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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023146632
(43)【公開日】2023-10-12
(54)【発明の名称】観察方法およびマーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 23/04 20180101AFI20231004BHJP
G02B 21/36 20060101ALI20231004BHJP
G02B 21/06 20060101ALI20231004BHJP
G01N 23/2252 20180101ALI20231004BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20231004BHJP
【ＦＩ】
G01N23/04 330
G02B21/36
G02B21/06
G01N23/2252
G01N21/64 E
G01N21/64 F
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022053918
(22)【出願日】2022-03-29
(71)【出願人】
【識別番号】304020177
【氏名又は名称】国立大学法人山口大学
(71)【出願人】
【識別番号】000004271
【氏名又は名称】日本電子株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100090387
【弁理士】
【氏名又は名称】布施 行夫
(74)【代理人】
【識別番号】100090398
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 美千栄
(74)【代理人】
【識別番号】100161540
【弁理士】
【氏名又は名称】吉田 良伸
(72)【発明者】
【氏名】春田 知洋
(72)【発明者】
【氏名】中村 教泰
【テーマコード（参考）】
2G001
2G043
2H052
【Ｆターム（参考）】
2G001AA03
2G001BA11
2G001CA03
2G001DA09
2G001GA01
2G001GA06
2G001HA13
2G001LA01
2G001MA04
2G001NA07
2G001NA10
2G001NA12
2G001RA06
2G043AA01
2G043CA06
2G043DA02
2G043EA01
2G043FA01
2G043FA02
2G043LA03
2H052AA09
2H052AF10
2H052AF14
2H052AF25
(57)【要約】
【課題】容易に、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことができる観察方法を提供する。
【解決手段】シリカ粒子２と、シリカ粒子２に取り込まれた蛍光物質と、ケイ素よりも原子番号が大きい物質（重金属粒子４）と、を含むマーカー１０を含む試料を作製する工程と、試料を蛍光顕微鏡で撮影することによって、蛍光顕微鏡像を取得する工程と、試料を電子顕微鏡で撮影することによって、電子顕微鏡像を取得する工程と、蛍光顕微鏡像におけるマーカー１０の像と、電子顕微鏡像におけるマーカー１０の像に基づいて、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う工程と、を含む。
【選択図】図１
【解決手段】シリカ粒子２と、シリカ粒子２に取り込まれた蛍光物質と、ケイ素よりも原子番号が大きい物質（重金属粒子４）と、を含むマーカー１０を含む試料を作製する工程と、試料を蛍光顕微鏡で撮影することによって、蛍光顕微鏡像を取得する工程と、試料を電子顕微鏡で撮影することによって、電子顕微鏡像を取得する工程と、蛍光顕微鏡像におけるマーカー１０の像と、電子顕微鏡像におけるマーカー１０の像に基づいて、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う工程と、を含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シリカ粒子と、前記シリカ粒子に取り込まれた蛍光物質と、ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、を含むマーカーを含む試料を作製する工程と、
前記試料を蛍光顕微鏡で撮影することによって、蛍光顕微鏡像を取得する工程と、
前記試料を電子顕微鏡で撮影することによって、電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記蛍光顕微鏡像における前記マーカーの像と、前記電子顕微鏡像における前記マーカーの像に基づいて、前記蛍光顕微鏡像と前記電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う工程と、
を含む、観察方法。
前記試料を蛍光顕微鏡で撮影することによって、蛍光顕微鏡像を取得する工程と、
前記試料を電子顕微鏡で撮影することによって、電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記蛍光顕微鏡像における前記マーカーの像と、前記電子顕微鏡像における前記マーカーの像に基づいて、前記蛍光顕微鏡像と前記電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う工程と、
を含む、観察方法。
【請求項2】
請求項１において、
前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、重金属である、観察方法。
前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、重金属である、観察方法。
【請求項3】
請求項１または２において、
前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、金である、観察方法。
前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、金である、観察方法。
【請求項4】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、前記シリカ粒子の表面に付着している、観察方法。
前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、前記シリカ粒子の表面に付着している、観察方法。
【請求項5】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、前記シリカ粒子のコアに存在する、観察方法。
前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、前記シリカ粒子のコアに存在する、観察方法。
