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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023146683
(43)【公開日】2023-10-12
(54)【発明の名称】マウス由来大腸上皮細胞株
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20231004BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20231004BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20231004BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20231004BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20231004BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20231004BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12Q1/02 ZNA
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022053999
(22)【出願日】2022-03-29
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．トライトン
(71)【出願人】
【識別番号】000006884
【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】松本 敏
(72)【発明者】
【氏名】谷口 龍一郎
(72)【発明者】
【氏名】長岡 紀子
(72)【発明者】
【氏名】荒▲瀬▼ 壮兵
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ53
4B063QR06
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
4B065AA91X
4B065AC20
4B065CA60
(57)【要約】 （修正有）
【課題】正常細胞に近い大腸上皮細胞株及びその利用法の提供。
【解決手段】下記（ａ）～（ｊ）の１又は２以上の性質が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い、正常細胞に近いマウス由来大腸上皮細胞株。
（ａ）ＵＥＡ－１（ハリエニシダレクチン）との結合性
（ｂ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現量
（ｃ）ＭＵＣ２の発現量
（ｄ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量
（ｅ）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量
（ｆ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量
（ｇ）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量
（ｈ）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量
（ｉ）ＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量
（ｊ）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）
【選択図】なし
【解決手段】下記（ａ）～（ｊ）の１又は２以上の性質が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い、正常細胞に近いマウス由来大腸上皮細胞株。
（ａ）ＵＥＡ－１（ハリエニシダレクチン）との結合性
（ｂ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現量
（ｃ）ＭＵＣ２の発現量
（ｄ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量
（ｅ）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量
（ｆ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量
（ｇ）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量
（ｈ）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量
（ｉ）ＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量
（ｊ）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ａ）～（ｊ）から選ばれる１又は２以上の性質を有する、正常細胞に近いマウス由来大腸上皮細胞株。
（ａ）ＵＥＡ－１（ハリエニシダレクチン）との結合性がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｂ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現量がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｃ）ＭＵＣ２の発現量がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｄ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｅ）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｆ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｇ）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｈ）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｉ）ＣＤ－１３０のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｊ）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ａ）ＵＥＡ－１（ハリエニシダレクチン）との結合性がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｂ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現量がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｃ）ＭＵＣ２の発現量がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｄ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｅ）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｆ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｇ）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｈ）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｉ）ＣＤ－１３０のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｊ）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
【請求項2】
前記（ａ）－（ｊ）のすべての性質を有する、請求項１に記載の細胞株。
【請求項3】
下記（ｄ－１）～（ｊ－１）から選ばれる１又は２以上の性質を有する、請求項１又は２に記載の細胞株。
（ｄ－１）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５．０倍高い。
（ｅ－１）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５０倍高い。
（ｆ－１）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３～３０倍高い。
（ｇ－１）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３０～２０００倍高い。
（ｈ－１）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～３００倍高い。
（ｉ－１）ＣＤ－１３０のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～１０倍高い。
（ｊ－１）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～１０倍高い。
（ｄ－１）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５．０倍高い。
（ｅ－１）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５０倍高い。
（ｆ－１）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３～３０倍高い。
（ｇ－１）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３０～２０００倍高い。
（ｈ－１）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～３００倍高い。
（ｉ－１）ＣＤ－１３０のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～１０倍高い。
（ｊ－１）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～１０倍高い。
【請求項4】
前記（ｄ－１）～（ｊ－１）のすべての性質を有する、請求項１～３のいずれかに記載の細胞株。
【請求項5】
さらに、下記（ｋ－１）及び（ｌ－１）から選ばれる１又はすべての性質を有する、請求項１～４のいずれかに記載の細胞株。
（ｋ－１）Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１００～１００００倍高い。
（ｌ－１）Ｃｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１／１０００～１／２倍低い。
（ｋ－１）Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１００～１００００倍高い。
（ｌ－１）Ｃｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１／１０００～１／２倍低い。
【請求項6】
ＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウスの大腸上皮様器官から得られたものである請求項１～５のいずれかに記載の細胞株。
【請求項7】
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５８８）である請求項１～６のいずれかに記載の細胞株。
【請求項8】
請求項１～７のいずれかに記載の細胞株を用いることを特徴とするがん予防及び／又は治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項9】
がん予防及び／又は治療剤が、医薬品の形態である請求項８に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マウス由来の大腸上皮細胞株及びその利用法に関する。
【背景技術】
【0002】
大腸がんは、ヒトに頻発するがんのひとつであり、日本においては、消化器がんでは胃がんに次いで死亡率が高く、食習慣の欧米化に伴って急増している。近年、大腸がんの原因遺伝子や発生メカニズムの解析が積極的に行われているが、正常な大腸上皮細胞が大腸がんに至る発がん過程は完全には明らかにされていない。大腸がんの発がん過程の解明には正常細胞に近い性質を持った大腸上皮細胞株の取得が重要であるが、これまで、ヒトやマウスから確立された大腸上皮細胞株の多くは大腸がん細胞由来であり（非特許文献１及び特許文献１）、がん細胞の薬物耐性や薬効成分のスクリーニングなど既にがん化した細胞の性質の研究を行う上では有用であるが、がんに至るプロセスを解析するためには適していない。
【0003】
正常細胞の性質に近い腸管上皮細胞は、マウスやモルモットで報告されているが、これらは初代培養したものであり、株化されていない（非特許文献２及び３）。また、ヒト大腸正常上皮細胞株の取得も報告されている（特許文献２）が、この方法は、ＳＶ４０ウイルスの導入により不死化させた細胞株を取得しているため、ｐ５３遺伝子変異が必ずしも起こっているわけではなく、一般的なｐ５３遺伝子変異後に大腸がんに至る発がん機構の解析等には使用することが適切でないという問題があった。また、取得された細胞株はショ糖イソマルターゼやＤＰＰ４を産生するため、小腸型に分化する性質があると考えられ、正常細胞に近い性質を持った大腸上皮細胞株とは言えないものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２００３－２５０５３５号公報
【特許文献2】特開平１０－２８５８０号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】J. Fogh et al., J. Natl. Cancer Inst.,1977, 58, 209-214.
【非特許文献2】C. Booth et al., Epithelial cell biology, 1995,4,76-86.
