2023-15297 Ｃ／ＥＢＰα小分子活性化ＲＮＡ組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023015297

(43)【公開日】2023-01-31

(54)【発明の名称】Ｃ／ＥＢＰα小分子活性化ＲＮＡ組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20230124BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230124BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20230124BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20230124BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230124BHJP

   A61P 5/50 20060101ALI20230124BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230124BHJP

   A61K 31/155 20060101ALI20230124BHJP

   A61K 31/4439 20060101ALI20230124BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20230124BHJP

   A61K 31/64 20060101ALI20230124BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230124BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230124BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7105

A61P1/16 ZNA

A61P3/04

A61P3/06

A61P3/10

A61P5/50

A61P43/00 111

A61P43/00 121

A61K31/155

A61K31/4439

A61K31/517

A61K31/64

A61K45/00

C12N15/113 Z

【審査請求】有

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022182989

(22)【出願日】2022-11-16

(62)【分割の表示】P 2021150183の分割

【原出願日】2014-11-24

(31)【優先権主張番号】61/907,732

(32)【優先日】2013-11-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】512325200

【氏名又は名称】ミナ セラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(72)【発明者】

【氏名】セトロム、ポール

(57)【要約】

【課題】患者のインスリン抵抗性又は肥満を治療するための、Ｃ／ＥＢＰαの標的化調節に有用な組成物を提供する。
【解決手段】患者のインスリン抵抗性又は肥満を治療するために用いられる組成物は、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡを含む。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者のインスリン抵抗性又は肥満を治療するために用いられる、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡを含む組成物。

【請求項2】

前記患者の肝細胞におけるＬＤＬレベルを減少させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記患者の肝細胞におけるトリグリセリドレベルを減少させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記患者の体重を減少させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記患者の肝臓サイズを減少させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

ＦＡＴ／ＣＤ３６、ＳＲＥＢＰ１、ＤＧＡＴ２、ＣＥＴＰ、ＦＡＳＮ、ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１α、ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１β、又はＭＬＸＩＰＬの発現を低減させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

ＬＰＬ、ＬＸＤ、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＣＢ、ＡＰＯＣ３、ＭＴＰ、ＬＤＬＲ、ＰＧＣ－１α、ＰＧＣ－１β、ＰＰＡＲγ、又はＰＰＡＲαの発現を増加させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記ｓａＲＮＡが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、３１８又は３７４を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記患者の白色脂肪組織を低減させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記患者の褐色脂肪組織を活性化させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記患者の体脂肪を低減させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記患者の血清アルブミンレベルを増加させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

肝臓のインスリン感受性を増加させるか又はＩＩ型糖尿病を治療する薬物と共に投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

メトホルミン、スルホニル尿素、非スルホニル尿素分泌促進剤、αグルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グルカゴン様ペプチド－１類似体、及びジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤、又はそれらの組み合わせと共に投与される、請求項１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｃ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰα経路を調節するための、ポリヌクレオチド、具体的にはｓａＲＮＡ組成物に関する。また、本発明は、上記組成物を、代謝障害、過剰増殖性疾患の治療、及び幹細胞系統の制御等の治療応用に使用するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰアルファ、又はＣ／ＥＢＰＡ）は、ヒト及びラットを横断して保存されているロイシンジッパータンパク質である。この核内転写因子は、肝細胞、骨髄性単核球、脂肪細胞、並びに他のタイプの乳房上皮細胞に豊富に存在する［非特許文献１］。この核内転写因子は、Ｎ末端部分にある２つのトランスアクチベーションドメイン、Ｃ末端部分にある、他のＣ／ＥＢＰファミリーメンバーとの二量体化を媒介するロイシンジッパー領域及びＤＮＡ結合ドメインで構成される。Ｃ／ＥＢＰ転写因子のファミリーの結合部位は、正常な肝細胞機能の維持、及び傷害への応答に関与する多数の遺伝子のプロモーター領域に存在する。Ｃ／ＥＢＰαは、免疫及び炎症応答、発生、細胞増殖、抗アポトーシス、及び幾つかの代謝経路に関与する幾つかの肝臓特異的遺伝子の転写に多面的効果を有する［非特許文献２］。Ｃ／ＥＢＰαは、肝細胞の分化状態の維持に不可欠である。Ｃ／ＥＢＰαは、アルブミン転写を活性化し、尿素産生に関与する複数のオルニチン回路酵素をコードする遺伝子の発現を調節し、したがって正常な肝機能に重要な役割を果たしている。

