▶ オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023145597
(43)【公開日】2023-10-11
(54)【発明の名称】ＲＮＡを編集するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20231003BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231003BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20231003BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231003BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20231003BHJP
A61K 48/00 20060101ALN20231003BHJP
A61K 38/46 20060101ALN20231003BHJP
A61K 31/7105 20060101ALN20231003BHJP
A61P 25/00 20060101ALN20231003BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/11 Z
C12N5/10
C12N15/55
A61K48/00
A61K38/46
A61K31/7105
A61P25/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023121336
(22)【出願日】2023-07-26
(62)【分割の表示】P 2020519046の分割
【原出願日】2018-10-09
(31)【優先権主張番号】62/569,376
(32)【優先日】2017-10-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】512208051
【氏名又は名称】オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】マンデル，ゲイル
(72)【発明者】
【氏名】アデルマン，ジョン・ピー
(72)【発明者】
【氏名】シナモン，ジョン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細胞内、特に細胞の核内の内因性ＲＮＡの配列を編集する方法を提供する。
【解決手段】細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、およびｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を、前記細胞に送達するステップを含み、前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み、前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法である。
【選択図】図１－１
【解決手段】細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、およびｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を、前記細胞に送達するステップを含み、前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み、前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法である。
【選択図】図１－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードす
る核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記細胞に送達するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み
、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集
されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードす
る核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記細胞に送達するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み
、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集
されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
【請求項2】
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＲＮＡ編集酵素がデアミナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である
、請求項１に記載の方法。
、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、これらの断片、およびこれらの変異体からな
る群から選択される、請求項４に記載の方法。
る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項５に記載
の方法。
の方法。
【請求項7】
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、請求項１から６のい
ずれか一項に記載の方法。
ずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、請求
項７に記載の方法。
項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記内因性ＲＮＡが中枢神経系細胞で発現されるＲＮＡである、請求項１から９のいず
れか一項に記載の方法。
れか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、請求
項１０に記載の方法。
項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミ
スマッチをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
スマッチをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体で
ある、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
ある、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしく
は欠失を有する配列番号４７を含む、請求項１３に記載の方法。
は欠失を有する配列番号４７を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結
合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデ
アミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前
記配列がＢｏｘＢ配列である、請求項１に記載の方法。
合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデ
アミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前
記配列がＢｏｘＢ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、請求項１から１５のいず
れか一項に記載の方法。
れか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１７に記載の方
法。
法。
【請求項19】
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、ガイドＲＮＡをコードする
核酸分子を前記細胞に送達するステップを含み、
前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ
）によって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集
されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
核酸分子を前記細胞に送達するステップを含み、
前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ
）によって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集
されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
【請求項20】
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項２１に記
載の方法。
載の方法。
【請求項23】
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、請求
項１９に記載の方法。
項１９に記載の方法。
【請求項24】
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミ
スマッチをさらに含む、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
スマッチをさらに含む、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、請求項１９から２４のいずれか一
項に記載の方法。
項に記載の方法。
【請求項26】
前記内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、請
求項１９から２５のいずれか一項記載の方法。
求項１９から２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項27】
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルお
よび／または機能を変化させる、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
よび／または機能を変化させる、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、請求項１９から２７のいずれか一項に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項29】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項２８に記載の方
法。
法。
【請求項30】
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードす
る核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記対象に投与するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み
、
前記ＲＮＡ編集酵素は、前記中枢神経系の遺伝性疾患に関連するミスマッチ突然変異を
修正する、方法。
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードす
る核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記対象に投与するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み
、
前記ＲＮＡ編集酵素は、前記中枢神経系の遺伝性疾患に関連するミスマッチ突然変異を
修正する、方法。
【請求項31】
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハ
イブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを
含む、請求項３１に記載の方法。
イブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを
含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、請求項３０から３２のいずれか一項に記載
の方法。
の方法。
【請求項34】
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である
、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびこれらの断片または変異体から選択され
る、請求項３４に記載の方法。
る、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項３５に記
載の方法。
載の方法。
【請求項37】
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、請求項３０から３６
のいずれか一項に記載の方法。
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、請求
項３７に記載の方法。
項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、
請求項３０から３８のいずれか一項に記載の方法。
請求項３０から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体で
ある、請求項３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
ある、請求項３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしく
は欠失を有する配列番号４７を含む、請求項４０に記載の方法。
は欠失を有する配列番号４７を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結
合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデ
アミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前
記配列がＢｏｘＢ配列である、請求項３０に記載の方法。
合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデ
アミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前
記配列がＢｏｘＢ配列である、請求項３０に記載の方法。
【請求項43】
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、請求項３０から４２のい
ずれか一項に記載の方法。
ずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項４４に記載の方
法。
法。
【請求項46】
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、ガ
イドＲＮＡをコードする核酸分子を前記対象に投与するステップを含み、前記ガイドＲＮ
Ａは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的
に認識される配列を含む、方法。
イドＲＮＡをコードする核酸分子を前記対象に投与するステップを含み、前記ガイドＲＮ
Ａは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的
に認識される配列を含む、方法。
【請求項47】
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハ
イブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを
含む、請求項４７に記載の方法。
イブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを
含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、請求項４６から４８のいずれか一項に記載
の方法。
の方法。
【請求項50】
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１もしくはＡＤＡＲ２またはこれらの変異体である、請求項４
６から４９のいずれか一項に記載の方法。
６から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項５０に記
載の方法。
載の方法。
【請求項52】
内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、請求項４６から５１のいずれか一項に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項53】
内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、請求項
４６から５２のいずれか一項記載の方法。
４６から５２のいずれか一項記載の方法。
【請求項54】
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルお
よび／または機能を変化させる、請求項４６から５３のいずれか一項に記載の方法。
よび／または機能を変化させる、請求項４６から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、請求項４６から５４のいずれか一項に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項56】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項５５に記載の方
法。
法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１７年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５６９３７６号
に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。前記出願は
、参照により本明細書に組み込まれる。
に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。前記出願は
、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＮＳ０８７７２６の下で政府
支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【0003】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
これと共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体が参照により本明細書
に組み込まれる：配列表のコンピュータ読取可能な形式のコピー（ファイル名：ＳＥＱＬ
ＩＳＴ．ｔｘｔ；データ記録日：２０１８年１０月９日；ファイルサイズ：４４．６ＫＢ
）。
これと共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体が参照により本明細書
に組み込まれる：配列表のコンピュータ読取可能な形式のコピー（ファイル名：ＳＥＱＬ
ＩＳＴ．ｔｘｔ；データ記録日：２０１８年１０月９日；ファイルサイズ：４４．６ＫＢ
）。
【0004】
本発明は、核酸編集の分野に関する。具体的には、ＲＮＡ、特に核内の内因性ＲＮＡを
治療的に編集するための組成物および方法が開示される。
治療的に編集するための組成物および方法が開示される。
【背景技術】
【0005】
本発明が属する分野の先行技術を説明するために、本明細書全体を通していくつかの刊
行物および特許文書が引用されている。これらの引用の各々は、完全に示されているかの
ように、参照により本明細書に組み込まれる。
行物および特許文書が引用されている。これらの引用の各々は、完全に示されているかの
ように、参照により本明細書に組み込まれる。
【0006】
遺伝物質を編集または改変する戦略、例えば、種々の遺伝子編集技術で進歩が見られる
。しかしながら、特に神経系において、疾患の原因となる突然変異を修正する方法論の必
要性が残っている。
。しかしながら、特に神経系において、疾患の原因となる突然変異を修正する方法論の必
要性が残っている。
【0007】
レット症候群は、転写因子メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）の散発的突然
変異によって引き起こされる神経発達障害である（Ａｍｉｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）
Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２３：１８５－１８８）。ＭＥＣＰ２はＸ染色体上に位置する。
哺乳動物における遺伝子量補償（ｄｏｓａｇｅ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）機序のため
、レット症候群に罹患した女性はモザイクであり、野生型細胞と突然変異型細胞との間で
およそ５０：５０に分かれる。ＭＥＣＰ２突然変異を有する女性は、発話および意図的な
手の動きなどの初期の発達上のマイルストーンの後退を経験し、次いで、呼吸を含む重度
の運動異常を獲得し、平均で４０歳までに死亡する（Ｎｅｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（２０１
０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９４４－９５０；Ｐｅｒｃｙ，ｅｔ ａｌ．（２０
１０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９５１－９５５）。ＭＥＣＰ２に突然変異を有し
、Ｘ染色体が１つしかない男性は、なおさらに深刻な疾患を発症し、通常２歳未満で死亡
する（Ｓｃｈｕｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，７４：１１６
－１２６）。レット症候群の治療法はない。
変異によって引き起こされる神経発達障害である（Ａｍｉｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）
Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２３：１８５－１８８）。ＭＥＣＰ２はＸ染色体上に位置する。
哺乳動物における遺伝子量補償（ｄｏｓａｇｅ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）機序のため
、レット症候群に罹患した女性はモザイクであり、野生型細胞と突然変異型細胞との間で
およそ５０：５０に分かれる。ＭＥＣＰ２突然変異を有する女性は、発話および意図的な
手の動きなどの初期の発達上のマイルストーンの後退を経験し、次いで、呼吸を含む重度
の運動異常を獲得し、平均で４０歳までに死亡する（Ｎｅｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（２０１
０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９４４－９５０；Ｐｅｒｃｙ，ｅｔ ａｌ．（２０
１０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９５１－９５５）。ＭＥＣＰ２に突然変異を有し
、Ｘ染色体が１つしかない男性は、なおさらに深刻な疾患を発症し、通常２歳未満で死亡
する（Ｓｃｈｕｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，７４：１１６
－１２６）。レット症候群の治療法はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ａｍｉｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２３：１８５－１８８
【非特許文献2】Ｎｅｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９４４－９５０
【非特許文献3】Ｐｅｒｃｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９５１－９５５
【非特許文献4】Ｓｃｈｕｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，７４：１１６－１２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の一態様によると、細胞内、特に細胞の核内の内因性ＲＮＡの配列を編集する方
法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、ｉ）核局在化シグナルと、ＲＮＡ結合
ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素とを含む融合タンパク質をコードする核酸分子、お
よびｉｉ）１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸分子を細胞に送達するステッ
プを含む。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含む
。ガイドＲＮＡはまた、内因性ＲＮＡ中の標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集さ
れるヌクレオチドでミスマッチを含む。一定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡ
に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、例えばＡＤＲＡＲ１またはＡＤＡＲ２
である。一定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドであり、ＲＮＡ結合ド
メインによって特異的に認識される配列がＢｏｘＢ配列である。一定の実施形態では、内
因性ＲＮＡが、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである。一定の実施
形態では、核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルである。これら
の方法の核酸分子は、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクタ
ー）などの単一のベクター内に含まれていてもよい。
法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、ｉ）核局在化シグナルと、ＲＮＡ結合
ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素とを含む融合タンパク質をコードする核酸分子、お
よびｉｉ）１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸分子を細胞に送達するステッ
プを含む。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含む
。ガイドＲＮＡはまた、内因性ＲＮＡ中の標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集さ
れるヌクレオチドでミスマッチを含む。一定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡ
に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、例えばＡＤＲＡＲ１またはＡＤＡＲ２
である。一定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドであり、ＲＮＡ結合ド
メインによって特異的に認識される配列がＢｏｘＢ配列である。一定の実施形態では、内
因性ＲＮＡが、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである。一定の実施
形態では、核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルである。これら
の方法の核酸分子は、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクタ
ー）などの単一のベクター内に含まれていてもよい。
【0010】
本発明の別の態様によると、細胞内、特に細胞の核内の内因性ＲＮＡの配列を編集する
追加の方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、１つまたは複数のガイドＲＮ
Ａをコードする核酸分子を細胞に送達するステップを含み、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡに作
用するヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などの内因性デアミナーゼによって特異
的に認識される（１又は複数の）配列および／または構造を含む。ガイドＲＮＡはまた、
内因性ＲＮＡ中の標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミス
マッチを含む。一定の実施形態では、ＡＤＡＲがＡＤＲＡ１またはＡＤＡＲ２である。一
定の実施形態では、内因性ＲＮＡが、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮ
Ａである。一定の実施形態では、核酸分子が、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクタ
ー）内に含まれる。
追加の方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、１つまたは複数のガイドＲＮ
Ａをコードする核酸分子を細胞に送達するステップを含み、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡに作
用するヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などの内因性デアミナーゼによって特異
的に認識される（１又は複数の）配列および／または構造を含む。ガイドＲＮＡはまた、
内因性ＲＮＡ中の標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミス
マッチを含む。一定の実施形態では、ＡＤＡＲがＡＤＲＡ１またはＡＤＡＲ２である。一
定の実施形態では、内因性ＲＮＡが、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮ
Ａである。一定の実施形態では、核酸分子が、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクタ
ー）内に含まれる。
【0011】
本発明の別の態様によると、細胞内、特に細胞の核内の内因性ＲＮＡの配列を編集する
追加の方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、ガイドＲＮＡをコードする核
酸分子（例えば、ＡＡＶ内）を細胞に送達するステップを含み、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡ
に作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的に認識される
（１又は複数の）配列および／または構造を含む。したがって、種々の態様では、本編集
する方法を、組換えＲＮＡ編集酵素の非存在下で（例えば、組換えＡＤＡＲの非存在下で
）行うことができる。よって、実施形態では、本方法が、本明細書に記載される編集に影
響を及ぼすための内因性ＡＤＡＲ活性を請け負う。
追加の方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、ガイドＲＮＡをコードする核
酸分子（例えば、ＡＡＶ内）を細胞に送達するステップを含み、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡ
に作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的に認識される
（１又は複数の）配列および／または構造を含む。したがって、種々の態様では、本編集
する方法を、組換えＲＮＡ編集酵素の非存在下で（例えば、組換えＡＤＡＲの非存在下で
）行うことができる。よって、実施形態では、本方法が、本明細書に記載される編集に影
響を及ぼすための内因性ＡＤＡＲ活性を請け負う。
【0012】
本発明の別の態様によると、対象のレット症候群を処置、抑制および／または予防する
方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、本発明のＲＮＡ編集法を使用するス
テップを含む。例えば、本方法は、ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含
む融合タンパク質をコードする核酸分子およびガイドＲＮＡをコードする核酸分子を対象
に投与するステップを含み得、融合タンパク質は核局在化シグナルを含む。一定の実施形
態では、本方法が、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を対象に投与するステップを含み
、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などの内因性
ヒトデアミナーゼによって特異的に認識される（１又は複数の）配列および／または（１
又は複数の）構造を含み、ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）
ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチド
でミスマッチを含む。
方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、本発明のＲＮＡ編集法を使用するス
テップを含む。例えば、本方法は、ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含
む融合タンパク質をコードする核酸分子およびガイドＲＮＡをコードする核酸分子を対象
に投与するステップを含み得、融合タンパク質は核局在化シグナルを含む。一定の実施形
態では、本方法が、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を対象に投与するステップを含み
、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などの内因性
ヒトデアミナーゼによって特異的に認識される（１又は複数の）配列および／または（１
又は複数の）構造を含み、ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）
ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチド
でミスマッチを含む。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】編集効率が配列依存性であることを示している。図１Ａは、ＭｅＣＰ２におけるメチルＤＮＡ結合ドメイン（ＭＢＤ）、転写リプレッサードメイン（ＴＲＤ）、およびＮＣｏＲ相互作用ドメイン（ＮＩＤ）に対する３つのＧ＞Ａ突然変異の位置を示す概略図である。図１Ｂは、部位特異的ＲＮＡ編集のコア構成要素の概略図である。ハイブリッドエディターゼ（Ｅｄｉｔａｓｅ）は、バクテリオファージλ（λＮ）由来のＲＮＡ結合ドメインと、ＲＮＡ ２に作用するヒトアデノシンデアミナーゼ（ｈＡＤＡＲ２）の触媒ドメイン（デアミナーゼドメイン）を含む。核局在化シグナル（ＮＬＳ）の３つのコピーと、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの２つのコピーも含まれているが、示されていない。ガイドＲＮＡはＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡに相補的で、λＮ ＲＮＡ結合ドメインによって認識されるヘアピン（ステムループ）を含む。標的Ａに対して、編集効率を高めるためにガイドにＣが導入されている。図１Ｃは、ガイドを用いた（上）または用いない（下）、ガイドエディターゼのＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞へのトランスフェクション後のＭｅｃｐ２Ｗ１０４Ｘ ｃＤＮＡの配列決定クロマトグラムである。図１Ｄは、Ｍｅｃｐ２ ｃＤＮＡの直接配列決定法を使用して定量化された、図１Ｃのデータを含む、ＡからＩへの編集％（平均±ＳＤ；ｎ＝３）を示す図である。薄灰色バー、エディターゼのみでトランスフェクトされた細胞；濃灰色バー、エディターゼおよびガイドでトランスフェクトされた細胞。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を使用した一元配置分散分析。ｎｓ：有意でない。
【図2】Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡに対する部位特異的Ａ－Ｇミスマッチのガイドを使用して、より効率的なエディターゼによるオフターゲット編集を減少させることができることを示している。図２Ａは、ガイドＲＮＡおよびエディターゼＷＴまたはエディターゼＥ
４８８ＱのＮ２Ａ細胞へのトランスフェクション後のＲ１０６Ｑ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）部位でのＡからＩへの編集％（平均±ＳＤ；ｎ＝３、図２Ｂのデータを含む）を示す図である。図２Ｂは、エディターゼＷＴ（上）またはエディターゼＥ４８８Ｑ（下）で編集したＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ ｃＤＮＡの代表的なクロマトグラムである。図２Ｃは、２つの異なるガイドＲＮＡに対するＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡを示す図である。標準ガイド（上）は、編集を増強するために、標的Ａ（太字で強調）でＡ－Ｃミスマッチ（Ｒ１０６Ｑ）を含む。改変ガイド（下）は、この部位での編集を阻害するためにアステリスクでマークされたオフターゲットＡでＡ－Ｇミスマッチを含む。提供される標的配列は、配列番号５２である。図２Ｄは、Ｎ２Ａ細胞をエディターゼＥ４８８Ｑおよび標的部位でのみミスマッチを含むガイド（上）またはオンターゲットＡ－Ｃミスマッチとオフターゲット部位でのＡ－Ｇミスマッチの両方を含む改変ガイド（下）でトランスフェクションした後のＭｅｃｐ２ ｃＤＮＡのクロマトグラムである。図２Ｅは、Ａ－Ｇミスマッチを含むガイドにより、オフターゲット編集が大幅に減少する（平均±ＳＤ；ｎ＝３、図２Ｄのデータを含む）ことを示す図である。図２Ｆは、オフターゲットＡ－Ｇミスマッチの存在は、Ｒ１０６Ｑ部位での編集には影響を及ぼさない（平均±ＳＤ；ｎ＝３、図２Ｄのデータを含む）。薄灰色バー、エディターゼのみでトランスフェクトされた細胞；濃灰色バー、エディターゼおよびガイドでトランスフェクトされた細胞；黒色バー、エディターゼおよびＡ－Ｇミスマッチを含むガイドでトランスフェクトされた細胞。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を使用した一元配置分散分析。ｎｓ：有意でない。
【図3】初代ニューロンのＡＡＶ１／２形質導入後の内因性ＭｅＣＰ２ ｍＲＮＡの配列分析を示している。図３Ａは、ＡＡＶ１／２ウイルスによる形質導入の７日後、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙ海馬ニューロン（ＤＩＶ１４）から単離されたｃＤＮＡの配列分析による編集の定量化（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。＋ガイドは、ニューロンのシナプシンＩプロモーターの制御下にあるエディターゼおよびそれぞれＵ６プロモーターの制御下で発現される６コピーのガイドを含むＡＡＶ１／２を指す。ガイドは、Ｒ１０６Ｑの標的ＡでのＣミスマッチおよびオフターゲットＡ Ｔ１０５ＴでのＧミスマッチを含む。対照ウイルスは、シナプシンＩプロモーターの制御下でエディターゼをコードするが、いずれのガイド配列も欠く（－ガイド）。＊＊＊＊対応のない両側ｔ検定によりＰ＜０．０００１。図３Ｂは、ガイドＲＮＡ領域に対するＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡ（配列番号５２）および一次アミノ酸配列（配列番号５３）を示す図である。標的Ａは太字で示され、アステリスクはオフターゲット編集されたＡ残基を示す。ガイドのヘアピンは、λＮペプチドによって認識されるＢｏｘＢ配列の位置を表す。グラフは、Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡ内のオフターゲット部位での編集の定量化を提供する（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。残基Ｎ１２６Ｓがガイド領域の外にある。
【図4】部位特異的ＲＮＡ編集がＭｅＣＰ２タンパク質レベルを上昇させ、それによって編集後の内因性疾患の原因となるタンパク質の機能的回復を示していることを示す図である。エディターゼのみまたはエディターゼとガイドを発現しているＡＡＶ１／２で７日前に形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙまたは野生型（ＷＴ、Ｍｅｃｐ２＋／ｙ）同胞海馬ニューロン（ＤＩＶ１４）からの全細胞可溶化物の代表的なウエスタンブロットが提供される。ガイドは、Ｒ１０６Ｑ部位でのＣミスマッチおよびオフターゲットＡ、Ｔ１０５ＴでのＧミスマッチを含む。グラフは、各条件がβ－アクチンに正規化されたウエスタンブロットの定量化（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を提供する。薄灰色バー、エディターゼのみで形質導入された細胞。濃灰色バー、エディターゼおよびガイドで形質導入された細胞。＊＊＊対応のない両側ｔ検定によりＰ＜０．００１。
【図5】部位特異的ＲＮＡ編集が、ＭｅＣＰ２がヘテロクロマチンに結合する能力を回復することを示しており、編集後の内因性タンパク質の機能の回復を示している。エディターゼ（ＨＡ）およびＭｅＣＰ２について免疫標識された海馬ニューロン（ＤＩＶ１４）の代表的な共焦点画像を示している。ＤＡＰＩ染色は、核の輪郭を描き、ヘテロクロマチン構造（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｆｏｃｉ）を示す。挿入図は、隣接パネルでより高い倍率とより高いゲインで撮像された細胞の境界を定める。図５Ａは、野生型（Ｍｅｃｐ２＋／ｙ）ニューロン培養物を示す図である。図５Ｂは、エディターゼのみ（ガイドなし）を発現するＡＡＶ１／２ウイルスが形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙニューロン培養物を示す図である。これらのニューロンは、ヘテロクロマチン中にＭｅＣＰ２濃縮を決して示さなかった。図５Ｃは、エディターゼおよび標的ＡでＣミスマッチを含むガイドを発現するＡＡＶ１／２ウイルスが形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙニューロン培養物を示す図である。図５Ｄは、エディターゼおよび標的ＡでＣミスマッチを含むガイドを発現するＡＡＶ１／２ウイルスが形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／
