(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023152619
(43)【公開日】2023-10-17
(54)【発明の名称】カルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー及び応用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/48 20060101AFI20231005BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20231005BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231005BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20231005BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20231005BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20231005BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231005BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231005BHJP
A61K 31/454 20060101ALI20231005BHJP
A61K 31/5415 20060101ALI20231005BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231005BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20231005BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/48 Z
C12N15/113 Z ZNA
A61P25/28
A61P25/16
A61P27/06
A61P21/02
A61K45/00
A61K48/00
A61K31/454
A61K31/5415
A61K31/7088
A61K31/7105
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022174533
(22)【出願日】2022-10-31
(31)【優先権主張番号】202210351580.3
(32)【優先日】2022-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522426548
【氏名又は名称】首都医科大学
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＰＩＴＡＬ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１０，Ｘｉｔｏｕｔｉａｏ，Ｙｏｕ’ａｎｍｅｎｗａｉ，Ｆｅｎｇｔａｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００６９，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000291
【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】劉 ▲レイ▼
(72)【発明者】
【氏名】▲ゴン▼ 芳燕
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ27
4B063QS36
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA02
4C084ZA16
4C084ZA33
4C084ZA94
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC39
4C086BC89
4C086GA07
4C086GA10
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA16
4C086ZA33
4C086ZA94
(57)【要約】 （修正有）
【課題】カルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー及び応用を提供する。
【解決手段】一態様において、高齢関連神経変性疾患の治療用薬物の調製及び疾患検出方法におけるカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカーの応用であって、該マーカーが過剰リン酸化ＴＬＫ２であることを特徴とするマーカーであり、ＴＬＫ２阻害薬物、ＴＬＫ２のＲＮＡ干渉因子、ＴＬＫ２ノックアウト因子又はＴＬＫ２がノックアウトされたＲＮＡ干渉因子を更に含む、カルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカーの応用を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】一態様において、高齢関連神経変性疾患の治療用薬物の調製及び疾患検出方法におけるカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカーの応用であって、該マーカーが過剰リン酸化ＴＬＫ２であることを特徴とするマーカーであり、ＴＬＫ２阻害薬物、ＴＬＫ２のＲＮＡ干渉因子、ＴＬＫ２ノックアウト因子又はＴＬＫ２がノックアウトされたＲＮＡ干渉因子を更に含む、カルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカーの応用を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
様々な高齢関連神経変性疾患の治療用薬物の調製及び疾患検出方法におけるカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカーの応用。
【請求項2】
疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症又は緑内障を含むが、これらに限定されないことを特徴とする請求項１に記載の応用。
【請求項3】
マーカーは、過剰リン酸化ＴＬＫ２であることを特徴とするカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー。
【請求項4】
ＴＬＫ２阻害薬物、ＴＬＫ２のＲＮＡ干渉因子、ＴＬＫ２ノックアウト因子又はＴＬＫ２がノックアウトされたＲＮＡ干渉因子を更に含むことを特徴とする請求項３に記載のカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー。
【請求項5】
ＴＬＫ２阻害薬物は、ピモジド、チオリダジン又はトリフルオペラジンを含むが、これらに限定されないことを特徴とする請求項４に記載のカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー。
【請求項6】
ＴＬＫ２のＲＮＡ干渉因子は、低分子干渉核酸、アンチセンスＲＮＡ又はＴＬＫ２ ｍＲＮＡの転写及びタンパク質の翻訳を阻害する他の因子であることを特徴とする請求項４に記載のカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー。
【請求項7】
ＴＬＫ２のＲＮＡ干渉配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～３３に示されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項６に記載のカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオマーカーの技術分野に関し、特にカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー及び応用に関する。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病（ＡＤ）やパーキンソン病（ＰＤ）は、高齢者で最もよく見られる神経変性疾患である。現在、中国でアルツハイマー病患者は、５００万人と多く、世界の全症例数の２５％を占め、毎年の新規症例が３０万に近く、明らかに増加する傾向を呈する。７５歳以上の人の発症率が８％に達し、８０歳以上の人は１１％に達する。アルツハイマー病の患者のうち女性が男性よりも多く、６０歳以上の人ではアルツハイマー病に罹患する女性が男性よりも２～３倍高い。６０歳以上の人では、パーキンソン病の発症率が１～２％であり、８０歳以上の人では、発症率が４％に達することができ、ＡＤに次いで２番目に大きな神経変性疾患である。
【0003】
筋萎縮性側索硬化症は希少疾患に属し、発症率が十万分の一であり、全世界で毎年６千人近くの患者が新規に増加している。中国には２０万人近くの患者がいる。緑内障は、４５歳以上の場合に発症率が２％である。全世界に７０００万の緑内障患者がいて、中国に１０００万近くの緑内障患者がいる。
【0004】
従来の研究により、カルシウム過負荷が関連する神経変性疾患で一定の役割を果たし、特にニューロンでは、カルシウムイオンは、神経伝達物質の放出、ニューロンの可塑性及び遺伝子発現などを調節可能であることを見出した。アルツハイマー病では、βアミロイドの細胞内での濃縮によってカルシウムイオンの恒常性不全を直接引き起こす可能性があり、ミクログリア細胞と星状膠細胞に影響を与えてカルシウム過負荷を間接発生させる可能性もある。ニューロンカルシウム過負荷による細胞損傷は、ＡＤの発生と発展に密接に関連している。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）では、カルシウム透過性ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体媒介の慢性興奮毒性によって細胞内のカルシウムイオンの不均衡を招き、小胞体のカルシウムイオンの枯渇及びミトコンドリアのカルシウムイオンの過負荷が伴われる可能性がある。脳幹と脊髄のような運動ニューロン亜集団は、少量のカルシウム結合タンパク質のみを発現し、カルシウム過負荷により極めて傷害されやすい。
【0005】
緑内障患者の篩板細胞（ｌａｍｉｎａ ｃｒｉｂｒｏｓａ ｃｅｌｌｓ）及び線維柱帯細胞（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ ｃｅｌｌｓ）には、カルシウム過負荷及びカルシウムイオン恒常性を調節するチャネルの発現の変化が発生する。ラット緑内障モデルにおいて、網膜神経節細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ）にカルシウム過負荷が発生する。
【0006】
パーキンソン病では、ドーパミン作動性ニューロンの異常放電は、その独特のＣａｖ１．３ Ｌ型カルシウムイオンチャネルにより維持される。Ｃａｖ１．３ Ｌ型カルシウムイオンチャネルは、過分極電位に対して開き、カルシウムイオンが細胞に入るようにする必要があり、それによりドーパミン作動性ニューロンにカルシウム過負荷が発生し、最終的にカルシウム依存性ニューロン細胞死を招く。パーキンソン病患者の脳では、α－シヌクレインの異常堆積によってレビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ，ＬＢｓ）が形成され、α－シヌクレインの凝集は、細胞膜と相互作用して孔を形成し、カルシウムイオン恒常性が不均衡になり、カルシウム依存性細胞死を招く。
【0007】
細胞内カルシウム過負荷は、細胞の酸化ストレスの増加、細胞核の透過性の変化、加水分解酵素の活性の変化、ＡＴＰレベルの低下、ミトコンドリア機能損傷、ＤＮＡエンドヌクレアーゼの活性の増加、オートファジー機能の低下などを含む様々な細胞機能障害を招き、最終的に細胞死を招く。更に、α－シヌクレインの凝集によってもカルシウム過負荷及びオートファジー機能の低下を招く。オートファジー機能の損傷は、ＡＤ、ＰＤなどの神経変性疾患を招く要因にもなっている。大量の研究により示されたように、パーキンソン病に関連する遺伝因子（例えば、ＬＲＲＫ２、ＧＢＡ、ＳＭＰＤ１、ＳＮＣＡ、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、ＳＣＡＲＢ２）、及びアルツハイマー病に関連する遺伝因子（例えば、ＡｐｏＥ）は、いずれもオートファジー－リソソーム経路（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｌｙｓｏｓｏｍｅ ｐａｔｈｗａｙ）に関与している。これらの遺伝子は、リソソーム酵素のコード、リソソームの輸送やミトコンドリアのオートファジーなどに関連する機能に関与する。オートファジー機能が損なわれると、α－シヌクレインやβアミロイドなどの異常堆積を直接招く可能性がある。従って、細胞オートファジー機能の維持は、カルシウム過負荷の関与する神経変性疾患の共通標的でもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、カルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー及び応用を提供することを目的とする。応用とは、ＴＬＫ２阻害剤、ＴＬＫ２ ＲＮＡ干渉薬物などのＴＬＫ２を干渉するポリシーを提供することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記目的を実現するために、本発明は、様々な高齢関連神経変性疾患の治療用薬物の調製及び疾患検出方法におけるカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカーの応用を提供する。
【0010】
好ましくは、疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症又は緑内障を含むが、これらに限定されない。
【0011】
マーカーは、過剰リン酸化ＴＬＫ２であるカルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカーである。
【0012】
好ましくは、ＴＬＫ２阻害薬物、ＴＬＫ２のＲＮＡ干渉因子、ＴＬＫ２ノックアウト因子又はＴＬＫ２がノックアウトされたＲＮＡ干渉因子を更に含む。
【0013】
好ましくは、ＴＬＫ２阻害薬物は、ピモジド、チオリダジン又はトリフルオペラジンを含むが、これらに限定されない。
【0014】
好ましくは、ＴＬＫ２のＲＮＡ干渉因子は、低分子干渉核酸、アンチセンスＲＮＡ又はＴＬＫ２ ｍＲＮＡ転写及びタンパク質の翻訳を阻害する他の因子である。
【0015】
好ましくは、ＴＬＫ２のＲＮＡ干渉配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～３３に示されるヌクレオチド配列を有する。
【0016】
従って、本発明は、上記カルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー及び応用を採用し、カルシウム過負荷及びＴＬＫ２過剰リン酸化は、新規な分子マーカーとして疾患の進展を予測するか又は治療効果を検定し、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及び緑内障に対して迅速な早期警報の作用を有し、且つ、上記病症の治療用薬物の調製過程で主な治療効果を奏する。
【0017】
