144018 クロロトキシン領域を含むキメラ抗原受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023144018

(43)【公開日】2023-10-06

(54)【発明の名称】クロロトキシン領域を含むキメラ抗原受容体

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20230928BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230928BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20230928BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20230928BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

A61P35/00

C07K19/00 ZNA

C12N5/10

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023129665

(22)【出願日】2023-08-09

(62)【分割の表示】P 2022007016の分割

【原出願日】2016-10-13

(31)【優先権主張番号】62/241,021

(32)【優先日】2015-10-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】598004424

【氏名又は名称】シティ・オブ・ホープ

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100091214

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 進介

(72)【発明者】

【氏名】バリッシュ，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，クリスティーン イー．

(72)【発明者】

【氏名】フォーマン スティーブン ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ドンルイ

(57)【要約】

【課題】キメラ膜貫通免疫受容体（ＣＡＲ）に関する。
【解決手段】ヒト神経膠腫又は他のヒト腫瘍細胞に結合する、クロロトキシン若しくは関連毒素又はクロロトキシンのバリアント若しくは関連毒素を含む細胞外領域、膜貫通領域、共刺激領域、並びに細胞内シグナリング領域を含む、キメラ膜貫通免疫受容体（ＣＡＲ）に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２６～４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞を含む組成物を患者に投与することを含む、膠芽腫に罹患している患者を治療するための方法。

【請求項2】

Ｔ細胞が、配列番号２６～４０のいずれか１つのアミノ酸配列からなるキメラ抗原受容体を発現する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

Ｔ細胞が、配列番号２６、２７、２８、３６、３７及び３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

Ｔ細胞が、配列番号２６、２７、２８、３６、３７及び３８のいずれか１つのアミノ酸配列からなるキメラ抗原受容体を発現する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

キメラ抗原受容体が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

Ｔ細胞の少なくとも５０％が、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞又は幹セントラルメモリー細胞である、請求項１記載の方法。

【請求項7】

Ｔ細胞の少なくとも６０％が、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞又は幹セントラルメモリー細胞である、請求項１記載の方法。

【請求項8】

Ｔ細胞の少なくとも７０％が、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞又は幹セントラルメモリー細胞である、請求項１記載の方法。

【請求項9】

Ｔ細胞の少なくとも８０％が、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞又は幹セントラルメモリー細胞である、請求項１記載の方法。

【請求項10】

Ｔ細胞の少なくとも５０％が、セントラルメモリーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

Ｔ細胞の少なくとも６０％が、セントラルメモリーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

Ｔ細胞の少なくとも７０％が、セントラルメモリーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

Ｔ細胞の少なくとも８０％が、セントラルメモリーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

キメラ抗原受容体が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項15】

キメラ抗原受容体が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

組換えＴ細胞を用いる治療を含む、腫瘍特異的Ｔ細胞に基づく免疫療法は、抗腫瘍治療のために研究されてきた。キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）は、細胞外腫瘍認識／標的化領域、細胞外リンカー／スペーサー、膜貫通領域、並びに細胞内Ｔ細胞活性化及び共刺激シグナル伝達領域で構成される。認識／標的化領域の設計は、有害な標的外効果（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ）を回避するのに極めて重要である。ＣＡＲ腫瘍標的化領域の大部分は、特定の抗原に結合する抗体の特異性を活用する、抗体配列に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ）である。ＩＬ‐１３受容体、ＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞を標的とするＩＬ－１３サイトカインＣＡＲ等の、通常の受容体リガンドに由来するＣＡＲ腫瘍標的化領域の例も存在する。いくつかの注目に値する成功に関わらず、新規なＣＡＲ腫瘍標的化領域の同定及び検証は、未だに本分野における主要な課題である。

【0002】

悪性神経膠腫（ＭＧ）は、未分化星状細胞腫（ＡＡ‐ＷＨＯグレードＩＩＩ）及び神経膠芽腫（ＧＢＭ‐ＷＨＯグレードＩＶ）を含み、米国において毎年約２０，０００新規症例が診断されている。米国脳腫瘍学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によれば、米国の２０１０年の国勢調査データに基づく、悪性脳腫瘍に罹患する個人の総有病者数は概ね１４０，０００人である。ＭＧは希少疾患であり、その悪性挙動及び概ね致死性の高度に攻撃的かつ異質である。現在の高グレード（高悪性度）のＭＧ用の標準治療法がもたらす利益は短期間で、これらの脳腫瘍は事実上治癒しえない。実際に、現代の外科的及び放射線治療技術でも、中枢神経系（ＣＮＳ）内という部位により既に重度の病的状態がしばしば悪化し、５年生存率はかなり低い。さらに、疾患が再発する患者の大多数の治療の選択肢はほとんどない。したがって、特に初期治療法後に再発／進行した患者のより効果的な治療法が極めて望まれる。

【0003】

ＣＡＲを発現する組換えＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）（ＡＣＴ）は、ＣＡＲ Ｔ細胞が抗原的に異なる腫瘍集団を特異的に認識するように組換えられ、ＭＧの再発率を低下させる安全かつ有効な方法を提供することができる（非特許文献１～５）。また、Ｔ細胞は、脳実質（ｂｒａｉｎ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ）を通って移動して、浸潤性悪性細胞を標的とし、死滅させることができる（非特許文献６～９）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０：９５６３０４