【非特許文献3】T. Kawahara et al., J. Immunol., 2004, 172,3051-3058.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、正常細胞に近い性質を持った大腸上皮細胞株及びその利用法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題に鑑み検討したところ、大腸発癌モデルであるＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウス（α－ＤＫＯマウス）から正常細胞に近い性質を持った大腸上皮細胞株を取得することに成功した。また、当該細胞株を用いれば、がん予防治療剤をスクリーニングできることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕～〔９〕に係るものである。
【0009】
〔１〕下記（ａ）～（ｊ）から選ばれる１又は２以上の性質を有する、正常細胞に近いマウス由来大腸上皮細胞株。
（ａ）ＵＥＡ－１（ハリエニシダレクチン）との結合性がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｂ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現量がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｃ）ＭＵＣ２の発現量がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｄ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｅ）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｆ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｇ）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｈ）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｉ）ＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｊ）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ａ）ＵＥＡ－１（ハリエニシダレクチン）との結合性がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｂ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現量がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｃ）ＭＵＣ２の発現量がマウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｄ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｅ）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｆ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｇ）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｈ）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｉ）ＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
（ｊ）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。
【0010】
〔２〕前記（ａ）－（ｊ）のすべての性質を有する、〔１〕に記載の細胞株。
〔３〕下記（ｄ－１）～（ｊ－１）から選ばれる１又は２以上の性質を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の細胞株。
（ｄ－１）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５．０倍高い。
（ｅ－１）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５０倍高い。
（ｆ－１）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３～３０倍高い。
（ｇ－１）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３０～２０００倍高い。
（ｈ－１）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～３００倍高い。
（ｉ－１）ＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～１０倍高い。
（ｊ－１）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～１０倍高い。
〔４〕前記（ｄ－１）－（ｊ－１）のすべての性質を有する、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の細胞株。
〔５〕さらに、下記（ｋ－１）及び（ｌ－１）から選ばれる１又はすべての性質を有する、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の細胞株。
（ｋ－１）Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１００～１００００倍高い。
（ｌ－１）Ｃｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１／１０００～１／２倍低い。
〔６〕ＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウスの大腸上皮様器官から得られたものである〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の細胞株。
〔７〕Ｍ３Ｃ－１Ｂ９（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５８８）である〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の細胞株。
〔８〕〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の細胞株を用いることを特徴とするがん予防及び／又は治療剤をスクリーニングする方法。
〔９〕がん予防及び／又は治療剤が、医薬品の形態である〔８〕に記載のスクリーニング方法。
〔３〕下記（ｄ－１）～（ｊ－１）から選ばれる１又は２以上の性質を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の細胞株。
（ｄ－１）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５．０倍高い。
（ｅ－１）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５０倍高い。
（ｆ－１）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３～３０倍高い。
（ｇ－１）ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３０～２０００倍高い。
（ｈ－１）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～３００倍高い。
（ｉ－１）ＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～１０倍高い。
（ｊ－１）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～１０倍高い。
〔４〕前記（ｄ－１）－（ｊ－１）のすべての性質を有する、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の細胞株。
〔５〕さらに、下記（ｋ－１）及び（ｌ－１）から選ばれる１又はすべての性質を有する、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の細胞株。
（ｋ－１）Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１００～１００００倍高い。
（ｌ－１）Ｃｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡ発現量が、マウス大腸がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１／１０００～１／２倍低い。
〔６〕ＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウスの大腸上皮様器官から得られたものである〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の細胞株。
〔７〕Ｍ３Ｃ－１Ｂ９（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５８８）である〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の細胞株。
〔８〕〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の細胞株を用いることを特徴とするがん予防及び／又は治療剤をスクリーニングする方法。