【請求項6】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記マーカーは、機能性物質を含む、観察方法。
前記マーカーは、機能性物質を含む、観察方法。
【請求項7】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記試料を作製する工程では、第１マーカーと第２マーカーを含む前記試料を作製し、
前記第１マーカーに含まれる前記蛍光物質が発する光の波長と、前記第２マーカーに含まれる前記蛍光物質が発する光の波長は、異なる、観察方法。
前記試料を作製する工程では、第１マーカーと第２マーカーを含む前記試料を作製し、
前記第１マーカーに含まれる前記蛍光物質が発する光の波長と、前記第２マーカーに含まれる前記蛍光物質が発する光の波長は、異なる、観察方法。
【請求項8】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記試料を作製する工程では、第１マーカーと第２マーカーを含む前記試料を作製し、
前記第１マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、前記第２マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、異なる、観察方法。
前記試料を作製する工程では、第１マーカーと第２マーカーを含む前記試料を作製し、
前記第１マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、前記第２マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、異なる、観察方法。
【請求項9】
請求項１ないし８のいずれか１項において、
前記試料を作製する工程では、第１マーカーと第２マーカーを含む前記試料を作製し、
前記第１マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、前記第２マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、形状が異なる、観察方法。
前記試料を作製する工程では、第１マーカーと第２マーカーを含む前記試料を作製し、
前記第１マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、前記第２マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、形状が異なる、観察方法。
【請求項10】
請求項１ないし９のいずれか１項において、
前記試料を作製する工程では、第１マーカーと第２マーカーを含む前記試料を作製し、
前記第１マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、前記シリカ粒子の表面に付着し、
前記第２マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、前記シリカ粒子のコアに存在する、観察方法。
前記試料を作製する工程では、第１マーカーと第２マーカーを含む前記試料を作製し、
前記第１マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、前記シリカ粒子の表面に付着し、
前記第２マーカーに含まれる前記ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、前記シリカ粒子のコアに存在する、観察方法。
【請求項11】
請求項７ないし１０のいずれか１項において、
前記第１マーカーは、第１機能性物質を含み、
前記第２マーカーは、前記第１機能性物質とは異なる第２機能性物質を含む、観察方法。
前記第１マーカーは、第１機能性物質を含み、
前記第２マーカーは、前記第１機能性物質とは異なる第２機能性物質を含む、観察方法。
【請求項12】
請求項１ないし１１のいずれか１項において、
前記試料に対して元素マッピングを行い、元素マップを取得する工程と、
前記電子顕微鏡像における前記マーカーの像と、前記元素マップにおける前記マーカーの像に基づいて、前記電子顕微鏡像と前記元素マップとの間の位置合わせを行う工程と、を含む、観察方法。
前記試料に対して元素マッピングを行い、元素マップを取得する工程と、
前記電子顕微鏡像における前記マーカーの像と、前記元素マップにおける前記マーカーの像に基づいて、前記電子顕微鏡像と前記元素マップとの間の位置合わせを行う工程と、を含む、観察方法。
【請求項13】
蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で同一試料を観察するために用いられるマーカーであって、
シリカ粒子と、
前記シリカ粒子に取り込まれた蛍光物質と、
ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、
を含む、マーカー。
シリカ粒子と、
前記シリカ粒子に取り込まれた蛍光物質と、
ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、
を含む、マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、観察方法およびマーカーに関する。
【背景技術】
【0002】
光学顕微鏡と電子顕微鏡との間で試料の同一箇所を観察する手法が知られている。
【0003】
例えば、特許文献１には、光の照射により局在表面プラズモン共鳴を励起する複数の金粒子をマーカーとして用いていることによって、光学顕微鏡像と電子顕微鏡像との間で位置合わせを可能とした観察方法が開示されている。
【0004】
局在表面プラズモン共鳴により特定波長の光が金粒子で吸収または散乱されるため、光学顕微鏡像においてナノサイズの金粒子でも観察が可能となる。また、金粒子は、原子番号が大きいため、透過電子顕微鏡において十分なコントラストが得られる。したがって、局在表面プラズモン共鳴を励起する複数の金粒子をマーカーとして用いることによって、光学顕微鏡像と透過電子顕微鏡像との間で位置合わせが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０２０－１３６０５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記のように、光学顕微鏡像と電子顕微鏡像との間で位置合わせを可能とした観察方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明に係る観察方法の一態様は、
シリカ粒子と、前記シリカ粒子に取り込まれた蛍光物質と、ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、を含むマーカーを含む試料を作製する工程と、
前記試料を蛍光顕微鏡で撮影することによって、蛍光顕微鏡像を取得する工程と、