【非特許文献2】Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：４７４

【非特許文献3】Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０：９７２

【非特許文献4】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１２ １８：２１９９

【非特許文献5】Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｍｏ／ Ｔｈｅｒ ２１ ：６２９

【非特許文献6】Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：４８９２

【非特許文献7】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９：３３３２

【非特許文献8】Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：４８９２

【非特許文献9】Ｙａｇｈｏｕｂｉ ２００９ Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ ６：５３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書では、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域を含む、キメラ膜貫通免疫受容体（キメラ抗原受容体又はＣＡＲ）が記載される。細胞外領域は、クロロトキシン（サソリ（Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ）の毒液中に見出される３６アミノ酸ペプチド毒素）、若しくは関連毒素、又はクロロトキシン若しくは関連する毒素の変異体、並びに、場合によっては、例えば、ヒトＦｃ領域の一部分を含む、スペーサー、を含む。膜貫通部分は、例えば、ＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ２８膜貫通領域、又はＣＤ３膜貫通領域を含む。細胞内シグナル伝達領域は、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖（ＣＤ３ζ）からのシグナル伝達領域、及び一つ又はそれ以上の共刺激領域（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）、例えば４‐１ＢＢ共刺激領域、を含む。細胞外領域がＴ細胞の表面上に発現されると、ＣＡＲが、Ｔ細胞活性を、クロロトキシンの受容体を発現する当該細胞に指向させうる。当該細胞としては、神経膠芽腫細胞があげられる。細胞内領域内にＣＤ３ζと直列に、４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激領域等の共刺激領域を含むことにより、Ｔ細胞が共刺激シグナルを受容しうる。Ｔ細胞、例えば患者特異的な自己Ｔ細胞は、本明細書において記載されるＣＡＲｓを発現するように組換えられてよく、組換え細胞は、ＡＣＴで増殖され、用いられてよい。アルファベータ（αβ）Ｔ細胞及びガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞をともに含む、様々なＴ細胞サブセットが用いられうる。さらに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞等の他の免疫細胞においても発現されることができる。患者が本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞を用いて治療される場合、その細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）のＴ細胞又は同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）のＴ細胞であってよい。いくつかの場合、用いられる細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ４５ＲＡ－である、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）を含むセル集団であり、または、用いられる細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ_ＣＭ細胞、ステムセントラルメモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含むセル集団（すなわち、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団）である。Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋であり、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞の両方、並びに、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をともに含む。そのような細胞を用いると、他の種類の患者特異的Ｔ細胞を用いるのと比較して、養子移植後の細胞の長期の持続性を改善することができる。

【0006】

本明細書で記載されるのは、ＣＡＲをコードする核酸分子であって：クロロトキシン（ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＫＲＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ；配列番号１）、又は、システイン残基は修飾されない条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；膜貫通領域であり：ＣＤ４膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ２８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、から選択される、膜貫通領域；共刺激領域（例えば、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体及び４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体の両方；並びに、ＣＤ３ζシグナル伝達領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、を含む、核酸分子である。

【0007】

ある実施形態では、ＣＡＲは、クロロトキシンの代わりに、クロロトキシンに関連する毒素を含む。したがって、ＣＡＲは、ＧａＴｘ２、サソリ（Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ ｈｅｂｒａｅｕｓ）由来の毒素（ＶＳＣＥＤＣＰＤＨＣＳＴＱＫＡＲＡＫＣＤＮＤＫＣＶＣＥＰＩ；配列番号５６）、又は、システイン残基は修飾されない条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；膜貫通領域であり：ＣＤ４膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ２８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、から選択される、膜貫通領域；共刺激領域（例えば、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体及び４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体の両方；並びに、ＣＤ３ζシグナル伝達領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、を含んでもよい。

【0008】

ある実施形態では、ＣＡＲは、一つより多くのクロロトキシン配列（例えば、連続的であるか又は１‐１０個のアミノ酸によって分離されているかのいずれかの、二つ若しくは三つ又はそれ以上の配列番号１のコピー）、又は一つより多くのクロロトキシンに関連する毒素を含んでもよい。したがって、ＣＡＲは、二つ又はそれ以上のクロロトキシン配列（例えば、配列番号１、続いて配列番号１、続いてその分子の残り）を含んでもよく、或いは、ＣＡＲは、クロロトキシン配列に続いてクロロトキシンに関連する毒素の配列（例えば、配列番号５７又は図２５に示される他の毒素）を含んでもよい。

【0009】

ＣＡＲは、ＧａＴｘ１、サソリ（Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ ｈｅｂｒａｅｕｓ）由来の毒素（ＣＧＰＣＦＴＴＤＨＱＭＥＱＫＣＡＥＣＣＧＧＩＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＮＲ；配列番号５７）、又は、システイン残基は修飾されない条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；膜貫通領域であり：ＣＤ４膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ２８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、から選択される、膜貫通領域；共刺激領域（例えば、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体及び４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体の両方；並びに、ＣＤ３ζシグナル伝達領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、を含んでもよい。

【0010】

ＣＡＲは、ＡａＣｔｘ、サソリ（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）由来の毒素（ＭＣＩＰＣＦＴＴＮＰＮＭＡＡＫＣＮＡＣＣＧＳＲＲＧＳＣＲＧＰＱＣＩＣ；配列番号５８）、又は、システイン残基は修飾されない条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；膜貫通領域であり：ＣＤ４膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ２８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、から選択される、膜貫通領域；共刺激領域（例えば、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体及び４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体の両方；並びに、ＣＤ３ζシグナル伝達領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、を含んでもよい。

【0011】

ＣＡＲは、ＢｍＫＣＴ、サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉｉ）由来の毒素（ＣＧＰＣＦＴＴＤＡＮＭＡＲＫＣＲＥＣＣＧＧＩＧＫＣＦＧＰＱＣＬＣＮＲＩ；配列番号５９）、又は、システイン残基は修飾されない条件で１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；膜貫通領域であり：表２に示される膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ４膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ２８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通領域又は１‐１０個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、から選択される、膜貫通領域；共刺激領域（例えば、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するその変異体及び４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体の両方；並びに、ＣＤ３ζシグナル伝達領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、を含んでもよい。

