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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023145399
(43)【公開日】2023-10-11
(54)【発明の名称】核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6848 20180101AFI20231003BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20231003BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20231003BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6848 Z
C12N15/10 100Z
C12Q1/6806 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023049680
(22)【出願日】2023-03-27
(31)【優先権主張番号】P 2022051971
(32)【優先日】2022-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000120456
【氏名又は名称】栄研化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100126653
【弁理士】
【氏名又は名称】木元 克輔
(72)【発明者】
【氏名】毛利 勇太
(72)【発明者】
【氏名】浅野 良則
(72)【発明者】
【氏名】川口 公平
(72)【発明者】
【氏名】陳 雅▲民▼
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ10
4B063QQ28
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR56
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR79
4B063QS14
4B063QS24
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】本発明は、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合における、生体試料に起因する反応阻害を低減することを目的とする。
【解決手段】本発明の一側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含み、反応阻害は、生体試料に起因する反応阻害である。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の一側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含み、反応阻害は、生体試料に起因する反応阻害である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法であって、
核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含み、
反応阻害は、生体試料に起因する反応阻害である、方法。
核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含み、
反応阻害は、生体試料に起因する反応阻害である、方法。
【請求項2】
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体が、第一の共重合体、第二の共重合体、第三の共重合体、又は第四の共重合体であり、
第一の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８７±４ｃｍ－１、８４２±４ｃｍ－１、８７０±４ｃｍ－１、９５９±４ｃｍ－１、１０５６±４ｃｍ－１、１１６３±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１３８９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７０７±４ｃｍ－１、２９４７±４ｃｍ－１、及び２９９１±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５６±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７５～０．１０３であり、
７８７±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１８６であり、
８４２±４ｃｍ－１で０．０１８～０．０３１であり、
８７０±４ｃｍ－１で０．００９～０．０７８であり、
９５９±４ｃｍ－１で０．３１７～０．９８８であり、
１１６３±４ｃｍ－１で０．６１６～０．７２４であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．１３３～０．１４１であり、
１３８９±４ｃｍ－１で０．０６１～０．０９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．１５８～０．５３３であり、
１７０７±４ｃｍ－１で１．００１～１．２４６であり、
２９４７±４ｃｍ－１で０．０７７～０．０９０であり、
２９９１±４ｃｍ－１で０．０２８～０．０４３である、共重合体であり、
第二の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、共重合体であり、
第三の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８６±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９６４±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１５７±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１４０２±４ｃｍ－１、１４７９±４ｃｍ－１、１７２１±４ｃｍ－１、２８７５±４ｃｍ－１、及び２９５７±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７４～０．０８１であり、
７８６±４ｃｍ－１で０．１５７～０．１７２であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０４９～０．０６３であり、
９６４±４ｃｍ－１で０．４６３～０．４６９であり、
１１５７±４ｃｍ－１で０．４５０～０．４５７であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．５４６～０．５６３であり、
１４０２±４ｃｍ－１で０．００４～０．０１７であり、
１４７９±４ｃｍ－１で０．０２６～０．５２０であり、
１７２１±４ｃｍ－１で１．１８６～１．２３４であり、
２８７５±４ｃｍ－１で０．０４７～０．０５４であり、
２９５７±４ｃｍ－１で０．１３８～０．１７１である、共重合体であり、
第四の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８４±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９５５±４ｃｍ－１、１０５５±４ｃｍ－１、１１６６±４ｃｍ－１、１２２９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７１７±４ｃｍ－１、及び２９５６±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５５±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０２０～０．０４５であり、
７８４±４ｃｍ－１で０．１６１～０．２１３であり、
８５３±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０１８であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５３～０．０７６であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０３９～０．０６９であり、
９５５±４ｃｍ－１で０．４４２～０．４８１であり、
１１６６±４ｃｍ－１で０．０８０～０．１９７であり、
１２２９±４ｃｍ－１で０．４４３～０．５９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．２０８～０．２２７であり、
１７１７±４ｃｍ－１で０．４６２～０．５３０であり、
２９５６±４ｃｍ－１で０超、０．１０７以下である、共重合体である、請求項１に記載の方法。
第一の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８７±４ｃｍ－１、８４２±４ｃｍ－１、８７０±４ｃｍ－１、９５９±４ｃｍ－１、１０５６±４ｃｍ－１、１１６３±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１３８９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７０７±４ｃｍ－１、２９４７±４ｃｍ－１、及び２９９１±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５６±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７５～０．１０３であり、
７８７±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１８６であり、
８４２±４ｃｍ－１で０．０１８～０．０３１であり、
８７０±４ｃｍ－１で０．００９～０．０７８であり、
９５９±４ｃｍ－１で０．３１７～０．９８８であり、
１１６３±４ｃｍ－１で０．６１６～０．７２４であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．１３３～０．１４１であり、
１３８９±４ｃｍ－１で０．０６１～０．０９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．１５８～０．５３３であり、
１７０７±４ｃｍ－１で１．００１～１．２４６であり、
２９４７±４ｃｍ－１で０．０７７～０．０９０であり、
２９９１±４ｃｍ－１で０．０２８～０．０４３である、共重合体であり、
第二の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、共重合体であり、
