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特開2023-152713β－グルコシダーゼ活性向上剤、アグリコン含有組成物の製造方法、アグリコン吸収促進剤、及び飲食品
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023152713
(43)【公開日】2023-10-17
(54)【発明の名称】β－グルコシダーゼ活性向上剤、アグリコン含有組成物の製造方法、アグリコン吸収促進剤、及び飲食品
(51)【国際特許分類】
A23L 33/125 20160101AFI20231005BHJP
A23L 5/00 20160101ALI20231005BHJP
【ＦＩ】
A23L33/125
A23L5/00 J
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023018716
(22)【出願日】2023-02-09
(62)【分割の表示】P 2022059013の分割
【原出願日】2022-03-31
(71)【出願人】
【識別番号】000231453
【氏名又は名称】日本食品化工株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000800
【氏名又は名称】デロイトトーマツ弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】山根 健司
(72)【発明者】
【氏名】三輪 智弘
(72)【発明者】
【氏名】相沢 萌子
【テーマコード（参考）】
4B018
4B035
【Ｆターム（参考）】
4B018LB10
4B018MD29
4B018MD42
4B018MD86
4B018MD87
4B018ME14
4B018MF12
4B018MF13
4B035LC06
4B035LG19
4B035LG50
4B035LP41
(57)【要約】
【課題】β－グルコシダーゼ活性を有する細菌のβ－グルコシダーゼ活性を向上させることで、配糖体に含まれるファイトケミカルなどの有用成分の吸収を促進する。
【解決手段】グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖 を有効成分とするβ－グルコシダーゼ活性を有する細菌のβ－グルコシダーゼ活性向上剤、該β－グルコシダーゼ活性向上剤を利用したアグリコン含有組成物の製造方法、配糖体中のアグリコンの吸収促進剤、飲食品を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖 を有効成分とするβ－グルコシダーゼ活性を有する細菌のβ－グルコシダーゼ活性向上剤、該β－グルコシダーゼ活性向上剤を利用したアグリコン含有組成物の製造方法、配糖体中のアグリコンの吸収促進剤、飲食品を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を有効成分として含有することを特徴とするβ－グルコシダーゼ活性を有する細菌のβ－グルコシダーゼ活性向上剤。
【請求項2】
前記細菌は、ビフィズス菌、乳酸菌、及び腸内細菌に属する細菌から選ばれた少なくとも１種である、請求項１記載のβ－グルコシダーゼ活性向上剤。
【請求項3】
β－グルコシダーゼ活性を有する細菌に、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を付与して、β－グルコシダーゼを生成させ、該β－グルコシダーゼを配糖体に作用させて、アグリコンを遊離させることを特徴とするアグリコン含有組成物の製造方法。
【請求項4】
前記細菌は、ビフィズス菌、乳酸菌、及び腸内細菌に属する細菌から選ばれた少なくとも１種である、請求項３記載のアグリコン含有組成物の製造方法。
【請求項5】
前記アグリコンがファイトケミカルである、請求項３又は４記載のアグリコン含有組成物の製造方法。
【請求項6】
グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を有効成分として含有することを特徴とする配糖体中のアグリコンの吸収促進剤。
【請求項7】
前記アグリコンがファイトケミカルである、請求項６記載のアグリコンの吸収促進剤。
【請求項8】
グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖と、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌、及び配糖体の少なくとも１種とを含有することを特徴とする飲食品。
【請求項9】
前記細菌は、ビフィズス菌、乳酸菌、及び腸内細菌に属する細菌から選ばれた少なくとも１種である、請求項８記載の飲食品。
【請求項10】
前記配糖体が、アグリコンとしてファイトケミカルが結合したものである、請求項８又は９記載の飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌のβ－グルコシダーゼ活性向上剤、並びに該β－グルコシダーゼ活性向上剤を利用した、アグリコン含有組成物の製造方法、アグリコン吸収促進剤、及び飲食品に関する。
【背景技術】
【0002】
ファイトケミカルは、一般的に、通常の身体機能の維持には必要とされないが、健康に良い影響を与える植物由来の化合物を意味する。ファイトケミカルの中でも、イソフラボン類、フラボノール類、アントシアニン類等のフラボノイドなどは、グルコースなどの糖が結合した配糖体の形で多く存在している。これらの化合物は配糖体のままでは吸収され難く、効率の良い吸収には配糖体から糖が外れ、アグリコン化される必要がある。配糖体からアグリコンを得るためには、配糖体からβ－グルコシダーゼを用いて末端の糖を選択的に除去する方法が知られている。しかし、ヒトはβ－グルコシダーゼを有していないため、β－グルコシダーゼを有する腸内細菌の働きにより配糖体からアグリコンを遊離させることで、ファイトケミカルを効率よく吸収することが可能となる。
【0003】
そのため、従来よりβ－グルコシダーゼ活性を向上させる成分の探索や、β－グルコシダーゼ生産性の高い細菌の探索が行われてきた。例えば、β－グルコシダーゼ活性を促進する化合物としては、ダイフラクト―スアンハイドライド（特許文献１）が挙げられる。
【0004】
β－グルコシダーゼを有する細菌の一例として、ビフィズス菌や乳酸菌が挙げられる。ビフィズス菌や乳酸菌は整腸作用、抗アレルギー作用、病原菌およびウイルス等に対する感染防御、栄養、有害菌増殖抑制等の面でも有益に働く、プロバイオティクスとも呼ばれる有用菌でもある。そのため、ビフィズス菌や乳酸菌のβ－グルコシダーゼ活性を高めることは、摂取されたファイトケミカルを生体内において効率的に吸収する上で、有効な手段であるといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００５－２２５８３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌のβ－グルコシダーゼ活性を向上させることで、配糖体として存在しているファイトケミカルなどの有用成分から糖を脱離させ、アグリコン化したファイトケミカルの吸収を促進することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖が、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌、例えばビフィズス菌、乳酸菌、その他の腸内細菌などのβ－グルコシダーゼ活性を向上させる作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明の第１は、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を有効成分として含有することを特徴とするβ－グルコシダーゼ活性を有する細菌のβ－グルコシダーゼ活性向上剤を提供する。
【0009】
第１の発明において、前記細菌は、ビフィズス菌、乳酸菌、及び腸内細菌に属する細菌から選ばれた少なくとも１種であることが好ましい。
【0010】
本発明の第２は、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌に、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を付与して、β－グルコシダーゼを生成させ、該β－グルコシダーゼを配糖体に作用させて、アグリコンを遊離させることを特徴とするアグリコン含有組成物の製造方法を提供する。
【0011】
第２の発明において、前記細菌は、ビフィズス菌、乳酸菌、及び腸内細菌に属する細菌から選ばれた少なくとも１種であることが好ましい。
【0012】
また、第２の発明において、前記アグリコンがファイトケミカルであることが好ましい。
【0013】
本発明の第３は、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を有効成分として含有することを特徴とするアグリコン吸収促進剤を提供する。
【0014】
第３の発明において、前記アグリコンがファイトケミカルであることが好ましい。
【0015】
本発明の第４は、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖と、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌、及び配糖体の少なくとも１種とを含有することを特徴とする飲食品を提供する。
【0016】
第４の発明において、前記細菌は、ビフィズス菌、乳酸菌、及び腸内細菌に属する細菌から選ばれた少なくとも１種であることが好ましい。
【0017】