〔９〕がん予防及び／又は治療剤が、医薬品の形態である〔８〕に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明の細胞株は、正常細胞に近い大腸上皮細胞株であることから、当該細胞株を用いてがん予防及び／又は治療剤をスクリーニングすることができる。また、ｐ５３遺伝子の欠損によりがん化しやすい性質があることから、大腸がんの発がん過程の解明に用いることができる。さらに、これらの検証に必要な動物実験を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】正常細胞に近い大腸上皮細胞株（Ｍ３Ｃ－１Ｂ９）とがん細胞株であるＣＭＴ－９３株におけるＵＥＡ－１との結合性を示す（矢印はＵＥＡ－１と結合した細胞を示す）。
【図2】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＡｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現を免疫蛍光染色で確認した結果を示す（ＣＭＴ－９３株の画像と比較して変色している部分がＡｓｉａｌｏ ＧＭ１）。
【図3】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＭＵＣ２タンパクの発現を免疫蛍光染色で確認した結果を示す（ＣＭＴ－９３株の画像と比較して変色している部分がＭＵＣ２）。
【図4】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量の比較を示す。
【図5】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＦｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２のｍＲＮＡ発現量の比較を示す。
【図6】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼのｍＲＮＡ発現量の比較を示す。
【図7】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量の比較を示す。
【図8】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量の比較を示す。
【図9】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量の比較を示す。
【図10】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株における経上皮電気抵抗値の比較を示す。
【図11】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＣｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量の比較を示す。
【図12】Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株におけるＣｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡ発現量の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明において、「正常細胞」とは、有害な生理学的又は遺伝学的欠損のない健常マウスの大腸から集めることができる細胞を意味する。また、「細胞株」とは、無限に（例えば、６０継代以上）増殖することができる性質を持った細胞を意味する。
【0014】
本発明の細胞株は、マウス大腸より大腸上皮様器官を作製し、それを継代培養してクローン化することで得られる。
【0015】
使用するマウスは、ｐ５３遺伝子変異を有し、発がんメカニズムの解明に利用可能という点から、ＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウスが好ましい。ＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウスは、生後約８週齢で大腸がんを発症することが知られている。
【0016】
大腸上皮様器官を作製する方法は、例えば、まずマウスから大腸を取り出して、腸管を切開し、細分化した大腸組織片を作製し、その後、大腸組織片より大腸陰窩を遊離させ、陰窩細胞をＭａｔｒｉｇｅｌと重合させた後、Ｃｌｅｖｅｒｓら（Ｎａｔｕｒｅ ２００９,４５９,２６２－２６５）によって開発された培養法にＨＧＦ（肝細胞増殖因子）を添加することで行うことができる。培養に用いられる培養液は、大腸上皮様器官を培養できるものであればよく、例えば、Ｎｏｇｇｉｎ－１、ＥＧＦ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、Ｗｎｔ３ａ、ＨＧＦを含む１０％ＦＣＳ／ａＤＭＥＭが挙げられる。培養は、３６℃～３８℃で１～２週間行うことが好ましい。また、培養液は２～３日ごとに交換することが好ましい。
【0017】
大腸上皮様器官を継代培養する方法は、大腸上皮様器官が培養可能な条件であれば特に限定されないが、例えば、１０％ＦＣＳ／ａＤＭＥＭで培養することができる。クローン化する方法は、特に限定されないが、例えば、限界希釈法（培養用プレートの１個のウエルに１個の細胞が入るように細胞浮遊液を希釈して培養することを繰り返すことにより単一のクローンを選別する方法）を用いてクローン化することができる。
【0018】
得られた細胞クローンが上皮細胞株か否かを判断するためには、上皮細胞での発現が確認されているＲＮＡやタンパクを測定すればよく、例えば、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎやβ－ｃａｔｅｎｉｎの発現を確認することが挙げられる。当該ＲＮＡやタンパクの確認方法は、特に限定されないが、例えば抗Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体や抗β－ｃａｔｅｎｉｎ抗体で免疫染色し、抗原の発現が観察されるか否かで確認することができる。
【0019】
本発明細胞株の具体例としては、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５８８）（独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託）が挙げられる。
【0020】
本発明の細胞株は、正常細胞に近い性質を持った細胞株である。「正常細胞に近い性質」を示す例としては、（ａ）ＵＥＡ－１（ハリエニシダレクチン）との結合性が、がん細胞株と比べて高いこと、（ｂ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現量が、がん細胞株と比べて高いこと、（ｃ）ＭＵＣ２タンパクの発現量が、がん細胞株と比べて高いこと、（ｄ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現量が、がん細胞株と比べて高いこと、（ｅ）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）のｍＲＮＡ発現量が、がん細胞株と比べて高いこと、（ｆ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）のｍＲＮＡ発現量が、がん細胞株と比べて高いこと、（ｇ）ＴＬＲ５の発現量が、がん細胞株と比べて高いこと、（ｈ）ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量が、がん細胞株と比べて高いこと、（ｉ）ＣＤ１３０のｍＲＮＡの発現量が、がん細胞株と比べて高いことが挙げられる。また、（ｊ）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）が、がん細胞株と比べて高いことが挙げられる。
ここで、がん細胞株としてはＣＭＴ－９３株を挙げることができる。ＣＭＴ－９３株は、マウス結腸がん由来の細胞株であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で広く用いられている。本細胞株は、細胞バンク（ＡＴＣＣなど）から誰でも入手することが可能である。
本発明の細胞株は、上記（ａ）～（ｊ）の１又は２以上の性質を有するが、（ａ）～（ｊ）のすべての性質を有することが好ましい。
ここで、がん細胞株としてはＣＭＴ－９３株を挙げることができる。ＣＭＴ－９３株は、マウス結腸がん由来の細胞株であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で広く用いられている。本細胞株は、細胞バンク（ＡＴＣＣなど）から誰でも入手することが可能である。
本発明の細胞株は、上記（ａ）～（ｊ）の１又は２以上の性質を有するが、（ａ）～（ｊ）のすべての性質を有することが好ましい。
【0021】
（ａ）ＵＥＡ－１は、糖タンパク質や糖脂質の末端部分に結合したα－フコースに結合性の高いレクチンで、正常な大腸上皮細胞は糖鎖の末端にα－１，３－フコースを有しているため、ＵＥＡ－１との結合性が観察される。ＵＥＡ－１との結合性を測定する方法は、例えば、レクチン染色が挙げられる。レクチン染色は、凍結組織切片において、切片をビオチン標識ＵＥＡ－１で３～５℃で１０～１４時間染色を行うことが好ましい。
がん細胞株であるＣＭＴ－９３株では、ＵＥＡ－１との結合性がほとんど観察されないが、本発明細胞株では、正常細胞と同様にＵＥＡ－１との結合性が観察される。
がん細胞株であるＣＭＴ－９３株では、ＵＥＡ－１との結合性がほとんど観察されないが、本発明細胞株では、正常細胞と同様にＵＥＡ－１との結合性が観察される。
【0022】