【0012】

ある実施形態では、ＣＡＲは、クロロトキシン配列（配列番号１）が配列番号５６‐５９のうちのいずれか又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体によって置換された、配列番号２６‐５５のいずれかのアミノ酸配列を含む。

【0013】

ある実施形態では、共刺激領域は：表３に示される共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、及びＯＸ４０共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、から成る群から選択される。特定の実施形態では、４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体が存在する。ある実施形態では、二つの共刺激領域、例えばＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、並びに４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体がある。ある実施形態では、１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸修飾は、置換である。

【0014】

いくつかの場合、共刺激領域とＣＤ３ゼータシグナル伝達領域との間及び／又は二つの共刺激領域の間には、１‐６個のアミノ酸の短い配列（例えば、ＧＧＧ）がある。

【0015】

ＣＡＲの追加的な実施形態は、以下を含む：クロロトキシン受容体（Ｃｌｔｘ‐Ｒ）のための結合特異性又は免疫原性を高める１‐５個のアミノ酸が修飾されたクロロトキシンの変異体；クロロトキシン変異体は、１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含む変異体である；二つの異なる共刺激領域であり：ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、及びＯＸ４０共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、から成る群から選択される、二つの異なる共刺激領域；二つの異なる共刺激領域であり：ＣＤ２８共刺激領域又は１‐２個のアミノ酸が修飾されたその変異体、４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐２個のアミノ酸が修飾されたその変異体、及びＯＸ４０共刺激領域又は１‐２個のアミノ酸が修飾されたその変異体、から成る群から選択される、二つの異なる共刺激領域；クロロトキシン又は１‐２個のアミノ酸が修飾されたその変異体；膜貫通領域であり：ＣＤ４膜貫通領域又は１‐２個のアミノ酸が修飾されたその変異体、ＣＤ８膜貫通領域又は１‐２個のアミノ酸が修飾されたその変異体、ＣＤ２８膜貫通領域又は１‐２個のアミノ酸が修飾されたその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通領域又は１‐２個のアミノ酸が修飾されたその変異体、から選択される、膜貫通領域；共刺激領域（例えば、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体及び４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体の両方；並びに、ＣＤ３ζシグナル伝達領域又は１‐２個のアミノ酸が修飾されたその変異体；クロロトキシン又はその変異体と膜貫通領域との間に位置するスペーサー領域（例えば、配列番号２‐１２（表３）又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾されたそれらの変異体から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、スペーサー領域）；スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含む；スペーサー領域は、１‐１５０個のアミノ酸を含む；スペーサーがない；４‐１ＢＢシグナル伝達領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ζシグナル伝達領域は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、３個から１５個のアミノ酸のリンカーが、共刺激領域とＣＤ３ζシグナル伝達領域又はそれらの変異体との間に位置する。二つの共刺激領域がある特性の実施形態では、一方は４‐１ＢＢ共刺激領域であり、他方は：ＣＤ２８及びＣＤ２８ｇｇから選択される共刺激領域である。ある実施形態では、１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸修飾は、置換である。

【0016】

ある実施形態では、核酸分子は、配列番号２６‐５５から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する；キメラ抗原受容体は、配列番号２６‐５５から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0017】

また、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）ヒトＴ細胞の集団も開示され、キメラ抗原受容体は：クロロトキシン又は１‐５個のアミノ酸が修飾（例えば、１個又は２個）されたその変異体、クロロトキシンに関連する毒素又は１‐５個のアミノ酸が修飾（例えば、１個又は２個）されたその変異体のいずれか；膜貫通領域であり：ＣＤ４膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、ＣＤ２８膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、から選択される、膜貫通領域；共刺激領域（例えば、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体及び４‐１ＢＢ共刺激領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体の両方；並びに、ＣＤ３ζシグナル伝達領域又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体、を含んでもよい。ある実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、配列番号２６‐５５又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現するベクターを含む；ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）を含み、例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴ_ＣＭ細胞であり、或いは、ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及びステムセントラルメモリーＴ細胞の組み合わせ（Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞）を含み、例えば、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞である。いずれの場合も、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をともに含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちの少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちの少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０％、８０％又は９０％がＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかであり；ＣＤ３＋細胞である細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞のうちの少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０がＣＤ８＋細胞である）。

【0018】

また、患者のがんを治療する方法であって、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって導入された自己又は同種のヒトＴ細胞の集団（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ細胞）又はセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及びステムセントラルメモリーＴ細胞の組み合わせ（すなわち、Ｔ細胞はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞である）を含み、細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞である、自己又は同種のＴ細胞）を、投与する工程（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）、を含む方法も記載される。いずれの場合も、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をともに含み（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちの少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちの少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０％、８０％又は９０％がＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかであり；ＣＤ３＋細胞である細胞のうちの少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞のうちの少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０がＣＤ８＋細胞である）、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって導入され、キメラ抗原受容体は、配列番号２６‐５５又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では：がんは、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）であり；導入されたヒトＴ細胞は、患者からＴ細胞を採取する工程、セントラルメモリーＴ細胞を単離するためにＴ細胞を処理する工程、及びキメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて、セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも一部分に導入する工程であり、キメラ抗原受容体は、配列番号２６‐５５又は１‐５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されたその変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、工程、を含む方法によって調製された。