また、第４の発明において、前記配糖体が、アグリコンとしてファイトケミカルが結合したものであることが好ましい。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌にグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を付与することにより、β－グルコシダーゼ活性を向上させることができる。このため、本発明のβ－グルコシダーゼ活性向上剤を摂取することにより、腸内細菌のβ－グルコシダーゼ活性が向上する。その結果、アグリコンとしてファイトケミカルなどが結合した配糖体を摂取した際に、配糖体の糖が脱離してアグリコンが遊離しやすくなり、アグリコンであるファイトケミカルなどの吸収効率を高めることができる。
【0019】
また、本発明によれば、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌のβ－グルコシダーゼ活性を向上させ、該βグルコシダーゼを作用させることにより、配糖体からアグリコンを効率良く遊離させて、アグリコン含有組成物を製造することができる。
【0020】
更に、本発明によれば、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖と、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌、及び配糖体の少なくとも１種とを含有することにより、腸内において配糖体からアグリコンを遊離させて、アグリコンを効果的に吸収できる飲食品を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】グルコースとフルクトースを1対９で混合した水溶液にβ－グルコシダーゼを添加して２４時間反応させたサンプル溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図表である。
【図3】図２の分画溶液を活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約40％に濃縮した溶液について、４００ＭＨｚ核磁気共鳴分光計（ＮＭＲ）（製品名：Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ ４００ ＰＬＵＳ、ＢＲＵＫＥＲ社製）を用いた分析を行った結果を示す図表である。
【図5】グルコースを溶解した水溶液にβ－グルコシダーゼを添加して４８時間反応させたサンプル溶液を、逆浸透膜を用いて、グルコースとフルクトースを排除した後、活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約４０％に濃縮した溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図表である。
【図6】炭素源としてβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦを用いたビフィズス菌の培養上清液及び炭素源を加えないビフィズス菌の培養上清液によるグリシチンからの遊離グルコース量の結果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明において、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖（以下「β－GＦ」と略称することがある）の製造方法は特に制限はなく、酵素合成、化学合成、分解、抽出など様々な手法を用いることができるが、その簡便性や製造コスト等の点から、Ｄ－グルコース（以下、「グルコース」ともいう。）及びＤ－フルクトース（以下、「フルクトース」ともいう。）を含む糖質原料に酵素を作用させて製造することが好ましい。
【0023】
上記製造方法としては、例えば特許第６６３６００３号公報に記載された、グルコースとフルクトースとを含有する糖質原料にβ－グルコシダーゼを作用させる方法が好ましく採用される。この方法では、下記式（１）で示されるβ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→１）－Ｄ－フルクトースを含むグルコースとフラクトースがβ結合した二糖含有組成物を得ることができる。
【0024】
【化1】
【0025】
原料とするグルコースとフルクトースは、グルコース及びフルクトースを含有するものであれば特に制限はなく、グルコース及びフルクトースを任意で混合したものでもよく、例えば、スクロース等のグルコースとフルクトースとを構成糖として含む糖質を分解することにより生成させたものでもよく、例えば異性化酵素等の触媒によりグルコース又はフルクトースをもう一方の糖質に異性化することにより生成させたものでもよい。このような糖として、入手のしやすさやコスト等を考慮すると、異性化糖（ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、高果糖液糖）や転化糖を用いるのが好ましい。
【0026】
用いるグルコースとフルクトースの質量比は、固形分換算でグルコースとフルクトースの質量比が０．１：１０～１０：０．１とするのが好ましく、１：１０～１０：１とするのがより好ましい。
【0027】
用いるβ－グルコシダーゼとしては、特に制限はなく、種々の起源の酵素を用いることができる。例えば、アーモンド由来、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のβ－グルコシダーゼを用いることができ、培養した微生物などから分離精製した酵素を用いてもよく、市販の酵素製剤を用いてもよい。酵素製剤としてはβ－グルコシダーゼ製剤だけでなく、β－グルコシダーゼが混在したセルラーゼ製剤等を用いることもできる。
【0028】
グルコースとフルクトースにβ－グルコシダーゼを作用させる条件としては、用いるβ－グルコシダーゼの至適条件などを考慮して適宜設定することができる。例えば、グルコース及びフルクトースを含有し、固形分濃度が好ましくは３０～９０質量％、より好ましくは５０～８０質量％である水溶液を調製し、ｐＨを好ましくは４．０～８．０、より好ましくは５．０～７．０とし、上記固形分１ｇ当たり、好ましくは０．１～１０００ｍｇ、より好ましくは１～２５０ｍｇとなるようにβ－グルコシダーゼを添加し、好ましくは３０～８０℃、より好ましくは５０～７０℃にて、好ましくは１～１００時間、より好ましくは２４～７２時間保持することで作用させることができる。なお、上記水溶液の固形分当たりのグルコース及びフルクトースの合計含量は３０質量％以上であることが好ましく、５０質量％以上であることがより好ましく、７０質量％以上であることが更に好ましい。
【0029】
グルコースとフルクトースにβ－グルコシダーゼを作用させて得られたβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖含有組成物（以下「β－GＦ含有組成物」と略称することがある）は、液状のままであってもよいが、噴霧乾燥などの公知の方法により粉末状とすることができる。
【0030】
また、β－GＦ含有組成物は、必要に応じて、ろ過、脱色、脱臭、脱塩などの精製処理を常法により施すことができる。また、抽出、遠心分離、晶出、微生物資化、更に活性炭、多孔質担体、疎水性樹脂、親水性樹脂、イオン交換樹脂、吸着樹脂等を利用したクロマトグラフィーによる分画、透析、限界ろ過等の膜分画等の処理を施して、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖（β－GＦ）の純度を高めることができる。
【0031】
本発明において、β－GＦは、高純度化されたものとして利用することもできるが、β－GＦを含有する糖組成物として利用することもできる。この場合、β－GＦの含有量は、特に制限はないが、例えば、固形分あたり０．５質量％以上とすることが好ましく、１質量％以上とすることがより好ましく、２質量％以上とすることが更に好ましく、３質量％以上とすることが最も好ましい。固形分あたりのβ－GＦの含有量が０．５質量％未満では、β－GＦの特徴を十分に付与することができないというデメリットがある。
【0032】
なお、β－GF中にはβ―グルコシダーゼの作用によりグルコースがフラクトースにβ結合で糖転移反応した２糖の構造体、つまりβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトース、β－D－グルコピラノシル－(1→2)－D－フラクトース、β－D－グルコピラノシル－(1→3)－D－フラクトース、β－D－グルコピラノシル－(1→4)－D－フラクトース（セロビウロースとも言う）、β－D－グルコピラノシル－(1→5)－D－フラクトース、β－D－グルコピラノシル－(1→6)－D－フラクトース（ゲンチオビウロースとも言う）を含む。また、主にフラクトース骨格はβ－Ｄ－フルクトピラノースとして存在するが、鎖状構造を介して構造が変化し、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、β－Ｄ－フルクトフラノースとしても存在する。一例として、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースは、主にβ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→１）－β－Ｄ－フルクトピラノースとして存在するが、β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→１）－α－Ｄ－フルクトピラノース、β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→１）－α－Ｄ－フルクトフラノース、及びβ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→１）－β－Ｄ－フルクトフラノースとしても存在する。
【0033】
本発明において、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌として、例えば、ビフィズス菌、乳酸菌、その他の腸内細菌が挙げられる。