（ｂ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１は、小腸上皮細胞の微絨毛膜に局在する中性糖脂質であり、大腸でも正常細胞では恒常的な発現が認められている。Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の糖脂質抗原の発現を測定する方法は、例えば、抗Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１抗体を用いた免疫蛍光染色が挙げられる。免疫蛍光染色は通常の免疫染色の過程、例えば、細胞の準備、細胞の固定、細胞膜の透過処理、ブロッキング、一次抗体反応、洗浄、二次抗体反応、洗浄、核の染色、封入、顕微鏡での観察といった方法で行うことができる。細胞の固定は、特に１％パラホルムアルデヒド固定が好ましい。また、抗Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１抗体との反応は、３～５℃で１０～１４時間行うことが好ましい。
がん細胞株であるＣＭＴ－９３株では、Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１糖脂質がほとんど検出されないが、本発明細胞株では、正常細胞と同様にＡｓｉａｌｏ ＧＭ１の存在が観察される。
がん細胞株であるＣＭＴ－９３株では、Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１糖脂質がほとんど検出されないが、本発明細胞株では、正常細胞と同様にＡｓｉａｌｏ ＧＭ１の存在が観察される。
【0023】
（ｃ）ＭＵＣ２は、大腸ムチンの主要な糖タンパク質であり、正常大腸細胞では恒常的な発現が認められている。ＭＵＣ２の糖タンパク質抗原の発現を抗ＭＵＣ２抗体を用いて測定する方法は、例えば、免疫蛍光染色が挙げられ、その条件は、例えば、Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の検出の場合と同様の条件が挙げられる。
がん細胞株であるＣＭＴ－９３株では、抗ＭＵＣ２抗体との結合性がほとんど観察されないが、本発明細胞株では、正常細胞同様に抗ＭＵＣ２抗体との結合性が観察される。
がん細胞株であるＣＭＴ－９３株では、抗ＭＵＣ２抗体との結合性がほとんど観察されないが、本発明細胞株では、正常細胞同様に抗ＭＵＣ２抗体との結合性が観察される。
【0024】
（ｄ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅは、正常な大腸上皮細胞での糖脂質合成経路であるラクトシルセラミドからＡｓｉａｌｏ ＧＭ１への反応に必要な酵素であり、ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現は、がんの特性を抑制することが示唆されている（Ｄｏｎｇ Ｙ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２０１０,１０１,２０３９－４７）。
【0025】
ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量を測定する方法は、例えば定量化ＲＴ－ＰＣＲ法が挙げられる。当該方法は、具体的には、本発明の細胞株より抽出されたｍＲＮＡに対して、逆転写酵素及び逆転写反応用プライマーを用いて逆転写反応を行った後ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う。
【0026】
逆転写反応で用いられる逆転写反応用プライマーは、ｍＲＮＡの５’末端及び３’末端部の塩基配列を基に、ｃＤＮＡを合成するプライマーとして作製することができ、ランダムプライマー、オリゴｄｔプライマー、遺伝子特異的プライマーなどが挙げられるが、特にランダムプライマーが好ましい。また、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う際に使用するプライマーは、ｃＤＮＡの５’末端及び３’末端部の塩基配列を基に、ｃＤＮＡ全長を増幅するプライマーとして作製することができる。また、ＰＣＲ法においては、通常２種類のプライマーを１組として用いることが好ましく、両者がリーディング鎖とラギング鎖との組み合わせになるようにする必要がある。
斯かるプライマーは、例えば自動ＤＮＡ合成機によって容易に合成することができる。また、これらのプライマーを用いた増幅産物はプローブとしても使用することができる。
斯かるプライマーは、例えば自動ＤＮＡ合成機によって容易に合成することができる。また、これらのプライマーを用いた増幅産物はプローブとしても使用することができる。
【0027】
ＲＴ－ＰＣＲ反応の条件は、通常のＲＴ－ＰＣＲの条件で行うことができる。例えば、逆転写反応を５０～７０℃、熱変性反応を９０～９８℃、プライマーを鋳型ｃＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を３７～７２℃、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を５０～７５℃という温度条件で、これを１サイクルとしたものを１～数１０サイクル行う。なお、好ましい反応条件の一例としては、逆転写反応６０℃２０分、熱変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長反応７２℃１２０秒×３０サイクルが挙げられる。
【0028】
尚、本発明の細胞株よりｍＲＮＡを抽出する方法としては、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｐｈｅｎｏｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法等を利用すればよい。
【0029】
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量ががん細胞株であるＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５．０倍程度高いことが好ましく、さらに２．５～５．０倍高いことが好ましい。
【0030】
（ｅ）Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＦＵＴ２）は、正常な大腸上皮細胞での糖脂質合成経路であるアシアロＧＭ１からフコシルアシアロＧＭ１への反応に必要な酵素であり、正常大腸上皮細胞での発現が確認されている。
ＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量を測定する方法は、例えば定量化ＲＴ－ＰＣＲ法が挙げられ、その条件は前記ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡと同様にして行なうことができる。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５０倍程度高いことが好ましく、さらに８～４０倍高いことが好ましい。
ＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量を測定する方法は、例えば定量化ＲＴ－ＰＣＲ法が挙げられ、その条件は前記ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡと同様にして行なうことができる。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～５０倍程度高いことが好ましく、さらに８～４０倍高いことが好ましい。
【0031】
（ｆ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）は、主に大腸上皮細胞と血管平滑筋細胞に局在して細胞の増殖、分化に関与している。ＮＯＸ－１のｍＲＮＡ発現量を測定する方法は、例えば定量化ＲＴ－ＰＣＲ法が挙げられ、その条件は例えばＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡと同様にして行うことができる。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＮＯＸ－１のｍＲＮＡ発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＮＯＸ－１のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３～３０倍程高いことが好ましく、さらに６～２０倍、特に１０～２０倍高いことが好ましい。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＮＯＸ－１のｍＲＮＡ発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＮＯＸ－１のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３～３０倍程高いことが好ましく、さらに６～２０倍、特に１０～２０倍高いことが好ましい。
【0032】
（ｇ）ＴＬＲ５は、パターン認識受容体の一種であるトル様受容体５であり、正常大腸上皮細胞での発現が確認されている。ＴＬＲ５タンパクのｍＲＮＡ発現量を測定する方法は、例えば定量化ＲＴ－ＰＣＲ法が挙げられ、その条件は、例えば、ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡと同様の条件が挙げられる。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３０～２０００倍高いことが好ましく、さらに１０００～１８００倍高いことが好ましい。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて３０～２０００倍高いことが好ましく、さらに１０００～１８００倍高いことが好ましい。
【0033】