第三の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８６±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９６４±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１５７±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１４０２±４ｃｍ－１、１４７９±４ｃｍ－１、１７２１±４ｃｍ－１、２８７５±４ｃｍ－１、及び２９５７±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７４～０．０８１であり、
７８６±４ｃｍ－１で０．１５７～０．１７２であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０４９～０．０６３であり、
９６４±４ｃｍ－１で０．４６３～０．４６９であり、
１１５７±４ｃｍ－１で０．４５０～０．４５７であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．５４６～０．５６３であり、
１４０２±４ｃｍ－１で０．００４～０．０１７であり、
１４７９±４ｃｍ－１で０．０２６～０．５２０であり、
１７２１±４ｃｍ－１で１．１８６～１．２３４であり、
２８７５±４ｃｍ－１で０．０４７～０．０５４であり、
２９５７±４ｃｍ－１で０．１３８～０．１７１である、共重合体であり、
第四の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８４±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９５５±４ｃｍ－１、１０５５±４ｃｍ－１、１１６６±４ｃｍ－１、１２２９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７１７±４ｃｍ－１、及び２９５６±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５５±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０２０～０．０４５であり、
７８４±４ｃｍ－１で０．１６１～０．２１３であり、
８５３±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０１８であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５３～０．０７６であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０３９～０．０６９であり、
９５５±４ｃｍ－１で０．４４２～０．４８１であり、
１１６６±４ｃｍ－１で０．０８０～０．１９７であり、
１２２９±４ｃｍ－１で０．４４３～０．５９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．２０８～０．２２７であり、
１７１７±４ｃｍ－１で０．４６２～０．５３０であり、
２９５６±４ｃｍ－１で０超、０．１０７以下である、共重合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
第一の共重合体が、図１～３のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有し、
第二の共重合体が、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有し、
第三の共重合体が、図７～９のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有し、
第四の共重合体が、図１０～１２のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有する、請求項２に記載の方法。
第二の共重合体が、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有し、
第三の共重合体が、図７～９のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有し、
第四の共重合体が、図１０～１２のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
生体試料が、唾液、喀痰、又は鼻腔拭い液である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
生体試料が唾液若しくは鼻腔拭い液であり、かつ２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体が、第一の共重合体、第二の共重合体、若しくは第三の共重合体である、又は
生体試料が喀痰であり、かつ２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体が、第一の共重合体若しくは第四の共重合体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
生体試料が喀痰であり、かつ２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体が、第一の共重合体若しくは第四の共重合体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体が、第一の共重合体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
生体試料をドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合する工程において、核酸抽出液中の第一の共重合体の濃度が０．０１～０．２５％（ｗ／ｖ）となる量の第一の共重合体を混合する、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法であって、
核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含む、方法。
核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含む、方法。
【請求項9】
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体が、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１にピークを有する第二の共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、第二の共重合体である、請求項８に記載の方法。
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、第二の共重合体である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
第二の共重合体が、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
生体試料が鼻腔拭い液である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
非特異的増幅が、生体試料に起因する非特異的増幅である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
一般に、生体試料中の核酸を増幅する方法として、界面活性剤、グアニジン等のタンパク質変性剤又はフェノール、クロロホルム等の有機溶媒を使用して生体試料から核酸を抽出（溶出）し、得られた核酸抽出液から核酸を精製してから増幅する方法が知られている（例えば、特許文献１）。タンパク質変性剤及び有機溶媒は核酸増幅反応を阻害するため、この方法では、抽出工程の後にタンパク質変性剤及び有機溶媒を除去するための精製工程が必要である。
【0003】
一方、核酸抽出工程の後に精製工程を必ずしも必要としない、核酸の増幅方法も知られている。特許文献２には、ＤＮＡポリメラーゼとシクロデキストリンとバインダーとを少なくとも含有する固相状の試薬を、核酸を含む液体に溶解させる手順と、核酸を増幅する手順と、を含む核酸増幅方法が記載されている。この方法によれば、核酸の抽出にイオン性界面活性剤を用いた場合であっても、固相状試薬に含まれるシクロデキストリンによって、イオン性界面活性剤による核酸増幅反応の阻害を低減することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開平１１－２５３１５８号公報
【特許文献2】特開２０１４－１９８０２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
特許文献２の方法によれば、イオン性界面活性剤による核酸増幅反応の阻害を低減しつつ、精製工程を省略することで核酸の増幅までにかかる時間を短縮できる。しかしながら、この方法では、生体試料に含まれるタンパク質等の生体由来物質によって、核酸増幅反応時に目的の特異的増幅反応が阻害されるという欠点があった。
【0006】
そこで、本発明は、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合における、生体試料に起因する反応阻害を低減することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、ドデシルアルコール硫酸エステル塩と、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体との組合せを用いて核酸を抽出することで、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合に、生体試料に起因する反応阻害を低減することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【0008】
本発明の一側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含み、反応阻害は、生体試料に起因する反応阻害である。
【0009】
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体は、第一の共重合体、第二の共重合体、第三の共重合体、又は第四の共重合体であってよい。
第一の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８７±４ｃｍ－１、８４２±４ｃｍ－１、８７０±４ｃｍ－１、９５９±４ｃｍ－１、１０５６±４ｃｍ－１、１１６３±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１３８９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７０７±４ｃｍ－１、２９４７±４ｃｍ－１、及び２９９１±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５６±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７５～０．１０３であり、