ｙニューロン培養物を示す図である。図５Ｄ中、＋および－は、それぞれ、ヘテロクロマチン中にＭｅＣＰ２濃縮が存在するおよび存在しない核を示している。スケールバー、１０μｍ。図５Ｅ～図５Ｇ：各ヒストグラムは、３つのスライド（平均±ＳＤ）の各々の３つのフィールドからの細胞の定量化（エディターゼのみ、ｎ＝１３４；エディターゼおよびガイド、ｎ＝１３７）を表す。図５Ｅは、非感染細胞からのシグナルを閾値処理した後、ＨＡ核染色によって同定されたエディターゼ＋細胞の百分率を示す図である。百分率は、ＤＡＰＩ＋細胞の総数に対するものである。図５Ｆは、ヘテロクロマチン（構造）中にＭｅＣＰ２濃縮を有するエディターゼ＋細胞の百分率を示す図である。図５Ｇは、ヘテロクロマチン（構造）中にＭｅＣＰ２濃縮を有する全ての細胞の百分率を示す図である。ｎｓ：有意でない。
【図6】エディターゼのみまたはエディターゼとガイドＲＮＡをコードするＡＡＶベクターで処置された野生型マウスまたはＭｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａ（Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ）マウスの脳の歯状ニューロンヘテロクロマチンにおけるＭｅＣＰ２強度のグラフである。
【図7】種々のガイドＲＮＡの概略図と、処置していない、または２つのＢｏｘＢステムループを有するガイドＲＮＡ、ＧｌｕＡ２からのＲ／Ｇ結合部位を含むガイドＲＮＡもしくは内部ループを有するガイドＲＮＡで処置したＨＥＫ細胞におけるＭｅｃｐ２３１
７Ｇ＞Ａ（Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ）の編集％のグラフである。ＨＥＫ細胞はまた、ＣＭＶプロモーターの制御下で完全長天然ＡＤＡＲ２ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、一部は、部位特異的ＲＮＡ編集を利用して、ＲＮＡレベル（例えば、ｍＲＮ
Ａ）で、疾患の原因となる点突然変異、例えば、レット症候群の根底にあるメチルＣｐＧ
結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＤＮＡ結合ドメイン遺伝子のグアノシンからアデノシン
への（Ｇ＞Ａ）突然変異を修復することができるという驚くべき発見に基づく。重要なこ
とに、この部位特異的ＲＮＡ編集は、とりわけ、内因性ＲＮＡを修復し、タンパク質機能
を回復するのに有用である。したがって、実施形態では、本発明は、部位特異的ＲＮＡ編
集のための組成物および方法に関する。
Ａ）で、疾患の原因となる点突然変異、例えば、レット症候群の根底にあるメチルＣｐＧ
結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＤＮＡ結合ドメイン遺伝子のグアノシンからアデノシン
への（Ｇ＞Ａ）突然変異を修復することができるという驚くべき発見に基づく。重要なこ
とに、この部位特異的ＲＮＡ編集は、とりわけ、内因性ＲＮＡを修復し、タンパク質機能
を回復するのに有用である。したがって、実施形態では、本発明は、部位特異的ＲＮＡ編
集のための組成物および方法に関する。
【0015】
生殖系列または神経細胞に限局してヒトでレット症候群を引き起こすＭｅｃｐ２の突然
変異を有するよう操作されたマウスは、レット症候群の患者と同様の成長異常、不安およ
び運動障害を示す（Ｇｕｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２７：３
２２－３２６；Ｌｉｏｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７５：４９７－５
００；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２７：３２７－３３
１）。マウスでの研究は、最も強いレット症候群表現型が神経学的であり、ニューロンと
グリアの両方に影響を及ぼすことを示している（Ｌｉｏｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎ
ａｔｕｒｅ ４７５：４９７－５００；Ｌｕｉｋｅｎｈｕｉｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：６０３３－６０３８）が、多くの
他の組織も影響を受ける可能性がある（Ｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３８９－４４０４）。ヒトと同様に、雄レットマウスは雌
マウスよりも重症である。例えば、雌レットマウスは正常な寿命を生きるが、雄マウスは
生後３～４か月で死亡する（Ｇｕｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，
２７：３２２－３２６；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２
７：３２７－３３１）。細胞レベルでは、レットの雄および雌マウスの神経細胞は、細胞
体、核が小さく、プロセスの複雑さが減少しており（Ｂｅｌｉｃｈｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ
．（２００９）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，３４：７１－７７；Ｂｅｌｉｃｈｅｎｋ
ｏ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５１４：２４０－２５８
；Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅ
ｕｒｏｌ．，６４：５３７－５４４；Ｋｉｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２７：３０６－３２１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．
（２０１２）Ｂｒａｉｎ １３５：２６９９－２７１０；Ｔｒｏｐｅａ，ｅｔ ａｌ．（
２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０６：２０２９－２０３４；Ｓ
ｔｕｓｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３１８９６）、罹患した
ヒト細胞を思い出させる（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５４：１９５－２０１；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．
（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３：４４６－４５８；Ｂｅｌｉｃｈｅｎ
ｋｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．，５：１５０９－１５１３；
Ｂａｕｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５：１５８１－１５８
６）。重要なことに、条件付きＣｒｅリコンビナーゼ（Ｇｕｙ，ｅｔ ａｌ．（２００７
）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１１４３－１１４７）または遺伝子療法アプローチ（Ｓｉｎ
ｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄ
ｅｖ．，５：１０６－１１５；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈ
ｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１８０－１９０；Ｇａｒｇ，ｅｔ ａ
ｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３３：１３６１２－１３６２０；Ｇａｄａｌ
ｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１８－３０）を介したＭｅ
ｃｐ２ヌルマウスでのＭｅＣＰ２の回復により、疾患の後期でさえ、レット様症候群およ
び細胞欠損の多くが逆行する。表現型の逆転は、ヒトで、レット症候群を遺伝子置換戦略
で処置することができることを示している（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２
）Ｂｒａｉｎ １３５：２６９９－２７１０；Ｓｉｎｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１７
）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１０６－１１５；Ｇａ
ｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．
Ｄｅｖ．，５：１８０－１９０；Ｇａｒｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．，３３：１３６１２－１３６２０；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍ
ｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１８－３０）。しかしながら、ヒトでのＭＥＣＰ２遺伝子にか
かる重複は、ＭｅＣＰ２過剰発現および重度の神経障害をもたらす（Ｖａｎ Ｅｓｃｈ，
ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７７：４４２－４５３）。
さらに、マウスのＭｅＣＰ２は様々な神経細胞型で様々なレベルで発現され、マウスでの
ＭｅＣＰ２機能の喪失は遺伝子発現の細胞特異的変化をもたらす（Ｓｋｅｎｅ，ｅｔ ａ
ｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，３７：４５７－４６８；Ｂａｌｌａｓ，ｅｔ ａ
ｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：３１１－３１７；Ｓｈａｈｂａｚ
ｉａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：１１５－１２
４；Ｓｕｇｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３４：１２８７
７－１２８８３；Ｌｉｎｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３：２４６
－２５５）。これらの所見は、神経系の多様な細胞型にわたって正常なＭｅＣＰ２レベル
および細胞生理学を回復するために微調整しなければならないＭＥＣＰ２遺伝子置換の課
題を強調している。
変異を有するよう操作されたマウスは、レット症候群の患者と同様の成長異常、不安およ
び運動障害を示す（Ｇｕｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２７：３
２２－３２６；Ｌｉｏｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７５：４９７－５
００；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２７：３２７－３３
１）。マウスでの研究は、最も強いレット症候群表現型が神経学的であり、ニューロンと
グリアの両方に影響を及ぼすことを示している（Ｌｉｏｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎ
ａｔｕｒｅ ４７５：４９７－５００；Ｌｕｉｋｅｎｈｕｉｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：６０３３－６０３８）が、多くの
他の組織も影響を受ける可能性がある（Ｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３８９－４４０４）。ヒトと同様に、雄レットマウスは雌
マウスよりも重症である。例えば、雌レットマウスは正常な寿命を生きるが、雄マウスは
生後３～４か月で死亡する（Ｇｕｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，
２７：３２２－３２６；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２
７：３２７－３３１）。細胞レベルでは、レットの雄および雌マウスの神経細胞は、細胞
体、核が小さく、プロセスの複雑さが減少しており（Ｂｅｌｉｃｈｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ
．（２００９）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，３４：７１－７７；Ｂｅｌｉｃｈｅｎｋ
ｏ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５１４：２４０－２５８
；Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅ
ｕｒｏｌ．，６４：５３７－５４４；Ｋｉｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２７：３０６－３２１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．
（２０１２）Ｂｒａｉｎ １３５：２６９９－２７１０；Ｔｒｏｐｅａ，ｅｔ ａｌ．（
２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０６：２０２９－２０３４；Ｓ
ｔｕｓｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３１８９６）、罹患した
ヒト細胞を思い出させる（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５４：１９５－２０１；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．
（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３：４４６－４５８；Ｂｅｌｉｃｈｅｎ
ｋｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．，５：１５０９－１５１３；
Ｂａｕｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５：１５８１－１５８
６）。重要なことに、条件付きＣｒｅリコンビナーゼ（Ｇｕｙ，ｅｔ ａｌ．（２００７
）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１１４３－１１４７）または遺伝子療法アプローチ（Ｓｉｎ
ｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄ
ｅｖ．，５：１０６－１１５；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈ
ｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１８０－１９０；Ｇａｒｇ，ｅｔ ａ
ｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３３：１３６１２－１３６２０；Ｇａｄａｌ
ｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１８－３０）を介したＭｅ
ｃｐ２ヌルマウスでのＭｅＣＰ２の回復により、疾患の後期でさえ、レット様症候群およ
び細胞欠損の多くが逆行する。表現型の逆転は、ヒトで、レット症候群を遺伝子置換戦略
で処置することができることを示している（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２
）Ｂｒａｉｎ １３５：２６９９－２７１０；Ｓｉｎｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１７
）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１０６－１１５；Ｇａ
ｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．
Ｄｅｖ．，５：１８０－１９０；Ｇａｒｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．，３３：１３６１２－１３６２０；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍ
ｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１８－３０）。しかしながら、ヒトでのＭＥＣＰ２遺伝子にか
かる重複は、ＭｅＣＰ２過剰発現および重度の神経障害をもたらす（Ｖａｎ Ｅｓｃｈ，
ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７７：４４２－４５３）。
さらに、マウスのＭｅＣＰ２は様々な神経細胞型で様々なレベルで発現され、マウスでの
ＭｅＣＰ２機能の喪失は遺伝子発現の細胞特異的変化をもたらす（Ｓｋｅｎｅ，ｅｔ ａ
ｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，３７：４５７－４６８；Ｂａｌｌａｓ，ｅｔ ａ
ｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：３１１－３１７；Ｓｈａｈｂａｚ
ｉａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：１１５－１２
４；Ｓｕｇｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３４：１２８７
７－１２８８３；Ｌｉｎｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３：２４６
－２５５）。これらの所見は、神経系の多様な細胞型にわたって正常なＭｅＣＰ２レベル
および細胞生理学を回復するために微調整しなければならないＭＥＣＰ２遺伝子置換の課
題を強調している。
【0016】
本明細書では、ＲＮＡが正常な転写産物の環境で修復されるので、ＲＮＡのレベルでＭ
ＥＣＰ２突然変異を修復すると、ＭＥＣＰ２過剰発現と細胞型特異的調節の両方の問題が
、回避されることが示されている。レット症候群の根底にあるグアノシンからアデノシン
への（Ｇ＞Ａ）突然変異（Ｆｙｆｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．，１８：７０９－７１３）を標的とした。天然酵素のファミリーであるＲＮＡに
作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）は、内因性ｍＲＮＡにおいてＡをイノシン
（Ｉ）に加水分解的に脱アミノ化する（Ｂａｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ
５５：１０８９－１０９８；Ｂａｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：６０
７－６１３；Ｍｅｌｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３７９：４６０
－４６４；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ １５：５１
－６２；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
９１：１１４５７－１１４６１）。イノシン塩基はシトシン（Ｃ）と対になり、リボソー
ムによってＧとして翻訳される（Ｂａｓｉｌｉｏ，ｅｔ ａｌ．（１９６２）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，４８：６１３－６１６）。ＡＤＡＲファミリーのメンバ
ーの１つであるＡＤＡＲ２は、脳で高レベルに発現され、転写後に、一次転写産物の脱ア
ミノ化を通して、イオンチャネル透過性などのタンパク質機能を変化させる（Ｂｈａｌｌ
ａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：９５
０－９５６；Ｓｏｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ ６７：１１－１９；Ｂ
ｕｒｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：３０３－３０８）。ＡＤＡ
Ｒ２による自然編集は、その触媒活性に加えて、編集のために標的Ａをエクソンに適切に
配置するプレｍＲＮＡのイントロンによって媒介される二本鎖ＲＮＡ構造の認識が必要で
ある（Ｂｈａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１１：９５０－９５６；Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２７９：４９４１－４９５１；Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）
Ｃｅｌｌ ７５：１３６１－１３７０；Ｍａａｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２２２１－１２２２６；Ｌｏｍｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９
９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１７０９－１７１３；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９
７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：４３５４－４３５９）。ヒトＡＤ
ＡＲ２（ｈＡＤＡＲ２）のクローニング触媒ドメインは、通常終止コドンで、異種的に発
現されるｍＲＮＡのＧ＞Ａ修復を標的とするために、種々の構成で、利用されてきた（Ｈ
ａｎｓｗｉｌｌｅｍｅｎｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
，１３７：１５８７５－１５８８１；Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＣｈｅｍＭ
ｅｄＣｈｅｍ ９：２０２１－２０２５；Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｎｇ
ｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，５３：６２６７－６２７１；Ｓｃｈｎｅｉ
ｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：ｅ８
７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ
．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２
９０）。１つのアプローチでは、ＡＤＡＲ２の天然ＲＮＡ結合ドメインが、ナノモル濃度
の親和性で特異的短ＲＮＡヘアピンに結合する（Ａｕｓｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２
）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１０９６６－１０９６７）バクテリオファー
ジラムダ（λＮ；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２９０）由来のＲＮＡ結
合ペプチドで置き換えられた。次いで、異種ｍＲＮＡの標的編集が、λＮ認識ステムルー
プおよび標的ｍＲＮＡに相補的な領域を含むＲＮＡガイドと共にハイブリッドＡＤＡＲ２
タンパク質を発現させることによって達成される（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，
ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍ
ｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２９０）。
ＥＣＰ２突然変異を修復すると、ＭＥＣＰ２過剰発現と細胞型特異的調節の両方の問題が
、回避されることが示されている。レット症候群の根底にあるグアノシンからアデノシン
への（Ｇ＞Ａ）突然変異（Ｆｙｆｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．，１８：７０９－７１３）を標的とした。天然酵素のファミリーであるＲＮＡに
作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）は、内因性ｍＲＮＡにおいてＡをイノシン
（Ｉ）に加水分解的に脱アミノ化する（Ｂａｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ
５５：１０８９－１０９８；Ｂａｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：６０
７－６１３；Ｍｅｌｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３７９：４６０
－４６４；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ １５：５１
－６２；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
９１：１１４５７－１１４６１）。イノシン塩基はシトシン（Ｃ）と対になり、リボソー
ムによってＧとして翻訳される（Ｂａｓｉｌｉｏ，ｅｔ ａｌ．（１９６２）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，４８：６１３－６１６）。ＡＤＡＲファミリーのメンバ
ーの１つであるＡＤＡＲ２は、脳で高レベルに発現され、転写後に、一次転写産物の脱ア
ミノ化を通して、イオンチャネル透過性などのタンパク質機能を変化させる（Ｂｈａｌｌ
ａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：９５
０－９５６；Ｓｏｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ ６７：１１－１９；Ｂ
ｕｒｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：３０３－３０８）。ＡＤＡ
Ｒ２による自然編集は、その触媒活性に加えて、編集のために標的Ａをエクソンに適切に
配置するプレｍＲＮＡのイントロンによって媒介される二本鎖ＲＮＡ構造の認識が必要で
ある（Ｂｈａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１１：９５０－９５６；Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２７９：４９４１－４９５１；Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）
Ｃｅｌｌ ７５：１３６１－１３７０；Ｍａａｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２２２１－１２２２６；Ｌｏｍｅｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９
９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１７０９－１７１３；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９
７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：４３５４－４３５９）。ヒトＡＤ
ＡＲ２（ｈＡＤＡＲ２）のクローニング触媒ドメインは、通常終止コドンで、異種的に発
現されるｍＲＮＡのＧ＞Ａ修復を標的とするために、種々の構成で、利用されてきた（Ｈ
ａｎｓｗｉｌｌｅｍｅｎｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
，１３７：１５８７５－１５８８１；Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＣｈｅｍＭ
ｅｄＣｈｅｍ ９：２０２１－２０２５；Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｎｇ
ｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，５３：６２６７－６２７１；Ｓｃｈｎｅｉ
ｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：ｅ８
７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ
．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２
９０）。１つのアプローチでは、ＡＤＡＲ２の天然ＲＮＡ結合ドメインが、ナノモル濃度
の親和性で特異的短ＲＮＡヘアピンに結合する（Ａｕｓｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２
）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１０９６６－１０９６７）バクテリオファー
ジラムダ（λＮ；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２９０）由来のＲＮＡ結
合ペプチドで置き換えられた。次いで、異種ｍＲＮＡの標的編集が、λＮ認識ステムルー
プおよび標的ｍＲＮＡに相補的な領域を含むＲＮＡガイドと共にハイブリッドＡＤＡＲ２
タンパク質を発現させることによって達成される（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，
ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍ
ｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２９０）。
【0017】
以前は、内因性ＲＮＡもｍＲＮＡも、特に機能的タンパク質を生成するように修復され
ることに関して、部位特異的ＲＮＡ編集によって修復されてこなかった。しかしながら、
内因性Ｍｅｃｐ２におけるＧ＞Ａ突然変異に対するこのアプローチが、本明細書で初めて
実証されている。Ｍｅｃｐ２の突然変異は、十分確立された機能をコードするドメインに
ある。さらに、修復の忠実度を、配列分析、ウエスタンブロッティング、および単一細胞
レベルでの免疫化学によって監視することができる。ここでは、内因性Ｍｅｃｐ２転写産
物内のＧ＞Ａ突然変異を有効に修復するために、組換えｈＡＤＡＲ２－λＮタンパク質（
本明細書ではエディターゼとも呼ばれる）を使用した。トランスフェクトマウス神経芽細
胞腫（Ｎ２Ａ）細胞でのＭｅｃｐ２編集のパラメータを決定した後、アデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）を使用して、ＤＮＡ結合ドメインに重度のヒトＧ＞Ａ突然変異を含むレット症
候群マウスモデルからの初代ニューロン培養を形質導入した（ＭｅＣＰ２３１７Ｇ＞Ａ；
ＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑ）。この突然変異により、ＭｅＣＰ２タンパク質レベルが低下し、
ヘテロクロマチンへの結合が大幅に減少する。突然変異ＲＮＡの編集効率を最初にニュー
ロンで定量化し、次いで、編集によってＭｅＣＰ２タンパク質レベルが救済され、ニュー
ロン、グリアおよび非神経細胞型を含む細胞内のＭｅＣＰ２の重要な特性であるヘテロク
ロマチン構造における結合の濃縮につながるかどうかを試験した。本明細書に提示される
結果は、部位特異的ＲＮＡ編集が、レット症候群ならびに遺伝子療法を受けられる他の神
経疾患の根底にある疾患の原因となるＭＥＣＰ２突然変異を治療的に修復できることを示
している。
ることに関して、部位特異的ＲＮＡ編集によって修復されてこなかった。しかしながら、
内因性Ｍｅｃｐ２におけるＧ＞Ａ突然変異に対するこのアプローチが、本明細書で初めて
実証されている。Ｍｅｃｐ２の突然変異は、十分確立された機能をコードするドメインに
ある。さらに、修復の忠実度を、配列分析、ウエスタンブロッティング、および単一細胞
レベルでの免疫化学によって監視することができる。ここでは、内因性Ｍｅｃｐ２転写産
物内のＧ＞Ａ突然変異を有効に修復するために、組換えｈＡＤＡＲ２－λＮタンパク質（
本明細書ではエディターゼとも呼ばれる）を使用した。トランスフェクトマウス神経芽細
胞腫（Ｎ２Ａ）細胞でのＭｅｃｐ２編集のパラメータを決定した後、アデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）を使用して、ＤＮＡ結合ドメインに重度のヒトＧ＞Ａ突然変異を含むレット症
候群マウスモデルからの初代ニューロン培養を形質導入した（ＭｅＣＰ２３１７Ｇ＞Ａ；
ＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑ）。この突然変異により、ＭｅＣＰ２タンパク質レベルが低下し、
ヘテロクロマチンへの結合が大幅に減少する。突然変異ＲＮＡの編集効率を最初にニュー
ロンで定量化し、次いで、編集によってＭｅＣＰ２タンパク質レベルが救済され、ニュー
ロン、グリアおよび非神経細胞型を含む細胞内のＭｅＣＰ２の重要な特性であるヘテロク
ロマチン構造における結合の濃縮につながるかどうかを試験した。本明細書に提示される
結果は、部位特異的ＲＮＡ編集が、レット症候群ならびに遺伝子療法を受けられる他の神
経疾患の根底にある疾患の原因となるＭＥＣＰ２突然変異を治療的に修復できることを示
している。
【0018】
本発明によると、細胞内の核酸分子を編集する方法が提供される。特定の実施形態では
、編集される核酸分子が、ＲＮＡ分子、特に核内のＲＮＡ分子（例えば、一次転写産物、
プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ（例えば、核からの輸送前のｍＲＮＡ））である。特定の
実施形態では、編集される核酸分子が、内因性および／または核転写産物である。ＣＲＩ
ＳＰＲ技術などの遺伝子編集では、ゲノムのオフターゲット突然変異が永続的である。対
照的に、細胞内のＲＮＡターンオーバーは、ＲＮＡ内のオフターゲット突然変異が一時的
であることを意味する。さらに、ＲＮＡ編集は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集とは異なり、段
階的であり得る。結果として、オフターゲット突然変異は必ずしも１００％まで編集され
るわけではない。
、編集される核酸分子が、ＲＮＡ分子、特に核内のＲＮＡ分子（例えば、一次転写産物、
プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ（例えば、核からの輸送前のｍＲＮＡ））である。特定の
実施形態では、編集される核酸分子が、内因性および／または核転写産物である。ＣＲＩ
ＳＰＲ技術などの遺伝子編集では、ゲノムのオフターゲット突然変異が永続的である。対
照的に、細胞内のＲＮＡターンオーバーは、ＲＮＡ内のオフターゲット突然変異が一時的
であることを意味する。さらに、ＲＮＡ編集は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集とは異なり、段
階的であり得る。結果として、オフターゲット突然変異は必ずしも１００％まで編集され
るわけではない。
【0019】
実施形態では、本発明は、タンパク質発現および／または機能の微調整を提供する核酸
分子をＲＮＡ編集する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、編集されていない状態
と比較して、タンパク質発現および／または機能の正常レベルの回復を可能にする。本明
細書に記載される処置の文脈において、本発明の方法は、未処置の状態と比較して、正常
レベルまたは少なくとも正常レベルに近いタンパク質発現および／または機能の回復を可
能にする。
分子をＲＮＡ編集する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、編集されていない状態
と比較して、タンパク質発現および／または機能の正常レベルの回復を可能にする。本明
細書に記載される処置の文脈において、本発明の方法は、未処置の状態と比較して、正常
レベルまたは少なくとも正常レベルに近いタンパク質発現および／または機能の回復を可
能にする。
【0020】
実施形態では、本発明は、例えば記載される療法の文脈で、（例えば、投薬を介して）
調整可能な一過的編集を提供する核酸分子をＲＮＡ編集する方法を提供する。例えば、本
発明は、標的ＲＮＡの可逆的編集を可能にする。
調整可能な一過的編集を提供する核酸分子をＲＮＡ編集する方法を提供する。例えば、本
発明は、標的ＲＮＡの可逆的編集を可能にする。
【0021】
特定の実施形態では、編集される細胞が非分裂細胞である。特定の実施形態では、編集
される細胞がニューロンおよび／またはグリア細胞である。特定の実施形態では、編集さ
れる細胞が非神経細胞である。特定の実施形態では、編集される細胞がニューロンである
。細胞（例えば、ニューロン）は、中枢神経系（例えば、脳、脊髄）および／または末梢
神経系にあり得る。細胞は、（例えば、インビボ処置方法で）処置される対象に存在し得
る、または細胞は、インビトロで処置され、次いで、対象に投与され得る（例えば、エキ
ソビボ処置方法）。
される細胞がニューロンおよび／またはグリア細胞である。特定の実施形態では、編集さ
れる細胞が非神経細胞である。特定の実施形態では、編集される細胞がニューロンである
。細胞（例えば、ニューロン）は、中枢神経系（例えば、脳、脊髄）および／または末梢
神経系にあり得る。細胞は、（例えば、インビボ処置方法で）処置される対象に存在し得
る、または細胞は、インビトロで処置され、次いで、対象に投与され得る（例えば、エキ
ソビボ処置方法）。
【0022】
本発明の一定の実施形態では、本方法が、１）ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合さ
れたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子および２）ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡを
コードする核酸分子を細胞に送達するステップを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合
ドメインが、ＲＮＡ編集酵素のＮ末端に連結される。実施形態では、ＲＮＡ編集酵素およ
びＲＮＡ結合ドメインを含む融合物が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を
含まない。実施形態では、ＲＮＡ編集酵素およびＲＮＡ結合ドメインを含む融合物が、少
なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。例えば、ＲＮＡ編集酵素およ
びＲＮＡ結合ドメインを含む融合物は、１、２、３、４、５またはそれ以上のＮＬＳをさ
らに含む。複数のＮＬＳが使用される場合、各ＮＬＳは互いに直接連結していてもよいし
、または１～約５個のアミノ酸のアミノ酸リンカーによって分離されていてもよい。特定
の実施形態では、ＮＬＳが、融合タンパク質のＮ末端にある。ＮＬＳの例は、Ｋｏｓｕｇ
ｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４：４７８－４８５；参
照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。特定の実施形態では、ＮＬＳが、
コンセンサス配列Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号５８）（例えば、単節型（ｍｏｎ
ｏｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コンセンサス配列
（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０～１２（Ｋ／Ｒ）３／５（配列番号５９）（式中、（Ｋ／Ｒ
）３／５は、５つのアミノ酸のうち少なくとも３つがリジンまたはアルギニンのいずれか
であることを表す）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳがｃ－ｍｙｃ ＮＬＳを含む。
特定の実施形態では、ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳが、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５４）
を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳがヌクレオプラスミンＮＬＳである。特定の実施形
態では、ヌクレオプラスミンＮＬＳが、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番
号６０）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳを含む。
特定の実施形態では、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳが、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４
７）を含む。特定の実施形態では、融合物が、３つのＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例え
ば、配列ＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６７））を含む
。種々の実施形態では、ＮＬＳが、上記の配列（例えば、配列番号５８、５９、６０、４
７、５４または６７）中に、これらの配列が１つまたは複数の置換、付加または欠失（例
えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約１０、または
約１５（約１～５、または約１～１０、または約１～１５を含む）の置換、付加または欠
失）を含むように、突然変異／変異を含み得る。特定の実施形態では、ＮＬＳ内のリジン
アミノ酸がアルギニンアミノ酸で置換されていてもよい、および／またはＮＬＳ内のアル
ギニンアミノ酸がリジンアミノ酸で置換されていてもよい。融合タンパク質は、融合タン
パク質のＮ末端で、精製タグ（例えば、ＨＡタグ）をさらに含んでいてもよい。
れたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子および２）ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡを
コードする核酸分子を細胞に送達するステップを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合
ドメインが、ＲＮＡ編集酵素のＮ末端に連結される。実施形態では、ＲＮＡ編集酵素およ
びＲＮＡ結合ドメインを含む融合物が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を
含まない。実施形態では、ＲＮＡ編集酵素およびＲＮＡ結合ドメインを含む融合物が、少
なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。例えば、ＲＮＡ編集酵素およ
びＲＮＡ結合ドメインを含む融合物は、１、２、３、４、５またはそれ以上のＮＬＳをさ
らに含む。複数のＮＬＳが使用される場合、各ＮＬＳは互いに直接連結していてもよいし
、または１～約５個のアミノ酸のアミノ酸リンカーによって分離されていてもよい。特定
の実施形態では、ＮＬＳが、融合タンパク質のＮ末端にある。ＮＬＳの例は、Ｋｏｓｕｇ
ｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４：４７８－４８５；参
照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。特定の実施形態では、ＮＬＳが、
コンセンサス配列Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号５８）（例えば、単節型（ｍｏｎ
ｏｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コンセンサス配列
（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０～１２（Ｋ／Ｒ）３／５（配列番号５９）（式中、（Ｋ／Ｒ
）３／５は、５つのアミノ酸のうち少なくとも３つがリジンまたはアルギニンのいずれか
であることを表す）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳがｃ－ｍｙｃ ＮＬＳを含む。
特定の実施形態では、ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳが、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５４）
を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳがヌクレオプラスミンＮＬＳである。特定の実施形
態では、ヌクレオプラスミンＮＬＳが、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番
号６０）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳを含む。
特定の実施形態では、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳが、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４
７）を含む。特定の実施形態では、融合物が、３つのＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例え
ば、配列ＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６７））を含む
。種々の実施形態では、ＮＬＳが、上記の配列（例えば、配列番号５８、５９、６０、４
７、５４または６７）中に、これらの配列が１つまたは複数の置換、付加または欠失（例
えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約１０、または
約１５（約１～５、または約１～１０、または約１～１５を含む）の置換、付加または欠
失）を含むように、突然変異／変異を含み得る。特定の実施形態では、ＮＬＳ内のリジン
アミノ酸がアルギニンアミノ酸で置換されていてもよい、および／またはＮＬＳ内のアル
ギニンアミノ酸がリジンアミノ酸で置換されていてもよい。融合タンパク質は、融合タン
パク質のＮ末端で、精製タグ（例えば、ＨＡタグ）をさらに含んでいてもよい。
【0023】
本発明の核酸分子は、単一ベクター内に含まれていてもよいし、または別々のベクター
に含まれていてもよい。例えば、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集
酵素をコードする核酸分子およびガイドＲＮＡをコードする核酸分子は、単一ベクター内
に含まれる。核酸分子は、連続的に（前または後に）および／または同時に（同時的に）
細胞に送達され得る。核酸分子は、同じ組成物または別個の組成物で（例えば、別個のベ
クターに含まれる場合）送達され得る。特定の実施形態では、核酸分子が、単一ベクター
、特にＡＡＶベクターなどのウイルスベクターで送達される。
に含まれていてもよい。例えば、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集
酵素をコードする核酸分子およびガイドＲＮＡをコードする核酸分子は、単一ベクター内
に含まれる。核酸分子は、連続的に（前または後に）および／または同時に（同時的に）
細胞に送達され得る。核酸分子は、同じ組成物または別個の組成物で（例えば、別個のベ
クターに含まれる場合）送達され得る。特定の実施形態では、核酸分子が、単一ベクター
、特にＡＡＶベクターなどのウイルスベクターで送達される。
【0024】
特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がヒトである。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集
酵素がデアミナーゼである。デアミナーゼの例としては、限定されないが、ＲＮＡに作用
するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、
触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰ
ＯＢＥＣ３Ｇ））、および活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡまたはＡＩＤ；
Ｃ：ＧはＴ：Ａに変換される）が挙げられる。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、
ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはＡＤＡＲ３などのＡＤＡＲである。特定の実施形態では、
ＲＮＡ編集酵素がＡＤＡＲ１である（例えば、Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０３およびＧｅｎＢａ
ｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１１１１．５およびＮＰ＿００１１０２．３ならびにこれらのア
イソフォーム参照）。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がＡＤＡＲ２である。ＲＮＡ
編集酵素が完全長未満であってもよい。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がその天然
のＲＮＡ結合ドメインを欠いている。例えば、ＲＮＡ編集酵素が、酵素の触媒ドメインを
含んでもよい、または酵素の触媒ドメインからなってもよい。
酵素がデアミナーゼである。デアミナーゼの例としては、限定されないが、ＲＮＡに作用
するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、
触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰ
ＯＢＥＣ３Ｇ））、および活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡまたはＡＩＤ；
Ｃ：ＧはＴ：Ａに変換される）が挙げられる。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、
ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはＡＤＡＲ３などのＡＤＡＲである。特定の実施形態では、
ＲＮＡ編集酵素がＡＤＡＲ１である（例えば、Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０３およびＧｅｎＢａ
ｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１１１１．５およびＮＰ＿００１１０２．３ならびにこれらのア
イソフォーム参照）。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がＡＤＡＲ２である。ＲＮＡ
編集酵素が完全長未満であってもよい。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がその天然
のＲＮＡ結合ドメインを欠いている。例えば、ＲＮＡ編集酵素が、酵素の触媒ドメインを
含んでもよい、または酵素の触媒ドメインからなってもよい。
【0025】
ヒトＡＤＡＲ１のアミノ酸配列の例は、
ＭＮＰＲＱＧＹＳＬＳ ＧＹＹＴＨＰＦＱＧＹ ＥＨＲＱＬＲＹＱＱＰ ＧＰＧＳＳＰ
ＳＳＦＬ ＬＫＱＩＥＦＬＫＧＱ ＬＰＥＡＰＶＩＧＫＱ ＴＰＳＬＰＰＳＬＰＧ ＬＲ
ＰＲＦＰＶＬＬＡ ＳＳＴＲＧＲＱＶＤＩ ＲＧＶＰＲＧＶＨＬＲ ＳＱＧＬＱＲＧＦＱ
Ｈ ＰＳＰＲＧＲＳＬＰＱ ＲＧＶＤＣＬＳＳＨＦ ＱＥＬＳＩＹＱＤＱＥ ＱＲＩＬＫ
ＦＬＥＥＬ ＧＥＧＫＡＴＴＡＨＤ ＬＳＧＫＬＧＴＰＫＫ ＥＩＮＲＶＬＹＳＬＡ Ｋ
ＫＧＫＬＱＫＥＡＧ ＴＰＰＬＷＫＩＡＶＳ ＴＱＡＷＮＱＨＳＧＶ ＶＲＰＤＧＨＳＱ
ＧＡ ＰＮＳＤＰＳＬＥＰＥ ＤＲＮＳＴＳＶＳＥＤ ＬＬＥＰＦＩＡＶＳＡ ＱＡＷＮ
ＱＨＳＧＶＶ ＲＰＤＳＨＳＱＧＳＰ ＮＳＤＰＧＬＥＰＥＤ ＳＮＳＴＳＡＬＥＤＰ
ＬＥＦＬＤＭＡＥＩＫ ＥＫＩＣＤＹＬＦＮＶ ＳＤＳＳＡＬＮＬＡＫ ＮＩＧＬＴＫＡ
ＲＤＩ ＮＡＶＬＩＤＭＥＲＱ ＧＤＶＹＲＱＧＴＴＰ ＰＩＷＨＬＴＤＫＫＲ ＥＲＭ
ＱＩＫＲＮＴＮ ＳＶＰＥＴＡＰＡＡＩ ＰＥＴＫＲＮＡＥＦＬ ＴＣＮＩＰＴＳＮＡＳ
ＮＮＭＶＴＴＥＫＶＥ ＮＧＱＥＰＶＩＫＬＥ ＮＲＱＥＡＲＰＥＰＡ ＲＬＫＰＰＶ
ＨＹＮＧ ＰＳＫＡＧＹＶＤＦＥ ＮＧＱＷＡＴＤＤＩＰ ＤＤＬＮＳＩＲＡＡＰ ＧＥ
ＦＲＡＩＭＥＭＰ ＳＦＹＳＨＧＬＰＲＣ ＳＰＹＫＫＬＴＥＣＱ ＬＫＮＰＩＳＧＬＬ
Ｅ ＹＡＱＦＡＳＱＴＣＥ ＦＮＭＩＥＱＳＧＰＰ ＨＥＰＲＦＫＦＱＶＶ ＩＮＧＲＥ
ＦＰＰＡＥ ＡＧＳＫＫＶＡＫＱＤ ＡＡＭＫＡＭＴＩＬＬ ＥＥＡＫＡＫＤＳＧＫ Ｓ
ＥＥＳＳＨＹＳＴＥ ＫＥＳＥＫＴＡＥＳＱ ＴＰＴＰＳＡＴＳＦＦ ＳＧＫＳＰＶＴＴ
ＬＬ ＥＣＭＨＫＬＧＮＳＣ ＥＦＲＬＬＳＫＥＧＰ ＡＨＥＰＫＦＱＹＣＶ ＡＶＧＡ
ＱＴＦＰＳＶ ＳＡＰＳＫＫＶＡＫＱ ＭＡＡＥＥＡＭＫＡＬ ＨＧＥＡＴＮＳＭＡＳ
ＤＮＱＰＥＧＭＩＳＥ ＳＬＤＮＬＥＳＭＭＰ ＮＫＶＲＫＩＧＥＬＶ ＲＹＬＮＴＮＰ
ＶＧＧ ＬＬＥＹＡＲＳＨＧＦ ＡＡＥＦＫＬＶＤＱＳ ＧＰＰＨＥＰＫＦＶＹ ＱＡＫ
ＶＧＧＲＷＦＰ ＡＶＣＡＨＳＫＫＱＧ ＫＱＥＡＡＤＡＡＬＲ ＶＬＩＧＥＮＥＫＡＥ
ＲＭＧＦＴＥＶＴＰＶ ＴＧＡＳＬＲＲＴＭＬ ＬＬＳＲＳＰＥＡＱＰ ＫＴＬＰＬＴ
ＧＳＴＦ ＨＤＱＩＡＭＬＳＨＲ ＣＦＮＴＬＴＮＳＦＱ ＰＳＬＬＧＲＫＩＬＡ ＡＩ
ＩＭＫＫＤＳＥＤ ＭＧＶＶＶＳＬＧＴＧ ＮＲＣＶＫＧＤＳＬＳ ＬＫＧＥＴＶＮＤＣ
Ｈ ＡＥＩＩＳＲＲＧＦＩ ＲＦＬＹＳＥＬＭＫＹ ＮＳＱＴＡＫＤＳＩＦ ＥＰＡＫＧ
ＧＥＫＬＱ ＩＫＫＴＶＳＦＨＬＹ ＩＳＴＡＰＣＧＤＧＡ ＬＦＤＫＳＣＳＤＲＡ Ｍ
ＥＳＴＥＳＲＨＹＰ ＶＦＥＮＰＫＱＧＫＬ ＲＴＫＶＥＮＧＥＧＴ ＩＰＶＥＳＳＤＩ
ＶＰ ＴＷＤＧＩＲＬＧＥＲ ＬＲＴＭＳＣＳＤＫＩ ＬＲＷＮＶＬＧＬＱＧ ＡＬＬＴ
ＨＦＬＱＰＩ ＹＬＫＳＶＴＬＧＹＬ ＦＳＱＧＨＬＴＲＡＩ ＣＣＲＶＴＲＤＧＳＡ
ＦＥＤＧＬＲＨＰＦＩ ＶＮＨＰＫＶＧＲＶＳ ＩＹＤＳＫＲＱＳＧＫ ＴＫＥＴＳＶＮ
ＷＣＬ ＡＤＧＹＤＬＥＩＬＤ ＧＴＲＧＴＶＤＧＰＲ ＮＥＬＳＲＶＳＫＫＮ ＩＦＬ
ＬＦＫＫＬＣＳ ＦＲＹＲＲＤＬＬＲＬ ＳＹＧＥＡＫＫＡＡＲ ＤＹＥＴＡＫＮＹＦＫ
ＫＧＬＫＤＭＧＹＧＮ ＷＩＳＫＰＱＥＥＫＮ ＦＹＬＣＰＶ（配列番号７２）である
。
ＭＮＰＲＱＧＹＳＬＳ ＧＹＹＴＨＰＦＱＧＹ ＥＨＲＱＬＲＹＱＱＰ ＧＰＧＳＳＰ
ＳＳＦＬ ＬＫＱＩＥＦＬＫＧＱ ＬＰＥＡＰＶＩＧＫＱ ＴＰＳＬＰＰＳＬＰＧ ＬＲ
ＰＲＦＰＶＬＬＡ ＳＳＴＲＧＲＱＶＤＩ ＲＧＶＰＲＧＶＨＬＲ ＳＱＧＬＱＲＧＦＱ
Ｈ ＰＳＰＲＧＲＳＬＰＱ ＲＧＶＤＣＬＳＳＨＦ ＱＥＬＳＩＹＱＤＱＥ ＱＲＩＬＫ
ＦＬＥＥＬ ＧＥＧＫＡＴＴＡＨＤ ＬＳＧＫＬＧＴＰＫＫ ＥＩＮＲＶＬＹＳＬＡ Ｋ
ＫＧＫＬＱＫＥＡＧ ＴＰＰＬＷＫＩＡＶＳ ＴＱＡＷＮＱＨＳＧＶ ＶＲＰＤＧＨＳＱ
ＧＡ ＰＮＳＤＰＳＬＥＰＥ ＤＲＮＳＴＳＶＳＥＤ ＬＬＥＰＦＩＡＶＳＡ ＱＡＷＮ
ＱＨＳＧＶＶ ＲＰＤＳＨＳＱＧＳＰ ＮＳＤＰＧＬＥＰＥＤ ＳＮＳＴＳＡＬＥＤＰ
ＬＥＦＬＤＭＡＥＩＫ ＥＫＩＣＤＹＬＦＮＶ ＳＤＳＳＡＬＮＬＡＫ ＮＩＧＬＴＫＡ
ＲＤＩ ＮＡＶＬＩＤＭＥＲＱ ＧＤＶＹＲＱＧＴＴＰ ＰＩＷＨＬＴＤＫＫＲ ＥＲＭ
ＱＩＫＲＮＴＮ ＳＶＰＥＴＡＰＡＡＩ ＰＥＴＫＲＮＡＥＦＬ ＴＣＮＩＰＴＳＮＡＳ
ＮＮＭＶＴＴＥＫＶＥ ＮＧＱＥＰＶＩＫＬＥ ＮＲＱＥＡＲＰＥＰＡ ＲＬＫＰＰＶ
ＨＹＮＧ ＰＳＫＡＧＹＶＤＦＥ ＮＧＱＷＡＴＤＤＩＰ ＤＤＬＮＳＩＲＡＡＰ ＧＥ
ＦＲＡＩＭＥＭＰ ＳＦＹＳＨＧＬＰＲＣ ＳＰＹＫＫＬＴＥＣＱ ＬＫＮＰＩＳＧＬＬ
Ｅ ＹＡＱＦＡＳＱＴＣＥ ＦＮＭＩＥＱＳＧＰＰ ＨＥＰＲＦＫＦＱＶＶ ＩＮＧＲＥ
ＦＰＰＡＥ ＡＧＳＫＫＶＡＫＱＤ ＡＡＭＫＡＭＴＩＬＬ ＥＥＡＫＡＫＤＳＧＫ Ｓ
ＥＥＳＳＨＹＳＴＥ ＫＥＳＥＫＴＡＥＳＱ ＴＰＴＰＳＡＴＳＦＦ ＳＧＫＳＰＶＴＴ
ＬＬ ＥＣＭＨＫＬＧＮＳＣ ＥＦＲＬＬＳＫＥＧＰ ＡＨＥＰＫＦＱＹＣＶ ＡＶＧＡ
ＱＴＦＰＳＶ ＳＡＰＳＫＫＶＡＫＱ ＭＡＡＥＥＡＭＫＡＬ ＨＧＥＡＴＮＳＭＡＳ
ＤＮＱＰＥＧＭＩＳＥ ＳＬＤＮＬＥＳＭＭＰ ＮＫＶＲＫＩＧＥＬＶ ＲＹＬＮＴＮＰ
ＶＧＧ ＬＬＥＹＡＲＳＨＧＦ ＡＡＥＦＫＬＶＤＱＳ ＧＰＰＨＥＰＫＦＶＹ ＱＡＫ
ＶＧＧＲＷＦＰ ＡＶＣＡＨＳＫＫＱＧ ＫＱＥＡＡＤＡＡＬＲ ＶＬＩＧＥＮＥＫＡＥ
ＲＭＧＦＴＥＶＴＰＶ ＴＧＡＳＬＲＲＴＭＬ ＬＬＳＲＳＰＥＡＱＰ ＫＴＬＰＬＴ
ＧＳＴＦ ＨＤＱＩＡＭＬＳＨＲ ＣＦＮＴＬＴＮＳＦＱ ＰＳＬＬＧＲＫＩＬＡ ＡＩ
ＩＭＫＫＤＳＥＤ ＭＧＶＶＶＳＬＧＴＧ ＮＲＣＶＫＧＤＳＬＳ ＬＫＧＥＴＶＮＤＣ
Ｈ ＡＥＩＩＳＲＲＧＦＩ ＲＦＬＹＳＥＬＭＫＹ ＮＳＱＴＡＫＤＳＩＦ ＥＰＡＫＧ
ＧＥＫＬＱ ＩＫＫＴＶＳＦＨＬＹ ＩＳＴＡＰＣＧＤＧＡ ＬＦＤＫＳＣＳＤＲＡ Ｍ
ＥＳＴＥＳＲＨＹＰ ＶＦＥＮＰＫＱＧＫＬ ＲＴＫＶＥＮＧＥＧＴ ＩＰＶＥＳＳＤＩ
ＶＰ ＴＷＤＧＩＲＬＧＥＲ ＬＲＴＭＳＣＳＤＫＩ ＬＲＷＮＶＬＧＬＱＧ ＡＬＬＴ
ＨＦＬＱＰＩ ＹＬＫＳＶＴＬＧＹＬ ＦＳＱＧＨＬＴＲＡＩ ＣＣＲＶＴＲＤＧＳＡ
ＦＥＤＧＬＲＨＰＦＩ ＶＮＨＰＫＶＧＲＶＳ ＩＹＤＳＫＲＱＳＧＫ ＴＫＥＴＳＶＮ
ＷＣＬ ＡＤＧＹＤＬＥＩＬＤ ＧＴＲＧＴＶＤＧＰＲ ＮＥＬＳＲＶＳＫＫＮ ＩＦＬ
ＬＦＫＫＬＣＳ ＦＲＹＲＲＤＬＬＲＬ ＳＹＧＥＡＫＫＡＡＲ ＤＹＥＴＡＫＮＹＦＫ
ＫＧＬＫＤＭＧＹＧＮ ＷＩＳＫＰＱＥＥＫＮ ＦＹＬＣＰＶ（配列番号７２）である
。
【0026】
特定の実施形態では、ＡＤＡＲ１のデアミナーゼドメインが、配列番号７２のアミノ酸
８３９～１２２２を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、そのデアミナーゼド
メインの配列番号７２との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％
または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１
００％の相同性または同一性を有する配列を含む。
８３９～１２２２を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、そのデアミナーゼド
メインの配列番号７２との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％
または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１
００％の相同性または同一性を有する配列を含む。
【0027】
特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインを含
む。特定の実施形態では、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインが、ＧｅｎＢａｎｋ寄
託番号Ｕ８２１２０のアミノ酸２９９～７０１を含む。特定の実施形態では、ＡＤＡＲ２
またはそのデアミナーゼドメインが、Ｅ４８８Ｑ突然変異を含む（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏ
ｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４
：ｅ１５７）。特定の実施形態では、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインが、
ＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤ
ＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲ
ＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧ
ＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩ
ＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫ
ＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴ
ＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧ
ＥＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳ
ＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶ
ＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧ
ＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡ
ＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦ
ＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭ
ＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬ
ＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷ
ＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳ
ＬＴＰ（配列番号５５；Ｅ４８８が示される）を含む。
む。特定の実施形態では、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインが、ＧｅｎＢａｎｋ寄
託番号Ｕ８２１２０のアミノ酸２９９～７０１を含む。特定の実施形態では、ＡＤＡＲ２
またはそのデアミナーゼドメインが、Ｅ４８８Ｑ突然変異を含む（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏ
ｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４
：ｅ１５７）。特定の実施形態では、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインが、
ＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤ
ＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲ
ＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧ
ＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩ
ＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫ
ＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴ
ＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧ
ＥＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳ
ＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶ
ＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧ
ＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡ
ＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦ
ＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭ
ＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬ
ＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷ
ＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳ
ＬＴＰ（配列番号５５；Ｅ４８８が示される）を含む。
【0028】
特定の実施形態では、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインが、
ＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤ
ＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲ
ＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧ
ＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩ
ＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫ
ＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴ
ＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧ
ＱＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳ
ＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶ
ＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧ
ＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡ
ＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦ
ＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭ
ＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬ
ＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷ
ＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳ
ＬＴＰ（配列番号７１；Ｅ４８８Ｑが示される）を含む。
ＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤ
ＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲ
ＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧ
ＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩ
ＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫ
ＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴ
ＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧ
ＱＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳ
ＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶ
ＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧ
ＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡ
ＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦ
ＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭ
ＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬ
ＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷ
ＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳ
ＬＴＰ（配列番号７１；Ｅ４８８Ｑが示される）を含む。
【0029】
特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、配列番号５５または７１との少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特
に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列
を含む。
％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特
に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列
を含む。
【0030】
上記のように、ＲＮＡ編集酵素はＲＮＡ結合ドメインに連結されている。ＲＮＡ編集酵
素が、ＲＮＡ結合ドメインに直接（すなわち、リンカー配列なしで）連結されてもよいし
、またはポリペプチドリンカーを介して連結されてもよい。例えば、ポリペプチドリンカ
ーは、１～約５０個のアミノ酸、１～約２５個のアミノ酸、１～約２０個のアミノ酸、１
～約１５個のアミノ酸、１～約１０個のアミノ酸、または１～約５個のアミノ酸を含み得
る。特定の実施形態では、リンカーが、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４４）を含み（
式中、ｎは、１～約１０、特に１～約５である）を含む。例えば、リンカー配列は、ＧＧ
ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）であり得る。種々の実施形態では、リンカ
ーが、上記の配列（例えば、配列番号４４または４５）中に、これらの配列が１つまたは
複数の置換、付加または欠失（例えば、約１、または約２、または約３、または約４、ま
たは約５、または約１０、または約１５（約１～５、または約１～１０、または約１～１
５を含む）の置換、付加または欠失）を含むように、突然変異／変異を含み得る。
素が、ＲＮＡ結合ドメインに直接（すなわち、リンカー配列なしで）連結されてもよいし
、またはポリペプチドリンカーを介して連結されてもよい。例えば、ポリペプチドリンカ
ーは、１～約５０個のアミノ酸、１～約２５個のアミノ酸、１～約２０個のアミノ酸、１
～約１５個のアミノ酸、１～約１０個のアミノ酸、または１～約５個のアミノ酸を含み得
る。特定の実施形態では、リンカーが、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４４）を含み（
式中、ｎは、１～約１０、特に１～約５である）を含む。例えば、リンカー配列は、ＧＧ
ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）であり得る。種々の実施形態では、リンカ
ーが、上記の配列（例えば、配列番号４４または４５）中に、これらの配列が１つまたは
複数の置換、付加または欠失（例えば、約１、または約２、または約３、または約４、ま
たは約５、または約１０、または約１５（約１～５、または約１～１０、または約１～１
５を含む）の置換、付加または欠失）を含むように、突然変異／変異を含み得る。
【0031】
ＲＮＡ結合ドメインは、特定のＲＮＡ配列および／またはＲＮＡ構造（例えば、ヘアピ
ン）を特異的に認識する任意のポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ結
合ドメインが、人工ＲＮＡ結合ドメイン、特にＲＮＡに対して高い親和性を有するもので
ある。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインが、ファージＲＮＡ結合ドメインである
（例えば、Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００８
）１００：１２５－１３８参照）。例えば、ＲＮＡ結合ドメインは、λＮペプチド（例え
ば、Ｃｉｌｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ（１９９７）３：５７－６７参照）またはファ
ージＭＳ２コートタンパク質（例えば、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍ．Ｖｉ
ｒｏｌ．（１９９７）８：１７６－１８５参照）である。特定の実施形態では、λＮペプ
チドが、アミノ酸配列：ＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ（配列番号４６
）を含む。特定の実施形態では、λＮペプチドが、配列番号４６との少なくとも８０％、
８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少
なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含
む。
ン）を特異的に認識する任意のポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ結
合ドメインが、人工ＲＮＡ結合ドメイン、特にＲＮＡに対して高い親和性を有するもので
ある。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインが、ファージＲＮＡ結合ドメインである
（例えば、Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００８
）１００：１２５－１３８参照）。例えば、ＲＮＡ結合ドメインは、λＮペプチド（例え
ば、Ｃｉｌｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ（１９９７）３：５７－６７参照）またはファ
ージＭＳ２コートタンパク質（例えば、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍ．Ｖｉ
ｒｏｌ．（１９９７）８：１７６－１８５参照）である。特定の実施形態では、λＮペプ
チドが、アミノ酸配列：ＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ（配列番号４６
）を含む。特定の実施形態では、λＮペプチドが、配列番号４６との少なくとも８０％、
８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少
なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含
む。
【0032】
実施形態では、融合タンパク質が、アミノ酸リンカーを介してヒトＡＤＡＲ２のデアミ
ナーゼドメイン（例えば、配列番号５５または７１）のアミノ末端に連結されたλＮペプ
チド（配列番号４６）を含む。特定の実施形態では、リンカーが、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ
（配列番号４４；式中、ｎは１～約１０または１～約５である）または配列ＧＧＧＧＳＧ
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質が、
配列：
ＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＨ
ＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰ
ＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲＲＫ
ＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴ
ＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩＳＲ
ＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬ
ＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴＳＰ
ＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥ
ＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧＥＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳＩＱ
ＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬ
ＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧＳＬ
ＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹ
ＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦＳＶ
ＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶ
ＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬＲＳ
ＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳ
ＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳＬＴ
Ｐ（配列番号６８）を含む。
ナーゼドメイン（例えば、配列番号５５または７１）のアミノ末端に連結されたλＮペプ
チド（配列番号４６）を含む。特定の実施形態では、リンカーが、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ
（配列番号４４；式中、ｎは１～約１０または１～約５である）または配列ＧＧＧＧＳＧ
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質が、
配列：
ＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＨ
ＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰ
ＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲＲＫ
ＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴ
ＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩＳＲ
ＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬ
ＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴＳＰ
ＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥ
ＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧＥＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳＩＱ
ＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬ
ＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧＳＬ
ＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹ
ＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦＳＶ
ＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶ
ＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬＲＳ
ＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳ
ＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳＬＴ
Ｐ（配列番号６８）を含む。
【0033】
特定の実施形態では、融合タンパク質が、Ｎ末端で少なくとも１つのＮＬＳをさらに含
む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例えば、配列番号４
７）を含む。特定の実施形態では、融合体が、３つのＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例え
ば、配列番号６７）を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質が、配列：
ＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱ
ＡＱＷＫＡＡＮＧＧＧＧ
ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡ
ＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤ
ＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫ
ＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧ
ＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦ
ＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫ
ＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡ
ＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧ
ＥＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶ
ＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶ
ＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬ
ＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡ
ＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲ
ＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭ
ＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦ
ＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷ
ＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳＬＴＰ（配列番号６９）を含む。
む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例えば、配列番号４
７）を含む。特定の実施形態では、融合体が、３つのＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例え
ば、配列番号６７）を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質が、配列：
ＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱ
ＡＱＷＫＡＡＮＧＧＧＧ
ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡ
ＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤ
ＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫ
ＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧ
ＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦ
ＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫ
ＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡ
ＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧ
ＥＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶ
ＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶ
ＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬ
ＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡ
ＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲ
ＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭ
ＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦ
ＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷ
ＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳＬＴＰ（配列番号６９）を含む。
【0034】
特定の実施形態では、融合タンパク質が、配列番号６８または６９との少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特
に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列
を含む。
％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特
に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列
を含む。
【0035】
本発明のガイドＲＮＡは、標的配列を標的とするまたはこれに特異的にハイブリダイズ
する配列（例えば、相補的配列）、およびＲＮＡ結合ドメインによって認識される配列を
含む。ガイドＲＮＡは、変更または編集されるヌクレオチド（例えば、アデノシン）に向
けられた標的配列とのミスマッチを含む。本明細書で使用される場合、「特異的にハイブ
リダイズする」という用語は、核酸分子が標的配列と１００％相補的である必要があるこ
とを意味しない。むしろ、変更／編集される（１又は複数の）ミスマッチヌクレオチドを
含まない配列は、標的配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９
％または１００％相補的、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％相補的
であり得る。しかしながら、本明細書で説明されるように、配列は、オフターゲット編集
を減少させるために、追加のミスマッチ（例えば、Ｇミスマッチ）を含み得る。実施形態
では、配列が、約１個、または約２個、または約３個、または約４個、または約５個、ま
たは約１０個、または約１５個（約１～５個、または約１～１０個、または約１～１５個
を含む）のミスマッチを含み得る。特定の実施形態では、相補性の領域（例えば、ガイド
ＲＮＡと標的配列との間）が、少なくとも約１０個、少なくとも約１２個、少なくとも約
１５個、少なくとも約１７個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約
３０個、少なくとも約３５個、またはそれ以上のヌクレオチドである。特定の実施形態で
は、相補性の領域（例えば、ガイドＲＮＡと標的配列との間）が、約１５～約３０個のヌ
クレオチド、約１５～約２５個のヌクレオチド、約２０～約３０個のヌクレオチド、約２
０～約２５個のヌクレオチド、または約２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、また
は２５個のヌクレオチドである。典型的には、ガイドＲＮＡと標的配列との間のミスマッ
チが、ガイドＲＮＡと標的配列との間の相補性の領域の中央（例えば、ガイドＲＮＡ配列
の中央５０％以内）に向かっている。特定の実施形態では、標的配列が配列番号５２を含
む。
する配列（例えば、相補的配列）、およびＲＮＡ結合ドメインによって認識される配列を
含む。ガイドＲＮＡは、変更または編集されるヌクレオチド（例えば、アデノシン）に向
けられた標的配列とのミスマッチを含む。本明細書で使用される場合、「特異的にハイブ
リダイズする」という用語は、核酸分子が標的配列と１００％相補的である必要があるこ
とを意味しない。むしろ、変更／編集される（１又は複数の）ミスマッチヌクレオチドを
含まない配列は、標的配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９
％または１００％相補的、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％相補的
であり得る。しかしながら、本明細書で説明されるように、配列は、オフターゲット編集
を減少させるために、追加のミスマッチ（例えば、Ｇミスマッチ）を含み得る。実施形態
では、配列が、約１個、または約２個、または約３個、または約４個、または約５個、ま
たは約１０個、または約１５個（約１～５個、または約１～１０個、または約１～１５個
を含む）のミスマッチを含み得る。特定の実施形態では、相補性の領域（例えば、ガイド
ＲＮＡと標的配列との間）が、少なくとも約１０個、少なくとも約１２個、少なくとも約
１５個、少なくとも約１７個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約
３０個、少なくとも約３５個、またはそれ以上のヌクレオチドである。特定の実施形態で
は、相補性の領域（例えば、ガイドＲＮＡと標的配列との間）が、約１５～約３０個のヌ
クレオチド、約１５～約２５個のヌクレオチド、約２０～約３０個のヌクレオチド、約２
０～約２５個のヌクレオチド、または約２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、また
は２５個のヌクレオチドである。典型的には、ガイドＲＮＡと標的配列との間のミスマッ
チが、ガイドＲＮＡと標的配列との間の相補性の領域の中央（例えば、ガイドＲＮＡ配列
の中央５０％以内）に向かっている。特定の実施形態では、標的配列が配列番号５２を含
む。
【0036】
ガイドＲＮＡは、細胞内のＲＮＡに対する正しいまたは所望の編集を含む。ガイドＲＮ
Ａを使用して、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異を含む、任意の突然変異、
特に点突然変異を修正することができる。例えば、レット症候群では、共通のＧ＞Ａ突然
変異が存在する。これらの突然変異により、アミノ酸変化Ｒ１０６Ｑ（ＣＡＡ）、Ｗ１０
４Ｘ（ＵＡＧ）およびＲ３０６Ｈ（ＣＡＣ）が得られる。ナンセンス突然変異の場合、こ
れらはＣからＴへの突然変異で、Ａが３’位置にあって終止コドンを形成する、または中
央位置にある（例えば、ＵＡＧからＵＧＧ）。ナンセンス突然変異を編集して、終止コド
ンを削除することができる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、（例えば、ＡＤＡＲ
によって）Ａが脱アミノ化され得るように、これらの突然変異体のＡと一致するＣを含む
。
Ａを使用して、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異を含む、任意の突然変異、
特に点突然変異を修正することができる。例えば、レット症候群では、共通のＧ＞Ａ突然
変異が存在する。これらの突然変異により、アミノ酸変化Ｒ１０６Ｑ（ＣＡＡ）、Ｗ１０
４Ｘ（ＵＡＧ）およびＲ３０６Ｈ（ＣＡＣ）が得られる。ナンセンス突然変異の場合、こ
れらはＣからＴへの突然変異で、Ａが３’位置にあって終止コドンを形成する、または中
央位置にある（例えば、ＵＡＧからＵＧＧ）。ナンセンス突然変異を編集して、終止コド
ンを削除することができる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、（例えば、ＡＤＡＲ
によって）Ａが脱アミノ化され得るように、これらの突然変異体のＡと一致するＣを含む
。
【0037】
本発明のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される１つまたは複数の配
列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡ結合ドメインによって認識され
る２つの配列を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される２つ
の配列が、ミスマッチまたは標的配列と特異的にハイブリダイズする配列の両側にあり得
る。例えば、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される１つの配列（例えば、ＢｏｘＢ）が
、標的突然変異の約１５～２０または約１６～１８ヌクレオチド５’に位置し、ＲＮＡ結
合ドメインによって認識される第２の配列（例えば、ＢｏｘＢ）が、標的突然変異の約８
～１２または約１０ヌクレオチド３’に位置する。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメ
インによって認識される配列が、ガイドＲＮＡの末端にない（すなわち、ガイドＲＮＡの
末端の配列が標的配列と相補的であり得る）。ＲＮＡ結合ドメインによって認識される２
つ以上の配列が存在する場合、それらの配列は同じであっても異なっていてもよいが、好
ましくは同じＲＮＡ結合ドメインによって認識される。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合
ドメインによって認識される配列がＢｏｘＢ配列である。特定の実施形態では、ＢｏｘＢ
配列が、ＧＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣ（配列番号４８）またはＧＧＣＣＣＵＧＡＡＡ
ＡＡＧＧＧＣＣ（配列番号４９）を含む。特定の実施形態では、ＢｏｘＢ配列が、配列番
号４８または４９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％また
は１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００
％の相同性または同一性を有する。
列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡ結合ドメインによって認識され
る２つの配列を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される２つ
の配列が、ミスマッチまたは標的配列と特異的にハイブリダイズする配列の両側にあり得
る。例えば、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される１つの配列（例えば、ＢｏｘＢ）が
、標的突然変異の約１５～２０または約１６～１８ヌクレオチド５’に位置し、ＲＮＡ結
合ドメインによって認識される第２の配列（例えば、ＢｏｘＢ）が、標的突然変異の約８
～１２または約１０ヌクレオチド３’に位置する。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメ
インによって認識される配列が、ガイドＲＮＡの末端にない（すなわち、ガイドＲＮＡの
末端の配列が標的配列と相補的であり得る）。ＲＮＡ結合ドメインによって認識される２
つ以上の配列が存在する場合、それらの配列は同じであっても異なっていてもよいが、好
ましくは同じＲＮＡ結合ドメインによって認識される。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合
ドメインによって認識される配列がＢｏｘＢ配列である。特定の実施形態では、ＢｏｘＢ
配列が、ＧＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣ（配列番号４８）またはＧＧＣＣＣＵＧＡＡＡ
ＡＡＧＧＧＣＣ（配列番号４９）を含む。特定の実施形態では、ＢｏｘＢ配列が、配列番
号４８または４９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％また
は１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００
％の相同性または同一性を有する。
【0038】
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、表１に示される配列（ＤＮＡ分子のＲＮＡバー
ジョンを含む）を標的とする、または配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが
、表１に示される配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％
または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１
００％の相同性または同一性を有する配列を標的とするまたは配列を含む。特定の実施形
態では、ガイドＲＮＡが、配列番号１５～２２、特に配列番号１５、１７、１９または２
１の１つを含む、あるいは配列番号１５～２２、特に配列番号１５、１７、１９または２
１の１つとの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００
％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同
性または同一性を有する配列を含む。
ジョンを含む）を標的とする、または配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが
、表１に示される配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％
または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１
００％の相同性または同一性を有する配列を標的とするまたは配列を含む。特定の実施形
態では、ガイドＲＮＡが、配列番号１５～２２、特に配列番号１５、１７、１９または２
１の１つを含む、あるいは配列番号１５～２２、特に配列番号１５、１７、１９または２
１の１つとの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００
％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同
性または同一性を有する配列を含む。
【0039】
ガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸分子は、ガイドＲＮＡをコードする核酸
配列の複数のコピーを含み得る。例えば、核酸分子は、それぞれプロモーターの制御下に
ある、ガイドＲＮＡをコードする核酸配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、またはそれ以上のコピーを含み得る。
配列の複数のコピーを含み得る。例えば、核酸分子は、それぞれプロモーターの制御下に
ある、ガイドＲＮＡをコードする核酸配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、またはそれ以上のコピーを含み得る。
【0040】
特定の実施形態では、本発明の核酸分子が、ベクター（例えば、プラスミド）、特にウ
イルスベクターを介して、細胞に送達され（例えば、感染、トランスフェクション、電気
穿孔等を介して）、発現される。本発明の発現ベクターは、強力なプロモーター、構成的
プロモーター、組織もしくは細胞特異的プロモーター、ユビキタスプロモーター、および
／または制御プロモーターを使用することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ド
メインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子のプロモーターが、
組織または細胞特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターがニュー
ロン特異的プロモーターまたはユビキタスプロモーターである。プロモーターの例は、当
技術分野で周知であり、それだけに限らないが、シナプスプロモーター、特にシナプシン
Ｉプロモーター、ＣＡＧプロモーターおよびＭＥＣＰ２プロモーターを含む。ガイドＲＮ
Ａに関して、ＲＮＡプロモーターの例は当該分野で周知であり、それだけに限らないが、
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６およびＨ１；例えば、Ｍｙｓｌｉ
ｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２５０２
－０９）または短ＲＮＡを発現することが知られている他のプロモーターを含む。特定の
実施形態では、プロモーターがヒトＵ６プロモーターである。本発明の分子を発現するた
めの発現ベクターの例としては、限定されないが、プラスミドおよびウイルスベクター（
例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルスおよびレンチ
ウイルス）が挙げられる。特定の実施形態では、ベクターがＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ－１
～ＡＡＶ－１２および他の血清型およびハイブリッドＡＡＶベクター；例えば、ＡＡＶ１
、またはＡＡＶ２、またはＡＡＶ３、またはＡＡＶ４、またはＡＡＶ５、またはＡＡＶ６
、またはＡＡＶ７、またはＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０、またはＡＡＶ
１１、またはＡＡＶ１２）である。特定の実施形態では、ベクターが、ニューロンおよび
／またはグリアに感染することができる。
イルスベクターを介して、細胞に送達され（例えば、感染、トランスフェクション、電気
穿孔等を介して）、発現される。本発明の発現ベクターは、強力なプロモーター、構成的
プロモーター、組織もしくは細胞特異的プロモーター、ユビキタスプロモーター、および
／または制御プロモーターを使用することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ド
メインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子のプロモーターが、
組織または細胞特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターがニュー
ロン特異的プロモーターまたはユビキタスプロモーターである。プロモーターの例は、当
技術分野で周知であり、それだけに限らないが、シナプスプロモーター、特にシナプシン
Ｉプロモーター、ＣＡＧプロモーターおよびＭＥＣＰ２プロモーターを含む。ガイドＲＮ
Ａに関して、ＲＮＡプロモーターの例は当該分野で周知であり、それだけに限らないが、
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６およびＨ１；例えば、Ｍｙｓｌｉ
ｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２５０２
－０９）または短ＲＮＡを発現することが知られている他のプロモーターを含む。特定の
実施形態では、プロモーターがヒトＵ６プロモーターである。本発明の分子を発現するた
めの発現ベクターの例としては、限定されないが、プラスミドおよびウイルスベクター（
例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルスおよびレンチ
ウイルス）が挙げられる。特定の実施形態では、ベクターがＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ－１
～ＡＡＶ－１２および他の血清型およびハイブリッドＡＡＶベクター；例えば、ＡＡＶ１
、またはＡＡＶ２、またはＡＡＶ３、またはＡＡＶ４、またはＡＡＶ５、またはＡＡＶ６
、またはＡＡＶ７、またはＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０、またはＡＡＶ
１１、またはＡＡＶ１２）である。特定の実施形態では、ベクターが、ニューロンおよび
／またはグリアに感染することができる。
【0041】
別の態様によると、ＲＮＡ編集および治療方法を含む本発明の方法が、上記のように、
ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を細胞に送達するステップを含むが、
ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子を使用
しない。ＡＤＡＲ（例えば、ＡＤＡＲ １～３）は、神経系で高レベルまで発現される。
よって、本発明のガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲ酵素、特にＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２など
の内因性デアミナーゼ酵素を内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡに引き付けることができる。よっ
て、実施形態では、本発明は、内因性ＡＤＡＲ酵素の関与を可能にし、組換えＡＤＡＲ酵
素を必要としない。ガイドＲＮＡのみを使用することによって、非哺乳動物ＲＮＡ結合ド
メインに対する潜在的な免疫応答が回避される。さらに、この方法によって、高度反復性
ガイド配列をＡＡＶベクターに含めることが可能になり、オフターゲット編集が減少する
。本発明のこの態様の特定の実施形態では、ガイドが、標的配列を標的とするまたはこれ
に特異的にハイブリダイズする配列（例えば、相補的配列）、およびデアミナーゼ、特に
ＡＤＡＲ（例えば、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２）によって認識される配列を含む。ガイ
ドＲＮＡは、限定されないが、ＲＮＡヘアピン（例えば、ＡＤＡＲの自然標的に基づく）
、ＡＤＡＲによって認識される二本鎖「バルジ」を作成するミスマッチ、および／または
内因性ＡＤＡＲによる標的編集で通常必要とされる任意の他の配列を含み得る。特定の実
施形態では、ガイドＲＮＡが、１つ、２つ、またはそれ以上のＢｏｘＢ配列を含む。特定
の実施形態では、ガイドＲＮＡが、ＧｌｕＲ２からのＲ／Ｇ結合部位を含む（Ｗｅｔｔｅ
ｎｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４５（５
）：２７９７－２８０８；Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，
７：４１４７８；例えば、ＧＵＧＧＡＡＵＡＧＵＡＵＡＡＣＡＡ－ＵＡＵＧＣＵＡＡＡＵ
ＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＵＡＵＣＣＣＡＣ（配列番号７０）、あるいは少なくとも８０％、
８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少
なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含
む）。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、内部ループを有することを含む（Ｌｅｈｍ
ａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９１（１）：１－１３；
例えば、４個、６個、８個、１０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含むループ）。特
定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、ＭＥＣＰ２ ＲＮＡと相補的な領域、編集用のミス
マッチ（例えば、Ａ：Ｃ）を含み、オフターゲット編集用のＡ：Ｇミスマッチを含んでい
てもよい。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子が、本明細書に記載
されるベクター内に含まれる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、Ｕ６プロモーター
または低分子ＲＮＡを発現する他のプロモーターから発現される。
ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を細胞に送達するステップを含むが、
ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子を使用
しない。ＡＤＡＲ（例えば、ＡＤＡＲ １～３）は、神経系で高レベルまで発現される。
よって、本発明のガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲ酵素、特にＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２など
の内因性デアミナーゼ酵素を内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡに引き付けることができる。よっ
て、実施形態では、本発明は、内因性ＡＤＡＲ酵素の関与を可能にし、組換えＡＤＡＲ酵
素を必要としない。ガイドＲＮＡのみを使用することによって、非哺乳動物ＲＮＡ結合ド
メインに対する潜在的な免疫応答が回避される。さらに、この方法によって、高度反復性
ガイド配列をＡＡＶベクターに含めることが可能になり、オフターゲット編集が減少する
。本発明のこの態様の特定の実施形態では、ガイドが、標的配列を標的とするまたはこれ
に特異的にハイブリダイズする配列（例えば、相補的配列）、およびデアミナーゼ、特に
ＡＤＡＲ（例えば、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２）によって認識される配列を含む。ガイ
ドＲＮＡは、限定されないが、ＲＮＡヘアピン（例えば、ＡＤＡＲの自然標的に基づく）
、ＡＤＡＲによって認識される二本鎖「バルジ」を作成するミスマッチ、および／または
内因性ＡＤＡＲによる標的編集で通常必要とされる任意の他の配列を含み得る。特定の実
施形態では、ガイドＲＮＡが、１つ、２つ、またはそれ以上のＢｏｘＢ配列を含む。特定
の実施形態では、ガイドＲＮＡが、ＧｌｕＲ２からのＲ／Ｇ結合部位を含む（Ｗｅｔｔｅ
ｎｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４５（５
）：２７９７－２８０８；Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，
７：４１４７８；例えば、ＧＵＧＧＡＡＵＡＧＵＡＵＡＡＣＡＡ－ＵＡＵＧＣＵＡＡＡＵ
ＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＵＡＵＣＣＣＡＣ（配列番号７０）、あるいは少なくとも８０％、
８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少
なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含
む）。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、内部ループを有することを含む（Ｌｅｈｍ
ａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９１（１）：１－１３；
例えば、４個、６個、８個、１０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含むループ）。特
定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、ＭＥＣＰ２ ＲＮＡと相補的な領域、編集用のミス
マッチ（例えば、Ａ：Ｃ）を含み、オフターゲット編集用のＡ：Ｇミスマッチを含んでい
てもよい。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子が、本明細書に記載
されるベクター内に含まれる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、Ｕ６プロモーター
または低分子ＲＮＡを発現する他のプロモーターから発現される。
【0042】
本発明によると、中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法が
提供される。本発明によると、進行性神経発達疾患を処置、抑制および／または予防する
方法が提供される。例えば、本発明は、実施形態で、対象のＲＮＡの突然変異を特徴とす
る遺伝性中枢神経系疾患の処置、抑制および／または予防を提供する。実施形態では、本
発明は、異常なＧ突然変異の回復によるＲＮＡの正常タンパク質への翻訳を直接的または
間接的に回復することによって、例えば読み取られるＲＮＡをＧとして編集することによ
って、進行性神経発達疾患を処置、抑制および／または予防する方法を提供する。
提供される。本発明によると、進行性神経発達疾患を処置、抑制および／または予防する
方法が提供される。例えば、本発明は、実施形態で、対象のＲＮＡの突然変異を特徴とす
る遺伝性中枢神経系疾患の処置、抑制および／または予防を提供する。実施形態では、本
発明は、異常なＧ突然変異の回復によるＲＮＡの正常タンパク質への翻訳を直接的または
間接的に回復することによって、例えば読み取られるＲＮＡをＧとして編集することによ
って、進行性神経発達疾患を処置、抑制および／または予防する方法を提供する。
【0043】
本発明によると、レット症候群を含む進行性神経発達疾患を含む、中枢神経系の遺伝性
疾患を処置、抑制および／または予防する方法は、インビボまたはエキソビボで有効であ
る。例えば、インビボ法の場合、（１又は複数の）本核酸分子（例えば、記載される融合
タンパク質をコードする、例えば、記載されるガイドＲＮＡをコードする）を対象に投与
する。エキソビボ法では、細胞（同系または同種）を本核酸分子（例えば、記載される融
合タンパク質をコードする、例えば、記載されるガイドＲＮＡをコードする）と接触させ
、対象に導入する。処置に関する実施形態は、インビボ法およびエキソビボ法に等しく適
用される。
疾患を処置、抑制および／または予防する方法は、インビボまたはエキソビボで有効であ
る。例えば、インビボ法の場合、（１又は複数の）本核酸分子（例えば、記載される融合
タンパク質をコードする、例えば、記載されるガイドＲＮＡをコードする）を対象に投与
する。エキソビボ法では、細胞（同系または同種）を本核酸分子（例えば、記載される融
合タンパク質をコードする、例えば、記載されるガイドＲＮＡをコードする）と接触させ
、対象に導入する。処置に関する実施形態は、インビボ法およびエキソビボ法に等しく適
用される。
【0044】
本発明によると、ＭＥＣＰ２遺伝子に関連する遺伝性疾患を処置、抑制および／または
予防する方法が提供される。実施形態では、本発明は、機能的ＭＥＣＰ２タンパク質のレ
ベルを非疾患または健康な対象のレベルまで回復するための、例えばＲＮＡレベルでの、
遺伝子編集を提供する。Ｍｅｃｐ２は、ヒトまたはマウス、特にヒトであり得る。実施形
態では、本発明は、疾患状態に対して機能的ＭＥＣＰ２タンパク質のレベルを上昇させる
ための、例えばＲＮＡレベルでの、遺伝子編集を提供する。実施形態では、ＭＥＣＰ２遺
伝子に関連する遺伝性疾患が、新生児脳症、小頭症、Ｘ連鎖知的障害、ＰＰＭ－Ｘ症候群
（躁うつ病、錐体路徴候、パーキンソン症候群および巨精巣症）、双極性障害、パーキン
ソン症候群、筋緊張増加、誇大反射、および巨精巣症、またはこれらの組み合わせである
。実施形態では、ＭＥＣＰ２遺伝子に関連する遺伝性疾患が、男性または女性対象に影響
を及ぼす。
予防する方法が提供される。実施形態では、本発明は、機能的ＭＥＣＰ２タンパク質のレ
ベルを非疾患または健康な対象のレベルまで回復するための、例えばＲＮＡレベルでの、
遺伝子編集を提供する。Ｍｅｃｐ２は、ヒトまたはマウス、特にヒトであり得る。実施形
態では、本発明は、疾患状態に対して機能的ＭＥＣＰ２タンパク質のレベルを上昇させる
ための、例えばＲＮＡレベルでの、遺伝子編集を提供する。実施形態では、ＭＥＣＰ２遺
伝子に関連する遺伝性疾患が、新生児脳症、小頭症、Ｘ連鎖知的障害、ＰＰＭ－Ｘ症候群
（躁うつ病、錐体路徴候、パーキンソン症候群および巨精巣症）、双極性障害、パーキン
ソン症候群、筋緊張増加、誇大反射、および巨精巣症、またはこれらの組み合わせである
。実施形態では、ＭＥＣＰ２遺伝子に関連する遺伝性疾患が、男性または女性対象に影響
を及ぼす。
【0045】
本発明によると、レット症候群を処置、抑制および／または予防する方法が提供される
。特定の実施形態では、レット症候群が、ＭｅＣＰ２のＧ＞Ａ突然変異を特徴とする。例
えば、レット症候群は、ＭＥＣＰ２のＲ１０６Ｑ、Ｗ１０４ＸまたはＲ３０６Ｈ変異を特
徴とし得る。ヒトＭＥＣＰ２の例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａ
ｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４２０４およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００４９９２．３
およびＮＰ＿００４９８３．１で提供される（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１１１
０７９２．１、ＮＰ＿００１１０４２６２．１、ＮＭ＿００１３１６３３７．１およびＮ
Ｐ＿００１３０３２６６．１のアイソフォームも参照）。特定の実施形態では、レット症
候群が、ＭｅＣＰ２のＲ１０６Ｑ突然変異を含む。特定の実施形態では、本方法が、ＲＮ
Ａ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子、およびガ
イドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子を投与するステップを含む。特定の
実施形態では、本方法が、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子を投与
するステップを含む。核酸分子は、対象に直接投与され得る、または細胞に送達され、次
いで、これが対象に投与され得る。
。特定の実施形態では、レット症候群が、ＭｅＣＰ２のＧ＞Ａ突然変異を特徴とする。例
えば、レット症候群は、ＭＥＣＰ２のＲ１０６Ｑ、Ｗ１０４ＸまたはＲ３０６Ｈ変異を特
徴とし得る。ヒトＭＥＣＰ２の例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａ
ｎｋ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４２０４およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００４９９２．３
およびＮＰ＿００４９８３．１で提供される（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１１１
０７９２．１、ＮＰ＿００１１０４２６２．１、ＮＭ＿００１３１６３３７．１およびＮ
Ｐ＿００１３０３２６６．１のアイソフォームも参照）。特定の実施形態では、レット症
候群が、ＭｅＣＰ２のＲ１０６Ｑ突然変異を含む。特定の実施形態では、本方法が、ＲＮ
Ａ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子、およびガ
イドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子を投与するステップを含む。特定の
実施形態では、本方法が、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子を投与
するステップを含む。核酸分子は、対象に直接投与され得る、または細胞に送達され、次
いで、これが対象に投与され得る。
【0046】
特定の実施形態では、ＭＥＣＰ２のアミノ酸配列が、
ＭＶＡＧＭＬＧＬＲＥ ＥＫＳＥＤＱＤＬＱＧ ＬＫＤＫＰＬＫＦＫＫ ＶＫＫＤＫＫ
ＥＥＫＥ ＧＫＨＥＰＶＱＰＳＡ
ＨＨＳＡＥＰＡＥＡＧ ＫＡＥＴＳＥＧＳＧＳ ＡＰＡＶＰＥＡＳＡＳ ＰＫＱＲＲＳ
ＩＩＲＤ ＲＧＰＭＹＤＤＰＴＬ
ＰＥＧＷＴＲＫＬＫＱ ＲＫＳＧＲＳＡＧＫＹ ＤＶＹＬＩＮＰＱＧＫ ＡＦＲＳＫＶ
ＥＬＩＡ ＹＦＥＫＶＧＤＴＳＬ ＤＰＮＤＦＤＦＴＶＴ ＧＲＧＳＰＳＲＲＥＱ ＫＰ
ＰＫＫＰＫＳＰＫ ＡＰＧＴＧＲＧＲＧＲ ＰＫＧＳＧＴＴＲＰＫ
ＡＡＴＳＥＧＶＱＶＫ ＲＶＬＥＫＳＰＧＫＬ ＬＶＫＭＰＦＱＴＳＰ ＧＧＫＡＥＧ
ＧＧＡＴ ＴＳＴＱＶＭＶＩＫＲ
ＰＧＲＫＲＫＡＥＡＤ ＰＱＡＩＰＫＫＲＧＲ ＫＰＧＳＶＶＡＡＡＡ ＡＥＡＫＫＫ
ＡＶＫＥ ＳＳＩＲＳＶＱＥＴＶ
ＬＰＩＫＫＲＫＴＲＥ ＴＶＳＩＥＶＫＥＶＶ ＫＰＬＬＶＳＴＬＧＥ ＫＳＧＫＧＬ
ＫＴＣＫ ＳＰＧＲＫＳＫＥＳＳ ＰＫＧＲＳＳＳＡＳＳ ＰＰＫＫＥＨＨＨＨＨ ＨＨ
ＳＥＳＰＫＡＰＶ ＰＬＬＰＰＬＰＰＰＰ ＰＥＰＥＳＳＥＤＰＴ ＳＰＰＥＰＱＤＬＳ
Ｓ ＳＶＣＫＥＥＫＭＰＲ ＧＧＳＬＥＳＤＧＣＰ ＫＥＰＡＫＴＱＰＡＶ ＡＴＡＡＴ
ＡＡＥＫＹ ＫＨＲＧＥＧＥＲＫＤ ＩＶＳＳＳＭＰＲＰＮ ＲＥＥＰＶＤＳＲＴＰ Ｖ
ＴＥＲＶＳ（配列番号５６）である。
ＭＶＡＧＭＬＧＬＲＥ ＥＫＳＥＤＱＤＬＱＧ ＬＫＤＫＰＬＫＦＫＫ ＶＫＫＤＫＫ
ＥＥＫＥ ＧＫＨＥＰＶＱＰＳＡ
ＨＨＳＡＥＰＡＥＡＧ ＫＡＥＴＳＥＧＳＧＳ ＡＰＡＶＰＥＡＳＡＳ ＰＫＱＲＲＳ
ＩＩＲＤ ＲＧＰＭＹＤＤＰＴＬ
ＰＥＧＷＴＲＫＬＫＱ ＲＫＳＧＲＳＡＧＫＹ ＤＶＹＬＩＮＰＱＧＫ ＡＦＲＳＫＶ
ＥＬＩＡ ＹＦＥＫＶＧＤＴＳＬ ＤＰＮＤＦＤＦＴＶＴ ＧＲＧＳＰＳＲＲＥＱ ＫＰ
ＰＫＫＰＫＳＰＫ ＡＰＧＴＧＲＧＲＧＲ ＰＫＧＳＧＴＴＲＰＫ
ＡＡＴＳＥＧＶＱＶＫ ＲＶＬＥＫＳＰＧＫＬ ＬＶＫＭＰＦＱＴＳＰ ＧＧＫＡＥＧ
ＧＧＡＴ ＴＳＴＱＶＭＶＩＫＲ
ＰＧＲＫＲＫＡＥＡＤ ＰＱＡＩＰＫＫＲＧＲ ＫＰＧＳＶＶＡＡＡＡ ＡＥＡＫＫＫ
ＡＶＫＥ ＳＳＩＲＳＶＱＥＴＶ
ＬＰＩＫＫＲＫＴＲＥ ＴＶＳＩＥＶＫＥＶＶ ＫＰＬＬＶＳＴＬＧＥ ＫＳＧＫＧＬ
ＫＴＣＫ ＳＰＧＲＫＳＫＥＳＳ ＰＫＧＲＳＳＳＡＳＳ ＰＰＫＫＥＨＨＨＨＨ ＨＨ
ＳＥＳＰＫＡＰＶ ＰＬＬＰＰＬＰＰＰＰ ＰＥＰＥＳＳＥＤＰＴ ＳＰＰＥＰＱＤＬＳ
Ｓ ＳＶＣＫＥＥＫＭＰＲ ＧＧＳＬＥＳＤＧＣＰ ＫＥＰＡＫＴＱＰＡＶ ＡＴＡＡＴ
ＡＡＥＫＹ ＫＨＲＧＥＧＥＲＫＤ ＩＶＳＳＳＭＰＲＰＮ ＲＥＥＰＶＤＳＲＴＰ Ｖ
ＴＥＲＶＳ（配列番号５６）である。
【0047】
Ｒ１０６、Ｗ１０４およびＲ３０６は下線付きで上に示される。
【0048】
特定の実施形態では、ＭＥＣＰ２をコードする核酸が、
ａｔｇｇ ｔａｇｃｔｇｇｇａｔ ｇｔｔａｇｇｇｃｔｃ ａｇｇｇａａｇａａａ ａ
ｇｔｃａｇａａｇａ ｃｃａｇｇａｃｃｔｃ ｃａｇｇｇｃｃｔｃａ ａｇｇａｃａａａ
ｃｃ ｃｃｔｃａａｇｔｔｔ ａａａａａｇｇｔｇａ ａｇａａａｇａｔａａ ｇａａａ
ｇａａｇａｇ ａａａｇａｇｇｇｃａ ａｇｃａｔｇａｇｃｃ ｃｇｔｇｃａｇｃｃａ
ｔｃａｇｃｃｃａｃｃ ａｃｔｃｔｇｃｔｇａ ｇｃｃｃｇｃａｇａｇ ｇｃａｇｇｃａ
ａａｇ ｃａｇａｇａｃａｔｃ
ａｇａａｇｇｇｔｃａ ｇｇｃｔｃｃｇｃｃｃ ｃｇｇｃｔｇｔｇｃｃ ｇｇａａｇｃ
ｔｔｃｔ ｇｃｃｔｃｃｃｃｃａ ａａｃａｇｃｇｇｃｇ ｃｔｃｃａｔｃａｔｃ ｃｇ
ｔｇａｃｃｇｇｇ ｇａｃｃｃａｔｇｔａ ｔｇａｔｇａｃｃｃｃ ａｃｃｃｔｇｃｃｔ
ｇ ａａｇｇｃｔｇｇａｃ ａｃｇｇａａｇｃｔｔ ａａｇｃａａａｇｇａ ａａｔｃｔ
ｇｇｃｃｇ ｃｔｃｔｇｃｔｇｇｇ ａａｇｔａｔｇａｔｇ ｔｇｔａｔｔｔｇａｔ ｃ
ａａｔｃｃｃｃａｇ ｇｇａａａａｇｃｃｔ ｔｔｃｇｃｔｃｔａａ ａｇｔｇｇａｇｔ
ｔｇ ａｔｔｇｃｇｔａｃｔ ｔｃｇａａａａｇｇｔ ａｇｇｃｇａｃａｃａ ｔｃｃｃ
ｔｇｇａｃｃ ｃｔａａｔｇａｔｔｔ ｔｇａｃｔｔｃａｃｇ ｇｔａａｃｔｇｇｇａ
ｇａｇｇｇａｇｃｃｃ ｃｔｃｃｃｇｇｃｇａ ｇａｇｃａｇａａａｃ ｃａｃｃｔａａ
ｇａａ ｇｃｃｃａａａｔｃｔ ｃｃｃａａａｇｃｔｃ ｃａｇｇａａｃｔｇｇ ｃａｇ
ａｇｇｃｃｇｇ ｇｇａｃｇｃｃｃｃａ ａａｇｇｇａｇｃｇｇ ｃａｃｃａｃｇａｇａ
ｃｃｃａａｇｇｃｇｇ ｃｃａｃｇｔｃａｇａ ｇｇｇｔｇｔｇｃａｇ ｇｔｇａａａ
ａｇｇｇ ｔｃｃｔｇｇａｇａａ ａａｇｔｃｃｔｇｇｇ ａａｇｃｔｃｃｔｔｇ ｔｃ
ａａｇａｔｇｃｃ ｔｔｔｔｃａａａｃｔ ｔｃｇｃｃａｇｇｇｇ ｇｃａａｇｇｃｔｇ
ａ ｇｇｇｇｇｇｔｇｇｇ ｇｃｃａｃｃａｃａｔ ｃｃａｃｃｃａｇｇｔ ｃａｔｇｇ
ｔｇａｔｃ ａａａｃｇｃｃｃｃｇ ｇｃａｇｇａａｇｃｇ ａａａａｇｃｔｇａｇ ｇ
ｃｃｇａｃｃｃｔｃ ａｇｇｃｃａｔｔｃｃ ｃａａｇａａａｃｇｇ ｇｇｃｃｇａａａ
ｇｃ ｃｇｇｇｇａｇｔｇｔ ｇｇｔｇｇｃａｇｃｃ ｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇ ａｇｇｃ
ｃａａａａａ ｇａａａｇｃｃｇｔｇ ａａｇｇａｇｔｃｔｔ ｃｔａｔｃｃｇａｔｃ
ｔｇｔｇｃａｇｇａｇ ａｃｃｇｔａｃｔｃｃ ｃｃａｔｃａａｇａａ ｇｃｇｃａａｇ
ａｃｃ ｃｇｇｇａｇａｃｇｇ ｔｃａｇｃａｔｃｇａ ｇｇｔｃａａｇｇａａ ｇｔｇ
ｇｔｇａａｇｃ ｃｃｃｔｇｃｔｇｇｔ ｇｔｃｃａｃｃｃｔｃ ｇｇｔｇａｇａａｇａ
ｇｃｇｇｇａａａｇｇ ａｃｔｇａａｇａｃｃ ｔｇｔａａｇａｇｃｃ ｃｔｇｇｇｃ
ｇｇａａ ａａｇｃａａｇｇａｇ ａｇｃａｇｃｃｃｃａ ａｇｇｇｇｃｇｃａｇ ｃａ
ｇｃａｇｃｇｃｃ ｔｃｃｔｃａｃｃｃｃ ｃｃａａｇａａｇｇａ ｇｃａｃｃａｃｃａ
ｃ ｃａｔｃａｃｃａｃｃ ａｃｔｃａｇａｇｔｃ ｃｃｃａａａｇｇｃｃ ｃｃｃｇｔ
ｇｃｃａｃ ｔｇｃｔｃｃｃａｃｃ ｃｃｔｇｃｃｃｃｃａ ｃｃｔｃｃａｃｃｔｇ ａ
ｇｃｃｃｇａｇａｇ ｃｔｃｃｇａｇｇａｃ ｃｃｃａｃｃａｇｃｃ ｃｃｃｃｔｇａｇ
ｃｃ ｃｃａｇｇａｃｔｔｇ ａｇｃａｇｃａｇｃｇ ｔｃｔｇｃａａａｇａ ｇｇａｇ
ａａｇａｔｇ ｃｃｃａｇａｇｇａｇ ｇｃｔｃａｃｔｇｇａ ｇａｇｃｇａｃｇｇｃ
ｔｇｃｃｃｃａａｇｇ ａｇｃｃａｇｃｔａａ ｇａｃｔｃａｇｃｃｃ ｇｃｇｇｔｔｇ
ｃｃａ ｃｃｇｃｃｇｃｃａｃ ｇｇｃｃｇｃａｇａａ ａａｇｔａｃａａａｃ ａｃｃ
ｇａｇｇｇｇａ ｇｇｇａｇａｇｃｇｃ ａａａｇａｃａｔｔｇ ｔｔｔｃａｔｃｃｔｃ
ｃａｔｇｃｃａａｇｇ ｃｃａａａｃａｇａｇ ａｇｇａｇｃｃｔｇｔ ｇｇａｃａｇ
ｃｃｇｇ ａｃｇｃｃｃｇｔｇａ ｃｃｇａｇａｇａｇｔ ｔａｇｃｔｇａ（配列番号５
７）である。
ａｔｇｇ ｔａｇｃｔｇｇｇａｔ ｇｔｔａｇｇｇｃｔｃ ａｇｇｇａａｇａａａ ａ
ｇｔｃａｇａａｇａ ｃｃａｇｇａｃｃｔｃ ｃａｇｇｇｃｃｔｃａ ａｇｇａｃａａａ
ｃｃ ｃｃｔｃａａｇｔｔｔ ａａａａａｇｇｔｇａ ａｇａａａｇａｔａａ ｇａａａ
ｇａａｇａｇ ａａａｇａｇｇｇｃａ ａｇｃａｔｇａｇｃｃ ｃｇｔｇｃａｇｃｃａ
ｔｃａｇｃｃｃａｃｃ ａｃｔｃｔｇｃｔｇａ ｇｃｃｃｇｃａｇａｇ ｇｃａｇｇｃａ
ａａｇ ｃａｇａｇａｃａｔｃ
ａｇａａｇｇｇｔｃａ ｇｇｃｔｃｃｇｃｃｃ ｃｇｇｃｔｇｔｇｃｃ ｇｇａａｇｃ
ｔｔｃｔ ｇｃｃｔｃｃｃｃｃａ ａａｃａｇｃｇｇｃｇ ｃｔｃｃａｔｃａｔｃ ｃｇ
ｔｇａｃｃｇｇｇ ｇａｃｃｃａｔｇｔａ ｔｇａｔｇａｃｃｃｃ ａｃｃｃｔｇｃｃｔ
ｇ ａａｇｇｃｔｇｇａｃ ａｃｇｇａａｇｃｔｔ ａａｇｃａａａｇｇａ ａａｔｃｔ
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ａａｔｃｃｃｃａｇ ｇｇａａａａｇｃｃｔ ｔｔｃｇｃｔｃｔａａ ａｇｔｇｇａｇｔ
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ｃｃｇｇ ａｃｇｃｃｃｇｔｇａ ｃｃｇａｇａｇａｇｔ ｔａｇｃｔｇａ（配列番号５
７）である。
【0049】
実施形態では、本発明は、古典的レット症候群および変異型レット症候群（別名、非定
型レット症候群）を含むレット症候群を処置、抑制および／または予防する方法を提供す
る。実施形態では、レット症候群が、Ｚａｐｐｅｌｌａ変異型、Ｈａｎｅｆｅｌｄ変異型
、Ｒｏｌａｎｄｏ変異型および／または「不完全型」変異型である。
型レット症候群）を含むレット症候群を処置、抑制および／または予防する方法を提供す