ニューロン及び非ニューロン細胞では、カルシウム過負荷は、酸素不足の条件により誘発され、ＴＬＫ２過剰リン酸化に繋がる。細胞にカルシウム過負荷が発生した場合、ＴＬＫ２が過剰リン酸化（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｅｒｙｌａｔｉｏｎ）し、そのホスファターゼの活性が高くなる。ＴＬＫ２のリン酸化基質は、ＣＲＥＢＲＦ（転写因子であり、リソソーム遺伝子の転写を調節する機能を有する）及びミトコンドリアの断片化に繋がる未知のタンパク質を含む。ＴＬＫ２遺伝子ノックアウト、ＲＮＡによるＴＬＫ２転写及びタンパク質の翻訳の干渉、低分子阻害剤は、いずれもカルシウム過負荷による下流の損傷を阻害することができる。
【0018】
以下、図面及び実施例により、本発明の技術的解決手段を更に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】ショウジョウバエの翅の表現型の模式図である。
【図2】ＭＣ１６ショウジョウバエの筋線維における蛍光タンパク質の分布の模式図である。
【図3】ＭＣ１６ショウジョウバエのカルシウム過負荷現象の模式図である。
【図4】ＴＬＫ ＲＮＡｉがカルシウム過負荷による筋肉損傷を阻害することを示す模式図である。
【図5】ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエの筋肉損傷をレスキューすることを示す模式図である。
【図6】ＴＬＫ ＲＮＡｉがカルシウム過負荷による細胞死をレスキューすることを示す模式図である。
【図7】ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエのミトコンドリアの機能欠陥をレスキューすることを示す模式図である。
【図8】ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエにおけるカルシウム過負荷のレベルに影響を与えないことを示す模式図である。
【図9】ＴＬＫ ＲＮＡｉがカルシウム過負荷によるオートファジー－リソソーム機能を高めることを示す模式図である。
【図10】ＴＬＫ ＲＮＡｉがα－シヌクレイン過剰発現によるドーパミンニューロンをレスキューすることを示す模式図である。
【図11】ＴＬＫ ＲＮＡｉがＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエにおけるミトコンドリア機能を回復することを示す模式図である。
【図12】ＴＬＫ ＲＮＡｉがα－シヌクレイン過剰発現によるオートファジー－リソソーム機能を回復することを示す模式図である。
【図13】ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによるオートファジーフラックスの活性化の模式図である。
【図14】ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによるマーカータンパク質のオートファジーの模式図である。
【図15】ＴＬＫ２阻害剤（ＰＭＺ）がα－シヌクレイン過剰発現によるオートファジーをレスキューすることを示す模式図である。
【図16】既知のＴＬＫ阻害剤の化学構造模式図である。
【図17】ＴＬＫ２阻害剤（ＰＭＺ）がα－シヌクレイン過剰発現によるオートファジーをレスキューすることを示す模式図である。
【図18】ＴＬＫ２タンパク質がカルシウム過負荷細胞溶解液により処理された後の模式図である。
【図19】ＴＬＫ２タンパク質がカルシウム過負荷細胞溶解液により処理された後の過剰リン酸化の模式図である。
【図20】カルシウム過負荷がＴＬＫ２キナーゼの活性を増加させることを示す模式図である。
【図21】カルシウム過負荷誘導モデルによるマウスの実験フローチャートの模式図である。
【図22】ＴＬＫ２ノックアウトによりカルシウム過負荷を緩和する場合のマウス死亡時間の模式図である。
【図23】ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりカルシウム過負荷によるドーパミンニューロン死をレスキューすることを示す模式図である。
【図24】ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりカルシウム過負荷によるオートファジー機能の低下を改善することを示す模式図である。
【図25】ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりα－シヌクレイン過剰発現モデルマウスをレスキューするフローの模式図である。
【図26】ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりα－シヌクレイン過剰発現による行動異常をレスキューすることができることを示す模式図である。
【図27】ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりα－シヌクレイン過剰発現によるオートファジーの低下を改善することができることを示す模式図である。
【図28】ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりα－シヌクレイン過剰発現によるドーパミンニューロン死を減少させることができることを示す模式図である。
【図29】α－シヌクレイン過剰発現及びカルシウム過負荷の病理学的条件下でのＴＬＫ２の過剰リン酸化の模式図である。
【図30】低酸素条件下でのヒト網膜上皮細胞のカルシウム過負荷の模式図である。
【図31】新規な低分子がカルシウム過負荷による損傷を阻害する活性を有することを示す模式図である。
【図32】マウスＴＬＫ２遺伝子ノックアウトが緑内障損傷に拮抗する作用を有することを示す模式図である。
【図33】ＰＭＺが緑内障損傷に拮抗する作用を有することを示す模式図である。
【図34】複数のヒトＴＬＫ２ ＲＮＡｉ配列がＴＬＫ２タンパク質レベルを低下させることができることを示す模式図である。
【図35】ＴＬＫ２（ｓｈＲＮＡ）ノックダウンが細胞内ｔａｕタンパク質レベルを低下させることができることを示す模式図である。
【図36】ＴＬＫ２（ｓｈＲＮＡ）ノックダウンが細胞内ＦＵＳタンパク質レベルを低下させ、細胞オートファジーレベルを高めることができることを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、図面及び実施例により、本発明の技術的解決手段を更に説明する。
【0021】
別途定義されていない限り、本発明において使用される技術用語又は科学用語は、本発明の属する分野における当業者に理解されている通常の意味を有するものとする。
【0022】
当業者にとって明らかなように、本発明は、上記例示的な実施例の細部に限定されず、且つ本発明の主旨又は実質的な特徴から逸脱しない限り、他の具体的な形態により本発明を実現することができる。従って、どの点においても、実施例が限定的なものではなく例示的なものであると見なすべきである。本発明の範囲は、上記説明に限定されるものではなく、下記請求項によって限定されるものであるため、請求項の同等要件の意味及び範囲内にある全ての変化が本発明内に網羅されることを意図し、請求項におけるいかなる図面符号を、係る請求項を制限するものとして見なしてはいけない。
【0023】
更に、実施形態に従って本明細書を説明するが、各実施形態が１つの独立した技術的解決手段のみを含むわけではなく、明細書のこのような記述方法は明瞭にするためであり、当業者が明細書を全体として見なすべきであり、各実施例における技術的解決手段は、適切に組み合わせられ、当業者が理解できる他の実施形態を形成することもできることを理解すべきである。これらの他の実施形態も本発明の保護範囲内に含まれる。
【0024】
以上に記載の具体的な実施例は、本発明を解釈するためのみに用いられ、本発明の保護範囲はこれに限定されず、本技術分野に熟知する任意の技術者が本発明に開示されている技術範囲内で本発明の技術的解決手段及びその発明思想に基づいて同等置換又は変更を加えたものは、全て本発明／発明の保護範囲内に含まれることを更に理解すべきである。
【0025】
本発明において使用される「含む」又は「包含」などの類似する単語は、一番前の主語である要素がこの単語の前に列挙された要素を含み、他の要素をも含む可能性を排除しないことを意味する。「内」、「外」、「上」、「下」などの用語により指示される方位又は位置関係は、図面に示される方位又は位置関係に基づくものであり、本発明を説明しやすく説明を簡略化するためのものに過ぎず、係る装置又は素子が必ず特定の方位を有したり、特定の方位で構成・操作したりしなければならないことを指示又は示唆するわけではないため、本発明を制限するものとして理解してはいけず、説明される対象の絶対的位置が変更された場合、その相対的位置関係もそれに応じて変更する可能性がある。本発明において、別途明確に規定・限定されていない限り、「付着」などの用語は、広い意味で理解されるべきであり、例えば、固定接続であってもよいし、取り外し可能な接続、又は一体的であってもよく、直接接続であってもよいし、中間媒体を介する間接接続であってもよく、２つの素子内部の連通又は２つの素子の相互作用関係であってもよい。当業者であれば、具体的な状況に応じて本発明における上記用語の具体的な意味を理解することができる。本発明において使用される「約」という用語は、当業者に公知の意味を有し、当該用語により修飾される数値がその±５０％、±４０％、±３０％、±２０％、±１０％、±５％又は±１％の範囲内にある意味であることが好ましい。
【0026】
別途特に定義されていない限り、本開示において使用される全ての用語（技術用語又は科学用語を含む）は、本開示の属する分野における当業者に理解されている意味と同じである。更に、本明細書において明確に定義されていない限り、例えば汎用辞書で定義された用語は、それらの関連技術の文脈における意味に合致する意味を有すると理解されるべきであり、理想的又は高度に形式的な意味で解釈すべきではないことを理解されたい。
【0027】
関連分野の当業者に既知の技術、方法及び機器について詳細に検討しない場合があるが、適切な場合、前記技術、方法及び機器は、明細書の一部として見なすべきである。
【0028】
本発明の明細書に援用される従来の技術文献に開示された内容は、全体として援用により本発明に組み込まれ、それによって本発明の開示内容の一部となる。
【0029】
以下の内容では、特に説明されていない限り、採用される薬物及び計器は、全て当分野における通常の選択である。また、表１及び表２には、本実施例に係る抗体及び化学試薬の情報が列挙されている。
【0030】
【表1】
【0031】
【表2-1】
【表2-2】
【0032】
以下の内容では、本発明のデータの平均値を比較する時、ｔ検定及び分散検定は、サンプル全体が正規分布に従い、サンプル間の分散が均一であるという仮設に基づくものである。２つのグループの間の比較について、対応のないｔ検定を使用して統計的分析を行う。３つ以上のグループの比較について、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定を使用して有意性を決定する。Ｌｏｇ－ｒａｎｋアルゴリズムでは、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ検定を使用して生存分析を行う。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計的分析を行う。Ｐ＜０．０５であれば、統計的意味を有すると考えられる（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【0033】
試験テスト１
一、ショウジョウバエ慢性カルシウム過負荷モデルの構築
ショウジョウバエに、ヒトＢＮＣ１ａの第４３０位のグリシンがシステインに突然変異した突然変異体をトランスジェニック発現させ、当該突然変異の発現によって細胞質におけるカルシウムイオン濃度が徐々に上昇し、このトランスジェニックショウジョウバエをＵＡＳ－Ｃ１６（Ｇ４３０Ｃ突然変異体を発現したトランスジェニックショウジョウバエ第１６号を意味する）と称する。
一、ショウジョウバエ慢性カルシウム過負荷モデルの構築
ショウジョウバエに、ヒトＢＮＣ１ａの第４３０位のグリシンがシステインに突然変異した突然変異体をトランスジェニック発現させ、当該突然変異の発現によって細胞質におけるカルシウムイオン濃度が徐々に上昇し、このトランスジェニックショウジョウバエをＵＡＳ－Ｃ１６（Ｇ４３０Ｃ突然変異体を発現したトランスジェニックショウジョウバエ第１６号を意味する）と称する。
【0034】
パーキンソン病の場合にも、筋肉組織にカルシウム過負荷の現象が発生する。また、筋肉組織は、ニューロンと同じく興奮性組織であり、分子経路が実質的に一致しており、且つショウジョウバエの筋肉組織が非常に大きく、表現型を観察して遺伝子スクリーニングを行うことに役立つ。そのうち、最大の筋肉組織は、ショウジョウバエの翅が飛行するように制御する飛行筋である。飛行筋が損傷されると、翅には対応する表現型が現れる。従って、筋プロモーターＭｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ（Ｍｈｃ） Ｐｒｏｍｏｔｅｒを採用してＧａｌ４タンパク質の発現を媒介する（Ｍｈｃ－Ｇａｌ４は、ｈＢＮＣ１ Ｇ４３０ＣをＵＡＳの下流に接続する）。Ｇａｌ４は、転写活性化タンパク質として、ＵＡＳのＤＮＡ配列に結合し、ＵＡＳ配列の下流の遺伝子フラグメントの発現を強く活性化することができる。
【0035】
本発明は、ショウジョウバエ組織特異的プロモーターにより駆動されるＧａｌ４発現系統及びＵＡＳに連結されるトランスジェニックフラグメントのショウジョウバエ系統を構築し、この２つのショウジョウバエ系統を交配することで、子孫ショウジョウバエが組織特異的細胞内においてＵＡＳの後に連結される遺伝子を発現することができる。ショウジョウバエＧａｌ４／ＵＡＳ系を利用し、ショウジョウバエ筋肉慢性カルシウム過負荷モデルを構築し、その遺伝子型は、Ｍｈｃ－ｇａｌ４＞ＵＡＳ－Ｃ１６であり、以下、このショウジョウバエをＭＣ１６と略称する。
【0036】
二、ＭＣ１６ショウジョウバエの表現型
使用されるショウジョウバエは、全てショウジョウバエの標準的なトウモロコシ粉餌で２５℃の恒温インキュベータにおいて飼育された。インキュベータの湿度は、６０％に維持され、昼９：００～２１：００、２０００～３０００ｌｕｘ、夜２１：００～翌日９：００、０ｌｕｘという昼夜交替モードに設定された。ショウジョウバエが７日間程度になった時点で、ショウジョウバエの翅の表現型を直接観察した。
使用されるショウジョウバエは、全てショウジョウバエの標準的なトウモロコシ粉餌で２５℃の恒温インキュベータにおいて飼育された。インキュベータの湿度は、６０％に維持され、昼９：００～２１：００、２０００～３０００ｌｕｘ、夜２１：００～翌日９：００、０ｌｕｘという昼夜交替モードに設定された。ショウジョウバエが７日間程度になった時点で、ショウジョウバエの翅の表現型を直接観察した。
【0037】
図１のように、正常Ｍｈｃ－Ｇａｌ４ショウジョウバエの翅は、地面に平行するように表現し、且つ正常に飛行することができる。ＭＣ１６カルシウム過負荷ショウジョウバエの翅は、持続的に下へ垂れ下がるか又は上へ立ち上がるという異常な筋肉状態を表現し、且つ飛行能力が失われ、筋肉内に損傷が存在することが示唆された。７日目のＭＣ１６カルシウム過負荷ショウジョウバエの翅の表現型を統計したところ、約８０％のショウジョウバエの翅は、持続的に下へ垂れ下がるか又は上へ立ち上がるように表現することを見出し、ＭＣ１６ショウジョウバエには対応する表現型が発生可能であることが説明された。
【0038】
図１において、図ａは、正常対照Ｍｈｃ－ｇａｌ４ショウジョウバエの翅が平行に並んでいる場合であり、図ｂは、カルシウム過負荷ショウジョウバエの翅の位置が上又は下へ向かう場合であり、翅を制御する筋肉に損傷が発生したことが説明された。