前記試料を電子顕微鏡で撮影することによって、電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記蛍光顕微鏡像における前記マーカーの像と、前記電子顕微鏡像における前記マーカーの像に基づいて、前記蛍光顕微鏡像と前記電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う工程と、
を含む。
シリカ粒子と、前記シリカ粒子に取り込まれた蛍光物質と、ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、を含むマーカーを含む試料を作製する工程と、
前記試料を蛍光顕微鏡で撮影することによって、蛍光顕微鏡像を取得する工程と、
前記試料を電子顕微鏡で撮影することによって、電子顕微鏡像を取得する工程と、
前記蛍光顕微鏡像における前記マーカーの像と、前記電子顕微鏡像における前記マーカーの像に基づいて、前記蛍光顕微鏡像と前記電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う工程と、
を含む。
【0008】
このような観察方法では、マーカーが蛍光物質とケイ素よりも原子番号が大きい物質とを含むため、当該マーカーを蛍光顕微鏡用のマーカーとして用いることもできるし、電子顕微鏡用のマーカーとして用いることもできる。したがって、このような観察方法では、容易に、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことができる。
【0009】
本発明に係るマーカーの一態様は、
蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で同一試料を観察するために用いられるマーカーであって、
シリカ粒子と、
前記シリカ粒子に取り込まれた蛍光物質と、
ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、
を含む。
蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で同一試料を観察するために用いられるマーカーであって、
シリカ粒子と、
前記シリカ粒子に取り込まれた蛍光物質と、
ケイ素よりも原子番号が大きい物質と、
を含む。
【0010】
このようなマーカーは、蛍光物質とケイ素よりも原子番号が大きい物質とを含むため、当該マーカーを蛍光顕微鏡用のマーカーとして用いることもできるし、電子顕微鏡用のマーカーとして用いることもできる。したがって、このようなマーカーでは、容易に、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】第１実施形態に係る観察方法に用いられるマーカーを模式的に示す図。
【図2】マーカーのＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像、Ｓｉの元素マップ、およびＡｕの元素マップ。
【図3】第１実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャート。
【図4】第２実施形態に係る観察方法に用いられる第１マーカーおよび第２マーカーを模式的に示す図。
【図5】第２実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャート。
【図6】第３実施形態に係る観察方法に用いられるマーカーを模式的に示す図。
【図7】マーカーの変形例を模式的に示す図。
【図8】第１マーカーおよび第２マーカーの変形例を模式的に示す図。
【図9】マウスの脾臓の蛍光顕微鏡像。
【図10】マウスの脾臓の透過電子顕微鏡像。
【図12】ラットの肝臓の蛍光顕微鏡像。
【図14】ラットの肝臓のＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像。
【図15】Ｓｉの元素マップ。
【図16】Ｆｅの元素マップ。
【図17】ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像上に、Ｓｉの元素マップとＦｅの元素マップを重ねた画像。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【0013】
【0014】
マーカー１０は、図１に示すように、シリカ粒子２と、シリカ粒子２に取り込まれた蛍光物質と、重金属粒子４と、を含む。マーカー１０は、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で同一試料を観察するために用いられるマーカーである。
【0015】
シリカ粒子２は、有機シリカ化合物を原料として合成される有機シリカ粒子である。有機シリカ化合物としては、例えば、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシランなどを用いることができる。
【0016】
有機シリカ粒子は、機能性物質を粒子内部に含有させたり、機能性物質を表面に結合させたりすることができる。マーカー１０では、シリカ粒子２は、蛍光物質を内部に含有している。例えば、有機シリカ化合物を合成してシリカ粒子２を作製する際に、蛍光物質を加えることで、シリカ粒子２に蛍光物質を取り込ませることができる。例えば、有機シリ
カ粒子は、粒子表面を様々な化学物質や生体物質で修飾できる。
カ粒子は、粒子表面を様々な化学物質や生体物質で修飾できる。
【0017】
シリカ粒子２の直径は、例えば、１００ｎｍ程度である。なお、シリカ粒子２の直径は特に限定されず、試料の種類や観察の目的などに応じて任意の直径のシリカ粒子２を用いることができる。
【0018】
蛍光物質は、例えば、ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）などの蛍光色素や、ＧＦＰ（green fluorescent protein）などの蛍光タンパク質である。
【0019】
重金属粒子４は、比重が４以上の金属の粒子である。重金属粒子４としては、例えば、鉄粒子、マンガン粒子、金粒子などを用いることができる。ここで、金粒子は、王水以外の酸やアルカリでは腐食せず、また、細胞毒性が低く、細胞内に入れても悪影響を及ぼす可能性が低い。したがって、重金属粒子４として金粒子を用いたマーカー１０は、生体試料を観察する際のマーカーとして有効である。
【0020】
重金属粒子４は、シリカ粒子２の表面に付着（結合）している。重金属粒子４の直径は、例えば、１ｎｍ程度である。なお、重金属粒子４の直径は特に限定されず、試料の種類や観察の目的などに応じて任意の直径の重金属粒子４を用いることができる。
【0021】
図２は、マーカー１０のＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ（high-angle annular dark-field scanning transmission electron microscopy）像、Ｓｉの元素マップ、およびＡｕの元素マップである。Ｓｉの元素マップおよびＡｕの元素マップは、ＥＤＳ（energy dispersive X-ray spectroscopy）による元素マッピングで得られた。