【0003】

成人の肝臓では、Ｃ／ＥＢＰαは、高分化した肝細胞で機能するとされているが、急速に増殖する肝癌細胞は、わずかなＣ／ＥＢＰαしか発現しない［非特許文献３］。Ｃ／ＥＢＰαは、網膜芽細胞腫の上方制御並びにＣｄｋ２及びＣｄｋ４の阻害により、細胞増殖の強力な阻害因子であるｐ２１を上方制御することが知られている［非特許文献４；非特許文献５］。肝細胞癌（ＨＣＣ）では、Ｃ／ＥＢＰαは、抗増殖特性を有する腫瘍抑制因子として機能する［非特許文献６］。

【0004】

Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡ又はＣ／ＥＢＰαタンパク質調節を研究するために、様々な手法が実施されている。Ｃ／ＥＢＰαタンパク質は、翻訳後リン酸化及びＳＵＭＯ化により制御されることが知られている。例えば、ＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤及び細胞外シグナル制御キナーゼ１及び／又は２（ＥＲＫ１／２）は、Ｃ／ＥＢＰαのセリン２１リン酸化を阻止し、それによりＣ／ＥＢＰαタンパク質の顆粒球への分化能を低下させる［非特許文献７；非特許文献８］。加えて、Ｃ／ＥＢＰαの翻訳は、２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアン（dioxoolean）－１，９－ジエン－２８－酸（ＣＤＤＯ）により効率的に誘導することができ、それにより、Ｃ／ＥＢＰαタンパク質アイソフォームの比率が、ｐ３０形態よりも全長ｐ４２形態が有利になるように変更され、それにより顆粒球への分化が誘導される［非特許文献９］。

【0005】

Ｃ／ＥＢＰα遺伝子は、染色体１９ｑ１３．１に位置する、イントロンを含まない遺伝子である。ほとんどの真核細胞では、遺伝子発現を制御するための機序としてＲＮＡ相補性が使用されている。１つの例は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡを使用して、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）により遺伝子発現をノックダウンするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路である。短鎖二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、遺伝子のプロモーター領域を標的とし、それら遺伝子の転写活性化を媒介する能力も有することが今や確立されており、それらは、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）、アンチジーンＲＮＡ（ａｇＲＮＡ）、又は短鎖活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）と呼ばれている［非特許文献１０］。遺伝子のｓａＲＮＡ誘導性活性化は、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類を含む他の哺乳動物種で保存されており、遺伝子の内因性上方制御の効果を研究するための一般的な方法として急速に広まりつつある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｌｅｋｓｔｒｏｍ－Ｈｉｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ、２７３巻、２８５４５～２８５４８頁（１９９８年）

【非特許文献2】Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、５巻（５号）、５６５～５７０頁（１９９５年）

【非特許文献3】Ｕｍｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻、２８８～２９２頁（１９９１年）

【非特許文献4】Ｔｉｍｃｈｅｎｋｏら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１０巻、８０４～８１５頁（１９９６年）

【非特許文献5】Ｗａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、８巻、８１７～８２８頁（２００１年）

【非特許文献6】Ｉａｋｏｖａら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２１巻（１号）、２８～３４頁（２０１１年）

【非特許文献7】Ｒａｄｏｍｓｋａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０３巻（２号）、３７１～３８１頁（２００６年）

【非特許文献8】Ｒｏｓｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４巻（２号）、６７５～６８６頁（２００４年）

【非特許文献9】Ｋｏｓｃｈｍｉｅｄｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、１１０巻（１０号）、３６９５～３７０５頁（２００７年）

【非特許文献10】Ｌｉら、ＰＮＡＳ、１０３巻、１７３３７～１７３４２頁（２００６年）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、治療を目的としたｓａＲＮＡによるＣ／ＥＢＰαの標的化調節に対する必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、診断及び予後を含む治療を目的としてＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現及び／又は機能を調節する短鎖活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）分子を、設計、調製、製造、製剤化、及び／又は使用するための組成物、方法、及びキットを供給する。

【0009】

本発明の１つの態様は、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡ及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の別の態様は、対象体の代謝経路を調節するための方法であって、上記対象体に、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡを投与することを含む方法を提供する。

【0010】

本発明の別の態様は、過剰増殖性細胞の増殖を阻害する方法であって、上記細胞を、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡと接触させることを含む方法を提供する。
本発明の別の態様は、過剰増殖性障害を治療又は予防するための方法であって、上記過剰増殖性障害を有する対象体に、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡを投与することを含む方法を提供する。

【0011】

本発明の別の態様は、細胞の上皮間葉転換を制御するための方法であって、上記細胞を、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡと接触させることを含む方法を提供する。
本発明の更に別の態様は、幹細胞の分化及び多能性を制御するための方法であって、上記幹細胞を、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡと接触させることを含む方法を提供する。

