特開 2023-146921 胎児感染の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023146921

(43)【公開日】2023-10-12

(54)【発明の名称】胎児感染の検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/689 20180101AFI20231004BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20231004BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20231004BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20231004BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20231004BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20231004BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231004BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/689 Z

C12Q1/686 Z ZNA

G01N33/50 Z

G01N33/569 B

G01N33/53 M

C12Q1/6851 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022054362

(22)【出願日】2022-03-29

(71)【出願人】

【識別番号】598015084

【氏名又は名称】学校法人福岡大学

(71)【出願人】

【識別番号】510136312

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立成育医療研究センター

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100145104

【弁理士】

【氏名又は名称】膝舘 祥治

(72)【発明者】

【氏名】宮本 新吾

(72)【発明者】

【氏名】漆山 大知

(72)【発明者】

【氏名】秦 健一郎

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045AA28

2G045CB30

2G045DA12

2G045DA13

2G045DA14

2G045FB01

2G045FB02

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ03

4B063QQ06

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】胎児感染の検出方法を提供する。
【解決手段】妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価することと、前記細菌量に基づいて、前記試料と対象における胎児感染とを関連付けることと、を含む胎児感染の検出方法である。前記細菌量の評価は、定量ＰＣＲ法で行われてよく、前記試料中の１６Ｓリボソーム遺伝子のコピー数を測定することを含んでいてよい。試料は、対象の羊水に由来してよい。
【選択図】図１０Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価することと、
前記細菌量に基づいて、前記試料と対象における胎児感染とを関連付けることと、を含む胎児感染の検出方法。

【請求項2】

妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価することと、
前記細菌量に基づいて、前記試料と対象における子宮内感染とを関連付けることと、を含む妊娠転機の診断を補助する方法。

【請求項3】

前記細菌量の評価は、定量ＰＣＲ法で行われる請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記細菌量の評価は、前記試料中の１６Ｓリボソーム遺伝子のコピー数を測定することを含む請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記試料は、対象の羊水に由来する請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、胎児感染の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

早産は、新生児の罹病および５歳未満の小児の死亡の主な原因であり、在胎期間が短いほど、顕著にリスクが増す。早産の少なくとも４０％は子宮内感染に関連していると考えられている。子宮内感染では、絨毛膜羊膜炎、羊水感染を経て、胎児感染へと進行すると考えられる。胎児感染では、胎児炎症反応性症候群（ＦＩＲＳ）等のリスクが高まるため、迅速な対応が求められる。

【0003】

胎児感染を産前に診断する方法としては、臍帯穿刺を行なって胎児の血中サイトカインレベルを測定する方法がある。しかし、臍帯穿刺は侵襲的であるため利用に制限がある。これに関連して、羊水中のマトリックスメタロプロテアーゼ－８の濃度を測定して胎児感染を診断する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。一方、妊婦に由来する試料から特定の微生物を検出することを含む絨毛膜羊膜炎の検出方法が提案されている（例えば、特許文献２及び３参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特表２００４－５２２９４２号公報

【特許文献2】特開２０１７－２０９０６３号公報

【特許文献3】国際公開第２０２１／１１２２３７号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、胎児感染の検出方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。第一態様は、妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価することと、評価した細菌量に基づいて、試料と対象における胎児感染とを関連付けることと、を含む胎児感染の検出方法である。

【0007】

第二態様は、妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価することと、評価した細菌量に基づいて、試料と対象における子宮内感染とを関連付けることと、を含む妊娠転機の診断を補助する方法である。

【0008】

細菌量の評価は、定量ＰＣＲ法で行われてよく、試料中の１６Ｓリボソーム遺伝子のコピー数を測定することを含んでいてよい。また、試料は妊娠中の対象の羊水に由来するものであってよい。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、胎児感染の検出方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージと羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図2A】絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩＩ群と羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図2B】絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩＩ群についてのＲＯＣ曲線である。

【図3A】絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩ－ＩＩＩ群と羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図3B】絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩ－ＩＩＩ群についてのＲＯＣ曲線である。

【図4A】絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩ－ＩＩＩ群と羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図4B】絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩ－ＩＩＩ群についてのＲＯＣ曲線である。