【0022】
図２に示すＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像、Ｓｉの元素マップ、およびＡｕの元素マップから、数ｎｍ程度の金粒子が、１００ｎｍ程度のシリカ粒子の表面に付着している様子を確認できる。
【0023】
１．２． 観察方法
次に、第１実施形態に係る観察方法について説明する。図３は、第１実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。
次に、第１実施形態に係る観察方法について説明する。図３は、第１実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。
【0024】
（１）電子顕微鏡用の試料作製Ｓ１００
まず、試料を準備する。観察対象は、例えば、生体試料である。試料は、例えば、組織や、細胞、細胞内小器官、タンパク質、培養した器官、培養した組織、培養した細胞、ウィルス、細菌などの微生物などである。なお、観察対象となる試料は特に限定されない。
まず、試料を準備する。観察対象は、例えば、生体試料である。試料は、例えば、組織や、細胞、細胞内小器官、タンパク質、培養した器官、培養した組織、培養した細胞、ウィルス、細菌などの微生物などである。なお、観察対象となる試料は特に限定されない。
【0025】
次に、試料に複数のマーカー１０を取り込ませる。例えば、試料が個体や組織の場合には静脈注射によって複数のマーカー１０を組織内に取り込ませることができる。また、試料が細胞や単細胞生物の場合には、細胞の貪食作用によって複数のマーカー１０を細胞内に取り込ませることができる。上述したように、シリカ粒子２は、様々な表面修飾が可能であるため、マーカー１０の組織や細胞への取り込みを修飾作用によって制御できる。
【0026】
次に、マーカー１０が取り込まれた試料を蛍光顕微鏡で観察する。蛍光顕微鏡は、光学顕微鏡の一種であり、試料に対して光をあてて蛍光を観察する顕微鏡である。試料を蛍光顕微鏡で観察し、マーカー１０が取り込まれた組織や細胞を探す。マーカー１０は蛍光物質を含むため、蛍光顕微鏡で観察することによって光（蛍光）を発する。そのため、マーカー１０が取り込まれた組織や細胞を容易に見つけることができる。
【0027】
マーカー１０が取り込まれた組織や細胞をみつけたら、マーカー１０が取り込まれた組織や細胞を切り出す。
【0028】
切り出した試料を用いて電子顕微鏡用の試料を作製する。例えば、まず、切り出した試料を四酸化オスミウム溶液などによって固定する。次に、固定された試料の水分を有機溶媒へ置換（脱水）し、樹脂包埋する。次に、樹脂包埋された試料をミクロトームなどで薄片化する。これにより、電子顕微鏡で観察可能な電子顕微鏡用の試料を作製できる。
【0029】
（２）蛍光顕微鏡像の撮影Ｓ１０２
次に、電子顕微鏡用の試料を蛍光顕微鏡で撮影し、蛍光顕微鏡像を取得する。マーカー１０は蛍光物質を含むため、マーカー１０を蛍光顕微鏡用のマーカーとして用いることができる。
次に、電子顕微鏡用の試料を蛍光顕微鏡で撮影し、蛍光顕微鏡像を取得する。マーカー１０は蛍光物質を含むため、マーカー１０を蛍光顕微鏡用のマーカーとして用いることができる。
【0030】
ここで、一般的に、蛍光色素や蛍光タンパク質は、固定や、脱水、樹脂包埋などでその蛍光が失われる。例えば、蛍光タンパク質や蛍光色素は、グルタールアルデヒドによる架橋や、四酸化オスミウムによる酸化によって、蛍光が失われる。
【0031】
しかしながら、マーカー１０では、蛍光物質がシリカ粒子２に取り込まれているため、固定や、脱水、樹脂包埋を行っても、蛍光が失われない。したがって、マーカー１０を含む電子顕微鏡用の試料を蛍光顕微鏡で観察できる。
【0032】
（３）電子顕微鏡像の撮影Ｓ１０４
電子顕微鏡用の試料を透過電子顕微鏡で撮影し、透過電子顕微鏡像を取得する。シリカ粒子２の表面には重金属粒子４が付着しているため、透過電子顕微鏡において高いコントラストが得られる。そのため、マーカー１０を透過電子顕微鏡用のマーカーとして用いることができる。なお、走査透過電子顕微鏡や走査電子顕微鏡においても、重金属は高いコントラストが得られる。したがって、マーカー１０を電子顕微鏡用のマーカーとして用いることができる。
電子顕微鏡用の試料を透過電子顕微鏡で撮影し、透過電子顕微鏡像を取得する。シリカ粒子２の表面には重金属粒子４が付着しているため、透過電子顕微鏡において高いコントラストが得られる。そのため、マーカー１０を透過電子顕微鏡用のマーカーとして用いることができる。なお、走査透過電子顕微鏡や走査電子顕微鏡においても、重金属は高いコントラストが得られる。したがって、マーカー１０を電子顕微鏡用のマーカーとして用いることができる。
【0033】
（４）位置合わせＳ１０６
蛍光顕微鏡像におけるマーカー１０の像と、電子顕微鏡像におけるマーカー１０の像に基づいて、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う。蛍光顕微鏡像および電子顕微鏡像において、マーカー１０の像の位置を対応づけることによって、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことができる。蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことによって、試料の同一箇所を蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像で確認できる。
蛍光顕微鏡像におけるマーカー１０の像と、電子顕微鏡像におけるマーカー１０の像に基づいて、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う。蛍光顕微鏡像および電子顕微鏡像において、マーカー１０の像の位置を対応づけることによって、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことができる。蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことによって、試料の同一箇所を蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像で確認できる。
【0034】
１．３． 効果
第１実施形態に係る観察方法は、シリカ粒子２と、シリカ粒子２に取り込まれた蛍光物質と、重金属粒子４と、を含むマーカー１０を含む試料を作製する工程Ｓ１００と、試料を蛍光顕微鏡で撮影することによって蛍光顕微鏡像を取得する工程Ｓ１０２と、試料を電子顕微鏡で撮影することによって電子顕微鏡像を取得する工程Ｓ１０４と、蛍光顕微鏡像におけるマーカー１０の像と電子顕微鏡像におけるマーカー１０の像に基づいて、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う工程と、を含む。