【0019】

また：配列番号２６‐５５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、核酸分子；５個以下のアミノ酸の置換、削除又は挿入の存在を除いて配列番号２６‐５５から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、核酸分子；５個以下のアミノ酸の置換の存在を除いて配列番号２６‐５５から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、核酸分子；並びに、２個以下のアミノ酸の置換の存在を除いて配列番号２６‐５５から選択されるアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、核酸分子、も記載される。

【0020】

クロロトキシン又はその変異体を含むＣＡＲを発現するＴ細胞は、神経膠芽腫、及びクロロトキシンのための受容体を発現する他のがん等の、がんの治療において有用であり得る。そのようながんは：原発性脳腫瘍及び神経膠腫（多形神経膠芽腫 ＷＨＯグレードＩＶ、未分化星状細胞腫 ＷＨＯグレードＩＩＩ、低悪性度（低グレード）星状細胞腫 ＷＨＯグレードＩＩ、毛様細胞性星状細胞腫 ＷＨＯグレードＩ、他の等級を付けられていない神経膠腫、乏突起神経膠腫、膠肉腫、神経節膠腫、髄膜腫、上衣腫）、神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫、神経芽腫、神経節腫、黒色腫（転移性）、黒色腫（原発性）、褐色細胞腫、ユーイング肉腫、原発性神経外胚葉性腫瘍、小細胞肺がん、シュワン細胞腫）、他の脳腫瘍（類表皮嚢胞（類表皮腫）、未知の病理の脳腫瘍、脳下垂体の神経膠芽腫（ｐｔ．））未知の組織期限の脳への転移腫瘍）、並びに他のがん（乳がん、乳がん転移、腎臓がん、肝臓がん肺がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん）を含むが、これらに限定されない。

【0021】

本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲｓのいずれかをコードする核酸分子（例えば、ＣＡＲｓのうちの一つをコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書に記載のＣＡＲｓのいずれかを発現する単離されたＴリンパ球を含む。

【0022】

本明細書に記載のＣＡＲは、クロロトキシン領域（すなわち、クロロトキシン又はその変異体）と膜貫通領域との間に位置するスペーサー領域を含んでもよい。様々な異なるスペーサーが用いられてよい。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部分、例えばヒトＦｃ領域のヒンジ部分若しくはＣＨ３領域又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載のＣＡＲｓにおいて用いられうる様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例

【表1】

【0023】

いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンＣＨ１領域とＣＨ２領域との間に入る配列、例えばＩｇＧ４ Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジの全て又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３領域又はＣＨ３領域とＣＨ２領域をともに含む。免疫グロブリンに由来する配列は、一つ又はそれ以上のアミノ酸修飾、例えば１、２、３、４又は５個の置換、例えば標的外結合（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）を低減する置換、を含んでもよい。

【0024】

「アミノ酸修飾」は、タンパク質若しくはペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入及び／又は削除をいう。「アミノ酸置換」若しくは「置換」は、元のペプチド若しくはタンパク質配列における特定の位置のアミノ酸の、他のアミノ酸による交換をいう。置換は、非保存的な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、他の分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）、或いは、保存的な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、同じ分類に属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）、結果として生じるタンパク質中のアミノ酸を変化させるように行われてもよい。そのような保存的な変化は、概して、結果として生じるタンパク質の構造及び機能のより小さな変化につながる。以下はアミノ酸の種々の分類の例である：１）無極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に帯電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別の分類は、フェニル基を有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンであり得る。

【0025】

特定の実施形態では、スペーサーは、修飾されていないスペーサーに存在するものと異なるアミノ酸残基によって置換された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。一つ又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はそれらの組み合わせの、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下で更に詳細に記載されるこの番号付け体系において、表１のＩｇＧヒンジ配列及びＩｇＧ４ヒンジリンカー（ＨＬ）配列の最初のアミノ酸が２１９であるように、表１のＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）スペーサーの最初のアミノ酸は２１９であり、表１のＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）スペーサーの最初のアミノ酸は２１９である。

【0026】

ある実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換の一つ又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来する：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ又はそれらの組み合わせ。

【0027】

特定の実施形態では、修飾されたスペーサーは、修飾されていないスペーサーに存在するものと異なるアミノ酸残基によって置換された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４領域に由来する。一つ又はそれ以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はそれらの組み合わせの、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。

【0028】

ある実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換の一つ又はそれ以上を含むがこれらに限定されない、ＩｇＧ４領域に由来する：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ又はそれらの組み合わせ。ここで、修飾されていないスペーサーにおけるアミノ酸は、示された位置において上記の同定されたアミノ酸によって置換される。

【0029】

本明細書において論じられる免疫グロブリン中のアミノ酸位置について、番号付けは、ＥＵインデックス又はＥＵ番号付け体系（Ｋａｂａｔら、１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版、米国公衆衛生局、国立保健研究機構、ベスセダ、参照により全体が本明細書に組み込まれる）に従う。ＥＵインデックス若しくはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス又はＥＵ番号付け体系は、ＥＵ抗体の番号付け（Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３： ７８－８５）を参照する。

【0030】

様々な膜貫通領域が用いられてよい。表２は、適当な膜貫通領域の例を含む。スペーサー領域が存在する場合には、膜貫通領域は、スペーサー領域に対してカルボキシ末端に位置する。
表２：膜貫通領域の例

【表2】

【0031】

本明細書に記載のＣＡＲの多くは、一つ又はそれ以上の（例えば、二つの）共刺激領域を含む。（複数の）共刺激領域は、膜貫通領域とＣＤ３ζシグナル伝達領域との間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達領域と共に、適当な共刺激領域の例を含む。
表３：ＣＤ３ζ領域及び共刺激領域の例