【0039】
三、飛行筋の筋線維
ショウジョウバエの飛行筋（ＩＦＭ）をＨＬ３バッファに入れて解剖し、ショウジョウバエが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を持っているため、ライカＳＰ８共焦点顕微鏡を直接利用して結像させることができる。
ショウジョウバエの飛行筋（ＩＦＭ）をＨＬ３バッファに入れて解剖し、ショウジョウバエが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を持っているため、ライカＳＰ８共焦点顕微鏡を直接利用して結像させることができる。
【0040】
ショウジョウバエの翅の飛行を制御する筋線維が第２胸節の部位に成長するため、胸節部位の飛行筋を選択して筋線維の形態を観察した。且つ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、正常に細胞質に均一に分布することができる。
【0041】
緑色蛍光タンパク質を発現するショウジョウバエをそれぞれＭｈｃ－Ｇａｌ４ショウジョウバエ及びＭＣ１６カルシウム過負荷ショウジョウバエと交配し、雑種第一代のショウジョウバエにおいて筋線維組織の形態変化を観察できた。図２のように、図ａは、正常対照Ｍｈｃ－ｇａｌ４ショウジョウバエの筋線維であり、平行に並んでおり、緑色蛍光タンパク質シグナルが均一且つ規則的に分布しており、図ｂにおけるＭＣ１６ショウジョウバエの筋線維が乱雑に分布しており、緑色蛍光タンパク質のシグナルが非常に不規則に分布しており、ＭＣ１６ショウジョウバエに筋肉損傷が発生したことが示された。
【0042】
四、ＭＣ１６ショウジョウバエにカルシウム過負荷が発生したか否かの検出
ＨＬ３バッファにおいてショウジョウバエの飛行筋を解剖し、室温で５μＭのＦｌｕｏ４－ＡＭ及び０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７において暗所で３０分間インキュベートした。続いてＨＬ３バッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により結像させて蛍光強度を測定した。
ＨＬ３バッファにおいてショウジョウバエの飛行筋を解剖し、室温で５μＭのＦｌｕｏ４－ＡＭ及び０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７において暗所で３０分間インキュベートした。続いてＨＬ３バッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により結像させて蛍光強度を測定した。
【0043】
Ｆｌｕｏ４は、カルシウムイオン指示薬であり、その蛍光強度は、カルシウムイオン濃度の上昇に伴って増加する。本試験では、Ｆｌｕｏ４を利用してカルシウムイオンのレベルを検証し、図３において、Ｆは蛍光強度を表し、Ｆ／Ｆ０で相対蛍光強度を分析した。２つのグループの間は対応のないｔ検定を採用し、統計学的有意差があった。結果により、ＭＣ１６ショウジョウバエにおけるＦｌｕｏ４の蛍光強度が正常対照Ｍｈｃ－Ｇａｌ４ショウジョウバエの蛍光強度よりも明らかに高いことが示され、ＭＣ１６ショウジョウバエにカルシウム過負荷の現象が確かに発生したことが明らかである。また、ＭＣ１６ショウジョウバエのカルシウム過負荷シグナルがミトコンドリアに集中しており、ミトコンドリアがカルシウムイオンを代謝する主な細胞小器官の１つであるため、ミトコンドリアにカルシウム過負荷の現象が発生した。
【0044】
五、ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエの翅の表現型を明らかにレスキューすることができる
ＵＡＳ－ＲＮＡｉショウジョウバエ系統をＭＣ１６ショウジョウバエと交配し、雑種第一代ショウジョウバエを使用した。ショウジョウバエが７日間程度になった時点で、ショウジョウバエの翅の表現型を直接観察した。毎回の試験には約１００匹のショウジョウバエが使用され、３回繰り返した。
ＵＡＳ－ＲＮＡｉショウジョウバエ系統をＭＣ１６ショウジョウバエと交配し、雑種第一代ショウジョウバエを使用した。ショウジョウバエが７日間程度になった時点で、ショウジョウバエの翅の表現型を直接観察した。毎回の試験には約１００匹のショウジョウバエが使用され、３回繰り返した。
【0045】
図４のように、ａは、ＭＣ１６ショウジョウバエの遺伝子スクリーニングの模式図であり、ＭＣ１６ショウジョウバエをＵＡＳ－ＲＮＡｉショウジョウバエ系統と交配し、ＭＣ１６ショウジョウバエの翅の表現型を観察し、ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエの翅の表現型をレスキューすることができることを見出した。ｂは、ＭＣ１６／＋及びＭＣ１６／ＴＬＫ ＲＮＡｉショウジョウバエの翅の正常率であり、それぞれ５～７日間の雄ショウジョウバエ及び雌ショウジョウバエを比較した。ＭＣ１６／ＴＬＫ ＲＮＡｉショウジョウバエの翅の正常率がＭＣ１６／＋ショウジョウバエよりも高かった。
【0046】
六、ＴＬＫ ＲＮＡｉ作用の検証
（１）ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエの筋肉損傷及びミトコンドリアの欠陥をレスキューすることができる
ショウジョウバエ筋肉を２．５％のグルタルアルデヒド（０．１ＭのＰＢバッファで希釈）において４℃で４時間固定化した。０．１ＭのＰＢバッファで３回洗い流し、毎回１０分間とした。続いて標準レジメンに従ってサンプルを調製して結像させ、透過型電子顕微鏡（ＨＴ７７００）により観察した。
（１）ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエの筋肉損傷及びミトコンドリアの欠陥をレスキューすることができる
ショウジョウバエ筋肉を２．５％のグルタルアルデヒド（０．１ＭのＰＢバッファで希釈）において４℃で４時間固定化した。０．１ＭのＰＢバッファで３回洗い流し、毎回１０分間とした。続いて標準レジメンに従ってサンプルを調製して結像させ、透過型電子顕微鏡（ＨＴ７７００）により観察した。
【0047】
図５のように、透過型電子顕微鏡によりＭＣ１６カルシウム過負荷ショウジョウバエの筋線維及びミトコンドリアの損傷を観察し、透過型電子顕微鏡の結果により示されたように、正常のＭｈｃ－Ｇａｌ４ショウジョウバエでは、筋線維が長尺緻密状を呈し、ミトコンドリアが円形緻密状を呈するが、ＭＣ１６カルシウム過負荷ショウジョウバエでは、筋線維が溶けており、ミトコンドリアが空胞状を呈し、ＭＣ１６カルシウム過負荷ショウジョウバエの筋線維及びミトコンドリアが損傷され、ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエの筋肉損傷及びミトコンドリアの欠陥をレスキューすることができることが示された。
【0048】
（２）ＴＬＫ ＲＮＡｉがＴＵＮＥＬ染色シグナルを明らかに減少させることができる
ショウジョウバエの飛行筋（ＩＦＭ）をＨＬ３バッファにおいて解剖し、４％のＰＦＡにより室温で１５分間固定化し、続いて０．２％のＰＢＳＴで３回パンチングし、毎回５分間とした。１０ｇ／ｍＬのプロテアーゼＫ（ＰＢＳ溶液で希釈）により５６℃で１０分間インキュベートした。０．２％のＰＢＳＴで３回洗い流し、毎回５分間とした。ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）のＴＵＮＥＬ反応混合液を仕様書に従って配合し、３７℃で、暗所で２時間インキュベートした。０．２％のＰＢＳＴで３回洗い流し、毎回５分間とした。Ｆ－ａｃｔｉｎ粉末をＤＭＳＯに溶かして１０００倍の原液とし、原液を１：１０００でＰＢＳにおいて希釈し、室温で、暗所で１時間染色し、ＰＢＳで３回洗い流し、毎回５分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡を利用して画像を得た。
ショウジョウバエの飛行筋（ＩＦＭ）をＨＬ３バッファにおいて解剖し、４％のＰＦＡにより室温で１５分間固定化し、続いて０．２％のＰＢＳＴで３回パンチングし、毎回５分間とした。１０ｇ／ｍＬのプロテアーゼＫ（ＰＢＳ溶液で希釈）により５６℃で１０分間インキュベートした。０．２％のＰＢＳＴで３回洗い流し、毎回５分間とした。ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）のＴＵＮＥＬ反応混合液を仕様書に従って配合し、３７℃で、暗所で２時間インキュベートした。０．２％のＰＢＳＴで３回洗い流し、毎回５分間とした。Ｆ－ａｃｔｉｎ粉末をＤＭＳＯに溶かして１０００倍の原液とし、原液を１：１０００でＰＢＳにおいて希釈し、室温で、暗所で１時間染色し、ＰＢＳで３回洗い流し、毎回５分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡を利用して画像を得た。
【0049】
ＭＣ１６カルシウム過負荷ショウジョウバエの筋線維及びミトコンドリアのいずれにも損傷が発生し、これらの損傷は細胞死に繋がる。ｉｎ ｓｉｔｕターミナルトランスフェラーゼを介したｄＵＴＰニックエンドラベリング技術（ＴＵＮＥＬ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によってそれぞれ細胞アポトーシス及びネクローシスを検出することで、ＭＣ１６ショウジョウバエの細胞死の方式を決定した。図６のように、結果により、対照ショウジョウバエには明らかなＴＵＮＥＬ染色シグナルがなく、ＭＣ１６ショウジョウバエには明らかなＴＵＮＥＬシグナルがあり、ＴＬＫ ＲＮＡｉがＴＵＮＥＬ染色シグナルを明らかに減少させ、ＭＣ１６ショウジョウバエの細胞死をレスキューすることができることが示された。
【0050】
（３）ＴＬＫ ＲＮＡｉがカルシウム過負荷によるミトコンドリアの機能欠陥を回復することができる
ショウジョウバエの飛行筋（ＩＦＭ）をＨＬ３バッファにおいて解剖し、１μＭのＴＭＲＭで染色し、室温で、暗所で１０分間インキュベートした。続いてＨＬ３バッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。
ショウジョウバエの飛行筋（ＩＦＭ）をＨＬ３バッファにおいて解剖し、１μＭのＴＭＲＭで染色し、室温で、暗所で１０分間インキュベートした。続いてＨＬ３バッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。
【0051】
ＴＭＲＭ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎ）は、生細胞のミトコンドリアを標識する染料であり、よくミトコンドリアの膜電位を測定するために用いられる。図７において、赤色は、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）を表し、Ｍｈｃ－ｇａｌ４／＋、ＭＣ１６及びＭＣ１６／ＴＬＫ ＲＮＡｉショウジョウバエの飛行筋にＴＭＲＭ蛍光染色を行い、Ｍｈｃ－ｇａｌ４／＋ショウジョウバエと比べ、ＭＣ１６ショウジョウバエのＴＭＲＭ蛍光強度が顕著に低下したが、ＴＬＫ ＲＮＡｉがＴＭＲＭの蛍光強度を明らかに回復し、カルシウム過負荷によるミトコンドリアの機能欠陥を回復することができた。
【0052】
（４）ＴＬＫ ＲＮＡｉがカルシウム過負荷のレベルに影響を与えない
ＨＬ３バッファにおいてショウジョウバエの脳又は筋肉を解剖し、且つ室温で５μＭのＦｌｕｏ４－ＡＭ及び０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７において暗所で３０分間インキュベートした。続いてＨＬ３バッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により結像させ、蛍光強度を測定した。
ＨＬ３バッファにおいてショウジョウバエの脳又は筋肉を解剖し、且つ室温で５μＭのＦｌｕｏ４－ＡＭ及び０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７において暗所で３０分間インキュベートした。続いてＨＬ３バッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により結像させ、蛍光強度を測定した。
【0053】
図８のように、Ｆｌｕｏ４－ＡＭカルシウムイオン指示薬により染色し、その蛍光強度がカルシウムイオン濃度の上昇につれて増加する。ＭＣ１６／ＴＬＫ ＲＮＡｉショウジョウバエのＦｌｕｏ４－ＡＭの蛍光強度は、ＭＣ１６／＋ショウジョウバエと比べ、統計学的有意差がなく、ＴＬＫ ＲＮＡｉがカルシウム過負荷のレベルに影響を与えないことが示された。
【0054】
（５）ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエにおける上昇したＲｅｆ（２）Ｐタンパク質のレベルを低下させることができる
ショウジョウバエの飛行筋を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で、４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
ショウジョウバエの飛行筋を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で、４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
【0055】
リソソームは、細胞内の消化器官であり、細胞内の殆どの物質を分解することができる。オートファジーは、主な細胞質タンパク質の分解経路の１つであり、オートファゴソームは、リソソームと融合してオートファジーリソソームを形成することができる。リソソームの機能が損なわれると、オートファジー過程も影響される。ＬＣ３タンパク質複合体は、オートファジーのマーカーであり、オートファジー膜の伸長過程に関与し、ＧＡＢＡＲＡＰタンパク質は、ＬＣ３タンパク質の機能と類似し、オートファゴソームの成熟に必要なものである。
【0056】
更に、Ｒｅｆ（２）Ｐは、哺乳動物Ｐ６２のショウジョウバエ相同体であり、オートファジーの基質として、ユビキチン化タンパク質をオートファゴソームに伝達する。Ｐ６２の蓄積は、一般的にオートファジー活性の低下を表す。Ｍｈｃ－ｇａｌ４／＋とＭｈｃ－ｇａｌ４／ＴＬＫ ＲＮＡｉショウジョウバエのタンパク質レベルには有意差がなかった。図９のように、Ｍｈｃ－ｇａｌ４／＋ショウジョウバエと比べ、ＭＣ１６／＋ショウジョウバエは、Ｒｅｆ（２）Ｐタンパク質レベルが上昇し、ＧＡＢＡＲＡＰレベルが明らかに変化しておらず、オートファゴソームの過程が正常であるが、オートファジーリソソームの機能が低下する可能性があることが示された。重要なのは、ＴＬＫ ＲＮＡｉがＭＣ１６ショウジョウバエにおける上昇したＲｅｆ（２）Ｐタンパク質レベルを低下させることができることである。
【0057】
以上から分かるように、ＴＬＫ ＲＮＡｉは、カルシウム過負荷により誘導された細胞死、ミトコンドリア損傷及びオートファジー－リソソームの低下をレスキューすることができ、カルシウム過負荷媒介細胞損傷に対して肝心な分子である。
【0058】
試験テスト２
一、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを過剰発現するショウジョウバエの構築
