特開 2023-145401 ＤＮＡアプタマー、それを含む医薬組成物及びＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023145401

(43)【公開日】2023-10-11

(54)【発明の名称】ＤＮＡアプタマー、それを含む医薬組成物及びＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20231003BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20231003BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20231003BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231003BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20231003BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231003BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231003BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231003BHJP

【ＦＩ】

C12N15/115 Z ZNA

A61K31/711

A61P9/00

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61P9/04

A61P1/16

A61P13/12

A61P11/00

【審査請求】有

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023050398

(22)【出願日】2023-03-27

(31)【優先権主張番号】17/705,421

(32)【優先日】2022-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523112921

【氏名又は名称】財團法人祺華教育基金會

【氏名又は名称原語表記】ＣＨＩ－ＨＵＡ ＦＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110002066

【氏名又は名称】弁理士法人筒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】呉 宛霖

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA36

4C086ZA59

4C086ZA75

4C086ZA81

4C086ZB21

4C086ZC41

(57)【要約】      （修正有）

【課題】本発明は、ＤＮＡアプタマー、それを含む医薬組成物、ＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制する方法に関するものであり、特に、ＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制することができるＤＮＡアプタマーに関するものである。
【解決手段】本発明のＤＮＡアプタマーは、ＴＸＮＤＣ５に特異的に結合するポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、特定のヌクレオチド配列である。医薬組成物は、上記ＤＮＡアプタマーを活性成分として含む。ＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制する方法は、上記ＤＮＡアプタマーをＴＸＮＤＣ５に結合することを含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＸＮＤＣ５に特異的に結合するポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１－１４のいずれか１つのヌクレオチド配列よりなる群から選択される、
ＤＮＡアプタマー。

【請求項2】

前記ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３のヌクレオチド配列である、
請求項１に記載のＤＮＡアプタマー。

【請求項3】

前記ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７のヌクレオチド配列である、
請求項１に記載のＤＮＡアプタマー。

【請求項4】

前記ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１のヌクレオチド配列である、
請求項１に記載のＤＮＡアプタマー。

【請求項5】

請求項１に記載のＤＮＡアプタマーを活性成分として含む、
医薬組成物。

【請求項6】

前記ＤＮＡアプタマーは心臓線維化的治療剤である、
請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記ＤＮＡアプタマーは心不全に対する治療剤である、
請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記ＤＮＡアプタマーは肝線維化に対する治療剤である、
請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記ＤＮＡアプタマーは腎線維化に対する治療剤である、
請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記ＤＮＡアプタマーは慢性腎臓疾患に対する治療剤である、
請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記ＤＮＡアプタマーは肺線維化に対する治療剤である、
請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項12】

請求項１に記載のＤＮＡアプタマーをＴＸＮＤＣ５に結合することを含む、
ＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＤＮＡアプタマー、それを含む医薬組成物、ＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制する方法に関するものである。特に、ＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制することができるＤＮＡアプタマーに関するものである。

【背景技術】

【0002】

チオレドキシンドメイン含有タンパク質５(Thioredoxin domain-containing 5、ＴＸＮＤＣ５)は、小胞体にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの酵素活性を有する、小胞体タンパクである。ＴＸＮＤＣ５は、細胞タンパク質ジスルフィド結合の好適なフォールディング及び正確な形成を促進する。

【0003】

近年、ＴＸＮＤＣ５は、多くの疾患の発病原因において、重要な役割を果たすことが既に立証されている。

【0004】

ある研究において、ＴＸＮＤＣ５は、心臓線維化及び心不全の重要な調節者であって、細胞外基質タンパクのフォールディングを促すと共に、酸化還元感受性のＮ末端キナーゼ・信号により心臓線維化を誘導することが指摘されている(Ying-Chun Shih et al. Endoplasmic Reticulum Protein TXNDC5 Augmentsmyocardial Fibrosis by Facilitating Extracellularmatrix Protein Folding and Redox-Sensitive Cardiac Fibroblast Activation.Circ Res 2018 Apr 13; 122(8):1052-1068)。上記研究は、ＴＸＮＤＣ５を取り除くと、βアゴニストが誘導する心臓線維化及び収縮機能障害を回避できるということも示している。

【0005】

また、ＴＸＮＤＣ５が、ＴＧＦＢＲ１の肺線維芽細胞におけるフォールディング及び安定の促進を通じてＴＧＦβ１のシグナル伝達を向上させることにより、肺線維化を促進すると共に、ＴＸＮＤＣ５の線維芽細胞を特異的に取り除くことにより、ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ(ＢＬＭ)が誘導する肺線維化(ＰＦ)及び肺機能損害を軽減することができることも立証されている(Tzu-Han Lee et al. Fibroblast-enriched endoplasmic reticulum protein TXNDC5 promotes pulmonary fibrosis by augmenting TGFβ signaling through TGFBR1 stabilization. nature communications 11:4254(2020))。

【0006】

また、ＴＸＮＤＣ５は、腎線維化の重要な調節者であると共に、慢性腎臓疾患の動物モデルにおいて、Ｔｘｎdｃ５の線維芽細胞を特異的に取り除くことにより、腎線維化を緩和することができることが立証されている(YT Chen, PY Jhao, CT Hung, YF Wu, SJ Lin, WC Chiang, SL Lin, KC Yang. Endoplasmic Reticulum Protein TXNDC5 Promotes Renal Fibrosis by Enforcing TGFβ Signaling in Kidney Fibroblasts. Journal of Clinical Investigation 2021mar 1: 131(5): e143645)。

【0007】

別の研究において、ＴＸＮＤＣ５は、前線維化ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３シグナル伝達の活性化を通じて、肝星細胞(hepatic stellate cells)の活性及び細胞外基質を促進することにより、肝線維化を引き起こすことが示されている(CT Hung, TH Su, YT Chen, YF Wu, YT Chen, SJ Lin, SL Lin, KC Yang. gutjnl. Gut 2021 Dec 21: gutjnl-2021-325065)。

【発明の概要】

【0008】

本発明の目的は、ＴＸＮＤＣ５に特異的に結合するポリヌクレオチドを含むＤＮＡアプタマーを提供することである。前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１－１４のいずれか１つのヌクレオチド配列よりなる群から選択される。

【0009】

前記ＤＮＡアプタマーに関して、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３のヌクレオチド配列である。

【0010】

前記ＤＮＡアプタマーに関して、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７のヌクレオチド配列である。

【0011】

前記ＤＮＡアプタマーに関して、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１のヌクレオチド配列である。

【0012】

上記目的のいずれか１つを達成するために、本発明は、上記ＤＮＡアプタマーを活性成分として含む医薬組成物を提供する。

【0013】

前記医薬組成物に関して、前記ＤＮＡアプタマーは、心臓線維化に対する治療剤である。

【0014】

前記医薬組成物に関して、前記ＤＮＡアプタマーは、心不全に対する治療剤である。

【0015】

前記医薬組成物に関して、前記ＤＮＡアプタマーは、肝線維化に対する治療剤である。

【0016】

前記医薬組成物に関して、前記ＤＮＡアプタマーは、腎線維化に対する治療剤である。

【0017】

前記医薬組成物に関して、前記ＤＮＡアプタマーは、慢性腎臓疾患に対する治療剤である。

【0018】

前記医薬組成物に関して、前記ＤＮＡアプタマーは、肺線維化に対する治療剤である。

【0019】

上記目的のいずれか１つを達成するために、本発明は、更に、上記ＤＮＡアプタマーをＴＸＮＤＣ５に結合することを含む、ＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ＤＮＡアプタマーのＴＸＮＤＣ５に対する結合親和性を説明する図である。

【図2A】Ａｐｔ－３を示す３Ｄ構造図である。

【図2B】Ａｐｔ－３及び野生型ヒトＴＸＮＤＣ５を示すドッキングシミュレーション図であり、矢印は、ＣＧＨＣ触媒モチーフである。

【図3A】Ａｐｔ－７を示す３Ｄ構造図である。

【図3B】Ａｐｔ－７及び野生型ヒトＴＸＮＤＣ５を示すドッキングシミュレーション図であり、矢印は、ＣＧＨＣ触媒モチーフである。

【図4A】Ａｐｔ－１１を示す３Ｄ構造図である。

【図4B】Ａｐｔ－１１及び野生型ヒトＴＸＮＤＣ５を示すドッキングシミュレーション図であり、矢印は、ＣＧＨＣ触媒モチーフである。

【図5A】Ａｐｔ－３の解離定数を示す図である。

【図5B】Ａｐｔ－７の解離定数を示す図である。

【図6A】ヒトＴＸＮＤＣ５及びマウスＴＸＮＤＣ５の最適濃度を示す図である。

【図6B】ＴＸＮＤＣ５タンパク全体の遅延時間を示す図である。

【図6C】Ｔｒｘドメインの最適濃度を示す図である。

【図6D】Ｔｒｘドメインの遅延時間を示す図である。

【図7A】ＴｒｘドメインとＨ₂Ｏ₂との交互作用によるＴＸＮＤＣ５ジスルフィド結合異性化酵素(disulfide isomerase)の活性アッセイを示す図である。