る。実施形態では、レット症候群が、Ｚａｐｐｅｌｌａ変異型、Ｈａｎｅｆｅｌｄ変異型
、Ｒｏｌａｎｄｏ変異型および／または「不完全型」変異型である。
【0050】
実施形態では、本発明は、限定されないが、運動失調、制御されない手の動き（例えば
、手もみもしくは絞り、拍手、擦り、洗浄、または手から口への運動）、後天性小頭症、
自閉症様行動、呼吸不規則性、摂食および嚥下困難、成長遅延、低血圧、パニック発作、
歯ぎしり（ブラキシズムＢｒｕｘｉｓｍ）、振戦、失行症、心臓不規則性（例、ＱＴ間隔
および／またはＴ波異常）、ならびに発作を含むレット症候群の１つまたは複数の症状の
減少、改善および／または抑止を提供する。
、手もみもしくは絞り、拍手、擦り、洗浄、または手から口への運動）、後天性小頭症、
自閉症様行動、呼吸不規則性、摂食および嚥下困難、成長遅延、低血圧、パニック発作、
歯ぎしり（ブラキシズムＢｒｕｘｉｓｍ）、振戦、失行症、心臓不規則性（例、ＱＴ間隔
および／またはＴ波異常）、ならびに発作を含むレット症候群の１つまたは複数の症状の
減少、改善および／または抑止を提供する。
【0051】
実施形態では、本組成物が、例えばレット症候群を処置、抑制および／または予防する
本方法に、以下のいずれかと組み合わせて使用され得る：トリデカン酸、フィンゴリモド
（例えば、ＧＩＬＥＮＹＡ）、ケタミン、ＥＰＩ－７４３（バチキノン）、サリゾタン（
ＥＭＤ－１２８、１３０）、スタチン（例えば、ロバスタチン）、三環系抗うつ薬（ＴＣ
Ａ、例えばデシプラミン）、酢酸グラチラマー（例えば、ＣＯＰＡＸＯＮＥ）、デキスト
ロメトルファン、および／または経口コレステロール２４－ヒドロキシラーゼ（ＣＨ２４
Ｈ）阻害剤（例えば、ＴＡＫ－９３５／ＯＶ９３５）。
本方法に、以下のいずれかと組み合わせて使用され得る：トリデカン酸、フィンゴリモド
（例えば、ＧＩＬＥＮＹＡ）、ケタミン、ＥＰＩ－７４３（バチキノン）、サリゾタン（
ＥＭＤ－１２８、１３０）、スタチン（例えば、ロバスタチン）、三環系抗うつ薬（ＴＣ
Ａ、例えばデシプラミン）、酢酸グラチラマー（例えば、ＣＯＰＡＸＯＮＥ）、デキスト
ロメトルファン、および／または経口コレステロール２４－ヒドロキシラーゼ（ＣＨ２４
Ｈ）阻害剤（例えば、ＴＡＫ－９３５／ＯＶ９３５）。
【0052】
上記のように、本発明は、レット症候群を抑制、処置および／または予防するための核
酸分子、ベクター、および組成物および方法を提供する。本明細書に記載される少なくと
も１つの核酸を含む組成物も、本発明に含まれる。特定の実施形態では、組成物が、少な
くとも１つのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、発現ベク
ター）と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを含む。組成物は、ＲＮＡ結合ド
メインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子をさらに含み得る。
特定の実施形態では、核酸分子の全てが、単一の発現ベクター（例えば、ウイルスベクタ
ー（例えば、ＡＡＶ））内にコードされる。あるいは、核酸分子が、少なくとも１つの薬
学的に許容される担体を含む別個の組成物内に含まれてもよい。本発明はまた、少なくと
も１つのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、発現ベクター
）を含む第１の組成物と、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素を
コードする少なくとも１つの核酸分子を含む第２の組成物とを含むキットを包含する。第
１および第２の組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
特定の実施形態では、本発明のキットが、少なくとも１つのガイドＲＮＡもしくはガイド
ＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、発現ベクター）および／またはＲＮＡ結合ドメイ
ンに連結もしくは融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子を含む第１の組成物を
含む。第１および第２の組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含
み得る。
酸分子、ベクター、および組成物および方法を提供する。本明細書に記載される少なくと
も１つの核酸を含む組成物も、本発明に含まれる。特定の実施形態では、組成物が、少な
くとも１つのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、発現ベク
ター）と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを含む。組成物は、ＲＮＡ結合ド
メインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子をさらに含み得る。
特定の実施形態では、核酸分子の全てが、単一の発現ベクター（例えば、ウイルスベクタ
ー（例えば、ＡＡＶ））内にコードされる。あるいは、核酸分子が、少なくとも１つの薬
学的に許容される担体を含む別個の組成物内に含まれてもよい。本発明はまた、少なくと
も１つのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、発現ベクター
）を含む第１の組成物と、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素を
コードする少なくとも１つの核酸分子を含む第２の組成物とを含むキットを包含する。第
１および第２の組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
特定の実施形態では、本発明のキットが、少なくとも１つのガイドＲＮＡもしくはガイド
ＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、発現ベクター）および／またはＲＮＡ結合ドメイ
ンに連結もしくは融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子を含む第１の組成物を
含む。第１および第２の組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含
み得る。
【0053】
上記で説明されるように、本発明の組成物は、レット症候群を処置するのに有用である
。治療上有効量の組成物が、それを必要とする対象に投与され得る。投与量、方法および
投与時間は、本明細書で提供される教示が与えられれば、当業者により容易に決定可能で
ある。
。治療上有効量の組成物が、それを必要とする対象に投与され得る。投与量、方法および
投与時間は、本明細書で提供される教示が与えられれば、当業者により容易に決定可能で
ある。
【0054】
本明細書に記載される成分は、一般に、製剤として患者に投与される。本明細書で使用
される「患者」または「対象」という用語は、ヒトまたは動物の対象を指す。本発明の成
分は、指示される疾患または障害を処置するために医師の指導の下で治療的に使用され得
る。
される「患者」または「対象」という用語は、ヒトまたは動物の対象を指す。本発明の成
分は、指示される疾患または障害を処置するために医師の指導の下で治療的に使用され得
る。
【0055】
本発明の成分を含む製剤は、水、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、
グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、界面活性剤、懸濁化剤またはこれらの適切な混合物などの
許容される媒体（例えば、薬学的に許容される担体）を用いて投与用に好都合に製剤化さ
れ得る。選択された媒体中の薬剤の濃度は変動してよく、媒体は、製剤の所望の投与経路
に基づいて選択され得る。従来の媒体または薬剤が投与される薬剤と適合しない場合を除
いて、製剤へのその使用が企図される。
グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、界面活性剤、懸濁化剤またはこれらの適切な混合物などの
許容される媒体（例えば、薬学的に許容される担体）を用いて投与用に好都合に製剤化さ
れ得る。選択された媒体中の薬剤の濃度は変動してよく、媒体は、製剤の所望の投与経路
に基づいて選択され得る。従来の媒体または薬剤が投与される薬剤と適合しない場合を除
いて、製剤へのその使用が企図される。
【0056】
適切な製剤の選択は、選択された投与方法に依存する。例えば、本発明の成分は、任意
の所望の組織（例えば、脳）または周囲領域への直接注射によって投与され得る。この場
合、製剤は、血液または標的組織と適合する媒体中に分散された成分を含む。
の所望の組織（例えば、脳）または周囲領域への直接注射によって投与され得る。この場
合、製剤は、血液または標的組織と適合する媒体中に分散された成分を含む。
【0057】
治療は、例えば、非経口的に、血流中への注射（例えば、静脈内）によって、または皮
下、筋肉内もしくは腹腔内注射によって投与され得る。特定の実施形態では、治療が、（
例えば、処置される組織への）直接注射によって投与される。注射用の製剤が当技術分野
で知られている。治療を投与する方法として注射が選択された場合、生物学的効果を発揮
するのに十分な量の分子が標的細胞に到達することを確実にするための措置をとらなけれ
ばならない。
下、筋肉内もしくは腹腔内注射によって投与され得る。特定の実施形態では、治療が、（
例えば、処置される組織への）直接注射によって投与される。注射用の製剤が当技術分野
で知られている。治療を投与する方法として注射が選択された場合、生物学的効果を発揮
するのに十分な量の分子が標的細胞に到達することを確実にするための措置をとらなけれ
ばならない。
【0058】
有効成分としての本発明の化合物を医薬担体と緊密に混和して含有する医薬組成物は、
従来の医薬配合技術によって調製することができる。担体は、例えば、静脈内、経口また
は非経口など、投与に望ましい調製の形態に応じて多種多様な形態をとることができる。
経口剤形の調製では、例えば、経口液体調製物（例えば、懸濁剤、エリキシルおよび液剤
など）の場合、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤など
の通常の医薬媒体；または経口固形調製物（例えば、散剤、カプセル剤および錠剤など）
の場合、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの担体のいずれか
を使用することができる。注射可能な懸濁液を調製することができ、その場合、適切な液
体担体、懸濁化剤などを使用することができる。
従来の医薬配合技術によって調製することができる。担体は、例えば、静脈内、経口また
は非経口など、投与に望ましい調製の形態に応じて多種多様な形態をとることができる。
経口剤形の調製では、例えば、経口液体調製物（例えば、懸濁剤、エリキシルおよび液剤
など）の場合、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤など
の通常の医薬媒体；または経口固形調製物（例えば、散剤、カプセル剤および錠剤など）
の場合、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの担体のいずれか
を使用することができる。注射可能な懸濁液を調製することができ、その場合、適切な液
体担体、懸濁化剤などを使用することができる。
【0059】
本発明の製剤は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態で製剤化さ
れ得る。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置を受けている患者に適した製剤の物
理的に別個の単位を指す。各投薬量は、選択された医薬担体と共に所望の効果を生み出す
ように計算された量の有効成分を含むべきである。適切な投薬単位を決定するための手順
は、当業者に周知である。投薬単位は、患者の体重に基づいて比例的に増加または減少し
得る。特定の病的状態を緩和するための適切な濃度は、当技術分野で知られているように
、投薬濃度曲線計算によって決定され得る。
れ得る。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置を受けている患者に適した製剤の物
理的に別個の単位を指す。各投薬量は、選択された医薬担体と共に所望の効果を生み出す
ように計算された量の有効成分を含むべきである。適切な投薬単位を決定するための手順
は、当業者に周知である。投薬単位は、患者の体重に基づいて比例的に増加または減少し
得る。特定の病的状態を緩和するための適切な濃度は、当技術分野で知られているように
、投薬濃度曲線計算によって決定され得る。
【0060】
本発明の方法は、本発明の（１又は複数の）組成物の投与後の対象の疾患または障害を
監視して、方法の有効性を監視するステップをさらに含み得る。例えば、対象がレット症
候群の特徴について監視され得る。
監視して、方法の有効性を監視するステップをさらに含み得る。例えば、対象がレット症
候群の特徴について監視され得る。
【0061】
定義
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される：
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈上別
段の意味を有することが明らかな場合を除き、複数の指示対象を含む。
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される：
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈上別
段の意味を有することが明らかな場合を除き、複数の指示対象を含む。
【0062】
「薬学的に許容される」は、動物、特にヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政
府の規制当局による承認、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認められている薬
局方に列挙されていることを示す。
府の規制当局による承認、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認められている薬
局方に列挙されていることを示す。
【0063】
「担体」は、例えば、希釈剤、アジュバント、保存剤（例えば、チメルソール（Ｔｈｉ
ｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜
硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８
０）、乳化剤、緩衝液（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、抗微生物剤、増量
物質（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助剤または本発明の活性剤と共
に投与されるビヒクルを指す。薬学的に許容される担体は、水および油（石油、動物、植
物または合成起源のものを含む）などの無菌液体であり得る。水または生理食塩水ならび
にデキストロースおよびグリセロール水溶液が、特に注射液のための担体として好ましく
使用される。適切な医薬担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｐｒに記載されている。
ｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜
硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８
０）、乳化剤、緩衝液（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、抗微生物剤、増量
物質（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助剤または本発明の活性剤と共
に投与されるビヒクルを指す。薬学的に許容される担体は、水および油（石油、動物、植
物または合成起源のものを含む）などの無菌液体であり得る。水または生理食塩水ならび
にデキストロースおよびグリセロール水溶液が、特に注射液のための担体として好ましく
使用される。適切な医薬担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｐｒに記載されている。
【0064】
本明細書で使用される「処置する」という用語は、（例えば、１つまたは複数の症状に
おける）患者の状態の改善、状態の進行の遅延等を含む、疾患に罹患した患者に利益を与
えるあらゆる種類の処置を指す。
おける）患者の状態の改善、状態の進行の遅延等を含む、疾患に罹患した患者に利益を与
えるあらゆる種類の処置を指す。
【0065】
本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、対象が状態を発症する確率の
低下をもたらす、状態を発症するリスクがある対象の予防的処置を指す。
低下をもたらす、状態を発症するリスクがある対象の予防的処置を指す。
【0066】
化合物または医薬組成物の「治療上有効量」は、特定の障害もしくは疾患および／また
はその症状を予防、抑制または処置するのに有効な量を指す。
はその症状を予防、抑制または処置するのに有効な量を指す。
【0067】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物、特に哺乳動物、特にヒトを
指す。
指す。
【0068】
「単離」という用語は、その製造中の存在する他の成分からの化合物の分離を指す。「
単離」は、他の化合物もしくは材料との人工的もしくは合成混合物、または基本的な活性
を実質的に妨害しないが、例えば、不完全な精製または安定剤の添加により存在し得る不
純物の存在を除外することを意図していない。
単離」は、他の化合物もしくは材料との人工的もしくは合成混合物、または基本的な活性
を実質的に妨害しないが、例えば、不完全な精製または安定剤の添加により存在し得る不
純物の存在を除外することを意図していない。
【0069】
「リンカー」、「リンカードメイン」および「連結」という用語は、共有結合または少
なくとも２つの化合物、例えばＲＮＡ編集酵素とＲＮＡ結合ドメインを共有結合的に結合
する原子の鎖を含む化学的部分を指す。リンカーは、アミノ酸配列（例えば、１～５０個
のアミノ酸、１～２５個のアミノ酸、１～２０個のアミノ酸、１～１５個のアミノ酸、１
～１０個のアミノ酸、または１～５個のアミノ酸）であり得る。
なくとも２つの化合物、例えばＲＮＡ編集酵素とＲＮＡ結合ドメインを共有結合的に結合
する原子の鎖を含む化学的部分を指す。リンカーは、アミノ酸配列（例えば、１～５０個
のアミノ酸、１～２５個のアミノ酸、１～２０個のアミノ酸、１～１５個のアミノ酸、１
～１０個のアミノ酸、または１～５個のアミノ酸）であり得る。
【0070】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上、好ましくは３
つ以上のリボ－および／またはデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子を含む。
オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、種々の因子、ならびにオリゴヌクレオチドの特定
の適用および使用に依存する。
つ以上のリボ－および／またはデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子を含む。
オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、種々の因子、ならびにオリゴヌクレオチドの特定
の適用および使用に依存する。
【0071】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれか
のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指し、一本鎖の場合、線状または環状形態のその相補的配列
の分子を指す。核酸分子の議論において、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から
３’方向に配列を提供する通常の慣例に従って、本明細書に記載され得る。本発明の核酸
に関して、「単離核酸」という用語が時々使用される。この用語は、ＤＮＡに適用される
場合、それが起源をもつ生物の自然に存在するゲノム中で直接隣接する配列から分離され
たＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターな
どのベクターに挿入された、または原核もしくは真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡ
に組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。
のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指し、一本鎖の場合、線状または環状形態のその相補的配列
の分子を指す。核酸分子の議論において、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から
３’方向に配列を提供する通常の慣例に従って、本明細書に記載され得る。本発明の核酸
に関して、「単離核酸」という用語が時々使用される。この用語は、ＤＮＡに適用される
場合、それが起源をもつ生物の自然に存在するゲノム中で直接隣接する配列から分離され
たＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターな
どのベクターに挿入された、または原核もしくは真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡ
に組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。
【0072】
「ベクター」は、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスなどの遺
伝子要素であり、これに別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が
結合され得る。結合した配列または要素の複製をもたらすために、ベクターがレプリコン
であってもよい。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、一本鎖または二本
鎖であり得る。ベクターは、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シ
グナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの、宿主細胞または生物のポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドコード配列の発現を促進する転写および翻訳制御配列など
の発現オペロンまたは要素を含み得る。
伝子要素であり、これに別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が
結合され得る。結合した配列または要素の複製をもたらすために、ベクターがレプリコン
であってもよい。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、一本鎖または二本
鎖であり得る。ベクターは、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シ
グナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの、宿主細胞または生物のポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドコード配列の発現を促進する転写および翻訳制御配列など
の発現オペロンまたは要素を含み得る。
【0073】
「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴ
ＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの、宿主細胞ま
たは生物の核酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進する転写および翻訳制御配列
を有し得る核酸セグメントを指す。「発現ベクター」は、宿主細胞または生物における核
酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進するベクターである。
ＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの、宿主細胞ま
たは生物の核酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進する転写および翻訳制御配列
を有し得る核酸セグメントを指す。「発現ベクター」は、宿主細胞または生物における核
酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進するベクターである。
【0074】
本明細書で使用される場合、「核局在化シグナル」（ＮＬＳ）は、結合したポリペプチ
ドの細胞の核への移動を促進する分子またはポリペプチドを指す。特定の実施形態では、
核局在化シグナルが、タンパク質を核に向けるペプチドである。典型的には、ＮＬＳは主
に塩基性の正に帯電したアミノ酸（特に、リジンおよびアルギニン）を含む。ＮＬＳは、
単節型、双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）または多節型（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔｅ）であ
り得る。ＮＬＳは、典型的には短ペプチドである（例えば、約２０個未満のアミノ酸、約
１５個未満のアミノ酸、または約１０個未満のアミノ酸）。ＮＬＳの例は、Ｋｏｓｕｇｉ
ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４：４７８－４８５；参照
により本明細書に組み込まれる）に提供されている。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コ
ンセンサス配列Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号５８）（例えば、単節型（ｍｏｎｏ
ｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コンセンサス配列（
Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０～１２（Ｋ／Ｒ）３／５（配列番号５９）（式中、（Ｋ／Ｒ）
３／５は、５つのアミノ酸のうち少なくとも３つがリジンまたはアルギニンのいずれかで
あることを表す）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ
（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４７））である。特定の実施形態では、ｃ－ｍｙｃ
ＮＬＳが、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５４）を含む。特定の実施形態では、Ｎ
ＬＳが、ヌクレオプラスミンＮＬＳ ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０
）である。提供される配列に関して、リジンおよびアルギニンアミノ酸は交換可能である
。
ドの細胞の核への移動を促進する分子またはポリペプチドを指す。特定の実施形態では、
核局在化シグナルが、タンパク質を核に向けるペプチドである。典型的には、ＮＬＳは主
に塩基性の正に帯電したアミノ酸（特に、リジンおよびアルギニン）を含む。ＮＬＳは、
単節型、双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）または多節型（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔｅ）であ
り得る。ＮＬＳは、典型的には短ペプチドである（例えば、約２０個未満のアミノ酸、約
１５個未満のアミノ酸、または約１０個未満のアミノ酸）。ＮＬＳの例は、Ｋｏｓｕｇｉ
ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４：４７８－４８５；参照
により本明細書に組み込まれる）に提供されている。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コ
ンセンサス配列Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号５８）（例えば、単節型（ｍｏｎｏ
ｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コンセンサス配列（
Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０～１２（Ｋ／Ｒ）３／５（配列番号５９）（式中、（Ｋ／Ｒ）
３／５は、５つのアミノ酸のうち少なくとも３つがリジンまたはアルギニンのいずれかで
あることを表す）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ
（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４７））である。特定の実施形態では、ｃ－ｍｙｃ
ＮＬＳが、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５４）を含む。特定の実施形態では、Ｎ
ＬＳが、ヌクレオプラスミンＮＬＳ ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０
）である。提供される配列に関して、リジンおよびアルギニンアミノ酸は交換可能である
。
【0075】
種々の実施形態では、ＮＬＳを含めることにより、例えばＮＬＳの非存在下での編集に
対して、オフターゲット編集を減少させるまたは抑止する。例えば、種々の実施形態では
、ＮＬＳを含む本遺伝子編集方法が、オフターゲット編集を約１０％、または約２０％、
または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、
または約８０％、または約９０％、または約１００％減少させる。種々の実施形態では、
ＮＬＳを含む本遺伝子編集方法が、オフターゲット編集を約２倍、または約３倍、または
約５倍、または約１０倍、または約３０倍減少させる。
対して、オフターゲット編集を減少させるまたは抑止する。例えば、種々の実施形態では
、ＮＬＳを含む本遺伝子編集方法が、オフターゲット編集を約１０％、または約２０％、
または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、
または約８０％、または約９０％、または約１００％減少させる。種々の実施形態では、
ＮＬＳを含む本遺伝子編集方法が、オフターゲット編集を約２倍、または約３倍、または
約５倍、または約１０倍、または約３０倍減少させる。
【0076】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示するために提供される。実施例は例示
であり、本発明を限定することを決して意図していない。
であり、本発明を限定することを決して意図していない。
【0077】
［実施例１］
材料および方法
プラスミド構築
野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインに融合されたλＮペプチドをコードするｐｃＤＮＡ ３
．１＋プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を入手した（
Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（
２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２９０
）。エディターゼＥ４８８Ｑ ｃＤＮＡを、野生型エディターゼのオーバーラップＰＣＲ
によって作製し、ｐｃＤＮＡ３．１＋にクローニングした。ＨＡエピトープの２つのコピ
ーおよびＳＶ４０ ＮＬＳの３つのコピーをハイブリッドエディターゼのフレームにイン
フレームでおよびＮ末端に挿入することによって、両バージョンのエディターゼをｐｃＤ
ＮＡ３．１＋中で改変した（ｐＧＭ１０９０、野生型；ｐＧＭ１０９１、Ｅ４８８Ｑ）。
Ｍｅｃｐ２－ＢｏｘＢガイドについては、３つの異なるＭｅｃｐ２ Ｇ＞Ａ突然変異を表
す合成オリゴヌクレオチド、およびそれらのアンチセンス配列を、Ｂｓａ１オーバーハン
グとアニーリングし、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６ポリリンカー［ｐＧＭ１０９９（Ｗ１０４Ｘ）、
ｐＧＭ１１８１（３０６Ｈ）、ｐＧＭ１０８５（Ｒ１０６Ｑ）］（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。オフターゲットＡ－Ｇミスマッチ
を含むＭｅｃｐ２－ＢｏｘＢガイド（ｐＧＭ１１０８９）もｐＥＮＴＲ／Ｕ６にある。Ｍ
ｅｃｐ２編集基質については、マウスＭｅｃｐ２ Ｅ１アイソフォームｃＤＮＡ（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００１０７５４４８．１）のＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ断片を、ｐＥ
ＧＦＰ－Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のマルチクローニングサイトにクローニングした。Ｍ
ｅｃｐ２の個々のＧ＞Ａ突然変異を、同じ制限酵素部位のオーバーハングを用いてオーバ
ーラップＰＣＲによって作製し、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ）のｅＧＦＰとの融合タンパク質としてインフレームでクローニングし
た。全てのサブクローニングを配列分析によって検証した。プラスミド構築およびＰＣＲ
増幅で使用したプライマー配列を表１に示す。
材料および方法
プラスミド構築
野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインに融合されたλＮペプチドをコードするｐｃＤＮＡ ３
．１＋プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を入手した（
Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（
２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２９０
）。エディターゼＥ４８８Ｑ ｃＤＮＡを、野生型エディターゼのオーバーラップＰＣＲ
によって作製し、ｐｃＤＮＡ３．１＋にクローニングした。ＨＡエピトープの２つのコピ
ーおよびＳＶ４０ ＮＬＳの３つのコピーをハイブリッドエディターゼのフレームにイン
フレームでおよびＮ末端に挿入することによって、両バージョンのエディターゼをｐｃＤ
ＮＡ３．１＋中で改変した（ｐＧＭ１０９０、野生型；ｐＧＭ１０９１、Ｅ４８８Ｑ）。
Ｍｅｃｐ２－ＢｏｘＢガイドについては、３つの異なるＭｅｃｐ２ Ｇ＞Ａ突然変異を表
す合成オリゴヌクレオチド、およびそれらのアンチセンス配列を、Ｂｓａ１オーバーハン
グとアニーリングし、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６ポリリンカー［ｐＧＭ１０９９（Ｗ１０４Ｘ）、
ｐＧＭ１１８１（３０６Ｈ）、ｐＧＭ１０８５（Ｒ１０６Ｑ）］（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。オフターゲットＡ－Ｇミスマッチ
を含むＭｅｃｐ２－ＢｏｘＢガイド（ｐＧＭ１１０８９）もｐＥＮＴＲ／Ｕ６にある。Ｍ
ｅｃｐ２編集基質については、マウスＭｅｃｐ２ Ｅ１アイソフォームｃＤＮＡ（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００１０７５４４８．１）のＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ断片を、ｐＥ
ＧＦＰ－Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のマルチクローニングサイトにクローニングした。Ｍ
ｅｃｐ２の個々のＧ＞Ａ突然変異を、同じ制限酵素部位のオーバーハングを用いてオーバ
ーラップＰＣＲによって作製し、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ）のｅＧＦＰとの融合タンパク質としてインフレームでクローニングし
た。全てのサブクローニングを配列分析によって検証した。プラスミド構築およびＰＣＲ
増幅で使用したプライマー配列を表１に示す。
【表1】
【0078】
プラスミド構築物
λＮペプチドと野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインの融合ｃＤＮＡ（エディターゼ）を含む
最初の構築物が記載されている（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２
０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇ
ｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
１１０：１８２８５－１８２９０）。これを、ＨＡエピトープタグの２つのコピー、引き
続いてハイブリッドエディターゼ（ｐＧＭ１０９０）にインフレームおよびＮ末端のＳＶ
４０ ＮＬＳの３つのコピーを含むよう改変した。これを行うために、ＨＡエピトープタ
グの２つのコピーおよびコザック配列をコードする２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを、
ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐｅＩオーバーハングとアニーリングし、λＮドメイン配列に５’
で連結した。ＳＶ４０ ＮＬＳの３つのコピーを、ｐＥＣＦＰ－Ｎｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）からのＰＣＲによって増幅し、ＢｓｐＥＩオーバーハングを使用してＨＡエピトープ
タグとλＮドメインの間に付加した。ＡＤＡＲ２触媒ドメインにＥ４８８Ｑ突然変異を含
むプラスミドｐＧＭ１０９１を、同じステップを使用して作製した。
λＮペプチドと野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインの融合ｃＤＮＡ（エディターゼ）を含む
最初の構築物が記載されている（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２
０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇ
ｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
１１０：１８２８５－１８２９０）。これを、ＨＡエピトープタグの２つのコピー、引き
続いてハイブリッドエディターゼ（ｐＧＭ１０９０）にインフレームおよびＮ末端のＳＶ
４０ ＮＬＳの３つのコピーを含むよう改変した。これを行うために、ＨＡエピトープタ
グの２つのコピーおよびコザック配列をコードする２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを、
ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐｅＩオーバーハングとアニーリングし、λＮドメイン配列に５’
で連結した。ＳＶ４０ ＮＬＳの３つのコピーを、ｐＥＣＦＰ－Ｎｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）からのＰＣＲによって増幅し、ＢｓｐＥＩオーバーハングを使用してＨＡエピトープ
タグとλＮドメインの間に付加した。ＡＤＡＲ２触媒ドメインにＥ４８８Ｑ突然変異を含
むプラスミドｐＧＭ１０９１を、同じステップを使用して作製した。
【0079】
ＡＡＶ形質導入実験に使用したプラスミドｐＧＭ１２５８は、シナプシンＩプロモータ
ーの制御下にあるエディターゼｃＤＮＡ、およびそれぞれヒトＵ６プロモーターの制御下
にあるオフターゲットＡ－Ｇミスマッチを有するＭｅｃｐ２Ｒ１０６ＱガイドＤＮＡの６
つのコピーを含む。Ｕ６－Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド領域を導入するために、ヒトＵ６
プロモーターおよびプラスミドｐＸ５５２（６０９５８；Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｓｗｉｅｃｈ
，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３：１０２－１０６）
からのＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ配列を制限消化（ＮｄｅＩ／ＡｐａＩ）によって除去し
、６つのＵ６－Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド配列をこれらの部位の間に２つのステップで
挿入した。最初のステップで、Ｕ６－Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド領域の３つのコピーを
、以下の制限部位：ＮｄｅＩ／ＭｆｅＩ、ＭｆｅＩ／ＳｐｅＩおよびＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ
＋ＡｐａＩ（ｐＧＭ１２５７）を有するＰＣＲアンプリコン（ｐＧＭ１１０８鋳型）の４
方向ライゲーションによってｐＸ５５２にクローニングした。第２のステップで、Ｕ６－
Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド領域の３つの追加のコピーを、以下の制限部位：ＮｈｅＩ／
ＳａｃＩ、ＳａｃＩ／ＡｆＩＩＩおよびＡｆＩＩＩ／ＡｐａＩを付加するプライマーを使
用して、ｐＧＭ１１０８からのＰＣＲ増幅によって作製した。最終プラスミドｐＧＭ１２
５８を、ＮｈｅＩ／ＡｐａＩで消化したｐＧＭ１２５７の制限、および３つのＵ６－Ｍｅ
ｃｐ２Ｒ１０６Ｑ ＰＣＲアンプリコンによる４方向ライゲーションによって作製した。
エディターゼｃＤＮＡをｐＧＭ１２５８に導入するために、エディターゼのＯＲＦに対応
する配列をプラスミドｐＧＭ１０９１から増幅し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩオーバーハ
ングを使用して、ｐＧＭ１２５７のシナプシンＩプロモーターの下流に付加した。
ーの制御下にあるエディターゼｃＤＮＡ、およびそれぞれヒトＵ６プロモーターの制御下
にあるオフターゲットＡ－Ｇミスマッチを有するＭｅｃｐ２Ｒ１０６ＱガイドＤＮＡの６
つのコピーを含む。Ｕ６－Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド領域を導入するために、ヒトＵ６
プロモーターおよびプラスミドｐＸ５５２（６０９５８；Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｓｗｉｅｃｈ
，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３：１０２－１０６）
からのＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ配列を制限消化（ＮｄｅＩ／ＡｐａＩ）によって除去し
、６つのＵ６－Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド配列をこれらの部位の間に２つのステップで
挿入した。最初のステップで、Ｕ６－Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド領域の３つのコピーを
、以下の制限部位：ＮｄｅＩ／ＭｆｅＩ、ＭｆｅＩ／ＳｐｅＩおよびＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ
＋ＡｐａＩ（ｐＧＭ１２５７）を有するＰＣＲアンプリコン（ｐＧＭ１１０８鋳型）の４
方向ライゲーションによってｐＸ５５２にクローニングした。第２のステップで、Ｕ６－
Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド領域の３つの追加のコピーを、以下の制限部位：ＮｈｅＩ／
ＳａｃＩ、ＳａｃＩ／ＡｆＩＩＩおよびＡｆＩＩＩ／ＡｐａＩを付加するプライマーを使
用して、ｐＧＭ１１０８からのＰＣＲ増幅によって作製した。最終プラスミドｐＧＭ１２
５８を、ＮｈｅＩ／ＡｐａＩで消化したｐＧＭ１２５７の制限、および３つのＵ６－Ｍｅ
ｃｐ２Ｒ１０６Ｑ ＰＣＲアンプリコンによる４方向ライゲーションによって作製した。
エディターゼｃＤＮＡをｐＧＭ１２５８に導入するために、エディターゼのＯＲＦに対応
する配列をプラスミドｐＧＭ１０９１から増幅し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩオーバーハ
ングを使用して、ｐＧＭ１２５７のシナプシンＩプロモーターの下流に付加した。
【0080】
ＡＡＶベクターおよびウイルス調製
ヒトシナプシンＩプロモーターを含むＡＡＶ１／２バックボーンベクター、ｐＸ５５２
を、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した（プラスミド６０９５８；Ｓｗｉｅｃｈ，ｅｔ ａｌ．
（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３：１０２－１０６）。ガイドｃＤＮ
Ａ（ｐＧＭ１１８６、エディターゼのみ；ｐＧＭ１２５８、エディターゼとＲ１０６Ｑガ
イド）の６つのコピーを用いないでおよび用いて、ｅＧＦＰ－ＫＡＳＨコード配列をＨＡ
タグ付きＮＬＳエディターゼｃＤＮＡで置き換えることによってｐＸ５５２を改変した。
ウイルスを作製する前に、エディターゼおよびガイド配列を配列分析によって検証した。
ヒトシナプシンＩプロモーターを含むＡＡＶ１／２バックボーンベクター、ｐＸ５５２
を、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した（プラスミド６０９５８；Ｓｗｉｅｃｈ，ｅｔ ａｌ．
（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３：１０２－１０６）。ガイドｃＤＮ
Ａ（ｐＧＭ１１８６、エディターゼのみ；ｐＧＭ１２５８、エディターゼとＲ１０６Ｑガ
イド）の６つのコピーを用いないでおよび用いて、ｅＧＦＰ－ＫＡＳＨコード配列をＨＡ
タグ付きＮＬＳエディターゼｃＤＮＡで置き換えることによってｐＸ５５２を改変した。
ウイルスを作製する前に、エディターゼおよびガイド配列を配列分析によって検証した。
【0081】
各ＡＡＶ１／２キメラベクターを、アデノウイルスフリートランスフェクション法（Ｍ
ａｔｓｕｓｈｉｔａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：９３８－９
４５；Ｅａｒｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，９１：ｅ０１９８０
－１６）によって、１ベクター当たり３つの２２５ｃｍ２フラスコのスケールで、ヒト胎
児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞で作製した。各フラスコで、約２×１０７個のＨ
ＥＫ２９３細胞を、ＤＮＡ：ＰＥＩ重量比１：２でポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と混合
した以下の４つのプラスミドＤＮＡ合計４５μｇでトランスフェクトした。プラスミドＤ
ＮＡ混合物は、１５μｇのｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、それぞれ７．５μｇのｐ
ＨＬＰ１９－１およびｐＨＬＰ１９－２、ならびに２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を有す
るＡＡＶベクターゲノム配列を含むＡＡＶベクターエディターゼ組換えプラスミドの１つ
（１５μｇ）を含んでいた。ｐＨＬＰ１９－１はＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡ
Ｖ１ ＶＰタンパク質を供給するＡＡＶ１ヘルパープラスミドであり、ｐＨＬＰ１９－２
はＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ２ ＶＰタンパク質を供給するＡＡＶ２ヘル
パープラスミドである（Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０２：２
４１２－２４１９）。トランスフェクションの３日後、細胞を収集した。次いで、ＡＡＶ
ベクター粒子を細胞溶解によって細胞から回収し、ＨｉＴｒａｐ（商標）ヘパリンカラム
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｄｅｓｔｅｒｒｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｓｃｉ．，１１６：１８０５－１８１８）を使用して精製した。各ウイルス力価を
、エディターゼコード配列に対して作製されたプローブを使用した定量的ドットブロット
アッセイによって決定した。
ａｔｓｕｓｈｉｔａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５：９３８－９
４５；Ｅａｒｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，９１：ｅ０１９８０
－１６）によって、１ベクター当たり３つの２２５ｃｍ２フラスコのスケールで、ヒト胎
児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞で作製した。各フラスコで、約２×１０７個のＨ
ＥＫ２９３細胞を、ＤＮＡ：ＰＥＩ重量比１：２でポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と混合
した以下の４つのプラスミドＤＮＡ合計４５μｇでトランスフェクトした。プラスミドＤ
ＮＡ混合物は、１５μｇのｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、それぞれ７．５μｇのｐ
ＨＬＰ１９－１およびｐＨＬＰ１９－２、ならびに２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を有す
るＡＡＶベクターゲノム配列を含むＡＡＶベクターエディターゼ組換えプラスミドの１つ
（１５μｇ）を含んでいた。ｐＨＬＰ１９－１はＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡ
Ｖ１ ＶＰタンパク質を供給するＡＡＶ１ヘルパープラスミドであり、ｐＨＬＰ１９－２
はＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ２ ＶＰタンパク質を供給するＡＡＶ２ヘル
パープラスミドである（Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０２：２
４１２－２４１９）。トランスフェクションの３日後、細胞を収集した。次いで、ＡＡＶ
ベクター粒子を細胞溶解によって細胞から回収し、ＨｉＴｒａｐ（商標）ヘパリンカラム
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｄｅｓｔｅｒｒｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｓｃｉ．，１１６：１８０５－１８１８）を使用して精製した。各ウイルス力価を
、エディターゼコード配列に対して作製されたプローブを使用した定量的ドットブロット
アッセイによって決定した。
【0082】
細胞培養
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１３１）を、５％ＣＯ２加湿インキュベータ
ー内３７℃で、１０％ＦＢＳ（ロット番号ＡＡＣ２０－０９５５；ＨｙＣｌｏｎｅ）中Ｄ
ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に維持した。初代ニ
ューロンを、標的相同組換え（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍｓ）によって作製され、遺伝子
型判定によって特徴付けられたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウス系統から誘導した。全ての動
物実験が、オレゴン健康科学大学の動物実験委員会によって承認された。子（Ｐ０）を断
頭によって殺し、脳を２５ ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含む氷冷ハンクス基礎塩溶液（ＨＢＳＳ
、ｐＨ７．４）中で解剖した。個々の海馬を髄膜なしで切除し、遺伝子型によってプール
した。組織を、３７℃で１０分間、ＨＢＳＳ中１％トリプシンおよび０．０１％ＤＮａｓ
ｅ Ｉで処置した。組織片をＨＢＳＳ中室温で３回すすぎ、２５ｍＭグルコース、１％ペ
ニシリン／ストレプトマイシン、１％ウマ血清（ロット番号Ｂ０２３０７－７０２１；Ｈ
ｙＣｌｏｎｅ）、および１％ＦＢＳを含む最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）で分離した。ニュ
ーロンを、０．４μｍフィルターを通して濾過することによって分離し、Ｎｅｕｒｏｂａ
ｓａｌ－Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｇｌｕｔａｍ
ａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２％Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍ
ｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンか
らなるニューロン増殖培地中、ポリ－Ｌ－リジンコーティング皿に１２ウェル皿中１ウェ
ル当たり５×１０５個細胞、または９６ウェルガラスチャンバー中５×１０４個の密度で
蒔いた。２４時間後、ニューロンに完全な培地交換を受けさせて細胞破片を除去した。２
～３日毎に半分の培地を交換した。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で維持した。
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１３１）を、５％ＣＯ２加湿インキュベータ
ー内３７℃で、１０％ＦＢＳ（ロット番号ＡＡＣ２０－０９５５；ＨｙＣｌｏｎｅ）中Ｄ
ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に維持した。初代ニ
ューロンを、標的相同組換え（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍｓ）によって作製され、遺伝子
型判定によって特徴付けられたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウス系統から誘導した。全ての動
物実験が、オレゴン健康科学大学の動物実験委員会によって承認された。子（Ｐ０）を断
頭によって殺し、脳を２５ ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含む氷冷ハンクス基礎塩溶液（ＨＢＳＳ
、ｐＨ７．４）中で解剖した。個々の海馬を髄膜なしで切除し、遺伝子型によってプール
した。組織を、３７℃で１０分間、ＨＢＳＳ中１％トリプシンおよび０．０１％ＤＮａｓ
ｅ Ｉで処置した。組織片をＨＢＳＳ中室温で３回すすぎ、２５ｍＭグルコース、１％ペ
ニシリン／ストレプトマイシン、１％ウマ血清（ロット番号Ｂ０２３０７－７０２１；Ｈ
ｙＣｌｏｎｅ）、および１％ＦＢＳを含む最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）で分離した。ニュ
ーロンを、０．４μｍフィルターを通して濾過することによって分離し、Ｎｅｕｒｏｂａ
ｓａｌ－Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｇｌｕｔａｍ
ａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２％Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍ
ｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンか
らなるニューロン増殖培地中、ポリ－Ｌ－リジンコーティング皿に１２ウェル皿中１ウェ
ル当たり５×１０５個細胞、または９６ウェルガラスチャンバー中５×１０４個の密度で
蒔いた。２４時間後、ニューロンに完全な培地交換を受けさせて細胞破片を除去した。２
～３日毎に半分の培地を交換した。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で維持した。
【0083】
Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスの作製および遺伝子型判定
Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスを作製するための標的化ベクターは、Ｍｅｃｐ２エクソン
３、引き続いてイントロン３のフリッパーゼ認識標的（ｆｒｔ）隣接ネオマイシンカセッ
ト、Ｍｅｃｐ２エクソン４の最初の１．２ｋｂ、およびホスホグリセリン酸キナーゼプロ
モーター（ＰＧＫ）から発現されるネオマイシン耐性遺伝子からなっていた。線形構築物
をマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）に電気穿孔し、正しく標的化されたクローンをＧ４１８
感受性および配列決定によって同定した。ノックインＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ対立遺伝子を
発現するマウスを、標準的な手順によってｍＥＳＣから作製した。ネオマイシン耐性カセ
ットを、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスと、Ｒｏｓａ ２６遺伝子座からのフリッパーゼリ
コンビナーゼを発現するマウス（在庫番号００９０８６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を
交配することによって除去した。カセットの除去を配列決定によって確認した。
Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスを作製するための標的化ベクターは、Ｍｅｃｐ２エクソン
３、引き続いてイントロン３のフリッパーゼ認識標的（ｆｒｔ）隣接ネオマイシンカセッ
ト、Ｍｅｃｐ２エクソン４の最初の１．２ｋｂ、およびホスホグリセリン酸キナーゼプロ
モーター（ＰＧＫ）から発現されるネオマイシン耐性遺伝子からなっていた。線形構築物
をマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）に電気穿孔し、正しく標的化されたクローンをＧ４１８
感受性および配列決定によって同定した。ノックインＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ対立遺伝子を
発現するマウスを、標準的な手順によってｍＥＳＣから作製した。ネオマイシン耐性カセ
ットを、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスと、Ｒｏｓａ ２６遺伝子座からのフリッパーゼリ
コンビナーゼを発現するマウス（在庫番号００９０８６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を
交配することによって除去した。カセットの除去を配列決定によって確認した。
【0084】
Ｍｅｃｐ２遺伝子の第３のイントロンの領域を増幅する以下のプライマー：Ｍｅｃｐ２
－Ｒ１０６Ｑ Ｆｗｄ（５′ ｇｇａｃｃｔａｔｇｔａｔｇａｔｇａｃｃｃ ３′（配列
番号５０））およびＭｅｃｐ２－Ｒ１０６Ｑ Ｒｅｖ（５′ ｇｇｔｃａｔｔｇｇｇｃｔ
ａｇａｃｔｇａａ ３′（配列番号５１））を使用して、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスの
遺伝子型判定を実施した。Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑノックイン動物のアンプリコンは、ネオ
マイシンカセットを除去するために使用された残りのｆｒｔ部位を含んでいるので、ＰＣ
Ｒ産物が野生型よりも９３塩基対大きくなっている（３９２ｂｐ対２９９ｂｐ）。
－Ｒ１０６Ｑ Ｆｗｄ（５′ ｇｇａｃｃｔａｔｇｔａｔｇａｔｇａｃｃｃ ３′（配列
番号５０））およびＭｅｃｐ２－Ｒ１０６Ｑ Ｒｅｖ（５′ ｇｇｔｃａｔｔｇｇｇｃｔ
ａｇａｃｔｇａａ ３′（配列番号５１））を使用して、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスの
遺伝子型判定を実施した。Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑノックイン動物のアンプリコンは、ネオ
マイシンカセットを除去するために使用された残りのｆｒｔ部位を含んでいるので、ＰＣ
Ｒ産物が野生型よりも９３塩基対大きくなっている（３９２ｂｐ対２９９ｂｐ）。
【0085】
ＲＮＡ編集
Ｎ２Ａ細胞を分析するために、１２ウェルプレート中１ウェル当たり１．３×１０３個
細胞の密度で細胞を播種した。２４時間後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）低血清培地（Ｔｈ
ｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中２：１比のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ
ｎ（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＤＮＡを
使用して、細胞を野生型またはＥ４８８Ｑエディターゼ（ｐＧＭ１０９０および１０９１
）、１コピーのガイド（ｐＧＭ１０９９、ｐＧＭ１１８１またはｐＧＭ１１０８）、およ
びＭｅｃｐ２－ｅｇｆｐ ｃＤＮＡ（ｐＧＭ１１７４、ｐＧＭ１１７２またはｐＧＭ１１
７３）を含むプラスミドでトランスフェクトした。１ウェル当たり添加したプラスミドＤ
ＮＡの量は、１２５ｎｇの標的、２５０ｎｇのエディターゼおよび２．５μｇのガイドで
あった。７２時間後、細胞を収集し、製造元の指示に従ってＰｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標
）ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＴＵＲＢ
Ｏ ＤＮＡフリー（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、残留プラスミドＤＮＡを
除去した。全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔ
ｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
を使用して逆転写し、オリゴｄＴを使用してプライミングした。トランスフェクトＭｅｃ
ｐ２－ｅｇｆｐ ｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３のＣＭＶプロモーターの５’プライマー
およびｅｇｆｐ遺伝子の逆方向プライマーを使用したＰＣＲによって配列分析のために増
幅した。初代ニューロンの編集分析のために、ＤＩＶ７で、５×１０５個の海馬初代ニュ
ーロンを、細胞１個当たり３～６×１０４個ウイルスゲノムの感染多重度でＡＡＶ１／２
で形質導入した。ウイルス量は、全培地量の５％を超えなかった。トランスフェクション
１週間後に細胞を収集し、トランスフェクトＮ２Ａ細胞について記載されるように編集効
率について分析した。
Ｎ２Ａ細胞を分析するために、１２ウェルプレート中１ウェル当たり１．３×１０３個
細胞の密度で細胞を播種した。２４時間後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）低血清培地（Ｔｈ
ｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中２：１比のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ
ｎ（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＤＮＡを
使用して、細胞を野生型またはＥ４８８Ｑエディターゼ（ｐＧＭ１０９０および１０９１
）、１コピーのガイド（ｐＧＭ１０９９、ｐＧＭ１１８１またはｐＧＭ１１０８）、およ
びＭｅｃｐ２－ｅｇｆｐ ｃＤＮＡ（ｐＧＭ１１７４、ｐＧＭ１１７２またはｐＧＭ１１
７３）を含むプラスミドでトランスフェクトした。１ウェル当たり添加したプラスミドＤ
ＮＡの量は、１２５ｎｇの標的、２５０ｎｇのエディターゼおよび２．５μｇのガイドで
あった。７２時間後、細胞を収集し、製造元の指示に従ってＰｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標
）ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＴＵＲＢ
Ｏ ＤＮＡフリー（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、残留プラスミドＤＮＡを
除去した。全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔ
ｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
を使用して逆転写し、オリゴｄＴを使用してプライミングした。トランスフェクトＭｅｃ
ｐ２－ｅｇｆｐ ｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３のＣＭＶプロモーターの５’プライマー
およびｅｇｆｐ遺伝子の逆方向プライマーを使用したＰＣＲによって配列分析のために増
幅した。初代ニューロンの編集分析のために、ＤＩＶ７で、５×１０５個の海馬初代ニュ
ーロンを、細胞１個当たり３～６×１０４個ウイルスゲノムの感染多重度でＡＡＶ１／２
で形質導入した。ウイルス量は、全培地量の５％を超えなかった。トランスフェクション
１週間後に細胞を収集し、トランスフェクトＮ２Ａ細胞について記載されるように編集効
率について分析した。
【0086】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）およびＰＣＲ産物の直接配列決定によって、ＡからＩへ
の編集の効率を決定した。アンチセンス鎖からの配列ピーク高さの定量化を、Ｂｉｏｅｄ
ｉｔソフトウェアパッケージ（ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ ｂｉｏ
ｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ；Ｆｉｌｅ ＞ Ｂａｔｃｈ Ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ Ｒａｗ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ）を使用して、四色素トレース配列を処理することに
よって決定した。次いで、各部位での編集量を、所与の部位でのＴ（非編集）およびＣ（
編集）ピークの最大高さを使用し、編集されたｃＤＮＡの百分率を計算して決定した｛１
００％×［Ｃ高さ／（Ｔ高さ＋Ｃ高さ）］｝。５％編集検出限界を、比率が低下するＲ１
０６Ｑ突然変異体と野生型Ｍｅｃｐ２プラスミドを含む混合物のＧ－Ａピーク高さを測定
することによって決定した。センス鎖のＡ／Ｇピーク高さを使用するよりも正確であるた
め、アンチセンス鎖のＣ／Ｔピーク高さを定量化した（Ｅｇｇｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａｌ
．（２０１１）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２：３１９）。しかしながら、明確にするため
に、全てのクロマトグラムを逆相補鎖で示している。
の編集の効率を決定した。アンチセンス鎖からの配列ピーク高さの定量化を、Ｂｉｏｅｄ
ｉｔソフトウェアパッケージ（ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ ｂｉｏ
ｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ；Ｆｉｌｅ ＞ Ｂａｔｃｈ Ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ Ｒａｗ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ）を使用して、四色素トレース配列を処理することに
よって決定した。次いで、各部位での編集量を、所与の部位でのＴ（非編集）およびＣ（
編集）ピークの最大高さを使用し、編集されたｃＤＮＡの百分率を計算して決定した｛１
００％×［Ｃ高さ／（Ｔ高さ＋Ｃ高さ）］｝。５％編集検出限界を、比率が低下するＲ１
０６Ｑ突然変異体と野生型Ｍｅｃｐ２プラスミドを含む混合物のＧ－Ａピーク高さを測定
することによって決定した。センス鎖のＡ／Ｇピーク高さを使用するよりも正確であるた
め、アンチセンス鎖のＣ／Ｔピーク高さを定量化した（Ｅｇｇｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａｌ
．（２０１１）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２：３１９）。しかしながら、明確にするため
に、全てのクロマトグラムを逆相補鎖で示している。
【0087】
ウエスタンブロッティング
ＡＡＶ１／２で形質導入された初代海馬ニューロンを、１００μＬの全細胞溶解緩衝液
（２５ｍＭ トリス、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６
３０；Ｓｉｇｍａ）、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤（完
全ＥＤＴＡフリー；Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ βメルカプトエタノール、および２５０ユニ
ット／ｍＬベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。可溶化物を４℃で
１０分間、９３００×ｇで遠心分離し、可溶性画分を単離した。ＢＣＡタンパク質アッセ
イキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、タンパク質濃度を
測定した。等量のタンパク質可溶化物を、Ｍｏｐｓ－ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中ＮｕＰａｇｅ（登録商標）４～１２％ビス－ト
リスゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離し、タンパク質
をニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に
ブロッティングした。膜を、１ｘ ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を
含むＴＢＳ）中３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、次いで、ウサギ抗ｍＭｅＣＰ２（Ｃ
ｏｖａｎｃｅ）またはウサギ抗β－アクチン（８２２７；Ａｂｃａｍ）のいずれかと４℃
で一晩インキュベートした。１ｘＴＢＳＴで３回洗浄した後、ブロットを抗ウサギＩｇＧ
ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６８０（１：１００００希釈；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ）と１時間インキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してブロットを定量化
した。
ＡＡＶ１／２で形質導入された初代海馬ニューロンを、１００μＬの全細胞溶解緩衝液
（２５ｍＭ トリス、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６
３０；Ｓｉｇｍａ）、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤（完
全ＥＤＴＡフリー；Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ βメルカプトエタノール、および２５０ユニ
ット／ｍＬベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。可溶化物を４℃で
１０分間、９３００×ｇで遠心分離し、可溶性画分を単離した。ＢＣＡタンパク質アッセ
イキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、タンパク質濃度を
測定した。等量のタンパク質可溶化物を、Ｍｏｐｓ－ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中ＮｕＰａｇｅ（登録商標）４～１２％ビス－ト
リスゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離し、タンパク質
をニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に
ブロッティングした。膜を、１ｘ ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を
含むＴＢＳ）中３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、次いで、ウサギ抗ｍＭｅＣＰ２（Ｃ
ｏｖａｎｃｅ）またはウサギ抗β－アクチン（８２２７；Ａｂｃａｍ）のいずれかと４℃
で一晩インキュベートした。１ｘＴＢＳＴで３回洗浄した後、ブロットを抗ウサギＩｇＧ
ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６８０（１：１００００希釈；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ）と１時間インキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してブロットを定量化
した。
【0088】
免疫染色
海馬初代ニューロンを、室温で２０分間、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し
た。固定した細胞を、室温で１０分間、１×ＰＢＳＧ（１×ＰＢＳ中０．１Ｍグリシン）
で２回洗浄した。次いで、細胞をブロッキングし、４°Ｃで１時間、透過処理し［０．５
％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、Ｓｉｇｍａ；１ｘＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ソース）］、加
湿チャンバー中４℃で一晩、ＭｅＣＰ２（ウサギｍＡｂ Ｄ４Ｆ３；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎ
ａｌｉｎｇ）およびＨＡ（ラットｍＡｂ ３Ｆ１０；Ｒｏｃｈｅ）に対して産生された一
次抗体とインキュベートした。細胞を０．５％Ｉｇｅｐａｌを含む１×ＰＢＳで３回洗浄
し、二次抗体Ａｌｅｘａ ４８８およびＡｌｅｘａ ５６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１時間インキュベートした。０．５％Ｉｇｅｐａｌを含む
１×ＰＢＳでさらに洗浄した後、細胞を３００ｎＭ ＤＡＰＩと５分間インキュベートし
、次いで、１×ＰＢＳで再度洗浄した。細胞を、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ褪
色防止試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して一晩マウ
ントした。全ての画像を、４０倍水浸対物レンズを使用して、Ｚｅｉｓｓ ７１０共焦点
顕微鏡で０．５μｍの光学切片のｚスタックとして取得した。ＨＡおよびＭｅＣＰ２蛍光
像を、全ての試料にわたって同じ設定を使用して取得した。総細胞数または抗体陽性細胞
の数を、ＩｍａｇｅＪ細胞カウンタープラグイン（国立衛生研究所、ｉｍａｇｅｊ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／ｉｊ、バージョン１．６０＿６５（３２ビット））によって決定した。
海馬初代ニューロンを、室温で２０分間、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し
た。固定した細胞を、室温で１０分間、１×ＰＢＳＧ（１×ＰＢＳ中０．１Ｍグリシン）
で２回洗浄した。次いで、細胞をブロッキングし、４°Ｃで１時間、透過処理し［０．５
％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、Ｓｉｇｍａ；１ｘＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ソース）］、加
湿チャンバー中４℃で一晩、ＭｅＣＰ２（ウサギｍＡｂ Ｄ４Ｆ３；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎ
ａｌｉｎｇ）およびＨＡ（ラットｍＡｂ ３Ｆ１０；Ｒｏｃｈｅ）に対して産生された一
次抗体とインキュベートした。細胞を０．５％Ｉｇｅｐａｌを含む１×ＰＢＳで３回洗浄
し、二次抗体Ａｌｅｘａ ４８８およびＡｌｅｘａ ５６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１時間インキュベートした。０．５％Ｉｇｅｐａｌを含む
１×ＰＢＳでさらに洗浄した後、細胞を３００ｎＭ ＤＡＰＩと５分間インキュベートし
、次いで、１×ＰＢＳで再度洗浄した。細胞を、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ褪
色防止試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して一晩マウ
ントした。全ての画像を、４０倍水浸対物レンズを使用して、Ｚｅｉｓｓ ７１０共焦点
顕微鏡で０．５μｍの光学切片のｚスタックとして取得した。ＨＡおよびＭｅＣＰ２蛍光
像を、全ての試料にわたって同じ設定を使用して取得した。総細胞数または抗体陽性細胞
の数を、ＩｍａｇｅＪ細胞カウンタープラグイン（国立衛生研究所、ｉｍａｇｅｊ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／ｉｊ、バージョン１．６０＿６５（３２ビット））によって決定した。
【0089】
統計分析
全ての統計は、ＧｒａｐｈＰａｄバージョン６．０ソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ）を使用
して実施した。Ｎ２Ａ細胞でのＡからＩへの編集の百分率を、一元配置分散分析を使用し
て分析し、引き続いて、ボンフェローニ事後検定を使用して分析した。Ｍｅｃｐ２Ｒ１０
６Ｑ／ｙ形質導入ニューロンでのＡからＩへの編集のレベル、ＭｅＣＰ２タンパク質レベ
ルを比較するウエスタンブロット、およびヘテロクロマチン構造でのＭｅＣＰ２濃縮を示
すニューロンの数を、それぞれ対応のないｔ検定を使用して分析した。全ての実験結果を
平均±ＳＤとして表す。
全ての統計は、ＧｒａｐｈＰａｄバージョン６．０ソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ）を使用
して実施した。Ｎ２Ａ細胞でのＡからＩへの編集の百分率を、一元配置分散分析を使用し
て分析し、引き続いて、ボンフェローニ事後検定を使用して分析した。Ｍｅｃｐ２Ｒ１０
６Ｑ／ｙ形質導入ニューロンでのＡからＩへの編集のレベル、ＭｅＣＰ２タンパク質レベ
ルを比較するウエスタンブロット、およびヘテロクロマチン構造でのＭｅＣＰ２濃縮を示
すニューロンの数を、それぞれ対応のないｔ検定を使用して分析した。全ての実験結果を
平均±ＳＤとして表す。
【0090】
結果
異種的に発現されるＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡへの標的化エディターゼによってＭｅｃｐ２
Ｇ＞Ａ突然変異を修復することができる
ヒトＭＥＣＰ２には古典的レット症候群を引き起こす少なくとも３つのＧ＞Ａ突然変異
がある。ＭｅＣＰ２Ｒ１０６ＱとＭｅＣＰ２Ｗ１０４Ｘの２つの突然変異はメチルＤＮＡ
結合ドメイン（ＭＢＤ）内に存在し、１つの、ＭｅＣＰ２Ｒ３０６ＨはＮＣｏＲ相互作用
ドメイン（ＮＩＤ）に存在する（Ｆｙｆｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ．
Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：７０９－７１３；Ｌｙｓｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６：８９８－９０２）（図１Ａ）。エディターゼがこれらの突然
変異を修復できるかどうかを決定するために、エディターゼ、ガイドＲＮＡおよびＭｅｃ
ｐ２ ｃＤＮＡのＮ２Ａ細胞への一過的トランスフェクション後に、編集を試験した。異
種的に発現されるＭｅＣＰ２タンパク質を内因性のものと区別するために、異種的に発現
されるＭｅＣＰ２にＣ末端ｅＧＦＰをタグ付けした。エディターゼおよびＭｅｃｐ２－ｇ
ｆｐ ｃＤＮＡが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター－エンハ
ンサーから発現され、ガイドが、ヒトＵ６核内低分子ＲＮＡ遺伝子プロモーターから発現
された。ＡＤＡＲ２が一次転写産物として核内の内因性ｍＲＮＡを編集するので、λＮペ
プチドに加えて、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原核局在化シグナル（ＮＬＳ）の３つ
のコピーを、エディターゼに付加した（Ｄｅｓｔｅｒｒｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，１１６：１８０５－１８１８）。各ガイドＲＮＡは、λＮペプチ
ドによって認識される配列を表す２つのステムループ（ＢｏｘＢ）を含んでいる。１つの
ＢｏｘＢステムループは標的Ａの５’の１６～１８塩基に位置し、２つ目は標的Ａの３’
の１０塩基に位置する（図１Ｂ）。標的Ａに対するステムループの数および位置は、研究
に基づき（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ
ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－
１８２９０）、トランスフェクション分析でＭｅｃｐ２について経験的に決定した。編集
は、相補的ガイドのその部位でのＣミスマッチで最適であり（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ
ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：ｅ８７；Ｗｏｎｇ
，ｅｔ ａｌ．（２００１）ＲＮＡ ７：８４６－８５８；Ｋａｌｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ
．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：４８７４－４８８１）、
全てのＭｅｃｐ２ガイドｍＲＮＡがこのミスマッチを含んでいる。
異種的に発現されるＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡへの標的化エディターゼによってＭｅｃｐ２
Ｇ＞Ａ突然変異を修復することができる
ヒトＭＥＣＰ２には古典的レット症候群を引き起こす少なくとも３つのＧ＞Ａ突然変異
がある。ＭｅＣＰ２Ｒ１０６ＱとＭｅＣＰ２Ｗ１０４Ｘの２つの突然変異はメチルＤＮＡ
結合ドメイン（ＭＢＤ）内に存在し、１つの、ＭｅＣＰ２Ｒ３０６ＨはＮＣｏＲ相互作用
ドメイン（ＮＩＤ）に存在する（Ｆｙｆｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ．
Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：７０９－７１３；Ｌｙｓｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６：８９８－９０２）（図１Ａ）。エディターゼがこれらの突然
変異を修復できるかどうかを決定するために、エディターゼ、ガイドＲＮＡおよびＭｅｃ
ｐ２ ｃＤＮＡのＮ２Ａ細胞への一過的トランスフェクション後に、編集を試験した。異
種的に発現されるＭｅＣＰ２タンパク質を内因性のものと区別するために、異種的に発現
されるＭｅＣＰ２にＣ末端ｅＧＦＰをタグ付けした。エディターゼおよびＭｅｃｐ２－ｇ
ｆｐ ｃＤＮＡが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター－エンハ
ンサーから発現され、ガイドが、ヒトＵ６核内低分子ＲＮＡ遺伝子プロモーターから発現
された。ＡＤＡＲ２が一次転写産物として核内の内因性ｍＲＮＡを編集するので、λＮペ
プチドに加えて、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原核局在化シグナル（ＮＬＳ）の３つ
のコピーを、エディターゼに付加した（Ｄｅｓｔｅｒｒｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，１１６：１８０５－１８１８）。各ガイドＲＮＡは、λＮペプチ
ドによって認識される配列を表す２つのステムループ（ＢｏｘＢ）を含んでいる。１つの
ＢｏｘＢステムループは標的Ａの５’の１６～１８塩基に位置し、２つ目は標的Ａの３’
の１０塩基に位置する（図１Ｂ）。標的Ａに対するステムループの数および位置は、研究
に基づき（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ
ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－
