特開 2023-146361 マイクロデバイス及びこれを用いた方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023146361

(43)【公開日】2023-10-12

(54)【発明の名称】マイクロデバイス及びこれを用いた方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20231004BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20231004BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20231004BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20231004BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20231004BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 Z

C12M1/00 A

C12M3/00 Z

C12N1/00 B

C12N5/071

C12N5/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022053505

(22)【出願日】2022-03-29

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和３年１１月２日 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｅｎｓｏｒｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．ｏｒｇ／ｄｌ／ｄｌ．ｐｈｐ 令和３年１１月１１日 第１２回マイクロ・ナノ工学シンポジウム 令和３年１２月２７日 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｅｅｅｍｅｍｓ２０２２．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｇｉ 令和４年１月１２日 Ｔｈｅ ３５ｔｈ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ

(71)【出願人】

【識別番号】317006683

【氏名又は名称】地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000154

【氏名又は名称】弁理士法人はるか国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】田中 葵

(72)【発明者】

【氏名】三村 久敏

(72)【発明者】

【氏名】高森 翔

(72)【発明者】

【氏名】大崎 寿久

(72)【発明者】

【氏名】三木 則尚

(72)【発明者】

【氏名】竹内 昌治

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B029CC01

4B029DA03

4B029DC07

4B029DF05

4B029DF10

4B029DG06

4B029GA08

4B029GB10

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA05

4B065BC20

4B065BC50

4B065CA24

4B065CA46

(57)【要約】      （修正有）

【課題】簡便な溶液交換を実現するマイクロデバイスを提供する。
【解決手段】溶液交換部材１００と、溶液交換部材に取り付け可能な細胞保持カセット２００とを含むマイクロデバイスであって、細胞保持カセットは、細胞を含む第一溶液を保持するウェル２１０を有し、溶液交換部材は、ウェルに保持された第一溶液を吸引する吸引毛細管１１０と、ウェルに流入させる第二溶液を保持するリザーバー１２０とを有し、細胞を含む第一溶液をウェルに保持した細胞保持カセットを、溶液交換部材の吸引毛細管と第二溶液を保持したリザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力によるウェルから吸引毛細管への第一溶液の吸引と、リザーバーからウェルへの第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、その後、細胞及び溶液とがウェルに保持された状態で、ウェルから吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、溶液交換が停止されるよう構成される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

溶液交換部材と、前記溶液交換部材に取り付け可能な細胞保持カセットとを含むマイクロデバイスであって、
前記細胞保持カセットは、細胞を含む第一溶液を保持するためのウェルを有し、
前記溶液交換部材は、前記ウェルに保持された前記第一溶液を毛細管力により吸引する吸引毛細管と、前記ウェルに流入させる第二溶液を保持するためのリザーバーとを有し、
前記細胞を含む第一溶液を前記ウェルに保持した前記細胞保持カセットを、前記溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記第二溶液を保持した前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第一溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止されるよう構成されている、
マイクロデバイス。

【請求項2】

前記吸引毛細管は、前記溶液交換部材に取り付けられる前の前記細胞保持カセットの前記ウェルに保持される前記第一溶液の体積と、前記細胞保持カセットが取り付けられる前の前記溶液交換部材の前記リザーバーに保持される前記第二溶液の体積との合計より小さい容積を有するとともに、気相中に開口した下流端部を有し、
前記溶液交換の開始後、毛細管力により前記ウェルから吸引された溶液が前記吸引毛細管の前記下流端部に到達することにより、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されるよう構成されている、
請求項１に記載のマイクロデバイス。

【請求項3】

前記細胞保持カセットは、前記溶液交換部材に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能に構成されている、
請求項１又は２に記載のマイクロデバイス。

【請求項4】

前記細胞保持カセットの複数回の溶液交換に用いられる複数の前記溶液交換部材を含む、
請求項３に記載のマイクロデバイス。

【請求項5】

複数の前記細胞保持カセットと、前記複数の細胞保持カセットの溶液交換に用いられる複数の前記溶液交換部材とを含む、
請求項１乃至４のいずれかに記載のマイクロデバイス。

【請求項6】

外部ポンプに接続されることなく用いられる、
請求項１乃至５のいずれかに記載のマイクロデバイス。

【請求項7】

請求項１乃至６のいずれかに記載のマイクロデバイスを用いた溶液交換方法であって、
細胞を含む第一溶液を前記ウェルに保持し前記溶液交換部材に取り付けられていない前記細胞保持カセットと、第二溶液を前記リザーバーに保持し前記細胞保持カセットが取り付けられていない前記溶液交換部材とを準備する準備工程と、
前記準備工程後、前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第一溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止される溶液交換工程と、
を含む、溶液交換方法。

【請求項8】

前記吸引毛細管は、前記準備工程で前記ウェルに保持される前記第一溶液の体積と前記リザーバーに保持される前記第二溶液の体積との合計より小さい容積を有するとともに、気相中に開口した下流端部を有し、
前記溶液交換工程において、毛細管力により前記ウェルから吸引された溶液が前記吸引毛細管の前記下流端部に到達することにより、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止される、
請求項７に記載の溶液交換方法。

【請求項9】

前記細胞保持カセットは、前記溶液交換部材に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能に構成され、
前記溶液交換工程における前記溶液交換の停止後に、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材から取り外すことをさらに含む、
請求項７又は８に記載の溶液交換方法。

【請求項10】

前記マイクロデバイスは、第一溶液交換部材、第二溶液交換部材及び第三溶液交換部材を含む複数の前記溶液交換部材と、前記溶液交換部材に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能な前記細胞保持カセットとを含み、
前記準備工程及び前記溶液交換工程として、前記第一溶液交換部材を用いた第一準備工程及び第一溶液交換工程を含み、さらに、
前記第一溶液交換工程における前記溶液交換の停止後に、前記細胞保持カセットを前記第一溶液交換部材から取り外して、前記細胞及び前記溶液交換後の第三溶液を前記ウェルに保持し前記溶液交換部材に取り付けられていない前記細胞保持カセットを準備するともに、第四溶液を前記リザーバーに保持し前記細胞保持カセットが取り付けられていない前記第二溶液交換部材を準備する第二準備工程と、
前記第二準備工程後、前記細胞保持カセットを前記第二溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第三溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第四溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞と前記溶液交換後の第五溶液とがウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止される第二溶液交換工程と、
前記第二溶液交換部材に代えて前記第三溶液交換部材を用いる以外は前記第二準備工程と同様の第三準備工程と、
前記第二溶液交換部材に代えて前記第三溶液交換部材を用いる以外は前記第二溶液交換工程と同様の第三溶液交換工程と、
を含む、請求項９に記載の溶液交換方法。

【請求項11】

前記マイクロデバイスは、複数の前記溶液交換部材と複数の前記細胞保持カセットとを含み、
前記複数の細胞保持カセットの各々について、前記複数の溶液交換部材を用いた前記準備工程及び前記溶液交換工程を含む、
請求項７乃至１０のいずれかに記載の溶液交換方法。

【請求項12】

前記マイクロデバイスを外部ポンプに接続することなく用いる、
請求項７乃至１１のいずれかに記載の溶液交換方法。

【請求項13】

請求項１乃至６のいずれかに記載のマイクロデバイスを用いた細胞培養方法であって、
前記細胞保持カセットは、前記溶液交換部材に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能に構成され、
細胞を含む第一溶液を前記ウェルに保持し前記溶液交換部材に取り付けられていない前記細胞保持カセットと、第二溶液を前記リザーバーに保持し前記細胞保持カセットが取り付けられていない前記溶液交換部材とを準備する準備工程と、
前記準備工程後、前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第一溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止される溶液交換工程と、
前記溶液交換工程における前記溶液交換の停止後に、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材から取り外し、取り外された前記細胞保持カセットの前記ウェル内で前記細胞を培養する培養工程と、
を含む、細胞培養方法。

【請求項14】

請求項１乃至６のいずれかに記載のマイクロデバイスを用いた遺伝子導入細胞の製造方法であって、
細胞を含む第一溶液を前記ウェルに保持し前記溶液交換部材に取り付けられていない前記細胞保持カセットと、前記細胞に導入する核酸を含む遺伝子導入用の第二溶液を前記リザーバーに保持し前記細胞保持カセットが取り付けられていない前記溶液交換部材とを準備する準備工程と、
前記準備工程後、前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第一溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞と前記核酸を含む溶液とが前記ウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止される溶液交換工程と、
前記溶液交換工程後、前記細胞保持カセットの前記ウェルにおいて前記核酸を含む溶液中で前記細胞を保持することにより前記細胞への前記核酸の導入を行って、前記核酸が導入された遺伝子導入細胞を得る遺伝子導入工程と、
を含む、遺伝子導入細胞の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロデバイス及びこれを用いた方法に関する。

【背景技術】

【0002】

非特許文献１には、シリンジポンプを用いて培養液を連続的に灌流しながらマイクロチャンバー内で細胞を培養するマイクロ流体デバイスが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Paul J. Hung et al., “A novel high aspect ratio microfluidic design to provide a stable and uniform microenvironment for cell growth in a high throughput mammalian cell culture array”, Lab Chip, 2005, 5, 44-48

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら従来、細胞が培養されたウェル内の溶液を交換する場合、当該溶液の交換は、作業者がピペット等の器具を用いて手作業で行うか、又はシリンジポンプ等の外部ポンプを用いて行う必要があったため、操作や装置が煩雑にならざるを得なかった。

【0005】

本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、簡便な溶液交換を実現するマイクロデバイス及びこれを用いた方法を提供することをその目的の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係るマイクロデバイスは、溶液交換部材と、前記溶液交換部材に取り付け可能な細胞保持カセットとを含むマイクロデバイスであって、前記細胞保持カセットは、細胞を含む第一溶液を保持するためのウェルを有し、前記溶液交換部材は、前記ウェルに保持された前記第一溶液を毛細管力により吸引する吸引毛細管と、前記ウェルに流入させる第二溶液を保持するためのリザーバーとを有し、前記細胞を含む第一溶液を前記ウェルに保持した前記細胞保持カセットを、前記溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記第二溶液を保持した前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第一溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止されるよう構成されている。本発明によれば、簡便な溶液交換を実現するマイクロデバイスが提供される。

【0007】

前記マイクロデバイスにおいて、前記吸引毛細管は、前記溶液交換部材に取り付けられる前の前記細胞保持カセットの前記ウェルに保持される前記第一溶液の体積と、前記細胞保持カセットが取り付けられる前の前記溶液交換部材の前記リザーバーに保持される前記第二溶液の体積との合計より小さい容積を有するとともに、気相中に開口した下流端部を有し、前記マイクロデバイスは、前記溶液交換の開始後、毛細管力により前記ウェルから吸引された溶液が前記吸引毛細管の前記下流端部に到達することにより、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されるよう構成されていることとしてもよい。

【0008】

前記マイクロデバイスにおいて、前記細胞保持カセットは、前記溶液交換部材に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能に構成されていることとしてもよい。また、この場合、前記マイクロデバイスは、前記細胞保持カセットの複数回の溶液交換に用いられる複数の前記溶液交換部材を含むこととしてもよい。また、前記マイクロデバイスは、複数の前記細胞保持カセットと、前記複数の細胞保持カセットの溶液交換に用いられる複数の前記溶液交換部材とを含むこととしてもよい。また、前記マイクロデバイスは、外部ポンプに接続されることなく用いられることとしてもよい。

【0009】

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る溶液交換方法は、前記いずれかのマイクロデバイスを用いた溶液交換方法であって、細胞を含む第一溶液を前記ウェルに保持し前記溶液交換部材に取り付けられていない前記細胞保持カセットと、第二溶液を前記リザーバーに保持し前記細胞保持カセットが取り付けられていない前記溶液交換部材とを準備する準備工程と、前記準備工程後、前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第一溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止される溶液交換工程と、を含む。本発明によれば、簡便な溶液交換方法が提供される。

【0010】

前記方法において、前記吸引毛細管は、前記準備工程で前記ウェルに保持される前記第一溶液の体積と前記リザーバーに保持される前記第二溶液の体積との合計より小さい容積を有するとともに、気相中に開口した下流端部を有し、前記溶液交換工程において、毛細管力により前記ウェルから吸引された溶液が前記吸引毛細管の前記下流端部に到達することにより、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることとしてもよい。