【図7B】ＴＸＮＤＣ５とＨ₂Ｏ₂又は１６Ｆ１６との交互作用によるＴＸＮＤＣ５ジスルフィド異性化酵素の活性アッセイを示す図である。

【図7C】細胞により表現されたＴＸＮＤＣ５とびＨ₂Ｏ₂との相互作用によるＴＸＮＤＣ５ジスルフィド異性化酵素の活性アッセイを示す図である。

【図8A】アプタマー－３の剤量反応アッセイを示す図である。

【図8B】アプタマー－３の抑制率を示す図である。

【図8C】アプタマー－７の剤量反応アッセイを示す図である。

【図8D】アプタマー－７の抑制率を示す図である。

【図8E】アプタマー－１１の剤量反応アッセイを示す図である。

【図8F】アプタマー－１１の抑制率を示す図である。

【図9A】体外生物活性アッセイの制御グループを示す結果である。

【図9B】体外生物活性アッセイの第一実験グループを示す結果である。

【図9C】体外生物活性アッセイの第二実験グループを示す結果である。

【図9D】体外生物活性アッセイの第三実験グループを示す結果である。

【図10A】抗線維化作用アッセイを示す結果である。

【図10B】抗線維化作用アッセイを示す結果である。

【図11A】細胞内ウエスタンブロッティングアッセイを示す結果である。

【図11B】細胞内ウエスタンブロッティングアッセイを示す結果である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本開示内容の目的、特徴及び効果の理解を助けるために、本開示内容の詳細な説明に添付図の実施例を合わせて説明する。

【0022】

磁気アシスト迅速アプタマー選択(Magnetic-assisted rapid aptamer selection、ＭＡＲＡＳ)
先行研究に基づき、ＴＸＮＤＣ５を標的とすることは、例えば、心臓線維化、心不全、肝線維化、腎線維化、慢性腎臓疾患及び肺線維化のような様々な線維化に関連する疾患に対する新規な治療方法になり得る。

【0023】

ＴＸＮＤＣ５を標的とする戦略は、高特異性及び高親和性でＴＸＮＤＣ５と結合することができると共に、ＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制することができる、ＤＮＡアプタマーを提供する。このために、磁気アシスト迅速アプタマー選択によってこの新規な磁気のアプタマーに基づいて選択する方法を複数の標的であるＴＸＮＤＣ５のＤＮＡアプタマー識別に用いる。

【0024】

ＭＡＲＡＳによりＴＸＮＤＣ５を標的とするＤＮＡアプタマー(以下、アプタマーという場合がある)を選択する方法を以下の通り説明する。

【0025】

まず、ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎキットの操作マニュアルに基づいて、ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎキットによって、野生型ＴＸＮＤＣ５、触媒機能を失ったＴＸＮＤＣ５タンパク及びヒト血清をビオチン化する。

【0026】

計１００μgのそれぞれの生物化タンパク(上記ビオチン化された野生型ＴＸＮＤＣ５、触媒機能を失ったＴＸＮＤＣ５タンパク及びヒト血清を含む)と、ストレプトアビジン(streptavidin、ＳＡ)が被覆された５０μgのビーズ(ＭＮＰ)(ＳＡ－ＭＮＰ)とを混合して、４℃で一晩置く。

【0027】

次に、ビーズと綴合せていないビオチン化タンパクを除去するために、磁気プラットフォームによって、それぞれの上記混合物(ビオチン化タンパク及び、ビオチン化タンパクに対応して反応するビーズを含む)を磁気分離する。

【0028】

ＭＮＰと綴合せたタンパク(ＴＸＮＤＣ５－ＭＮＰ)を結合緩衝液によって洗浄する(前記結合緩衝液は、２０mMのＴｒｉｓ－Ｃｌ(ｐＨ７.６)、１５０mMのＮａＣｌ、５０mMのＫＣｌ、２mMのＭｇＣｌ₂、１mMのＣａＣｌ₂及び０.０５vol%Ｔｗｅｎ－２０を含み、以下の用語「結合緩衝液」は、ここに記載されているものと同じ成分を含む結合緩衝液を意味する)と共に、上記洗浄されたＭＮＰと綴合せたタンパクを上記結合緩衝液の中に保存して、４℃下で放置するか、上記洗浄されたＭＮＰと綴合せたタンパクを後続の実験に継続して用いる。

【0029】

更に、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅd ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社(ＩＤＴ)によって、２５０nMの規模を採用することにより、出発遺伝子ライブラリとして、ランダムな５０種ヌクレオチのｓｓＤＮＡ遺伝子ライブラリ(アプタマー遺伝子ライブラリ)を化学合成している。それぞれのアプタマー(ｓｓＤＮＡ)は、２０個の中央ヌクレオチドがランダムであるポリヌクレオチドからなる。

【0030】

ＰＣＲ増幅及びシークエンシングに用いるために、固着された二段のステムループ(stem-loop)が、中央のヌクレオチドの両側にあり、その両端に配列されている(５’-AGCAGC ACAGAGGTC-N20-GCGTGCTACCGTGAA-３’)(Tsao, S.m et al. Generation of Aptamers from A Primer-Free Randomized ssDNA Library Usingmagnetic-Assisted Rapid Aptamer Selection. Sci Rep7, 45478, doi:10.1038/ srep45478(2017))。使用した二組のプライマーは以下の通りである。
５’-AGCAGCACAGAGGTC-３’及び５’-TTC ACGGTAGCACGC-３’。

【0031】

上記ｓｓＤＮＡライブラリが構築された後、出発遺伝子ライブラリとして、ランダムに選ばれた０.５μlのオリゴヌクレオチド溶液(出発濃度は、１００μMである)を使用すると共に、９.５μlの結合緩衝液を加えることにより、オリゴヌクレオチド遺伝子ライブラリを１０μlにまで希釈する(ランダムに選ばれたオリゴヌクレオチド溶液の最終濃度は５μMである)。

【0032】

ｓｓＤＮＡ二次構造を形成するために、上記溶液を９５℃に加熱して、５分間維持する共に、すばやく４℃に冷却し、上記溶液のｓｓＤＮＡが二次構造を形成した後、上記溶液を室温で静置して、３０分間維持する。結合緩衝液の中でＴＸＮＤＣ５(マウス野生型ＴＸＮＤＣ５)－ＭＮＰと、オリゴヌクレオチド(ｓｓＤＮＡ)とが作用することによって、室温でラウンド１のポジティブ選択を３０分間行う。

【0033】

これにより、アプタマー－ＴＸＮＤＣ５－ＭＮＰ複合物を形成するために、ＴＸＮＤＣ５－ＭＮＰとオリゴヌクレオチドとが共に結合する。上記アプタマー－ＴＸＮＤＣ５－ＭＮＰ複合物を、ＭＡＲＡＳプラットフォーム内部に配置し、強度が１４ガウスかつ４０－５０ＫＨｚの回転磁界を施して、１０分間維持している。上記回転磁界処理を経た後、凝集を避けるために、上記アプタマー－ＴＸＮＤＣ５－ＭＮＰ複合物を、２.５分ごとに移液する(ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ)方式によって、かき混ぜる。

【0034】

上記アプタマー－ＴＸＮＤＣ５－ＭＮＰ複合物を、２００μlの結合緩衝液で３回洗浄すると共に、結合緩衝液の中に保存する。両種ＴＸＮＤＣ５(ヒト及びマウス)に結合されるアプタマーを精製するために、改めて、上記アプタマー－ＴＸＮＤＣ５－ＭＮＰ複合物を１００μlの結合緩衝液の中で懸濁すると共に、同一の流れで次のラウンドのポジティブ選択(ヒト野生型ＴＸＮＤＣ５)を行う。