第１実施形態に係る観察方法は、シリカ粒子２と、シリカ粒子２に取り込まれた蛍光物質と、重金属粒子４と、を含むマーカー１０を含む試料を作製する工程Ｓ１００と、試料を蛍光顕微鏡で撮影することによって蛍光顕微鏡像を取得する工程Ｓ１０２と、試料を電子顕微鏡で撮影することによって電子顕微鏡像を取得する工程Ｓ１０４と、蛍光顕微鏡像におけるマーカー１０の像と電子顕微鏡像におけるマーカー１０の像に基づいて、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う工程と、を含む。
【0035】
マーカー１０は、蛍光物質と重金属粒子４を含むため、蛍光顕微鏡用のマーカーとして用いることもできるし、電子顕微鏡用のマーカーとして用いることもできる。したがって、第１実施形態に係る観察方法では、容易に、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことができる。
【0036】
２． 第２実施形態
２．１． マーカー
次に、第２実施形態に係る観察方法に用いられるマーカーについて説明する。図４は、第２実施形態に係る観察方法に用いられる第１マーカー１０Ａ、および第２マーカー１０Ｂを模式的に示す図である。
２．１． マーカー
次に、第２実施形態に係る観察方法に用いられるマーカーについて説明する。図４は、第２実施形態に係る観察方法に用いられる第１マーカー１０Ａ、および第２マーカー１０Ｂを模式的に示す図である。
【0037】
第１マーカー１０Ａに含まれる重金属粒子４Ａと第２マーカー１０Ｂに含まれる重金属粒子４Ｂは、異なる。例えば、重金属粒子４Ａは鉄粒子であり、重金属粒子４Ｂは金粒子である。
【0038】
第１マーカー１０Ａにおいてシリカ粒子２Ａに取り込まれた蛍光物質が発する光の波長と第２マーカー１０Ｂにおいてシリカ粒子２Ｂに取り込まれた蛍光物質が発する光の波長は、異なる。例えば、シリカ粒子２Ａに取り込まれた蛍光物質はローダミン（Rhodamine）であり、赤色の蛍光である。また、シリカ粒子２Ｂに取り込まれた蛍光物質はＦＩＴＣであり、緑色の蛍光である。
【0039】
第１マーカー１０Ａは機能性物質６Ａを含み、第２マーカー１０Ｂは機能性物質６Ａとは異なる機能性物質６Ｂを含む。機能性物質は、例えば、薬剤（ポリマー（ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン等））、タンパク質、官能基、生理活性物質（アミノ酸、ペプチド、脂質、糖質、それら複数の成分からなる複合体等）、ナノ材料（酸化鉄、金ナノ粒子、カーボンナノチューブ等）、（金属）クラスター、降圧剤や色素などの有機化合物、リンカーなどである。機能性物質６Ａは、例えば、シリカ粒子２Ａの表面に結合または吸着している。同様に、機能性物質６Ｂはシリカ粒子２Ｂの表面に結合または吸着している。
【0040】
ここで、機能性物質として、特定の組織や、特定の細胞、特定の細胞内小器官に特異的に取り込まれる機能性物質が知られている。機能性物質６Ａおよび機能性物質６Ｂとして、互いに異なる生体試料の部位（組織や、細胞、細胞内小器官など）に取り込まれる機能性物質を用いてもよい。
【0041】
２．２． 観察方法
次に、第２実施形態に係る観察方法について説明する。図５は、第２実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。
次に、第２実施形態に係る観察方法について説明する。図５は、第２実施形態に係る観察方法の一例を示すフローチャートである。
【0042】
【0043】
（１）電子顕微鏡用の試料作製Ｓ２００
まず、電子顕微鏡用の試料を作製する。電子顕微鏡用の試料を作製する工程では、試料に第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを取り込ませる。例えば、機能性物質６Ａおよび機能性物質６Ｂとして、互いに異なる細胞に取り込まれる機能性物質が用いられており、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂは、互いに異なる細胞に取り込まれる。
まず、電子顕微鏡用の試料を作製する。電子顕微鏡用の試料を作製する工程では、試料に第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを取り込ませる。例えば、機能性物質６Ａおよび機能性物質６Ｂとして、互いに異なる細胞に取り込まれる機能性物質が用いられており、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂは、互いに異なる細胞に取り込まれる。
【0044】
電子顕微鏡用の試料を作製する工程Ｓ２００のその他の工程は、上述した図３に示す電子顕微鏡用の試料を作製する工程Ｓ１００と同様に行われる。
【0045】
（２）蛍光顕微鏡像の撮影Ｓ２０２
次に、電子顕微鏡用の試料を蛍光顕微鏡で撮影し、蛍光顕微鏡像を取得する。
次に、電子顕微鏡用の試料を蛍光顕微鏡で撮影し、蛍光顕微鏡像を取得する。
【0046】
第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂは、異なる蛍光物質を含む。例えば、第１マ
ーカー１０Ａが蛍光物質としてローダミンを含む場合、赤色の蛍光を発する。また、第２マーカー１０Ｂが蛍光物質としてＦＩＴＣを含む場合、緑色の蛍光を発する。すなわち、蛍光顕微鏡像では、第１マーカー１０Ａは赤色の蛍光として観察され、第２マーカー１０Ｂは緑色の蛍光として観察される。このように第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂが異なる蛍光物質を含むことによって、蛍光顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。
ーカー１０Ａが蛍光物質としてローダミンを含む場合、赤色の蛍光を発する。また、第２マーカー１０Ｂが蛍光物質としてＦＩＴＣを含む場合、緑色の蛍光を発する。すなわち、蛍光顕微鏡像では、第１マーカー１０Ａは赤色の蛍光として観察され、第２マーカー１０Ｂは緑色の蛍光として観察される。このように第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂが異なる蛍光物質を含むことによって、蛍光顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。
【0047】
（３）電子顕微鏡像の撮影Ｓ２０４
次に、電子顕微鏡用の試料を透過電子顕微鏡で撮影し、透過電子顕微鏡像を取得する。
次に、電子顕微鏡用の試料を透過電子顕微鏡で撮影し、透過電子顕微鏡像を取得する。
【0048】
第１マーカー１０Ａに含まれる重金属粒子４Ａを構成する物質（元素）と、第２マーカー１０Ｂに含まれる重金属粒子４Ｂを構成する物質（元素）は、異なる。すなわち、重金属粒子４Ａを構成する元素の原子番号と、重金属粒子４Ｂを構成する元素の原子番号は、異なる。そのため、透過電子顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａのコントラストと第２マーカー１０Ｂのコントラストが異なる。