（ｈ）ＬＬ３７は、抗菌ペプチドであり、ＴＬＲ５と同様、正常大腸上皮細胞での発現が確認されている。また、ＬＬ３７は正常大腸粘膜で高発現であるが、大腸がん組織では低発現である（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., ２０１２,７２, ｐ６５１２）。ＬＬ３７ペプチドのｍＲＮＡ発現量を測定する方法は、定量化ＲＴ－ＰＣＲ法が挙げられ、その条件は、例えば、ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡと同様の条件が挙げられる。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＬＬ３７のｍＲＮＡの発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～３００倍高いことが好ましく、さらに２０～３００倍高いことが好ましい。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＬＬ３７のｍＲＮＡの発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～３００倍高いことが好ましく、さらに２０～３００倍高いことが好ましい。
【0034】
（ｉ）ＣＤ１３０は、糖タンパク質であり、ＩＬ－６受容体と会合して細胞内にシグナルを伝える。ＣＤ１３０は、ＴＬＲ５と同様、正常大腸上皮細胞での発現が確認されている。ＣＤ１３０糖タンパクのｍＲＮＡ発現量を測定する方法は、例えば定量化ＲＴ－ＰＣＲ法が挙げられ、その条件は、例えば、ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡと同様の条件が挙げられる。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～１０倍高いことが好ましく、さらに３～８倍高いことが好ましい。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて２～１０倍高いことが好ましく、さらに３～８倍高いことが好ましい。
【0035】
（ｊ）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）は、経上皮細胞バリア機能の主な構成要素であり、隣接した細胞間の密着結合であるタイトジャンクションの強度と強い相関関係を示す。抵抗値が高いほどタイトジャンクションの形成が優れている。正常細胞では上皮細胞間の密着性が高いが、炎症や癌化がおきている細胞では、腸管上皮細胞の透過性が亢進することが判明している。ＴＥＥＲ値の測定は、トランスウェルで単層培養した本発明細胞の管腔側と基底側に電極を挿入することにより測定され、その抵抗値（Ω/cm2）で数値化できる。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＴＥＥＲ値ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＴＥＥＲ値は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～１０倍高いことが好ましく、さらに２～８倍、特に２～５倍高いことが好ましい。
本発明の細胞株は、正常細胞と同様にＴＥＥＲ値ががん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＴＥＥＲ値は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１．５～１０倍高いことが好ましく、さらに２～８倍、特に２～５倍高いことが好ましい。
【0036】
Ｃｌａｕｄｉｎ－１は、細胞間結合に関与するタンパク質である。Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量を測定する方法は、例えば定量化ＲＴ－ＰＣＲ法が挙げられ、その条件は、例えば、ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡと同様の条件が挙げられる。
本発明の細胞株は、Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量が、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＣｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡの発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１００～１００００倍高いことが好ましく、さらに１０００～２０００倍高いことが好ましい。
本発明の細胞株は、Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量が、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて高い。本発明の細胞株のＣｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡの発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１００～１００００倍高いことが好ましく、さらに１０００～２０００倍高いことが好ましい。
【0037】
Ｃｌａｕｄｉｎ－２は、細胞間結合に関与するタンパク質であり、大腸がん粘膜上皮細胞で発現レベルが高いものである。Ｃｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡ発現量を測定する方法は、例えば定量化ＲＴ－ＰＣＲ法が挙げられ、その条件は、例えば、ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡと同様の条件が挙げられる。
本発明の細胞株は、Ｃｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡ発現量が、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて低い。本発明の細胞株のＣｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡの発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１／１０００～１／２倍低いことが好ましく、さらに１／１００～１／２倍低いことが好ましい。
本発明の細胞株は、Ｃｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡ発現量が、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて低い。本発明の細胞株のＣｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡの発現量は、がん細胞株ＣＭＴ－９３株と比べて１／１０００～１／２倍低いことが好ましく、さらに１／１００～１／２倍低いことが好ましい。
【0038】
本発明の細胞株は、正常細胞に近い性質を持っているが、ＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウス由来であり、当該ＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウスは生後約８週齢で大腸がんを発症することから、本細胞株ががん化したか否かを指標にすることで、がん予防治療剤やその成分のスクリーニングに使用することができる。具体的には、被験物質の存在下に本細胞株を培養し、本細胞株ががん化したか否かを判定すればよい。ここで本細胞株ががん化したか否かは、ＵＥＡ－１との結合性またはＡｓｉａｌｏ ＧＭ１、ＭＵＣ２の発現量ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＦＵＴ２、ＮＯＸ－１、ＴＬＲ５、ＬＬ３７、ＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量が、既存のがん細胞株と同等程度に低いことやＴＥＥＲ値が、既存のがん細胞株と同等程度であることのうちの１つ以上を満たすことが挙げられる。これらの性質の判定は、前記と同様にして行うことができる。
【0039】
上記スクリーニング方法により選択された物質は、主として医薬品として使用できる。斯かる医薬品は、固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【0040】
さらに本発明の細胞株は、免疫学的、薬学的及び毒性研究に応用することができる。
すなわち、本発明の細胞株は、例えば（１）腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性や毒性又は有効性を有することが疑われる物質を、本発明の細胞株を有する培養物と反応、培養又は接触させ、そして（２）細胞株に対する物質の作用を定性的または定量的に測定することで、腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変異誘発性、毒性または有効性をスクリーニングするのにも適している。
従って、本発明の細胞株を用いて、本発明の細胞株、本発明の細胞株を培養するための培地、及び突然変異誘発性、毒性または有効性物質の代謝応答を測定するための試薬を含んでなる、診断キットを作製することも可能である。
すなわち、本発明の細胞株は、例えば（１）腸管細胞の代謝に対して突然変異誘発性や毒性又は有効性を有することが疑われる物質を、本発明の細胞株を有する培養物と反応、培養又は接触させ、そして（２）細胞株に対する物質の作用を定性的または定量的に測定することで、腸管細胞の代謝に及ぼす物質の突然変異誘発性、毒性または有効性をスクリーニングするのにも適している。
従って、本発明の細胞株を用いて、本発明の細胞株、本発明の細胞株を培養するための培地、及び突然変異誘発性、毒性または有効性物質の代謝応答を測定するための試薬を含んでなる、診断キットを作製することも可能である。
【実施例0041】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0042】
実施例１ 正常細胞の性質を持った大腸上皮細胞株の取得
［１］材料及び方法
（ａ）動物