【0011】

前記方法において、前記細胞保持カセットは、前記溶液交換部材に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能に構成され、前記方法は、前記溶液交換工程における前記溶液交換の停止後に、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材から取り外すことをさらに含むこととしてもよい。また、この場合、前記マイクロデバイスは、第一溶液交換部材、第二溶液交換部材及び第三溶液交換部材を含む複数の前記溶液交換部材と、前記溶液交換部材に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能な前記細胞保持カセットとを含み、前記方法は、前記準備工程及び前記溶液交換工程として、前記第一溶液交換部材を用いた第一準備工程及び第一溶液交換工程を含み、さらに、前記第一溶液交換工程における前記溶液交換の停止後に、前記細胞保持カセットを前記第一溶液交換部材から取り外して、前記細胞及び前記溶液交換後の第三溶液を前記ウェルに保持し前記溶液交換部材に取り付けられていない前記細胞保持カセットを準備するとともに、第四溶液を前記リザーバーに保持し前記細胞保持カセットが取り付けられていない前記第二溶液交換部材を準備する第二準備工程と、前記第二準備工程後、前記細胞保持カセットを前記第二溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第三溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第四溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞と前記溶液交換後の第五溶液とがウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止される第二溶液交換工程と、前記第二溶液交換部材に代えて前記第三溶液交換部材を用いる以外は前記第二準備工程と同様の第三準備工程と、前記第二溶液交換部材に代えて前記第三溶液交換部材を用いる以外は前記第二溶液交換工程と同様の第三溶液交換工程と、を含むこととしてもよい。

【0012】

前記方法において、前記マイクロデバイスは、複数の前記溶液交換部材と複数の前記細胞保持カセットとを含み、本方法は、前記複数の細胞保持カセットの各々について、前記複数の溶液交換部材を用いた前記準備工程及び前記溶液交換工程を含むこととしてもよい。また、前記方法において、前記マイクロデバイスを外部ポンプに接続することなく用いることとしてもよい。

【0013】

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る細胞培養方法は、前記いずれかのマイクロデバイスを用いた細胞培養方法であって、前記細胞保持カセットは、前記溶液交換部材に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能に構成され、細胞を含む第一溶液を前記ウェルに保持し前記溶液交換部材に取り付けられていない前記細胞保持カセットと、第二溶液を前記リザーバーに保持し前記細胞保持カセットが取り付けられていない前記溶液交換部材とを準備する準備工程と、前記準備工程後、前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第一溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止される溶液交換工程と、前記溶液交換工程における前記溶液交換の停止後に、前記細胞及び溶液が前記ウェルに保持された前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材から取り外し、取り外された前記細胞保持カセットの前記ウェル内で前記細胞を培養する培養工程と、を含む。本発明によれば、簡便な溶液交換による細胞培養方法が提供される。

【0014】

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る遺伝子導入細胞の製造方法は、前記いずれかのマイクロデバイスを用いた遺伝子導入細胞の製造方法であって、細胞を含む第一溶液を前記ウェルに保持し前記溶液交換部材に取り付けられていない前記細胞保持カセットと、前記細胞に導入する核酸を含む遺伝子導入用の第二溶液を前記リザーバーに保持し前記細胞保持カセットが取り付けられていない前記溶液交換部材とを準備する準備工程と、前記準備工程後、前記細胞保持カセットを前記溶液交換部材の前記吸引毛細管と前記リザーバーとの間に取り付けることによって、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への前記第一溶液の吸引と、前記リザーバーから前記ウェルへの前記第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、前記細胞と前記核酸を含む溶液とが前記ウェルに保持された状態で、毛細管力による前記ウェルから前記吸引毛細管への溶液の吸引が停止されることにより、前記溶液交換が停止される溶液交換工程と、前記溶液交換工程後、前記細胞保持カセットの前記ウェルにおいて前記核酸を含む溶液中で前記細胞を保持することにより前記細胞への前記核酸の導入を行って、前記核酸が導入された遺伝子導入細胞を得る遺伝子導入工程と、を含む。本発明によれば、簡便な溶液交換による遺伝子導入細胞の製造方法が提供される。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、簡便な溶液交換を実現するマイクロデバイス及びこれを用いた方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本実施形態に係るマイクロデバイスの一例を平面視で示す説明図である。

【図2】本実施形態に係るマイクロデバイスの構成例を斜視で示す説明図である。

【図3】本実施形態に係る実施例におけるマイクロデバイスの具体的な製造例を示す説明図である。

【図4】本実施形態に係る方法の一例に含まれる主な工程を示す説明図である。

【図5】本実施形態に係る方法の他の例に含まれる主な工程を示す説明図である。

【図6】本実施形態に係る方法のさらに他の例に含まれる主な工程を示す説明図である。

【図7】本実施形態に係る実施例においてセンサ細胞の匂い物質応答性を評価した結果を示す説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下に、本発明の一実施形態に係るマイクロデバイス（以下、「本デバイス」という。）及びこれを用いた方法（以下、「本方法」という。）について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。

【0018】

図１には、本デバイスの一例を平面視で示す。図２には、本デバイスの構成例を斜視で示す。図３には、後述の実施例における本デバイスの具体的な製造例を示す。図４には、本方法の一例に含まれる主な工程を示す。図５には、本方法の他の例に含まれる主な工程を示す。図６には、本方法のさらに他の例に含まれる主な工程を示す。

【0019】

なお、本実施形態においては、図中に示す両矢印Ｚが指す方向を「上下方向」、矢頭Ｕが指す方向を「上方」、矢頭Ｄが指す方向を「下方」という。上下方向は鉛直方向であってもよい。また、図中に示す矢印Ａが指す方向を「吸引方向Ａ」といい、矢印Ｂが指す方向を「流入方向Ｂ」という。

【0020】

本デバイス１は、溶液交換部材１００と、当該溶液交換部材１００に取り付け可能な細胞保持カセット２００とを含むマイクロデバイスである。細胞保持カセット２００は、細胞を含む第一溶液を保持するためのウェル２１０を有する。溶液交換部材１００は、細胞保持カセット２００のウェル２１０に保持された第一溶液を毛細管力により吸引する吸引毛細管１１０と、当該ウェル２１０に流入させる第二溶液を保持するためのリザーバー１２０とを有する。

【0021】

そして、本デバイス１は、細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持した細胞保持カセット２００を、溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０と第二溶液を保持したリザーバー１２０との間に取り付けることによって、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への当該第一溶液の吸引と、当該リザーバー１２０から当該ウェル２１０への当該第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、当該細胞及び溶液が当該ウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引が停止されることにより、当該溶液交換が停止されるよう構成されている。

【0022】

また、本方法は、その一側面として、本デバイス１を用いた溶液交換方法を包含する。溶液交換方法である本方法は、準備工程と、溶液交換工程とを含む。準備工程においては、細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持し溶液交換部材１００に取り付けられていない細胞保持カセット２００と、第二溶液をリザーバー１２０に保持し細胞保持カセット２００が取り付けられていない溶液交換部材１００とを準備する。

【0023】

溶液交換工程においては、準備工程後、細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間に取り付けることによって、毛細管力による当該細胞保持カセット２００のウェル２１０から当該溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引と、当該リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入とによる溶液交換が開始される。

【0024】

また、溶液交換工程においては、溶液交換の開始後、細胞及び溶液が細胞保持カセット２００のウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェル２１０から溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０への吸引が停止されることにより、当該溶液交換が停止される。

【0025】

すなわち、本デバイス１は、細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持した細胞保持カセット２００を、第二溶液をリザーバー１２０に保持し吸引毛細管１１０を有する溶液交換部材１００に取り付けるという簡便な操作のみで、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への当該第一溶液の吸引が自発的に開始されるとともに、当該リザーバー１２０から当該ウェル２１０への当該第二溶液の流入も開始され、しかも、その後、当該細胞及び溶液が当該ウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引が自発的に停止されるよう構成されている。したがって、本デバイス１を用いることにより、細胞保持カセット２００のウェル２１０内の溶液交換を簡便に実現することができる。

【0026】

本デバイス１に含まれる細胞保持カセット２００は、基部２２０と、当該基部２２０に有底穴として形成されたウェル２１０とを有している。基部２２０を構成する材料は、本発明の効果が得られれば特に限られず、例えば、樹脂、ガラス、セラミックス及び金属からなる群より選択される１以上であってもよく、樹脂で構成されることが好ましい。基部２２０の形状は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、基板状であることが好ましい。すなわち、基部２２０は、基板状に構成された樹脂製の部材であることが好ましい。

【0027】

細胞保持カセット２００の基部２２０は、図２に示すように、第一基板２２１と第二基板２２２とを含んで構成されてもよい。図２に示す例では、第一基板２２１に貫通穴が形成され、第二基板２２２は当該貫通穴の下方を塞ぐように当該第一基板２２１に接着される。ただし、基部２２０は、本発明の効果が得られれば、図２に示す例に限られず、例えば、ウェル２１０を構成する有底穴が形成された１つの基板から構成されてもよい。

【0028】

ウェル２１０は、底面２１１と、当該底面２１１の外周から上方に延びる内側面２１２と、当該底面２１１及び内側面２１２で囲まれた保持空間２１３とを有している。図２に示す例においては、第一基板２２１の貫通穴の内面がウェル２１０の内側面２１２を構成し、第二基板２２２の上面のうち当該貫通穴（保持空間２１３）内に露出する部分がウェル２１０の底面２１１を構成する。

【0029】

ウェル２１０の底面２１１及び内側面２１２は、親水性を有することが好ましい。ウェル２１０の底面２１１及び内側面２１２の親水性は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該底面２１１及び内側面２１２の水接触角は、８５°以下であることが好ましく、６０°以下であることがより好ましい。

【0030】

ウェル２１０の底面２１１は、当該ウェル２１０に接着性細胞を保持する場合、当該細胞に対して接着性を有することが好ましい。この点、例えば、基部２２０を構成する材料の表面（例えば、樹脂表面）である底面２１１に、細胞接着性成分（例えば、細胞接着性を示すペプチド、タンパク質、糖鎖、多糖類、又は細胞接着性基が人工的に導入された化合物）を塗布することにより、当該底面２１１に細胞接着性を付与してもよい。

【0031】

一方、ウェル２１０に非接着性の細胞を保持する場合や、ウェル２１０内に培養担体を入れて当該培養担体に細胞（接着性細胞及び／又は非接着性細胞）を担持する場合には、当該ウェル２１０の底面２１１は、当該細胞に対して接着性を有してもよいし、接着性を有しなくてもよい。

【0032】

ウェル２１０は、その上方の開口の全部又は一部を塞ぐ天面２１４を有してもよい。具体的に、例えば、ウェル２１０内の溶液交換は、当該ウェル２１０の上方の開口の全部を天面２１４によって塞いだ状態で実施する。すなわち、溶液交換中のウェル２１０は、溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０及びリザーバー１２０と連通するための開口を除き、密閉される。

【0033】

一方、例えば、ウェル２１０内で細胞を培養する場合、当該ウェル２１０の上方の開口の少なくとも一部を、酸素を含む気相中に開放しておくことが好ましい。すなわち、この場合、例えば、図に示すように、通気孔２１５が形成された天面２１４を有するウェル２１０内で細胞を培養する。ウェル２１０が開口を介して気相と連通していることにより、当該気相から当該開口を介して当該ウェル２１０の培養細胞に酸素を効率よく供給することができる。

【0034】

ただし、例えば、ウェル２１０が高い酸素透過性を有する材料で構成された天面２１４を有する場合には、当該天面２１４の一部が開口している必要はない。また、天面２１４を有しないウェル２１０内で細胞を培養することによっても当該細胞に当該ウェル２１０外の気相から当該細胞に酸素を効率よく供給することができる。

【0035】

ウェル２１０の天面２１４は、図２に示すように、シール部材２３０で構成されてもよい。シール部材２３０は、ウェル２１０の上方の開口の全部又は一部を塞ぐように、基部２２０の上面２２０ａに接着される。この結果、シール部材２３０の下方側の表面のうち保持空間２１３内に露出する部分が、ウェル２１０の天面２１４を構成する。