７８７±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１８６であり、
８４２±４ｃｍ－１で０．０１８～０．０３１であり、
８７０±４ｃｍ－１で０．００９～０．０７８であり、
９５９±４ｃｍ－１で０．３１７～０．９８８であり、
１１６３±４ｃｍ－１で０．６１６～０．７２４であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．１３３～０．１４１であり、
１３８９±４ｃｍ－１で０．０６１～０．０９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．１５８～０．５３３であり、
１７０７±４ｃｍ－１で１．００１～１．２４６であり、
２９４７±４ｃｍ－１で０．０７７～０．０９０であり、
２９９１±４ｃｍ－１で０．０２８～０．０４３である、共重合体である。
第二の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、共重合体である。
第三の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８６±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９６４±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１５７±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１４０２±４ｃｍ－１、１４７９±４ｃｍ－１、１７２１±４ｃｍ－１、２８７５±４ｃｍ－１、及び２９５７±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７４～０．０８１であり、
７８６±４ｃｍ－１で０．１５７～０．１７２であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０４９～０．０６３であり、
９６４±４ｃｍ－１で０．４６３～０．４６９であり、
１１５７±４ｃｍ－１で０．４５０～０．４５７であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．５４６～０．５６３であり、
１４０２±４ｃｍ－１で０．００４～０．０１７であり、
１４７９±４ｃｍ－１で０．０２６～０．５２０であり、
１７２１±４ｃｍ－１で１．１８６～１．２３４であり、
２８７５±４ｃｍ－１で０．０４７～０．０５４であり、
２９５７±４ｃｍ－１で０．１３８～０．１７１である、共重合体である。
第四の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８４±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９５５±４ｃｍ－１、１０５５±４ｃｍ－１、１１６６±４ｃｍ－１、１２２９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７１７±４ｃｍ－１、及び２９５６±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５５±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０２０～０．０４５であり、
７８４±４ｃｍ－１で０．１６１～０．２１３であり、
８５３±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０１８であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５３～０．０７６であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０３９～０．０６９であり、
９５５±４ｃｍ－１で０．４４２～０．４８１であり、
１１６６±４ｃｍ－１で０．０８０～０．１９７であり、
１２２９±４ｃｍ－１で０．４４３～０．５９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．２０８～０．２２７であり、
１７１７±４ｃｍ－１で０．４６２～０．５３０であり、
２９５６±４ｃｍ－１で０超、０．１０７以下である、共重合体である。
第一の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８７±４ｃｍ－１、８４２±４ｃｍ－１、８７０±４ｃｍ－１、９５９±４ｃｍ－１、１０５６±４ｃｍ－１、１１６３±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１３８９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７０７±４ｃｍ－１、２９４７±４ｃｍ－１、及び２９９１±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５６±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７５～０．１０３であり、
７８７±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１８６であり、
８４２±４ｃｍ－１で０．０１８～０．０３１であり、
８７０±４ｃｍ－１で０．００９～０．０７８であり、
９５９±４ｃｍ－１で０．３１７～０．９８８であり、
１１６３±４ｃｍ－１で０．６１６～０．７２４であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．１３３～０．１４１であり、
１３８９±４ｃｍ－１で０．０６１～０．０９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．１５８～０．５３３であり、
１７０７±４ｃｍ－１で１．００１～１．２４６であり、
２９４７±４ｃｍ－１で０．０７７～０．０９０であり、
２９９１±４ｃｍ－１で０．０２８～０．０４３である、共重合体である。
第二の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、共重合体である。
第三の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８６±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９６４±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１５７±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１４０２±４ｃｍ－１、１４７９±４ｃｍ－１、１７２１±４ｃｍ－１、２８７５±４ｃｍ－１、及び２９５７±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７４～０．０８１であり、
７８６±４ｃｍ－１で０．１５７～０．１７２であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０４９～０．０６３であり、
９６４±４ｃｍ－１で０．４６３～０．４６９であり、
１１５７±４ｃｍ－１で０．４５０～０．４５７であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．５４６～０．５６３であり、
１４０２±４ｃｍ－１で０．００４～０．０１７であり、
１４７９±４ｃｍ－１で０．０２６～０．５２０であり、
１７２１±４ｃｍ－１で１．１８６～１．２３４であり、
２８７５±４ｃｍ－１で０．０４７～０．０５４であり、
２９５７±４ｃｍ－１で０．１３８～０．１７１である、共重合体である。
第四の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８４±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９５５±４ｃｍ－１、１０５５±４ｃｍ－１、１１６６±４ｃｍ－１、１２２９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７１７±４ｃｍ－１、及び２９５６±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５５±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０２０～０．０４５であり、
７８４±４ｃｍ－１で０．１６１～０．２１３であり、
８５３±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０１８であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５３～０．０７６であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０３９～０．０６９であり、
９５５±４ｃｍ－１で０．４４２～０．４８１であり、
１１６６±４ｃｍ－１で０．０８０～０．１９７であり、
１２２９±４ｃｍ－１で０．４４３～０．５９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．２０８～０．２２７であり、
１７１７±４ｃｍ－１で０．４６２～０．５３０であり、
２９５６±４ｃｍ－１で０超、０．１０７以下である、共重合体である。
【0010】
第一の共重合体は、図１～３のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよく、第二の共重合体は、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよく、第三の共重合体は、図７～９のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよく、第四の共重合体は、図１０～１２のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよい。
【0011】
生体試料は、唾液、喀痰、又は鼻腔拭い液であってよい。
【0012】
生体試料が唾液又は鼻腔拭い液の場合には、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体として、第一の共重合体、第二の共重合体、又は第三の共重合体を用いてもよい。生体試料が喀痰の場合には、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体として、第一の共重合体又は第四の共重合体を用いてもよい。
【0013】
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体は、好ましくは第一の共重合体である。