【0012】

本発明の種々の実施形態の詳細は、本明細書の下記に示されている。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び図面から、並びに特許請求の範囲から明白になるだろう。

【0013】

上述の及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面に図示されているような本発明の特定の実施形態に関する以下の説明から明白になるだろう。添付の図面では、類似の参照文字は、異なる図面の全体にわたって同一の部分を参照している。図面は、必ずしも縮尺通りではなく、むしろ、本発明の種々の実施形態の原理を図示する際に強調がなされている。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】肝臓に対するＣ／ＥＢＰαの主要効果を示す図である。

【図2】脂肪組織に対するＣ／ＥＢＰαの副次的効果を示す図である。

【図3-1】本発明のｓａＲＮＡの効果を示す一連のヒストグラムを示す図である。Ａは、ＨｅｐＧ２細胞へのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのトランスフェクションが、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現を正に制御することを示す；Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞へのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのトランスフェクションが、アルブミン遺伝子の発現を正に制御することを示す；Ｃには、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの用量増加が、９６時間にわたりＣ／ＥＢＰα遺伝子発現に対して用量依存的効果を示すことが示されている。Ｄには、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの用量増加が、９６時間にわたりアルブミン遺伝子発現に対して用量依存的効果を示すことが示されている。

【図3-2】パネルＥ～Ｇには、アルブミンプロモーター（アルブミンＤ－ボックス）結合タンパク質（ＤＢＰ）のＤ部位及びアルブミン（ＡＬＢ）が全て、１つ又は複数のＣ／ＥＢＰα結合部位を有することが示されている。これらパネルには、各遺伝子の上流及び下流に（Ｅ）Ｃ／ＥＢＰα、（Ｆ）ＤＢＰ、及び（Ｇ）アルブミン（ＡＬＢ）の２０００個のヌクレオチドを含むゲノム領域が示されている。ゲノム領域内の染色体座標（「スケール」及び染色体識別子）、Ｃ／ＥＢＰα結合部位（「ＣＥＢＰＡ」；黒色のボックス）、Ｃ／ＥＢＰα結合モチーフ（「ＧＣＡＡＴモチーフ」；黒色の垂直線）の出現、及びＲｅｆＳｅｑ遺伝子（青色のボックス及び線）が示されている。

【図4】メチル化状態及び遺伝子発現に対する効果に関する研究を示す図である。Ａ～Ｂには、（Ａ）Ｃ／ＥＢＰＡ及び（Ｂ）ＤＢＰのプロモーター領域にあるＣｐＧ島のメチル化アッセイが、対照と比較してメチル化の低減を示したことが示されている。Ｃ：ヒトアルブミンに特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、２０ｎＭ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのトランスフェクション後にアルブミン分泌が著しく増加したことを検出した。Ｄ：Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクション細胞では、オルニチン回路酵素オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードする遺伝子の発現が増加し、尿素産生能力の向上が示唆された。Ｅ：Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクション細胞では、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）をコードする遺伝子の発現が減少し、細胞分化の制御が向上したことが示唆された。Ｆ：Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、様々な濃度でＨｅｐＧ２細胞増殖の著しい下方制御を引き起こした。

【図5】本発明のｓａＲＮＡに関するｉｎ ｖｉｖｏ研究の結果を示す図である。Ａ～Ｆ：慢性肝硬変及び自発性肝細胞癌を有する雄ウィスターラットにＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを静脈内注射した。ラット血清中でのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーのヌクレアーゼ感受性を、表示されている時間にわたって試験した。血中ｓａＲＮＡの著しい減少が、２４～４８時間で観察された。その後、ラットを、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーで、４８時間毎の反復用量で１週間処置した。アルブミン、ビリルビン、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルを測定した。対照と比較してアルブミンの循環レベルが増加したことは、肝臓傷害からの回復を示唆する。

【図6】本発明のｓａＲＮＡの全組織及び組織化学研究を示す図である。Ａ：肝腫瘍容積は、対照と比較して、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを注射したラットで目に見えて低減された。Ｂ：腫瘍量は、３ｍｍを超える直径を有する全腫瘍小結節の容積により評価した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを注射したラットは、２週間の処置後、腫瘍量が著しく低減した。Ｃ：スクランブル－ｓａＲＮＡを注射した対照ラット及びＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを注射したラットの２μｍ肝臓切片を免疫染色して、胎盤型グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ－ｐ）の発現を調べた。