【0035】

続いて、過去ラウンド２のポジティブ選択による遺伝子ライブラリ(ｓｓＤＮＡ)と、ネガティブ血清－ＭＮＰとを共に室温で３０分間作用させることにより、ネガティブ選択を行う。磁気分離した後、ネガティブ血清－ＭＮＰと結合したアプタマーが除去される。上記ネガティブ選択手順の通り、収集された上清液に対して、他のネガティブ－ＭＮＰによって、処理を持続する(ラウンド２の血清－ＭＮＰ及びラウンド１の触媒機能を失ったＴＸＮＤＣ５－ＭＮＰ)。最終上清液を収集し、上記上清液には、血清及び触媒機能を失ったＴＸＮＤＣ５と結合しないアプタマー－ＴＸＮＤＣ５－ＭＮＰ複合物が含まれる。

【0036】

標的結合アプタマーをＰＣＲで増幅すると共に、ＰＣＲ純化キット(ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ純化キット(ＱＩＡＧＥＮ))によって、商品操作マニュアルに従って、標的結合されたアプタマーのアンプリコンを純化する。続いて、標的結合アプタマーの純化されたアンプリコンをｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター内にサブクローニングすると共に、ＤＨ５α受容性細胞内に導入する。Ｈｉｇｈ－Ｓｐｅｅd Ｐｌａｓｍｉdｍｉｎｉキット(Ｇｅｎｅａｉd社製)を使用して、ランダムに選ばれたコロニーを純化すると共に、上記コロニーにシークエンシングを行う。１４個のＴＸＮＤＣ５と結合されたアプタマーの詳細な配列は、表１に列記される。

【0037】

【表1】

【0038】

ＴＸＮＤＣ５の触媒機能に対するアプタマーの抑制作用を更に検討するために、後続の実験に用いるべく、アプタマー－３(Ａｐ－３)、アプタマー－７(Ａｐ－７)及びアプタマー－１１(Ａｐ－１１)を代表して選出した。

【0039】

単独アプタマーの逆検証
上記流れを経て、１００nMのアプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１を結合緩衝液の中でフォールディングさせる。２０nMのアプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１を取り出して、それぞれ、ポジティブ(マウス及びヒトＴＸＮＤＣ５(５μl))－ＭＮＰ及びネガティブ(血清及び触媒機能を失ったＴＸＮＤＣ５タンパク(５μl))－ＭＮＰと交雑すると共に、上記ＭＡＲＡＳ手順に基づき、交雑されたアプタマー－ＭＮＰを処理する。ＭＮＰと綴合せたアプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１を収集すると共に、１００μlのddＨ₂Ｏの中で９５℃に加熱して５分間維持することにより、アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１を溶出する。

【0040】

ｑ－ＰＣＲにより、上記アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１の量を検出すると共に、相対的発現量の程度を使用して検出結果を作成する。ｑ－ＰＣＲによってアプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１の量を検出する手順を以下の通り説明する。アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１の相対的発現を測定するために、ＢｉｏＲａd社製のＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔシステムによって、９６ウェル盤においてｑ－ＰＣＲを行う。

【0041】

上記溶出されたアプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１を五倍希釈し、上記希釈を経たアプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１をそれぞれ１００μlのリボヌクレアーゼが含まれる水の中に溶解する。ＢｉｏＲａd社製のＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔシステムを使用して９６ウェル盤の中でｑ－ＰＣＲを行うことによって、アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１の相対的発現を示している。

【0042】

総量が１０μlであるｑ－ＰＣＲ混合物を使用してｑ－ＰＣＲ反応を行い、上記ｑ－ＰＣＲ混合物中には、５μlの２ｘ_ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ(ＢｉｏＲａd)、１μlのポジティブアプタマープライマー(１μM、ＩＤＴ社)、１μlの逆方向アプタマープライマー(１μM、ＩＤＴ社)及び３μlの溶出されたアプタマーが含まれる。ｑ－ＰＣＲのパラメーターは、９５℃で３分間、９４℃で３０秒間で４０回の循環を行い、６０℃で３０秒間維持し、並びに、７２℃で３０秒間維持する。

【0043】

図１に示すように、アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１は、ポジティブ制御グループとの強い結合及び無視できるほどのネガティブ制御グループとの結合が観察された。アプタマー－３は、ヒトＴＸＮＤＣ５及びマウスＴＸＮＤＣ５に対して特異的な結合親和性があることを示している。アプタマー－１１は、マウスＴＸＮＤＣ５に対して特異で強力な結合親和性を有することを示している。

【0044】

アプタマー構造及びアプタマー/ＴＸＮＤＣ５のドッキング部位予測
上記確認されたＴＸＮＤＣ５を標的とするアプタマーとＴＸＮＤＣ５の触媒ドメインとが相互に作用するかを判断するために、コンピュータモデルを使用して、アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１の３Ｄモデル及び模擬タンパクドッキング部位を予測する。アプタマー構造及びアプタマー/ＴＸＮＤＣ５ドッキング部位予測については、後続の手順で示している。

【0045】

まず、Ｍ－ｆｏｌd ＤＮＡフォールディングウェブサイト ソフトウェア(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)を通じて、自由エネルギー最小化技術に基づいて、アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１の二次構造を予測する。Ｍ－ｆｏｌd ＤＮＡフォールディング形式のパラメーターを設定するために、アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１の出発配列を２５℃であって、１５０mMのＮａ^＋、２mMのＭｇ^２＋イオン環境において現れる線性形式に設定する。

【0046】

計算を行う状況を以下の通り設定した。最小自由エネルギーに基づいて、フォールディング立体構造は５％以内にのみあり、かつ５０個フォールディングの最大数量がペア塩基間の最大距離に制限されないことが考慮されている。次に、前記単独のアプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１をＲＮＡアプタマーと同じように改変すると共に、ＲＮＡＣｏｍｐｏｓｅｒ(http://rnacomposer.cs.put.poznan.pl)によって、二次構造に基づき予測を行う。

【0047】

最後に、ＰａｔｃｈＤｏｃｋサーバー(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/ PatchDock/)によって、個別のアプタマーのドッキング部位及び野生型ヒトＴＸＮＤＣ５構造(Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ、https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)を予測する。
アプタマー(リガンド分子)及びＴＸＮＤＣ５(受容体分子)の両者のタンパク質データバンク(protein data bank,ＰＤＢ)に基づきコードを選択し、酵素抑制剤の類型の平均二乗偏差(mean square deviation)(ＲＭＳＤ, ４ Å)の低閥値によって評価する。

【0048】

上記予測の結果は、図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、図４Ｂに示されるところ、上記あらゆる三種類のアプタマーは、それぞれその３’末端及び５’末端箇所に単一ステムループ構造(Ａｐ－１１)又は二重ステムループ構造(Ａｐ－３及びＡｐ－７)が現れ、自由エネルー値を有すること(Ａｐ－３:ΔＧ＝－４.２９kcal/mol、Ａｐ－７:ΔＧ＝－２.６６kcal/mol、Ａｐ－１１:ΔＧ＝－７.２０kcal/mol)を観察できる。

【0049】

３Ｄ構造、及びドッキング部位に対する予測結果は、アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１が野生型ヒトＴＸＮＤＣ５に強固に固着され(図２Ａ-４Ｂ)、かつアプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１の結合位置が触媒性チオレドキシン(catalytic thioredoxin,ＣＧＨＣ)に概ねドッキングできることを証明している。これは、ＴＸＮＤＣ５を標的とするアプタマーを、ＴＸＮＤＣ５に対するジスルフィドイソメラーゼ活性の潜在的なアンタゴニストとすることを更に表す。

【0050】

アプタマー－３及びアプタマー－７の解離定数(Ｋ _d )
ＴＸＮＤＣ５を標的とするアプタマーの結合親和性を更に判断するために、アプタマー－３及びアプタマー－７のＫ_d値をアプタマーと目標分子との交互作用の指数とし、アプタマー－３及びアプタマー－７のＫ_d値をｑ－ＰＣＲによって測定し、測定結果を非線形回帰フィッティングした。アプタマー－３及びアプタマー－７のＫ_d値の測定手段を以下に説明する。