【表3】

【0032】

本明細書に記載のクロロトキシンを含むＣＡＲの中には、表４に要約されるものがあり、その中で、各ＣＡＲについてのスペーサー領域、膜貫通領域及び（複数の）共刺激領域が示されている。
表４：クロロトキシンを含むＣＡＲの例

【表4】

＊シグナル配列を含む配列についての配列番号／シグナル配列を除く配列についての配列番号

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ発現Ｔ細胞の生成を示す図である。（Ａ）クロロトキシン（ＣＬＴＸ）‐リダイレクト（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）カセットをコードするレンチウイルス構築物の概要であり、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及び切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）配列の転写がＥＦ１プロモーター（ＥＦ１ｐ）によって駆動される。（Ｂ）ＣＬＴＸ‐ＣＡＲの図であり、細胞外３６アミノ酸クロロトキシンペプチド及びＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）スペーサー領域、ＣＤ２８膜貫通領域、及び細胞内ＣＤ２８及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達領域配列を含む。（Ｃ）ＣＬＴＸ‐ＣＡＲを発現するように組換えられた健常ドナーＴ細胞（ＨＤ１８７．２ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}）のフローサイトメトリー分析。示されているのは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋（ＣＤ８－）Ｔ細胞サブセットの両方におけるＣＬＴＸ‐ＣＡＲ及びＣＤ１９ｔ導入遺伝子の同時発現を表す、抗ＣＤ１９抗Ｆｃ及び抗ＣＤ８染色である。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激の１８日後の導入された細胞（ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ）及び導入されていない細胞（モック）についての免疫反応性細胞の割合（Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ）が示されて、ヒトＴ細胞をＣＬＴＸ－ＣＡＲ用いて形質導入する能力を実証している。

【0034】

【図2】ＣＬＴＸ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、神経膠芽腫細胞株Ｕ２５１Ｔを特異的に認識することを示す図である。（Ａ‐Ｆ）ＣＬＴＸは、ＧＢＭ細胞に結合し、非ＧＢＭ細胞への最小の結合を示す。示されているのは、Ａ、健常ドナー由来のヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）；Ｂ、ヒトＥＢＶ転換リンパ芽球細胞株、ＬＣＬ；Ｃ、大型Ｔ抗原転換ヒト胎性腎臓細胞株２９３Ｔ；Ｄ、健常ドナー由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）から分化したヒト星状細胞；及びＥ、ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ２５１Ｔ、に結合する、クロロトキシン抱合（ｃｈｌｏｒｏｔｏｘｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）Ｃｙ５．５（ＣＬＴＸ‐Ｃｙ５．５）の評価である。細胞株は、培地（未処置）中、又は１μＭのＣＬＴＸ‐Ｃｙ５．５を含む培地中、３７℃で１時間にわたって培養され、次いでフローサイトメトリーによって評価された。（Ｆ）ＣＬＴＸ－ＣＡＲ Ｔ細胞による、ＬＣＬ、２９３Ｔ又は原発性のヒト星状細胞ではなく、神経膠腫腫瘍細胞株Ｕ２５１Ｔの特異的死滅。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で７２時間にわたってＣＬＴＸ－ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養された、生存標的細胞（ＬＣＬ、２９３Ｔ、星状細胞及びＵ２５１Ｔ）の数である。＊＊：ｐ＜０．０１；ｎｓ：非特異的であり、スチューデントｔ検定は、図に示されるように群の間で行われた。

【0035】

【図3】複数の低継代（ｌｏｗ－ｐａｓｓａｇｅ）でヒト原発性脳腫瘍（ＰＢＴ）株へのＣＬＴＸ結合は、ＩＬ１３Ｒα２発現から独立していることを示す図である。１μＭのＣＬＴＸ‐Ｃｙ５．５を含む培地中で１時間培養され、次いでＰＥ抱合ＩＬ１３Ｒα２抗体を用いて染色された、（Ａ）４つのＩＬ１３Ｒα２‐ｌｏｗ及び（Ｂ）４つのＩＬ１３Ｒα２‐ｈｉｇｈ細胞株のフローサイトメトリー分析。

【0036】

【図4】低継代ＰＢＴヒト神経膠芽腫細胞株ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞認識及び死滅は、ＩＬ１３Ｒα２発現から独立していることを示す図である。（Ａ）ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞は、原発性ＧＢＭ株対胎性腎臓細胞株２９３Ｔのパネルの統計的に有意な死滅を示す。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で２４、４８及び７２時間にわたってＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養された、生存標的細胞の数である。＊＊＊：ｐ＜０．００１であり、スチューデントｔ検定は、ＰＢＴ細胞生存率と２９３Ｔ細胞との間で行われた。（Ｂ）生細胞画像化（ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて観察され、モック対照に比較した、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞によるＰＢＴ００３‐４及びＰＢＴ００９腫瘍細胞の排除（Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）。エフェクター：標的比＝１：４（４，０００Ｔ細胞、１６，０００標的細胞）でモック又はＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養されたＰＢＴ００３‐４及びＰＢＴ００９細胞の代表的な画像であり、共培養直後（０時間）及び共培養の３日後（７２ｈ）に明視野顕微鏡によって撮影された。

【0037】

【図5】ＧＢＭ細胞を用いて刺激した後のＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞活性化を示す図である。Ｔ細胞は、タンパク質輸送阻害剤（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の存在下、エフェクター：標的比＝１：１（２５，０００Ｔ細胞、２５，０００標的細胞）で５時間にわたって標的細胞によって刺激された。脱顆粒を起こしているＣＡＲ‐Ｔ細胞の割合は、フローサイトメトリーを用いて、（Ａ）ＣＤ１０７ａ免疫反応性、及び（Ｂ）細胞内染色によって決定されるサイトカイン産生によって決定された。＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１、２９３Ｔ細胞刺激されたＴ細胞と、ＰＢＴ刺激されたＴ細胞の各々における脱顆粒／サイトカイン分泌を比較するシダク‐ボンフェローニ補正（Ｓｉｄａｋ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を用いた一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。