【図7】本発明のｓａＲＮＡに関するｉｎ ｖｉｖｏ研究の結果を示す図である。Ａ～Ｄ：７匹の対照ラットの全ＲＮＡ抽出物及び７匹のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー注射ラットの全ＲＮＡ抽出物を、（Ａ）アルブミン遺伝子発現、（Ｂ）Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現、（Ｃ）肝細胞核内因子（ＨＮＦ）４α遺伝子発現、及び（Ｄ）ＨＮＦ１α遺伝子発現について分析した。これら因子の増加により、アルブミンの発現を促進するのに必要な転写因子が上方制御されたことが確認された。ＨＧＦをコードするｍＲＮＡレベルは減少した。Ｅ～Ｇ：７匹の対照ラットの全ＲＮＡ抽出物及び７匹のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー注射ラットを、（Ｅ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子発現、（Ｆ）ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＤ１）遺伝子発現、及び（Ｇ）プラスミノーゲン遺伝子発現について分析した。ＨＧＦをコードするｍＲＮＡレベルの減少は、細胞増殖の正の調節を示す。ＨＰＤ１及びプラスミノーゲンのレベルの増加は、肝細胞の機能が改善したことを示す。

【図8】Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションＨｅｐＧ２細胞における、一群の８４個の肝臓癌特異的遺伝子の遺伝子発現プロファイルを分析した図である。

【図9】プロモーター内の結合部位の特定を示す図である。Ａ～Ｃ：ＳＴＡＴ３（Ａ）遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ（ＭＹＣ）（Ｂ）遺伝子、及びインターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）（Ｃ）遺伝子のＣｈＩＰ－Ｓｅｑ分析は、それらのプロモーター領域内のＣ／ＥＢＰα結合部位の存在を示す。Ｄ～９Ｆ：Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡをトランスフェクションすると、ＨｅｐＧ２細胞のＳＴＡＴ３（Ｄ）、ｃＭｙｃ（Ｅ）、及びＩＬ６Ｒ（Ｆ）の相対発現が低減した。

【図10】メチル化アッセイ及びウエスタンブロットの結果を示す図である。Ａ～Ｃ：ＳＴＡＴ３（Ａ）、ＭＹＣ（Ｂ）、及びＩＬ６Ｒ（Ｃ）のプロモーター領域にあるＣｐＧ島のメチル化アッセイが、対照と比較して過剰メチル化を示したことが示されている。Ｄ：ウエスタンブロット分析により、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションした細胞では、ＳＴＡＴ３の残基７０５及び７２７でのリン酸化が減少し、ＩＬ６Ｒが下方制御されることが示された。

【図11】ｈｕｈ７肝細胞株でのＣ／ＥＢＰα発現を、対照、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ単独、様々なデンドリマー、及び様々なｓａＲＮＡ：デンドリマー複合比のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー複合体を用いて試験した図である。試料は、多くの場合、二重反復だった。

【図12】ＨｅｐＧ２細胞でのＣ／ＥＢＰα発現を、様々な期間インキュベートしたＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー複合体で測定した図である。

【図13】Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー複合体を、３×用量及び１注射当り１００ｕＬで注射した１週間後に、マウスの血清アルブミンレベルについて試験した図である。

【図14】本発明のｓａＲＮＡに関するＩｎ ｖｉｖｏ研究を示す図である。Ａ～Ｂ：正常なＣ５７Ｂｌ６／ＪマウスにＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを静脈注射すると、対照と比較して、（Ａ）アルブミン及び（Ｂ）非抱合型ビリルビンの循環レベルが増加することを示す。Ｃ～Ｅ：Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを正常なＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに静脈注射すると、（Ｃ）ＡＬＴ、（Ｄ）ＡＳＴ、及び（Ｅ）ＧＧＴの循環レベルが減少することを示す。

【図15-1】本発明のｓａＲＮＡに関するＩｎ ｖｉｖｏ研究を示す図である。Ａ～Ｂ：体重（Ａ）及びコレステロール（Ｂ）を、各注射後に測定した。群間での体重の変化は、観察されなかった。Ｃ：漸増用量での処置後に測定したヘモグロビン（Ｈｂ）レベル。処置は、Ｈｂレベルを正常範囲から変化させなかった。Ｄ：白血球細胞（ＷＢＣ）数の測定は、漸増用量のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーで処置しても影響を受けなかった。

【図15-2】本発明のｓａＲＮＡに関するＩｎ ｖｉｖｏ研究を示す図である。Ｅ：血小板（ＰＬＴ）数の測定は、対照動物から著しい変化を示さなかった。３×のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡデンドリマーで処置すると、ＰＬＴ数の変化は、正常範囲により近いことが示された。Ｆ：ＧＧＴの測定は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー処置が、正常範囲により近い値をもたらすことを示唆する。Ｇ：ＳＧＯＴのレベルは、対照動物と処置動物とで変化がなかった。Ｈ：１×及び２×処置動物におけるＳＧＰＴの循環レベルは、対照又は３×群と比較して、正常範囲により近かった。