【0051】

アプタマー－３及びアプタマー－７を分離すると共に、１００nMから３.１２５nMまで連続希釈を徐々に行い、アプタマー－３及びアプタマー－７を上記手順と同様の方法によって結合緩衝液の中でフォールディングする。アプタマー－３及びアプタマー－７に特異的に結合させるために、マウス－ＭＮＰ又はヒト－ＭＮＰのいずれか１つとアプタマー－３及びアプタマー－７とを等量で混合すると共に、上記ＭＡＲＡＳ及びｑ－ＰＣＲを継続して行う。

【0052】

ｑ－ＰＣＲから得られるそれぞれのＣｔ値の測定結果及び濃度の測定結果をＰＲＩＳＭ ８(Ｇｒａｐｈｐａd)によって非線形回帰の手段でフィッティングすることにより、アプタマー－３及びアプタマー－７のＫ_d値を測定する。それぞれの測定結果に対しても三重複で行うことで、誤差を減少させる。

【0053】

図５Ａ及び図５Ｂに示すように、マウスＴＸＮＤＣ５に対するアプタマー－３のＫ_d値は、７.５０４nMであり、ヒトＴＸＮＤＣ５に対するアプタマー－７のＫ_d値は、１６.９nMであることから、ＸＮＤＣ５を標的とするアプタマーはＴＸＮＤＣ５と効率よく結合できることが証明された。

【0054】

インスリン還元アッセイ
それぞれのアプタマーによるＴＸＮＤＣ５のジスルフィドイソメラーゼ活性を抑制する潜在能力を判断するために、インスリン濁度アッセイ(turbidimetric assay)を行う。

【0055】

インスリン濁度アッセイを行うために、２つの単独のＴＸＮＤＣ５のチオレドキシンドメイン(Ｔｒｘ１及びＴｒｘ２)及びＴＸＮＤＣ５タンパクを製造する。

【0056】

ＴＸＮＤＣ５の単独ドメイン(Ｔｒｘ１及びＴｒｘ２)は、高い触媒機能を有する。Ｔｒｘ１及びＴｒｘ２は、Ｙａｏ－Ｈｏｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃによって合成されたものであり、高速液体クロマトグラフ(high performance liquid chromatography,ＨＰＬＣ)によって分析すると、その純度は８５％より大きい。粉末形式の純化Ｔｒｘ１及びＴｒｘ２ペプチドを、濃度が１mg/mlである１:３アセトニトリル/水の混合物中で懸濁する。

【0057】

ＴＸＮＤＣ５のＴｒｘ１配列は、skhlytadm fthgiqsaah fvmffapwcg hcqrlqptwn dlgkynsme dakvyvakvd ctahsdvcsa qgvrgyptlk lfkpgqeavk yqgprdfqtl enwmlqtlneである。また、ＴＸＮＤＣ５のＴｒｘ２配列は、g lyelsanfe lhvaqgdhfi kffapwcghc kalaptweql alglehsetv kigkvdctqh yelcsgnqvr gyptllwfrd gkkvdqykgk rdleslreyv esqlqrteである。

【0058】

野生型ヒトＴＸＮＤＣ５、マウスＴＸＮＤＣ５、触媒性のある突然変異ヒトＴＸＮＤＣ５は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製のバキュロウイルス発現ベクターシステムによって生産される(Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社)。まず、ＰＣＲによってＴＸＮＤＣ５のｃＤＮＡをその両側の選択された制限断片(Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社より提供)に加える。

【0059】

続いて、上記制限断片を上記バキュロウイルス発現ベクターに送り、ＴＸＮＤＣ５のｃＤＮＡを含む上記バキュロウイルス発現ベクターを複数の昆虫細胞の中にトランスフェクションすることにより、必要なＴＸＮＤＣ５タンパクをコードする。ニッケル精製したカラムを使用して、細胞破片の可溶性断片の中から各種の組換えＴＸＮＤＣ５タンパクを純化する。

【0060】

必要なＴＸＮＤＣ５全体を含む上記断片を、調製した緩衝溶液の中で(２０mMのＰＢＳ,３００mM ＮａＣｌ, １０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ, ｐＨ７.５)に富化すると共に、更に溶解する。一定分量の純化されたＴＸＮＤＣ５タンパクを少量のサンプルに分けて－８０℃で保存するか、後続の測定を行うために処理を継続する。

【0061】

アプタマー滴定ＴＸＮＤＣ５の作用を測定するためのインスリン濁度アッセイを行う前に、Ｓｍｉｔｈ, Ａ.ｍ等の方法(Smith, A.m. et al. A high-throughput turbidometric assay for screening inhibitors of protein disulfide isomerase activity. J. Biomol. Screen. 9, 614-620, doi:10.1177/1087057104265292(2004))に基づいて、顕著な信号雑音比(signal-to-noise ratio,ＳＮＲ)を達成するように、インスリン濁度アッセイに用いられるＴＸＮＤＣ５のＴｒｘ１とＴｒｘ２、又はＴＸＮＤＣ５タンパク全体の最適な還元濃度を設ける。

【0062】

３８４ウェル盤(Greiner)の中で、総体積が３０μlである溶液(０.１６mMのインスリン(Sigma-Aldrich)及びレダクターゼが存在する)で測定を実施する。ＴＸＮＤＣ５タンパク全体(ヒト又はマウス)(３３、５.５、１及び０.０２μg/ml、図６Ａ)又はＴＸＮＤＣ５ペプチド(Ｔｒｘ１又はＴｒｘ２)(５.６、２.８、１.１２及び０.２８μM、図６Ｃ)の濃度を測定緩衝液(１００mMのリン酸及び０.２mMのＥＤＴＡ、ｐＨ７.０)の中で変更する。

【0063】

反応を開始させるために、５μlの３.５mM ＤＴＴ(最終濃度は０.５mMである)を加える。３７℃でＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ検体メーター(ＢｉｏＴｅｋ製)を使用して６５０nmの箇所で上記反応９０分間をモニターする。３７℃でＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸｍｕｌｔｉ－ｍｏdｅ検体メーター(ＢｉｏＴｅｋ)によって６５０nmの箇所で上記反応９０分間をモニターする。レダクターゼの最適な濃度を確認するために、ＯＤ_650nMの累積値及び遅延時間を示す。３倍又は６倍のＳＮＲを得るとき、後続のインスリン還元濁度測定に用いるために、レダクターゼの指示濃度を決定することができる。

【0064】

インスリン濁度アッセイに用いられるＴＸＮＤＣ５のＴｒｘ１とＴｒｘ２、又はＴＸＮＤＣ５タンパク全体の最適な還元濃度の測定結果は、図６Ａ－６Ｄに示す通りであり、高用量のＴＸＮＤＣ５(３３μg/ml)は、エンドポイント濁度で、５.５μg/ml、１μg/ml及び０.０２μg/mlのＴＸＮＤＣ５と比較して、それぞれ、およそ５％、２０％及び４０％の増加が見られた(図６Ａ)。異性化酵素還元反応は、用量増加とともに加速され、劇的な濁度が見られた。

【0065】

この異性化酵素還元反応は、ＴＸＮＤＣ５が最高量に達したとき、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)を加えた後１０分間で得られるものである。ＴＸＮＤＣ５による希釈用量を使用すると、インスリンの化学還元出発時間は２２５０秒以上(図６Ｂ)まで著しく遅延し、並びに、Ｔｒｘ１及びＴｒｘ２による希釈剤量を使用すると、インスリンの化学還元出発時間は３７００秒以上(図６Ｄ)まで著しく遅延する。

【0066】

個別のＴＸＮＤＣ５のドメインＴｒｘ１及びＴｒｘ２に関して、全長のＴＸＮＤＣ５タンパクと比較して、Ｔｒｘ１及びＴｒｘ２２つのドメインでは比較的長い反応時間及び比較的弱い動的反応(図６Ａ－６Ｄ)が示される。これは、ＴＸＮＤＣ５タンパク全体が用量増加により、還元反応が早く行われることにより、触媒されることができるためである(これにより、出発時間をより短くすることができる)(図６Ｂ及び図６Ｄ)。

【0067】

ＴＸＮＤＣ５の触媒機能により生成される、沈殿したインスリン鎖の形成を確認するために、ＴＸＮＤＣ５のＴｒｘ１とＴｒｘ２、又はＴＸＮＤＣ５タンパク全体を、それぞれ、過酸化水素(Ｈ₂Ｏ₂)又はタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ抑制剤１６Ｆ１６(５０μｍ)と共に反応させる。ＴＸＮＤＣ５のＴｒｘ１、Ｔｒｘ２、及びＴＸＮＤＣ５タンパク全体のレダクターゼ活性をインスリン還元アッセイで測定する。