【0038】

【図6】異なるリンカー設計を有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を示す図である。（Ａ）ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）、ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）、ＣＤ８ｈ及び短いリンカー（Ｌ）を含む、リンカーが異なるＣＬＴＸ‐ＣＡＲ構築物の模式図（膜貫通領域は示されていない）。（Ｂ）異なるリンカーを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｕ２５１Ｔ ＧＢＭ細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で２４、４８及び７２時間にわたって、異なるＣＬＴＸ‐リダイレクト構築物を宿す（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）Ｔ細胞と共培養された、生存Ｕ２５１Ｔ細胞の数である。（Ｃ）異なるリンカーを有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に続いて、異なるサイトカイン産生レベルを示す。異なるＬＴＸ‐リダイレクト構築物を用いて組換えられたＴ細胞は、エフェクター：標的比＝１：１（２０，０００Ｔ細胞、２０，０００標的細胞）でＵ２５１Ｔ細胞を用いて刺激された。ＩＦＮγ分泌は、上清のＥＬＩＳＡアッセイによって検出された。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１、表示されたＣＡＲ Ｔ細胞とモックＴ細胞を比較するシダク‐ボンフェローニ補正を用いた一元配置分散分析。

【0039】

【図7】異なる細胞内シグナル伝達領域を有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を示す図である。（Ａ）細胞内共刺激領域（ＣＤ２８及び４１ＢＢ）が異なるＣＬＴＸ‐ＣＡＲ構築物の模式図。（Ｂ）異なる共刺激領域を有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｕ２５１Ｔ ＧＢＭ細胞を死滅させることが可能である。プロットされているのは、同じ期間にわたってモックＴ細胞と共培養されたものに対して正規化した後の、エフェクター：標的比＝１：１（１５，０００Ｔ細胞、１５，０００標的細胞）で２４、４８及び７２時間にわたって、異なるＣＬＴＸ‐リダイレクト構築物を宿すＴ細胞と共培養された、生存Ｕ２５１Ｔ細胞の数である。（Ｃ）異なる共刺激領域を有するＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原攻撃に続いて、様々なレベルのサイトカインを産生する。異なるＬＴＸ‐リダイレクト構築物を用いて組換えられたＴ細胞は、エフェクター：標的比＝１：１（２０，０００Ｔ細胞、２０，０００標的細胞）でＵ２５１Ｔ細胞を用いて刺激された。ＩＦＮγ分泌は、上清のＥＬＩＳＡアッセイによって検出された。＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１、表示されたＣＡＲ Ｔ細胞とモックＴ細胞を比較するシダク‐ボンフェローニ補正を用いた一元配置分散分析。

【0040】

【図8】ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞は、生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）、確立されたＵ２５１Ｔ ＧＢＭ腫瘍の成長を低減することを示す図である。（Ａ）ＮＳＧマウスにおけるＵ２５１Ｔ異種移植の増殖及びＴ細胞処置を示す図式。皮下に移植されたＵ２５１Ｔ細胞を有するマウス（第－１４日目から第０日目）は、ＰＢＳ（腫瘍のみ）、モックＴ細胞、又はＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて処置された。（Ｂ）腫瘍進行は、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞処置によって阻害される。Ｔ細胞注入の時から２０日間（第０日目から第２０日目）にわたって、腫瘍の成長がキャリパー測定によって測定された。＊＊＊：ｐ＜０．００１、腫瘍のみ又はモック処置された群と、ＣＬＴＸ‐ＣＡＲ Ｔ細胞処置されたマウスにおける腫瘍体積を比較する、Ｔ細胞注入後２０日目のデータについて行われたシダク‐ボンフェローニ補正を用いた一元配置分散分析

【0041】

【図9】ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号２６）図である。

【0042】

【図10】ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号２７）図である。

【0043】

【図11】ＣＬＴＸ‐ＣＤ８ｈ‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号２８）図である。

【0044】

【図12】ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ｈｉｎｇｅ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号２９）図である。

【0045】

【図13】ＣＬＴＸ‐Ｌ‐‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３０）図である。

【0046】

【図14】ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐４ｇｇ‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３１）図である。

【0047】

【図15】ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３２）図である。

【0048】

【図16】ＣＬＴＸ‐ＣＤ８ｈ‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３３）図である。

【0049】

【図17】ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ｈｉｎｇｅ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３４）図である。

【0050】

【図18】ＣＬＴＸ‐Ｌ‐ＣＤ２８ｔｍ‐ＣＤ２８ｇｇ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３５）図である。

【0051】

【図19】ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）‐ＣＤ４ｔｍ‐ＣＤ２８ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３６）図である。

【0052】

【図20】ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＨＬ‐ＣＨ３）‐ＣＤ４ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３７）図である。

【0053】

【図21】ＣＬＴＸ‐ＣＤ８ｈ‐ＣＤ２８ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３８）図である。

【0054】

【図22】ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ｈｉｎｇｅ）‐ＣＤ２８ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号３９）図である。

【0055】

【図23】ＣＬＴＸ‐Ｌ‐ＣＤ２８ｔｍ‐４‐１ＢＢ‐ｚｅｔａのアミノ酸配列を示す（配列番号４０）図である。

【0056】

【図24】Ｔ２Ａ（リボソームスキップ配列及び切断型ＣＤ１９；配列番号６０）を備えた図２１のＣＡＲを示す図である。切断型ＣＤ１９は、ＣＡＲと同時発現され、トランスフェクトされた細胞を同定及び定量化するための単純な方法を可能にする。