１８２９０）、トランスフェクション分析でＭｅｃｐ２について経験的に決定した。編集
は、相補的ガイドのその部位でのＣミスマッチで最適であり（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ
ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：ｅ８７；Ｗｏｎｇ
，ｅｔ ａｌ．（２００１）ＲＮＡ ７：８４６－８５８；Ｋａｌｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ
．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：４８７４－４８８１）、
全てのＭｅｃｐ２ガイドｍＲＮＡがこのミスマッチを含んでいる。
【0091】
Ｎ２Ａ細胞を、エディターゼ、ＭｅＣＰ２－ＧＦＰをコードする別個のプラスミド、お
よびガイド配列を含むまたは欠く第３のプラスミドでコトランスフェクトした。３日後、
サンガー法を使用して、Ｍｅｃｐ２－ｇｆｐ ｍＲＮＡの標的領域から合成されたｃＤＮ
Ａを分析した（図１Ｃおよび図１Ｄ）。標的Ａ位置での相対ピーク高さを決定することに
よって、編集効率を測定した。３つ全てのＭｅｃｐ２突然変異がガイド依存的に編集され
、二本鎖ＲＮＡを必要とするＡＤＡＲ２媒介編集と一致していた（図１Ｃおよび図１Ｄ）
。標的Ａの編集％は、ＡＤＡＲ２触媒ドメインの配列優先性と同様に、５’ヌクレオチド
の環境によって変化した（Ｅｇｇｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．，２：３１９；Ｌｅｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３９：１２８７５－１２８８４）。具体的には、インビトロスクリーニングに
基づいて、ＡＤＡＲ２触媒ドメインによるＡ脱アミノ化に最適な５’ヌクレオチド階層は
Ｕ＞Ａ＞Ｃ＞Ｇであり、最も最適な３’ヌクレオチドはＣ～Ｇ～Ａ＞Ｕである。Ｗ１０４
Ｘ（ＵＡＧ）が最も効率的に編集され（７６±１０％）、Ｒ３０６Ｈ（ＣＡＣ、３４±３
％）およびＲ１０６Ｑ（ＣＡＡ、２５±２％）が続くが、Ｍｅｃｐ２の場合、統計学的に
差はなかった（図１Ｄ）。Ｍｅｃｐ２ Ｇ＞Ａ突然変異を修復するためのエディターゼシ
ステムをさらに最適化するために、ヒト患者ではＷ１０４Ｘ突然変異よりも一般的であり
、Ｒ３０６Ｈよりも重度の形態のレット症候群を引き起こすために、Ｒ１０６Ｑに焦点を
当てた（Ｆｙｆｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：
７０９－７１３；Ｃｕｄｄａｐａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ
．，５１：１５２－１５８）。
よびガイド配列を含むまたは欠く第３のプラスミドでコトランスフェクトした。３日後、
サンガー法を使用して、Ｍｅｃｐ２－ｇｆｐ ｍＲＮＡの標的領域から合成されたｃＤＮ
Ａを分析した（図１Ｃおよび図１Ｄ）。標的Ａ位置での相対ピーク高さを決定することに
よって、編集効率を測定した。３つ全てのＭｅｃｐ２突然変異がガイド依存的に編集され
、二本鎖ＲＮＡを必要とするＡＤＡＲ２媒介編集と一致していた（図１Ｃおよび図１Ｄ）
。標的Ａの編集％は、ＡＤＡＲ２触媒ドメインの配列優先性と同様に、５’ヌクレオチド
の環境によって変化した（Ｅｇｇｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．，２：３１９；Ｌｅｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３９：１２８７５－１２８８４）。具体的には、インビトロスクリーニングに
基づいて、ＡＤＡＲ２触媒ドメインによるＡ脱アミノ化に最適な５’ヌクレオチド階層は
Ｕ＞Ａ＞Ｃ＞Ｇであり、最も最適な３’ヌクレオチドはＣ～Ｇ～Ａ＞Ｕである。Ｗ１０４
Ｘ（ＵＡＧ）が最も効率的に編集され（７６±１０％）、Ｒ３０６Ｈ（ＣＡＣ、３４±３
％）およびＲ１０６Ｑ（ＣＡＡ、２５±２％）が続くが、Ｍｅｃｐ２の場合、統計学的に
差はなかった（図１Ｄ）。Ｍｅｃｐ２ Ｇ＞Ａ突然変異を修復するためのエディターゼシ
ステムをさらに最適化するために、ヒト患者ではＷ１０４Ｘ突然変異よりも一般的であり
、Ｒ３０６Ｈよりも重度の形態のレット症候群を引き起こすために、Ｒ１０６Ｑに焦点を
当てた（Ｆｙｆｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：
７０９－７１３；Ｃｕｄｄａｐａｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ
．，５１：１５２－１５８）。
【0092】
デアミナーゼドメインの突然変異、Ｅ４８８Ｑはハイブリッドエディターゼの編集効率
を増加させる
Ｅ４８８Ｑ突然変異を含むｈＡＤＡＲ２触媒ドメインは、触媒速度（Ｍｏｎｔｉｅｌ－
Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
４４：ｅ１５７；Ｋｕｔｔａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ３２９５－Ｅ３３０４）と基質ＲＮＡに対する触媒ドメインの
親和性（Ｌｅｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：
１２８７５－１２８８４）の両方を増加させることによって、Ａ＞Ｉ編集効率を増加させ
る。この特徴により、Ｅ４８８Ｑ突然変異が、好ましくない５’および３’環境のより高
い編集レベルを達成することが可能になる（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ
ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｋｕｔｔ
ａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ
３２９５－Ｅ３３０４）。ＥｄｉｔａｓｅＥ４８８Ｑが、最適以下５’Ｃを有するＭｅｃ
ｐ２Ｒ１０６Ｑの標的Ａの編集効率を増加させるかどうかを試験するために、Ｎ２Ａ細胞
をＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ－ｅｇｆｐおよびエディターゼＥ４８８Ｑ ｃＤＮＡでコトラン
スフェクトした。配列分析により、編集にはガイド発現が必要であり、Ｍｅｃｐ２ ｍＲ
ＮＡの編集％が、野生型エディターゼと比較してエディターゼＥ４８８Ｑで約２倍増加す
ることが示された（５１±１１％対２２±５％、ｎ＝３、Ｐ＜０．０１）（図２Ａ）。
を増加させる
Ｅ４８８Ｑ突然変異を含むｈＡＤＡＲ２触媒ドメインは、触媒速度（Ｍｏｎｔｉｅｌ－
Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
４４：ｅ１５７；Ｋｕｔｔａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ３２９５－Ｅ３３０４）と基質ＲＮＡに対する触媒ドメインの
親和性（Ｌｅｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：
１２８７５－１２８８４）の両方を増加させることによって、Ａ＞Ｉ編集効率を増加させ
る。この特徴により、Ｅ４８８Ｑ突然変異が、好ましくない５’および３’環境のより高
い編集レベルを達成することが可能になる（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ
ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｋｕｔｔ
ａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ
３２９５－Ｅ３３０４）。ＥｄｉｔａｓｅＥ４８８Ｑが、最適以下５’Ｃを有するＭｅｃ
ｐ２Ｒ１０６Ｑの標的Ａの編集効率を増加させるかどうかを試験するために、Ｎ２Ａ細胞
をＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ－ｅｇｆｐおよびエディターゼＥ４８８Ｑ ｃＤＮＡでコトラン
スフェクトした。配列分析により、編集にはガイド発現が必要であり、Ｍｅｃｐ２ ｍＲ
ＮＡの編集％が、野生型エディターゼと比較してエディターゼＥ４８８Ｑで約２倍増加す
ることが示された（５１±１１％対２２±５％、ｎ＝３、Ｐ＜０．０１）（図２Ａ）。
【0093】
ハイブリッドエディターゼに野生型ｈＡＤＡＲ２またはｈＡＤＡＲ２Ｅ４８８Ｑ触媒ド
メインを使用して、トランスフェクトＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ－ｅｇｆｐ ｃＤＮＡのガイ
ド領域内に１つのオフターゲット編集部位を検出した（図２Ｂ）。この部位で編集すると
、サイレントコドン変化Ｔ１０５Ｔ（ＡＣＡ＞ＡＣＧ）が生じる。オフターゲット部位で
のＧミスマッチは、トランスフェクト基質におけるオフターゲット編集を減少させること
ができる（Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ
．Ｅｎｇｌ．，５３：６２６７－６２７１）。ＧミスマッチがＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡのオ
フターゲット編集も減少させるかどうかを決定するために、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ－ｅｇ
ｆｐ ｃＤＮＡ、エディターゼＥ４８８Ｑ、および近くのオフターゲットＡでＧミスマッ
チを有するガイドをコードするプラスミドでトランスフェクトしたＮ２Ａ細胞で編集効率
を分析した（図２Ｃ）。Ａ－Ｇミスマッチを含むガイドでエディターゼを標的とした場合
、オフターゲット編集の量が有意に減少した（４．９±０％ミスマッチあり、３３±５％
ミスマッチなし、ｎ＝３、Ｐ＜０．０００１；図２Ｄおよび図２Ｅ）が、標的Ａでの編集
には有意な効果はなかった（図２Ｄおよび図２Ｆ）。編集イベントの全てで、ガイドＲＮ
Ａの存在が必要であった（図２Ｅおよび図２Ｆ）。
メインを使用して、トランスフェクトＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ－ｅｇｆｐ ｃＤＮＡのガイ
ド領域内に１つのオフターゲット編集部位を検出した（図２Ｂ）。この部位で編集すると
、サイレントコドン変化Ｔ１０５Ｔ（ＡＣＡ＞ＡＣＧ）が生じる。オフターゲット部位で
のＧミスマッチは、トランスフェクト基質におけるオフターゲット編集を減少させること
ができる（Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ
．Ｅｎｇｌ．，５３：６２６７－６２７１）。ＧミスマッチがＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡのオ
フターゲット編集も減少させるかどうかを決定するために、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ－ｅｇ
ｆｐ ｃＤＮＡ、エディターゼＥ４８８Ｑ、および近くのオフターゲットＡでＧミスマッ
チを有するガイドをコードするプラスミドでトランスフェクトしたＮ２Ａ細胞で編集効率
を分析した（図２Ｃ）。Ａ－Ｇミスマッチを含むガイドでエディターゼを標的とした場合
、オフターゲット編集の量が有意に減少した（４．９±０％ミスマッチあり、３３±５％
ミスマッチなし、ｎ＝３、Ｐ＜０．０００１；図２Ｄおよび図２Ｅ）が、標的Ａでの編集
には有意な効果はなかった（図２Ｄおよび図２Ｆ）。編集イベントの全てで、ガイドＲＮ
Ａの存在が必要であった（図２Ｅおよび図２Ｆ）。
【0094】
部位特異的ＲＮＡ編集は内因性のレットの原因となる突然変異を修復し、タンパク質レ
ベルおよびＭｅＣＰ２機能を回復する
次に、エディターゼＥ４８８Ｑが（ｉ）内因性Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡのＲ１０６Ｑミス
センス突然変異を修復し、（ｉｉ）タンパク質レベルを回復し、（ｉｉｉ）マウスでのレ
ット様症状を逆転するのに必要な特徴的な機能的特徴であるヘテロクロマチンに結合する
ＭｅＣＰ２の能力を回復することができるかどうかを試験した（Ｇａｒｇ，ｅｔ ａｌ．
（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３３：１３６１２－１３６２０）。これらの試験
では、ニューロンをマウスから単離し、内因性Ｍｅｃｐ２遺伝子にＲ１０６Ｑ突然変異を
含むように操作した。培養ニューロンを、２つのＡＡＶ（ＡＡＶ１／２）のいずれかで形
質導入した。両ウイルスがヒトシナプシンＩプロモーターの制御下でエディターゼＥ４８
８Ｑを発現し（Ｓｗｉｅｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．，３３：１０２－１０６）、１つのウイルスはそれぞれがヒトＵ６プロモーターの制御
下にある６コピーのガイド（オフターゲットミスマッチガイド；図２Ｃ）をさらに含んで
いた。他のウイルスは対照として機能し、全てのガイド配列を欠いていた。海馬ニューロ
ンをＰ０ Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙマウスから作製し、インビトロで７日（ＤＩＶ７）
のＡＡＶ１／２ハイブリッドカプシドを有するガイド含有または対照ＡＡＶベクターで形
質導入した。さらに７日間ウイルスを発現させた後、Ｍｅｃｐ２ ｃＤＮＡを実験培養物
および対照培養物から調製し、サンガー法によって分析した。エディターゼとガイドの両
方を発現する培養物では、Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡの７２±５％が修復されるが（図３Ａ）
、ガイドを欠く対照ウイルスで形質導入したニューロンでは編集が検出されなかった。Ｒ
１０６Ｑでの編集に加えて、配列分析は、Ｍｅｃｐ２ ｃＤＮＡ内のいくつかのオフター
ゲット編集部位も同定した（図３Ｂ）。オフターゲット部位は、ガイドＲＮＡに相補的な
領域内で主に発生したが、１つのイベントはガイドの外（Ｎ１２６Ｓ）で発生した。
ベルおよびＭｅＣＰ２機能を回復する
次に、エディターゼＥ４８８Ｑが（ｉ）内因性Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡのＲ１０６Ｑミス
センス突然変異を修復し、（ｉｉ）タンパク質レベルを回復し、（ｉｉｉ）マウスでのレ
ット様症状を逆転するのに必要な特徴的な機能的特徴であるヘテロクロマチンに結合する
ＭｅＣＰ２の能力を回復することができるかどうかを試験した（Ｇａｒｇ，ｅｔ ａｌ．
（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３３：１３６１２－１３６２０）。これらの試験
では、ニューロンをマウスから単離し、内因性Ｍｅｃｐ２遺伝子にＲ１０６Ｑ突然変異を
含むように操作した。培養ニューロンを、２つのＡＡＶ（ＡＡＶ１／２）のいずれかで形
質導入した。両ウイルスがヒトシナプシンＩプロモーターの制御下でエディターゼＥ４８
８Ｑを発現し（Ｓｗｉｅｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．，３３：１０２－１０６）、１つのウイルスはそれぞれがヒトＵ６プロモーターの制御
下にある６コピーのガイド（オフターゲットミスマッチガイド；図２Ｃ）をさらに含んで
いた。他のウイルスは対照として機能し、全てのガイド配列を欠いていた。海馬ニューロ
ンをＰ０ Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙマウスから作製し、インビトロで７日（ＤＩＶ７）
のＡＡＶ１／２ハイブリッドカプシドを有するガイド含有または対照ＡＡＶベクターで形
質導入した。さらに７日間ウイルスを発現させた後、Ｍｅｃｐ２ ｃＤＮＡを実験培養物
および対照培養物から調製し、サンガー法によって分析した。エディターゼとガイドの両
方を発現する培養物では、Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡの７２±５％が修復されるが（図３Ａ）
、ガイドを欠く対照ウイルスで形質導入したニューロンでは編集が検出されなかった。Ｒ
１０６Ｑでの編集に加えて、配列分析は、Ｍｅｃｐ２ ｃＤＮＡ内のいくつかのオフター
ゲット編集部位も同定した（図３Ｂ）。オフターゲット部位は、ガイドＲＮＡに相補的な
領域内で主に発生したが、１つのイベントはガイドの外（Ｎ１２６Ｓ）で発生した。
【0095】
ウエスタンブロッティングによりＡＡＶ１／２形質導入培養物中のＭｅＣＰ２タンパク
質の量を測定することによって、ＲＮＡ編集の機能的結果を試験した。ＭＢＤの他の突然
変異と同様に（Ｇｏｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，
１５：２７４－２８３；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
ｅｔ．，２５：５５８－５７０）、ＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑタンパク質レベルは野生型レベ
ルと比較して低下している（図４）。突然変異ＭｅＣＰ２タンパク質のレベルの低下は、
不安定化が原因である可能性がある（Ｇｏｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：２７４－２８３）。突然変異初代ニューロンにおけるエディ
ターゼおよびガイドの発現は、エディターゼのみの発現と比較して、ＭｅＣＰ２タンパク
質レベルを約３倍増加させた（図４；１２．９±１％ガイドなしと比較して、３５．３±
２％ガイドあり、ｎ＝３、Ｐ＜０．００１）。これは、編集後の内因性疾患の原因となる
タンパク質の機能的回復を初めて実証している。
質の量を測定することによって、ＲＮＡ編集の機能的結果を試験した。ＭＢＤの他の突然
変異と同様に（Ｇｏｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，
１５：２７４－２８３；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
ｅｔ．，２５：５５８－５７０）、ＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑタンパク質レベルは野生型レベ
ルと比較して低下している（図４）。突然変異ＭｅＣＰ２タンパク質のレベルの低下は、
不安定化が原因である可能性がある（Ｇｏｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：２７４－２８３）。突然変異初代ニューロンにおけるエディ
ターゼおよびガイドの発現は、エディターゼのみの発現と比較して、ＭｅＣＰ２タンパク
質レベルを約３倍増加させた（図４；１２．９±１％ガイドなしと比較して、３５．３±
２％ガイドあり、ｎ＝３、Ｐ＜０．００１）。これは、編集後の内因性疾患の原因となる
タンパク質の機能的回復を初めて実証している。
【0096】
ＭｅＣＰ２は、インビトロとインビボの両方でメチル－ＣｐＧに高い親和性で結合し（
Ｓｋｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，３７：４５７－４６８；Ｌ
ａｇｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，１３：ｅ１００６７９
３）、これは正常な機能にとって重要な特性である。マウス細胞では、ＭｅＣＰ２のＭＢ
Ｄの突然変異により、ｍＣＧが豊富な増幅サテライト配列を含むヘテロクロマチンへの結
合が減少する（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，
２５：５５８－５７０；Ｈｅｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ｅＬｉｆｅ ３：ｅ
０２６７６）。ＭＢＤ突然変異であるＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑも、インビトロでメチル－Ｃ
ｐＧへの結合減少を示す（Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｌ．，１１：２７０６－２７１５）。ＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑが細胞内の結合を同様に減
少させたかどうか、およびＧ＞Ａ突然変異Ｍｅｃｐ２ ＲＮＡの編集がヘテロクロマチン
の濃縮を回復するかどうかを決定するために、核を、ガイドを含むまたは対照としてガイ
ドを含まない、ＨＡタグ付きエディターゼをコードするＡＡＶ１／２で形質導入したＭｅ
ｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙニューロン培養物で免疫標識した（図５）。ＤＮＡのＡ－Ｔに富む
領域に強く結合する蛍光指示薬であるＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルイ
ンドール）を使用して、核およびヘテロクロマチンを同定した。野生型ニューロン（Ｍｅ
ｃｐ２＋／ｙ）からの培養物では、核が、機能的なＭＢＤを反映して、ＤＡＰＩ染色ヘテ
ロクロマチン（構造）で古典的ＭｅＣＰ２濃縮を示した（図５Ａ）。対照的に、ガイド配
列を欠いたエディターゼウイルスで形質導入したＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙ同胞から調製
した培養物では、ＭｅＣＰ２免疫蛍光が、ＤＮＡへの結合を妨げるＭＢＤの突然変異が予
想されるように、核全体に散在して分布していた（Ｇｏｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１
１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：２７４－２８３；Ｈｅｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ
．（２０１４）ｅＬｉｆｅ ３：ｅ０２６７６）（図５Ｂ）。染色の強度も野生型核より
低く、おそらく不安定化ＭｅＣＰ２タンパク質を反映している。対照的に、エディターゼ
とガイドＲＮＡの両方を発現するＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑニューロンは、野生型核と同様の
レベルまでのＭｅＣＰ２免疫蛍光の明確な増加、およびヘテロクロマチン構造でＭｅＣＰ
２タンパク質の濃縮を示し、ＭＢＤの機能的回復を示した（図５Ｃおよび図５Ｄ）。免疫
蛍光の結果を定量化するために、ガイドの存在に関係なく、細胞の同じ割合でエディター
ゼが発現されることを３つの実験で最初に決定した（エディターゼのみ６７±７％、エデ
ィターゼおよびガイド６７±１０％；それぞれｎ＝１３４および１３７細胞；図５Ｅ）。
次いで、エディターゼおよびガイドで形質導入された培養物において、エディターゼを発
現している細胞の７４±１１％（図５Ｆ）および全細胞の４９±８％が、ヘテロクロマチ
ン構造でＭｅＣＰ２の濃縮を示している（図５Ｇ）ことが決定された。ＭｅＣＰ２の濃縮
は、ガイドを欠くウイルスで形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ核のヘテロクロマチン
構造内で検出されず、編集がガイドの存在に依存していることを示す配列決定結果と一致
している。
Ｓｋｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，３７：４５７－４６８；Ｌ
ａｇｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，１３：ｅ１００６７９
３）、これは正常な機能にとって重要な特性である。マウス細胞では、ＭｅＣＰ２のＭＢ
Ｄの突然変異により、ｍＣＧが豊富な増幅サテライト配列を含むヘテロクロマチンへの結
合が減少する（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，
２５：５５８－５７０；Ｈｅｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ｅＬｉｆｅ ３：ｅ
０２６７６）。ＭＢＤ突然変異であるＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑも、インビトロでメチル－Ｃ
ｐＧへの結合減少を示す（Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｌ．，１１：２７０６－２７１５）。ＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑが細胞内の結合を同様に減
少させたかどうか、およびＧ＞Ａ突然変異Ｍｅｃｐ２ ＲＮＡの編集がヘテロクロマチン
の濃縮を回復するかどうかを決定するために、核を、ガイドを含むまたは対照としてガイ
ドを含まない、ＨＡタグ付きエディターゼをコードするＡＡＶ１／２で形質導入したＭｅ
ｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙニューロン培養物で免疫標識した（図５）。ＤＮＡのＡ－Ｔに富む
領域に強く結合する蛍光指示薬であるＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルイ
ンドール）を使用して、核およびヘテロクロマチンを同定した。野生型ニューロン（Ｍｅ
ｃｐ２＋／ｙ）からの培養物では、核が、機能的なＭＢＤを反映して、ＤＡＰＩ染色ヘテ
ロクロマチン（構造）で古典的ＭｅＣＰ２濃縮を示した（図５Ａ）。対照的に、ガイド配
列を欠いたエディターゼウイルスで形質導入したＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙ同胞から調製
した培養物では、ＭｅＣＰ２免疫蛍光が、ＤＮＡへの結合を妨げるＭＢＤの突然変異が予
想されるように、核全体に散在して分布していた（Ｇｏｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１
１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：２７４－２８３；Ｈｅｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ
．（２０１４）ｅＬｉｆｅ ３：ｅ０２６７６）（図５Ｂ）。染色の強度も野生型核より
低く、おそらく不安定化ＭｅＣＰ２タンパク質を反映している。対照的に、エディターゼ
とガイドＲＮＡの両方を発現するＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑニューロンは、野生型核と同様の
レベルまでのＭｅＣＰ２免疫蛍光の明確な増加、およびヘテロクロマチン構造でＭｅＣＰ
２タンパク質の濃縮を示し、ＭＢＤの機能的回復を示した（図５Ｃおよび図５Ｄ）。免疫
蛍光の結果を定量化するために、ガイドの存在に関係なく、細胞の同じ割合でエディター
ゼが発現されることを３つの実験で最初に決定した（エディターゼのみ６７±７％、エデ
ィターゼおよびガイド６７±１０％；それぞれｎ＝１３４および１３７細胞；図５Ｅ）。
次いで、エディターゼおよびガイドで形質導入された培養物において、エディターゼを発
現している細胞の７４±１１％（図５Ｆ）および全細胞の４９±８％が、ヘテロクロマチ
ン構造でＭｅＣＰ２の濃縮を示している（図５Ｇ）ことが決定された。ＭｅＣＰ２の濃縮
は、ガイドを欠くウイルスで形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ核のヘテロクロマチン
構造内で検出されず、編集がガイドの存在に依存していることを示す配列決定結果と一致
している。
【0097】
ＡＤＡＲは、アフリカツメガエル卵母細胞で外因性ｍＲＮＡのＧ＞Ａ突然変異を修復す
るために使用されてきた（Ｗｏｏｌｆ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：８２９８－８３０２）。本明細書に提示されるデータは、操
作されたｈＡＤＡＲ２触媒ドメインを使用した部位特異的ＲＮＡ編集が内因性突然変異ｍ
ＲＮＡを修復し、突然変異によって引き起こされる細胞欠陥を逆転することができること
を実証している。
るために使用されてきた（Ｗｏｏｌｆ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：８２９８－８３０２）。本明細書に提示されるデータは、操
作されたｈＡＤＡＲ２触媒ドメインを使用した部位特異的ＲＮＡ編集が内因性突然変異ｍ
ＲＮＡを修復し、突然変異によって引き起こされる細胞欠陥を逆転することができること
を実証している。
【0098】
マウスおよびヒトでは、３つの遺伝子がＡＤＡＲタンパク質をコードしているが、ＡＤ
ＡＲ１とＡＤＡＲ２のみがＡからＩへの触媒活性を示す（Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｋ．（２
０１０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９：３２１－３４９）。天然ＡＤＡＲ
媒介編集は、脳のタンパク質機能を転写後に調節するために非常に重要であり、イオンチ
ャネルおよび受容体で最初に示されている（Ｂｈａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ
ａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：９５０－９５６；Ｓｏｍｍｅｒ，ｅｔ
ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ ６７：１１－１９；Ｂｕｒｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９
７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：３０３－３０８）が、多くの他のタンパク質および非コード
ＲＮＡにも及ぶことが現在知られている（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ
．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３５３：１１１－１２１；Ｎｉｓｈ
ｉｋｕｒａ，Ｋ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１７：
８３－９６）。ＡＤＡＲ２触媒ドメインは、異種ｍＲＮＡを編集するその能力のため（Ｖ
ｏｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．
，５３：６２６７－６２７１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：ｅ８７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅ
ｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏ
ｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２９０；Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）
ＲＮＡ ７：８４６－８５８）およびその十分特徴付けられた編集機序のため（Ｋｕｔｔ
ａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ
３２９５－Ｅ３３０４；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）
Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２３：４２６－４３３）に、焦点を当てら
れた。実際、エディターゼが触媒ドメイン内にＥ４８８Ｑ突然変異を含む場合に、Ｍｅｃ
ｐ２ ｍＲＮＡの編集効率の向上が見られた（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ
ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｋｕｔ
ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：
Ｅ３２９５－Ｅ３３０４；Ｐｈｅｌｐｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４３：１１２３－１１３２）。二本鎖ＲＮＡに複合化されたｈＡＤ
ＡＲ２触媒ドメインの構造の解明（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ
．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３：４２６－４３３）が、ＭｅＣＰ２および他
の突然変異についての編集効率および特異性をさらに最適化するための他の突然変異を作
製するための価値ある資源を提供する（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：９８７２－９８８０）。以前の取り組みとは対照的
に、ＡＤＡＲは通常、核内の一次転写産物を編集するため、ここでの構築物の全てが、特
に内因性ｍＲＮＡの編集効率を増加させるＮＬＳを含んでいた（Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．
（２００１）ＲＮＡ ７：８４６－８５８）。
ＡＲ１とＡＤＡＲ２のみがＡからＩへの触媒活性を示す（Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｋ．（２
０１０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９：３２１－３４９）。天然ＡＤＡＲ
媒介編集は、脳のタンパク質機能を転写後に調節するために非常に重要であり、イオンチ
ャネルおよび受容体で最初に示されている（Ｂｈａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ
ａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：９５０－９５６；Ｓｏｍｍｅｒ，ｅｔ
ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ ６７：１１－１９；Ｂｕｒｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９
７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：３０３－３０８）が、多くの他のタンパク質および非コード
ＲＮＡにも及ぶことが現在知られている（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ
．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３５３：１１１－１２１；Ｎｉｓｈ
ｉｋｕｒａ，Ｋ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１７：
８３－９６）。ＡＤＡＲ２触媒ドメインは、異種ｍＲＮＡを編集するその能力のため（Ｖ
ｏｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．
，５３：６２６７－６２７１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：ｅ８７；Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅ
ｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏ
ｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５－１８２９０；Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）
ＲＮＡ ７：８４６－８５８）およびその十分特徴付けられた編集機序のため（Ｋｕｔｔ
ａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ
３２９５－Ｅ３３０４；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）
Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２３：４２６－４３３）に、焦点を当てら
れた。実際、エディターゼが触媒ドメイン内にＥ４８８Ｑ突然変異を含む場合に、Ｍｅｃ
ｐ２ ｍＲＮＡの編集効率の向上が見られた（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ
ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｋｕｔ
ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：
Ｅ３２９５－Ｅ３３０４；Ｐｈｅｌｐｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４３：１１２３－１１３２）。二本鎖ＲＮＡに複合化されたｈＡＤ
ＡＲ２触媒ドメインの構造の解明（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ
．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３：４２６－４３３）が、ＭｅＣＰ２および他
の突然変異についての編集効率および特異性をさらに最適化するための他の突然変異を作
製するための価値ある資源を提供する（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：９８７２－９８８０）。以前の取り組みとは対照的
に、ＡＤＡＲは通常、核内の一次転写産物を編集するため、ここでの構築物の全てが、特
に内因性ｍＲＮＡの編集効率を増加させるＮＬＳを含んでいた（Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．
（２００１）ＲＮＡ ７：８４６－８５８）。
【0099】
トランスフェクト細胞では、標的ＡでのエディターゼＥ４８８Ｑを使用したより高い編
集効率により、ガイド領域内の１つの部位でのオフターゲット編集も高くなった。単一オ
フターゲット編集部位は、Ｇ－Ａミスマッチを使用することによって減少した（Ｓｃｈｎ
ｅｉｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：
ｅ８７）。特に、標的ｍＲＮＡ以外の高度に発現されているｍＲＮＡを表す５つのｃＤＮ
Ａの配列決定は、オフターゲット編集を示さなかった（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅ
ｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７
）。しかし、また驚くべきことに、ニューロンを用いた本試験では、オフターゲット編集
部位が、トランスフェクトＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡと内因性Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡとの間で
異なっていた。具体的には、内因性の修復されたＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡでは、ｃＤＮＡか
ら発現されたＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡには存在しないガイド領域内および外側のいくつかの
追加のオフターゲット編集部位が見られた（図３Ｂ）。トランスフェクトＭｅｃｐ２ ｍ
ＲＮＡと内因性Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡとの間のオフターゲット編集部位の違いは、ＲＮＡ
の折りたたみおよび他の下流プロセシングイベントに影響を及ぼし得る配列の違いを反映
している可能性がある。重要なことに、内因性Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡのオフターゲット部
位のいずれもレット症候群を引き起こすことが報告されていない（Ｆｙｆｅ，ｅｔ ａｌ
．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：７０９－７１３）。レット症候
群マウスモデルをさらに使用して、症候性マウスの野生型ＭｅＣＰ２の回復によって細胞
および行動症状が逆転することを示すことができる（Ｇｕｙ，ｅｔ ａｌ．（２００７）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１１４３－１１４７；Ｓｉｎｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１
７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１０６－１１５；Ｇ
ａｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ
．Ｄｅｖ．，５：１８０－１９０；Ｇａｒｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．，３３：１３６１２－１３６２０；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）
Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１８－３０）。
集効率により、ガイド領域内の１つの部位でのオフターゲット編集も高くなった。単一オ
フターゲット編集部位は、Ｇ－Ａミスマッチを使用することによって減少した（Ｓｃｈｎ
ｅｉｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：
ｅ８７）。特に、標的ｍＲＮＡ以外の高度に発現されているｍＲＮＡを表す５つのｃＤＮ
Ａの配列決定は、オフターゲット編集を示さなかった（Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅ
ｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７
）。しかし、また驚くべきことに、ニューロンを用いた本試験では、オフターゲット編集
部位が、トランスフェクトＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡと内因性Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡとの間で
異なっていた。具体的には、内因性の修復されたＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡでは、ｃＤＮＡか
ら発現されたＭｅｃｐ２ ｍＲＮＡには存在しないガイド領域内および外側のいくつかの
追加のオフターゲット編集部位が見られた（図３Ｂ）。トランスフェクトＭｅｃｐ２ ｍ
ＲＮＡと内因性Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡとの間のオフターゲット編集部位の違いは、ＲＮＡ
の折りたたみおよび他の下流プロセシングイベントに影響を及ぼし得る配列の違いを反映
している可能性がある。重要なことに、内因性Ｍｅｃｐ２ ｍＲＮＡのオフターゲット部