【0034】
ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム属に属する細菌であれば特に制限はなく、例えば、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム、ビフィドバクテリウム・カテニュラタム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシズ・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・アングラタム、ビフィドバクテリウム・ファエカリス、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクティスが挙げられる。なお、ビフィズス菌は、腸内細菌に限られず、β－グルコシダーゼ活性を有するものであれば、いずれも使用できる。
乳酸菌としては、ラクトバチラス属やラクチプランチバチラス属、リモシラクトバチラス属、ラクチカゼイバチルス属、レビラクトバチラス属、フルクチラクトバチラス属、アピラクトバチラス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属に属する有用細菌であれば特に制限はなく、例えばラクトバチラス・ガセリ、ラクトバチラス・カゼイ、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシズ・メセンテロイデスが挙げられる。なお、乳酸菌は、腸内細菌に限られず、β－グルコシダーゼ活性を有するものであれば、いずれも使用できる。
乳酸菌としては、ラクトバチラス属やラクチプランチバチラス属、リモシラクトバチラス属、ラクチカゼイバチルス属、レビラクトバチラス属、フルクチラクトバチラス属、アピラクトバチラス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属に属する有用細菌であれば特に制限はなく、例えばラクトバチラス・ガセリ、ラクトバチラス・カゼイ、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシズ・メセンテロイデスが挙げられる。なお、乳酸菌は、腸内細菌に限られず、β－グルコシダーゼ活性を有するものであれば、いずれも使用できる。
【0035】
ビフィズス菌、乳酸菌以外の腸内細菌としては、例えばバクテロイデス属（Bacteroides）、クロストリジウム属（Clostridium）、ロセブリア属(Roseburia)、ドレア属(Dorea)などに属する細菌が挙げられる。
【0036】
本発明においてビフィズス菌、乳酸菌及びその他の腸内細菌のβ－グルコシダーゼの活性向上は、４－ニトロフェニルβ－グルコシド（以下、ｐＮＰＧ）の遊離ｐＮＰを指標にして評価することができる。具体的には１３．６ｍＭ ｐＮＰＧ溶液０．２ｍＬ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．４ｍＬ、菌培養上清液０．２ｍＬの反応液から成り、４０℃で一定時間後、反応混合液０．４ｍＬを１０ｍＬの０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液に加え、遊離ｐＮＰを４０５ｎｍの吸光度を測定することにより評価する。
【0037】
すなわち、供試菌を、β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→１）－Ｄ－フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖（β－ＧＦ）を添加した培地に植菌して所定時間培養する。そして、培養した後の培養上清液を用いた遊離ｐＮＰ値を、β－ＧＦの代わりにグルコースを添加して培養した培養上清液を用いた遊離ｐＮＰ値で割り、１００を乗することでβ－グルコシダーゼ活性向上率（％）を算出する。本発明においては活性向上率（％）が１１０を超えた場合に十分なβ－グルコシダーゼの活性向上効果があると判断する。
【0038】
本発明のβ－グルコシダーゼ活性向上剤は、これを摂取することにより、腸内細菌に作用して、腸内細菌のβ－グルコシダーゼ活性を向上させることができ、それによって摂取された配糖体からアグリコンを遊離させ、アグリコンの吸収性を高める効果をもたらす。このため、本発明のβ－グルコシダーゼ活性向上剤は、アグリコン吸収促進剤として用いることもできる。
【0039】
本発明のβ－グルコシダーゼ活性向上剤及びアグリコン吸収促進剤は、飲食品、医薬品、医薬部外品等に、原料として、あるいは添加剤として、配合して使用することができる。
【0040】
本発明において、有効成分であるβ－GＦの、飲食品、医薬品、医薬部外品等への配合量は、ビフィズス菌、乳酸菌及びその他の腸内細菌など、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌のβ－グルコシダーゼ活性向上効果を発揮できる量であれば特に限定されない。
【0041】
本発明のβ－グルコシダーゼ活性向上剤及びアグリコン吸収促進剤を配合する飲食品の種類は、特に制限はなく、例えば、日常的に食する飲食品、健康食品（サプリメント、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品、栄養補助食品等）、病者用食品等として提供することができる。その形態としては、飲食物、錠剤、液剤、カプセル（軟カプセル、硬カプセル）、粉末、顆粒、スティック、ゼリーなどが挙げられる。このような飲食品は、飲食品の製造に通常用いられる方法に従って、製造することができる。
【0042】
本発明の有効成分であるβ－GＦを飲食品として提供する場合には、該有効成分をそのまま飲食品として提供することもできるし、あるいはそれを飲食品に含有させて提供することもできる。飲食品として提供する場合には、本発明の有効成分であるβ－GＦを有効量含有させることが好ましい。本明細書において、本発明の有効成分を「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に後述するような範囲で本発明の有効成分が摂取されるような含有量をいう。
【0043】
本発明の有効成分であるβ－GＦを含有させるのに適した飲食品としては、例えば、以下のものが挙げられる。
・ノンアルコール飲料（果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュース、プラントベースミルク飲料、炭酸飲料、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料、スポーツ飲料、コーヒー、カフェオレ、ココア飲料、茶系飲料、乳酸菌飲料、乳飲料、栄養ドリンク、ノンアルコールビール、ノンアルコールチューハイ、ノンアルコールカクテル、ニアウォーター、フレーバーウォーターなど）、アルコール飲料（ビール、発泡酒、リキュール、チューハイ、清酒、ワイン、果実酒、カクテル、蒸留酒など）などの飲料類
・アイスクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、かき氷、フラッペ、フローズンヨーグルト、ゼリー、プリン、ババロア、水羊羹などの冷菓類
・水飴、果実のシロップ漬、氷みつ、チョコレートシロップ、カラメルシロップなどのシロップ類
・フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、バタークリーム、カスタードクリームなどのペースト類
・マーマレード、フルーツソース、ブルーベリージャム、苺ジャムなどのジャム類
・食パン、ロールパン、ブリオッシュ、蒸しパン、あんパン、クリームパンなどのパン類
・ビスケット、クラッカー、クッキー、ワッフル、マフィン、スポンジケーキ、パイなどの焼菓子類
・シュークリーム、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディなどの洋菓子類
・せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、大福、ういろう、餡類、錦玉、カステラ、飴玉などの和菓子類
・醤油、魚醤、味噌、ひしお、マヨネーズ、ドレッシング、三杯酢、天つゆ、麺つゆ、ウスターソース、オイスターソース、ケチャップ、焼き鳥のタレ、焼き肉のタレ、漬け込みタレ、甘味料、粉飴、食酢、すし酢、カレールウ、中華の素、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルソルト、テーブルシュガーなどの各種調味料類
・パスタソース、ミートソース、トマトソース、ホワイトソース、デミグラスソース、カレーソース、ハヤシソース、グレービーソース、ハンバーグソース、サルサソース、ステーキソースなどのソース類
・糠漬け、粕漬け、味噌漬け、福神漬け、べったら漬、奈良漬け、千枚漬、梅干しなどの漬物類
・たくわん漬の素、白菜漬の素、キムチの素などの漬物の素
・ハム、ベーコン、ソーセージ、ハンバーグ、ミートボールなどの畜肉製品類
・魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、干物などの魚肉製品類
・塩ウニ、カラスミ、塩辛、なれずし、酢コンブ、さきするめ、田麩などの各種珍味類
・海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類
・煮豆、煮魚、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品
・乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜などの瓶詰類や缶詰類
・天ぷら、トンカツ、フリッター、唐揚げ、竜田揚げなどの揚げ物用衣類
・うどん、そば、中華麺、パスタ、春雨、ビーフン、餃子の皮、シューマイの皮などの麺類
・プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席汁粉、即席スープなどの即席食品類
本発明において、β－GＦを日常的に食する飲食品に配合する場合には、β－GＦの飲食品における含有量（固形分換算）は、例えば、その下限値（以上又は超える）は０．５質量％、１質量％、１．５質量％とすることができ、その上限値（以下又は未満）は３５質量％、３０質量％、２５質量％とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、日常的に食する食品におけるβ－GＦの含有量（固形分換算）の範囲は、例えば、０．５～３５質量％、１～３０質量％、１．５～２５質量％とすることができる。
・ノンアルコール飲料（果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュース、プラントベースミルク飲料、炭酸飲料、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料、スポーツ飲料、コーヒー、カフェオレ、ココア飲料、茶系飲料、乳酸菌飲料、乳飲料、栄養ドリンク、ノンアルコールビール、ノンアルコールチューハイ、ノンアルコールカクテル、ニアウォーター、フレーバーウォーターなど）、アルコール飲料（ビール、発泡酒、リキュール、チューハイ、清酒、ワイン、果実酒、カクテル、蒸留酒など）などの飲料類
・アイスクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、かき氷、フラッペ、フローズンヨーグルト、ゼリー、プリン、ババロア、水羊羹などの冷菓類
・水飴、果実のシロップ漬、氷みつ、チョコレートシロップ、カラメルシロップなどのシロップ類
・フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、バタークリーム、カスタードクリームなどのペースト類
・マーマレード、フルーツソース、ブルーベリージャム、苺ジャムなどのジャム類
・食パン、ロールパン、ブリオッシュ、蒸しパン、あんパン、クリームパンなどのパン類
・ビスケット、クラッカー、クッキー、ワッフル、マフィン、スポンジケーキ、パイなどの焼菓子類
・シュークリーム、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディなどの洋菓子類
・せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、大福、ういろう、餡類、錦玉、カステラ、飴玉などの和菓子類
・醤油、魚醤、味噌、ひしお、マヨネーズ、ドレッシング、三杯酢、天つゆ、麺つゆ、ウスターソース、オイスターソース、ケチャップ、焼き鳥のタレ、焼き肉のタレ、漬け込みタレ、甘味料、粉飴、食酢、すし酢、カレールウ、中華の素、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルソルト、テーブルシュガーなどの各種調味料類
・パスタソース、ミートソース、トマトソース、ホワイトソース、デミグラスソース、カレーソース、ハヤシソース、グレービーソース、ハンバーグソース、サルサソース、ステーキソースなどのソース類
・糠漬け、粕漬け、味噌漬け、福神漬け、べったら漬、奈良漬け、千枚漬、梅干しなどの漬物類
・たくわん漬の素、白菜漬の素、キムチの素などの漬物の素
・ハム、ベーコン、ソーセージ、ハンバーグ、ミートボールなどの畜肉製品類
・魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、干物などの魚肉製品類
・塩ウニ、カラスミ、塩辛、なれずし、酢コンブ、さきするめ、田麩などの各種珍味類
・海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類
・煮豆、煮魚、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品
・乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜などの瓶詰類や缶詰類
・天ぷら、トンカツ、フリッター、唐揚げ、竜田揚げなどの揚げ物用衣類
・うどん、そば、中華麺、パスタ、春雨、ビーフン、餃子の皮、シューマイの皮などの麺類
・プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席汁粉、即席スープなどの即席食品類
本発明において、β－GＦを日常的に食する飲食品に配合する場合には、β－GＦの飲食品における含有量（固形分換算）は、例えば、その下限値（以上又は超える）は０．５質量％、１質量％、１．５質量％とすることができ、その上限値（以下又は未満）は３５質量％、３０質量％、２５質量％とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、日常的に食する食品におけるβ－GＦの含有量（固形分換算）の範囲は、例えば、０．５～３５質量％、１～３０質量％、１．５～２５質量％とすることができる。
【0044】
本発明において、β－GＦをサプリメント（例えば、スティックサプリメント）として提供する場合には、サプリメントにおけるβ－GＦの含有量（固形分換算）は、例えば、その下限値（以上又は超える）は５０質量％、６０質量％、７０質量％とすることができ、その上限値（以下又は未満）は１００質量％、９８質量％、９５質量％とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、サプリメントにおけるβ－GＦの含有量の範囲は、例えば、５０～１００質量％、６０～９８質量％、７０～９５質量％とすることができる。
【0045】
本発明の有効成分であるβ－GＦを医薬品又は医薬部外品として提供する場合には、必要に応じて、有効成分に対し薬学上許容される基材や担体を添加して製剤化することができる。例えば、β－GＦを経口投与される医薬品又は医薬部外品に製剤化することができる。経口投与製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、粉末、顆粒、カプセル剤が挙げられる。このような製剤は、医薬品および医薬部外品の製造に通常用いられる方法に従って、製造することができる。
【0046】
本発明において、β－GＦを医薬品又は医薬部外品に配合する場合には、医薬品又は医薬部外品における含有量（固形分換算）は、例えば、その下限値（以上又は超える）は０．１質量％とすることができ、その上限値（以下又は未満）は３０質量％とすることができる。
【0047】
本発明の有効成分であるβ－GＦの摂取量又は投与量は、受容者の性別、年齢および体重、摂取時間、剤形、症状、摂取・投与経路、並びに組み合わせる食品・薬剤等に依存して決定できる。本発明の有効成分であるβ－GＦの成人１日当たりの摂取量又は投与量は、固形分換算質量により特定することができ、例えば、その下限値は０．１ｇ、３ｇとすることができ、その上限値は３０ｇ、１０ｇとすることができる。これらの上限値および下限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、上記摂取量又は投与量の範囲は、例えば、０．１～３０ｇ、３～１０ｇとすることができる。
本発明が適用される配糖体としては、β－グルコシダーゼにより糖が脱離し、アグリコンが遊離するものであれば特に制限はないが、ファイトケミカルが結合した配糖体が好ましく採用される。本発明において、ファイトケミカルとは、ヒトの健康に良い影響を与える植物由来化合物を意味し、例えば、ポリフェノール、フラボノイドなどが挙げられる。
ポリフェノールとはベンゼン環に複数の水酸基を持つ化合物を指し、タンニン（加水分解タンニンとしてガロタンニン、エラジタンニン、縮合型タンニンとしてカテキンやエピカテキンの縮合体）、カテキン（カテキン、エピカテキン）、フラボノイド（フラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノノール、イソフラボン、カルコン、オーロン、ロイコアントシアニン、カテキン）、リグナン（セサミノール、ピノレジノール）、リグニン、クマリン、シンプルフェノール（プロトカテチュ酸、没食子酸、シリンガ酸）などが挙げられ、抗酸化作用を有することが知られている。本発明のβ－GＦを摂取することにより、配糖体の形で存在しているポリフェノールにおけるアグリコンとしてのポリフェノール成分の消化吸収を促進することができる。
本発明が適用される配糖体としては、β－グルコシダーゼにより糖が脱離し、アグリコンが遊離するものであれば特に制限はないが、ファイトケミカルが結合した配糖体が好ましく採用される。本発明において、ファイトケミカルとは、ヒトの健康に良い影響を与える植物由来化合物を意味し、例えば、ポリフェノール、フラボノイドなどが挙げられる。
ポリフェノールとはベンゼン環に複数の水酸基を持つ化合物を指し、タンニン（加水分解タンニンとしてガロタンニン、エラジタンニン、縮合型タンニンとしてカテキンやエピカテキンの縮合体）、カテキン（カテキン、エピカテキン）、フラボノイド（フラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノノール、イソフラボン、カルコン、オーロン、ロイコアントシアニン、カテキン）、リグナン（セサミノール、ピノレジノール）、リグニン、クマリン、シンプルフェノール（プロトカテチュ酸、没食子酸、シリンガ酸）などが挙げられ、抗酸化作用を有することが知られている。本発明のβ－GＦを摂取することにより、配糖体の形で存在しているポリフェノールにおけるアグリコンとしてのポリフェノール成分の消化吸収を促進することができる。
【0048】