【0014】
生体試料をドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合する工程において、核酸抽出液中の第一の共重合体の濃度が０．０１～０．２５％（ｗ／ｖ）となる量の第一の共重合体を混合してもよい。
【0015】
本発明の一側面に係る核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含む。
【0016】
核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法において、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１にピークを有する第二の共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、第二の共重合体であってよい。第二の共重合体は、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよい。
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、第二の共重合体であってよい。第二の共重合体は、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよい。
【0017】
核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法において、生体試料は鼻腔拭い液であってよい。
【0018】
核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法において、非特異的増幅は、生体試料に起因する非特異的増幅であってよい。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合における、生体試料に起因する反応阻害を低減することができる。また、本発明によれば、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合における非特異的増幅も低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】第一の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５））のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図2】第一の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図3】第一の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図4】第二の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図5】第二の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図6】第二の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図7】第三の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ８０２）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図8】第三の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ８０２）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図9】第三の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ８０２）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図10】第四の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０７）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図11】第四の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０７）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図12】第四の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０７）のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。
【図13】ＳＤＳとリピジュア（登録商標）との組合せがＲＴ－ＬＡＭＰ反応における反応阻害に及ぼす影響を示すグラフである。
【図14】ＳＤＳとリピジュア（登録商標）との組合せがＲＴ－ＬＡＭＰ反応における非特異的増幅に及ぼす影響を示すグラフである。
【図15】核酸抽出液中のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５の濃度と、目的の増副産物の検出時間の遅延との関係を示すグラフである。
【図16】異なる検体量において、ＳＤＳとＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５との組合せがＲＴ－ＬＡＭＰ反応における反応阻害に及ぼす影響を示すグラフである。
【図17】ＬＤＳとＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５との組合せがＲＴ－ＬＡＭＰ反応における反応阻害に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の一側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程（以下、抽出工程ともいう。）を含む。反応阻害は、生体試料に起因する反応阻害であり、より具体的には、生体試料中の生体由来物質に起因する反応阻害である。生体由来物質は核酸以外の物質であり、例えばタンパク質が挙げられる。
【0022】
本明細書において、生体試料とは、生体から採取した試料（検体）又はその懸濁液を意味する。核酸を含む生体試料は特に限定されず、例えば、喀痰、体液、糞便、組織、又はこれらの懸濁液であってよい。体液は、例えば、鼻汁、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、精液、又は羊水であってよい。また、核酸を含む生体試料は、鼻咽頭拭い液、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、又はうがい液であってもよい。
【0023】
生体試料に含まれる核酸の種類は特に限定されない。核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、一本鎖又は二重鎖であってよい。核酸の由来も限定されず、核酸は、例えば、動物、植物、菌類、細菌類、又はウイルスに由来する核酸であってよい。
【0024】
ドデシルアルコール硫酸エステル塩は、ドデシルアルコール硫酸エステルの塩であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）であってよい。
【0025】
ＭＰＣ単位をモノマー単位として有する共重合体（以下、ＭＰＣポリマーという。）としては、日油株式会社製のリピジュア（登録商標）シリーズを用いることができる。ＭＰＣポリマーは、好ましくはＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５として市販されているＭＰＣポリマー（以下、第一の共重合体という。）、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２として市販されているＭＰＣポリマー（以下、第二の共重合体という。）、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ８０２として市販されているＭＰＣポリマー（以下、第三の共重合体という。）、又はＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０７として市販されているＭＰＣポリマー（以下、第四の共重合体という。）である。これらの製品はいすれも５質量％ＭＰＣポリマー水溶液である。核酸増幅反応における反応阻害を低減する観点からは、第一の共重合体がより好ましい。核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する観点からは、第二の共重合体がより好ましい。ＭＰＣポリマーとして、複数のＭＰＣポリマーを用いてもよい。
【0026】
生体試料が唾液又は鼻腔拭い液である場合、ＭＰＣポリマーは、好ましくは第一の共重合体、第二の共重合体、又は第三の共重合体である。生体試料が喀痰である場合、ＭＰＣポリマーは、好ましくは第一の共重合体若しくは第四の共重合体である。
【0027】
第一の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８７±４ｃｍ－１、８４２±４ｃｍ－１、８７０±４ｃｍ－１、９５９±４ｃｍ－１、１０５６±４ｃｍ－１、１１６３±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１３８９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７０７±４ｃｍ－１、２９４７±４ｃｍ－１、及び２９９１±４ｃｍ－１にピークを有する。１０５６±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときの各ピークのピーク強度は、
７４８±４ｃｍ－１で０．０７５～０．１０３であり、
７８７±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１８６であり、
８４２±４ｃｍ－１で０．０１８～０．０３１であり、
８７０±４ｃｍ－１で０．００９～０．０７８であり、
９５９±４ｃｍ－１で０．３１７～０．９８８であり、
１１６３±４ｃｍ－１で０．６１６～０．７２４であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．１３３～０．１４１であり、
１３８９±４ｃｍ－１で０．０６１～０．０９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．１５８～０．５３３であり、
１７０７±４ｃｍ－１で１．００１～１．２４６であり、
２９４７±４ｃｍ－１で０．０７７～０．０９０であり、
２９９１±４ｃｍ－１で０．０２８～０．０４３である。
７４８±４ｃｍ－１で０．０７５～０．１０３であり、
７８７±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１８６であり、