位のいずれもレット症候群を引き起こすことが報告されていない（Ｆｙｆｅ，ｅｔ ａｌ
．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：７０９－７１３）。レット症候
群マウスモデルをさらに使用して、症候性マウスの野生型ＭｅＣＰ２の回復によって細胞
および行動症状が逆転することを示すことができる（Ｇｕｙ，ｅｔ ａｌ．（２００７）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１１４３－１１４７；Ｓｉｎｎｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１
７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１０６－１１５；Ｇ
ａｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ
．Ｄｅｖ．，５：１８０－１９０；Ｇａｒｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．，３３：１３６１２－１３６２０；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）
Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１８－３０）。
【0100】
［実施例２］
Ｍｅｃｐ２突然変異Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａを有するマウスを使用して、インビボで本
方法を試験した。Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａ突然変異は、Ｒ１０６Ｑアミノ酸変化を有する
ＭｅＣＰ２をもたらす。手短に言えば、Ｍｅｃｐ２突然変異Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａを有
するマウスを、６コピーのガイドＲＮＡを使用してまたは使用しないで、本発明のＥ４８
８Ｑ突然変異を有するエディターゼをコードするＡＡＶベクターで処置した。その向神経
性の特性のために、ＰＨＰ．Ｂカプシドを有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ９変異体）を使
用した（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２６（３）
：６６４－６６８）。１．１×１０１０ウイルスゲノム相当物（ｖｇｅ）のＡＡＶをマウ
スの海馬に定位的に注射した。直接ウイルス注射の３～４週間後、マウスをと殺し、Ｍｅ
ＣＰ２機能を脳で検出した。表２に見られるように、インビボでの効率的な標的化ＲＮＡ
編集および脳のＭｅＣＰ２機能の回復が観察された。さらに、ＲＮＡ配列分析に基づいて
、歯状顆粒ニューロンでのＡからＩへの編集効率が３９％であると決定され、ＣＡ１ニュ
ーロンでのＡからＩへの編集効率が６４％であると決定された。図６に見られるように、
歯状ヘテロクロマチンのＭｅＣＰ２強度は、ガイドＲＮＡを有さないＡＡＶを注射したマ
ウスと比較して、ガイドＲＮＡを有するＡＡＶを注射したマウスの方で高かった。これら
の結果は、ＭｅＣＰ２ ＤＮＡ結合能力の救済を示している。
Ｍｅｃｐ２突然変異Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａを有するマウスを使用して、インビボで本
方法を試験した。Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａ突然変異は、Ｒ１０６Ｑアミノ酸変化を有する
ＭｅＣＰ２をもたらす。手短に言えば、Ｍｅｃｐ２突然変異Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａを有
するマウスを、６コピーのガイドＲＮＡを使用してまたは使用しないで、本発明のＥ４８
８Ｑ突然変異を有するエディターゼをコードするＡＡＶベクターで処置した。その向神経
性の特性のために、ＰＨＰ．Ｂカプシドを有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ９変異体）を使
用した（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２６（３）
：６６４－６６８）。１．１×１０１０ウイルスゲノム相当物（ｖｇｅ）のＡＡＶをマウ
スの海馬に定位的に注射した。直接ウイルス注射の３～４週間後、マウスをと殺し、Ｍｅ
ＣＰ２機能を脳で検出した。表２に見られるように、インビボでの効率的な標的化ＲＮＡ
編集および脳のＭｅＣＰ２機能の回復が観察された。さらに、ＲＮＡ配列分析に基づいて
、歯状顆粒ニューロンでのＡからＩへの編集効率が３９％であると決定され、ＣＡ１ニュ
ーロンでのＡからＩへの編集効率が６４％であると決定された。図６に見られるように、
歯状ヘテロクロマチンのＭｅＣＰ２強度は、ガイドＲＮＡを有さないＡＡＶを注射したマ
ウスと比較して、ガイドＲＮＡを有するＡＡＶを注射したマウスの方で高かった。これら
の結果は、ＭｅＣＰ２ ＤＮＡ結合能力の救済を示している。
【表2】
【0101】
表２：インビボでエディターゼ酵素を発現し、機能的ＭｅＣＰ２を示す細胞数の定量化
．エディターゼおよびガイドＲＮＡをコードするＡＡＶ ＰＨＰ．ＢをＭｅｃｐ２３１７
Ｇ＞Ａマウスの海馬に注射した。注射の３週間後、マウスを免疫組織化学のために処理し
た。非感染細胞からのシグナルを閾値処理した後、注射したマウスの脳切片のＨＡ免疫染
色によってエディターゼ＋細胞を同定した。百分率は、ＤＡＰＩによって同定された細胞
の総数に対するものである。ヘテロクロマチン（構造）内のＭｅＣＰ２濃縮を示すエディ
ターゼ＋細胞の百分率は、ＭｅＣＰ２タンパク質機能の回復を示す。ｎ＝８６４細胞。
．エディターゼおよびガイドＲＮＡをコードするＡＡＶ ＰＨＰ．ＢをＭｅｃｐ２３１７
Ｇ＞Ａマウスの海馬に注射した。注射の３週間後、マウスを免疫組織化学のために処理し
た。非感染細胞からのシグナルを閾値処理した後、注射したマウスの脳切片のＨＡ免疫染
色によってエディターゼ＋細胞を同定した。百分率は、ＤＡＰＩによって同定された細胞
の総数に対するものである。ヘテロクロマチン（構造）内のＭｅＣＰ２濃縮を示すエディ
ターゼ＋細胞の百分率は、ＭｅＣＰ２タンパク質機能の回復を示す。ｎ＝８６４細胞。
【0102】
［実施例３］
プラスミド構築
アミノ末端Ｆｌａｇタグを含む完全長ヒトＡＤＡＲ２をコードする配列を、酵母発現ベ
クターからｐｃＤＮＡ ３．１＋（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
）にサブクローニングした。完全長ＡＤＡＲ２を動員するよう設計されたＭｅｃｐ２ガイ
ドを発現させるために、合成オリゴヌクレオチドをＢｓａ１オーバーハングとアニーリン
グし、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６ポリリンカー［ｐＧＭ１０９９（２ｘＢｏｘＢガイドＷ１０４Ｘ
）、ｐＧＭ１１９２（内部ループガイドＷ１０４Ｘ）、ｐＧＭ１３１０（ＧｌｕＡ２ステ
ムループＷ１０４Ｘ］（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクロー
ニングした。Ｍｅｃｐ２３１１Ｇ＞Ａ（Ｗ１０４Ｘ）突然変異を含むＭｅｃｐ２編集基質
は実施例１に記載されている。全てのサブクローニングを配列分析によって検証した。プ
ラスミド構築およびＰＣＲ増幅で使用したプライマー配列を表３に示す。
プラスミド構築
アミノ末端Ｆｌａｇタグを含む完全長ヒトＡＤＡＲ２をコードする配列を、酵母発現ベ
クターからｐｃＤＮＡ ３．１＋（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
）にサブクローニングした。完全長ＡＤＡＲ２を動員するよう設計されたＭｅｃｐ２ガイ
ドを発現させるために、合成オリゴヌクレオチドをＢｓａ１オーバーハングとアニーリン
グし、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６ポリリンカー［ｐＧＭ１０９９（２ｘＢｏｘＢガイドＷ１０４Ｘ
）、ｐＧＭ１１９２（内部ループガイドＷ１０４Ｘ）、ｐＧＭ１３１０（ＧｌｕＡ２ステ
ムループＷ１０４Ｘ］（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクロー
ニングした。Ｍｅｃｐ２３１１Ｇ＞Ａ（Ｗ１０４Ｘ）突然変異を含むＭｅｃｐ２編集基質
は実施例１に記載されている。全てのサブクローニングを配列分析によって検証した。プ
ラスミド構築およびＰＣＲ増幅で使用したプライマー配列を表３に示す。
【0103】
細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）を、５％ＣＯ２加湿インキュベー
ター内３７℃で、１０％ＦＢＳ中ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ）に維持した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）を、５％ＣＯ２加湿インキュベー
ター内３７℃で、１０％ＦＢＳ中ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ）に維持した。
【0104】
ＲＮＡ編集
完全長ＡＤＡＲ２を使用した編集を分析するために、１２ウェルプレート中１ウェル当
たり１．３×１０３個細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。２４時間後、Ｏｐｔ
ｉ－ＭＥＭ（商標）低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
中２：１比のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＤＮＡを使用して、細胞を完全長ヒトＡＤＡＲ２（ｐＧＭ１
１５５）、１コピーのガイド（ｐＧＭ１０９９、ｐＧＭ１１９２またはｐＧＭ１３１０）
、およびＭｅｃｐ２３１１Ｇ＞Ａ－ｅｇｆｐ ｃＤＮＡをコードするプラスミドでトラン
スフェクトした。１ウェル当たり添加したプラスミドＤＮＡの量は、１２５ｎｇの標的、
２５０ｎｇのヒトＡＤＡＲ２および２．５μｇのガイドであった。７２時間後、細胞を収
集し、製造元の指示に従ってＰｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ａ
ｍｂｉｏｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＴＵＲＢＯ ＤＮＡフリー（商標）キッ
ト（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、残留プラスミドＤＮＡを除去した。全ＲＮＡを、Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写し、オリゴｄ
Ｔを使用してプライミングした。トランスフェクトＭｅｃｐ２３１１Ｇ＞Ａ－ｅｇｆｐ
ｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３のＣＭＶプロモーターの５’プライマーおよびｅｇｆｐ遺
伝子の逆方向プライマーを使用したＰＣＲによって配列分析のために増幅した。
完全長ＡＤＡＲ２を使用した編集を分析するために、１２ウェルプレート中１ウェル当
たり１．３×１０３個細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。２４時間後、Ｏｐｔ
ｉ－ＭＥＭ（商標）低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
中２：１比のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＤＮＡを使用して、細胞を完全長ヒトＡＤＡＲ２（ｐＧＭ１
１５５）、１コピーのガイド（ｐＧＭ１０９９、ｐＧＭ１１９２またはｐＧＭ１３１０）
、およびＭｅｃｐ２３１１Ｇ＞Ａ－ｅｇｆｐ ｃＤＮＡをコードするプラスミドでトラン
スフェクトした。１ウェル当たり添加したプラスミドＤＮＡの量は、１２５ｎｇの標的、
２５０ｎｇのヒトＡＤＡＲ２および２．５μｇのガイドであった。７２時間後、細胞を収
集し、製造元の指示に従ってＰｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ａ
ｍｂｉｏｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＴＵＲＢＯ ＤＮＡフリー（商標）キッ
ト（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、残留プラスミドＤＮＡを除去した。全ＲＮＡを、Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写し、オリゴｄ
Ｔを使用してプライミングした。トランスフェクトＭｅｃｐ２３１１Ｇ＞Ａ－ｅｇｆｐ
ｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３のＣＭＶプロモーターの５’プライマーおよびｅｇｆｐ遺
伝子の逆方向プライマーを使用したＰＣＲによって配列分析のために増幅した。
【表3】
【0105】
結果
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの
制御下、完全長ヒトＡＤＡＲ２およびＭｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａでトランスフェクトした。
ヒトＡＤＡＲ２は、内因性ＡＤＡＲ２を模倣した完全長天然ＡＤＡＲ２分子であった。Ｍ
ｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａ突然変異は、Ｒ１０６Ｑアミノ酸変化（Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ）を
もたらす。次いで、細胞を、１）上記の２つのＢｏｘＢステムループを有するガイドＲＮ
Ａ（例えば、実施例１参照）、２）ＧｌｕＡ２からのＲ／Ｇ結合部位を含むガイドＲＮＡ
（Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．，４５（５）：２７９７－２８０８；Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ
．Ｒｅｐ．，７：４１４７８）、または３）内部ループを有するガイドＲＮＡ（Ｌｅｈｍ
ａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９１（１）：１－１３）
で処置した。図７に見られるように、２つのＢｏｘＢステムループを含むガイドＲＮＡを
含むガイドＲＮＡは、完全長ＡＤＡＲ２を動員して、トランスフェクトＨＥＫ細胞でＭｅ
ｃｐ２ ＲＮＡを編集することができた。これらの結果は、標的ＲＮＡ配列に加えて、通
常は標的ＲＮＡに含まれていない配列の存在を含み得る、標的ＲＮＡへの完全長ＡＤＡＲ
の動員を実証している。
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの
制御下、完全長ヒトＡＤＡＲ２およびＭｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａでトランスフェクトした。
ヒトＡＤＡＲ２は、内因性ＡＤＡＲ２を模倣した完全長天然ＡＤＡＲ２分子であった。Ｍ
ｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａ突然変異は、Ｒ１０６Ｑアミノ酸変化（Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ）を
もたらす。次いで、細胞を、１）上記の２つのＢｏｘＢステムループを有するガイドＲＮ
Ａ（例えば、実施例１参照）、２）ＧｌｕＡ２からのＲ／Ｇ結合部位を含むガイドＲＮＡ
（Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．，４５（５）：２７９７－２８０８；Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ
．Ｒｅｐ．，７：４１４７８）、または３）内部ループを有するガイドＲＮＡ（Ｌｅｈｍ
ａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９１（１）：１－１３）
で処置した。図７に見られるように、２つのＢｏｘＢステムループを含むガイドＲＮＡを
含むガイドＲＮＡは、完全長ＡＤＡＲ２を動員して、トランスフェクトＨＥＫ細胞でＭｅ
ｃｐ２ ＲＮＡを編集することができた。これらの結果は、標的ＲＮＡ配列に加えて、通
常は標的ＲＮＡに含まれていない配列の存在を含み得る、標的ＲＮＡへの完全長ＡＤＡＲ
の動員を実証している。
【0106】
本発明の好ましい実施形態のいくらかを上で記載し、具体的に例示してきたが、本発明
がこのような実施形態に限定されることを意図していない。以下の特許請求の範囲に示さ
れる、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の修正を行うことができる。
がこのような実施形態に限定されることを意図していない。以下の特許請求の範囲に示さ
れる、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の修正を行うことができる。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記細胞に送達するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記細胞に送達するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0106】
本発明の好ましい実施形態のいくらかを上で記載し、具体的に例示してきたが、本発明
がこのような実施形態に限定されることを意図していない。以下の特許請求の範囲に示さ
れる、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の修正を行うことができる。
一態様において、本発明は以下を包含する。
[項目１]
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードす
る核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記細胞に送達するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み
、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集
されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
[項目２]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目１に記載の方法。
[項目３]
前記ＲＮＡ編集酵素がデアミナーゼである、項目１に記載の方法。
[項目４]
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である
、項目１に記載の方法。
[項目５]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、これらの断片、およびこれらの変異体からな
る群から選択される、項目４に記載の方法。
[項目６]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目５に記載の
方法。
[項目７]
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、項目１から６のいず
れか一項に記載の方法。
[項目８]
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、項目
７に記載の方法。
[項目９]
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、
項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
[項目１０]
前記内因性ＲＮＡが中枢神経系細胞で発現されるＲＮＡである、項目１から９のいずれ
か一項に記載の方法。
[項目１１]
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、項目
１０に記載の方法。
[項目１２]
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミ
スマッチをさらに含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１３]
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体で
ある、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
[項目１４]
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしく
は欠失を有する配列番号４７を含む、項目１３に記載の方法。
[項目１５]
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結
合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデ
アミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前
記配列がＢｏｘＢ配列である、項目１に記載の方法。
[項目１６]
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、項目１から１５のいずれ
か一項に記載の方法。
[項目１７]
前記ベクターがウイルスベクターである、項目１６に記載の方法。
[項目１８]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目１７に記載の方法
。
[項目１９]
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、ガイドＲＮＡをコードする
核酸分子を前記細胞に送達するステップを含み、
前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ
）によって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集
されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
[項目２０]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目１９に記載の方法。
[項目２１]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である、項目１９に記載の方法。
[項目２２]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目２１に記載
の方法。
[項目２３]
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、項目
１９に記載の方法。
[項目２４]
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミ
スマッチをさらに含む、項目１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
[項目２５]
前記内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、項目１９から２４のいずれか一項
に記載の方法。
[項目２６]
前記内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、項
目１９から２５のいずれか一項記載の方法。
[項目２７]
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルお
よび／または機能を変化させる、項目１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
[項目２８]
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、項目１９から２７のいずれか一項に記
載の方法。
[項目２９]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目２８に記載の方法
。
[項目３０]
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードす
る核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記対象に投与するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み
、
前記ＲＮＡ編集酵素は、前記中枢神経系の遺伝性疾患に関連するミスマッチ突然変異を
修正する、方法。
[項目３１]
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、項目３０に記載の方法。
[項目３２]
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハ
イブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを
含む、項目３１に記載の方法。
[項目３３]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目３０から３２のいずれか一項に記載の
方法。
[項目３４]
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である
、項目３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
[項目３５]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびこれらの断片または変異体から選択され
る、項目３４に記載の方法。
[項目３６]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目３５に記載
の方法。
[項目３７]
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、項目３０から３６の
いずれか一項に記載の方法。
[項目３８]
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、項目
３７に記載の方法。
[項目３９]
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、
項目３０から３８のいずれか一項に記載の方法。
[項目４０]
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体で
ある、項目３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
[項目４１]
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしく
は欠失を有する配列番号４７を含む、項目４０に記載の方法。
[項目４２]
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結
合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデ
アミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前
記配列がＢｏｘＢ配列である、項目３０に記載の方法。
[項目４３]
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、項目３０から４２のいず
れか一項に記載の方法。
[項目４４]
前記ベクターがウイルスベクターである、項目４３に記載の方法。
[項目４５]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目４４に記載の方法
。
[項目４６]
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、ガ
イドＲＮＡをコードする核酸分子を前記対象に投与するステップを含み、前記ガイドＲＮ
Ａは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的
に認識される配列を含む、方法。
[項目４７]
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、項目４６に記載の方法。
[項目４８]
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハ
イブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを
含む、項目４７に記載の方法。
[項目４９]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目４６から４８のいずれか一項に記載の
方法。
[項目５０]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１もしくはＡＤＡＲ２またはこれらの変異体である、項目４６
から４９のいずれか一項に記載の方法。
[項目５１]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目５０に記載
の方法。
[項目５２]
内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、項目４６から５１のいずれか一項に記
載の方法。
[項目５３]
内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、項目４
６から５２のいずれか一項記載の方法。
[項目５４]
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルお
よび／または機能を変化させる、項目４６から５３のいずれか一項に記載の方法。
[項目５５]
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、項目４６から５４のいずれか一項に記
載の方法。
[項目５６]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目５５に記載の方法
。
がこのような実施形態に限定されることを意図していない。以下の特許請求の範囲に示さ
れる、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の修正を行うことができる。
一態様において、本発明は以下を包含する。
[項目１]
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードす
る核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記細胞に送達するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み
、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集
されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
[項目２]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目１に記載の方法。
[項目３]
前記ＲＮＡ編集酵素がデアミナーゼである、項目１に記載の方法。
[項目４]
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である
、項目１に記載の方法。
[項目５]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、これらの断片、およびこれらの変異体からな
る群から選択される、項目４に記載の方法。
[項目６]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目５に記載の
方法。
[項目７]
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、項目１から６のいず
れか一項に記載の方法。
[項目８]
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、項目
７に記載の方法。
[項目９]
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、
項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
[項目１０]
前記内因性ＲＮＡが中枢神経系細胞で発現されるＲＮＡである、項目１から９のいずれ
か一項に記載の方法。
[項目１１]
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、項目
１０に記載の方法。
[項目１２]
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミ
スマッチをさらに含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１３]
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体で
ある、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
[項目１４]
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしく
は欠失を有する配列番号４７を含む、項目１３に記載の方法。
[項目１５]
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結
合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデ
アミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前
記配列がＢｏｘＢ配列である、項目１に記載の方法。
[項目１６]
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、項目１から１５のいずれ
か一項に記載の方法。
[項目１７]
前記ベクターがウイルスベクターである、項目１６に記載の方法。
[項目１８]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目１７に記載の方法
。
[項目１９]
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、ガイドＲＮＡをコードする
核酸分子を前記細胞に送達するステップを含み、
前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ
）によって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集
されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
[項目２０]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目１９に記載の方法。
[項目２１]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である、項目１９に記載の方法。
[項目２２]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目２１に記載
の方法。
[項目２３]
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、項目
１９に記載の方法。
[項目２４]
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミ
スマッチをさらに含む、項目１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
[項目２５]
前記内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、項目１９から２４のいずれか一項
に記載の方法。
[項目２６]
前記内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、項
目１９から２５のいずれか一項記載の方法。
[項目２７]
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルお
よび／または機能を変化させる、項目１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
[項目２８]
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、項目１９から２７のいずれか一項に記
載の方法。
[項目２９]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目２８に記載の方法
。
[項目３０]
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードす
る核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記対象に投与するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み
、
前記ＲＮＡ編集酵素は、前記中枢神経系の遺伝性疾患に関連するミスマッチ突然変異を
修正する、方法。
[項目３１]
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、項目３０に記載の方法。
[項目３２]
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハ
イブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを
含む、項目３１に記載の方法。
[項目３３]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目３０から３２のいずれか一項に記載の
方法。
[項目３４]
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である
、項目３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
[項目３５]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびこれらの断片または変異体から選択され
る、項目３４に記載の方法。
[項目３６]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目３５に記載
の方法。
[項目３７]
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、項目３０から３６の
いずれか一項に記載の方法。
[項目３８]
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、項目
３７に記載の方法。
[項目３９]
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、
項目３０から３８のいずれか一項に記載の方法。
[項目４０]
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体で
ある、項目３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
[項目４１]
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしく
は欠失を有する配列番号４７を含む、項目４０に記載の方法。
[項目４２]
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結
合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデ
アミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前
記配列がＢｏｘＢ配列である、項目３０に記載の方法。
[項目４３]
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、項目３０から４２のいず
れか一項に記載の方法。
[項目４４]
前記ベクターがウイルスベクターである、項目４３に記載の方法。
[項目４５]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目４４に記載の方法
。
[項目４６]
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、ガ
イドＲＮＡをコードする核酸分子を前記対象に投与するステップを含み、前記ガイドＲＮ
Ａは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的
に認識される配列を含む、方法。
[項目４７]
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、項目４６に記載の方法。
[項目４８]
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハ
イブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２ ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを
含む、項目４７に記載の方法。
[項目４９]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目４６から４８のいずれか一項に記載の
方法。
[項目５０]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１もしくはＡＤＡＲ２またはこれらの変異体である、項目４６
から４９のいずれか一項に記載の方法。
[項目５１]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目５０に記載
の方法。
[項目５２]
内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、項目４６から５１のいずれか一項に記
載の方法。
[項目５３]
内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、項目４
６から５２のいずれか一項記載の方法。
[項目５４]
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルお
よび／または機能を変化させる、項目４６から５３のいずれか一項に記載の方法。
[項目５５]
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、項目４６から５４のいずれか一項に記
載の方法。
[項目５６]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目５５に記載の方法
。
【外国語明細書】