【図15-3】本発明のｓａＲＮＡに関するＩｎ ｖｉｖｏ研究を示す図である。Ｉ：アルカリホスファターゼの循環レベルは、対照動物と処置動物との間で差異を示さなかった。Ｊ：非抱合型ビリルビンの循環レベルは、対照と比べて、処置動物では用量依存的に増加した。Ｋ～Ｌ：尿素（Ｋ）及びクレアチニン（Ｌ）のレベルは、対照と比較して処置動物では変化を示さなかった。

【図16】（Ａ）対照、（Ｂ）１×Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー、（Ｃ）２×Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー、及び（Ｄ）４×Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーで処置したラットの肝臓組織を示す図である。

【図17】（Ａ）対照、（Ｂ）１×Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー、（Ｃ）２×Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー、及び（Ｄ）４×Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーで処置したラットの腎臓組織を示す図である。

【図18】（Ａ）対照、（Ｂ）１×Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー、（Ｃ）２×Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー、及び（Ｄ）４×Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーで処置したラットの脾臓組織を示す図である。

【図19】増殖研究を示す図である。Ａ～Ｇ：Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の線維芽細胞（Ａ）、ＨＬ６０細胞（Ｂ）、Ｋ５６２細胞（Ｃ）、ジャーカット細胞（Ｄ）、Ｕ９３７細胞（Ｅ）、Ｕ３７３細胞（Ｆ）、及び３２ＤＺ１０細胞（Ｇ）のＷＳＴ－１細胞増殖アッセイの結果。

【図20】Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後のＨＬ６０細胞、Ｕ９３７細胞、線維芽細胞、ジャーカット細胞、Ｋ５６２細胞、Ｕ３７３細胞、３２Ｄｐ２１０細胞の細胞増殖。

【図21】本発明のｓａＲＮＡに関する増殖研究を示す図である。Ａ～Ｆ：Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションの後のヒトＨＣＣ（ＨｅｐＧ２）細胞（Ａ）、ラット肝臓癌（Ｂ）細胞、ヒト膵臓類上皮癌（Ｃ）細胞、ヒト乳腺癌（ＭＣＦ７）細胞（Ｄ）、ヒト転移性前立腺癌（ＤＵ１４５）細胞（Ｅ）、ラットインスリノーマ（ＭＩＮ６）（Ｆ）細胞の細胞増殖。

【図22】Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後のＭＩＮ６細胞、線維芽細胞、ＭＣＦ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ラット肝臓細胞、Ｐａｎｃ１細胞、及びＤｕ１４５細胞の細胞増殖を示す図である。

【図23】同質遺伝子ＰＥＯ１及びＰＥＯ４細胞株ペアのｉｎ ｖｉｖｏ誘導を示す図である。

【図24】Ａ～Ｃ：Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクショントランスフェクション後のＰＥＯ１細胞及びＰＥＯ４細胞の細胞増殖を示す図である。

【図25】増殖アッセイを示す図である。Ａ～Ｃ：Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ＋Ｃ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡトランスフェクショントランスフェクション後のＨｅｐＧ２細胞増殖アッセイ、ウエスタンブロット、及びｍＲＮＡレベル。

【図26】増殖アッセイを示す図である。Ａ～Ｃ：Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ＋Ｃ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＭＣＦ７細胞増殖アッセイ、ウエスタンブロット、及びｍＲＮＡレベル。

【図27】対照群とＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置群との間の、発現制御倍数データのグラフ表示を提供するヒートマップを示す図である。

【図28】発現パターンアッセイを示す図である。Ａ：この散布図では、アレイの全ての成熟ｍｉＲＮＡの正規化発現が、対照群とＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置群との間で比較されている。中心線は、無変化のｍｉＲＮＡ発現を示す。Ｂ：このクラスタグラムには、ｍｉＲＮＡ発現プロファイル全体の教師無し階層化クラスタ分析が示されている。

【図29】癌進行におけるマイクロＲＮＡの役割（従来技術の結果）を示す図である。

【図30】コレステロールに対する効果を示す図である。Ａ～Ｂ：Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、コレステロール（Ａ）及びＬＤＬ（Ｂ）の循環レベルを変化させた。

【図31】体重に対する効果を示す図である。Ａ：デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの体重変化。Ｂ：高脂肪／高コレステロール食餌を与えたラット及び与えなかったラットの身体サイズの変化。

【図32A】肝臓の脂質及び病理を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝臓のトリグリセリドレベル。

【図32B】肝臓の脂質及び病理を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝臓のコレステロールレベル。

【図32C】肝臓の脂質及び病理を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝臓サイズ及び外観。

【図32D】肝臓の脂質及び病理を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝臓組織の組織病理学的染色画像。