また、フラボノイドは上記ポリフェノールにも含まれるが、狭義にはフラボン（ルテオリン、アピゲニン等）、フラボノール（ケルセチン、ケンフェロール等）、フラバノン（ナリンゲニン、ヘスペレチン等）、フラバノノール、イソフラボン（ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン等）の５種類を指し、広義にはアントシアニジン、ロイコシアニジン、カテキン、カルコン（フロレチン、イソリクイリチゲニン等）、オーロン、クメスタン（クメステロール等）等を含むものである。
【0049】
フラボノイドには抗酸化作用が期待されるが、その他に、エストロジェン作用を有するフラボノイドとして、カルコン類のイソリクイリチゲニン、イソフラボン類のゲニステイン、ダイゼイン、グリシテイン、フラボノール類のケンフェロール、フラバノン類のナリンゲニン、フラボン類のアピゲニン、クメスタン類のクメステロールを挙げることができる。その他にも、フラボノイドには発ガン予防効果、老化防止効果、痴呆症・糖尿病・動脈硬化・胃潰瘍・肝炎等の改善効果が期待され、研究されている。
【0050】
本発明のアグリコン含有組成物の製造方法は、β－GＦをβ－グルコシダーゼ活性を有する細菌に付与してβ－グルコシダーゼを生成させ、該β－グルコシダーゼを上記配糖体に作用させることで、配糖体からアグリコンが遊離され、アグリコン含有組成物を得る方法であり、配糖体として存在していなくても安定な化合物において、特に有用である。例えば、イソフラボン配糖体を含む豆乳や味噌を、β－GＦを付与したβ－グルコシダーゼ活性を有する乳酸菌を用いて醗酵させることにより、豆乳や味噌中の遊離したイソフラボンを得ることができる。
【0051】
本発明の飲食品としては、β－GＦと、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌、及び配糖体の少なくとも１種とを含有するものを提供することもできる。このような飲食品であれば、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌、及び配糖体の少なくとも１種が、β－GＦと一緒に摂取されることによって、腸内で配糖体中のアグリコンを効果的に遊離させて、アグリコンを吸収させることができる。特に好ましくは、β－GＦと、β－グルコシダーゼ活性を有する細菌と、生理活性を持つポリフェノールあるいはフラボノイドなどのファイトケミカルが結合した配糖体とを含有する飲食品である。このような飲食品を摂取することにより、生理活性を持つポリフェノールあるいはフラボノイドなどのファイトケミカルを体内で遊離させて効果的に吸収させることができる。
【実施例0052】
［実施例１］
（１）β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含む、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖の製造例
Ｄ－グルコース（製品名：無水結晶ブドウ糖、日本食品化工株式会社製）（以下、「グルコース」ともいう。）とＤ－フルクトース（ナカライテスク株式会社製）（以下、「フルクトース」ともいう。）を１対９比で混合したものをそれぞれ６０ｗ／ｗ％となるように超純水に溶解した。０．１Ｍの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．６に調整した。６０℃下でβ－グルコシダーゼ（東洋紡株式会社製）を１ｍｇ／ｇ－ｄｓ添加し、２４時間保持し、反応させた。
（１）β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含む、グルコースとフラクトースとがβ結合した二糖の製造例
Ｄ－グルコース（製品名：無水結晶ブドウ糖、日本食品化工株式会社製）（以下、「グルコース」ともいう。）とＤ－フルクトース（ナカライテスク株式会社製）（以下、「フルクトース」ともいう。）を１対９比で混合したものをそれぞれ６０ｗ／ｗ％となるように超純水に溶解した。０．１Ｍの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．６に調整した。６０℃下でβ－グルコシダーゼ（東洋紡株式会社製）を１ｍｇ／ｇ－ｄｓ添加し、２４時間保持し、反応させた。
【0053】
こうして得られたサンプル溶液のＨＰＬＣ分析結果を図１に示す。ＨＰＬＣ分析は、カラム（２５０ｍｍ×６．０ｍｍＩ．Ｄ．）（製品名：ＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８、株式会社ワイエムシィ）を二本連結し、カラム温度を３０℃として超純水を流速１．２ｍＬ／ｍｉｎで通液し、示差屈折率検出器（株式会社島津製作所製）で検出を行った。図１に示すように、上記サンプル溶液は、9割以上がグルコースとフルクトースであり、β－ＧＦである２糖画分（ＤＰ２）は数％含まれていた。
【0054】
次に、得られたサンプル溶液を、逆浸透膜で処理して、単糖及び塩を含むその他の夾雑物を排除した分画液を得た。
【0055】
この分画溶液について、前記と同様にＨＰＬＣ分析した結果を図２に示す。図２に示すように、逆浸透膜による分画後においては、単糖画分が０％、重合度２が９０％、重合度３以上が１０％である分画液が得られた。このように、逆浸透膜による分画後においては、グルコースとフルクトースがＨＰＬＣ分析にて検出できない程度に排除され、β－ＧＦである２糖画分（ＤＰ２）が９割以上含まれていた。
【0056】
続いて、逆浸透膜処理により得られた溶液を活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約４０％に濃縮して、シラップ状のβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦの濃縮液を得た。
【0057】
当該サンプルについて４００ＭＨｚ核磁気共鳴分光計（ＮＭＲ）（製品名：Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ ４００ ＰＬＵＳ、ＢＲＵＫＥＲ社製）を用いた分析を行った結果、アノメリックプロトン由来のシグナルが５．１ｐｐｍ（α－アノマー）及び４．５ｐｐｍ（β－アノマー）に確認され、グリコシディックプロトンに由来するシグナルが４．４ｐｐｍに確認された。測定結果を図３に示す。
【0058】
更に、当該サンプルについてＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラムとしてＳｈｏｄｅｘ ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＧ－５０ ４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ社製）を用い、カラム温度４０℃、８０％アセトニトリル、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで通液し、荷電化粒子検出器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で検出を行った。測定結果を図４に示す。
【0059】
β―ＧＦの取得と並行して、グルコースのみを６０ｗ／ｗ％となるように超純水に溶解し、０．１Ｍの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．６に調整した。６０℃下でβ－グルコシダーゼ（東洋紡株式会社製）を１ｍｇ／ｇ－ｄｓ添加し、４８時間保持し、反応させた。得られたサンプル溶液を、逆浸透膜で処理して、単糖及び塩を含むその他の夾雑物を排除した分画液を得た。さらに逆浸透膜処理により得られた溶液を活性炭で脱色し、Ｈ形及びＯＨ形イオン交換樹脂により脱塩し、精製し、更に、濃度約４０％に濃縮して、ゲンチオビオースを主とするβ－グルコビオースを含むシラップ状の濃縮液を得た。当該についてＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラムとしてＳｈｏｄｅｘ ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＧ－５０ ４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ社製）を用い、カラム温度４０℃、８０％アセトニトリル、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで通液し、荷電化粒子検出器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で検出を行った。測定結果を図５に示す。図４と図５のＨＰＬＣのクロマトグラムは大きく異なることが分かったため、図４に示すβ―ＧＦはβ―グルコビオースを含むシラップと大きく異なる糖組成であることが示された。
【0060】
さらにβ―グルコシダーゼの酵素性質とＨＰＬＣ解析結果、及びＮＭＲの解析結果と合わせて、当該サンプルはβ―グルコシダーゼの作用によりグルコースがフラクトースにβ結合で糖転移反応した２糖の構造体の割合が９０％程度であり、二糖の画分としてβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを約４０％含み、その他グルコースとフルクトースとがβ結合した二糖を約６０％含む組成であることが分かった。
【0061】
また、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦの濃縮液を４℃で保存したところ、白色結晶の生成が確認された。
【0062】
ＨＰＬＣ分析及び４００ＭＨｚ核磁気共鳴分光計（ＮＭＲ）（製品名：Ａｖａｎｃｅ―III、ＢＲＵＫＥＲ社製）を用いた分析の結果、白色結晶は特開２０１９－９４３０７
（Ｐ２０１９－９４３０７Ａ）に記載された通り、β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→１）－β－Ｄ－フルクトピラノースであることが明らかとなった。