【0068】

３８４ウェル盤(Ｇｒｅｉｎｅｒ)の中で、総体積が３０μlである溶液(最終濃度が０.１６mMであるインスリン(Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ)及びレダクターゼが存在する)で測定を行う。

【0069】

５.６μMのＴＸＮＤＣ５ペプチド(Ｔｒｘ１及びＴｒｘ２、図７Ａ)、０.０２μg/mlのＴＸＮＤＣ５タンパク全体(図７Ｂ)、又はそれぞれの細胞破片(野生型ＴＸＮＤＣ５又は触媒機能を失ったＴＸＮＤＣ５タンパク(ＡＡＡ)を有するヒト肝星細胞ＬＸ２、図７Ｃ)由来の１０μgのタンパクの濃度を、測定緩衝液(１００mMのリン酸及び０.２mMのＥＤＴＡ、ｐＨ７.０)の中で変更する。

【0070】

ＴＸＮＤＣ５の触媒機能により生成される沈殿したインスリン鎖の形成を更に確認するために、最終濃度が１２５mMである５μlの過酸化水素、又は最終濃度が５０mMである５μl １６Ｆ１６(タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ阻害剤)を２５μlのレダクターゼ/インスリン/測定緩衝液の混合物中に加える。

【0071】

反応を開始させるために、５μlの３.５mM ＤＴＴ(最終濃度は０.５mMである)を上記混合物中に加えて、３７℃でＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ検体メーター(ＢｉｏＴｅｋ製)によって６５０nm箇所で上記反応を９０分間モニターする。６５０nmでの吸光値(ＯＤ_650nm)において、３７℃で全体９０分間のうち５分間の増加が測定された。累積したＯＤ_650nmが酵素動的能力として表されている。

【0072】

ＬＸ２は、台湾国立台湾大学病院の蘇東弘(Ｔｕｎｇ－Ｈｕｎｇ Ｓｕ)医師から取得したものである。前記細胞株は、１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン/ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭの中に置かれ、かつ培養箱の中で培養され、前記培養箱は、３７℃で９５％のＯ₂及び５％のＣＯ₂の循環で良好に制御される。

【0073】

過酸化水素(Ｈ₂Ｏ₂)は、還元を減少させることによって、反応を中断させることができる。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ抑制剤１６Ｆ１６は、ＴＸＮＤＣ５の触媒活性を消滅させることができる。

【0074】

同時に、ＴＸＮＤＣ５の、触媒性ドメインを有する構造形態の影響を更に評価するために、肝細胞(ヒト肝星細胞ＬＸ２)が慢病毒形質導入システムによって発見された野生型ＴＸＮＤＣ５又は触媒機能を失ったＴＸＮＤＣ５タンパク(ＡＡＡ)に形質導入され、上記肝細胞の断片に動的還元測定を行う。動的還元測定は、上記インスリン還元アッセイを参考にして行う。

【0075】

ＬＸ２細胞株内過剰発現制御グループ（ｐＬＡＳ２ｗ.ｐＰｕｒｏ）、ヒト野生型ＴＸＮＤＣ５（ｐＬＡＳ２ｗ.ｐＰｕｒｏ－ＴＸＮＤＣ５）又は触媒機能を失ったＴＸＮＤＣ５タンパク(ｐＬＡＳ２ｗ.ｐＰｕｒｏ－ＴＸＮＤＣ５－ＡＡＡ)に用いるために、慢病毒形質導入システムを採用し、必要なタンパクの生産量を向上させるために、感染多重度(multiplicity of infection,ＭＯＩ)が１５であり、ポリブレン(Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ)(８μg/ml)を含む無血清ＤＭＥＭ培養基の中で培養感染させたＬＸ２細胞株を２４時間培養し、維持する。

【0076】

現有のＤＭＥＭ培養基を注意深く吸引すると共に、新鮮な培養基に交換した後、ピューロマイシン(０.５ng/ml)を使用して、手順を行うのに用いられる、形質導入された細胞を選択する。１倍の細胞分解緩衝液(Cell Signaling Technology、ＭＡ、米国)を使用して細胞を均質化し、上記細胞分解緩衝液の中にプロテアーゼ抑制剤混合物及びＨＡＬＴホスファターゼ(Thermo Fisher Scientific、ＭＡ、米国)を補充し、次に、上記方式によって処理した細胞を４℃で、１０,０００xgで１０分間遠心分離して、上清液を収集する。

【0077】

ＢＣＡタンパク質アッセイによってタンパクライセートの濃度を決定し、上記インスリン還元アッセイに用いるために、計１０μgであるそれぞれのタンパク質のサンプルをddＨ₂Ｏの中(最終体積は５μlである)で希釈する。

【0078】

ＴＸＮＤＣ５のＴｒｘ１及びＴｒｘ２と、又はＴＸＮＤＣ５タンパク全体とＨ₂Ｏ₂又は１６Ｆ１６との上記反応の測定結果は、図７Ａ－７Ｃにおいて示通りである。ＴＸＮＤＣ５タンパク全体及び単独のＴｒｘ１、Ｔｒｘ２ドメインとＨ₂Ｏ₂との動的反応は、完全かつ効率的に中止される(図７Ａ及び７Ｂ)。図７Ｂに示すように、エンドポイント動的吸光値の高原箇所は、１６Ｆ１６の増加に伴って、衰減する。これは、インスリンにおける交互鎖ジスルフィド結合の還元分裂に触媒能力が必要であることを証明している。

【0079】

図７Ｃに示すように、ＴＸＮＤＣ５を過剰に有する細胞は、比較的高いインスリン沈澱率を示した。しかし、このような加速反応は、触媒機能を失ったＴＸＮＤＣ５タンパクを含む細胞ライセート又はＨ₂Ｏ₂を加えた細胞ライセートにおいて、存在しない。

【0080】

ＴＸＮＤＣ５に対するアプタマー(アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１)の滴定効果を測定する手順を以下の通り説明する。

【0081】

(ステップ１)
アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１のそれぞれ(６０μl)を結合バッファー(２０μl)に別々に混合し、アプタマーと結合バッファーの混合物とを９５℃に５分間加熱して維持した後、４℃に急冷して二次構造を形成し、２５℃で３０分間維持する。

【0082】

(ステップ２)
４０μlの結合緩衝液を希釈剤として使用し、それぞれの受体混合物に半分ずつ連続希釈を行う。アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１のそれぞれを７.８１２５μM、１５.６２５μM、３１.２５μM、６２.５μM、１２５μM、２５０μM、５００μMと濃度を変えた各種希釈液として調製している。

【0083】

(ステップ３)
アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１の４０μlの各希釈液(それぞれ、７.８１２５μM、１５.６２５μM、３１.２５μM、６２.５μM、１２５μM、２５０μM及び５００μMと異なる濃度である)を５μlのヒト野生型ＴＸＮＤＣ５(０.４μlのヒト野生型ＴＸＮＤＣ５(３.１２５μg/ml)を５μlに希釈する)と共に振動させて、３０分間培養する。

【0084】

(ステップ４)
１.６mMのインスリン(インスリンを０.１ＮのＨＣｌの中に溶解させて、調製する)を、１００mMのリン酸及び０.２mMのＥＤＴＡ(ｐＨ７)からなる測定緩衝液に加えることによって、インスリン/測定緩衝液を調製する。それぞれのインスリン/測定緩衝液の体積は１５μlであり、インスリンの体積は６μlであって、測定緩衝液の体積は９μlである。

【0085】

(ステップ５)
異なる濃度のそれぞれのアプタマー(アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１)を有する上記混合物とヒト野生型ＴＸＮＤＣ５とを、それぞれ、対応するインスリン/測定緩衝液を加える。即ち、アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１については、それぞれ、７つの実験グループサンプル(７.８１２５μM、１５.６２５μM、３１.２５μM、６２.５μM、１２５μM、２５０μM及び５００μMと異なる濃度である)を有する。制御グループサンプルとして、上記アプタマーを加えなかった混合物及びヒト野生型ＴＸＮＤＣ５のインスリン/測定緩衝液を調製する。

【0086】

(ステップ６)
すべての実験グループサンプル及び制御グループのサンプルをそれぞれのウェルにつき３０μlの量で３８４ウェル盤の中に加える。その後、それぞれの実験グループサンプル及び制御グループサンプルの中に、反応を開始させるために、５μlの３.５mMのＤＴＴを加えて、素早く混合する。