Ｇａｕｇｈｔｅｒｌｅｓｓ－Ｇａｌ４（ＤａＧＳ）プロモーターによりＵＡＳ－ＳＮＣＡの発現を誘導し、このショウジョウバエをＤａＧＳ＞ＳＮＣＡと略称する。ミフェプリストン（ＲＵ４８６、Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）により、ＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエがα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを全身的に広く発現するように駆動することができる。ＲＵ４８６がショウジョウバエの健康に影響しないため、ＲＵ４８６が投与されたＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエと投与されていないショウジョウバエを比較した。同様に、Ｆｌｕｏ４－ＡＭ染色によりカルシウム過負荷のレベルを検出し、結果により、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎの過剰発現によってショウジョウバエの脳及び筋肉細胞内におけるカルシウムイオンのレベルが増加し、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎの過剰発現がカルシウム過負荷に繋がることが検証された。
一、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを過剰発現するショウジョウバエの構築
Ｇａｕｇｈｔｅｒｌｅｓｓ－Ｇａｌ４（ＤａＧＳ）プロモーターによりＵＡＳ－ＳＮＣＡの発現を誘導し、このショウジョウバエをＤａＧＳ＞ＳＮＣＡと略称する。ミフェプリストン（ＲＵ４８６、Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）により、ＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエがα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを全身的に広く発現するように駆動することができる。ＲＵ４８６がショウジョウバエの健康に影響しないため、ＲＵ４８６が投与されたＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエと投与されていないショウジョウバエを比較した。同様に、Ｆｌｕｏ４－ＡＭ染色によりカルシウム過負荷のレベルを検出し、結果により、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎの過剰発現によってショウジョウバエの脳及び筋肉細胞内におけるカルシウムイオンのレベルが増加し、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎの過剰発現がカルシウム過負荷に繋がることが検証された。
【0059】
二、ＴＬＫはα－シヌクレインの堆積による損傷に対して肝心なタンパク質である
ショウジョウバエの全身組織を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。毎回の試験には約２０匹のショウジョウバエが使用され、３回繰り返して類似した結果が得られた。
ショウジョウバエの全身組織を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。毎回の試験には約２０匹のショウジョウバエが使用され、３回繰り返して類似した結果が得られた。
【0060】
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）は、ドーパミン作動性ニューロンのマーカーであり、ＴＨレベルの減少は、一般的にドーパミン作動性ニューロンの死を表す。対照ショウジョウバエと比べ、ＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエは、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質レベルが明らかに上昇し、ＴＨタンパク質レベルが明らかに低下した。ＴＬＫは、ＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエにおけるα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質のレベルを低下させ、一部のＴＨタンパク質レベルを回復することができた。ＴＬＫ ＲＮＡｉがα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを過剰発現したショウジョウバエに対しても保護作用を有することが説明された。
【0061】
三、ＴＬＫがα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現又はカルシウム過負荷により誘導された細胞死において肝心な役割を果たす
ショウジョウバエの脳組織をＨＬ３バッファにおいて解剖し、１μＭのＴＭＲＭで染色し、室温で、暗所で１０分間インキュベートした。続いてＨＬ３バッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。
ショウジョウバエの脳組織をＨＬ３バッファにおいて解剖し、１μＭのＴＭＲＭで染色し、室温で、暗所で１０分間インキュベートした。続いてＨＬ３バッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。
【0062】
図１１のように、赤色は、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）を表し、ＴＭＲＭを通じてミトコンドリアの膜電位を測定し、対照ショウジョウバエと比べ、ＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエのＴＭＲＭ蛍光強度が顕著に低下したが、ＴＬＫ ＲＮＡｉがＴＭＲＭの蛍光強度を明らかに回復することができた。ＴＬＫ ＲＮＡｉがＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエにおけるミトコンドリアの機能欠陥を回復することができることが検証され、ＴＬＫがα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現又はカルシウム過負荷により誘導された細胞死において肝心な役割を果たすことが説明された。
【0063】
四、ＴＬＫ ＲＮＡｉがショウジョウバエカルシウム過負荷又はα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現によるオートファジー－リソソームの機能障害をレスキューすることができる
ショウジョウバエの全身組織を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
ショウジョウバエの全身組織を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
【0064】
正常対照ショウジョウバエと比べ、ＲＵ４８６が投与されたＤａＧＳ＞ＳＮＣＡショウジョウバエは、ＧＡＢＡＲＡＰレベルが明らかに変化しておらず、Ｒｅｆ（２）Ｐタンパク質レベルが上昇したが、ＴＬＫ ＲＮＡｉがα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現ショウジョウバエにおいて上昇したＲｅｆ（２）Ｐタンパク質レベルを低下させることができた。
【0065】
試験テスト３ ＴＬＫ２のカルシウム過負荷損傷に対する媒介作用
（一）ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりオートファジーを活性化することができる
Ｈｅｌａ細胞を１０％のウシ胎児血清、１％のストレプトマイシン及びペニシリンが添加されたＤＭＥＭ培地において培養した。５万個程度の細胞を共焦点培養皿に播種し、細胞密度が５０％～７０％の間になると、１ｍＬの培地にＬＣ３－ｍＲＦＰ－ＧＦＰアデノウイルス（漢恒生物）を添加し、ＭＯＩ＝１０の標準に従う量のアデノウイルスを加えた。６～８時間トランスフェクトした後、培地を交換し、更に２４時間培養した後、ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により生細胞を結像させた。
（一）ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりオートファジーを活性化することができる
Ｈｅｌａ細胞を１０％のウシ胎児血清、１％のストレプトマイシン及びペニシリンが添加されたＤＭＥＭ培地において培養した。５万個程度の細胞を共焦点培養皿に播種し、細胞密度が５０％～７０％の間になると、１ｍＬの培地にＬＣ３－ｍＲＦＰ－ＧＦＰアデノウイルス（漢恒生物）を添加し、ＭＯＩ＝１０の標準に従う量のアデノウイルスを加えた。６～８時間トランスフェクトした後、培地を交換し、更に２４時間培養した後、ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により生細胞を結像させた。
【0066】
ＴＬＫ２ ＫＯのオートファジーに対する影響を検出し、通常のオートファジーフラックスの評価方法は、ＬＣ３－ｍＲＦＰ－ＧＦＰアデノウイルスを利用してオートファゴソーム及びオートファジーリソソームを標識することである。リソソーム内の低ｐＨ値によってＬＣ３－ｍＲＦＰ－ＧＦＰアデノウイルス中のＧＦＰ蛍光シグナルを消光させることができ、逆に、ＲＦＰが酸性ｐＨでより安定的な蛍光シグナルを示す。オートファジーフラックスが妨げられていなければ、黄色及び赤色の斑点がいずれも増加し、それぞれオートファゴソーム及びオートファジーリソソームの数の増加を表す。図１３において、ＬＣ３－ｍＲＦＰ－ＧＦＰアデノウイルスをトランスフェクトしてから４８時間後、Ｈｅｌａ ＷＴ及びＴＬＫ２ ＫＯの生細胞を結像させた。黄色の斑点がオートファゴソームを表し、赤色の斑点がオートファジーリソソームを表す。野生型細胞と比べ、ＴＬＫ２ ＫＯ細胞における黄色及び赤色の斑点がいずれも増加し、即ちＴＬＫ２ ＫＯによってオートファゴソーム及びオートファジーリソソームの数が増加した。
【0067】
（二）ＴＬＫ２ ＫＯ細胞におけるオートファジー状況の分析
Ｈｅｌａ細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
Ｈｅｌａ細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
【0068】
ＴＬＫ２ ＫＯ細胞において、ＬＣ３－ＩＩ／ＬＣ３－Ｉの値が増加し、Ｐ６２タンパク質レベルが低下した（図１４）。ＴＬＫ２ ＫＯによりオートファジーを活性化することができることが説明された。オートファジーは動的過程であり、より正確な方法は、オートファジーフラックスの過程を検出することで、オートファジーのレベルを評価することである。薬物でオートファジー経路を活性化又は遮断することにより、オートファジーフラックスが妨げられているか否かを評価することができる。
【0069】
ラパマイシン（Ｒａｐａ）によりオートファジーを活性化し、バフィロマイシンＡ１（Ｂａｆ Ａ１）によりオートファジーを阻害する。ラパマイシン（Ｒａｐａ、４０ｎＭ）及びバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１、１００ｎＭ）によりそれぞれ細胞を６時間処理した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ結果により示されたように、野生型Ｈｅｌａ細胞において、Ｒａｐａ処理によって、ＬＣ３－ＩＩ／ＬＣ３－Ｉの値が上昇し、Ｐ６２タンパク質レベルが低下し、Ｂａｆ Ａ１処理によって、ＬＣ３－ＩＩ／ＬＣ３－Ｉの値及びＰ６２タンパク質レベルが上昇した。ＴＬＫ２ ＫＯ細胞において、Ｒａｐａ処理よってＰ６２タンパク質レベルを更に低下させることができ、Ｂａｆ Ａ１処理によってＴＬＫ２ ＫＯで活性化されたオートファジーを遮断した。ＴＬＫ２ ＫＯ細胞において、オートファジーフラックスが妨げられていないことが説明された。
【0070】
（三）ＴＬＫ２阻害剤がα－シヌクレイン過剰発現のオートファジーに対する阻害作用を改善することができる
ＳＫＮ細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
ＳＫＮ細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ｓｅｃ ｏｎ／３ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
【0071】
図１５のように、神経芽細胞腫（ＳＫＮ－ＳＨ）細胞においてα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎのレンチウイルスを過剰発現し、正常対照細胞と比べ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを過剰発現した細胞のＬＣ３－ＩＩレベルが低く、Ｐ６２レベルが高く、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎの過剰発現によってオートファジー機能を低下させたことが示された。既知のＴＬＫ２キナーゼ阻害剤（Ｐｉｍｏｚｉｄｅ又はＰＭＺ）が加えられた場合、ＬＣ３－ＩＩタンパク質レベルをアップレギュレートし、Ｐ６２タンパク質レベルをダウンレギュレートすることができる。
【0072】
（四）ＴＬＫ２キナーゼ阻害剤が、ダウン発現ＴＬＫに類似し、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現によるオートファジー－リソソームの欠陥をレスキューすることができる
ＳＫＮ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１μＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを加え、室温で、暗所で１０分間インキュベートした。続いて再びＰＢＳバッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により画像を取得した。
ＳＫＮ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１μＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを加え、室温で、暗所で１０分間インキュベートした。続いて再びＰＢＳバッファで３回洗浄し、毎回１０分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により画像を取得した。
【0073】
図１７のように、赤色は、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒシグナルを表し、神経芽細胞腫（ＳＫＮ－ＳＨ）細胞においてα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎのレンチウイルスを４８時間過剰発現し、正常対照細胞と比べ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを過剰発現した細胞のＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒシグナルが低下したが、ＰＭＺがＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒシグナルを回復することができた。ＴＬＫ２キナーゼ阻害剤は、ダウン発現ＴＬＫに類似し、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現によるオートファジー－リソソームの欠陥をレスキューすることができ、ＰＭＺは、α－シヌクレイン過剰発現によって低下したオートファジーレベルを回復することができることが示された。これらの結果により、α－シヌクレイン過剰発現又はカルシウム過負荷の状況で、ＴＬＫ２が活性化される可能性があり、オートファジー－リソソームの機能低下を招いたことが示唆された。従って、ＴＬＫ２をノックアウトした場合又はＴＬＫ２キナーゼ阻害剤が加えられた場合、オートファジー－リソソームの機能を活性化することができる。