８４２±４ｃｍ－１で０．０１８～０．０３１であり、
８７０±４ｃｍ－１で０．００９～０．０７８であり、
９５９±４ｃｍ－１で０．３１７～０．９８８であり、
１１６３±４ｃｍ－１で０．６１６～０．７２４であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．１３３～０．１４１であり、
１３８９±４ｃｍ－１で０．０６１～０．０９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．１５８～０．５３３であり、
１７０７±４ｃｍ－１で１．００１～１．２４６であり、
２９４７±４ｃｍ－１で０．０７７～０．０９０であり、
２９９１±４ｃｍ－１で０．０２８～０．０４３である。
【0028】
図１～３は、後述の実施例６において測定した第一の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。したがって、第一の共重合体は、図１～３のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有するといえる。
【0029】
第二の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１に特徴的な吸収ピークを有する。１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときの各ピークのピーク強度は、
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である。
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である。
【0030】
図４～６は、後述の実施例６において測定した第二の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。したがって、第二の共重合体は、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有するといえる。
【0031】
第三の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８６±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９６４±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１５７±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１４０２±４ｃｍ－１、１４７９±４ｃｍ－１、１７２１±４ｃｍ－１、２８７５±４ｃｍ－１、及び２９５７±４ｃｍ－１に特徴的な吸収ピークを有する。１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときの各ピークのピーク強度は、
７４８±４ｃｍ－１で０．０７４～０．０８１であり、
７８６±４ｃｍ－１で０．１５７～０．１７２であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０４９～０．０６３であり、
９６４±４ｃｍ－１で０．４６３～０．４６９であり、
１１５７±４ｃｍ－１で０．４５０～０．４５７であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．５４６～０．５６３であり、
１４０２±４ｃｍ－１で０．００４～０．０１７であり、
１４７９±４ｃｍ－１で０．０２６～０．５２０であり、
１７２１±４ｃｍ－１で１．１８６～１．２３４であり、
２８７５±４ｃｍ－１で０．０４７～０．０５４であり、
２９５７±４ｃｍ－１で０．１３８～０．１７１である。
７４８±４ｃｍ－１で０．０７４～０．０８１であり、
７８６±４ｃｍ－１で０．１５７～０．１７２であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０４９～０．０６３であり、
９６４±４ｃｍ－１で０．４６３～０．４６９であり、
１１５７±４ｃｍ－１で０．４５０～０．４５７であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．５４６～０．５６３であり、
１４０２±４ｃｍ－１で０．００４～０．０１７であり、
１４７９±４ｃｍ－１で０．０２６～０．５２０であり、
１７２１±４ｃｍ－１で１．１８６～１．２３４であり、
２８７５±４ｃｍ－１で０．０４７～０．０５４であり、
２９５７±４ｃｍ－１で０．１３８～０．１７１である。
【0032】
図７～９は、後述の実施例６において測定した第三の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。したがって、第三の共重合体は、図７～９のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有するといえる。
【0033】
第四の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８４±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９５５±４ｃｍ－１、１０５５±４ｃｍ－１、１１６６±４ｃｍ－１、１２２９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７１７±４ｃｍ－１、及び２９５６±４ｃｍ－１に特徴的な吸収ピークを有する。１０５５±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときの各ピークのピーク強度は、
７４８±４ｃｍ－１で０．０２０～０．０４５であり、
７８４±４ｃｍ－１で０．１６１～０．２１３であり、
８５３±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０１８であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５３～０．０７６であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０３９～０．０６９であり、
９５５±４ｃｍ－１で０．４４２～０．４８１であり、
１１６６±４ｃｍ－１で０．０８０～０．１９７であり、
１２２９±４ｃｍ－１で０．４４３～０．５９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．２０８～０．２２７であり、
１７１７±４ｃｍ－１で０．４６２～０．５３０であり、
２９５６±４ｃｍ－１で０超、０．１０７以下である。
７４８±４ｃｍ－１で０．０２０～０．０４５であり、
７８４±４ｃｍ－１で０．１６１～０．２１３であり、
８５３±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０１８であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５３～０．０７６であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０３９～０．０６９であり、
９５５±４ｃｍ－１で０．４４２～０．４８１であり、
１１６６±４ｃｍ－１で０．０８０～０．１９７であり、
１２２９±４ｃｍ－１で０．４４３～０．５９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．２０８～０．２２７であり、
１７１７±４ｃｍ－１で０．４６２～０．５３０であり、
２９５６±４ｃｍ－１で０超、０．１０７以下である。
【0034】
図１０～１２は、後述の実施例６において測定した第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。したがって、第四の共重合体は、図１０～１２のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有するといえる。
【0035】
本明細書に記載されるフーリエ変換赤外吸収スペクトルは、減衰全反射（ＡＴＲ）法を利用したフーリエ変換赤外分光法により測定したスペクトルに対してベースライン補正及びＡＴＲ補正を行ったスペクトルである。ベースライン補正は、具体的には解析ソフトＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標）ＩＲ（株式会社島津製作所製）を用いて、表１に示す波数を補正点として指定して行うベースライン補正である。ＡＴＲ補正は、具体的には解析ソフトＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標）ＩＲ（株式会社島津製作所製）を用いて、９９９ｃｍ－１を補正波数として指定して行うＡＴＲ補正である。本明細書に記載されるピーク強度は、上記補正後のスペクトルにおいて、ピークの始点と終点を結んだ線（ベースライン）からピークトップまでの高さ、すなわち、ピークトップからベースラインに引いた垂線における、ベースラインとの交点からピークトップまでの長さを意味する。
【0036】
【表1】
【0037】
本明細書において、「±４」との記載は、その直前に数値が記載されている場合、該直前の数値から４を減じた数値を下限とし、該直前の数値に４を加えた数値を上限とする範囲を示すことを意味する。したがって、例えば、「波数７４８±４ｃｍ－１」は「波数７４４～７５２ｃｍ－１」と同義である。
【0038】
本明細書において、「実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトル」とは、完全に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルだけでなく、測定時に通常生じる誤差の範囲でピークの波数及び／又は強度が異なるフーリエ変換赤外吸収スペクトルも意味する。ここで、実施例６において示されるように、ピークの波数には±４ｃｍ－１の範囲でばらつきが生じ得るため、「実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトル」は、例えば、ピークの波数が±４ｃｍ－１の範囲で異なるフーリエ変換赤外吸収スペクトルであってよい。また、第一～第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルおいては、波数１０５５～１０５９ｃｍ－１付近のピークのピーク強度を１としたときの他のピークのピーク強度（本明細書中、「ピーク強度比」ともいう。）に、±３×標準偏差の範囲でばらつきが生じ得る。したがって、「実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトル」は、例えば、ピーク強度比が±３×標準偏差の範囲で異なるフーリエ変換赤外吸収スペクトルであってよく、具体的には、ピーク強度比が実施例６の表８～１１に示すピーク強度比の範囲内で図１～１２とは異なるフーリエ変換赤外吸収スペクトルであってよい。なお、後述するように、表８は第一の共重合体のピークを示し、表９は第二の共重合体のピークを示し、表１０は第三の共重合体のピークを示し、表１１は第四の共重合体のピークを示す。