【0036】

なお、通気孔２１５が形成された天面２１４を有するウェル２１０内で細胞を培養した後に、当該ウェル２１０内の溶液交換を行う場合には、例えば、当該通気孔２１５を他の材料で塞ぐことにより、当該ウェル２１０内を密閉することができる。

【0037】

シール部材２３０を構成する材料は、本発明の効果が得られれば特に限られず、例えば、樹脂、ガラス、セラミックス及び金属からなる群より選択される１以上であってもよく、樹脂で構成されることが好ましい。シール部材２３０の形状は特に限られないが、例えば、シート状であることが好ましい。すなわち、シール部材２３０は、樹脂製のシート状に構成された部材であることが好ましい。

【0038】

天面２１４を構成するシール部材２３０は、その少なくとも一部が基部２２０に対して剥離可能に接着していることが好ましい。この場合、例えば、ウェル２１０内で細胞を培養した後、又は溶液交換を行った後に、シール部材２３０の少なくとも一部を基部２２０から剥離して当該ウェル２１０の上方を開口させることにより、当該開口を介した当該細胞の回収等の操作を容易に行うことができる。

【0039】

ウェル２１０の底面２１１及び天面２１４は、透光性を有することが好ましく、透明性を有することが特に好ましい。ウェル２１０の底面２１１及び天面２１４が透光性又は透明性を有することにより、当該ウェル２１０内の細胞の観察を容易に行うことができる。

【0040】

ウェル２１０の形状は、本発明の効果が得られれば特に限られない。すなわち、例えば、ウェル２１０の形状は、平面視において円形、楕円形、多角形等の任意の形状であってもよい。また、ウェル２１０は、溶液交換部材１００のリザーバー１２０側の端部に、流入方向Ｂに向けて断面積（流入方向Ｂに対して垂直に切断した断面の面積）が拡大する拡大部２１６を有し、及び／又は、溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０側の端部に、吸引方向Ａに向けて断面積（吸引方向Ａに対して垂直に切断した断面の面積）が縮小する縮小部２１７を有することが好ましい。すなわち、図１に示すように、ウェル２１０は、平面視においてテーパ状の拡大部２１６及び縮小部２１７を有してもよい。ウェル２１０が拡大部２１６及び／又は縮小部２１７を有することにより、当該ウェル２１０から吸引毛細管１１０への溶液の吸引、及び／又は、リザーバー１２０からウェル２１０への溶液の流入を効果的に達成することができる。

【0041】

ウェル２１０のサイズは、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、ウェル２１０の底面２１１の面積は、１０００ｍｍ^２以下であってもよく、３００ｍｍ^２以下であることが好ましく、１００ｍｍ^２以下であることがより好ましい。また、ウェル２１０の底面２１１の面積は、例えば、１ｍｍ^２以上であってもよく、３ｍｍ^２以上であることが好ましく、１２ｍｍ^２以上であることがより好ましい。ウェル２１０の底面２１１の面積は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0042】

また、ウェル２１０の容積は、例えば、５０００μＬ以下であってもよく、５００μＬ以下であることが好ましく、２００μＬ以下であることがより好ましい。また、ウェル２１０の容積は、例えば、１μＬ以上であってもよく、１０μＬ以上であることが好ましく、３０μＬ以上であることがより好ましい。ウェル２１０の容積は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0043】

細胞保持カセット２００は、図１に示すように、ウェル２１０と溶液交換部材１００のリザーバー１２０とを連通させる上流流路２４０、及び／又は、ウェル２１０と溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０とを連通させる下流流路２５０を有することが好ましい。上流流路２４０及び下流流路２５０は、基部２２０において溝状のマイクロ流路として形成されている。そして、上流流路２４０の上流端部２４１（リザーバー１２０側の端部）は、基部２２０の外表面の一部２２０ｂに開口し、当該上流流路２４０の下流端部２４２（ウェル２１０側の端部）は、ウェル２１０内（例えば、内側面２１２）に開口している。下流流路２５０の上流端部２５１（ウェル２１０側の端部）は、ウェル２１０内（例えば、内側面２１２）に開口し、当該下流流路２５０の下流端部２５２（吸引毛細管１１０側の端部）は、基部２２０の外表面の一部２２０ｃに開口している。

【0044】

ただし、細胞保持カセット２００のウェル２１０と、溶液交換部材１００のリザーバー１２０及び吸引毛細管１１０とを連通させる態様は図１に示す例に限られない。すなわち、例えば、上流流路２４０の下流端部２４１、及び／又は、下流流路２５０の上流端部２５１は、それぞれ分岐してウェル２１０に連通していることとしてもよい。具体的に、例えば、上流流路２４０の下流端部２４１は、流入方向Ｂに向けて分岐してウェル２１０に接続し、連通する２以上の下流分岐流路（不図示）を有することとしてもよい。また、例えば、下流流路２５０の上流端部２５１は、吸引方向Ａと反対方向に向けて分岐してウェル２１０に接続し、連通する２以上の上流分岐流路（不図示）を有することとしてもよい。

【0045】

上流流路２４０及び下流流路２５０はウェル２１０と連通しているため、当該ウェル２１０に溶液が保持されることで、当該上流流路２４０及び下流流路２５０にも当該溶液が保持される。

【0046】

この点、上流流路２４０及び下流流路２５０の内面は親水性を有している。上流流路２４０及び下流流路２５０の内面の親水性は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該内面の水接触角は、８５°以下であることが好ましく、６０°以下であることがより好ましい。

【0047】

一方、上流流路２４０の上流端部２４１が開口する基部２２０の外表面２２０ｂ、及び、下流流路２５０の下流端部２５２が開口する基部２２０の外表面２２０ｃは、疎水性を有している。基部２２０の外表面２２０ｂ，２２０ｃの疎水性は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該外表面２２０ｂ，２２０ｃの水接触角は、９０°以上であることが好ましく、１００°以上であることがより好ましい。

【0048】

上流流路２４０及び下流流路２５０のサイズは、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、上流流路２４０の流路断面積（流入方向Ｂに対して垂直な面で切断した断面の面積）、及び下流流路２５０の流路断面積（吸引方向Ａに対して垂直な面で切断した断面の面積）は、それぞれ独立に、１０ｍｍ^２以下であってもよく、４ｍｍ^２以下であることが好ましく、１ｍｍ^２以下であることがより好ましい。また、上流流路２４０及び下流流路２５０の流路断面積は、例えば、それぞれ独立に、０．０００１ｍｍ^２以上であってもよく、０．０１ｍｍ^２以上であることが好ましい。上流流路２４０及び下流流路２５０の流路断面積は、それぞれ独立に、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0049】

本デバイス１に含まれる溶液交換部材１００は、基部１３０と、当該基部１３０にマイクロ流路として形成された吸引毛細管１１０と、当該基部１３０に有底穴として形成されたリザーバー１２０とを有している。

【0050】

基部１３０を構成する材料は、本発明の効果が得られれば特に限られず、例えば、樹脂、ガラス、セラミックス及び金属からなる群より選択される１以上であってもよく、樹脂で構成されることが好ましい。基部１３０の形状は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、基板状であることが好ましい。すなわち、基部１３０は、基板状に構成された樹脂製の部材であることが好ましい。

【0051】

溶液交換部材１００の基部１３０は、図２に示すように、第一基板１３１と、第二基板１３２と、シール部材１３３とを含んで構成されてもよい。図２に示す例において、第一基板１３１には、吸引毛細管１１０を構成する溝とリザーバー１２０の下部を構成する窪みとが形成され、第二基板１３２には、当該リザーバー１２０の上部を構成する貫通穴が形成されている。そして、第一基板１３１の上面のうち窪みに対応する位置に第二基板１３２が接着されることでリザーバー１２０が形成される。また、第一基板１３１の上面のうち溝の上方を塞ぐ位置にシール部材１３３が接着されることで吸引毛細管１１０が形成される。ただし、基部１３０は、本発明の効果が得られれば図２に示す例に限られず、例えば、吸引毛細管１１０を構成する溝と、リザーバー１２０を構成する有底穴とが形成された１つの基板と、当該基板の上面のうち当該溝の上方を塞ぐ位置に接着されたシール部材とを含んで構成されてもよい。

【0052】

吸引毛細管１１０は、細胞保持カセット２００のウェル２１０内の溶液を毛細管力によって吸引し、保持するマイクロ流路である。図１に示すように、吸引毛細管１１０の上流端部１１１（ウェル２１０側の端部）は、基部１３０の外表面の一部１３０ｃに開口している。そして、吸引毛細管１１０は、気体（例えば、空気）を保持した上流端部１１１の開口に溶液が接触することにより、毛細管現象により当該溶液が当該吸引毛細管１１０に吸引されるよう形成されている。

【0053】

また、吸引毛細管１１０の下流端部１１２（上流端部１１１と反対側の端部）は、基部１３０の外表面の一部１３０ａに開口している。すなわち、吸引毛細管１１０の下流端部１１２は、基部１３０の外表面１３０ａに形成された開口１１３を介して外部の気相（例えば、大気）に連通している。より具体的に、図２に示す例において、吸引毛細管１１０の下流端部１１２の開口１１３は、基部１３０の上面（シール部材１３３の上面１３３ａ）である外表面１３０ａに形成されている。そして、吸引毛細管１１０は、毛細管力により吸引された溶液が、気相に開口した下流端部１１２に到達することにより、当該毛細管力による吸引が自発的に停止されるよう形成されている。

【0054】

吸引毛細管１１０の内面は、親水性を有している。吸引毛細管１１０の内面の親水性は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該内面の水接触角は、８５°以下であることが好ましく、６０°以下であることがより好ましい。

【0055】

一方、吸引毛細管１１０の下流端部１１２が開口する基部１３０の外表面１３０ａは、疎水性を有する。基部１３０の外表面１３０ａの疎水性は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該外表面１３０ａの水接触角は、９０°以上であることが好ましく、１００°以上であることがより好ましい。

【0056】

吸引毛細管１１０の形状は、本発明の効果が得られれば特に限られない。すなわち、吸引毛細管１１０は、例えば、図に示すように、平面視において蛇行するよう形成されてもよい。また、吸引毛細管１１０は、例えば、平面視において渦巻状に形成されてもよく、複数に分岐した形状に形成されてもよい。

【0057】

吸引毛細管１１０のサイズは、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、吸引毛細管１１０の流路断面積（吸引方向Ａに対して垂直な面で切断した断面の面積）は、１０ｍｍ^２以下であってもよく、４ｍｍ^２以下であることが好ましく、１ｍｍ^２以下であることがより好ましい。また、吸引毛細管１１０の流路断面積は、例えば、０．０００１ｍｍ^２以上であってもよく、０．０１ｍｍ^２以上であることが好ましい。吸引毛細管１１０の流路断面積は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0058】

また、吸引毛細管１１０の容積は、例えば、１００００μＬ以下であってもよく、１０００μＬ以下であることが好ましい。また、吸引毛細管１１０の容積は、例えば、１μＬ以上であってもよく、１０μＬ以上であることが好ましい。吸引毛細管１１０の容積は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0059】

リザーバー１２０は、底面１２１と、当該底面１２１の外周から上方に延びる内側面１２２と、当該底面１２１及び内側面１２２で囲まれた保持空間１２３とを有している。図２に示す例においては、第一基板１３１の窪みが底面１２１を含むリザーバー１２０の下部を構成し、当該窪みの一部と第二基板１３２の貫通穴の内面とがリザーバー１２０の内側面１２２を構成している。また、リザーバー１２０の上方は、開口している。

【0060】

リザーバー１２０の底面１２１及び内側面１２２は、親水性を有することが好ましい。リザーバー１２０の底面１２１及び内側面１２２の親水性は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該底面１２１及び内側面１２２の水接触角は、８５°以下であることが好ましく、６０°以下であることがより好ましい。

【0061】

リザーバー１２０の形状は、本発明の効果が得られれば特に限られず、例えば、平面視において円形、楕円形、多角形等の任意の形状であってもよい。

【0062】

リザーバー１２０のサイズは、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、リザーバー１２０の容積は、１００００μＬ以下であってもよく、１０００μＬ以下であることが好ましい。また、リザーバー１２０の容積は、例えば、１μＬ以上であってもよく、１０μＬ以上であることが好ましい。リザーバー１２０の容積は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0063】