【図5A】羊水穿刺後の妊娠延長期間が１日未満の症例群と羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図5B】羊水穿刺後の妊娠延長期間が１日未満の症例群についてのＲＯＣ曲線である。

【図6A】羊水穿刺後の妊娠延長期間が１日以下の症例群と羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図6B】水穿刺後の妊娠延長期間が１日以下の症例群についてのＲＯＣ曲線である。

【図7A】羊水穿刺後の妊娠延長期間が７日以下の症例群と羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図7B】水穿刺後の妊娠延長期間が７日以下の症例群についてのＲＯＣ曲線である。

【図8A】胎児炎症反応性症候群と羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図8B】胎児炎症反応性症候群についてのＲＯＣ曲線である。

【図9A】新生児感染と羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図9B】新生児感染についてのＲＯＣ曲線である。

【図10A】胎児感染と羊水中の細菌量との関係を示す図である。

【図10B】胎児感染についてのＲＯＣ曲線である。

【図11】羊水中の細菌量による子宮内感染のグレードと絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージとの関係を示す図である。

【図12】羊水中の細菌量による子宮内感染のグレードと妊娠転帰の指標との関係を示す図である。

【図13】羊水中の細菌量による子宮内感染のグレードと妊娠転帰の指標との関係を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書に記載される数値範囲の上限及び下限は、当該数値を任意に選択して組み合わせることが可能である。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、胎児感染の検出方法及び妊娠転機の診断を補助する方法を例示するものであって、本発明は、以下に示す胎児感染の検出方法及び妊娠転機の診断を補助する方法に限定されない。

【0012】

胎児感染の検出方法
胎児感染の検出方法は、妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価する第１工程と、評価された細菌量に基づいて、試料と対象における胎児感染とを関連付ける第２工程と、を含む。胎児感染の検出方法は、胎児感染を診断することを補助する方法であってもよい。

【0013】

試料中に含まれる細菌量に基づいて胎児感染を検出することで、妊娠の転機を予測、診断して、的確な治療方針を選択することが可能になる。これにより、母児の予後向上が期待できる。試料中の細菌量の測定は迅速に行うことができることから、妊娠の転機を予測、診断を迅速に行うことが可能になる。

【0014】

第１工程
第１工程では、妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価する。対象はヒトの妊婦であればよく、例えば、周産期の妊婦であってよく、切迫早産、子宮内感染等が懸念される周産期の妊婦であってよい。試料は、子宮内感染に関連する細菌を検出可能な試料であればよく、例えば膣スワブ、羊水、血液、臍帯血等から調製することができる。好ましくは、試料は羊水から調製することができる。

【0015】

試料中の細菌量は、絶対定量により得られる値であってよく、半定量により得られる値であってよい。試料中の細菌量は、例えば以下のようにして定量することができる。試料からＤＮＡを抽出することと、抽出されたＤＮＡを鋳型とし、細菌に特異的な塩基配列を増幅対象領域とするプライマーセットを用いて定量ＰＣＲを実施することとを含む分析方法により、試料中の細菌量を定量することができる。定量ＰＣＲによって得られる細菌量は、例えば増幅されたオリゴヌクレオチドのコピー数であってよい。

【0016】

試料からのＤＮＡの抽出は、当該技術分野で慣用されているＤＮＡ抽出方法によって実施することができる。例えば、無菌的に採取された羊水を、低速遠心分離して胎脂等を除去した後、ガラスビーズ等を用いるビーズ処理によって物理的に細胞を破砕して溶菌し、市販のＤＮＡ抽出キット等を用いて試料に含まれるＤＮＡを抽出することができる。

【0017】

細菌に特異的な塩基配列としては、例えば１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を対象とすることができる。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットを用いることで増幅することができる。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットの増幅対象領域は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１からＶ９のすべての可変領域のいずれであってもよく、例えば、Ｖ１領域とＶ２領域を挟む保存領域を増幅対象領域とすることができる。

【0018】

定量ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅産物を定量的に得られる手法であればよく、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等の公知の手法を用いることができる。試料中の細菌量は、例えばデジタルＰＣＲを用いてＥｖａＧｒｅｅｎ法で定量される絶対定量値であってよい。