【0057】

【図25】様々なクロロトキシン関連毒素（配列番号１、５６～５９及び６１～７３）及びそれらのアミノ酸配列のアライメントを示す（Ｄａｒｄｅｖｅｔら、２０１５ Ｔｏｘｉｎｓ （Ｂａｓｅｌ） ７：１０７９）図である。

【発明を実施するための形態】

【0058】

以下に記載されるのは、クロロトキシン（ＣＬＴＸ）を含む様々なキメラ抗原受容体の構造、構築及び特徴付けである。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、最低限、細胞外認識領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達領域を含む組換え生体分子である。したがって、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができるいかなる分子である。例えば、ＣＡＲは、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドを含んでもよい。細胞外認識領域（細胞外領域又は単にそれが含む認識要素をいう場合もある）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜中にＣＡＲをつなぐ。細胞内シグナル伝達領域は、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達領域を含み、場合によっては、一つ又はそれ以上の共刺激シグナル伝達領域を含む。ＣＡＲｓは、ＭＨＣ拘束から独立して、抗原に結合すること及びＴ細胞活性化を誘導することである。したがって、ＣＡＲｓは、彼ら／彼女らのＨＬＡ遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を治療することができる「普遍的な（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を用いる養子免疫療法は、がんの治療のための強力な治療戦略であり得る。

【0059】

本明細書に記載のクロロトキシンを含む一つのＣＡＲは、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４（ＥＱ）‐ＣＤ２８ｇｇ‐Ｚｅｔａ（ゼータ）という。このＣＡＲは、以下を含む様々な重要な特徴を含む：クロロトキシン；ＣＨ２領域内の二つの部位においてＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）による結合を低減するような方法で変異させられた（Ｌ２３５Ｅ； Ｎ２９７Ｑ）、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域；領域、ＣＤ２８共刺激領域、及びＣＤ３ζ活性化領域。

【0060】

いくつかの場合、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列、及び細胞質シグナル伝達テールがない（アミノ酸３２３で切断された）、切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）が続くベクターを用いて産生されてよい。この配置において、ＣＤ１９ｔの同時発現は、不活性で非免疫原性の表面マーカーを提供し、それにより、遺伝子修飾細胞を正確に測定でき、遺伝子修飾細胞の正の選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、並びに、養子移植に続いての生体内での効率的な細胞追跡及び／又は治療用Ｔ細胞が画像化できる。ＣＤ１９ｔの同時発現は、治療用細胞を選択的に除去し、それにより自殺スイッチとして機能するための、臨床的に利用可能な抗体及び／又は免疫毒素試薬を用いる、導入された細胞の生体内における免疫学的標的化用マーカーを提供する。

【0061】

本明細書に記載のＣＡＲは、当分野で公知のいかなる手段によって産生されてよいが、好ましくは、それは組換えＤＮＡ技術を用いて産生される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、便利には、当分野で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）によって、調製され、完全なコード配列に組み立てられてよい。結果として生じるコード領域は、好ましくは発現ベクターの中に挿入され、適当な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を変換する（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）ために用いられる。

【0062】

非選択のＰＢＭＣ又は濃縮されたＣＤ３ Ｔ細胞又は濃縮されたＣＤ３又はメモリーＴ細胞サブセットを含む、患者から単離された様々なＴ細胞サブセット又はＴ_ＣＭ又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}は、ＣＡＲ発現用のベクターを用いて導入されることができる。セントラルメモリーＴ細胞は、一つの有用なＴ細胞サブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ）選択するため、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞について濃縮することで、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離されてよい。セントラルメモリーＴ細胞について濃縮された細胞は、例えば、ＣＡＲ、並びに、生体内検出用及び潜在的な生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）選択用の非免疫原性の表面マーカーである切断型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）の発現を指示するＳＩＮレンチウイルスベクターを用いて導入された、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化されてよい。活性化／遺伝的に修飾されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５を用いて生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増やされ、次いで凍結保存されてよい。

【実施例0063】

実施例１：ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ ＣＡＲの構築及び構造
クロロトキシンを含む有用なＣＡＲの構造、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａを、以下に記載する。コドン最適化されたＣＡＲ配列は：クロロトキシン、Ｆｃ受容体媒介認識を大幅に減少させる変異（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ）を含むＩｇＧ４ Ｆｃスペーサー、ＣＤ２８膜貫通領域、共刺激ＣＤ２８細胞質シグナル伝達領域、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達領域を含む。Ｔ２Ａリボソームスキップ配列は、不活性で非免疫原性の細胞表面検出／選択マーカーであるＣＤ１９ｔから、このＣＡＲ配列を分離する。このＴ２Ａ連鎖（ｌｉｎｋａｇｅ）は、単一の転写産物からのＣＡＲ及びＣＤ１９ｔの同調発現（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をもたらす。図１Ａは、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ‐Ｔ２ＡＣＤ１９ｔの翻訳領域の模式図である。この図において、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ ＣＡＲ、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及び切断型ＣＤ１９配列は、全て示されている。ＣＡＲ及びＣＤ１９ｔカセットの発現は、ヒトＥＦ１プロモーター（ＥＦ１ｐ）によって駆動される。図１Ｂは、発現された、成熟ＣＡＲを模式的に示す。