【0087】

(ステップ７)
実験グループサンプル及び制御グループサンプルの酵素反応をＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ検体メーター(ＢｉｏＴｅｋ製)によって６５０nm箇所でモニターする。

【0088】

酵素反応の測定結果は、図８Ａ－図８Ｆに示される。また、あらゆる三種類のアプタマー(アプタマー－３、アプタマー－７及びアプタマー－１１)による活性を抑制する程度は、用量の増加に伴って増加し、アプタマー－３のＩＣ５０値は２１３.７μM(Ｄ)であり、アプタマー－７のＩＣ５０値は２４１.０μM(Ｂ)であり、アプタマー－１１のＩＣ５０値は２６３.２μM(Ｆ)である。これは、ＴＸＮＤＣ５を標的とするアプタマーがＴＸＮＤＣ５のジスルフィドイソメラーゼ活性を抑制できることを証明している。

【0089】

体外生物活性アッセイ
ＴＸＮＤＣ５を標的とするＤＮＡアプタマーの線維芽細胞に対する生物活性を判断するために、体外生物活性アッセイを以下の通り行う。

【0090】

まず、細胞培養盤の中で３Ｔ３細胞(ＡＴＣＣ,ＣＲＬ－１６５８)を培養する。細胞密度は、５,０００細胞/ｃｍ^２であり、続いて、３Ｔ３細胞を６,４００μlのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培養基(Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏdｉｆｉｅd Ｅａｇｌｅｍｅdｉｕｍ,ＤＭＥＭ)の中で懸濁する。

【0091】

ＤＭＥＭの中には１０％のウシ胎仔血清(fetal bovine serum,ＦＢＳ)が含まれ、３Ｔ３細胞を４つの８ウェル培養スライド(chamber slides)(iBidi,８０８４１)の各ウェルの中に接種し、各ウェルの中には２００μlの上記ＤＭＥＭ及び５,０００個細胞が含まれ、これらの８ウェル培養スライドを培養箱の中に３７℃で放置して、一晩置く。

【0092】

翌日に、各培養スライドのそれぞれのウェルの培養基を完全に吸収した後、１００μlのＦＢＳなしのＤＭＥＭ培養基を各培養スライドのそれぞれのウェルの中に加える。その後、これらの８ウェル培養スライドを培養箱の中に放置して、３時間維持する。これらの８ウェル培養スライドを培養箱の中に放置して、３７℃で３時間維持した後、そのうち３個８ウェル培養スライドのそれぞれのウェルの中にＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴを加える(蛍光タンパクＦＡＭとアプタマー７の５’末端とを綴合して、アプタマー７の３’末端をdＴ修飾する)。

【0093】

これらのＦＡＭ_ａｐｔ７_dが加えられた培養スライドを第一実験グループ、第二実験グループ及び第三実験グループとして指定する。ＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴが加えられなかった培養スライドを制御グループとして指定する。

【0094】

ＦＡＭ_ａｐｔ７_dが第一実験グループに６時間後に、第一実験グループの中のそれぞれのウェルの培養基を完全に吸収すると共に、ＰＢＳで第一実験グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続することによって、その中における細胞破片を洗浄し出す。３Ｔ３細胞を洗浄された第一実験グループのそれぞれのウェルの中に固着するために、洗浄された第一実験グループのそれぞれのウェルの中に、４％のパラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)を、加えて１５分間維持する。

【0095】

第一実験グループの中に４％のパラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)を加えて、１５分間維持した後、ＰＢＳで第一実験グループのそれぞれのウェルを洗浄して、５分間持続し、３回繰り返すと共に、十倍希釈された透過緩衝液(permeabilization buffer)(Ａｂｃａｍ社製,ａｂ２１９８０１)を洗浄された第一実験グループのそれぞれのウェルの中に加えて、２０分間維持する。

【0096】

十倍希釈された透過緩衝液を第一実験グループのそれぞれのウェルの中に加えて、２０分間維持した後、ＰＢＳで第一実験グループのそれぞれのウェルを洗浄し、５分間持続して、３回繰り返すと共に、２００μl/ウェルの５％ウシ胎仔血清アルブミン(BioFroxx)ブロッキング緩衝液(blocking buffer)を洗浄された第一実験グループのそれぞれのウェルの中に加えて、室温で１時間維持する。

【0097】

２００μl/ウェルの５％ウシ胎仔血清アルブミン(BioFroxx)ブロッキング緩衝液(blocking buffer)を第一実験グループのそれぞれのウェルの中に加えて、室温で１時間維持した後、ＰＢＳで第一実験グループのそれぞれのウェルを洗浄し、５分間持続し、３回繰り返すと共に、一級抗体、即ち、ＴＸＮＤＣ５多株抗体(Proteintech,１９８３４－１－ＡＰ)(ブロッキング緩衝液で１:１００希釈倍数の希釈を行い)を洗浄された第一実験グループのそれぞれのウェルの中(ＴＸＮＤＣ５多株抗体の最終濃度は６.５μg/mlである)に加えて、４℃で一晩置く。

【0098】

ＴＸＮＤＣ５多株抗体を第一実験グループの中に加えて、一晩置いた後、ＰＢＳで第一実験グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返すと共に、二級抗体(ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５５５)(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製,Ａ－３１５７２)(ブロッキング緩衝液で１:５００希釈倍数の希釈を行う)を洗浄された第一実験グループのそれぞれのウェルの中(二級抗体の最終濃度は４μg/mlである)に加えて、室温で２時間維持する。これにより、第一実験グループにおけるＴＸＮＤＣ５を表記した。

【0099】

二級抗体を第一実験グループの中に加えて２時間維持した後、ＰＢＳで第一実験グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返し、更に、洗浄された第一実験グループのそれぞれのウェルにおける余剰液を取り除く。第一実験グループの余剰液を取り除いた後、４’,６－ジアミジノ－２－フェニルインドール(4’,6-diamidino-2-phenylindole,ＤＡＰＩ)を含む封入剤(mountingmedium)(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製,０１００－２０)を使用して、第一実験グループにおける３Ｔ３細胞の細胞核を標記する。

【0100】

染色済みの３Ｔ３細胞の影像は、蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ Ｍ７０００(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)によってキャプチャーされる。

【0101】

第二実験グループ、第三実験グループ及び制御グループに対しては、上記第一実験グループと同一の手順を繰り返す。第一実験グループ、第二実験グループ、第三実験グループ及び制御グループとの間で唯一異なる実験条件は、ＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴが第一実験グループ、第二実験グループ又は第三実験グループに加われた反応時間であり、ＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴを第二実験グループに加えて２４時間維持し、ＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴを第三実験グループに加えて４８時間維持し、かつＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴを制御グループに加えなかった。

【0102】

体外生物活性アッセイの測定結果は、図９Ａ－図９Ｄに示される。ＦＡＭ′を表記したＤＮＡアプタマー(緑色)は、６時間後から３Ｔ３細胞に取り込まれ、ＴＸＮＤＣ５と同一の区域にあると共に、４８時間目に細胞質において検出可能な状態を維持できる。図９Ａ－図９Ｄの測定結果は、これらＤＮＡアプタマーは自由に線維芽細胞に取り込まれると共に、ＴＸＮＤＣ５と交互に作用することを示している。同時に、これらＤＮＡアプタマーの細胞内の安定性は、少なくとも４８時間維持できる。

【0103】

上記測定結果は、ＤＮＡアプタマーがＴＸＮＤＣ５と直接相互に作用して、いかなる補助剤を必要としないことを示唆している。

【0104】

抗線維化作用アッセイ
ＴＸＮＤＣ５を標的とするＤＮＡアプタマーの線維芽細胞の中の抗線維化作用を判断するために、抗線維化作用のアッセイを以下の通り行う。

【0105】

まず、細胞培養盤の中で３Ｔ３細胞(ＡＴＣＣ,ＣＲＬ－１６５８)を培養する。細胞密度は５,０００細胞/cm²であり、続いて、３Ｔ３細胞を３,２００μlのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ 培養基(ＤＭＥＭ)の中で懸濁し、ＤＭＥＭの中には１０％のウシ胎仔血清(ＦＢＳ)が含まれ、３Ｔ３細胞を２つの８ウェル培養スライド(ｉＢｉdｉ,８０８４１)の各ウェルの中に接種し、各ウェルの中に２００μlの上記ＤＭＥＭ及び５,０００個細胞が含まれ、これらの８ウェル培養スライドを培養箱の中に放置して３７℃で一晩置く。