５－７週齢のＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウス（α－ＤＫＯ）
［１］材料及び方法
（ａ）動物
５－７週齢のＴＣＲα／ｐ５３遺伝子２重欠損マウス（α－ＤＫＯ）
【0043】
（ｂ）試薬
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
１０μＭ ＤＴＴ （ＳＩＧＭＡ）
１ｍＭ ＥＤＴＡ （ＳＩＧＭＡ）
ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２ （ａＤＭＥＭ） （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｍａｔｒｉｇｅｌ （Ｃｏｒｎｉｎｇ）
Ｎｏｇｇｉｎ－１ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
ＥＧＦ （上皮成長因子） （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
Ｗｎｔ３ａ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
ＨＧＦ （肝細胞増殖因子） （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
ＦＣＳ （ウシ胎児血清） （ＳＩＧＭＡ）
トリプシン （ＳＩＧＭＡ）
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
１０μＭ ＤＴＴ （ＳＩＧＭＡ）
１ｍＭ ＥＤＴＡ （ＳＩＧＭＡ）
ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２ （ａＤＭＥＭ） （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｍａｔｒｉｇｅｌ （Ｃｏｒｎｉｎｇ）
Ｎｏｇｇｉｎ－１ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
ＥＧＦ （上皮成長因子） （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
Ｗｎｔ３ａ （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
ＨＧＦ （肝細胞増殖因子） （Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
ＦＣＳ （ウシ胎児血清） （ＳＩＧＭＡ）
トリプシン （ＳＩＧＭＡ）
【0044】
（ｃ）大腸上皮様器官の作製
α－ＤＫＯをエーテルで麻酔した後に解剖し、大腸を取り出した。大腸に付着した腸管膜を丁寧に取り除いた後、腸管を縦方向に切開した。ＰＢＳで腸管内容物を取り除いた後、腸管を約１ｃｍの長さに細分化した。細分化した大腸組織片を１０μＭ ＤＴＴを添加したＰＢＳで５分間洗浄した。デカンテーションにてＰＢＳを除き、組織片を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳを用いて、氷冷下で３０分間静置した。その後、ピペッティングで遊離した上皮細胞を顕微鏡で観察し、大腸陰窩が遊離するまで本操作を実施した。遊離した陰窩組織をａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２ (ａＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)で２回、洗浄した。陰窩細胞が５００個／５０μＬとなるようにＭａｔｒｉｇｅｌを加え、ピペッティングでよく撹拌した。撹拌したＭａｔｒｉｇｅｌ ５０μＬを２４穴ウエルに重層した後、１０分間室温放置することによってＭａｔｒｉｇｅｌを重合させた。その後、Ｎｏｇｇｉｎ－１（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１（５００ｎｇ／ｍＬ）、Ｗｎｔ３ａ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含む１０％ＦＣＳ／ａＤＭＥＭを５００μＬ添加し培養を行った。培養条件は、３７℃であり、培養液の交換は３日おきに実施した。培養２週間後、ピペッティングによる機械的操作によって腸管上皮様器官を細分化して継代培養を行った。
α－ＤＫＯをエーテルで麻酔した後に解剖し、大腸を取り出した。大腸に付着した腸管膜を丁寧に取り除いた後、腸管を縦方向に切開した。ＰＢＳで腸管内容物を取り除いた後、腸管を約１ｃｍの長さに細分化した。細分化した大腸組織片を１０μＭ ＤＴＴを添加したＰＢＳで５分間洗浄した。デカンテーションにてＰＢＳを除き、組織片を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳを用いて、氷冷下で３０分間静置した。その後、ピペッティングで遊離した上皮細胞を顕微鏡で観察し、大腸陰窩が遊離するまで本操作を実施した。遊離した陰窩組織をａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２ (ａＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)で２回、洗浄した。陰窩細胞が５００個／５０μＬとなるようにＭａｔｒｉｇｅｌを加え、ピペッティングでよく撹拌した。撹拌したＭａｔｒｉｇｅｌ ５０μＬを２４穴ウエルに重層した後、１０分間室温放置することによってＭａｔｒｉｇｅｌを重合させた。その後、Ｎｏｇｇｉｎ－１（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１（５００ｎｇ／ｍＬ）、Ｗｎｔ３ａ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含む１０％ＦＣＳ／ａＤＭＥＭを５００μＬ添加し培養を行った。培養条件は、３７℃であり、培養液の交換は３日おきに実施した。培養２週間後、ピペッティングによる機械的操作によって腸管上皮様器官を細分化して継代培養を行った。
【0045】
（ｄ）大腸上皮細胞株の取得
上記（ｃ）の方法で作製した大腸上皮様器官培養系からＭａｔｒｉｇｅｌを機械的に取り除き培養容器底面に接着した細胞に１０％ＦＣＳ／ａＤＭＥＭを５００μＬ加え培養を６週間まで続けた。伸展細胞にトリプシン溶液１００μＬを加えて細胞を培養容器から剥離（トリプシン処理）し、６ウエル培養容器に移し培養のスケールアップを行った。培養容器底面に単層化した細胞をトリプシン処理によって剥離し、限界希釈法（培養用プレートの１個のウエルに１個の細胞が入るように細胞浮遊液を希釈して培養することを繰り返すことにより単一のクローンを選別する方法）を用いて希釈した細胞を１細胞／ウエルとなるように９６ウエルプレートに加え細胞のクローン化を実施した。細胞増殖が観察されたウエルから細胞を分離して２４ウエルで培養し、６ウエルプレートに継代培養した。得られた細胞クローンのβ－ｃａｔｅｎｉｎの発現性を免疫染色で確認した。免疫染色は、抗β－ｃａｔｅｎｉｎ抗体を培養細胞に加えることにより行われた。免疫染色にて両抗原の発現が観察された細胞を上皮細胞株と判断した。クローン化した細胞を継代培養することによって、最終的に１クローンの大腸上皮細胞株が得られ、ｍｏｕｓｅ ｃｏｌｏｎｉｃ ｃｙｐｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（Ｍ３Ｃ： Ｍ３Ｃ－１Ｂ９) と命名した。
上記（ｃ）の方法で作製した大腸上皮様器官培養系からＭａｔｒｉｇｅｌを機械的に取り除き培養容器底面に接着した細胞に１０％ＦＣＳ／ａＤＭＥＭを５００μＬ加え培養を６週間まで続けた。伸展細胞にトリプシン溶液１００μＬを加えて細胞を培養容器から剥離（トリプシン処理）し、６ウエル培養容器に移し培養のスケールアップを行った。培養容器底面に単層化した細胞をトリプシン処理によって剥離し、限界希釈法（培養用プレートの１個のウエルに１個の細胞が入るように細胞浮遊液を希釈して培養することを繰り返すことにより単一のクローンを選別する方法）を用いて希釈した細胞を１細胞／ウエルとなるように９６ウエルプレートに加え細胞のクローン化を実施した。細胞増殖が観察されたウエルから細胞を分離して２４ウエルで培養し、６ウエルプレートに継代培養した。得られた細胞クローンのβ－ｃａｔｅｎｉｎの発現性を免疫染色で確認した。免疫染色は、抗β－ｃａｔｅｎｉｎ抗体を培養細胞に加えることにより行われた。免疫染色にて両抗原の発現が観察された細胞を上皮細胞株と判断した。クローン化した細胞を継代培養することによって、最終的に１クローンの大腸上皮細胞株が得られ、ｍｏｕｓｅ ｃｏｌｏｎｉｃ ｃｙｐｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（Ｍ３Ｃ： Ｍ３Ｃ－１Ｂ９) と命名した。
【0046】
実施例２ Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とマウス大腸がん細胞株（ＣＭＴ－９３）との比較
［１］材料及び方法
（ａ）細胞
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９
マウス大腸がん細胞 ＣＭＴ－９３
［１］材料及び方法
（ａ）細胞
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９
マウス大腸がん細胞 ＣＭＴ－９３
【0047】
（ｂ）試薬
（１）ＵＥＡ－１との反応性を測定するのに使用した試薬
ビオチン標識ＵＥＡ－１（ベクターラボラトリーズ）
ＢＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣキット（ベクターラボラトリーズ）
（２）免疫蛍光染色で用いた試薬
b－ｃａｔｅｎｉｎ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）
ＡｓｉａｌｏＧＭ１抗体
ＭＵＣ２抗体（Ａｂｃａｍ）
（１）ＵＥＡ－１との反応性を測定するのに使用した試薬