溶液交換部材１００は、リザーバー１２０と細胞保持カセット２００のウェル２１０とを連通させる流出流路１４０を有することが好ましい。流出流路１４０は、基部１３０において溝状のマイクロ流路として形成されている。そして、図１に示すように、流出流路１４０の上流端部１４１（リザーバー１２０側の端部）は、リザーバー１２０内（例えば、内側面１２２）に開口し、当該流出流路１４０の下流端部１４２（ウェル２１０側の端部）は、基部１３０の外表面の一部１３０ｂに開口している。

【0064】

流出流路１４０はリザーバー１２０と連通しているため、当該リザーバー１２０に溶液が保持されることで、当該流出流路１４０にも当該溶液が保持される。この点、流出流路１４０の内面は親水性を有している。流出流路１４０の内面の親水性は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該内面の水接触角は、８５°以下であることが好ましく、６０°以下であることがより好ましい。

【0065】

一方、流出流路１４０の下流端部１４２が開口する基部１３０の外表面１３０ｂは、疎水性を有する。基部１３０の外表面１３０ｂの疎水性は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該外表面１３０ｂの水接触角は、９０°以上であることが好ましく、１００°以上であることがより好ましい。

【0066】

流出流路１４０のサイズは、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、流出流路１４０の流路断面積（流入方向Ｂに対して垂直な面で切断した断面の面積）は、１０ｍｍ^２以下であってもよく、４ｍｍ^２以下であることが好ましく、１ｍｍ^２以下であることがより好ましい。また、流出流路１４０の流路断面積は、例えば、０．０００１ｍｍ^２以上であってもよく、０．０１ｍｍ^２以上であることが好ましい。流出流路１４０の流路断面積は、それぞれ独立に、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0067】

本デバイス１は、細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００の吸引流路１１０とリザーバー１２０との間に取り付け可能に構成されている。細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００に取り付け可能とするための構成は、本発明の効果が得られれば特に限らないが、例えば、当該細胞保持カセット２００及び当該溶液保持部材１００は、一方が他方に係合するよう構成されていることが好ましい。

【0068】

すなわち、例えば、溶液交換部材１００は、細胞保持カセット２００が嵌め入れられる取付凹部１５０を有していることとしてもよい。具体的に、図１及び図２に示す例においては、溶液交換部材１００の基部１３０のうち吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間の位置に、細胞保持カセット２００の基部２２０が嵌め入れられる取付凹部１５０が形成されている。

【0069】

また、細胞保持カセット２００及び溶液交換部材１００は、互いに係合可能な一対の係合部を有してもよい。すなわち、細胞保持カセット２００及び溶液交換部材１００は、例えば、一方が凸形状を有し、他方が凹形状を有する一対の係合部を有してもよい。

【0070】

具体的に、図１に示す例において、細胞保持カセット２００は、基部２２０から突出して形成された凸形状の第一係合部２６０を有し、溶液交換部材１００は、当該突出部２６０と係合する凹形状の第二係合部１６０を有している。より具体的に、細胞保持カセット２００は、基部２２０のリザーバー１２０側の端部及び吸引毛細管１１０側の端部のそれぞれに第一係合部２６０を有し、溶液交換部材１００は、当該第一係合部２６０と係合する一対の第二係合部１６０とを有している。

【0071】

また、図１に示す例において、細胞保持カセット２００の上流流路２４０及び下流流路２５０は、それぞれ上流側の第一係合部２６０の外表面２２０ｂ及び下流側の第一係合部２６０の外表面２２０ｃに開口している。また、これに対応して、溶液保持部材１００の流出流路１４０及び吸引毛細管１１０は、それぞれ上流側の第二係合部１６０の外表面１３０ｂ及び下流側の第二係合部１６０の外表面１３０ｃに開口している。

【0072】

本デバイス１は、細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持した細胞保持カセット２００を、溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間に取り付けることによって、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への当該第一溶液の吸引が開始されるよう構成されている。

【0073】

すなわち、本デバイス１は、細胞保持カセット２００が溶液交換部材１００に取り付けられることによって、当該細胞保持カセット２００のウェル２１０と、当該溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０とが連通するよう構成されている。

【0074】

具体的に、細胞保持カセット２００が溶液交換部材１００に取り付けられた状態において、当該細胞保持カセット２００の下流流路２５０は、当該溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０と接続され、その結果、当該細胞保持カセット２００のウェル２１０と当該吸引毛細管１１０とが当該下流流路２５０を介して連通する。

【0075】

より具体的に、細胞保持カセット２００の下流流路２５０が開口する基部２２０の外表面２２０ｃと、溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０の上流端部１１１が開口する基部１３０の外表面１３０ｃとは密着するように構成されている。

【0076】

このため、細胞保持カセット２００においてウェル２１０とともに第一溶液を保持している下流流路２５０が、気体（例えば、空気）を保持している吸引毛細管１１０の上流端部１１１と接続され、連通することにより、毛細管力によって当該第一溶液は当該ウェル２１０及び下流流路２５０から当該吸引毛細管１１０に吸引され始める。すなわち、細胞保持カセット２００を溶液交換部１００に取り付けるだけで、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引が自発的に開始される。

【0077】

また、本デバイス１は、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引が開始されることにより、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入が開始されるよう構成されている。

【0078】

すなわち、本デバイス１は、細胞保持カセット２００が溶液交換部材１００に取り付けられることによって、当該細胞保持カセット２００のウェル２１０と、当該溶液交換部材１００のリザーバー１２０とが連通するよう構成されている。

【0079】

具体的に、細胞保持カセット２００が溶液交換部材１００に取り付けられた状態において、当該細胞保持カセット２００の上流流路２４０は、当該溶液交換部材１００の流出流路１４０と接続され、その結果、当該細胞保持カセット２００のウェル２１０と当該リザーバー１２０とが当該上流流路２４０及び当該流出流路１４０を介して連通する。

【0080】

より具体的に、細胞保持カセット２００の上流流路２４０が開口する基部２２０の外表面２２０ｂと、溶液交換部材１００の流出流路１４０が開口する基部１３０の外表面１３０ｂとは密着するように構成されている。

【0081】

また、細胞保持カセット２００のウェル２１０は、その上方の開口を塞ぐ天面２１４を有することで、上流流路２４０及び下流流路２５０を介してそれぞれリザーバー１２０及び吸引毛細管１１０に連通している以外は密閉されている。

【0082】

このため、ウェル２１０とリザーバー１２０とが連通した状態で、上述のとおり毛細管力によるウェル２１０から吸引引毛細管１１０への第一溶液の吸引が開始されることにより、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入も開始される。すなわち、細胞保持カセット２００を溶液交換部１００に取り付けるだけで、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引に加えて、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入も自発的に開始される。

【0083】

そして、本デバイス１においては、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引と、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入とが開始されることにより、当該ウェル２１０内の溶液交換が開始される。

【0084】

さらに、本デバイス１は、上述のように溶液交換が開始された後、細胞及び溶液がウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェル２１０から吸引毛細管１１０への吸引が停止されるよう構成されている。

【0085】

ここで、細胞及び溶液がウェル２１０に保持された状態で毛細管力による当該ウェル２１０から吸引毛細管１１０への吸引が停止されるための構成は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該吸引毛細管１１０は、溶液交換部１００に取り付けられる前の細胞保持カセット２００のウェル２１０に保持される第一溶液の体積と、細胞保持カセット２００が取り付けられる前の溶液交換部材１００のリザーバー１２０に保持される第二溶液の体積との合計（以下、「溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積」という。）より小さい容積を有するとともに、気相中に開口した下流端部１１２を有することとしてもよい。

【0086】

この場合、毛細管力によりウェル２１０から吸引毛細管１１０内に吸引された、溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積より小さい体積の溶液が、当該吸引毛細管１１０の下流端部１１２に到達することにより、当該毛細管力による吸引が停止される。

【0087】

具体的に、まず溶液交換開始時の吸引毛細管１１０は、その内部に気体を保持し、その下流端部１１２は気相（すなわち、本デバイス１外の雰囲気（例えば、大気））中に開口しているため、当該吸引毛細管１１０は、当該下流端部１１２の開口から当該気体を排出しながら、毛細管力によりウェル２１０から溶液を吸引する。

【0088】

次に、吸引毛細管１１０の下流端１１２は気相中に開口しているため、吸引された溶液が当該下流端１１２に到達することで、毛細管力によるウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引は自発的に停止される。

【0089】

ここで、吸引毛細管１１０の容積は、溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積より小さいため、毛細管力によるウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引は、当該ウェル２１０に溶液が保持された状態で停止される。

【0090】

このように、吸引毛細管１１０は、毛細管力によるウェル２１０からの溶液の吸引を自発的に開始するのみならず、ウェル２１０内に細胞及び溶液が保持された状態で、すなわち、細胞を保持したウェル２１０内の溶液が吸引され尽くされる前に、当該毛細管力による吸引を自発的に停止する。また、吸引毛細管１１０は、溶液交換の開始から停止までの間、毛細管力によりウェル２１０から吸引した溶液を排出することなく保持する。

【0091】

なお、溶液交換においては、ウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引と、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入とが並行して行われるため、当該ウェル２１０内では、残存している第一溶液と、流入した第二溶液との混合が少なからず生じる。このため、溶液交換が停止される時点においてウェル２１０に保持されている溶液は、その組成が第二溶液の組成と完全には一致しない第三溶液となる。この点、例えば、流体力学的な観点から、ウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引、及び、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入の条件（例えば、流量）が適切な範囲となるよう本デバイス１を設計することにより、溶液交換停止時のウェル２１０に保持される第三溶液の組成が第二溶液の組成に近いものとなるよう調整することができる。

【0092】

吸引毛細管１１０が上述のとおり、溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積より小さい容積を有する場合、当該吸引毛細管１１０の容積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積の０．９９倍以下であってもよく、０．９５倍以下であってもよく、０．９倍以下であってもよく、０．８倍以下であってもよく、０．７倍以下であってもよく、０．６倍以下であってもよい。また、吸引毛細管１１０の容積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積の０．１倍以上であってもよく、０．２倍以上であってもよく、０．３倍以上であってもよく、０．４倍以上であってもよい。溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積に対する吸引毛細管１１０の容積の割合は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0093】

また、吸引毛細管１１０が、溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積より小さい容積を有する場合、当然ながら、当該吸引毛細管１１０の容積は、ウェル２１０の容積とリザーバー１２０の容積との合計より小さくなる。

【0094】

具体的に、吸引毛細管１１０の容積は、例えば、ウェル２１０の容積とリザーバー１２０の容積との合計の０．９９倍以下であってもよく、０．９５倍以下であってもよく、０．９倍以下であってもよく、０．８倍以下であってもよく、０．７倍以下であってもよく、０．６倍以下であってもよい。また、吸引毛細管１１０の容積は、例えば、ウェル２１０の容積とリザーバー１２０の容積との合計の０．１倍以上であってもよく、０．２倍以上であってもよく、０．３倍以上であってもよく、０．４倍以上であってもよい。ウェル２１０の容積とリザーバー１２０の容積との合計に対する吸引毛細管１１０の容積の割合は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0095】

また、吸引毛細管１１０の容積は、細胞保持カセット２００が取り付けられる前の溶液交換部材１００のリザーバー１２０に保持される第二溶液の体積（以下、「溶液交換開始時の第二溶液の体積」という。）以上であることとしてもよい。この場合、溶液交換開始時にリザーバー１２０に保持されていた第二溶液の全てを溶液交換に利用することができる。

【0096】

具体的に、吸引毛細管１１０の容積は、例えば、吸引開始時の第二溶液の体積の１倍以上であってもよく、１．１倍以上であってもよく、１．２倍以上であってもよい。また、吸引毛細管１１０の容積は、例えば、吸引開始時の第二溶液の体積の１０倍以下であってもよく、８倍以下であってもよく、６倍以下であってもよく、４倍以下であってもよく、２倍以下であってもよい。吸引開始時の第二溶液の体積に対する吸引毛細管１１０の容積の割合は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0097】