【0106】

１つの培養スライドを２４時間グループに指定し、２４時間グループのそれぞれ２つのウェルを単位とし、それぞれを、第一実験グループ、第二実験グループ、第三実験グループ及び制御グループに指定する。もう１つの培養スライドを４８時間グループに指定し、２４時間グループと同様に、４８時間グループも第一実験グループ、第二実験グループ、第三実験グループ及び制御グループを有している。

【0107】

翌日に、２４時間グループ及び４８時間グループのそれぞれのウェルにおける培養基を完全に吸収した後、５０μlのＦＢＳなしのＤＭＥＭ培養基を２４時間グループ及び４８時間グループのそれぞれのウェルの中に加えた。その後、２４時間グループ及び４８時間グループを培養箱の中に放置して３７℃で３時間維持する。

【0108】

２４時間グループ及び４８時間グループを培養箱の中に放置して３７℃で３時間維持した後、２４時間グループ及び４８時間グループの第一実験グループのそれぞれのウェルの中にＴＧＦβ(最終濃度は１０μg/mlである)を加えた。また、２４時間グループ及び４８時間グループの第二実験グループのそれぞれのウェルの中にＴＧＦβ(最終濃度は１０μg/mlである)及び非標的アプタマー(Ｓｐｔ_dＴ)(最終濃度は５μg/mlである)を共に加えた。

【0109】

また、２４時間グループ及び４８時間グループの第三実験グループのそれぞれのウェルの中にＴＧＦβ(最終濃度は１０μg/mlである)及び上記ＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴ(最終濃度は５μg/mlである)を共に加えた。２４時間グループ及び４８時間グループの制御グループのそれぞれのウェルの中には、いかなる物も加えなかった。

【0110】

２４時間グループ及び４８時間グループの第一実験グループ、第二実験グループ、第三実験グループ及び制御グループに対して上述通りの処理を２４時間行った後、２４時間グループのそれぞれのウェルを完全に吸収すると共に、ＰＢＳで２４時間グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、その細胞破片を洗浄し出す。洗浄された２４時間グループのそれぞれのウェルの中に４％のパラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)を加えて、１５分間維持し、３Ｔ３細胞を洗浄された２４時間グループのそれぞれのウェルの中に固着する。

【0111】

４％のＰＦＡを２４時間グループの中に加えて１５分間維持した後、ＰＢＳで２４時間グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返すと共に、十倍希釈した透過緩衝液(Ａｂｃａｍ社製,ａｂ２１９８０１)を洗浄された２４時間グループのそれぞれのウェルの中に加えて２０分間維持した。

【0112】

十倍希釈された透過緩衝液を２４時間グループの中に加えて２０分間維持した後、ＰＢＳで２４時間グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返すと共に、２００μl/ウェルの５％ウシ胎仔血清アルブミン(BioFroxx)ブロッキング緩衝液を洗浄された２４時間グループのそれぞれのウェルの中に加えて室温で１時間維持する。

【0113】

２００μl/ウェルの５％ウシ胎仔血清アルブミン(BioFroxx)ブロッキング緩衝液を２４時間グループの中に加えて１時間維持した後、ＰＢＳで２４時間グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返すと共に、一級抗体、即ちα平滑筋アクチン(αＳＭＡ)多株抗体(Ａｂｃａｍ社製,ａｂ５６９４)(ブロッキング緩衝液の１:１００希釈倍数で希釈を行う)を洗浄された２４時間グループのそれぞれのウェルの中(αＳＭＡ多株抗体の最終濃度は２μg/mlである)に加えて４℃で一晩置く。

【0114】

αＳＭＡ多株抗体を２４時間グループの中に加えて一晩置いた後、ＰＢＳで２４時間グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返すと共に、二級抗体(ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５５５)(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製,Ａ－３１５７２)(ブロッキング緩衝液の１:５００希釈倍数で希釈を行う)を洗浄された２４時間グループのそれぞれのウェルの中(二級抗体の最終濃度は４μg/mlである)に加えて室温で２時間維持する。これにより、２４時間グループにおけるαＳＭＡを標記する。

【0115】

二級抗体を２４時間グループの中に加えて２時間維持した後、ＰＢＳで２４時間グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返し、更に洗浄された２４時間グループのそれぞれのウェルにおける余剰液(主な液体はＰＢＳである)を取り除く。２４時間グループにおける余剰液を取り除いた後、ＤＡＰＩを含む封入剤(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製,０１００－２０)を使用して、２４時間グループにおける３Ｔ３細胞の細胞核を標記する。

【0116】

２４時間グループにおける染色済みの３Ｔ３細胞の影像は、蛍光顕微鏡ＥＶＯＳｍ７０００(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)によってキャプチャーされる。

【0117】

上記２４時間グループの中の抗線維化作用アッセイを３回繰り返す。

【0118】

４８時間グループについては、上記２４時間グループと同一の手順を繰り返す。２４時間グループと４８時間グループとの間で唯一異なる実験条件は、ＴＧＦβ、ＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴ、Ｓｐｔ_dＴ又はその組み合わせが２４時間グループと４８時間グループに加わった反応時間である。２４時間グループの反応時間は２４時間であり、４８時間グループの反応時間は４８時間である。

【0119】

抗線維化作用アッセイの測定結果は、図１０Ａ及び１０Ｂに示す通りである。図１０Ａは、アプタマー７がαＳＭＡの発現を抑制することを示す。αＳＭＡは、ＴＧＦβで刺激処理された３Ｔ３線維芽細胞における線維芽細胞活化及び肌線維芽細胞分化転換(transdifferentiation)の標記である。

【0120】

制御グループと比較して、第一実験グループ(ＴＧＦβのみのグループ)及び第二実験グループ(Ｓｐｔ_dＴのグループ)は、３Ｔ３細胞において２４時間目及び４８時間目でαＳＭＡが顕著に発見されたが、第三実験グループ(ＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴのグループ)は、３Ｔ３細胞において２４時間目及び４８時間目でαＳＭＡが顕著に抑制される。

【0121】

図１０Ｂは、第一実験グループ、第二実験グループ及び第三実験グループのαＳＭＡ発現率を示し、図１０Ｂにおける符号「ｎｓ」は、データに顕著な差異がないことを意味し、図１０Ｂにおける星マークはＰ値を意味する(＊:Ｐ＜０.０５,＊＊:Ｐ＜０.０１)。

【0122】

ＴＸＮＤＣ５を標的とするＤＮＡアプタマー(ＦＡＭ_ａｐｔ７_dＴ)で処理すると、３Ｔ３細胞のＴＧＦβ刺激に対するαＳＭＡの発現が２４時間及び４８時間のいずれにおいても顕著に抑制されたが、非標的アダプター(Ｓｐｔ_dＴ)の処理ではこの発見はなかった。

【0123】

細胞内ウエスタンブロッティングアッセイ
ＴＸＮＤＣ５を標的とするＤＮＡアプタマーのフィブロネクチン(fibronectin)に対する細胞発現量の抑制作用を判断するために、細胞内ウエスタンブロッティングアッセイを以下の通り行う。

【0124】

まず、細胞培養盤の中で３Ｔ３細胞(ＡＴＣＣ,ＣＲＬ－１６５８)を培養する。細胞密度は５,０００細胞/cm²であり、続いて、３Ｔ３細胞を４,８００μlのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培養基(ＤＭＥＭ)の中に懸濁し、ＤＭＥＭの中には１０％のウシ胎仔血清(ＦＢＳ)が含まれ、３Ｔ３細胞を９６ウェル盤の６４ウェルの中に接種し、それぞれのウェルの中には１００μlの上記ＤＭＥＭ及び１,６００個細胞が含まれ、上記９６ウェル盤を培養箱の中に放置して、３７℃で一晩置く。

【0125】

同時に、現在の細胞内ウエスタンブロッティングアッセイに用いるアプタマーを製造する。アプタマーの製備手順は、以下の通りである。１５.７５μlのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴ基料(１００μM)、１μlのＴｒｉｓ－Ｃｌ(４００mM)、２μlのＮａＣｌ(１.５μM)、１μlのＫＣｌ(１μM)、０.０４μlのＭｇＣｌ₂₍１μM)、０.２μlのＣａＣｌ₂(１００mM)及び０.０１μlのＴｗｅｅｎ－２０を混合する。