【0039】
核酸抽出液中のドデシルアルコール硫酸エステル塩の濃度は、核酸を抽出できる濃度であれば特に制限されず、例えば、０．０１～１％（ｗ／ｖ）、０．１～１％（ｗ／ｖ）、又は０．２～１％（ｗ／ｖ）であってよい。抽出工程において混合するドデシルアルコール硫酸エステル塩の量は、核酸抽出液中のドデシルアルコール硫酸エステル塩の濃度が上記濃度範囲となる量であってよい。
【0040】
核酸抽出液中のＭＰＣポリマーの濃度は、例えば、０．０１～４．０％（ｗ／ｖ）であってよく、０．０２～２．０％（ｗ／ｖ）であってよい。ＭＰＣポリマーとして第一の共重合体を用いる場合、核酸抽出液中の第一の共重合体の濃度は、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）以上であり、０．０２５％（ｗ／ｖ）以上、０．０３％（ｗ／ｖ）以上、０．０５％（ｗ／ｖ）以上、０．０６％（ｗ／ｖ）以上、又は０．１％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。核酸抽出液中の第一の共重合体の濃度は、例えば、０．２５％（ｗ／ｖ）以下、０．２％（ｗ／ｖ）以下、０．１％（ｗ／ｖ）以下、０．０６％（ｗ／ｖ）以下、０．０５％（ｗ／ｖ）以下、又は０．０３％（ｗ／ｖ）以下であってよい。核酸抽出液中の第一の共重合体の濃度は、例えば、０．０１～０．２５％（ｗ／ｖ）、０．０２～０．２％（ｗ／ｖ）、０．０２５～０．１％（ｗ／ｖ）、又は０．０３～０．１％（ｗ／ｖ）であってよい。抽出工程において混合するＭＰＣポリマーの量は、核酸抽出液中のＭＰＣポリマーの濃度が上記濃度範囲となる量であってよい。
【0041】
生体試料、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及びＭＰＣポリマーを混合する順番は特に限定されず、各成分を任意の順番で混合することができる。また、各成分を同時に混合してもよい。一実施形態において、ドデシルアルコール硫酸エステル塩及びＭＰＣポリマーを予め混合して後述の核酸抽出試薬を調製しておき、かかる核酸抽出試薬を生体試料と混合してもよい。
【0042】
抽出工程の温度は特に限定されず、例えば、０～１００℃又は１５～３０℃であってよい。
【0043】
本側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸増幅反応を行うための公知の試薬を核酸抽出液に混合する工程をさらに含んでよい。核酸増幅反応を行うための公知の試薬としては、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）、及びプライマーが挙げられる。核酸増幅反応を行うためのその他の公知の試薬としては、例えば、酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤、酵素又は鋳型を安定化するジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の保護剤、増副産物を検出するためのプローブ、並びに核酸を効率的に増幅させる上で有用なシクロデキストリンが挙げられる。
【0044】
本側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸抽出液中の核酸を増幅する工程（以下、増幅工程ともいう。）をさらに含んでよい。核酸の増幅は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ（ループ媒介等温増幅）法、ＲＴ－ＬＡＭＰ（逆転写ＬＡＭＰ）法、ＴＲＣ（転写－逆転写協奏反応）法等、従来公知の核酸増幅法を用いて行うことができる。
【0045】
増幅工程は、シクロデキストリンの存在下で行うことが好ましい。シクロデキストリンとしては、例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン、及びこれらの誘導体が挙げられる。シクロデキストリンの誘導体とは、水酸基の一部がＯＲ基に置換された分子であり、Ｒは、例えば、炭化水素基又はヒドロキシアルキル基である。一例として、シクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（Ｈｐ－β－ＣＤ）であってよい。シクロデキストリンの量は、例えば、核酸抽出液中のドデシルアルコール硫酸エステル塩１質量部に対して８質量部以上であってよい。シクロデキストリンは、ドデシルアルコール硫酸エステル塩を包接する作用を有するため、核酸増幅反応にドデシルアルコール硫酸エステル塩が及ぼす影響を低減することができる。
【0046】
本側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸の抽出にドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーを用いるため、核酸を増幅する前に核酸抽出液から核酸を分離及び精製する必要がない。したがって、核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、抽出工程と増幅工程との間に、核酸抽出液から核酸を分離又は精製する工程を含まなくてよい。本方法によれば、核酸を分離又は精製する工程を割愛することができるため、簡便、迅速かつ高効率に核酸を増幅することができる。
【0047】
また、上記側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法においては、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーを組み合わせることで、増幅反応における反応阻害を低減できるだけでなく、非特異的増幅を低減することもできる。したがって、本発明の別の一側面は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩及びＭＰＣポリマーと混合して、核酸抽出液を得る工程（抽出工程）を含む、核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法であるといえる。非特異的増幅は、生体試料に起因する非特異的増幅であってよく、より具体的には、生体試料中の生体由来物質に起因する非特異的増幅であってよい。生体由来物質は核酸以外の物質であり、例えばタンパク質が挙げられる。
【0048】
抽出工程の詳細は、上述のとおりである。ただし、生体試料が鼻腔拭い液である場合、ＭＰＣポリマーは、より好ましくは第二の共重合体である。
【0049】
本側面に係る核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法は、核酸増幅反応を行うための公知の試薬を核酸抽出液に混合する工程をさらに含んでよく、かつ／又は核酸抽出液中の核酸を増幅する工程（増幅工程）をさらに含んでよい。これらの工程の詳細は、上述のとおりである。
【0050】
本側面に係る核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法においては、上記側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法同様、核酸を増幅する前に核酸抽出液から核酸を分離及び精製する必要がない。したがって、核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法は、抽出工程と増幅工程との間に、核酸抽出液から核酸を分離又は精製する工程を含まなくてよい。本方法によれば、核酸を分離又は精製する工程を割愛することができるため、簡便、迅速かつ高効率に核酸を増幅することができる。
【0051】
本発明の別の一側面は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩及びＭＰＣポリマーと混合して、核酸抽出液を得る工程（抽出工程）を含む、核酸を抽出する方法である。抽出工程の詳細は、上述のとおりである。
【0052】
本発明の別の一側面は、核酸を抽出する上記方法により核酸抽出液を得る工程（抽出工程）と、核酸抽出液中の核酸を増幅する工程（増幅工程）とを含む、核酸を増幅する方法である。増幅工程の詳細は、上述のとおりである。
【0053】
本側面に係る核酸を増幅する方法は、抽出工程と増幅工程との間に、核酸増幅反応を行うための公知の試薬を核酸抽出液に混合する工程を含んでよい。この工程の詳細は、上述のとおりである。また、本側面に係る核酸を増幅する方法は、抽出工程と増幅工程との間に、核酸抽出液から核酸を分離又は精製する工程を含まなくてよい。
【0054】
上記側面に係る核酸を抽出する方法及び核酸を増幅する方法によれば、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合における、生体試料に起因する反応阻害、及び非特異的増幅を低減することができる。
【0055】
本発明の別の一側面は、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーとを含む、核酸抽出試薬である。ドデシルアルコール硫酸エステル塩及びＭＰＣポリマーの詳細は、上述のとおりである。
【0056】
核酸抽出試薬中のドデシルアルコール硫酸エステル塩の濃度は、核酸を抽出できる濃度であれば特に制限されず、例えば、０．０１～１％（ｗ／ｖ）、０．１～１％（ｗ／ｖ）、又は０．２～１％（ｗ／ｖ）であってよい。
【0057】
核酸抽出試薬中のＭＰＣポリマーの濃度は、例えば、０．０１～４．０％（ｗ／ｖ）であってよく、０．０２～２．０％（ｗ／ｖ）であってよい。ＭＰＣポリマーとして第一の共重合体を用いる場合、核酸抽出試薬中の第一の共重合体の濃度は、例えば、０．０１～０．２５％（ｗ／ｖ）、０．０２～０．２％（ｗ／ｖ）、０．０２５～０．１％（ｗ／ｖ）、又は０．０３～０．１％（ｗ／ｖ）であってよい。
【0058】
核酸抽出試薬を使用することのできる生体試料は、核酸を含む生体試料であれば特に限定されず、上述の生体試料を用いることができる。核酸抽出試薬は、例えば、唾液、喀痰、又は鼻腔拭い液中の核酸を抽出するための試薬であってよい。
【0059】
上記側面に係る核酸抽出試薬は、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーとを含む組成物であるが、本発明の別の一側面において、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーは、別々の試薬として提供されてもよい。すなわち、本発明の別の一側面は、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーとを含む、核酸抽出用キットである。
【実施例0060】
以下の試験例において、「％」は、別段の記載がない限り（質量／容量）％、すなわち％（ｗ／ｖ）を指す。リピジュア（登録商標）の濃度は、リピジュア（登録商標）に含まれるＭＰＣポリマーの濃度で示した。
【0061】