また、吸引毛細管１１０の容積は、溶液交換部材１００に取り付けられる前の細胞保持カセット２００のウェル２１０に保持される第一溶液の体積（以下、「溶液交換開始時の第一溶液の体積」という。）以上であってもよいし、当該溶液交換開始時の第一溶液の体積以下であってもよい。すなわち、溶液交換においては、溶液交換開始時の第一溶液の全量を交換することとしてもよいし、当該溶液交換開始時の第一溶液の一部を交換することとしてもよい。

【0098】

具体的に、吸引毛細管１１０の容積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液の体積の０．１倍以上であってもよく、０．２倍以上であってもよく、０．４倍以上であってもよく、０．６倍以上であってもよく、０．８倍以上であってもよく、１倍以上であってもよく、２倍以上であってもよく、３倍以上であってもよい。また、吸引毛細管１１０の容積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液の体積の１０倍以下であってもよく、８倍以下であってもよく、６倍以下であってもよく、５倍以下であってもよい。溶液交換開始時の第一溶液の体積に対する吸引毛細管１１０の容積の割合は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0099】

次に、本方法のうち、本デバイス１を用いた溶液交換方法の詳細について説明する。溶液交換方法は、準備工程と溶液交換工程とを含む。準備工程においては、図４（Ａ）に示すように、細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持し、溶液交換部１００材に取り付けられていない細胞保持カセット２００を準備する。

【0100】

ここで、第一溶液に限らず、本方法において本デバイス１に保持する溶液は、ウェル２１０に保持される細胞の生存を維持できる水溶液であることが好ましく、例えば、リン酸緩衝液やハンクス液等の平衡塩類溶液又は培養液、又はこれらの溶液をベースに調製された水溶液が好ましく用いられる。

【0101】

準備工程においてウェル２１０に保持する第一溶液の体積は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、５０００μＬ以下であってもよく、５００μＬ以下であることが好ましく、２００μＬ以下であることがより好ましい。また、準備工程においてウェル２１０に保持する第一溶液の体積は、１μＬ以上であってもよく、１０μＬ以上であることが好ましく、３０μＬ以上であることがより好ましい。準備工程においてウェル２１０に保持する第一溶液の体積は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0102】

なお、細胞保持カセット２００の上流流路２４０及び下流流路２５０は、ウェル２１０に連通しているため、当該ウェル２１０に第一溶液を保持することにより、当該上流流路２４０及び下流流路２５０にも当該第一溶液が保持される。

【0103】

ウェル２１０に保持する細胞は、本発明による効果が得られるものであれば特に限られないが、例えば、哺乳類、爬虫類、両生類、魚類、又は昆虫の細胞が好ましく用いられ、哺乳類又は昆虫の細胞が特に好ましく用いられる。また、ウェル２１０に保持する細胞は、接着性細胞であってもよいし、非接着性細胞であってもよいが、接着性細胞が好ましく用いられる。

【0104】

本方法において、溶液交換は、ウェル２１０内に細胞を保持したまま行う。このため、例えば、ウェル２１０の底面２１１に細胞を接着させて保持することが好ましい。また、例えば、ウェル２１０内に培養担体を保持し、当該培養担体に細胞を保持することとしてもよい。また、例えば、ウェル２１０の底面２１１を、下流流路２５０より下方に窪んだ凹部として形成し、当該窪んだ底面２１１上に細胞を沈降させて保持することとしてもよい。

【0105】

細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持させる方法は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、当該第一溶液に当該細胞を懸濁して調製された細胞懸濁液を当該ウェル２１０に入れることにより、当該細胞を当該ウェル２１０に保持することとしてもよい。

【0106】

準備工程においては、予めウェル２１０内で細胞を培養することとしてもよい。この場合、予め培養された細胞がウェル２１０に保持された細胞保持カセット２００が準備される。なお、ウェル２１０内での細胞の培養は、当該ウェル２１０内に当該細胞を保持した細胞保持カセット２００をインキュベータ内に静置することにより好ましく実施される。また、細胞の培養中、ウェル２１０の上方は開口していることが好ましい。

【0107】

また、準備工程においては、図４（Ａ）に示すように、第二溶液をリザーバー１２０に保持し、細胞保持カセット２００が取り付けられていない溶液交換部材１００も準備する。

【0108】

準備工程においてリザーバー１２０に保持される第二溶液は、第一溶液と異なる組成を有する水溶液であることが好ましい。ただし、第一溶液及び第二溶液の組成は、目的に応じて適宜調整されればよい。すなわち、第二溶液は、例えば、平衡塩類溶液又は培養液に、ウェル２１０内の細胞に作用させたい成分を添加して調製された水溶液であることとしてもよい。

【0109】

準備工程においてリザーバー１２０に保持する第二溶液の体積は、本発明の効果が得られれば特に限られないが、例えば、１００００μＬ以下であってもよく、１０００μＬ以下であることが好ましい。また、準備工程においてリザーバー１２０に保持する第二溶液の体積は、１μＬ以上であってもよく、１０μＬ以上であることが好ましい。準備工程においてリザーバー１２０に保持する第二溶液の体積は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0110】

なお、溶液交換部材１００の流出流路１４０は、リザーバー１２０に連通しているため、当該リザーバー１２０に第二溶液を保持することにより、当該流出流路１４０にも当該第二溶液が保持される。

【0111】

準備工程においてリザーバー１２０に保持する第二溶液の体積（すなわち、溶液交換開始時の第二溶液の体積）は、例えば、当該準備工程においてウェル２１０に保持される第一溶液の体積（すなわち、溶液交換開始時の第一溶液の体積）以上であってもよいし、当該溶液交換開始時の第一溶液の体積以下であってもよい。

【0112】

具体的に、溶液交換開始時の第二溶液の体積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液の体積の０．１倍以上であってもよく、０．２倍以上であってもよく、０．４倍以上であってもよく、０．６倍以上であってもよく、０．８倍以上であってもよく、１倍以上であってもよく、２倍以上であってもよく、３倍以上であってもよい。また、溶液交換開始時の第二溶液の体積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液の体積の１０倍以下であってもよく、８倍以下であってもよく、６倍以下であってもよく、５倍以下であってもよく。溶液交換開始時の第一溶液の体積に対する、溶液交換開始時の第二溶液の体積の割合は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0113】

なお、準備工程で準備される第二溶液がリザーバー１２０に保持された溶液交換部材１００においては、当該リザーバー１２０に連通した流出流路１４０にも当該第二溶液が保持される。

【0114】

準備工程で準備される溶液交換部材１００においては、吸引毛細管１１０に気体を保持する。すなわち、準備工程においては、第二溶液をリザーバー１２０に保持し、且つ気体を吸引毛細管１１０に保持した、細胞保持カセット２００が取り付けられていない溶液交換部材１００を準備する。具体的に、吸引毛細管１１０は、気体で満たされていることとしてもよい。また、吸引毛細管１１０は液体を保持していないこととしてもよい。

【0115】

続く溶液交換工程においては、まず、図４（Ｂ）に示すように、細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間に取り付ける。すなわち、例えば、上述のように、細胞保持カセット２００及び溶液保持部材１００が、一方が他方に係合するよう構成されている場合には、当該細胞保持カセット２００と当該溶液保持部材１００とを係合することにより、当該細胞保持カセット２００を当該溶液保持部材１００に取り付ける。

【0116】

具体的に、例えば、図１及び図２に示すように、溶液交換部材１００が取付凹部１５０を有している場合には、細胞保持カセット２００を当該取付凹部１５０に嵌め入れる。また、図１に示すように、細胞保持カセット２００及び溶液交換部材１００が、それぞれ第一係合部２６０及び第二係合部１６０を有している場合には、当該第一係合部２６０と第二係合部１６０とを係合させる。

【0117】

そして、溶液交換工程においては、細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持した細胞保持カセット２００を、溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間に取り付けることによって、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への当該第一溶液の吸引が開始される。

【0118】

すなわち、細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００に取り付けて、当該細胞保持カセット２００のウェル２１０と、当該溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０とを連通させることにより、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引が開始される。

【0119】

具体的に、細胞保持カセット２００の第一溶液が保持された下流流路２５０と、溶液交換部材１００の気体が保持された吸引毛細管１１０とが接続されることにより、毛細管力によって当該第一溶液が当該吸引毛細管１１０に吸引され始める。

【0120】

すなわち、細胞保持カセット２００を溶液交換部１００に取り付けるだけで、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引が自発的に開始される。

【0121】

また、溶液交換工程においては、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引が開始されることにより、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入が開始される。

【0122】

すなわち、細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００に取り付けることにより、当該細胞保持カセット２００のウェル２１０と、当該溶液交換部材１００のリザーバー１２０とが連通した状態で、上述のように毛細管力による当該ウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引が開始されることにより、当該リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入も開始される。

【0123】

具体的に、細胞保持カセット２００の第一溶液が保持された上流流路２４０と、溶液交換部材１００の第二溶液が保持された流出流路１４０とが接続され、且つ、当該細胞保持カセット２００のウェル２１０が当該上流流路２４０及び下流流路２５０を介してリザーバー１２０及び吸引毛細管１１０とそれぞれ連通している以外は密閉されている状態で、上述のように毛細管力によって当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０に第一溶液が吸引され始めることにより、当該リザーバー１２０から当該ウェル２１０に第二溶液が流入し始める。

【0124】

すなわち、細胞保持カセット２００を溶液交換部１００に取り付けるだけで、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引に加えて、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入も自発的に開始される。

【0125】

このように溶液交換工程においては、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引と、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入とが開始されることにより、当該ウェル２１０内の溶液交換が開始される。

【0126】

そして、溶液交換工程においては、毛細管力によってウェル２１０から吸引毛細管１１０に溶液が吸引され続けている限り、リザーバー１２０から当該ウェル２１０に第二溶液が流入し続ける。

【0127】

さらに、溶液交換工程においては、上述のように溶液交換が開始された後、図４（Ｃ）に示すように、細胞及び溶液がウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェル２１０から吸引毛細管１１０への吸引が停止される。

【0128】

すなわち、例えば、上述のように、吸引毛細管１１０が溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積より小さい容積を有するとともに、気相中に開口した下流端部１１２を有する場合には、溶液交換工程において、毛細管力によりウェル２１０から当該吸引毛細管１１０に吸引された、当該溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積より小さい体積の溶液が当該吸引毛細管１１０の下流端部１１２に到達することにより、当該毛細管力による吸引が停止される。また、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への溶液の吸引が停止されることにより、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入も停止される。

【0129】

こうして溶液交換工程においては、細胞を保持したウェル２１０内の溶液が吸引され尽くされる前に、溶液交換が自発的に停止される。すなわち、溶液交換工程においては、溶液交換が開始されてから停止されるまでの間、細胞を含むウェル２１０内には溶液が保持され続け、最終的に、当該細胞と当該溶液交換後の溶液とが保持された当該ウェル２１０が得られる。

【0130】

上述のとおり吸引毛細管１１０が溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積より小さい容積を有する場合、溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積の０．９９倍以下であってもよく、０．９５倍以下であってもよく、０．９倍以下であってもよく、０．８倍以下であってもよく、０．７倍以下であってもよく、０．６倍以下であってもよい。また、溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積の０．１倍以上であってもよく、０．２倍以上であってもよく、０．３倍以上であってもよく、０．４倍以上であってもよい。溶液交換開始時の第一溶液及び第二溶液の合計体積に対する、溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積の割合は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0131】

溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積は、溶液交換開始時の第二溶液の体積以上であることとしてもよい。この場合、溶液交換開始時にリザーバー１２０に保持されていた第二溶液の全てを溶液交換に利用することができる。

【0132】

具体的に、溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積は、例えば、吸引開始時の第二溶液の体積の１．１倍以上であってもよく、１．２倍以上であってもよい。また、溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積は、例えば、吸引開始時の第二溶液の体積の１０倍以下であってもよく、８倍以下であってもよく、６倍以下であってもよく、４倍以下であってもよく、２倍以下であってもよい。吸引開始時の第二溶液の体積に対する、溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積の割合は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0133】

溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積は、溶液交換開始時の第一溶液の体積以上であってもよいし、当該溶液交換開始時の第一溶液の体積以下であってもよい。すなわち、溶液交換においては、溶液交換開始時の第一溶液の全量を交換することとしてもよいし、当該溶液交換開始時の第一溶液の一部を交換することとしてもよい。