【0019】

第２工程
第２工程では、評価された細菌量に基づいて、試料と対象における胎児感染とを関連付ける。第２工程は、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に胎児感染の検出と試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合に胎児感染の非検出と試料とを関連付けてよい。また、第２工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に胎児感染しているとの診断を補助し、細菌量が所定値未満の場合に胎児感染に至っていないとの診断を補助してよい。

【0020】

胎児感染が発生している対象には、必要に応じて抗菌剤等による治療介入、妊娠帰結等の処置を実施してもよい。すなわち、本発明は、胎児感染を検出することと検出された胎児感染を処置することとを含む胎児感染の処置方法をも包含してよく、胎児感染の処置を補助する方法を包含していてもよい。

【0021】

ここで、第２工程で用いられるカットオフ値は、例えばＲＯＣ曲線を用いて、所望の感度、特異度、Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ等が得られるように適宜設定すればよく、Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘを指標としてカットオフ値を設定してよい。カットオフ値として具体的には例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１０万以上、又は１００万以上であってよい。

【0022】

妊娠転機の診断を補助する方法
妊娠転機の診断を補助する方法は、妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価する第１工程と、評価された細菌量に基づいて、試料と対象における子宮内感染とを関連付ける第３工程と、を含む。

【0023】

試料中に含まれる細菌量に基づいて子宮内感染の状態を検出することで、妊娠の転機を予測、診断を補助することができる。これにより、的確な治療方針を選択することが可能になり、母児の予後向上が期待できる。

【0024】

第１工程では妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価する。妊娠転機の診断を補助する方法における第１工程の詳細は、胎児感染の検出方法における第１工程と同様であり、好ましい態様も同様である。

【0025】

第３工程では、評価された細菌量に基づいて、試料と対象における子宮内感染とを関連付ける。関連付けられる子宮内感染の状態としては、絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージ、試料採取後の妊娠延長期間、胎児炎症反応性症候群（ＦＩＲＳ）、新生児感染症、胎児感染等であってよい。また、試料と関連付けられる子宮内感染の状態は、子宮内感染の程度を評価する評価値（グレード）であってもよい。

【0026】

第３工程においては、第１工程で評価された細菌量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージとを関連付けてよい。ここで絨毛膜羊膜炎とは、胎児付属物である卵膜に細菌が感染して生じる炎症性疾患のことである。絨毛膜羊膜炎は、早産を引き起こす病態であり、また出生後の児の予後、例えば、中枢神経系障害、慢性呼吸障害等の後遺症と密接に関わっているとされる。絨毛膜羊膜炎の診断は、分娩後の胎盤病理検査で確定されるが、妊娠経過中においては臨床的診断と、顆粒球エラスターゼ等の早産マーカーを用いて診断がおこなわれている。しかし、これらの方法では絨毛膜羊膜炎の検出に対する感度が低く、早期発見が困難である。

【0027】

第１工程で評価された細菌量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージとを関連付けることで、妊娠中の対象における絨毛膜羊膜炎の発症状態を迅速に診断することができる。また、試料に含まれる細菌を同定する必要がないため、より簡便に絨毛膜羊膜炎の発症状態を診断することができる。

【0028】

第３工程では、第１工程で評価された細菌量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩＩＩとを関連付けてよい。Ｂｌａｎｃ分類のステージＩＩＩは、胎盤の組織学的診断で炎症が羊膜まで波及している段階である。第３工程では、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に、絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩＩＩに相当することと試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合にＢｌａｎｃ分類のステージＩＩＩ未満であることと試料とを関連付けてよい。また、第３工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に、絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩＩＩに相当するとの診断を補助してよい。

【0029】

試料と絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩＩＩとを関連付けるカットオフ値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１００万以上であってよい。

【0030】

第３工程では、第１工程で評価された細菌量に基づいて、試料と、絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩＩ又はＩＩＩに相当することとを関連付けてよい。Ｂｌａｎｃ分類のステージＩＩは、胎盤の組織学的診断で炎症が絨毛膜まで波及している段階である。第３工程では、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に、絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩＩ又はＩＩＩに相当することと試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合にＢｌａｎｃ分類のステージＩＩ未満に相当することと試料とを関連付けてよい。また、第３工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に、絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩＩ又はＩＩＩに相当するとの診断を補助してよい。