以下の試験例において、検体抽出液の調製は室温（２０～２５℃）にて行い、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応液の調製は氷上にて行った。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の鋳型として用いたＲＮＡは、配列番号１に示すＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＭ遺伝子を組み込んだ人工遺伝子を転写することにより作製した。検体と混合したリピジュア（登録商標）（ＭＰＣポリマーの５質量％水溶液）は、すべて日油株式会社製である。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応に用いたＬＡＭＰマスターミックスは、ＬＡＭＰプレミックス（緩衝液、ＭｇＳＯ４、ｄＮＴＰ、プライマーミックス、プローブ、ＡＭＶ逆転写酵素、及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含む）に、Ｈｐ－β－ＣＤを加え、撹拌及び遠心することで調製した。表２にプライマーミックスに含まれるプライマー及びプローブの配列並びに終濃度を示す。ただし、表２中のＬＦプライマー及びＬＢプライマーは、実施例１及び２では使用しなかった。プローブの３’末端はＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬで標識した。
【0062】
【表2】
【0063】
ＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、リアルタイムＰＣＲ装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（ロシュ社製）を用いて、６３℃で５０分行った。実施例２以外の実施例では、プローブの消光による蛍光強度の減少をモニタリングし（励起波長４６５ｎｍ、検出波長５１０ｎｍ）、所定の蛍光強度に減少するまでに要する時間（検出時間）を算出した。
【0064】
＜実施例１＞増幅阻害に対するＭＰＣポリマーの効果
（１）鼻腔拭い液
健常人から鼻腔拭い液を採取したドライスワブを、４００μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液３．８μＬを、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ８０２、又はＢＬ１００２を含む０．１５％ＳＤＳ溶液１１．３μＬに添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。表３に示す濃度は、増幅反応を阻害しない濃度である。別途、０．２％ＳＤＳ溶液３．８μＬを０．１５％ＳＤＳ溶液１１．３μＬに混合して、対照を調製した。
（１）鼻腔拭い液
健常人から鼻腔拭い液を採取したドライスワブを、４００μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液３．８μＬを、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ８０２、又はＢＬ１００２を含む０．１５％ＳＤＳ溶液１１．３μＬに添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。表３に示す濃度は、増幅反応を阻害しない濃度である。別途、０．２％ＳＤＳ溶液３．８μＬを０．１５％ＳＤＳ溶液１１．３μＬに混合して、対照を調製した。
【0065】
【表3】
【0066】
（２）唾液
健常人から採取した唾液３４μＬを、３１６μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液２４μＬに、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ８０２、又はＢＬ１００２を６．０μＬ添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。別途、精製水３４μＬを３１６μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に混合し、得られた溶液２４μＬに精製水６．０μＬ添加し、対照を調製した。
健常人から採取した唾液３４μＬを、３１６μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液２４μＬに、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ８０２、又はＢＬ１００２を６．０μＬ添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。別途、精製水３４μＬを３１６μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に混合し、得られた溶液２４μＬに精製水６．０μＬ添加し、対照を調製した。
【0067】
（３）喀痰
健常人から採取した喀痰１２．２μＬを、８７．８μＬの０．２３％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液４．０μＬに、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５又はＢＬ４０７を含む０．２５％ＳＤＳ溶液１６．０μＬを添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。別途、精製水１２．２μＬを８７．８μＬの０．２３％ＳＤＳ溶液に混合し、得られた溶液４．０μＬに０．２５％ＳＤＳ溶液１６．０μＬを混合して、対照を調製した。
健常人から採取した喀痰１２．２μＬを、８７．８μＬの０．２３％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液４．０μＬに、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５又はＢＬ４０７を含む０．２５％ＳＤＳ溶液１６．０μＬを添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。別途、精製水１２．２μＬを８７．８μＬの０．２３％ＳＤＳ溶液に混合し、得られた溶液４．０μＬに０．２５％ＳＤＳ溶液１６．０μＬを混合して、対照を調製した。
【0068】
（４）ＲＴ－ＬＡＭＰ反応
上記（１）～（３）の検体抽出液又は対照４．０μＬ、鋳型ＲＮＡ（鼻腔拭い液及び唾液に対しては５００コピー、喀痰に対しては２０００コピー）を含む溶液１．０μＬ、及びＬＡＭＰマスターミックス５．０μＬを混合し、得られた反応液（４．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、リピジュア（登録商標）を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。
上記（１）～（３）の検体抽出液又は対照４．０μＬ、鋳型ＲＮＡ（鼻腔拭い液及び唾液に対しては５００コピー、喀痰に対しては２０００コピー）を含む溶液１．０μＬ、及びＬＡＭＰマスターミックス５．０μＬを混合し、得られた反応液（４．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、リピジュア（登録商標）を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。
【0069】
結果を図１３に示す。図１３の（ａ）は鼻腔拭い液を含む反応液の結果を示し、図１３の（ｂ）は唾液を含む反応液の結果を示し、図１３の（ｃ）は喀痰を含む反応液の結果を示す。検体を含む反応液では、検体を含まない対照の反応液と比べて検出に長い時間を要していた。これは、検体中の生体由来物質により目的の増幅反応が阻害されたことを示す。また、リピジュア（登録商標）を添加することによって、検体を含む反応液での検出時間が短縮された。これは、リピジュア（登録商標）の添加によって、検体中の生体由来物質による目的の増幅反応の阻害が低減されたことを示す。
【0070】
＜実施例２＞非特異的増幅に対するＭＰＣポリマーの効果
健常人から鼻腔拭い液を採取したドライスワブを、４００μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液１．５μＬを、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ８０２、又はＢＬ１００２を含む０．１６％ＳＤＳ溶液１３．５μＬに添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。別途、０．２％ＳＤＳ溶液１．５μＬを０．１６％ＳＤＳ溶液１３．５μＬに混合して、対照を調製した。検体抽出液又は対照５．０μＬ及びＬＡＭＰマスターミックス５．０μＬを混合し、得られた反応液（４．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、リピジュア（登録商標）を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。なお、非特異的増幅の程度を調べるために、ＬＡＭＰマスターミックスには、反応液中の濃度が０．１０μＭとなるようにＳＹＴＯ（商標） ６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎを添加し、ＳＹＴＯの蛍光強度をモニタリングした（励起波長６１８ｎｍ、検出波長６６０ｎｍ）。
健常人から鼻腔拭い液を採取したドライスワブを、４００μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液１．５μＬを、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ８０２、又はＢＬ１００２を含む０．１６％ＳＤＳ溶液１３．５μＬに添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。別途、０．２％ＳＤＳ溶液１．５μＬを０．１６％ＳＤＳ溶液１３．５μＬに混合して、対照を調製した。検体抽出液又は対照５．０μＬ及びＬＡＭＰマスターミックス５．０μＬを混合し、得られた反応液（４．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、リピジュア（登録商標）を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。なお、非特異的増幅の程度を調べるために、ＬＡＭＰマスターミックスには、反応液中の濃度が０．１０μＭとなるようにＳＹＴＯ（商標） ６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎを添加し、ＳＹＴＯの蛍光強度をモニタリングした（励起波長６１８ｎｍ、検出波長６６０ｎｍ）。
【0071】