【図33A】遺伝子発現及び血清コレステロール研究を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットのＣＥＢＰα発現。

【図33B】遺伝子発現及び血清コレステロール研究を示す図である。Ａ～Ｄ：デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットのＣＤ３６発現。

【図33C】遺伝子発現及び血清コレステロール研究を示す図である。Ａ～Ｄ：デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットのＬＰＬ発現。

【図33D】遺伝子発現及び血清コレステロール研究を示す図である。Ａ～Ｄ：デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットのＬＸＲ発現。

【図34】デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの血清コレステロールレベルを示す図である。

【図35A】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＣＥＢＰαの発現。

【図35B】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＳＲＥＢＦ－１の発現。

【図35C】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＣＤ３６の発現。

【図35D】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＡＣＡＣＢの発現。

【図35E】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＡＰＯＣ３の発現。

【図35F】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＭＴＰの発現。

【図35G】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１αの発現。

【図35H】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＬＤＬＲの発現。

【図35I】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１βの発現。

【図35J】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＰＰＡＲγの発現。

【図35K】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＡＣＡＣＡの発現。

【図35L】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＭＬＸＩＰＬの発現。

【図35M】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＰＰＡＲαの発現。

【図35N】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＦＡＳＮの発現。

【図35O】遺伝子発現に対する効果を示す図である。デンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラット及び対照で処置したラットの肝細胞のＤＧＡＴ２の発現。

【図36A】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＳＲＥＢＰの発現。

【図36B】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＣＤ３６の発現。

【図36C】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＬＤＬＲの発現。

【図36D】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＰＰＡＲＧＣ１Ａの発現。

【図36E】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＡＰＯＣの発現。

【図36F】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＡＣＡＣＢの発現。

【図36G】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＰＥＲＣの発現。

【図36H】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＡＣＡＣＡの発現。

【図36I】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＭＬＸＰ１の発現。

【図36J】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＭＴＯＲの発現。

【図36K】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＰＰＡＲＡの発現。

【図36L】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＦＡＳＮの発現。

【図36M】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＢＡＴ細胞でのＤＧＡＴの発現。

【図37A】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＳＲＥＢＰの発現。

【図37B】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＣＤ３６の発現。

【図37C】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＬＤＬＲの発現。

【図37D】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＰＰＡＲＧＣ１Ａの発現。

【図37E】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＭＴＰの発現。

【図37F】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＡＰＯＣの発現。

【図37G】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＡＣＡＣＢの発現。

【図37H】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＰＥＲＣの発現。

【図37I】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＡＣＡＣＡの発現。

【図37J】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＭＬＸ１ＰＬの発現。

【図37K】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＭＴＯＲの発現。

【図37L】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＦＡＳＮの発現。

【図37M】遺伝子発現に対する効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＷＡＴ細胞でのＤＧＡＴの発現。

【図38A】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＡＳＴ。

【図38B】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＡＬＴ。

【図38C】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のクレアチニン。

【図38D】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の総ビリルビン。

【図38E】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の血小板数。

【図38F】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＷＢＣ。

【図38G】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のリンパ球。

【図38H】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の好中球。

【図38I】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＲＢＣ。

【図38J】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の単球。

【図38K】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の好酸球。

【図38L】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の好塩基球。

【図38M】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のヘモグロビン。

【図38N】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の体重。

【図38O】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の体重増加量。

【図38P】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の肝臓重量。

【図38Q】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の肝臓重量／体重。

【図38R】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の白色脂肪。

【図38S】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の白色脂肪／体重。

【図38T】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の褐色脂肪。

【図38U】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の褐色脂肪／体重。

【図38V】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の筋肉。

【図38W】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後の筋肉／体重。

【図39A】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のコレステロール。

【図39B】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のコレステロールの変化。

【図39C】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のトリグリセリド。

【図39D】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のトリグリセリドの変化。

【図39E】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＨＤＬ。

【図39F】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＨＤＬの変化。

【図39G】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＬＤＬ。

【図39H】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＬＤＬの変化。

【図39I】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＨＤＬ／ＬＤＬ。

【図39J】本発明のｓａＲＮＡを投与した際の、生物学的測定値に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＨＤＬ／ＬＤＬの変化。

【図40A】サイトカインレベルを示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＩＬ－６のレベル。

【図40B】サイトカインレベルを示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＩＬ－１ｂのレベル。

【図40C】サイトカインレベルを示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置後のＴＮＦ－αのレベル。