（Ｐ２０１９－９４３０７Ａ）に記載された通り、β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→１）－β－Ｄ－フルクトピラノースであることが明らかとなった。
【0063】
（２）ビフィズス菌及びヨーグルト由来乳酸菌によるβ－グルコシダーゼ活性向上確認試験方法
ヒト由来ビフィズス菌１２株及び市販ヨーグルト由来ビフィズス菌２株、乳酸菌４株を用いてβ－グルコシダーゼ活性の向上について検討した。本試験で用いたビフィズス菌及び乳酸菌は以下の通りであるが、これらの菌株は、理研BRC、市販ヨーグルト、市販乳酸飲料より入手、分離した。
・ヒト腸内ビフィズス菌(1２株)
ビフィドバクテリウム カシワノヘンス（Bifidobacterium kashiwanohense） JCM15439、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum） JCM1255、ビフィドバクテリウム アングラタム（Bifidobacterium angulatum） JCM7096、ビフィドバクテリウム ロンガム サブスピーシズ インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis） JCM1222、ビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシズ ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis） JCM10602、ビフィドバクテリウム シュードカテニュラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）JCM1200、ビフィドバクテリウム デンチウム（Bifidobacterium dentium）JCM1195、ビフィドバクテリウム ファエケェル（Bifidobacterium faecale） JCM19861、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Bifidobacterium breve）JCM1192、ビフィドバクテリウム アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis ）JCM1275、ビフィドバクテリウム カテニュラタム サブスピーシズ カテニュラタム（Bifidobacterium catenulatum subsp. catenulatum）JCM1194、ビフィドバクテリウム ロンガム サブスピーシズ ロンガム（Bifidobacterium longum subsp. longum） JCM1217
・市販ヨーグルトから分離したビフィズス菌(２株)
ビフィドバクテリウム ロンガム（Bifidobacterium longum SBT2928(雪印メグミルク社「ナチュレ恵」から単離)）、ビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシズ ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis GCL2505(江崎グリコ社「BifiX」から単離)）
・市販ヨーグルトから分離した乳酸菌(４株)
ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus GG(タカナシ乳業社「おなかへGG!」から単離)）、ラクトバチルス デルブリッキ サブスピーシズ デルブリッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii TUA4408L(マルサンアイ社「豆乳グルト」から単離)）、ラクチカゼイバチルス パラカゼイ（Lacticaseibacillus paracasei shirota(ヤクルト社「ヤクルト1000」から単離)）、ラクトバチルス デルブリッキ サブスピーシズ ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 2038(明治乳業「ブルガリアヨーグルト」から単離)）
まず、ビフィズス菌の前培養培地調製のため、所定量のGＡＭブイヨン（日水製薬）を１０ｍＬ試験管に３ｍＬずつ分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。冷却後、予めＧＡＭ寒天培地で培養していた上記ビフィズス菌のコロニーをイノキュレーティングループ（サーモフィッシャーサイエンス）を用いて植菌した。
ヒト由来ビフィズス菌１２株及び市販ヨーグルト由来ビフィズス菌２株、乳酸菌４株を用いてβ－グルコシダーゼ活性の向上について検討した。本試験で用いたビフィズス菌及び乳酸菌は以下の通りであるが、これらの菌株は、理研BRC、市販ヨーグルト、市販乳酸飲料より入手、分離した。
・ヒト腸内ビフィズス菌(1２株)
ビフィドバクテリウム カシワノヘンス（Bifidobacterium kashiwanohense） JCM15439、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum） JCM1255、ビフィドバクテリウム アングラタム（Bifidobacterium angulatum） JCM7096、ビフィドバクテリウム ロンガム サブスピーシズ インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis） JCM1222、ビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシズ ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis） JCM10602、ビフィドバクテリウム シュードカテニュラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）JCM1200、ビフィドバクテリウム デンチウム（Bifidobacterium dentium）JCM1195、ビフィドバクテリウム ファエケェル（Bifidobacterium faecale） JCM19861、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Bifidobacterium breve）JCM1192、ビフィドバクテリウム アドレセンチス（Bifidobacterium adolescentis ）JCM1275、ビフィドバクテリウム カテニュラタム サブスピーシズ カテニュラタム（Bifidobacterium catenulatum subsp. catenulatum）JCM1194、ビフィドバクテリウム ロンガム サブスピーシズ ロンガム（Bifidobacterium longum subsp. longum） JCM1217
・市販ヨーグルトから分離したビフィズス菌(２株)
ビフィドバクテリウム ロンガム（Bifidobacterium longum SBT2928(雪印メグミルク社「ナチュレ恵」から単離)）、ビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシズ ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis GCL2505(江崎グリコ社「BifiX」から単離)）
・市販ヨーグルトから分離した乳酸菌(４株)
ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus GG(タカナシ乳業社「おなかへGG!」から単離)）、ラクトバチルス デルブリッキ サブスピーシズ デルブリッキ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii TUA4408L(マルサンアイ社「豆乳グルト」から単離)）、ラクチカゼイバチルス パラカゼイ（Lacticaseibacillus paracasei shirota(ヤクルト社「ヤクルト1000」から単離)）、ラクトバチルス デルブリッキ サブスピーシズ ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 2038(明治乳業「ブルガリアヨーグルト」から単離)）
まず、ビフィズス菌の前培養培地調製のため、所定量のGＡＭブイヨン（日水製薬）を１０ｍＬ試験管に３ｍＬずつ分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。冷却後、予めＧＡＭ寒天培地で培養していた上記ビフィズス菌のコロニーをイノキュレーティングループ（サーモフィッシャーサイエンス）を用いて植菌した。
【0064】
また、乳酸菌の前培養培地調製のため、所定量のＭＲＳ培地（ベクトン・ディッキンソン）を１０ｍＬ試験管に３ｍＬずつ分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。冷却後、予めＧＡＭ寒天培地、あるいはMRS寒天培地で培養していた上記ビフィズス菌及び乳酸菌のコロニーをイノキュレーティングループ（サーモフィッシャーサイエンス）を用いて植菌した。
【0065】
次いで、上記で植菌した前培養培地を、アネロパック・ケンキ(三菱ガス化学)とともにアネロパック角形ジャーに入れ、３７℃の恒温機内で２４時間嫌気的に前培養をおこなった。
【0066】
ビフィズス菌の本培養のため、下記表１に示す組成のＩＬＳ培地を作製し、当該液体培地を１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌処理した。このＩＬＳ培地に、炭素源として、０．２２μｍフィルター(ミリポア社)を通過させ、ろ過滅菌したβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦ（Ｂｒｉｘ値４．０度）を、最終濃度が１．０％（ｖ／ｖ）となるように混合し、本培養培地を作製した。この本培養培地を、９６ウェルディープウェルプレート（ＢＭ機器）に１０００μＬずつ分注し、上記ビフィズス菌の前培養液を５０μＬ添加し、Ｓｕｒｅｓｅａｌ Ｂｒｅａｔｈａｂｌｅ(ＢＭ機器)を貼り付け、アネロパック・ケンキとともにアネロパック角形ジャーに入れ、３７℃の恒温機内で４８時間培養した。