ビオチン標識ＵＥＡ－１（ベクターラボラトリーズ）
ＢＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣキット（ベクターラボラトリーズ）
（２）免疫蛍光染色で用いた試薬
b－ｃａｔｅｎｉｎ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）
ＡｓｉａｌｏＧＭ１抗体
ＭＵＣ２抗体（Ａｂｃａｍ）
【0048】
（ｃ）ＵＥＡ－１レクチン（ハリエニシダレクチン）との結合性
取得したＭ３Ｃ－１Ｂ９株と既存の大腸がん上皮細胞株であるＣＭＴ－９３株を用いて、ＵＥＡ－１レクチン（ハリエニシダレクチン）との結合性を比較した。
その結果、ＵＥＡ-１は、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株に結合性を示したが、ＣＭＴ－９３株とは結合しなかった（図１）。ＵＥＡ－１が正常大腸上皮細胞に強く発現していることから、今回取得したＭ３Ｃ－１Ｂ９株は既存のがん細胞株と比較してより正常大腸上皮細胞に近い性質を持った細胞株であると考えられた。
取得したＭ３Ｃ－１Ｂ９株と既存の大腸がん上皮細胞株であるＣＭＴ－９３株を用いて、ＵＥＡ－１レクチン（ハリエニシダレクチン）との結合性を比較した。
その結果、ＵＥＡ-１は、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株に結合性を示したが、ＣＭＴ－９３株とは結合しなかった（図１）。ＵＥＡ－１が正常大腸上皮細胞に強く発現していることから、今回取得したＭ３Ｃ－１Ｂ９株は既存のがん細胞株と比較してより正常大腸上皮細胞に近い性質を持った細胞株であると考えられた。
【0049】
（ｄ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株を用いて、糖脂質抗原であるＡｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現を免疫蛍光染色で確認した。
（免疫蛍光染色法の手順）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株ならびにＣＭＴ－９３株を８穴のチャンバースライドでコンフルーエントに至るまで培養した。細胞を１．５％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．２％トライトン－Ｘ添加１０ｍＭリン酸緩衝液(Ｔ－ＰＢＳ)で２回洗浄した。チャンバースライドに２％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)添加Ｔ－ＰＢＳ（ＢＳＡ/Ｔ－ＰＢＳ）を加え、ブロッキング操作を行った。溶液をアスピレーターで取り除いた後、ＢＳＡ/Ｔ－ＰＢＳで希釈したウサギ抗ＡｓｉａｌｏＧＭ１抗体またはウサギ抗ＭＵＣ２抗体を加え一昼夜4℃で振盪培養した。
その結果、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では、Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現が確認されたが、ＣＭＴ－９３株では観察されなかった（図２）。
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株を用いて、糖脂質抗原であるＡｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現を免疫蛍光染色で確認した。
（免疫蛍光染色法の手順）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株ならびにＣＭＴ－９３株を８穴のチャンバースライドでコンフルーエントに至るまで培養した。細胞を１．５％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．２％トライトン－Ｘ添加１０ｍＭリン酸緩衝液(Ｔ－ＰＢＳ)で２回洗浄した。チャンバースライドに２％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)添加Ｔ－ＰＢＳ（ＢＳＡ/Ｔ－ＰＢＳ）を加え、ブロッキング操作を行った。溶液をアスピレーターで取り除いた後、ＢＳＡ/Ｔ－ＰＢＳで希釈したウサギ抗ＡｓｉａｌｏＧＭ１抗体またはウサギ抗ＭＵＣ２抗体を加え一昼夜4℃で振盪培養した。
その結果、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では、Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現が確認されたが、ＣＭＴ－９３株では観察されなかった（図２）。
【0050】
（ｅ）ＭＵＣ２の発現
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株を用いて、大腸ムチンの主要な糖タンパク質であるＭＵＣ２の発現を免疫蛍光染色で確認した。免疫蛍光染色は、前記（ｄ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では、ＭＵＣ２の発現が確認されたが、ＣＭＴ－９３株では観察されなかった（図３）。
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株を用いて、大腸ムチンの主要な糖タンパク質であるＭＵＣ２の発現を免疫蛍光染色で確認した。免疫蛍光染色は、前記（ｄ）Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１の発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では、ＭＵＣ２の発現が確認されたが、ＣＭＴ－９３株では観察されなかった（図３）。
【0051】
（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅタンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
（ｃＤＮＡの作製方法）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株ならびにＣＭＴ－９３株よりＴＲＩ－ｓｏｌを用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡ１μｇからランダムプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡには、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を使用した。
（ＲＴ－ＰＣＲの方法）
作製したｃＤＮＡを鋳型としてＱＩＡＧＥＮ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、５０℃、３０分間、９５℃、１５分間の条件で逆転写反応を行った後、９４℃、２０秒、各プライマーセットのアニーリング温度で２０秒、７２℃で目的の増幅サイズに合わせた秒数を１サイクルとして、４５サイクル反応させた。
（使用したプライマー及びその配列）
ＧＡ１ ｓｙｎｔｈｅａｓｅ：Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５'－ＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＴ－３'（配列番号１），Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５'-ＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＧＧＴ－３'（配列番号２））
（測定条件等）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株ならびにＣＭＴ－９３株から調製し段階希釈したｃＤＮＡを鋳型に各プライマーを用いて定量的ＰＣＲ反応を実施した。スタンダードｃＤＮＡは正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの結腸上皮細胞から調製した総ＲＮＡを鋳型として作製したｃＤＮＡを使用した。各遺伝子発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量で割ることにより算出した。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量は２．４倍となった（図４）。
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅタンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
（ｃＤＮＡの作製方法）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株ならびにＣＭＴ－９３株よりＴＲＩ－ｓｏｌを用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡ１μｇからランダムプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡには、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を使用した。
（ＲＴ－ＰＣＲの方法）
作製したｃＤＮＡを鋳型としてＱＩＡＧＥＮ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、５０℃、３０分間、９５℃、１５分間の条件で逆転写反応を行った後、９４℃、２０秒、各プライマーセットのアニーリング温度で２０秒、７２℃で目的の増幅サイズに合わせた秒数を１サイクルとして、４５サイクル反応させた。
（使用したプライマー及びその配列）