【図41】Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクション後のＣ／ＥＢＰα相対発現レベル、Ｃ／ＥＢＰβ相対発現レベル、及び「自己再生」転写因子相対発現レベルを示す図である。

【図42】Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクション後のＣ／ＥＢＰα相対発現レベル、Ｃ／ＥＢＰβ相対発現レベル、及びＮＡＮＯＧ相対発現レベルを示す図である。

【図43A】ウエスタンブロットを示す図である。Ｃ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰβタンパク質アイソフォームの比率を研究するための、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞のウエスタンブロット。

【図43B】ウエスタンブロットを示す図である。Ｃ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰβタンパク質アイソフォームの比率を研究するための、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞のウエスタンブロット。

【図44A】遺伝子発現を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及びＣ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後のＣ／ＥＢＰファミリーメンバーの相対発現。

【図44B】遺伝子発現を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及びＣ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後のＣ／ＥＢＰファミリーメンバーの相対発現。

【図44C】遺伝子発現を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及びＣ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後のＣ／ＥＢＰファミリーメンバーの相対発現。

【図45】Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ（ＣＡＷ１）でトランスフェクションした４日後の、又は臨床レトロウイルス複製ベクターにクローニングしたｍｉＲＮＡ設計のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ（ｍｉＣＡＷ１）で形質導入した４日後の、Ｕ８７－ｆＬｕｃ細胞におけるＣ／ＥＢＰα発現レベルを示す図である。スクランブルｓｉＲＮＡ（ｃｏｎ）、及びホタルルシフェラーゼ（ｍｉｆＬｕｃ）に対する小型阻害性ヘアピンを送達するレトロウイルスベクターを陰性対照として使用した。

【図46】Ｃ／ＥＢＰα－ＡＷ１ ｍｉＲＮＡインサート配列及び共通ｍｉＲ－３０構成（配列番号３８４）を示す図である。

【図47】ＭＴＬ－５０１（Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー）で治療した患者の血清アルブミンレベルを示す図である。

【図48】ＭＴＬ－５０１（Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー）で治療した硬変症患者の白血球数を示す図である。

【図49A】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図49B】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるＡＬＢ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図49C】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるｐ２１ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図49D】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。１０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図49E】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。１０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるＡＬＢ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図49F】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。１０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるｐ２１ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図50A】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図50B】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるｅｃＣＥＢＰＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図50C】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。１０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図50D】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。１０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるｅｃＣＥＢＰＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図50E】ＤＵ１４５細胞での発現を示す図である。５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞における、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ、ＡＷ６６５８１２レベルのＥＳＴＳを示す。

【図51】修飾Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションした後のＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡ、ＡＬＢ、ｐ２１のｍＲＮＡ発現レベルを示す。

【図52】相対発現を示す図である。Ａ～Ｄは、通常のトランスフェクション（Ｔ）、リバーストランスフェクション（ＲＴ）、１用量の５０ｎＭ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡによるトランスフェクション（１）又は２用量の５０ｎＭ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡによるトランスフェクション（２）を受けたＨｅｐＧ２細胞におけるＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ相対発現レベルを示す。

【図53A】増殖及び時間研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ処置ＨｅｐＧ２細胞の増殖低減を示す。

【図53B】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＨｅｐＧ２細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図53C】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＨｅｐＧ２細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図53D】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図53E】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＨｅｐＧ２細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図53F】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＨｅｐＧ２細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図53G】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図54A】増殖及び時間研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ処置ＤＵ１４５細胞の増殖低減を示す。

【図54B】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図54C】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＤＵ１４５細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図54D】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＤＵ１４５細胞におけるアルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図54E】増殖及び時間研究を示す図である。、Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図54F】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＤＵ１４５細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図54G】増殖及び時間研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＤＵ１４５細胞におけるアルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図55A】増殖及び製剤化研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ処置ＡＭＬ細胞の増殖低減を示す。

【図55B】増殖及び製剤化研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＡＭＬ細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図55C】増殖及び製剤化研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＡＭＬ細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図55D】増殖及び製剤化研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＡＭＬ細胞におけるアルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図55E】増殖及び製剤化研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＡＭＬ細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図55F】増殖及び製剤化研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＡＭＬ細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図55G】増殖及び製剤化研究を示す図である。Ｃ／ＥＢＰα―ｓａＲＮＡトランスフェクション後の様々な時点での、ＡＭＬ細胞におけるアルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図56A】製剤化研究。製剤化ＮＯＶ３４０－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後の、ＤＵ１４５細胞及びＨｅｐＧ２細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図56B】製剤化研究。製剤化ＮＯＶ３４０－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後の、ＤＵ１４５細胞及びＨｅｐＧ２細胞におけるＡＬＢのｍＲＮＡレベルを示す。