【0049】
例えば、第１マーカー１０Ａが重金属粒子４Ａとして鉄粒子（原子番号２６）を含み、第２マーカー１０Ｂが重金属粒子４Ｂとして金粒子（原子番号７９）を含む場合、透過電子顕微鏡像において、第２マーカー１０Ｂのコントラストは第１マーカー１０Ａのコントラストよりも強くなる。このように第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂが異なる原子番号の重金属粒子４を含むことによって、透過電子顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。特に、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像では、原子番号の２乗に比例したコントラストが得られるため、容易に第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。
【0050】
なお、走査電子顕微鏡においても透過電子顕微鏡像と同様に、原子番号の違いに応じたコントラストが得られる。
【0051】
（４）元素マッピングＳ２０５
次に、電子顕微鏡用の試料に対して元素マッピングを行い、元素マップを取得する。例えば、電子顕微鏡用の試料に対してＥＤＳマッピングを行い、鉄の元素マップおよび金の元素マップを取得する。
次に、電子顕微鏡用の試料に対して元素マッピングを行い、元素マップを取得する。例えば、電子顕微鏡用の試料に対してＥＤＳマッピングを行い、鉄の元素マップおよび金の元素マップを取得する。
【0052】
例えば、第１マーカー１０Ａが重金属粒子４Ａとして鉄粒子を含み、第２マーカー１０Ｂが重金属粒子４Ｂとして金粒子を含む場合、鉄の元素マップでは、第１マーカー１０Ａを確認でき、金の元素マップでは、第２マーカー１０Ｂを確認できる。
【0053】
（５）位置合わせ
蛍光顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像および第２マーカー１０Ｂの像と、電子顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像および第２マーカー１０Ｂの像に基づいて、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う。例えば、蛍光顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像の位置と電子顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像の位置を対応づけ、かつ、蛍光顕微鏡像における第２マーカー１０Ｂの像と電子顕微鏡像における第２マーカー１０Ｂの像を対応づける。これにより、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことができる。
蛍光顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像および第２マーカー１０Ｂの像と、電子顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像および第２マーカー１０Ｂの像に基づいて、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行う。例えば、蛍光顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像の位置と電子顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像の位置を対応づけ、かつ、蛍光顕微鏡像における第２マーカー１０Ｂの像と電子顕微鏡像における第２マーカー１０Ｂの像を対応づける。これにより、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせを行うことができる。
【0054】
また、電子顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像および第２マーカー１０Ｂの像と、元素マップにおける第１マーカー１０Ａの像および第２マーカー１０Ｂの像に基づいて、電子顕微鏡像と元素マップとの間の位置合わせを行う。
【0055】
また、蛍光顕微鏡像における第１マーカー１０Ａの像および第２マーカー１０Ｂの像と、元素マップにおける第１マーカー１０Ａの像および第２マーカー１０Ｂの像に基づいて、蛍光顕微鏡像と元素マップとの間の位置合わせを行う。
【0056】
この結果、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像との間の位置合わせ、電子顕微鏡像と元素マップとの間の位置合わせ、元素マップと蛍光顕微鏡像との間の位置合わせを行うことができる。
【0057】
２．３． 効果
第２実施形態に係る観察方法では、第１マーカー１０Ａに含まれる蛍光物質が発する光の波長と、第２マーカー１０Ｂに含まれる蛍光物質が発する光の波長は、異なる。そのため、第２実施形態に係る観察方法では、蛍光顕微鏡像において第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを色の違いによって区別できる。
第２実施形態に係る観察方法では、第１マーカー１０Ａに含まれる蛍光物質が発する光の波長と、第２マーカー１０Ｂに含まれる蛍光物質が発する光の波長は、異なる。そのため、第２実施形態に係る観察方法では、蛍光顕微鏡像において第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを色の違いによって区別できる。
【0058】
第２実施形態に係る観察方法では、第１マーカー１０Ａに含まれる重金属粒子４Ａを構成する物質と、第２マーカー１０Ｂに含まれる重金属粒子４Ｂを構成する物質は、異なる。そのため、第２実施形態に係る観察方法では、電子顕微鏡像において第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂをコントラストの違いによって区別できる。さらに、元素マップにおいて第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。
【0059】
第２実施形態に係る観察方法では、第１マーカー１０Ａは機能性物質６Ａを含み、第２マーカー１０Ｂは機能性物質６Ａとは異なる機能性物質６Ｂを含む。そのため、例えば、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを、互いに異なる組織や、細胞、細胞内小器官などに取り込ませることができる。
【0060】
したがって、第２実施形態に係る観察方法では、第１マーカー１０Ａに含まれる蛍光物質と第２マーカー１０Ｂに含まれる蛍光物質の組み合わせ、第１マーカー１０Ａに含まれる重金属粒子４Ａと第２マーカー１０Ｂに含まれる重金属粒子４Ｂの組み合わせによって、蛍光顕微鏡像、電子顕微鏡像、および元素マップをマルチカラー化できる。