結果を図１４に示す。図１４の（ａ）は鼻腔拭い液を含む反応液の結果を示し、図１４の（ｂ）は鼻腔拭い液を含まない対照の反応液の結果を示す。図１４の（ａ）が示すように、検体にＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２を添加した場合は、リピジュア（登録商標）を添加しなかった場合と比べて非特異的増幅反応が遅延した。これは、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２の添加によって、非特異的増幅反応が低減されたことを示す。
【0072】
＜実施例３＞ＭＰＣポリマー濃度の変化による影響
健常人から採取した唾液（２検体）又は精製水１１μＬに、０．００～０．２５％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５（第一の共重合体）を含む１．２％ＳＤＳ溶液７０μＬを添加し、検体抽出液を得た。鋳型ＲＮＡ２００コピーを含む溶液０．３μＬ、検体抽出液１０．０μＬ、及びＬＡＭＰマスターミックス１４．７μＬを混合し、得られた反応液（８．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。下式のとおり、唾液検体に起因する検出時間の遅延を算出した：
遅延時間（分）＝（唾液を含む反応液での検出時間）－（精製水を含む反応液での検出時間）
健常人から採取した唾液（２検体）又は精製水１１μＬに、０．００～０．２５％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５（第一の共重合体）を含む１．２％ＳＤＳ溶液７０μＬを添加し、検体抽出液を得た。鋳型ＲＮＡ２００コピーを含む溶液０．３μＬ、検体抽出液１０．０μＬ、及びＬＡＭＰマスターミックス１４．７μＬを混合し、得られた反応液（８．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。下式のとおり、唾液検体に起因する検出時間の遅延を算出した：
遅延時間（分）＝（唾液を含む反応液での検出時間）－（精製水を含む反応液での検出時間）
【0073】
結果を図１５に示す。０．０１６～０．２５％（ｗ／ｖ）のいずれ濃度でも、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を含まない場合と比較して、遅延時間が減少していた。この結果は、０．０１６～０．２５％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５の添加によって、唾液検体中の生体由来物質による目的の増幅反応の阻害が低減されたことを示す。
【0074】
＜実施例４＞検体量の変化による影響
健常人から採取した唾液１０μＬに、０．０６３％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５（第一の共重合体）を含む０．２％ＳＤＳ溶液を５０μＬ～４００μＬ添加して、検体抽出液を得た。検体抽出液に鋳型ＲＮＡ５１２８コピーを含む溶液６．４μＬを添加した。鋳型ＲＮＡと検体抽出液との混合溶液１０．０μＬ及びＬＡＭＰマスターミックス１５．０μＬを混合し、得られた反応液（４．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。
健常人から採取した唾液１０μＬに、０．０６３％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５（第一の共重合体）を含む０．２％ＳＤＳ溶液を５０μＬ～４００μＬ添加して、検体抽出液を得た。検体抽出液に鋳型ＲＮＡ５１２８コピーを含む溶液６．４μＬを添加した。鋳型ＲＮＡと検体抽出液との混合溶液１０．０μＬ及びＬＡＭＰマスターミックス１５．０μＬを混合し、得られた反応液（４．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。
【0075】
結果を図１６に示す。唾液１０μＬとＳＤＳ溶液を４００μＬと鋳型ＲＮＡ６．４μＬとを混合して得られた混合溶液中の唾液量（１倍）から、唾液量を１．９倍～６．３倍増加させることで、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５が未添加の場合は検出時間が遅くなり、目的の増幅反応の阻害が増大したことが示唆された。一方、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を添加することで、唾液量が増加しても検出時間はほとんど変わらず、目的の増幅反応の阻害が低減されていた。
【0076】
＜実施例５＞ＬＤＳの使用による影響
健常人から採取した唾液１１μＬに、０．０６３％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５（第一の共重合体）を含む１．２％ＬＤＳ溶液７０μＬを添加して、検体抽出液を得た。ＬＤＳは２社（Ａ社及びＢ社）から購入した。鋳型ＲＮＡ２５０コピーを含む溶液０．３μＬ、検体抽出液９．０μＬ、及びＬＡＭＰマスターミックス１５．７μＬを混合し、得られた反応液（８．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。
健常人から採取した唾液１１μＬに、０．０６３％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５（第一の共重合体）を含む１．２％ＬＤＳ溶液７０μＬを添加して、検体抽出液を得た。ＬＤＳは２社（Ａ社及びＢ社）から購入した。鋳型ＲＮＡ２５０コピーを含む溶液０．３μＬ、検体抽出液９．０μＬ、及びＬＡＭＰマスターミックス１５．７μＬを混合し、得られた反応液（８．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。
【0077】
結果を図１７に示す。ＬＤＳを用いた場合もＳＤＳを用いた場合と同様に、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５の添加により目的の増幅反応の阻害が低減された。
【0078】
＜実施例６＞ＭＰＣポリマーの分析
フーリエ変換赤外分光光度計ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１Ｓ（株式会社島津製作所製）を用いて、ＡＴＲ法によりＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ１００２、ＢＬ８０２、及びＢＬ４０７それぞれのフーリエ変換赤外吸収スペクトルを測定した。具体的には、上記リピジュアの原液を、ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１Ｓのプリズム面に２μＬ滴下し、自然乾燥させて密着させ、以下の条件で各リピジュアにつき３回ずつ測定を行った。
・測定モード：ＡＢＳ
・積算回数：４０回
・アポダイズ関数：Ｈａｐｐ－Ｇｅｎｚｅｌ
・測定波数範囲：４００～４０００ｃｍ－１
フーリエ変換赤外分光光度計ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１Ｓ（株式会社島津製作所製）を用いて、ＡＴＲ法によりＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ１００２、ＢＬ８０２、及びＢＬ４０７それぞれのフーリエ変換赤外吸収スペクトルを測定した。具体的には、上記リピジュアの原液を、ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１Ｓのプリズム面に２μＬ滴下し、自然乾燥させて密着させ、以下の条件で各リピジュアにつき３回ずつ測定を行った。
・測定モード：ＡＢＳ
・積算回数：４０回
・アポダイズ関数：Ｈａｐｐ－Ｇｅｎｚｅｌ
・測定波数範囲：４００～４０００ｃｍ－１
【0079】
解析ソフトＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標）ＩＲ（株式会社島津製作所製）を用いてスペクトルのベースライン補正及びＡＴＲ補正を行った。ベースライン補正は、表１に示す波数を補正点として指定して行った。ＡＴＲ補正は、９９９ｃｍ－１を補正波数として指定して行った。補正後のスペクトルにおけるピークを解析した。ＭＰＣポリマーに特徴的なピークが観察された波数範囲７００～３０００ｃｍ－１での補正後のスペクトルを図１～１２に示す。図１～３は第一の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５）のスペクトルであり、図４～６は第二の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２）のスペクトルであり、図７～９は第三の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ８０２）のスペクトルであり、図１０～１２は第四の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０７）のスペクトルである。また、補正後のスペクトルにおいて、波数１０５５～１０５９ｃｍ－１付近のピークのピーク強度を１としたときの他のピークのピーク強度（ピーク強度比）を算出した。波数範囲７００～３０００ｃｍ－１におけるピークの解析結果を表４～７に示す。
【0080】
【表4】
【0081】
【表5】
【0082】
【表6】
【0083】
【表7】
【0084】
各ＭＰＣポリマーの各ピークについて波数の平均値を算出し、平均値と測定値を比較したところ、測定値の平均値からのばらつきは±４ｃｍ－１以内であった。したがって、第一～第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルの測定においては、ピークの波数に±４ｃｍ－１の範囲でばらつきが生じるといえる。また、各ＭＰＣポリマーの各ピークについて３回の測定におけるピーク強度比から標準偏差を算出した。第一～第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルの測定においては、ピーク強度比に概ね±３×標準偏差の範囲でばらつきが生じるといえる。これらの結果から、第一～第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルは、表８～１１に示すピークを有するといえる。表８は第一の共重合体のピークを示し、表９は第二の共重合体のピークを示し、表１０は第三の共重合体のピークを示し、表１１は第四の共重合体のピークを示す。表８～１１中、「波数」は上記で算出した平均波数±４の値を示し、「ピーク強度比」は上記の「ピーク強度比±３×標準偏差」の数値範囲を示す。ただし、ピーク強度比－３×標準偏差の値が負の値の場合は、ピーク強度比の下限を「０超」と記載した。また、波数１０５５～１０５９ｃｍ－１付近のピークのピーク強度は「１」と記載した。
【0085】
【表8】
【0086】
【表9】
【0087】
【表10】
【0088】
【表11】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】