【0067】
また、対照本培養培地としてＩＬＳ培地に、炭素源としてろ過滅菌したグルコース（Ｂｒｉｘ値４．０度）を最終濃度が１．０％（ｖ／ｖ）となるように混合し、対照本培養培地として同様に培養した。
【0068】
【表1】
【0069】
乳酸菌の本培養のため、下記表２に示す組成のYP培地を作製した。次いで、当該液体培地を１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌処理した。このＹＰ培地に、炭素源として、０．２２μｍフィルター(ミリポア社)を通過させ、ろ過滅菌したβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦ（Ｂｒｉｘ値４．０度）を、最終濃度が１．０％（ｖ／ｖ）となるように混合し、本培養培地を作製し、９６ウェルディープウェルプレート（ＢＭ機器）に１０００μＬずつ分注し、上記乳酸菌の前培養液を５０μＬ添加し、Ｓｕｒｅｓｅａｌ Ｂｒｅａｔｈａｂｌｅ(BM機器)を貼り付け、アネロパック・ケンキとともにアネロパック角形ジャーに入れ、３７℃の恒温機内で４８時間培養した。また、対照本培養培地としてYP培地に、炭素源としてろ過滅菌したグルコース（Ｂｒｉｘ値４．０度）を最終濃度が１．０％（ｖ／ｖ）となるように混合し、対照本培養培地として同様に培養した。
【0070】
【表2】
【0071】
ビフィズス菌及び乳酸菌の培養終了後、本培養培地、及び対照本培養培地を９６ウェルＰＣＲプレートに２００μＬ回収し、１００００×ｇで１０分間遠心分離を実施し、培養液上清を回収した。また、ヨーグルト由来ビフィズス菌及び乳酸菌については残った菌体ペレットに１００μＬの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、マイクロプレートカップホーンを装着したＱＳｏｎｉｃａ社超音波ホモジナイザーを用いて菌体破砕を実施した。破砕後、１００００×ｇで１０分間遠心分離を実施し、菌体破砕液を回収した。
【0072】
β－グルコシダーゼ活性は１３．６ｍＭ ｐＮＰＧ溶液０．１ｍＬ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．２ｍＬ、菌培養上清液０．１ｍＬの反応液から成り、４０℃で４時間反応後、反応混合液０．２ｍＬに２．５ｍＬの０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液に加え、遊離ｐＮＰを４０５ｎｍの吸光度を測定することにより評価した。
【0073】
下記数式（１）に基づいて、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦを添加した培地に植菌して所定時間培養した後の培養上清液、あるいは菌体破砕液を用いた遊離ｐＮＰ値を、グルコースを加えて培養した培養上清液、あるいは菌体破砕液を用いた遊離ｐＮＰ値で割り、１００を乗することでβ－グルコシダーゼ活性向上率（％）を算出した。本発明においては活性向上率（％）が１１０を超えた場合に十分なβ－グルコシダーゼの活性向上効果があると判断した。
【0074】
【数1】
【0075】
（３）ビフィズス菌及び乳酸菌によるβ－グルコシダーゼ活性向上確認試験結果
下記表３にビフィズス菌の結果、表４に乳酸菌の結果を示す。表３、４からビフィズス菌及び乳酸菌の多くはβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦを添加した培地で生育するとβ－グルコシダーゼ活性が向上することが明らかになった。特に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ. ｌａｃｔｉｓ ＪＣＭ１０６０２やＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃａｌｅ ＪＣＭ１９８６１の活性向上率は３０００以上であり、非常に高い活性向上率を示した。活性向上したビフィズス菌や乳酸菌については、ゲノム上β－グルコシダーゼがアノテーションされていることも判明したため、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦは、β－グルコシダーゼ活性を保有するビフィズス菌及び市販ヨーグルトから分離した乳酸菌に対し、β－グルコシダーゼ活性を向上させることができることが示唆された。
下記表３にビフィズス菌の結果、表４に乳酸菌の結果を示す。表３、４からビフィズス菌及び乳酸菌の多くはβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦを添加した培地で生育するとβ－グルコシダーゼ活性が向上することが明らかになった。特に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ. ｌａｃｔｉｓ ＪＣＭ１０６０２やＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃａｌｅ ＪＣＭ１９８６１の活性向上率は３０００以上であり、非常に高い活性向上率を示した。活性向上したビフィズス菌や乳酸菌については、ゲノム上β－グルコシダーゼがアノテーションされていることも判明したため、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦは、β－グルコシダーゼ活性を保有するビフィズス菌及び市販ヨーグルトから分離した乳酸菌に対し、β－グルコシダーゼ活性を向上させることができることが示唆された。
【0076】
【表3】
【0077】
【表4】
【0078】
（４）β－グルコシダーゼ活性が向上したビフィズス菌培養液を用いた大豆イソフラボンの配糖体の一種であるグリシチンからのグルコース遊離試験
ビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシズ ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis） JCM10602、ビフィドバクテリウム ファエケェル（Bifidobacterium faecale） JCM19861、ビフィドバクテリウム アングラタム（Bifidobacterium angulatum） JCM7096を供試菌株とし、実施例１の（２）のビフィズス菌の培養上清液の調製方法と同様の方法を用いて、炭素源としてβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦ（最終濃度が１．０％（ｖ／ｖ））を用いた培養上清液（β－GＦ区）と対照区として炭素源を加えない培養上清液（無添加区）を調製した。次いで、９６ウェルＰＣＲプレートにグリシチン(富士フイルム和光純薬工業)７．０ｍｇ/１００ｍＬを５０μＬ、５０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ６．０)を１００μＬ、培養上清液を５０μＬ、プロクリン９５０（シグマ社）１．０ｍＬ/１００ｍＬを2μＬ混合し、４０℃で４８時間反応した。反応０時間、及び反応４８時間の反応液を回収後、９５℃で５分間加熱し、酵素失活を行った。続いて、回収した反応液中の遊離グルコース量をグルコースＣII－テストワコー（富士フイルム和光純薬工業）を用い
て定量し、反応４８時間目の遊離グルコース量と反応０時間目の遊離グルコース量を差し引くことで、反応４８時間目で遊離した真のグルコース量を算出した。また、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦを加えた培養液の試験区と無添加の培養液の対照区の遊離グルコース量を比較することで、β－グルコシダーゼ活性が向上したビフィズス菌培養液による大豆イソフラボンの配糖体であるグリシチンからのグルコース加水分解との関係性を観察した。
ビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシズ ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis） JCM10602、ビフィドバクテリウム ファエケェル（Bifidobacterium faecale） JCM19861、ビフィドバクテリウム アングラタム（Bifidobacterium angulatum） JCM7096を供試菌株とし、実施例１の（２）のビフィズス菌の培養上清液の調製方法と同様の方法を用いて、炭素源としてβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦ（最終濃度が１．０％（ｖ／ｖ））を用いた培養上清液（β－GＦ区）と対照区として炭素源を加えない培養上清液（無添加区）を調製した。次いで、９６ウェルＰＣＲプレートにグリシチン(富士フイルム和光純薬工業)７．０ｍｇ/１００ｍＬを５０μＬ、５０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ６．０)を１００μＬ、培養上清液を５０μＬ、プロクリン９５０（シグマ社）１．０ｍＬ/１００ｍＬを2μＬ混合し、４０℃で４８時間反応した。反応０時間、及び反応４８時間の反応液を回収後、９５℃で５分間加熱し、酵素失活を行った。続いて、回収した反応液中の遊離グルコース量をグルコースＣII－テストワコー（富士フイルム和光純薬工業）を用い