【0061】
このように、第２実施形態に係る観察方法では、複数のマーカーにおいて、シリカ粒子を互いに異なる化学物質や生体物質で修飾し、互いに異なる蛍光物質と、互いに異なる重金属粒子４を用いることによって、蛍光顕微鏡において細胞の取り込みを色の違いとして観察し、電子顕微鏡像において細胞の取り込みを重金属粒子のコントラストの違いとして観察し、元素マップにおいて細胞の取り込みを重金属粒子の元素（組成）の違いとして観察できる。これにより、蛍光顕微鏡像、電子顕微鏡像、および元素マップをマルチカラー化できる。
【0062】
３． 第３実施形態
次に、第３実施形態に係る観察方法に用いられるマーカーについて説明する。図６は、第３実施形態に係る観察方法に用いられるマーカー１０を模式的に示す図である。以下、第３実施形態に係る観察方法に用いられるマーカー１０において、図１に示すマーカー１０の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。
次に、第３実施形態に係る観察方法に用いられるマーカーについて説明する。図６は、第３実施形態に係る観察方法に用いられるマーカー１０を模式的に示す図である。以下、第３実施形態に係る観察方法に用いられるマーカー１０において、図１に示すマーカー１０の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。
【0063】
上述した図１に示すマーカー１０では、重金属粒子４がシリカ粒子２の表面に付着していたが、図６に示すように、重金属粒子４がシリカ粒子２のコアに存在してもよい。例えば、有機シリカ化合物を合成する際に重金属粒子４を加えることで、重金属粒子４をコアとしたシリカ粒子２を形成できる。
【0064】
図７は、マーカー１０の変形例を模式的に示す図である。
【0065】
図７に示すように、マーカー１０は、シリカ粒子２の表面に付着した重金属粒子４と、シリカ粒子２のコアに存在する重金属粒子４と、を含む。すなわち、マーカー１０において、シリカ粒子２の表面に複数の重金属粒子４が付着し、かつ、シリカ粒子２のコアに重金属粒子４が存在してもよい。なお、図７ではシリカ粒子２のコアに存在する重金属粒子４は１つとして図示されているが、コアに存在する重金属粒子４が複数個であってもよい。さらに、シリカ粒子２のコアに存在する複数個の重金属粒子４の径が同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【0066】
４． 変形例
なお、本発明は上述した実施形態に限定されず、本発明の要旨の範囲内で種々の変形実施が可能である。
なお、本発明は上述した実施形態に限定されず、本発明の要旨の範囲内で種々の変形実施が可能である。
【0067】
（１）第１変形例
例えば、上述した第１実施形態では、図１に示すように、マーカー１０が重金属粒子４を含む場合について説明したが、マーカー１０はケイ素よりも原子番号が大きい物質（元素）を含んでいればよい。ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、電子顕微鏡においてシリカ粒子２よりも強いコントラストが得られる。そのため、マーカー１０がケイ素よりも原子番号が大きい物質を含むことで、マーカー１０を電子顕微鏡用のマーカーとして用いることができる。
例えば、上述した第１実施形態では、図１に示すように、マーカー１０が重金属粒子４を含む場合について説明したが、マーカー１０はケイ素よりも原子番号が大きい物質（元素）を含んでいればよい。ケイ素よりも原子番号が大きい物質は、電子顕微鏡においてシリカ粒子２よりも強いコントラストが得られる。そのため、マーカー１０がケイ素よりも原子番号が大きい物質を含むことで、マーカー１０を電子顕微鏡用のマーカーとして用いることができる。
【0068】
（２）第２変形例
例えば、上述した第１実施形態では、電子顕微鏡用の試料作製Ｓ１００の後に、蛍光顕微鏡像の撮影Ｓ１０２を行った場合について説明したが、蛍光顕微鏡像の撮影を行うタイミングは特に限定されず、例えば蛍光顕微鏡像の撮影Ｓ１０２を電子顕微鏡用の試料作製Ｓ１００中に行ってもよい。例えば、電子顕微鏡用の試料作製Ｓ１００において、試料を蛍光顕微鏡で観察してマーカー１０が取り込まれた組織や細胞を探し、試料を切り出す箇所が決まったら、その箇所を蛍光顕微鏡で撮影してもよい。
例えば、上述した第１実施形態では、電子顕微鏡用の試料作製Ｓ１００の後に、蛍光顕微鏡像の撮影Ｓ１０２を行った場合について説明したが、蛍光顕微鏡像の撮影を行うタイミングは特に限定されず、例えば蛍光顕微鏡像の撮影Ｓ１０２を電子顕微鏡用の試料作製Ｓ１００中に行ってもよい。例えば、電子顕微鏡用の試料作製Ｓ１００において、試料を蛍光顕微鏡で観察してマーカー１０が取り込まれた組織や細胞を探し、試料を切り出す箇所が決まったら、その箇所を蛍光顕微鏡で撮影してもよい。
【0069】
上述した第２実施形態についても同様であり、蛍光顕微鏡像の撮影Ｓ２０２を電子顕微鏡用の試料作製Ｓ２００中に行ってもよい。
【0070】
（３）第３変形例
例えば、上述した第２実施形態では、第１マーカー１０Ａに含まれる重金属粒子４Ａと第２マーカー１０Ｂに含まれる重金属粒子４Ｂが、異なる物質である場合について説明したが、第１マーカー１０Ａに含まれる重金属粒子４Ａの形状と第２マーカー１０Ｂに含まれる重金属粒子４Ｂの形状が異なっていてもよい。これにより、透過電子顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。
例えば、上述した第２実施形態では、第１マーカー１０Ａに含まれる重金属粒子４Ａと第２マーカー１０Ｂに含まれる重金属粒子４Ｂが、異なる物質である場合について説明したが、第１マーカー１０Ａに含まれる重金属粒子４Ａの形状と第２マーカー１０Ｂに含まれる重金属粒子４Ｂの形状が異なっていてもよい。これにより、透過電子顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。
【0071】
また、第１マーカー１０Ａに含まれる重金属粒子４Ａの大きさ（粒径）と第２マーカー１０Ｂに含まれる重金属粒子４Ｂの大きさ（粒径）が異なっていてもよい。これにより、透過電子顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。
【0072】
また、例えば、図８に示すように、第１マーカー１０Ａにおいて重金属粒子４Ａはシリカ粒子２Ａの表面に付着し、第２マーカー１０Ｂにおいて重金属粒子４Ｂはシリカ粒子２Ｂのコアに存在してもよい。これにより、透過電子顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。
【0073】
（４）第４変形例
上述したように、マーカー１０は、シリカ粒子２と、重金属粒子４と、を含む。そのため、図２に示すように、透過電子顕微鏡像において、シリカ粒子２のコントラストと重金属粒子４のコントラストの２種類のコントラストが得られる。