【0031】

絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩＩ又はＩＩＩに相当することと試料とを関連付けるカットオフ値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として、２万以上、又は２万５千以上であってよい。

【0032】

第３工程では、第１工程で評価された細菌量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩからＩＩＩのいずれかに相当することとを関連付けてよい。Ｂｌａｎｃ分類のステージＩは、胎盤の組織学的診断で炎症が絨毛膜下に留まっている段階である。第３工程では、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に、絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩからＩＩＩのいずれかに相当することと試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合にＢｌａｎｃ分類のステージＩ未満に相当することと試料とを関連付けてよい。また、第３工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に、絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩからＩＩＩのいずれかに相当するとの診断を補助してよい。

【0033】

絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類のステージＩからＩＩＩのいずれかに相当することと試料とを関連付けるカットオフ値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１万以上であってよい。

【0034】

第３工程では、第１工程で評価された細菌量に基づいて、試料と試料採取後の妊娠延長期間とを関連付けてよい。例えば第３工程では、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に、試料採取後の妊娠延長可能な期間が１日未満であることと試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合に、試料採取後の妊娠延長可能な期間が１日以上であることと試料とを関連付けてよい。また、第３工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に、試料採取後の妊娠延長可能な期間が１日未満であるとの診断を補助してよい。

【0035】

妊娠延長可能な期間が１日未満であることと試料とを関連付けるカットオフ値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として５０００以上、１万以上、又は１００万以上であってよい。

【0036】

また例えば、第３工程では、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に、試料採取後の妊娠延長可能な期間が１日以下であることと試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合に、試料採取後の妊娠延長可能な期間が日を超えることと試料とを関連付けてよい。また、第３工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に、試料採取後の妊娠延長可能な期間が１日以下であるとの診断を補助してよい。

【0037】

妊娠延長可能な期間が１日以下であることと試料とを関連付けるカットオフ値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１万以上、又は１００万以上であってよい。

【0038】

また例えば、第３工程では、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に、試料採取後の妊娠延長可能な期間が７日以下であることと試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合に、試料採取後の妊娠延長可能な期間が７日を超えることと試料とを関連付けてよい。また、第３工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に、試料採取後の妊娠延長可能な期間が７日以下であるとの診断を補助してよい。

【0039】

妊娠延長可能な期間が７日以下であることと試料とを関連付けるカットオフ値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１万以上であってよい。

【0040】

第３工程では、第１工程で評価された細菌量に基づいて、胎児炎症反応性症候群（ＦＩＲＳ）であることと試料とを関連付けてよい。胎児炎症反応性症候群は、例えば出生直後の児の白血球数が２万／μＬ以上であることと対応する。例えば第３工程では、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に、胎児炎症反応性症候群（ＦＩＲＳ）であることと試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合に、胎児炎症反応性症候群ではないことと試料とを関連付けてよい。また、第３工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に、胎児炎症反応性症候群であるとの診断を補助してよい。

【0041】

胎児炎症反応性症候群であることと試料とを関連付けるカットオフ値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１万以上、１０万以上、又は４０万以上であってよい。

【0042】

第３工程では、第１工程で評価された細菌量に基づいて、試料と新生児感染症とを関連付けてよい。新生児感染症は、例えば出生直後の児に抗菌薬の投与を必要としたことと対応する。例えば第３工程では、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に、新生児感染症であることと試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合に、新生児感染症ではないことと試料とを関連付けてよい。また、第３工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に、新生児感染症であるとの診断を補助してよい。

【0043】

新生児感染症であることと試料とを関連付けるカットオフ値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として９万以上、又は１０万以上であってよい。

【0044】

第３工程では、第１工程で評価された細菌量に基づいて、試料と胎児感染とを関連付けてよい。胎児感染は、例えば出生後の臍帯炎の病理学的所見と対応する。例えば第３工程では、試料に含まれる細菌量が所定値（カットオフ値）以上の場合に、胎児感染していることと試料とを関連づけ、細菌量が所定値未満の場合に、胎児感染に至っていないことと試料とを関連付けてよい。また、第３工程は、試料に含まれる細菌量が所定値以上の場合に、胎児感染しているとの診断を補助してよい。