【0064】

ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ配列は、ヒトＧＭ‐ＣＳＦ受容体アルファリーダーペプチドクロロトキシン、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｑ修飾ＩｇＧ４ Ｆｃヒンジ（ここで二重変異Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７ＱはＦｃＲ認識を妨げる）、ＣＤ２８膜貫通、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達領域、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達領域配列の融合によって生成された。この配列は、コドン最適化後に新規合成された。Ｔ２Ａ配列は、Ｔ２Ａ含有プラスミドの消化から得られた。ＣＤ１９ｔ配列は、ＣＤ１９含有プラスミドの膜貫通コンポーネントまで、リーダーペプチド配列にわたるもの（すなわち、塩基対１‐９７２）から得られた。全３つの断片、１）ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ、２）Ｔ２Ａ、及び３）ＣＤ１９ｔは、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。適当な細胞の中にトランスフェクトされると、ベクターは宿主細胞ゲノムの中に組み込まれる。ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａのアミノ酸配列は、表示された様々な領域と共に図９に表わされる。

【実施例0065】

実施例２：ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａの発現のために用いられたｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは、臨床用ベクターＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ｚｅｔａ‐Ｔ２Ａ‐ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７がシティ・オブ・ホープ（ＣＯＨ）のＴ細胞治療研究所（ＴＣＴＲＬ）で供給された、元のプラスミドである。ＣＡＲの発現に用いられたｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから産生された。重要なことに、このベクターは、ＣＡＲの発現の駆動にヒトＥＦ１プロモーターを用いる。ベクターの５’配列及び３’配列はともに、以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから得られたように、ｐｖ６５３ＲＳＮから得られた。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＨＩＶ‐１系統ｐＮＬ４‐３から導き出された。ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列は以前に記載されている。

【0066】

ｐＨＩＶ７の構築は、以下のように行われた。簡潔に、介在ＳＬ３－ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）とともにｇａｇ－ｐｏｌプラス５’及び３’末端反復配列（ＬＴＲｓ）から６５３ｂｐを含む、ｐｖ６５３ＲＳＮは、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングされた：工程１において、５’ＬＴＲからｒｅｖ‐応答配列（ＲＲＥ）までの配列はｐ５’ＨＩＶ－１５１を作製し、次いで５’ＬＴＲがＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去して修飾され、最初にＣＭＶエンハンサーに連結された後、ＳＶ４０複製開始点に連結された（ｐ５’ＨＩＶ‐２）。工程２では、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ－１を作製した後、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターで４００ｂｐが削除され、ＨＩＶ Ｕ３におけるシス調節エレメントを除去し、ｐ３’ＨＩＶ‐２を形成した。工程３では、ｐＨＩＶ‐３を作製するため、ｐ５’ＨＩＶ‐３及びｐ３’ＨＩＶ‐２から単離された断片を結合した。工程４では、ｐ３’ＨＩＶ‐３を生成するため、ｐ３’ＨＩＶ‐２から余分な上流のＨＩＶ配列を除去してさらに修飾され、また、ｐ３’ＨＩＶ‐４を作製するため、ＷＰＲＥを含む６００ｂｐのＢａｍＨＩ‐ＳａｌＩ断片がｐ３’ＨＩＶ‐３に加えられた。工程５では、ｐＨＩＶ‐６を作製するため、ｐＨＩＶ‐３ＲＲＥはＰＣＲでサイズを減少し、ｐＨＩＶ‐３からの５’断片（示さず）及びｐ３’ＨＩＶ‐４に連結された。工程６では、ｐＨＩＶ‐７を作製するため、ＨＩＶ‐１ ｐＮＬ４‐３（５５）由来のｃＰＰＴ ＤＮＡフラップ配列を含む１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ‐ＢａｍＨＩ断片は、ｐＮＬ４‐３から増幅され、ｐＨＩＶ６のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置された。この元のプラスミドｐＨＩＶ７‐ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を、４プラスミド系を用いて元のベクターをパッケージングするために用いた。

【0067】

パッケージングシグナル、ｐｓｉ（Ψ）、は、ベクターへのウイルスゲノムの効率的なパッケージングに必要である。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写産物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの導入効率を増強することが実証されている。

【0068】

ヘルパー機能（ウイルスベクターの産生に必要である）は、組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の可能性を低減するため、３つの別個のプラスミドに分割した：１）ｐＣｇｐはウイルスベクターアセンブリのために要求されるｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする；２）ｐＣＭＶ‐Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためのウイルスゲノムの輸送を助けるためにＲＲＥ配列に作用する、Ｒｅｖタンパク質をコードする；３）ｐＣＭＶ‐Ｇは、ウイルスベクターの感染性に必要な、水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌｏ－ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。

【0069】

ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小限のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域は、ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する、約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；全３種のヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び、ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列を含む。複数の組換えが必要なため、当該領域の相同性のために複製コンピテント組換えウイルスが生成される可能性は極めて低い。加えて、如何なる結果として生じる組換え体も、レンチウイルス複製に必要な機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列がないであろう。

【0070】

ＣＭＶプロモーターがＥＦ１α‐ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）で置換され、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７とした。ＥＦ１ｐは、５６３ｂｐを有し、ＣＭＶプロモーターが切除された後に、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７に導入された。

【0071】

野生型ウイルスの病原性に必要であり、標的細胞の増殖性感染に必要なｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれた。さらに、ＣＬＴＸ‐ＩｇＧ４Ｆｃ（ＥＱ）‐ＣＤ２８‐ゼータ‐Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクター構築物は完全な３’ＬＴＲプロモーターを含まず、そのため、標的細胞における、結果として生じる発現及び逆転写されるＤＮＡプロウイルスゲノムのＬＴＲｓは不活性であろう。この設計の結果、すべてのＨＩＶ‐１由来の配列はプロウイルスから転写されず、治療用の配列のみが各プロモーターから発現されるであろう。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性を有意に減少させると予想される。