て定量し、反応４８時間目の遊離グルコース量と反応０時間目の遊離グルコース量を差し引くことで、反応４８時間目で遊離した真のグルコース量を算出した。また、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦを加えた培養液の試験区と無添加の培養液の対照区の遊離グルコース量を比較することで、β－グルコシダーゼ活性が向上したビフィズス菌培養液による大豆イソフラボンの配糖体であるグリシチンからのグルコース加水分解との関係性を観察した。
【0079】
（５）β－グルコシダーゼ活性が向上したビフィズス菌培養液を用いた大豆イソフラボンの配糖体であるグリシチンからのグルコース遊離試験結果
下記図６に結果を示す。図６から供試菌株として用いたビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシズ ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis） JCM10602、ビフィドバクテリウム ファエケェル（Bifidobacterium faecale） JCM19861、ビフィドバクテリウム アングラタム（Bifidobacterium angulatum） JCM7096の何れの菌株も、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦを添加し培養した培養上清液を用いた場合、無添加区と比較してグリシチンからの遊離グルコース量が多い結果となった。つまり、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦはビフィズス菌のβ－グルコシダーゼ活性を向上させ、配糖体からのグルコースを遊離、ひいてはアグリコンを遊離することが明らかとなった。
下記図６に結果を示す。図６から供試菌株として用いたビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシズ ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis） JCM10602、ビフィドバクテリウム ファエケェル（Bifidobacterium faecale） JCM19861、ビフィドバクテリウム アングラタム（Bifidobacterium angulatum） JCM7096の何れの菌株も、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦを添加し培養した培養上清液を用いた場合、無添加区と比較してグリシチンからの遊離グルコース量が多い結果となった。つまり、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦはビフィズス菌のβ－グルコシダーゼ活性を向上させ、配糖体からのグルコースを遊離、ひいてはアグリコンを遊離することが明らかとなった。
【0080】
［実施例２］
（１）腸内細菌によるβ－グルコシダーゼ活性向上確認試験方法
実施例1の（１）と同様にβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を調製した。
（１）腸内細菌によるβ－グルコシダーゼ活性向上確認試験方法
実施例1の（１）と同様にβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を調製した。
【0081】
所定量のＧＡＭブイヨン（日水製薬）をショット瓶に測り取り、純水で溶解して前培養用培地を作製した。次いで、当該前培養培地を１１５℃、１５分間オートクレーブで滅菌処理し、９７℃まで低下した段階でオートクレーブから取り出し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学、以下同様）とともにアネロパック角形ジャー（三菱ガス化学、以下同様）に入れ、３７℃の恒温機内で一晩静置保管した。次いで、一晩静置保管した前培養用培地を９６ウェルマイクロプレートに２００μＬずつ分注し、そこに事前に準備した下記表５、６に示す各種腸内細菌の凍結菌２μＬを添加した。各種腸内細菌については理研BRC、あるいはAmerican Type Culture Collection、German Collection of Microorganisms and Cell Cultureから入手した。
【0082】
【表5】
【0083】
【表6】
【0084】
次いで、マイクロプレートにＳｕｒｅｓｅａｌ Ｂｒｅａｔｈａｂｌｅ（ビーエム機器、以下同様）を貼り付け、アネロパック・ケンキとともにアネロパック角形ジャーに入れ、３７℃の恒温機内で表５に示す所定の培養時間で静置保管して対数増殖期となるように前培養をおこなった。
【0085】
一方、本培養開始２日前に、所定量のＧＡＭ糖分解用半流動培地（日水製薬）を純水にて溶解した後、定性濾紙（アドバンテック東洋）でろ過し、ＧＡＭ糖分解用半流動液体培地を作製した。次いで、当該液体培地を１１５℃、１５分間オートクレーブで滅菌処理し、９７℃まで低下した段階でオートクレーブから取り出し、アネロパック・ケンキとともにアネロパック角形ジャーに入れ、３７℃の恒温機内で一晩静置保管した。次いで、本培養開始前日、一晩静置保管したＧＡＭ糖分解用半流動液体培地に、事前に準備したβ－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖（Ｂｒｉｘ値５．０度）を最終濃度が０．５％（ｖ／ｖ）となるように混合し、本培養培地を作製した（本培養培地）。また、対照の培地として、一晩静置保管したＧＡＭ糖分解用半流動液体培地に、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むβ－GＦを混合せずに、糖質を含まない本培養培地を作製した（対照本培養培地）。
【0086】
次いで、本培養培地又は対照本培養培地を９６ウェルマイクロプレートに２００μＬずつ分注し、マイクロプレートにＳｕｒｅｓｅａｌ Ｂｒｅａｔｈａｂｌｅを貼り付け、アネロパック・ケンキとともにアネロパック角形ジャーに入れ、３７℃の恒温機内で一晩静置保管した。
【0087】
本培養開始当日、一晩静置保管した本培養培地又は対照本培養培地を分注したマイクロプレートに、表５に示す所定時間で前培養した前培養液２μＬを添加した。次いで、これらのマイクロプレートにＳｕｒｅｓｅａｌ Ｂｒｅａｔｈａｂｌｅを貼り付け、アネロパック・ケンキとともにアネロパック角形ジャーに入れ、３７℃の恒温機内で表１に示す所定の培養時間、静置保管して本培養をおこなった。培養終了後、本培養培地、及び対照本培養培地を９６ウェルＰＣＲプレートに２００μＬ回収し、１００００×ｇで１０分間遠心分離を実施し、培養液上清を回収した。また、乳酸菌については残った菌体ペレットに１００μＬの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、マイクロプレートカップホーンを装着したQSonica社超音波ホモジナイザーを用いて菌体破砕を実施した。破砕後、１００００×ｇで１０分間遠心分離を実施し、菌体破砕液を回収した。
【0088】
β－グルコシダーゼ活性は、１３．６ｍＭ ｐＮＰＧ溶液０．１ｍＬ、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．２ｍＬ、菌培養上清液あるいは菌体破砕液０．１ｍＬの反応液を調製し、４０℃で４時間反応後、反応混合液０．２ｍＬに２．５ｍＬの０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加え、遊離ｐＮＰを４０５ｎｍの吸光度を測定することにより評価した。前記数式（１）に基づいて、β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→１）－Ｄ－フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を添加した培地に植菌して所定時間培養した後の培養上清液あるいは菌体破砕液を用いた遊離ｐＮＰ値を、対照本培養培地で培養した培養上清液を用いた遊離ｐＮＰ値で割り、１００を乗することでβ－グルコシダーゼ活性向上率（％）を算出した。本発明においては活性向上率(%)が110を超えた場合に十分なβ－グルコシダーゼの活性向上効果があると判断した。
【0089】
（２）腸内細菌によるβ－グルコシダーゼ活性向上確認試験結果
結果は、表７、８に示される通りであった。なお、表７，８において、β-D-グルコピラノシル-(1→1)-D-フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖は「β-ＧＦ」と示す。
結果は、表７、８に示される通りであった。なお、表７，８において、β-D-グルコピラノシル-(1→1)-D-フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖は「β-ＧＦ」と示す。
【0090】
β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖を添加した培地における培養では、多くの常在腸内細菌と乳酸菌、また、酪酸産生菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ ＪＣＭ１２９８株のβ－グルコシダーゼ活性向上が確認された。特に、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓＪＣＭ６１２４株やＬａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＪＣＭ１１３６株の活性向上率はおよそ３００程度を示していた。
【0091】
以上のことから、β－D－グルコピラノシル－(1→1)－D－フラクトースを含むグルコースとフラクトースとがβ結合した二糖は常在腸内細菌の多くや乳酸菌、一部の酪酸産生菌の細菌に対してβ－グルコシダーゼ活性を向上させる効果を持つことが示唆された。
【0092】
【表7】
【0093】
【表8】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】