【0134】

具体的に、溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液の体積の０．１倍以上であってもよく、０．２倍以上であってもよく、０．４倍以上であってもよく、０．６倍以上であってもよく、０．８倍以上であってもよく、１倍以上であってもよく、２倍以上であってもよく、３倍以上であってもよい。また、溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積は、例えば、溶液交換開始時の第一溶液の体積の１０倍以下であってもよく、８倍以下であってもよく、６倍以下であってもよく、５倍以下であってもよい。溶液交換開始時の第一溶液の体積に対する、溶液交換工程においてウェル２１０から吸引毛細管１１０に吸引される溶液の体積の割合は、上記下限値のいずれかと、上記上限値のいずれかとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0135】

また、溶液交換工程において、溶液交換が停止された時点でウェル２１０内に保持されている細胞の数（以下、「溶液交換停止時の細胞数」という。）は、当該溶液交換の開始前に当該ウェル２１０に保持されていた細胞の数（以下、「溶液交換開始時の細胞数」という。）から大きく減少しないことが好ましく、同程度に維持されることが特に好ましい。

【0136】

すなわち、溶液交換工程において、溶液交換開始時の細胞数に対する、溶液交換停止時の細胞数の割合は、例えば、５０％以上であってもよく、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、８５％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることが特に好ましい。

【0137】

このように、本デバイス１及び本方法によれば、細胞保持カセット２００を溶液交換部材２００に取り付けるという簡単な操作のみで、当該細胞保持カセット２００の細胞を保持したウェル２１０内の溶液交換を効果的に達成することができる。

【0138】

本デバイス１の細胞保持カセット２００は、溶液交換部材１００に取り付け可能であり、且つ取り付け後に取り外し可能に構成されることとしてもよい。細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００に取り付け可能であり、且つ取り付け後に取り外し可能にするための構成は、本発明の効果が得られれば特に限られず、例えば、当該細胞保持カセット２００及び溶液保持部材１００は、一方が他方に係合可能であり、且つ、係合後に分離可能に構成されることとしてもよい。

【0139】

具体的に、例えば、図１及び図２に示すように、溶液交換部材１００が取付凹部１５０を有している場合には、細胞保持カセット２００は、当該取付凹部１５０に嵌め入れられることにより取り付け可能であり、且つ、その後、当該取付凹部１５０から抜き去ることにより取り外し可能に構成されてもよい。また、図１に示す細胞保持カセット２００の第一係合部２６０及び溶液交換部材１００の第二係合部１６０は、互いに係合可能であり、且つ、係合後に分離可能に構成されてもよい。

【0140】

このように本デバイス１の細胞保持カセット２００が、溶液交換部材１００に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能に構成されている場合、本方法は、図４（Ｄ）に示すように、溶液交換工程における溶液交換の停止後に、細胞と溶液交換後の第三溶液とがウェル２１０に保持された当該細胞保持カセット２００を、当該溶液交換部材１００から取り外すことをさらに含んでもよい。

【0141】

この場合、本方法は、例えば、上述のように溶液交換工程における溶液交換の停止後に溶液交換部材１００から取り外された細胞保持カセット２００のウェル２１０内で細胞を培養する培養工程をさらに含んでもよい。すなわち、本方法は、その一側面として、準備工程、溶液交換工程及び培養工程を含む細胞培養方法をも包含する。培養工程における細胞の培養は、例えば、細胞を含む第三溶液をウェル２１０に保持した細胞保持カセット２００をインキュベータ内に保持することにより好ましく実施される。細胞培養方法においては、第一溶液及び第二溶液が培養液であることが好ましく、少なくとも第二溶液が培養液であることが特に好ましい。

【0142】

本デバイス１は、複数の溶液交換部材１００と、当該溶液交換部材１００に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能な細胞保持カセット２００とを含むこととしてもよい。この場合、複数の溶液交換部材１００は、同一形状の吸引毛細管１１０及びリザーバー１２０を有してもよいし、異なる形状の吸引毛細管１１０及び／又はリザーバー１２０を有してもよい。

【0143】

そして、本デバイス１が、第一溶液交換部材１００（Ｉ）及び第二溶液交換部材１００（ＩＩ）を含む複数の溶液交換部材１００と、当該溶液交換部材１００に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能な細胞保持カセット２００とを含む場合、本方法は、当該第一溶液交換部材１００（Ｉ）を用いる準備工程及び溶液交換工程を、それぞれ第一準備工程及び第一溶液交換工程として実施し、さらに、当該第二溶液交換部１００（ＩＩ）を用いた第二準備工程及び第二溶液交換工程を含むこととしてもよい。

【0144】

すなわち、この場合、本方法においては、まず図５（Ａ）に示すように、第一準備工程において、細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持し溶液交換部材１００に取り付けられていない細胞保持カセット２００を準備するとともに、第二溶液をリザーバー１２０に保持し細胞保持カセット２００が取り付けられていない第一溶液交換部材１００（Ｉ）を準備する。

【0145】

次いで、第一準備工程後、第一溶液交換工程においては、図５（Ｂ）に示すように、細胞保持カセット２００を第一溶液交換部材１００（Ｉ）の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間に取り付けることによって、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引と、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、図５（Ｃ）に示すように、細胞と溶液交換後の第三溶液とがウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引が停止されることにより、当該溶液交換が停止される。

【0146】

さらに、続く第二準備工程においては、図５（Ｄ）に示すように、第一溶液交換工程における溶液交換の停止後に、細胞保持カセット２００を第一溶液交換部材１００（Ｉ）から取り外して、図５（Ｅ）に示すように、細胞及び第三溶液をウェル２１０に保持し、溶液交換部材１００に取り付けられていない当該細胞保持カセット２００を準備するとともに、第四溶液をリザーバー１２０に保持し細胞保持カセット２００が取り付けられていない第二溶液交換部材１００（ＩＩ）を準備する。

【0147】

ここで、第二準備工程においてリザーバー１２０に保持される第四溶液は、第三溶液と異なる組成を有する水溶液であることが好ましい。ただし、第四溶液の組成は、目的に応じて適宜調整されればよい。また、リザーバー１２０に保持する第四溶液の体積は、第一準備工程でリザーバー１２０に保持した第二溶液の体積と同一であってもよいし、異なっていてもよい。

【0148】

そして、第二準備工程後、第二溶液交換工程においては、図５（Ｆ）に示すように、細胞保持カセット２００を第二溶液交換部材１００（ＩＩ）の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間に取り付けることによって、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第三溶液の吸引と、当該リザーバー１２０から当該ウェル２１０への当該第四溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、図５（Ｇ）に示すように、当該細胞と溶液交換後の第五溶液とが当該ウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引が停止されることにより、当該溶液交換が停止される。

【0149】

また、本デバイス１の複数の溶液交換部材１００が、さらに第三溶液交換部材１００（ＩＩＩ）（不図示）を含む場合、本方法においては、上記第二溶液交換部１００（ＩＩ）に代えて、当該第三溶液交換部材１００（ＩＩＩ）を用いた第三準備工程及び第三溶液交換工程をさらに含む。

【0150】

すなわち、第二溶液交換工程に続く第三準備工程においては、第二溶液交換工程における溶液交換の停止後に、細胞保持カセット２００を第二溶液交換部材１００（ＩＩ）から取り外して、細胞及び第五溶液をウェル２１０に保持し、溶液交換部材１００に取り付けられていない当該細胞保持カセット２００を準備するとともに、第六溶液をリザーバー１２０に保持し細胞保持カセット２００が取り付けられていない第三溶液交換部材１００（ＩＩＩ）を準備する。

【0151】

ここで、第三準備工程においてリザーバー１２０に保持される第六溶液は、第五溶液と異なる組成を有する水溶液であることが好ましい。ただし、第六溶液の組成は、目的に応じて適宜調整されればよい。また、リザーバー１２０に保持する第六溶液の体積は、第一準備工程でリザーバー１２０に保持した第二溶液、及び／又は、第二準備工程でリザーバー１２０に保持した第四溶液の体積と同一であってもよいし、異なっていてもよい。

【0152】

そして、第三準備工程後、第三溶液交換工程においては、細胞保持カセット２００を第三溶液交換部材１００（ＩＩＩ）の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間に取り付けることによって、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への第五溶液の吸引と、当該リザーバー１２０から当該ウェル２１０への当該第六溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、当該細胞と溶液交換後の第七溶液とが当該ウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引が停止されることにより、当該溶液交換が停止される。

【0153】

本デバイス１が４つ以上の溶液交換部材１００を含む場合、４つ目以降の溶液交換部材１００を用いて上述した第二準備工程及び第三準備工程と同様の準備工程、及び第二溶液交換工程及び第三溶液交換工程と同様の溶液交換工程をさらに繰り返してもよい。このような本方法によれば、１つの細胞保持カセット２００のウェル２１０について、当該ウェル２１０内に細胞を保持したまま、複数回の溶液交換を簡便に実施することができる。

【0154】

本デバイス１は、複数の細胞保持カセット２００と、当該複数の細胞保持カセット２００の溶液交換に用いられる複数の溶液交換部材１００とを含むこととしてもよい。この場合、本方法は、複数の細胞保持カセット２００の各々について、複数の溶液交換部材１００を用いた準備工程及び溶液交換工程を含むこととしてもよい。すなわち、複数の細胞保持カセット２００の各々について、上述した準備工程及び溶液交換工程による溶液交換を１回のみ実施してもよいし、上述した第二準備工程及び第二溶液交換工程と同様の工程による２回以上の溶液交換を実施してもよい。

【0155】

なお、複数の溶液交換部材１００は、同一形状の吸引毛細管１１０及びリザーバー１２０を有してもよいし、異なる形状の吸引毛細管１１０及び／又はリザーバー１２０を有してもよい。また、複数の細胞保持カセット２００は、同一形状のウェル２１０を有してもよいし、異なる形状のウェル２１０を有してもよい。

【0156】

具体的に、例えば、本デバイス１が、第一溶液交換部材１００（Ｉ）及び第二溶液交換部材１００（ＩＩ）を含む複数の溶液交換部材１００と、第一細胞保持カセット２００（Ｉ）及び第二細胞保持カセット２００（ＩＩ）を含む複数の細胞保持カセット２００とを含む場合、本方法の準備工程においては、図６（Ａ）に示すように、細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持し溶液交換部材１００に取り付けられていない第一細胞保持カセット２００（Ｉ）及び第二細胞保持カセット２００（ＩＩ）を準備するとともに、第二溶液をリザーバー１２０に保持し細胞保持カセット２００が取り付けられていない第一溶液交換部材１００（Ｉ）及び第二溶液交換部材１００（ＩＩ）を準備する。

【0157】

ここで、第一細胞保持カセット２００（Ｉ）と第二細胞保持カセット２００（ＩＩ）とは、ウェル２１０に保持する細胞の種類又は数、及び／又は、ウェル２１０に保持する第一溶液の組成又は量が同一であってもよいし、異なっていてもよい。また、第一溶液交換部材１００（Ｉ）と第二溶液交換部材１００（ＩＩ）とは、リザーバー１２０に保持する第二溶液の組成又は量が同一であってもよいし、異なっていてもよい。

【0158】

次に、準備工程後、溶液交換工程においては、図６（Ｂ）に示すように、第一細胞保持カセット２００（Ｉ）及び第二細胞保持カセット２００（ＩＩ）を、それぞれ第一溶液交換部材１００（Ｉ）及び第二溶液交換部材１００（ＩＩ）に取り付けることによって、それぞれのウェル２１０の溶液交換が開始され、且つ、その後、図６（Ｃ）に示すように、細胞及び溶液が当該ウェル２１０に保持された状態で、当該溶液交換が停止される。

【0159】

複数の細胞保持カセット２００を含む本デバイス１が、当該細胞保持カセット２００の数より大きい数の溶液交換部材１００を含む場合には、当該複数の細胞保持カセット２００の１以上について、上述のように複数回の溶液交換を簡便に実施することもできる。このような本方法によれば、複数の細胞保持カセット２００の各々のウェル２１０について、溶液交換を簡便に実施することができる。