【0074】
（五）カルシウム過負荷によるＴＬＫ２過剰リン酸化、そのキナーゼ活性の活性化
ＴＬＫ２ ｃＤＮＡをＧＳＴタグ付きＰＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターにクローニングし、組換えプラスミドをＢＬ２１化学的コンピテントセルにおいて発現し、誘導条件としては、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより、２０℃で、１８０ｒｐｍで２０時間発現を誘導する。ＧＳＴ－ＴＬＫ２は、碧云天ＧＳＴタグ付きタンパク質精製キットの標準手順に従って精製された。１７μＭのｉｏｎｏｍｙｃｉｎでＨｅｌａ細胞を３時間処理し、細胞密度が７０％に達した時、細胞を収集した。溶解バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）において溶解した。４℃で、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。３μｇのＧＳＴ－ＴＬＫ２精製タンパク質と２００μｇの細胞溶解液を混合し、４℃で一晩垂直に振盪した。その後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズを加え、室温で１時間回転し続けた。ＷＢ及びＩＰ溶解液で６回洗浄し、毎回４℃で遠心分離機において２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮るか、又はＴＬＫ２タンパク質をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅにより４℃で一晩切断する。最終結果はクマシー染色により得られた。
ＴＬＫ２ ｃＤＮＡをＧＳＴタグ付きＰＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターにクローニングし、組換えプラスミドをＢＬ２１化学的コンピテントセルにおいて発現し、誘導条件としては、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより、２０℃で、１８０ｒｐｍで２０時間発現を誘導する。ＧＳＴ－ＴＬＫ２は、碧云天ＧＳＴタグ付きタンパク質精製キットの標準手順に従って精製された。１７μＭのｉｏｎｏｍｙｃｉｎでＨｅｌａ細胞を３時間処理し、細胞密度が７０％に達した時、細胞を収集した。溶解バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）において溶解した。４℃で、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。３μｇのＧＳＴ－ＴＬＫ２精製タンパク質と２００μｇの細胞溶解液を混合し、４℃で一晩垂直に振盪した。その後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズを加え、室温で１時間回転し続けた。ＷＢ及びＩＰ溶解液で６回洗浄し、毎回４℃で遠心分離機において２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮るか、又はＴＬＫ２タンパク質をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅにより４℃で一晩切断する。最終結果はクマシー染色により得られた。
【0075】
図１８のように、カルシウム過負荷時にＴＬＫ２が活性化されたか否かを検出するために、ＧＳＴ－ＴＬＫ２プラスミドを構築し、且つＧＳＴ ｐｕｌｌ ｄｏｗｎによりＴＬＫ２タンパク質を精製した。精製されたＴＬＫ２タンパク質をイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）により処理された細胞溶解液（カルシウム過負荷を誘導）又は正常細胞溶解液と共にインキュベートした。クマシーブリリアントブルー染色により、ＧＳＴ－ＴＬＫ２をイオノマイシンにより処理された細胞溶解液と共にインキュベートした後、タンパク質バンドがシフトアップしたことを見出し、ＴＬＫ２タンパク質が修飾されている可能性があることが示された。イオノマイシンにより処理されたＴＬＫ２ ＫＯ細胞溶解液と共にインキュベートした後にも、類似する変化が発生した。
【0076】
（六）イオノマイシンにより処理された後、正常細胞溶解液及びＴＬＫ２ ＫＯ細胞溶解液がいずれもＴＬＫ２のリン酸化を増加させることができる
ＴＬＫ２ ｃＤＮＡをＧＳＴタグ付きＰＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターにクローニングし、組換えプラスミドをＢＬ２１化学的コンピテントセルにおいて発現し、誘導条件としては、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより、２０℃で、１８０ｒｐｍで２０時間発現を誘導する。ＧＳＴ－ＴＬＫ２は、碧云天ＧＳＴタグ付きタンパク質精製キットの標準手順に従って精製された。１７μＭのｉｏｎｏｍｙｃｉｎでＨｅｌａ細胞を３時間処理し、細胞密度が７０％に達した時、細胞を収集した。溶解バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）において溶解した。４℃で、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。３μｇのＧＳＴ－ＴＬＫ２精製タンパク質と２００μｇの細胞溶解液を混合し、４℃で一晩垂直に振盪した。その後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズを加え、室温で１時間回転し続けた。ＷＢ及びＩＰ溶解液で６回洗浄し、毎回４℃で遠心分離機において２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮るか、又はＴＬＫ２タンパク質をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅにより４℃で一晩切断する。最終結果はｐｈｏｓ－ｔａｇ ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより得られた。
ＴＬＫ２ ｃＤＮＡをＧＳＴタグ付きＰＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターにクローニングし、組換えプラスミドをＢＬ２１化学的コンピテントセルにおいて発現し、誘導条件としては、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより、２０℃で、１８０ｒｐｍで２０時間発現を誘導する。ＧＳＴ－ＴＬＫ２は、碧云天ＧＳＴタグ付きタンパク質精製キットの標準手順に従って精製された。１７μＭのｉｏｎｏｍｙｃｉｎでＨｅｌａ細胞を３時間処理し、細胞密度が７０％に達した時、細胞を収集した。溶解バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）において溶解した。４℃で、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。３μｇのＧＳＴ－ＴＬＫ２精製タンパク質と２００μｇの細胞溶解液を混合し、４℃で一晩垂直に振盪した。その後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズを加え、室温で１時間回転し続けた。ＷＢ及びＩＰ溶解液で６回洗浄し、毎回４℃で遠心分離機において２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮るか、又はＴＬＫ２タンパク質をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅにより４℃で一晩切断する。最終結果はｐｈｏｓ－ｔａｇ ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより得られた。
【0077】
図１９のように、ｐｈｏｓ－ｔａｇ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法により、更にＧＳＴ－ＴＬＫ２タンパク質バンドのシフトアップがリン酸化修飾によるものであるか否かを検出した。Ｐｈｏｓ－ｔａｇは、リン酸イオンと特異的に結合できる機能性分子であり、リン酸化タンパク質の分離に使用可能である。正常のウェスタンブロットには、Ｍｎ２＋及びＰｈｏｓ－ｔａｇを加えれば、非リン酸タンパク質化抗体で検出することができる。Ｐｈｏｓ－ｔａｇ ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、非リン酸化タンパク質の移動速度が速く、リン酸化タンパク質の移動速度が遅くなる。移動度の変化により、リン酸化タンパク質の含有量を分析することができる。精製されたＴＬＫ２タンパク質とイオノマイシンにより処理された細胞溶解液（カルシウム過負荷を誘導）又は正常細胞溶解液をインキュベートした。結果により、イオノマイシンにより処理された後、正常細胞溶解液及びＴＬＫ２ ＫＯ細胞溶解液がいずれもＴＬＫ２のリン酸化を増加させることができることが示された。
【0078】
（七）カルシウム過負荷がＴＬＫ２のリン酸化を増加させることができる
ＴＬＫ２ ｃＤＮＡをＧＳＴタグ付きＰＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターにクローニングし、組換えプラスミドをＢＬ２１化学的コンピテントセルにおいて発現し、誘導条件としては、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより、２０℃で、１８０ｒｐｍで２０時間発現を誘導する。ＧＳＴ－ＴＬＫ２は、碧云天ＧＳＴタグ付きタンパク質精製キットの標準手順に従って精製された。１７μＭのｉｏｎｏｍｙｃｉｎでＨｅｌａ細胞を３時間処理し、細胞密度が７０％に達した時、細胞を収集した。溶解バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）において溶解した。４℃で、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。３μｇのＧＳＴ－ＴＬＫ２精製タンパク質と２００μｇの細胞溶解液を混合し、４℃で一晩垂直に振盪した。その後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズを加え、室温で１時間回転し続けた。ＷＢ及びＩＰ溶解液で６回洗浄し、毎回４℃で遠心分離機において２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮るか、又はＴＬＫ２タンパク質をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅにより４℃で一晩切断する。最終結果は質量分析により得られた。
ＴＬＫ２ ｃＤＮＡをＧＳＴタグ付きＰＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターにクローニングし、組換えプラスミドをＢＬ２１化学的コンピテントセルにおいて発現し、誘導条件としては、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより、２０℃で、１８０ｒｐｍで２０時間発現を誘導する。ＧＳＴ－ＴＬＫ２は、碧云天ＧＳＴタグ付きタンパク質精製キットの標準手順に従って精製された。１７μＭのｉｏｎｏｍｙｃｉｎでＨｅｌａ細胞を３時間処理し、細胞密度が７０％に達した時、細胞を収集した。溶解バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）において溶解した。４℃で、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。３μｇのＧＳＴ－ＴＬＫ２精製タンパク質と２００μｇの細胞溶解液を混合し、４℃で一晩垂直に振盪した。その後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズを加え、室温で１時間回転し続けた。ＷＢ及びＩＰ溶解液で６回洗浄し、毎回４℃で遠心分離機において２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮るか、又はＴＬＫ２タンパク質をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅにより４℃で一晩切断する。最終結果は質量分析により得られた。
【0079】
質量分析によりＴＬＫ２の全てのセリン／トレオニンのリン酸化部位を同定した。正常の場合（イオノマイシンにより処理されていない）、１２個の部位がリン酸化され、対照グループとイオノマイシン処理グループには、合計で１０個の同じリン酸化部位（Ｓ１０２、Ｓ１１４、Ｓ１１６、Ｓ１３３、Ｔ１６０、Ｓ２２２、Ｓ３２９、Ｓ３７５、Ｓ３９２及びＳ４４９）があり、対照グループには、２つの独特のリン酸化部位（Ｓ２２５及びＳ３７６）がある。対照グループと比べ、イオノマイシン処理グループには、１５個のリン酸化部位（Ｓ２５、Ｓ７２、Ｓ１０９、Ｓ１１０、Ｔ２０７、Ｓ２０９、Ｔ２１２、Ｓ２１７、Ｓ２７７、Ｔ２９９、Ｔ３００、Ｔ３６６、Ｓ６１６、Ｓ７５１及びＳ７５２）が多く含まれ、２つのリン酸化部位（Ｓ２２５及びＳ３７６）が少なく含まれる（表３を参照）、カルシウム過負荷がＴＬＫ２のリン酸化を増加させることができることが示された。
【0080】
【表3】
【0081】
（八）カルシウム過負荷がＴＬＫ２のリン酸化を増加させることでＴＬＫ２を活性化することができる
５０μＬの反応体系に１μＬのＡＴＰ（０．２ｍＭ）、１μｇのＴＬＫ２精製タンパク質及び２０μｇの基質を加え、残りの容量がキナーゼバッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）で満たされ、室温で１５分間反応させた。ＭＢＰタンパク質を陽性対照基質とし、ＰＧＫ１タンパク質を陰性対照基質とした。５０ｕｌの超強力型の化学発光法によるキナーゼ検出試薬Ｋｉｎａｓｅ－ＬｕｍｉTMを加え、均一に混合し、室温で、暗所で１０分間反応させた。続いて多機能マイクロプレートリーダーにより化学発光検出を行った。
５０μＬの反応体系に１μＬのＡＴＰ（０．２ｍＭ）、１μｇのＴＬＫ２精製タンパク質及び２０μｇの基質を加え、残りの容量がキナーゼバッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）で満たされ、室温で１５分間反応させた。ＭＢＰタンパク質を陽性対照基質とし、ＰＧＫ１タンパク質を陰性対照基質とした。５０ｕｌの超強力型の化学発光法によるキナーゼ検出試薬Ｋｉｎａｓｅ－ＬｕｍｉTMを加え、均一に混合し、室温で、暗所で１０分間反応させた。続いて多機能マイクロプレートリーダーにより化学発光検出を行った。
【0082】