上述したように、マーカー１０は、シリカ粒子２と、重金属粒子４と、を含む。そのため、図２に示すように、透過電子顕微鏡像において、シリカ粒子２のコントラストと重金属粒子４のコントラストの２種類のコントラストが得られる。
【0074】
したがって、例えば、第１マーカー１０Ａに含まれるシリカ粒子２Ｂの大きさ（粒径）と第２マーカー１０Ｂに含まれるシリカ粒子２Ｂの大きさ（粒径）を異ならせてもよい。これにより、透過電子顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。また、例えば、第１マーカー１０Ａにおいてシリカ粒子２Ａに付着させる重金属粒子４Ａの密度（数）と、第２マーカー１０Ｂにおいてシリカ粒子２Ａに付着させる重金属粒子４Ａの密度（数）と、を変えてもよい。これにより、透過電子顕微鏡像において、第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを区別できる。
【0075】
（５）第５変形例
上述した第２実施形態では、互いに蛍光物質および重金属粒子の種類が異なる第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを含む試料を作製する場合について説明したが、互いに蛍光物質および重金属粒子の種類が異なる３種以上のマーカーを含む試料を作製してもよい。
上述した第２実施形態では、互いに蛍光物質および重金属粒子の種類が異なる第１マーカー１０Ａと第２マーカー１０Ｂを含む試料を作製する場合について説明したが、互いに蛍光物質および重金属粒子の種類が異なる３種以上のマーカーを含む試料を作製してもよい。
【0076】
５． 実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【0077】
５．１． マウスの脾臓の観察
（１）試料作製
蛍光色素を含有する有機シリカ粒子の表面に金粒子を付着させたマーカーを準備した。次に、マウスに静脈注射してマウスの静脈内にマーカーを注入した。次に、マウスを灌流固定し、脾臓を取り出した。次に、取り出した脾臓を蛍光顕微鏡で観察し、マーカーが取り込まれた部位を見つけて切り出した。切り出した試料を浸漬固定し、脱水した後、樹脂包埋した。次に、樹脂包埋された試料をミクロトームなどで薄片化した。以上の工程により、電子顕微鏡用の試料を作製した。
（１）試料作製
蛍光色素を含有する有機シリカ粒子の表面に金粒子を付着させたマーカーを準備した。次に、マウスに静脈注射してマウスの静脈内にマーカーを注入した。次に、マウスを灌流固定し、脾臓を取り出した。次に、取り出した脾臓を蛍光顕微鏡で観察し、マーカーが取り込まれた部位を見つけて切り出した。切り出した試料を浸漬固定し、脱水した後、樹脂包埋した。次に、樹脂包埋された試料をミクロトームなどで薄片化した。以上の工程により、電子顕微鏡用の試料を作製した。
【0078】
（２）観察
作製された電子顕微鏡用の試料を蛍光顕微鏡で観察した。図９は、マウスの脾臓の蛍光顕微鏡像である。
作製された電子顕微鏡用の試料を蛍光顕微鏡で観察した。図９は、マウスの脾臓の蛍光顕微鏡像である。
【0079】
図９に示すように、蛍光顕微鏡像において、マーカーが取り込まれた部位が赤く光って観察された。
【0080】
作製された電子顕微鏡用の試料を透過電子顕微鏡で観察した。図１０は、マウスの脾臓の透過電子顕微鏡像である。
【0081】
図１０に示すように、透過電子顕微鏡像において、マーカーが黒いドットとして確認できた。マーカーが金粒子を含むため、透過電子顕微鏡像において強いコントラストが得られた。
【0082】
【0083】
図１１に示すように、透過電子顕微鏡像において、マーカーの形状を確認できた。
【0084】
５．２． ラットの肝臓の観察
（１）試料作製
蛍光色素を含有し、酸化鉄粒子をコアとする有機シリカ粒子をマーカーとして準備した。次に、ラットに静脈注射してラットの静脈内にマーカーを注入した。次に、ラットを灌流固定し、肝臓を取り出した。次に、取り出した肝臓を蛍光顕微鏡で観察し、マーカーが取り込まれた部位を見つけて切り出した。切り出した試料を浸漬固定し、脱水した後、樹脂包埋した。次に、樹脂包埋された試料をミクロトームなどで薄片化した。以上の工程により、電子顕微鏡用の試料を作製した。
（１）試料作製
蛍光色素を含有し、酸化鉄粒子をコアとする有機シリカ粒子をマーカーとして準備した。次に、ラットに静脈注射してラットの静脈内にマーカーを注入した。次に、ラットを灌流固定し、肝臓を取り出した。次に、取り出した肝臓を蛍光顕微鏡で観察し、マーカーが取り込まれた部位を見つけて切り出した。切り出した試料を浸漬固定し、脱水した後、樹脂包埋した。次に、樹脂包埋された試料をミクロトームなどで薄片化した。以上の工程により、電子顕微鏡用の試料を作製した。
【0085】
【0086】
【0087】
作製された電子顕微鏡用の試料を透過電子顕微鏡で観察した。図１４は、ラットの肝臓のＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像である。
【0088】
図１４に示すように、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像において、マーカーが黒いドットとして確認できた。マーカーが酸化鉄粒子を含むため、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像において強いコントラストが得られた。
【0089】
【0090】
【0091】
図１７は、白黒反転させたＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像上に、Ｓｉの元素マップとＦｅの元素マップを重ねた画像である。
【0092】
図１７に示す画像から細胞の特定の部位にマーカーが取り込まれていることが確認できた。また、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像および元素マップにおいてマーカーを明瞭に特定できるため、容易に、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ像と元素マップとの間の位置合わせを行うことができる。
【0093】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成を含む。実質的に同一の構成とは、例えば、機能、方法、及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成である。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【0094】
２…シリカ粒子、２Ａ…シリカ粒子、２Ｂ…シリカ粒子、４…重金属粒子、４Ａ…重金属粒子、４Ｂ…重金属粒子、６Ａ…機能性物質、６Ｂ…機能性物質、１０…マーカー、１０Ａ…第１マーカー、１０Ｂ…第２マーカー
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