【0160】

なお、図５及び図６に示す例においては、複数の溶液交換部材１００が別体として構成され、また、複数の細胞保持カセット１００が別体として構成されているが、これに限られず、例えば、複数の溶液交換部材１００は、共通の基部１３０と、当該基部１３０に互いに離間して形成された吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との複数の対とを有して構成されてもよいし、及び／又は、複数の細胞保持カセット２００は、共通の基部２２０と、当該基部２２０に互いに離間して形成された複数のウェル２１０とを有して構成されてもよい。

【0161】

本デバイス１及び本方法は、様々な用途で使用することができる。具体的に、本デバイス１及び本方法は、例えば、標的物質に対する細胞の応答の評価や、細胞に変化をもたらす物質のスクリーニングに使用することができる。また、本デバイス１及び本方法は、例えば、遺伝子導入細胞の製造に使用することもできる。

【0162】

すなわち、本方法は、その一側面として、本デバイス１を用いた遺伝子導入細胞の製造方法（以下、「本製造方法」という。）を包含する。本製造方法は、上述した準備工程及び溶液交換工程に加えて、遺伝子導入工程を含む。

【0163】

本製造方法の準備工程においては、図４（Ａ）に示すように、細胞を含む第一溶液をウェル２１０に保持し溶液交換部材１００に取り付けられていない細胞保持カセット２００と、当該細胞に導入する核酸を含む遺伝子導入用の第二溶液をリザーバー１２０に保持し細胞保持カセット２００が取り付けられていない溶液交換部材１００とを準備する。

【0164】

ここで、遺伝子導入（トランスフェクション）の対象とする細胞は、第二溶液を用いて核酸を導入できる細胞であれば特に限られない。第二溶液は、ウェル２１０内の細胞に導入すべき核酸を含み、当該細胞を当該第二溶液中で保持することにより当該細胞に当該核酸を導入することができる組成を有する遺伝子導入用の水溶液であれば特に限られず、例えば、市販の遺伝子導入キットを用いて調製されるものが好ましく用いられる。具体的に、遺伝子導入用の第二溶液は、例えば、細胞に導入すべき核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）と、カチオン性脂質とを含むことが好ましい。

【0165】

本製造方法の溶液交換工程においては、準備工程後、図４（Ｂ）に示すように、細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間に取り付けることによって、毛細管力によるウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への第一溶液の吸引と、当該リザーバー１２０から当該ウェル２１０への核酸を含む第二溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、図４（Ｃ）に示すように、細胞と核酸を含む溶液とが当該ウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェルから当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引が停止されることにより、当該溶液交換が停止される。

【0166】

なお、溶液交換工程における溶液交換後にウェル２１０内に保持される溶液は、当該ウェル２１０からの第一の溶液の吸引及び当該ウェル２１０への第二溶液の流入の結果、当該ウェル２１０内に保持される細胞に導入すべき核酸を含み、当該細胞を当該溶液中で保持することにより当該細胞に当該核酸を導入することができる組成を有する。

【0167】

続く遺伝子導入工程においては、溶液交換工程後、細胞保持カセット２００のウェル２１０において核酸を含む溶液中で細胞を保持することにより当該細胞への当該核酸の導入を行って、当該核酸が導入された遺伝子導入細胞を得る。

【0168】

遺伝子導入工程における細胞の保持は、例えば、細胞保持カセット２００をインキュベータ内で静置することにより実施される。遺伝子導入工程において核酸を含む溶液中で細胞を保持する時間は、当該細胞に当該核酸を導入するために必要な時間であれば特に限られない。

【0169】

遺伝子導入工程は、溶液交換部材１００に取り付けられたままの細胞保持カセット２００のウェル２１０内で細胞を保持することにより実施してもよいが、細胞保持カセット２００が、溶液交換部材１００に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能に構成されている場合、当該溶液交換部材１００から取り外された細胞保持カセット２００のウェル２１０内で細胞を保持することにより実施することが好ましい。

【0170】

すなわち、遺伝子導入工程においては、図４（Ｄ）に示すように、溶液交換後、細胞及び遺伝子導入用の核酸を含む溶液がウェル２１０に保持された細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００から取り外し、当該取り外された、溶液交換部材１００に取り付けられていない細胞保持カセット２００のウェル２１０内で、当該核酸を含む溶液中で細胞を保持することにより、遺伝子導入を実施することが好ましい。

【0171】

また、本デバイス１が、第一溶液交換部材１００（Ｉ）及び第二溶液交換部材１００（ＩＩ）を含む複数の溶液交換部材１００と、当該溶液交換部材１００に取り付け可能であり且つ取り付け後に取り外し可能な細胞保持カセット２００とを含む場合、本製造方法は、上述の準備工程、溶液交換工程及び遺伝子導入工程として、当該第一溶液交換部材１００（Ｉ）を用いた第一準備工程、第一溶液交換工程及び遺伝子導入工程を含み、さらに、当該第二溶液交換部材１００（ＩＩ）を用いた第二準備工程及び第二溶液交換工程を含むこととしてもよい。

【0172】

すなわち、この場合、第二準備工程においては、第一溶液交換部材１００（Ｉ）を用いて上述のように遺伝子導入工程を実施した後、遺伝子導入細胞を含む第三溶液をウェル２１０に保持し、当該第一溶液交換部材１００（Ｉ）から取り外され、溶液交換部材１００に取り付けられていない細胞保持カセット２００を準備する。

【0173】

ここで、遺伝子導入工程を、第一溶液交換部材１００に取り付けられたままの細胞保持カセット２００のウェル２１０内で細胞を保持することにより実施する場合、当該細胞保持カセット２００は、当該遺伝子導入工程後に当該第一溶液交換部材１００（Ｉ）から取り外される。

【0174】

一方、遺伝子導入工程を、溶液交換部材１００から取り外された細胞保持カセット２００のウェル２１０内で細胞を保持することにより実施する場合、当該細胞保持カセット２００は、当該遺伝子導入工程前又は当該遺伝子導入工程中に当該第一溶液交換部材１００（Ｉ）から取り外される。すなわち、この場合、第二準備工程における溶液交換部材１００の準備と、遺伝子導入工程とは並行して実施される。

【0175】

また、第二準備工程においては、第四溶液をリザーバー１２０に保持し細胞保持カセット２００が取り付けられていない第二溶液交換部材１００（ＩＩ）も準備する。第二準備工程においてリザーバー１２０に保持する第四溶液は、第三溶液と異なる組成を有する水溶液であることが好ましい。ただし、第四溶液の組成は、目的に応じて適宜調整されればよい。具体的に、第四溶液は、第三溶液に含まれている核酸（遺伝子導入工程後も細胞に導入されずに溶液中に残存している核酸）を含まないこととしてもよい。また、リザーバー１２０に保持する第四溶液の体積は、第一準備工程でリザーバー１２０に保持した第二溶液の体積と同一であってもよいし、異なっていてもよい。

【0176】

そして、第二準備工程後、第二溶液交換工程においては、図５（Ｆ）に示すように、細胞保持カセット２００を第二溶液交換部材１００（ＩＩ）の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間に取り付けることによって、毛細管力によるウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への第三溶液の吸引と、当該リザーバー１２０から当該ウェル２１０への第四溶液の流入とによる溶液交換が開始され、且つ、その後、図５（Ｇ）に示すように、遺伝子導入細胞及び溶液がウェル２１０に保持された状態で、毛細管力による当該ウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引が停止されることにより、当該溶液交換が停止される。

【0177】

このように、本製造方法によれば、従来の遺伝子導入細胞の製造において必要とされていた煩雑な操作を実施することなく、簡便に遺伝子導入細胞を製造することができる。なお、本製造方法について具体的には記載していないが、上述の溶液交換方法に関する種々の態様は、本製造方法にも適用され得る。

【0178】

本製造方法は、任意の遺伝子導入細胞の製造に使用することができるが、例えば、センサ細胞の製造に好ましく用いられる。センサ細胞は、受容体を利用する化学量センサの一つとして用いられる、遺伝子導入によって受容体（例えば、昆虫の嗅覚受容体）を発現させた細胞である。

【0179】

本デバイス１は、シンプルな構造を有する。すなわち、本デバイス１は、例えば、上述のとおり、細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００に取り付けることによって、溶液交換が自発的に開始され、且つ、その後、当該溶液交換が自発的に停止されるため、溶液を流通させるための外部ポンプ（例えば、シリンジポンプやぺリスタリックポンプ等の電気で駆動するポンプ）に接続する必要がない。

【0180】

したがって、本デバイス１は、外部ポンプに接続されることなく用いることができる。また、本方法においては、本デバイス１を外部ポンプに接続することなく用いることができる。本デバイス１がポンプレスのマイクロデバイスであることにより、複雑な装置を使用することなく、溶液交換を簡便に実施することができる。

【0181】

また、本デバイス１は、例えば、細胞保持カセット２００を溶液交換部材１００に取り付けることにより、当該細胞保持カセット２１０のウェル２１０と、当該溶液交換部材１００の吸引毛細管１１０及びリザーバー１２０のそれぞれとが一連の流路として接続され連通するよう構成されているため、各部材を接続し溶液を流通させるためのチューブ（例えば、フッ素樹脂チューブやシリコーンチューブ）を有する必要がない。

【0182】

したがって、本デバイス１は、チューブを有しないマイクロデバイスとすることができる。また、本方法においては、チューブを有しない本デバイス１を用いることができる。本デバイス１がチューブレスのマイクロデバイスであることにより、複雑な構造を必要とすることなく、溶液交換を簡便に実施することができる。

【0183】

また、本方法においては、溶液交換開始前に細胞保持カセット２００のウェル２１０に保持した溶液、及び、溶液交換部材１００のリザーバー１２０に保持した溶液のみを用いて、当該ウェル２１０の溶液交換を達成することができる。

【0184】

したがって、本方法は、例えば、細胞保持カセット２００の溶液交換部材１００への取り付けによる溶液交換の開始から、当該溶液交換の停止までの間、外部から本デバイス１に溶液を供給することなく、実施することができる。

【0185】

また、本方法は、例えば、細胞保持カセット２００の溶液交換部材１００への取り付けによる溶液交換の開始から、当該溶液交換の停止までの間、本デバイス１から外部に溶液を排出することなく、実施することができる。

【0186】

次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。

【実施例0187】

［細胞保持カセットの作製］
厚さ３ｍｍのアクリル板（アクリライト、三菱ケミカル）から、ＮＣ切削装置（MM-100、モディアシステムズ）を使用して、第一基板２２１を切り出した。また、厚さ１．０ｍｍのアクリル板から、ＮＣ切削装置を使用して、第二基板２２２を切り出した。その後、ヒートプレス機（TM-1955-10000，トーテム）を使用して、第一基板２２１と第二基板２２２とを熱圧着した。

【0188】

次に、プラズマエッチング装置（ＦＡ－１、サムコ）を用いて、細胞保持カセット２００のウェル底面２１１（アクリル樹脂表面）に対して、酸素プラズマ処理（出力２５Ｗ、酸素ガス流量２０ｍＬ／分、３０秒）を施すことにより、当該ウェル底面２１１を親水化した。

【0189】

さらに、親水化したウェル底面２１１に細胞接着性を付与した。すなわち、まず、ポリ－Ｄ－リジン（Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅ、シグマアルドリッチ）を０．１ｍｇ／ｍＬ含有する水溶液を、ウェル底面２１１に均一に滴下した。次いで、５分後にウェル２１０内のポリ－Ｄ－リジン水溶液を吸引除去した。その後、ウェル底面２１１を超純水でよく洗浄し、２時間乾燥させた。こうして、図３（Ａ）に示すような、ウェル２１０と、上流流路２４０及び下流流路２５０とを有する細胞保持カセット２００を得た。

【0190】

［溶液交換部材の作製］
厚さ３ｍｍのアクリル板（アクリライト、三菱ケミカル）から、ＮＣ切削装置（MM-100、モディアシステムズ）を使用して、第一基板１３１を切り出した。また、厚さ４．０ｍｍのアクリル板から、ＮＣ切削装置を使用して、第二基板１３２を切り出した。その後、ヒートプレス機（TM-1955-10000，トーテム）を使用して、第一基板１３１と第二基板１３２とを熱圧着した