インビトロキナーゼアッセイによりＴＬＫ２キナーゼの活性を検証した。インビトロキナーゼアッセイでは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、複数種のキナーゼの基質とすることができ、ＴＬＫ２（Ｎｏ ＴＬＫ２）が加えられていないタンパク質を対照とし、正常処理グループ（ＴＬＫ２＋Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びイオノマイシン処理グループ（ＴＬＫ２＋Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）では、同じ量のＴＬＫ２タンパク質と同じ量のＭＢＰタンパク質を反応させた。減少したＡＴＰレベルによりＴＬＫ２キナーゼの活性を反映する。正常対照と比べ、正常処理グループ及びイオノマイシン処理グループはいずれもＡＴＰを消費する。正常処理グループと比べ、イオノマイシン処理グループは、より多くのＡＴＰを消費することができる。カルシウム過負荷がＴＬＫ２キナーゼ活性を増加させることができることが示された。以上の結果により、カルシウム過負荷がＴＬＫ２のリン酸化を増加させることでＴＬＫ２を活性化することができることが示された。
【0083】
試験テスト４
一、ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりカルシウム過負荷をレスキューできるモデルマウスの構築
グルタミン酸受容体１ Ｌｕｒｃｈｅｒ突然変異体（ＧｌｕＲ１Ｌｃ）は、構成的に開放したカチオンチャネルを形成することができる。ＧｌｕＲ１Ｌｃを条件的に発現するトランスジェニックマウス（ＧｌｕＲ１Ｌｃ ｍ／ｍ、「ｍ」はＧｌｕＲ１Ｌｃを表す）を構築した。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）により誘導されたプロモーター（ｒｔＴＡ）と交配した後、ＧｌｕＲ１Ｌｃ ｍ／＋；ｒｔＴＡ＋／－マウスは、ドキシサイクリンを提供する時にＧｌｕＲ１Ｌｃを全身的に広く発現することができる。マウスの飲み水に正常濃度（２ｍｇ／ｍＬ）のドキシサイクリンを提供すれば、１日内にマウスの死を誘導できるが、ドキシサイクリンを２００倍（０．０１ｍｇ／ｍＬ）希釈した後、ＧｌｕＲ１Ｌｃマウスが３日間以上生存できることを見出した。従って、マウスの飲み水に０．０１ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを提供してＧｌｕＲ１Ｌｃの発現を徐々に誘導した。また、条件的ＴＬＫ２ノックアウトマウス（ＴＬＫ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＵＢＣ－ＣｒｅＥＲＴ２／＋）をも構築した。ＧｌｕＲ１Ｌｃを条件的に発現するトランスジェニックマウスと条件的ＴＬＫ２ノックアウトマウスを交配し、必要とされる遺伝子型（ＧｌｕＲ１Ｌｃ ｍ／＋；ｒｔＴＡ＋／－；ＴＬＫ２ｆｌｏｘ／－；ＵＢＣ－ＣｒｅＥＲＴ２／＋）が得られた。
一、ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりカルシウム過負荷をレスキューできるモデルマウスの構築
グルタミン酸受容体１ Ｌｕｒｃｈｅｒ突然変異体（ＧｌｕＲ１Ｌｃ）は、構成的に開放したカチオンチャネルを形成することができる。ＧｌｕＲ１Ｌｃを条件的に発現するトランスジェニックマウス（ＧｌｕＲ１Ｌｃ ｍ／ｍ、「ｍ」はＧｌｕＲ１Ｌｃを表す）を構築した。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）により誘導されたプロモーター（ｒｔＴＡ）と交配した後、ＧｌｕＲ１Ｌｃ ｍ／＋；ｒｔＴＡ＋／－マウスは、ドキシサイクリンを提供する時にＧｌｕＲ１Ｌｃを全身的に広く発現することができる。マウスの飲み水に正常濃度（２ｍｇ／ｍＬ）のドキシサイクリンを提供すれば、１日内にマウスの死を誘導できるが、ドキシサイクリンを２００倍（０．０１ｍｇ／ｍＬ）希釈した後、ＧｌｕＲ１Ｌｃマウスが３日間以上生存できることを見出した。従って、マウスの飲み水に０．０１ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを提供してＧｌｕＲ１Ｌｃの発現を徐々に誘導した。また、条件的ＴＬＫ２ノックアウトマウス（ＴＬＫ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＵＢＣ－ＣｒｅＥＲＴ２／＋）をも構築した。ＧｌｕＲ１Ｌｃを条件的に発現するトランスジェニックマウスと条件的ＴＬＫ２ノックアウトマウスを交配し、必要とされる遺伝子型（ＧｌｕＲ１Ｌｃ ｍ／＋；ｒｔＴＡ＋／－；ＴＬＫ２ｆｌｏｘ／－；ＵＢＣ－ＣｒｅＥＲＴ２／＋）が得られた。
【0084】
全てのマウスが首都医科大学動物センターで飼育されていた。動物実験は、首都医科大学動物論理委員会に承認された（承認番号：ＡＥＥＩ－２０１５－１５６）。ＧｌｕＲ１Ｌｃマウスは、上海南方模式生物科学技術有限会社から購入された。本プロジェクトは、相同組換えの原理を利用し、ＥＳ細胞ターゲティングの手段を採用し、Ｒｏｓａ２６（ＥＮＳＭＵＳＧ００００００８６４２９）の遺伝子部位にＳＡ－ｐｏｌｙＡ－Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ－Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ－ＴＲＥ－ｍｉｎｉＣＭＶｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｇｒｉａ１（Ｍｕｔ）－ｗｐｒｅ－ｐＡ－Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ－Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ－ＦＲＴ－ＰＧＫ－Ｎｅｏ－ｐＡ－ＦＲＴ発現カセットを部位特異的に挿入した。
【0085】
簡単な過程は以下の通りである。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇの方法によりＥＳ細胞ターゲティングベクターを構築し、当該ベクターは、３．３ｋｂ ５’相同アーム、ＳＡ－ｐｏｌｙＡ－Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ－Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ－ＴＲＥ－ｍｉｎｉＣＭＶｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｇｒｉａ１（Ｍｕｔ）－ｗｐｒｅ－ｐＡ－Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ －Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ－ＦＲＴ－ＰＧＫ－Ｎｅｏ－ｐＡ－ＦＲＴ、３．２ｋｂ ３’相同アーム及びＭＣ１－ＴＫ－ｐｏｌｙＡネガティブセレクション標識を含む。当該ベクターに対して線形化を行った後、電気的形質移入法によりＣ５７ＢＬ／６ ＥＳ細胞をトランスフェクトした。Ｇ４１８及びＧａｎｃ薬物によりスクリーニングした後、合計で１４４個の耐性ＥＳ細胞クローンを得た。ロングフラグメントＰＣＲにより同定したところ、合計で９個の相同組換えが正確になされた陽性クローンを得た。陽性ＥＳ細胞クローンを増幅した後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胞胚内に注射し、キメラマウスを得た。高割合のキメラマウスとｆｌｐマウスを交配してｆｌｐ遺伝子が陽性であるＦ１世代の陽性脱Ｎｅｏマウスを３匹得た。ＧｌｕＲ１Ｌｃ ｍ／ｍ（ＥＮＳＧ０００００１５５５１１）トランスジェニックマウスとｒｔＴＡ＋／＋マウスを交配し、マウスが８～１０週齢程度になった時、飲み水にドキシサイクリンを加えてＧｌｕＲ１Ｌｃの発現を誘導した。
【0086】
試験設計は、図２１の通りであり、８～１０週齢のマウスにタモキシフェン（コーン油を対照とする）を５日間連続的に腹腔内注射することで、ＴＬＫ２ノックアウトを誘導した。１ヶ月後、飲み水にドキシサイクリン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を加えることでＧｌｕＲ１Ｌｃの発現を誘導し、カルシウム過負荷の発生を誘導した。
【0087】
ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトマウスは、上海南方模式生物科学技術有限会社から購入された。ＴＬＫ２遺伝子（ＥＮＳＧ０００００１４６８７２）の削除は、Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムを採用して行われる。相同組換えの原理を利用し、胚細胞を用いた相同組換えの手段を採用し、ＴＬＫ２遺伝子にｆｌｏｘ修飾を行った。簡単な過程は以下の通りである。インビトロ転写により、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを得て、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇの方法により相同組換えベクター（ｄｏｎｏｒ ｖｅｃｔｏｒ）を構築し、当該ベクターは、２ｋｂ ５’相同アーム、０．７ｋｂ ｆｌｏｘ領域及び２．８ｋｂ ３’相同アームを含む。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ及びｄｏｎｏｒ ｖｅｃｔｏｒをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胚細胞に微量注射し、Ｆ０世代のマウスを得た。ロングフラグメントＰＣＲにより同定したところ、合計で１匹の相同組換えが正確になされたＦ０世代のマウスを得た。Ｆ０世代のマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを交配して４匹の陽性のＦ１世代のマウスを得た。ＴＬＫ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスには、エクソン４を標的としたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術が採用された。それをＵＢＣ－ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスとペアリングした後、マウスが８～１０週齢程度になった時、タモキシフェン（７５ｍｇ／ｋｇ）を１日に１回腹腔内注射し始め、連続的に５日間注射し、全身組織のＴＬＫ２遺伝子のノックアウトを招いた。
【0088】
図２１のように、８～１０週齢のＧｌｕＲ１Ｌｃｍ／＋；ｒｔＴＡ＋／－；ＴＬＫ２ｆｌｏｘ／－；ＵＢＣ－ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスに、タモキシフェン（コーン油を対照とする）を連続的に５日間腹腔内注射することで、ＴＬＫ２ノックアウトを誘導した。１ヶ月後、飲み水にドキシサイクリン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）を加えてマウスが死亡するまでＧｌｕＲ１Ｌｃの発現を誘導した。
【0089】
ＴＬＫ２ ＫＯがなくＧｌｕＲ１Ｌｃのみを発現するマウスは、ドキシサイクリンにより処理されてから３日後に死亡し始めたが、ヘテロ接合体ＴＬＫ２ ＫＯのあるＧｌｕＲ１Ｌｃマウスは、生存時間がより長い（図２１）ことが分かり、ＴＬＫ２ ＫＯによりカルシウム過負荷マウスの寿命を延長することができることが示された。
【0090】
二、ＴＬＫ２ ＫＯによりカルシウム過負荷マウスの寿命を延長することができる
ペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ）でマウスを麻酔してから、マウスの腹部と胸腔を解剖し、注射器を左心室に挿入し、右心耳を切断し、肝臓が完全に白くなるまで０．９％の生理食塩水で迅速に灌流し、組織を固定化するように、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で徐々に灌流した。脳組織を取り出して４％のＰＦＡに入れて一晩静置し、続いて１０％、２０％及び３０％の勾配のショ糖で脱水した。その後、ＯＣＴで包み、－８０℃の冷蔵庫で冷凍した。凍結ミクロトームにより脳組織を厚み１０μｍの冠状切片に切断した。脳組織切片を４％のＰＦＡに入れて室温で１５分間固定化し、続いて０．２％のＰＢＳＴ（ＰＢＳは０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を含む）で３回パンチングし、毎回５分間とし、続いて５％のＢＳＡにより室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキング溶液で一次抗体を適切な濃度に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間とした。二次抗体を１：２００で希釈し、室温で、暗所で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間とした。ＤＡＰＩ希釈液で５分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により画像を取得した。
ペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ）でマウスを麻酔してから、マウスの腹部と胸腔を解剖し、注射器を左心室に挿入し、右心耳を切断し、肝臓が完全に白くなるまで０．９％の生理食塩水で迅速に灌流し、組織を固定化するように、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で徐々に灌流した。脳組織を取り出して４％のＰＦＡに入れて一晩静置し、続いて１０％、２０％及び３０％の勾配のショ糖で脱水した。その後、ＯＣＴで包み、－８０℃の冷蔵庫で冷凍した。凍結ミクロトームにより脳組織を厚み１０μｍの冠状切片に切断した。脳組織切片を４％のＰＦＡに入れて室温で１５分間固定化し、続いて０．２％のＰＢＳＴ（ＰＢＳは０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を含む）で３回パンチングし、毎回５分間とし、続いて５％のＢＳＡにより室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキング溶液で一次抗体を適切な濃度に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間とした。二次抗体を１：２００で希釈し、室温で、暗所で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間とした。ＤＡＰＩ希釈液で５分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により画像を取得した。
【0091】
図２２のように、ドキシサイクリンにより誘導されていないＣｏｎｔｒｏｌマウスのうち、死亡したマウスがいなく、ドキシサイクリンのみにより誘導されてタモキシフェンにより誘導されていないＧｌｕＲ１マウスは、３日目から死亡し始め、最も長くて６日間生存でき、ドキシサイクリンとタモキシフェンの両方により誘導されたＧｌｕＲ１＋ ＴＬＫ２ ＣＫＯマウスは、４日目から死亡し始め、最も長くて９日間生存できた。
【0092】
図２３のように、赤色は、ＴＨ陽性ニューロンを表し、青色は、細胞核（ＤＡＰＩ）を表す。免疫蛍光染色の結果により、ＧｌｕＲ１マウスのＴＨ陽性ニューロンの数が減少し、ＴＬＫ２ ＣＫＯによりＴＨ陽性ニューロンの数を部分的に回復することができることが示された。
【0093】
三、ＴＬＫ２ ＫＯのカルシウム過負荷マウスモデルにおける保護作用