【0045】

胎児感染していることと試料とを関連付けるカットオフ値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１０万以上、３０万以上、又は１００万以上であってよい。

【0046】

第３工程では、第１工程で評価された細菌量に基づいて、子宮内感染の状態を評価する評価値（グレード）と試料とを関連付けてよい。子宮内感染の状態は、例えば以下のグレード０からグレード３の４段階に分類することができる。グレード０は、無菌的又は制菌状態である。グレード０では、試料採取後の妊娠延長期間が長く、胎児感染や新生児感染のリスクが少ないため、安全に長期間の妊娠延長が可能である。グレード１は、胎児感染又は新生児感染のリスクがまだ少ない状態である。グレード１では、試料採取後の妊娠延長期間は短い傾向があるが、抗菌薬治療が奏功すれば、コントロールできる可能性が高い。グレード２は、胎児感染又は新生児感染のリスクが比較的高い状態である。グレード２では、試料採取後の妊娠延長期間は短く、直ちに抗菌薬治療が奏功しない場合は早急な妊娠帰結が望まれる。グレード３は、胎児感染又は羊水感染のリスクが非常に高い状態である。グレード３では、妊娠延長できる可能性が非常に低いため、早急な妊娠帰結が望まれる。以上のように、第１工程で評価された細菌量に基づいて、子宮内感染の状態を分類評価することで、妊娠転帰の診断を補助することができる。

【0047】

第３工程では、試料に含まれる細菌量が第１の値未満の場合に、妊娠している対象をグレード０と診断し、第１の値以上第２の値未満の場合に、妊娠している対象をグレード１と診断し、第２の値以上第３の値未満の場合に、妊娠している対象をグレード２と診断し、第３の値以上の場合に、妊娠している対象をグレード３と診断してよい。第１の値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１万以上であってよい。第２の値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１０万以上であってよい。第３の値は、例えば、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数として１００万以上であってよい。

【0048】

第３工程のおける、子宮内感染の状態を評価する評価値（グレード）と試料との関連付けは、上記の４段階に限られず、上記のグレード０と、グレード１－２と、グレード３の３段階であってもよい。

【0049】

子宮内感染の処置方法
子宮内感染の処置方法は、妊娠中の対象に由来する試料に含まれる細菌量を評価することと、評価された細菌量に基づいて、試料と対象における子宮内感染の状態とを関連付けることと、関連付けられた子宮内感染の状態に基づいて、子宮内感染のリスクが高い対象を処置することと、を含む。

【0050】

子宮内感染のリスクが高い対象に必要に応じた処置を施すことで、早産の抑制、妊娠期間の延長、母体感染の抑制、新生児感染の抑制、胎児炎症反応症候群・新生児髄膜炎・新生児慢性肺疾患・脳室周囲白質軟化症・脳性麻痺・発達遅滞などの新生児疾患の抑制、障がい者の発生抑制、医療費・社会保障費の抑制、子育て世代の社会進出促進等の効果を得ることができる。ここで対象に応じた処置とは、子宮内感染について施される何らかの処置であればよく、例えば、感染症の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防、感染症に起因する症状の緩和等が挙げられる。具体的には、例えば、抗菌薬剤の投与、妊娠帰結等が挙げられる。

【実施例0051】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0052】

参考例
福岡大学病院に切迫早産の診断で入院し、妊娠２４週以降３４週未満で入院管理中に、子宮内感染を疑って羊水穿刺を行い、分娩後に胎盤、臍帯の組織学的検索を実施した６９症例を対象とした。対象からは書面でのインフォームドコンセントに同意を受けた。分娩後の胎盤の病理検査の結果では、絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩＩが３１例、ステージＩＩが２５例、ステージＩが８例、ステージ０が５例であった。

【0053】

羊水穿刺により無菌的に得た羊水１ｍＬについて低速遠心分離により、大きな細胞および胎脂を除去した。各検体に含まれる細菌を、Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｅ Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりガラスビーズを用いて溶菌し、ＱＩＡａｍｐ ＵＣＰ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により各検体に含まれるＤＮＡを抽出した。