ＧＡ１ ｓｙｎｔｈｅａｓｅ：Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５'－ＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＴ－３'（配列番号１），Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５'-ＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＧＧＴ－３'（配列番号２））
（測定条件等）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株ならびにＣＭＴ－９３株から調製し段階希釈したｃＤＮＡを鋳型に各プライマーを用いて定量的ＰＣＲ反応を実施した。スタンダードｃＤＮＡは正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの結腸上皮細胞から調製した総ＲＮＡを鋳型として作製したｃＤＮＡを使用した。各遺伝子発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量で割ることにより算出した。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量は２．４倍となった（図４）。
【0052】
（ｇ）ＦＵＴ２の発現
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＦＵＴ２タンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、前記（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量は１０．７倍となった（図５）。
（使用したプライマー）
ＦＵＴ２：ＱＴ００１６０９０９（ＱＩＡＧＥＮ）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＦＵＴ２タンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、前記（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＦＵＴ２のｍＲＮＡ発現量は１０．７倍となった（図５）。
（使用したプライマー）
ＦＵＴ２：ＱＴ００１６０９０９（ＱＩＡＧＥＮ）
【0053】
（ｈ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ－１）の発現
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＮＡＤＰＨオキシダーゼタンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＮＡＤＰＨオキシダーゼのｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのｍＲＮＡ発現量は１６．０倍となった（図６）。
（使用したプライマー）
ＮＯＸ－１：ＱＴ００１４００９１（ＱＩＡＧＥＮ）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＮＡＤＰＨオキシダーゼタンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＮＡＤＰＨオキシダーゼのｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのｍＲＮＡ発現量は１６．０倍となった（図６）。
（使用したプライマー）
ＮＯＸ－１：ＱＴ００１４００９１（ＱＩＡＧＥＮ）
【0054】
（ｉ）ＴＬＲ５の発現
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＴＬＲ５タンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量は１７００倍となった（図７）。
（使用したプライマー）
ＴＬＲ５：ＱＴ００２６２５４９（ＱＩＡＧＥＮ）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＴＬＲ５タンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＴＬＲ５のｍＲＮＡ発現量は１７００倍となった（図７）。
（使用したプライマー）
ＴＬＲ５：ＱＴ００２６２５４９（ＱＩＡＧＥＮ）
【0055】
（ｊ）ＬＬ３７の発現
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＬＬ３７タンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量は７０．０倍となった（図８）。
（使用したプライマー）
ＬＬ３７：ＱＴ００２４１６０３（ＱＩＡＧＥＮ）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＬＬ３７タンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＬＬ３７のｍＲＮＡ発現量は７０．０倍となった（図８）。
（使用したプライマー）
ＬＬ３７：ＱＴ００２４１６０３（ＱＩＡＧＥＮ）
【0056】
（ｋ）ＣＤ１３０の発現
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＣＤ１３０タンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量は４．６倍となった。（図９）。
（使用したプライマー）
ＣＤ１３０：ＱＴ００１０６４５６（ＱＩＡＧＥＮ）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＣＤ１３０タンパク質のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＣＤ１３０のｍＲＮＡ発現量は４．６倍となった。（図９）。
（使用したプライマー）
ＣＤ１３０：ＱＴ００１０６４５６（ＱＩＡＧＥＮ）
【0057】
（ｌ）経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株の経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）を比較した。
ＴＥＥＲ値の測定は、トランスウェルで単層培養したＭ３Ｃ-１Ｂ９細胞の管腔側と基底側に電極を挿入することにより測定され、その抵抗値（Ω/cm2）で数値化した。
その結果、ＣＭＴ－９３株のＴＥＥＲ値は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＴＥＥＲ値は３．２倍となった（図１０）。
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株の経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ値）を比較した。
ＴＥＥＲ値の測定は、トランスウェルで単層培養したＭ３Ｃ-１Ｂ９細胞の管腔側と基底側に電極を挿入することにより測定され、その抵抗値（Ω/cm2）で数値化した。
その結果、ＣＭＴ－９３株のＴＥＥＲ値は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、ＴＥＥＲ値は３．２倍となった（図１０）。
【0058】
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、正常大腸上皮細胞への発現が確認されているＣｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＣｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量は１５３８倍となった（図１１）。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＣｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量は低かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では高く、Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量は１５３８倍となった（図１１）。
【0059】
Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株とＣＭＴ－９３株から作製したｃＤＮＡを用いて、大腸がん粘膜上皮細胞で発現が確認されているＣｌａｕｄｉｎ－２のｍＲＮＡ発現量を定量化ＲＴ－ＰＣＲ法で解析した。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＣｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量は高かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では低く、Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量は１／４．２倍となった（図１２）。
ｃＤＮＡの作製及びＲＴ－ＰＣＲは、（ｆ）ＧＡ１ ｓｙｎｔｈａｓｅの発現の欄に記載の方法、条件にて行った。
その結果、ＣＭＴ－９３株でのＣｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量は高かったが、Ｍ３Ｃ－１Ｂ９株では低く、Ｃｌａｕｄｉｎ－１のｍＲＮＡ発現量は１／４．２倍となった（図１２）。
【0060】
これらＣＭＴ－９３株との比較結果から、Ｍ３Ｃ－1Ｂ９株は、がん細胞よりも正常細胞に近い性質を持った細胞であると言える。これら細胞株を使用することで、当該細胞株を用いてがん予防剤をスクリーニングすることができる。また、大腸がんの発がん過程の解明に用いることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】