マウスの脳組織をプロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）においてホモジネートし、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ ｓｅｃ ｏｎ／３ ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
マウスの脳組織をプロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）においてホモジネートし、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ ｓｅｃ ｏｎ／３ ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
【0094】
図２４のように、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの結果により、カルシウム過負荷マウスのＴＨタンパク質レベル及びＴＨ陽性ニューロンの数がいずれも低下したが、ＴＬＫ２ ＫＯによりＴＨのタンパク質レベル及びＴＨ陽性ニューロンの数を部分的に回復することができ、カルシウム過負荷ショウジョウバエと類似するように、ＧｌｕＲ１ＬｃマウスのＰ６２タンパク質レベルも上昇し、ＬＣ３－ＩＩ／Ｉの値が明らかに変化しておらず、ＴＬＫ２ ＫＯにより上昇したＰ６２タンパク質レベルを低下させることができることが分かった。
【0095】
四、ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりα－シヌクレイン過剰発現モデルマウスをレスキューすることができる
８～１０週齢程度のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを、ペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔してから、マウス脳定位固定装置に対称的に固定した。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｈ－α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ（漢恒生物）ウイルスを右側黒質部位に注射した（ＡＰ：－３．０ｍｍ；ＭＬ：－１．３ｍｍ；ＤＶ：－４．５ｍｍ）。１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器により０．１μＬ／ｍｉｎの速度で１μＬのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｈ－α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ（１．５×１０１２ｖｇ／ｍＬ）ウイルス又はＰＢＳを注射した。注射後に針を５分間保持した後、徐々に針を抜き出した。手術後に、マウスを電気毛布に置いて回復した。
８～１０週齢程度のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを、ペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔してから、マウス脳定位固定装置に対称的に固定した。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｈ－α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ（漢恒生物）ウイルスを右側黒質部位に注射した（ＡＰ：－３．０ｍｍ；ＭＬ：－１．３ｍｍ；ＤＶ：－４．５ｍｍ）。１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器により０．１μＬ／ｍｉｎの速度で１μＬのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｈ－α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ（１．５×１０１２ｖｇ／ｍＬ）ウイルス又はＰＢＳを注射した。注射後に針を５分間保持した後、徐々に針を抜き出した。手術後に、マウスを電気毛布に置いて回復した。
【0096】
図２５のように、８～１０週齢のホモ接合型ＴＬＫ２ ＫＯマウス（ＴＬＫ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＵＢＣ－ＣｒｅＥＲＴ２／＋）にタモキシフェン（コーン油を対照とする）を連続的に５日間腹腔内注射し、１週間後に、マウスの右側黒質緻密部（ＳＮｃ）にＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｈｕｍａｎ－α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎウイルス又はＰＢＳを注射し、１ヶ月後に、マウスに行動検出を行ってから殺処分した。
【0097】
五、ＴＬＫ２ ＫＯマウスがα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現マウスの行動異常を回復することができる
オープンフィールド試験では、マウスを飼育箱に置いて実験室の環境に約３０分間適応させ、続いて、マウスを５０×５０×５０ｃｍのフィールドに置いた。１分間適応させた後、マウスにオープンフィールドにおいて５分間探索させ続けた。ＳＭＡＲＴ ３．０ソフトウェア（ＲＷＤ、ｃｈｉｎａ）により５分間の自由探索を記録した後、マウスを飼育箱に戻し、７０％のエタノールでフィールドを清潔にした。
オープンフィールド試験では、マウスを飼育箱に置いて実験室の環境に約３０分間適応させ、続いて、マウスを５０×５０×５０ｃｍのフィールドに置いた。１分間適応させた後、マウスにオープンフィールドにおいて５分間探索させ続けた。ＳＭＡＲＴ ３．０ソフトウェア（ＲＷＤ、ｃｈｉｎａ）により５分間の自由探索を記録した後、マウスを飼育箱に戻し、７０％のエタノールでフィールドを清潔にした。
【0098】
ロータロッド試験では、マウスを飼育箱に置いて実験室の環境に約３０分間適応させ、続いて回転数が５～４５ｒｐｍ／ｍｉｎの加速回転ロッドに置き、最も長くて５分間持続した。毎日２回、連続的に３日間試験し、マウスがロータロッドから落ちた時間を記録し、且つ３日目の最後の２回の試験に対して運動能力分析を行った。
【0099】
図２６のように、左の図がロータロッド実験結果であり、真ん中及び右の図がオープンフィールド実験結果である。ロータロッド実験では、ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＢＳ注射グループ）、ＡＡＶ－ｓｙｎ（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎウイルス注射グループ）及びＡＡＶ－ｓｙｎ－ＴＬＫ２ ＣＫＯ（ＴＬＫ２ ＣＫＯマウスにα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎウイルスを注射したグループ）マウスがロータロッドから落ちた時間を比較した。オープンフィールド実験では、ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＢＳ注射グループ）、ＡＡＶ－ｓｙｎ（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎウイルス注射グループ）及びＡＡＶ－ｓｙｎ－ＴＬＫ２ ＣＫＯ（ＴＬＫ２ ＣＫＯマウスにα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎウイルスを注射したグループ）マウスが５分間自由移動した総距離及び平均速度を比較した。ＰＢＳが注射された対照グループと比べ、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現マウスの行動のパフォーマンスが悪かった。ＴＬＫ２ ＫＯマウスがα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現マウスの行動異常を回復することができた。
【0100】
六、ＴＬＫ２ ＫＯによりこれらの欠陥を軽減することができる
マウス脳組織をプロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）においてホモジネートし、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ ｓｅｃ ｏｎ／３ ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
マウス脳組織をプロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）においてホモジネートし、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ ｓｅｃ ｏｎ／３ ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
【0101】
図２７のように、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ結果により、左脳（対照グループ）と比べ、右脳のＴＨタンパク質レベルが低下し、且つα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質レベルが上昇したが、ＴＬＫ２ ＫＯによりα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現マウスにおける減少したＴＨタンパク質レベルを回復し、上昇したα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質レベルを低下させることができ、更に、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現マウスのＰ６２タンパク質レベルも上昇し、ＬＣ３－ＩＩ／Ｉの値が明らかに変化していなかったが、ＴＬＫ２ ＫＯにより上昇したＰ６２タンパク質レベルを低下させることができ、ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトによりα－シヌクレイン過剰発現によるオートファジーの低下を改善することができることが分かった。
【0102】
七、ＴＬＫ２ ＫＯによりα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現によるＴＨ陽性ニューロンの数の減少をレスキューすることができる
ペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ）でマウスを麻酔してから、マウスの腹部と胸腔を解剖し、注射器を左心室に挿入し、右心耳を切断し、肝臓が完全に白くなるまで０．９％の生理食塩水で迅速に灌流し、組織を固定化するように、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で徐々に灌流した。脳組織を取り出して４％のＰＦＡに入れて一晩静置し、続いて１０％、２０％及び３０％の勾配のショ糖で脱水した。その後、ＯＣＴで包み、－８０℃の冷蔵庫で冷凍した。凍結ミクロトームにより脳組織を厚み１０μｍの冠状切片に切断した。
ペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ）でマウスを麻酔してから、マウスの腹部と胸腔を解剖し、注射器を左心室に挿入し、右心耳を切断し、肝臓が完全に白くなるまで０．９％の生理食塩水で迅速に灌流し、組織を固定化するように、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で徐々に灌流した。脳組織を取り出して４％のＰＦＡに入れて一晩静置し、続いて１０％、２０％及び３０％の勾配のショ糖で脱水した。その後、ＯＣＴで包み、－８０℃の冷蔵庫で冷凍した。凍結ミクロトームにより脳組織を厚み１０μｍの冠状切片に切断した。
【0103】
脳組織切片を４％のＰＦＡに入れて室温で１５分間固定化し、続いて０．２％のＰＢＳＴ（ＰＢＳは０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を含む）で３回パンチングし、毎回５分間とし、続いて５％のＢＳＡにより室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキング溶液で一次抗体を適切な濃度に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間とした。二次抗体を１：２００で希釈し、室温で、暗所で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間とした。ＤＡＰＩ希釈液で５分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により画像を取得した。
【0104】
図２８のように、赤色は、ＴＨ陽性ニューロンを表し、緑色は、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを表し、青色は、細胞核（ＤＡＰＩ）を表す。左の白色破線ボックスを更に拡大したものは、右側の画像となる。マウス脳の冠状切片の免疫蛍光染色により、病変側のα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎの堆積が増加し、ＴＨ陽性ニューロンの数が減少したが、ＴＬＫ２ ＫＯによりα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現によるＴＨ陽性ニューロンの数の減少をレスキューすることができることが分かった。
【0105】
八、ＴＬＫ２がこれらの病理学的条件下で活性化される
マウス脳組織をプロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦ及びホスファターゼ阻害剤が添加されたＲＩＰＡ溶解液において迅速にホモジネートし、氷上で３０分間溶解した。４℃で、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集し、一部の上清液をアルカリホスファターゼにより処理し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。８％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに４０μｍｏｌ／ＬのＭｎＣｌ２及び２０μｍｏｌ／Ｌのｐｈｏｓ－ｔａｇを加えた。電気泳動後、５ｍＭのＥＤＴＡを含有する転写バッファでゲルを２０分間／回で２回洗浄することにより、二価カチオンを除去した。更に、正常の転写バッファで１０分間洗い流した。続いてタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。残りのステップは、正常のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの手順と同じである。