【0054】

段階希釈したＤＮＡ試料の１μＬを、ドロップレットデジタルＰＣＲ（バイオラッド社製）にインプットし、ドロップレット作製時に２２μＬに希釈した。以下に示す１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１及びＶ２領域に対するユニバーサルプライマーセットを用い、メーカー推奨のプロトコールに準じて定量ＰＣＲを行った。増副産物の定量は、ＥｖａＧｒｅｅｎ法によって行った。また、ネガティブコントロール（Ｂｌａｎｋ）としてＤＮＡ抽出溶液を用い、ポジティブコントロール（Ｎｏｒｍａｌ ＡＦ）として複数回計測済みの正常羊水を用いた。

【0055】

【表1】

【0056】

絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージと、羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数との関係を図１に示す。なお、有意差検定は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔで実施した。

【0057】

図１に示すように、ステージＩＩＩ群とステージＩＩ群は、ステージ０からＩ群、ポジティブコントロール群及びネガティブコントロール群と比べて、有意にコピー数が多かった。ポジティブコントロール群は、ネガティブコントロール群よりも有意にコピー数が多かった。また、胎盤の炎症状態と羊水中の細菌量とが相関することがわかる。さらに、妊娠初期の正常羊水でも、必ずしも無菌とは限らないことが分かる。

【0058】

実施例１
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩＩ群及びそれ以外の症例群を比較検討した。結果を図２Ａに示す。また、ＲＯＣ曲線を図２Ｂに示す。

【0059】

【表2】

【0060】

【表3】

【0061】

図２Ａから、絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩＩ群は、それ以外の症例群と比べて、有意にコピー数が多かった。また、１００万をカットオフ値とすることで、感度８１％、特異度８４％を達成できた。

【0062】

実施例２
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩ及びＩＩＩ群と、それ以外の症例群とを比較検討した。結果を図３Ａに示す。また、ＲＯＣ曲線を図３Ｂに示す。

【0063】

【表4】

【0064】

【表5】

【0065】

図３Ａから、絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩ－ＩＩＩ群は、それ以外の症例群と比べて、有意にコピー数が多かった。また、２５０００をカットオフ値とすることで、感度７５％、特異度７７％を達成できた。

【0066】

実施例３
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩからＩＩＩ群と、それ以外の症例群とを比較検討した。結果を図４Ａに示す。また、ＲＯＣ曲線を図４Ｂに示す。

【0067】

【表6】

【0068】

【表7】

【0069】

図４Ａから、絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩ－ＩＩＩ群は、それ以外の症例群と比べて、有意にコピー数が多かった。また、１万をカットオフ値とすることで、感度７７％、特異度８０％を達成できた。

【0070】

実施例４
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、羊水穿刺後の妊娠延長期間が１日未満の症例群と、それ以外の症例群とを比較検討した。結果を図５Ａに示す。また、ＲＯＣ曲線を図５Ｂに示す。

【0071】

【表8】

【0072】

【表9】

【0073】

図５Ａから、羊水穿刺後の妊娠延長期間が１日未満の症例群は、それ以外の症例群と比べて、有意にコピー数が多かった。また、５０００をカットオフ値とすることで、感度９２％、特異度４５％を達成できた。また１万をカットオフ値とすることで、感度８７％、特異度４８％を達成できた。さらに１００万をカットオフ値とすることで、感度５５％、特異度７１％を達成できた。

【0074】

実施例５
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、羊水穿刺後の妊娠延長期間が１日以下の症例群と、それ以外の症例群とを比較検討した。結果を図６Ａに示す。また、ＲＯＣ曲線を図６Ｂに示す。

【0075】

【表10】

【0076】

【表11】

【0077】

図６Ａから、羊水穿刺後の妊娠延長期間が１日以下の症例群は、それ以外の症例群と比べて、有意にコピー数が多かった。また、１万をカットオフ値とすることで、感度８４％、特異度６３％を達成できた。また、１００万をカットオフ値とすることで、感度５０％、特異度７４％を達成できた。