【0191】

次に、プラズマエッチング装置（ＦＡ－１、サムコ）を用いて、第一基板１３１に形成された、吸引毛細管１１０を構成する溝の内面（アクリル樹脂表面）に対して、酸素プラズマ処理（出力２５Ｗ、酸素ガス流量２０ｍＬ／分、１５秒）を施すことにより、当該内面を親水化した。

【0192】

一方、第一基板１３１に形成された取付凹部１５０の表面（流出流路１４０の下流端部が開口する外表面１３０ｂ、及び、吸引毛細管１１０の上流端部が開口する外表面１３０ｃを含む表面）に撥水コート剤（エスエフコートＳＦＥ－Ｂ００２Ｈ：ＳＦＥ Ｓｏｌｖｅｎｔ＝１：１、ＡＧＣセイミケミカル）を塗布することにより、当該表面の疎水化処理を行った．

【0193】

その後、ポリプロピレンシーリングテープ（マイクロプレートシーリングテープ９７９５、３Ｍ）から構成されるシール部材１３３を、第一基板１３１に形成された溝の上方の開口を塞ぐように貼り、密着させることにより、吸引毛細管１１０を形成した。なお、シーリングテープのうち、吸引毛細管１１０の下流端部１１２の上方に位置する部分には直径２ｍｍの穴を形成することで、当該下流端部を気相中に開口させた。こうして、図３（Ｂ）に示すような、リザーバー１２０と吸引毛細管１１０とを有する溶液交換部材１００を得た。

【0194】

［遺伝子導入細胞の製造］
上述のようにして製造した本デバイス１を用いて遺伝子導入細胞を製造した。すなわち、遺伝子を導入する細胞としては、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞２９３；Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ２９３）細胞を用い、当該ＨＥＫ２９３細胞に対する遺伝子導入により、昆虫の嗅覚受容体ＯＲ８（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ８）及び嗅覚受容体共受容体Ｏｒｃｏ（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と、カルシウム感受性蛍光タンパク質ＧＣａＭＰとを共発現するセンサ細胞を製造した。本デバイス１としては、１つの細胞保持カセット２００と、２つの溶液交換部材１００（第一溶液交換部材１００（Ｉ）及び第二溶液交換部材１００（ＩＩ））とを用いた。

【0195】

まず細胞保持カセット２００のウェル２１０内に、ＨＥＫ２９３細胞を０．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で含む細胞懸濁液７２μＬを加えることにより、当該ＨＥＫ２９３細胞を当該ウェル２１０に播種した。播種されたＨＥＫ２９３細胞は、ウェル２１０の底面２１１に沈降し、接着した。また、細胞保持カセット２００の上流流路２４０及び下流流路２５０にも培養液が保持された。

【0196】

ＨＥＫ２９３細胞の播種後、細胞保持カセット２００のウェル２１０の上方の開口を覆うように、直径２ｍｍの通気孔２１５が形成されたポリプロピレンシーリングテープ（マイクロプレートシーリングテープ９７９５、３Ｍ）から構成されるシール部材２３０を、基部２２０の上面２２０ａに貼り付けた。

【0197】

その後、ウェル２１０の乾燥を抑制するため、超純水を含ませたクリーンルーム用ワイパーと共に、細胞保持カセット２００を市販の細胞培養用プラスチックディッシュ内に置いた。そして、このプラスチックディッシュに蓋をして、温度３７℃、ＣＯ_２濃度５％雰囲気のインキュベータ内に載置し、２４時間静置培養を行った。

【0198】

次に遺伝子導入（トランスフェクション）を行った。遺伝子導入には、市販のトランスフェクション試薬であるLipofectamine LTX Reagent with PLUS Reagent（Thermo Fisher Scientific）を用いた。

【0199】

すなわち、１０μＬのLipofectamine LTX Reagent、８００μＬのOpti-MEM I Reduced Serum medium、８μＬのPLUS Reagentに、ネッタイシマカ由来ＯＲ８のＤＮＡ及びＯｒｃｏのＤＮＡをそれぞれ０.５μｇ及び１μｇと、ＧＣａＭＰのＤＮＡ２．５μｇとを加えることにより調製した。次いで、得られた混合液６０μＬを培養液（DMEM high glucose）２２０μＬで希釈することにより、トランスフェクション溶液を調製した。

【0200】

そして、２８０μＬのトランスフェクション溶液を第一溶液交換部材１００（Ｉ）のリザーバー１２０に入れた。この結果、第一溶液交換部材１００（Ｉ）のリザーバー１２０及び流出流路１４０にトランスフェクション溶液が保持された。また、第一溶液交換部材１００（Ｉ）の吸引毛細管１１０には空気が満たされた。

【0201】

一方、細胞保持カセット２００においてウェル２１０の上方を覆うシール部材２３０に形成された通気孔２１５を別のプロピレンシーリングテープで塞ぎ、当該ウェル２１０を密閉した。この結果、ウェル２１０においては、底面２１１に接着したＨＥＫ２９３細胞が溶液中で保持されるとともに、当該溶液の液面と天面２１４との間には空気からなる気相が密閉された。

【0202】

そして、この細胞保持カセット２００を第一溶液交換部材１００（Ｉ）の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０との間の位置に取り付けた。細胞保持カセット２００を第一溶液交換部材１００（Ｉ）に取り付けることによって、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への培養液の吸引が自発的に開始されるとともに、リザーバー１２０から当該ウェル２１０へのトランスフェクション溶液の流入も開始された。

【0203】

その後、吸引された溶液が吸引毛細管１１０の下流端部１１２に到達し、当該吸引毛細管１１０が当該溶液で満たされることで、細胞及び溶液がウェル２１０に保持された状態で、毛細管力によるウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引が自発的に停止され、リザーバー１２０から当該ウェル２１０へのトランスフェクション溶液の流入も停止された。

【0204】

こうして、細胞保持カセット２００を第一溶液交換部材１００（Ｉ）に取り付けるという簡便な操作のみで、細胞を含むウェル２１０内の溶液交換を達成することができた。なお、溶液交換を停止した時点で、リザーバー２１０にはトランスフェクション溶液はほとんど残っていなかった。一方、ウェル２１０内には、溶液交換開始時と同程度の体積の溶液が保持されていた。

【0205】

上述した溶液交換においては、流体力学的な観点から、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への培養液の吸引、及び、リザーバー１２０から当該ウェル２１０へのトランスフェクション溶液の流入が流量約５μＬ／秒で行われ、当該ウェル２１０内の細胞の生存を維持したまま、当該溶液交換の開始前にウェル２１０に保持された培養液の約９３％が、当該溶液交換の開始から約２０５秒でトランスフェクション溶液に交換されるよう、本デバイス１の形状や保持される溶液の体積等の条件が設定された。

【0206】

その後、細胞保持カセット２００を第一溶液交換部材１００（Ｉ）から取り外し、ウェル２１０を覆うシール部材１３３の通気孔２１５を開口した。そして、この細胞保持カセット２００を再びインキュベータ内で２４時間静置することにより、ウェル２１０内のＨＥＫ２９３細胞に対する遺伝子導入を行った。

【0207】

その後、２８０μＬの観察用バッファ溶液を第二溶液交換部材１００（ＩＩ）のリザーバー１２０に入れた。この結果、第二溶液交換部材１００（ＩＩ）のリザーバー１２０及び流出流路１４０に観察用バッファ溶液が保持された。また、第二溶液交換部材１００（ＩＩ）の吸引毛細管１１０には空気が満たされた。

【0208】

一方、細胞保持カセット２００においてウェル２１０の上方を覆うシール部材１３３に形成された通気孔２１５を別のプロピレンシーリングテープで塞ぎ、当該ウェル２１０を密閉した。この結果、ウェル２１０においては、底面２１１に接着した遺伝子導入細胞が溶液中で保持されるとともに、当該溶液の液面と天面２１４との間には空気からなる気相が密閉された。

【0209】

そして、この細胞保持カセット２００を第二溶液交換部材１００（ＩＩ）の吸引毛細管１１０とリザーバー１２０の間の位置に取り付けた。細胞保持カセット２００を第二溶液交換部材１００（ＩＩ）に取り付けることによって、毛細管力によるウェル２１０から吸引毛細管１１０への溶液の吸引が自発的に開始されるとともに、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への観察用バッファ溶液の流入も開始された。

【0210】

その後、吸引された溶液が吸引毛細管１１０の下流端部１１２に到達し、当該吸引毛細管１１０が当該溶液で満たされることで、細胞及び溶液がウェル２１０に保持された状態で、毛細管力によるウェル２１０から当該吸引毛細管１１０への溶液の吸引が自発的に停止され、リザーバー１２０から当該ウェル２１０への観察用バッファ溶液の流入も停止された。

【0211】

こうして、細胞保持カセット２００を第二溶液交換部材１００（ＩＩ）に取り付けるという簡便な操作のみで、ウェル２１０内の溶液交換を達成することができた。なお、溶液交換を停止した時点で、リザーバー１２０には観察用バッファ溶液はほとんど残っていなかった。一方、ウェル２１０内には、溶液交換開始時と同程度の体積の溶液が保持されていた。

【0212】

以上より、１つの細胞保持カセット２００と、２つの溶液交換部材１００とからなる本デバイス１を用いた簡便な操作により、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子を導入して、センサ細胞を製造することができた。

【0213】

［センサ細胞の匂い物質応答性の評価］
上述のようにして製造したセンサ細胞の匂い物質応答性を評価した。匂い物質としては、1-octen-3-olを用いた。すなわち、1-octen-3-olをＤＭＳＯで溶解して５００ｍＭのストック溶液を調製し、－２０℃で保存するとともに、観察の際には、当該ストック溶液をＨａｎｋｓ´ＢＳＳ（Balanced Salt Solution）で希釈し、５００μＭの1-octen-3-olを含む添加用溶液を調製して用いた。

【0214】

まず上述の第二溶液交換部材１００（ＩＩ）を用いた溶液交換によりウェル２１０内に観察用バッファ溶液を保持した細胞保持カセット２００をインキュベータ内で３０分間インキュベートした。

【0215】

その後、インキュベータから取り出した細胞保持カセット２００を倒立顕微鏡（ＩＸ７１Ｎ，オリンパス）のステージに置き、そのウェル２１０内の観察用バッファ溶液に、匂い物質（1-octen-3-ol）の終濃度が１００μＭとなる量の添加用溶液を添加した。

【0216】

そして、顕微鏡でタイムラプス撮影を行い、匂い物質の添加から０．４秒間隔で２分間、ウェル内の蛍光強度の経時変化を記録した。なお、蛍光波長はＢｌｕｅ励起（励起波長：４７０～４９０ｎｍ）とし、Ｇｒｅｅｎ検出（５１５～５５０ｎｍ）のＮＩＢＡフィルターを使用した。

【0217】

また、比較例１として、匂い物質（1-octen-3-ol）に代えて、ＤＭＳＯ（０．２％溶液）のみを添加した以外は同様にして、ウェル内の蛍光強度の経時変化を記録した。また、比較例２として、本デバイス１に代えて市販のガラスボトムディッシュを用い、本デバイス１を用いた溶液交換に代えて従来のピペット操作による溶液交換を行う方法で製造したセンサ細胞を用いた以外は同様にして、標的物質（1-octen-3-ol）添加後のウェル内の蛍光強度の経時変化を記録した。

【0218】

図７には、蛍光強度の経時変化を測定した結果を示す。図７に示すように、本デバイス１を用いた溶液交換により製造したセンサ細胞（実施例）は、ピペットを用いた従来の溶液交換により製造したセンサ細胞（比較例２）と同様、ウェルへの1-octen-3-olの添加後、蛍光強度の上昇が観察された。

【0219】

この結果は，センサ細胞が発現する嗅覚受容体AaOR8に、添加された1-octen-3-olが結合することで当該センサ細胞の細胞質内に培養液中のカルシウムイオンが流入し、当該細胞質内における当該カルシウムイオンとカルシウム感受性蛍光タンパク質GCaMPとの結合によって蛍光強度が上昇したことを示していると考えられた。一方、1-octen-3-olを添加せずDMSOを添加した比較例１では、ウェルへの1-octen-3-olの添加後も蛍光強度の上昇は見られず、経時的な褪色のみ観察された。以上より、本デバイス１を用いた簡便な操作による遺伝子導入により、匂い物質に応答するセンサ細胞を製造できたことが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】