マウス脳組織をプロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦ及びホスファターゼ阻害剤が添加されたＲＩＰＡ溶解液において迅速にホモジネートし、氷上で３０分間溶解した。４℃で、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集し、一部の上清液をアルカリホスファターゼにより処理し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。８％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに４０μｍｏｌ／ＬのＭｎＣｌ２及び２０μｍｏｌ／Ｌのｐｈｏｓ－ｔａｇを加えた。電気泳動後、５ｍＭのＥＤＴＡを含有する転写バッファでゲルを２０分間／回で２回洗浄することにより、二価カチオンを除去した。更に、正常の転写バッファで１０分間洗い流した。続いてタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。残りのステップは、正常のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの手順と同じである。
【0106】
図２９のように、α－シヌクレイン過剰発現及びカルシウム過負荷の病理学的条件下で、ＴＬＫ２に過剰リン酸化が発生した。ｐｈｏｓ－ｔａｇ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法によりＴＬＫ２のリン酸化を検出した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）によりセリン、トレオニン及びチロシン残基に脱リン酸化処理を行った。ＧｌｕＲ１Ｌｃ及びα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ過剰発現マウスの脳においてＴＬＫ２リン酸化が増加したことを検出した。これは、ＴＬＫ２がこれらの病理学的条件下で活性化されたことが示された。
【0107】
九、ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトにより緑内障をレスキューできる細胞モデル及び動物モデル
ＰＢＳでＲＧＣ－５細胞を３回洗浄し、室温で５μＭのＦｌｕｏ４－ＡＭ及び０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７において暗所で３０分間インキュベートした。続いてＰＢＳで３回洗浄し、毎回１０分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により結像させて蛍光強度を測定した。
ＰＢＳでＲＧＣ－５細胞を３回洗浄し、室温で５μＭのＦｌｕｏ４－ＡＭ及び０．０２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７において暗所で３０分間インキュベートした。続いてＰＢＳで３回洗浄し、毎回１０分間とした。ライカＳＰ８共焦点顕微鏡により結像させて蛍光強度を測定した。
【0108】
緑内障に関連する複数のタイプの細胞には全てカルシウム過負荷現象が発生し、これは、高眼圧によって血液の流動が妨げられ、細胞中の酸素が不足するからである。細胞中の酸素不足がミトコンドリアの機能低下に繋がり、細胞のＡＴＰレベルを維持できず、カルシウム過負荷を招く。
【0109】
図３０のように、低酸素条件下でヒト網膜の上皮細胞にカルシウム過負荷が発生した。１％の酸素ガスで２４時間飼育した後、細胞内の相対カルシウムイオン濃度がＦｌｕｏ－４ＡＭ蛍光強度により指示されることができる。低酸素によってカルシウム過負荷が招かれた。ＴＬＫ２遺伝子ノックアウト細胞において、低酸素により誘導された細胞死（ＬＤＨ ａｓｓａｙで測定）が阻害されることができる。
【0110】
細胞の大きさ及び成長速度に応じて、検出時に細胞密度が８０～９０％を超えないように、適量の細胞を９６ウェルの細胞培養プレートに接種した。培養液を吸い取り、ＰＢＳ液で１回洗浄した。新鮮な培養液（１％の血清を含む低血清培養液又は適切な無血清培養液の使用が薦められる）に交換し、各培養ウェルを、細胞のない培養液ウェル（バックグラウンドブランク対照ウェル）、薬物処理されていない対照細胞ウェル（サンプル対照ウェル）、薬物処理されていない後続の溶解に用いられる細胞ウェル（サンプル最大酵素活性対照ウェル）、及び薬物処理された細胞ウェル（薬物処理サンプルウェル）といったグループに分けて標識した。
【0111】
実験の必要に応じて適切な薬物処理を施し（例えば、０～１０μＬ程度の特定の薬物刺激を与え、異なる濃度、異なる処理時間を設定することができ、対照ウェルに対照のために適切な薬物溶剤を加える必要がある）、通常のように培養し続けた。所定の検出時点の前の１時間、細胞インキュベータから細胞培養プレートを取り出し、「サンプル最大酵素活性対照ウェル」に、キットにより提供されるＬＤＨ放出試薬を添加し、添加量は、元の培養液の体積の１０％とされた。ＬＤＨ放出試薬を添加した後、複数回繰り返してピペッティングして均一に混合してから、細胞インキュベータにおいてインキュベートし続けた。
【0112】
所定の時間に達した後、細胞培養プレートをマルチウェルプレート型の遠心分離機において４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離した。それぞれ各ウェルの上清液を１２０μＬ取り、新たな９６ウェルプレートの対応するウェルに加えてから、直ちにサンプル測定を行った。各ウェルにそれぞれ６０μＬのＬＤＨ検出作動液を加えた。均一に混合し、室温（約２５℃）で、暗所で３０ｍｉｎインキュベートした（アルミニウム箔により被覆した後に水平シェーカ又はサイドスイングシェーカに置いて徐々に振盪してもよい）。続いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。６００ｎｍ以上の任意の波長を参照波長として使用し、二波長測定を行い、計算した（測定された各グループの吸光度のいずれからもバックグラウンドブランク対照ウェルの吸光度を差し引く必要がある）。
【0113】
図３１のように、新規な低分子がカルシウム過負荷損傷を阻害する活性を有することを見出した。細胞カルシウム過負荷モデルにより低分子ライブラリ（２０００種類の活性低分子を超える）において薬物スクリーニングを行い、ｄｒｕｇ１（ＰＭＺ）は陽性対照とされた。Ｄｒｕｇ２～４は、それぞれＶｏｌａｓｅｒｔｉｂ、Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ Ｇａｌｌａｔｅ及びＸＬ４１３を表す。
【0114】
硝子体に生理食塩水を注射し、急性高眼圧緑内障モデルを確立し、眼圧計によりマウスの眼圧を測定したところ、５０～７０ｍｍＨｇであった。４８時間後、網膜を取った。免疫組織化学的染色を行い、それぞれＲＧＣ細胞核、ＲＧＣニューラル木、細胞死マーカーを標識した。細胞死を野生型の同世代のマウスと比較した。
【0115】
図３２のように、マウスのＴＬＫ２遺伝子ノックアウトが緑内障損傷に拮抗する作用を有する。ＷＢ図により、ＴＬＫ２ヘテロ接合体のノックアウトがＴＬＫ２タンパク質レベルを確かに低下させたことが分かった。β－ａｃｔｉｎでタンパク質のローディング量を標識した。右の図は、マウス網膜蛍光免疫結果である。Ｓｈａｍは、処理されていない正常マウスの網膜である。β３ ｔｕｂｕｌｉｎ抗体によりニューロンにおけるチューブリン（緑色）を染色して標識し、ＲＢＰＭＳ抗体により視神経の細胞体（赤色）を標識し、ＤＡＰＩによりＤＮＡ（即ち、細胞核、青色）を標識した。緑内障モデルは急性高眼圧モデルであった。図中の結果により、緑内障モデルにより、神経細管の染色減少と破断が招かれ、網膜神経節細胞の数が減少したことが分かった。ＴＬＫ２遺伝子ノックアウトの背景で、上記損傷が顕著に軽減した。
【0116】
硝子体に生理食塩水を注射し、急性高眼圧緑内障モデルを確立し、眼圧計によりマウスの眼圧を測定したところ、５０～７０ｍｍＨｇであった。６時間後、薬物を腹腔内注射した。４８時間後、網膜を取った。又は、ＡＡＶ２ウイルスを眼底注射してＴＬＫ２ ｓｈ ＲＮＡを２週間発現した後、高眼圧処理し、４８時間後、網膜を取った。
【0117】
図３３のように、ＰＭＺは、緑内障損傷に拮抗する作用を有する。倪氏染色により、網膜中のニューロンを標識した。矢印は、網膜神経節層を指示する。ｃｏｎｔｒｏｌは、処理されていない正常のマウス網膜である。Ｎｏ ｄｒｕｇは、緑内障モデリング後に薬物治療が施されていないことを指す。１０ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇは、ＰＭＺの腹腔内注射の用量である（１日に１回）。図中の結果により、緑内障モデルにおいて網膜神経節層のニューロン数が減少したが、高用量のＰＭＺ（３０ｍｇ／ｋｇ）が保護作用を発揮することが分かった。同様の方法でＥｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ Ｇａｌｌａｔｅ、ＡＡＶ２ウイルス発現ＴＬＫ２ ｓｈ ＲＮＡの配列（ＧＡＣＣＧＣＴＴＧＡＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＴＡ、ＣＣＡＴＴＡＴＣＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＴ、ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＴＧＡＴＡ）を検定したところ、類似した薬効を有する。
【0118】
十、ＴＬＫ２ ｓｉＲＮＡ及び人工合成ヌクレオチド配列１～３３などのＡＡＶウイルスにより発現されたｓｈＲＮＡによるＴＬＫ２ ＲＮＡｉのノックダウン効率の検証（図３２）
ＳＫＮ組織を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ ｓｅｃ ｏｎ／３ ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
ＳＫＮ組織を収集し、プロテアーゼ阻害剤及びＰＭＳＦが添加されたＲＩＰＡ溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及び０．１％のＳＤＳ）において、氷上で３０分間溶解した。その後、氷上で４０ｗ ３ ｓｅｃ ｏｎ／３ ｓｅｃ ｏｆｆで１分間超音波処理し、４℃で遠心分離機において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集し、ＳＤＳローディングバッファで希釈し、９５℃で５分間煮た。２０～３０μｇのタンパク質をローディングし、８０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。ブロモフェノールブルーが底部に流れてから、１３０ｍＡの定電流で一晩転写し、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。５％のスキムミルクを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。適切に希釈した一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＨＲＰ二次抗体を１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い、毎回５分間とした。ＥＣＬ化学発光によりウェスタンブロットを現像させた。
【0119】
図３４のように、複数のヒトＴＬＫ２ ＲＮＡｉ配列は、ＴＬＫ２タンパク質レベルを低下させることができる。ヒトＳＫＮ細胞において異なるＴＬＫ２ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。列挙された７本の配列は、上記３３個の配列よりランダムに合成されたものであり、全て異なる程度でＴＬＫ２タンパク質レベルを低下させることができる。
【0120】
十一、ＴＬＫ２ ｓｈＲＮＡがアルツハイマー病関連のｔａｕタンパク質の堆積を減少させることができる
ヒト神経腫細胞系（ＳＫＮ）にレンチウイルスにより発現されるヒトｔａｕタンパク質を感染させ、安定的な発現細胞系を確立した。続いてレンチウイルスでＴＬＫ２ ｓｈＲＮＡを感染させた。７２時間培養した後に細胞を溶解し、タンパク質を収集した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓを作成し、β－ａｃｔｉｎは、タンパク質ローディング量の対照とされた。実験を３回繰り返した。
ヒト神経腫細胞系（ＳＫＮ）にレンチウイルスにより発現されるヒトｔａｕタンパク質を感染させ、安定的な発現細胞系を確立した。続いてレンチウイルスでＴＬＫ２ ｓｈＲＮＡを感染させた。７２時間培養した後に細胞を溶解し、タンパク質を収集した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓを作成し、β－ａｃｔｉｎは、タンパク質ローディング量の対照とされた。実験を３回繰り返した。
【0121】
図３５のように、ノックダウンＴＬＫ２（ｓｈＲＮＡ）は、細胞内のｔａｕタンパク質レベルを低下させることができ、ヒト神経腫細胞系（ＳＫＮ）においてｔａｕが過剰発現され、ＴＬＫ２ ｓｈＲＮＡはレンチウイルスに感染した。
【0122】
十二、ＴＬＫ２ ｓｈＲＮＡが筋萎縮性側索硬化症関連のＦＵＳタンパク質の堆積を減少させることができる
マウス初代培養ニューロンにレンチウイルスにより発現されるＦＵＳを感染させ、このタンパク質は、ヒトの突然変異した病原性タンパク質ＦＵＳ（Ｐ５２５Ｌ）である。ＦＵＳ（Ｐ５２５Ｌ）を安定的に発現する細胞系を確立した後、レンチウイルスでＴＬＫ２ ｓｈＲＮＡを感染させて発現した。７２時間培養した後、細胞を溶解し、タンパク質を収集した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓを作成し、β－ａｃｔｉｎは、タンパク質ローディング量の対照とされた。ＬＣ３ＩＩ／Ｉの値が大きいことは、オートファジーが活躍的であることを表す。実験を３回繰り返した。
マウス初代培養ニューロンにレンチウイルスにより発現されるＦＵＳを感染させ、このタンパク質は、ヒトの突然変異した病原性タンパク質ＦＵＳ（Ｐ５２５Ｌ）である。ＦＵＳ（Ｐ５２５Ｌ）を安定的に発現する細胞系を確立した後、レンチウイルスでＴＬＫ２ ｓｈＲＮＡを感染させて発現した。７２時間培養した後、細胞を溶解し、タンパク質を収集した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓを作成し、β－ａｃｔｉｎは、タンパク質ローディング量の対照とされた。ＬＣ３ＩＩ／Ｉの値が大きいことは、オートファジーが活躍的であることを表す。実験を３回繰り返した。
【0123】
図３６のように、ノックダウンＴＬＫ２（ｓｈＲＮＡ）が細胞内のＦＵＳタンパク質レベルを低下させ、細胞のオートファジーレベルを向上させることができる。マウス初代培養ニューロンにおいてＦＵＳ（病原性ＦＵＳ突然変異体、当該突然変異によって患者が筋萎縮性側索硬化症に罹患するようになる）が過剰発現されていた。ＴＬＫ２ ｓｈＲＮＡはレンチウイルスに感染した。
【0124】
従って、本発明は、上記カルシウム過負荷媒介ニューロン死のマーカー及び応用を採用し、カルシウム過負荷及びＴＬＫ２過剰リン酸化は、新規な分子マーカーとして疾患の進展を予測するか又は治療効果を検定し、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及び緑内障に対して迅速な早期警報の作用を有し、且つ、上記病症の治療用薬物の調製過程で主な治療効果を奏する。
【0125】
最後に、以上の実施例は、本発明の技術的解決手段を説明するためのものに過ぎず、それを制限するものではなく、好ましい実施例を参照しながら本発明を詳細に説明したが、当業者であれば、依然として本発明の技術的解決手段に修正や同等置換を行うことができ、これらの修正や同等置換によっても修正後の技術的解決手段が本発明の技術的解決手段の精神と範囲から逸脱することはないことを理解できるであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【配列表】