【0126】

上記混合物の最終体積は、２０μlであり、かつ上記混合物におけるＦＡＭ_ａｐｔ_dＴ濃度は７８.７５μMである。続いて、上記混合物を９５℃に加熱して５分間維持する。上記混合物を９５℃に加熱して５分間維持した後、上記混合物を４℃に冷却して３０秒維持し、その後２５℃で放置して３０分間維持し、アプタマーフォールディングを生じさせる。

【0127】

上記手順に基づいて、濃度が７８.７５μMであるＦＡＭ_ａｐｔ_dＴ基料を調製する。濃度の異なるＦＡＭ_ａｐｔ_dＴ溶液を得るために、７０μlのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴ基料(７８.７５μM)と７０μlの結合緩衝液とを混ぜて、濃度が３９.３７５μMであるＦＡＭ_ａｐｔ_dＴ溶液を調製し、続いて、濃度が３９.３７５μMのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴ溶液を前記手段で順次希釈し、１９.６８μM、９.８４μM、４.９２μM、２.４６μM、１.２３μMの濃度であるＦＡＭ_ａｐｔ_dＴ溶液を別々に調製する。

【0128】

翌日に、上記９６ウェル盤の６４ウェルの培養基を完全に吸収した後、５０μlのＦＢＳなしのＤＭＥＭ培養基を上記６４ウェルのそれぞれのウェルの中に加える。その後、上記９６ウェル盤を培養箱の中に放置して、３７℃で３時間維持する。上記９６ウェル盤を培養箱の中に放置して、３７℃で３時間維持した後、異なる条件で上記９６ウェル盤の６４ウェルを処理する。

【0129】

上記９６ウェル盤における３２ウェルを制御グループに指定し、制御グループの３Ｔ３細胞はＴＧＦβで処理しない。上記９６ウェル盤における他の３２ウェルを実験グループに指定し、実験グループの３Ｔ３細胞を１０μg/mlのＴＧＦβで処理する。実験グループ及び制御グループの両者(５０μlのＦＢＳなしを含むＤＭＥＭ培養基)を、ＦＡＭ_ａｐｔ_dＴで以下の通り処理する。

【0130】

濃度が７８.７５μMである７０μlのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴを実験グループ/制御グループの第一バッチの四個ウェルのそれぞれに加え(ＦＡＭ_ａｐｔ_dＴの最終濃度は２０μMである)、濃度が３９.３７５μMである７０μlのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴを実験グループ/制御グループの第二バッチの四個ウェルのそれぞれに加え(ＦＡＭ_ａｐｔ_dＴの最終濃度は１０μMである)、濃度が１９.６８μMである７０μlのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴを実験グループ/制御グループの第三バッチの四個ウェルのそれぞれに加え(ＦＡＭ_ａｐｔ_dＴの最終濃度は５μMである)、濃度が９.８４μMである７０μlのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴを実験グループ/制御グループの第四バッチの四個ウェルのそれぞれに加え(ＦＡＭ_ａｐｔ_dＴの最終濃度は２.５μMである)、濃度が４.９２μMである７０μlのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴを実験グループ/制御グループの第五バッチの四個ウェルのそれぞれに加え(ＦＡＭ_ａｐｔ_dＴの最終濃度は１.２５μMである)、濃度が２.４６μMである７０μlのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴを実験グループ/制御グループの第六バッチの四個ウェルのそれぞれに加え(ＦＡＭ_ａｐｔ_dＴの最終濃度は０.６２５μMである)、濃度が１.２３μMである７０μlのＦＡＭ_ａｐｔ_dＴを実験グループ/制御グループの第七バッチの四個ウェルのそれぞれに加え(ＦＡＭ_ａｐｔ_dＴの最終濃度は０.３１２５μMである)、実験グループ/制御グループの第八バッチの四個ウェルのそれぞれにＦＡＭ_ａｐｔ_dＴは加えない。

【0131】

実験グループ/制御グループが上記処理を経た後、実験グループ及び制御グループを培養箱の中に放置して３７℃で７２時間維持する。

【0132】

実験グループ及び制御グループを培養箱の中に放置して７２時間維持した後、実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルにおける培養基を完全に吸収すると共に、ＰＢＳで実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返して、その細胞破片を洗浄し出す。その後、４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)を洗浄された実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルの中に加えて２０分間維持し、３Ｔ３細胞を洗浄された実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルの中に固着する。

【0133】

４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)を実験グループ及び制御グループの中に加えて２０分間維持した後、ＰＢＳで実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返すと共に、十倍希釈した透過緩衝液(Ａｂｃａｍ社製, ａｂ２１９８０１)を洗浄された実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルの中に加えて２０分間維持した。

【0134】

十倍希釈された透過緩衝液を実験グループ及び制御グループの中に加えて２０分間維持した後、ＰＢＳで実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返すと共に、１５０μl/ウェルのＬＩ－ＣＯＲブロッキング緩衝液を実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルの中に加えて室温で１時間維持する。

【0135】

１５０μl/ウェルのＬＩ－ＣＯＲブロッキング緩衝液を実験グループ及び制御グループの中に加えて１時間維持した後、ＰＢＳで実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返すと共に、一級抗体、即ち、フィブロネクチンモノクローナル抗体(ＢＤ Biosciences,６１００７７)(ＬＩ－ＣＯＲブロッキング緩衝液で１:１００希釈倍数の希釈を行う)を実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルの中(フィブロネクチンモノクローナル抗体の最終濃度は２.５μg/mlである)に加えて４℃で一晩置く。

【0136】

フィブロネクチンモノクローナル抗体を実験グループ及び制御グループの中に加えて一晩置いた後、ＰＢＳで実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルを洗浄して５分間持続し、３回繰り返す。その後、二級抗体(ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ)(ＬＩ－ＣＯＲブロッキング緩衝液で１:１０００希釈倍数の希釈を行う)とＣｅｌｌｔａｇ ７００(ＬＩ－ＣＯＲブロッキング緩衝液で１:５００希釈倍数の希釈を行う)を共に実験グループ及び制御グループのそれぞれのウェルの中(二級抗体の最終濃度が１μg/ml、Ｃｅｌｌｔａｇ ７００の最終濃度が０.２μg/ml)に加えて室温で２時間維持する。

【0137】

これにより、実験グループ及び制御グループにおけるフィブロネクチン及び３Ｔ３細胞の数量を検出する。Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ紅外線成像システムによって、実験グループ及び制御グループのスキャン及び分析を行う。実験グループ及び制御グループのＩＣ_５０をＰｒｉｓｍによって計算する。

【0138】

細胞内ウエスタンブロッティングアッセイの測定結果は、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す通りである。図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＴＸＮＤＣ５を標的とするＤＮＡアプタマーのフィブロネクチンの細胞発現量に対する強烈な抑制作用を示す。フィブロネクチンは、繊維生成過程における重要なＥＣＭタンパクである。図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＴＧＦβ刺激なし(ＩＣ₅₀ ５.３８９μM)又はＴＧＦβ刺激有り(ＩＣ₅₀ ４.１２μM)を示す。

【0139】

上述の通り、ＴＸＮＤＣ５を標的とするアプタマーは、ＴＸＮＤＣ５タンパクと結合すると共に、ＴＸＮＤＣ５の触媒能力を抑制することができる。先行技術は、ＴＸＮＤＣ５を標的とすることが有効な治療方法であり、器官線維化(例えば心臓線維化、肝線維化、肺線維化及び腎線維化)、心不全及び慢性腎臓疾患を予防又は治療できることを既に証明している。

【0140】

活性成分としてＴＸＮＤＣ５を標的とするアプタマーを含む医薬組成物を利用して、器官線維化、心不全及び慢性腎臓疾患の予防又は治療を行うことができる。上記医薬組成物は、例えば、生理食塩水、ナノ粒子、又はいかなる既知のアプタマーに適するベクターなど、薬学上受け入れられているベクターを含んでもよい。

【0141】

同時に、器官線維化の予防又は治療に用いられる方法を提供し、前記方法は、有効な投与量のＴＸＮＤＣ５を標的とするアプタマーを、必要とする対象に投与することを含む。

【0142】

具体的な実施例を通じて本出願の開示内容を説明したが、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は特許請求の範囲にて説明した本出願の開示内容の範囲及び要旨を逸脱しない状況で、具体的な実施例に対して様々な修正及び変更を行うことができる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【配列表】

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