【0078】

実施例６
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、羊水穿刺後の妊娠延長期間が７日以下の症例群と、それ以外の症例群とを比較検討した。結果を図７Ａに示す。また、ＲＯＣ曲線を図７Ｂに示す。

【0079】

【表12】

【0080】

【表13】

【0081】

図７Ａから、羊水穿刺後の妊娠延長期間が７日以下の症例群は、それ以外の症例群と比べて、有意にコピー数が多かった。また、1万をカットオフ値とすることで、感度７４％、特異度７５％を達成できた。

【0082】

実施例７
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、出生直後の児の白血球数（ｎＷＢＣ）が２万／μＬ以上であった症例群（ＦＩＲＳに相当）と、それ以外の症例群とを比較検討した。結果を図８Ａに示す。また、ＲＯＣ曲線を図８Ｂに示す。

【0083】

【表14】

【0084】

【表15】

【0085】

図８Ａから、出生直後の児の白血球数が２万／μＬ以上であった症例群は、それ以外の症例群と比べて、有意にコピー数が多かった。また、４４万をカットオフ値とすることで、感度７７％、特異度６４％を達成できた。

【0086】

実施例８
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、出生直後に抗菌薬投与が必要とされた症例群（新生児感染群）と、それ以外の症例群とを比較検討した。結果を図９Ａに示す。また、ＲＯＣ曲線を図９Ｂに示す。

【0087】

【表16】

【0088】

【表17】

【0089】

図９Ａから、胎児感染群は、それ以外の症例群と比べて、有意にコピー数が多かった。また、１０万をカットオフ値とすることで、感度７１％、特異度８８％を達成できた。

【0090】

実施例９
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、出生後の臍帯炎の所見が認められた症例群（胎児感染群）と、それ以外の症例群とを比較検討した。結果を図１０Ａに示す。また、ＲＯＣ曲線を図１０Ｂに示す。

【0091】

【表18】

【0092】

【表19】

【0093】

図１０Ａから、胎児感染群は、それ以外の症例群と比べて、有意にコピー数が多かった。また、１０万をカットオフ値とすることで、感度８６％、特異度６８％を達成できた。さらに１００万をカットオフ値とすることで、感度６９％、特異度８２％を達成できた。

【0094】

実施例１０
羊水１ｍＬ中の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコピー数について、１万、１０万及び１００万をカットオフ値として、４段階のグレードに分類して子宮内感染の状態を評価した。各グレードと絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージとの関係を図１１に示す。また、各グレードと、種々の妊娠転帰の指標との関係を表２０及び２１、図１２及び図１３に示す。表中、ＣＡＭ（ＳｔａｇｅＩＩＩ）は絨毛膜羊膜炎のＢｌａｎｃ分類ステージＩＩＩの症例を意味する。Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ＜２４ｈは、羊水穿刺後の妊娠延長期間が１日未満であった症例を意味する。Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ＜４８ｈは、羊水穿刺後の妊娠延長期間が１日以下であった症例を意味する。ｎＷＢＣ＞２００００／μｌは、出生直後の児の白血球数が２００００／μＬ以上であった症例を意味する。ｎＣＲＰ＞０ｍｇ／ｄＬは、出生直後の新生児の血清において炎症マーカーであるＣ反応性蛋白が陽性であった症例を意味する。Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｆｏｒ ｎｅｗｂｏｒｎは、出生直後の児に抗菌薬投与が必要であった症例を意味する。Ｆｕｎｉｓｉｔｉｓは、分娩後に臍帯炎の所見が認められた症例を意味する。

【0095】

【表20】

【0096】

【表21】

【0097】

グレード３は高い確率で、４８時間以内に分娩となり、重度の絨毛膜羊膜炎、臍帯炎（胎児感染の病理学的所見）をきたしていた。グレード０は高い確率で、重度の絨毛膜羊膜炎を来した症例はなく、臍帯炎（胎児感染）例も６％と低かった。グレード１－２は高い確率で４８時間以内に分娩となり、臍帯炎（胎児感染）例は約半数であった。さらにグレード１よりもグレード２の方が臍帯炎（胎児感染）例の頻度が２４％上昇した（グレード１：３０％，グレード２：５８％）。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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