【図56C】製剤化研究。製剤化ＮＯＶ３４０－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後の、ＤＵ１４５細胞及びＨｅｐＧ２細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図56D】製剤化研究。製剤化ＮＯＶ３４０－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後の、ＤＵ１４５細胞及びＨｅｐＧ２細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図56E】製剤化研究。製剤化ＮＯＶ３４０－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後の、ＤＵ１４５細胞及びＨｅｐＧ２細胞におけるＡＬＢのｍＲＮＡレベルを示す。

【図56F】製剤化研究。製剤化ＮＯＶ３４０－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後の、ＤＵ１４５細胞及びＨｅｐＧ２細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図57A】研究デザイン及びアルブミンレベルを示す図である。野生マウスで実施した、製剤化ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ研究のフローチャートを示す。

【図57B】研究デザイン及びアルブミンレベルを示す図である。血清アルブミンタンパク質レベルを示す。

【図57C】研究デザイン及びアルブミンレベルを示す図である。ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡレベルを示す。

【図57D】研究デザイン及びアルブミンレベルを示す図である。アルブミンｍＲＮＡレベルを示す。

【図57E】研究デザイン及びアルブミンレベルを示す図である。血清アルブミンタンパク質レベルを示す。

【図57F】研究デザイン及びアルブミンレベルを示す図である。ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡレベルを示す。

【図57G】研究デザイン及びアルブミンレベルを示す図である。アルブミンｍＲＮＡレベルを示す。

【図58A】研究デザイン及び結果を示す図である。ＤＥＮラットで実施した、製剤化ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ研究のフローチャートを示す。

【図58B】研究デザイン及び結果を示す図である。１２日目の腫瘍量を示す。

【図58C】研究デザイン及び結果を示す図である。１２日目の血清ビリルビンレベルを示す。

【図58D】研究デザイン及び結果を示す図である。１２日目のＡＬＴ肝酵素レベルを示す。

【図58E】研究デザイン及び結果を示す図である。１２日目の血清アルブミンレベルを示す。

【図58F】研究デザイン及び結果を示す図である。１２日目のコレステロールレベルを示す。

【図59A】ＥＬＩＳＡ及びｍＲＮＡ研究を示す図である。野生型マウスでの製剤化ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡによるアルブミンＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図59B】ＥＬＩＳＡ及びｍＲＮＡ研究を示す図である。野生型マウスでの製剤化ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡによるアルブミンＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図59C】ＥＬＩＳＡ及びｍＲＮＡ研究を示す図である。ＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図59D】ＥＬＩＳＡ及びｍＲＮＡ研究を示す図である。アルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図60】肝臓重量及び腫瘍容積を示す図である。Ａは、製剤化ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ処置後のＤＥＮラットの肝臓重量及び体重の比を示す。Ｂは、製剤化ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ処置後のＤＥＮラットの腫瘍容積を示す。

【図61】ウエスタンブロットを示す図である。Ａ及びＢは、ビオチン標識ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡで形質移入したＨｅｐＧ２細胞におけるウエスタンブロットの結果を示す。

【図62A】免疫沈降研究を示す図である。ビオチン標識ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのＣｈＩＰ－Ｓｅｑを示す。

【図62B】免疫沈降研究を示す図である。ビオチン標識ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのＣｈＩＰ－Ｓｅｑを示す。

【図62C】免疫沈降研究を示す図である。ビオチン標識ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのＣｈＩＰ－Ｓｅｑを示す。

【図62D】免疫沈降研究を示す図である。ビオチン標識ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのＣｈＩＰ－Ｓｅｑを示す。

【図62E】免疫沈降研究を示す図である。ビオチン標識ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのＣｈＩＰ－Ｓｅｑを示す。

【図63A】肝再生を示す図である。肝切除術後の肝再生率を示す。

【図63B】肝再生を示す図である。ＢｒｄＵ標識率を示す。

【図63C】肝再生を示す図である。ＰＣＮＡ標識率を示す。

【図63D】肝再生を示す図である。Ｋｉ－６７標識率を示す。

【図64】ＨＣＣ及び肝不全に関与する因子を示す図である。

【図65A】発現研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後のＨｅｐＧ２細胞のＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図65B】発現研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後のＨｅｐＧ２細胞のアルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図65C】発現研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後のＨｅｐＧ２細胞のｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図65D】発現研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後のＤＵ１４５細胞のＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図65E】発現研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡトランスフェクション後のＤＵ１４５細胞のｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図66A】発現研究を示す図である。様々な濃度のＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図66B】発現研究を示す図である。様々な濃度のＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞におけるアルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図66C】発現研究を示す図である。様々な濃度のＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図66D】発現研究を示す図である。様々な濃度のＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞におけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを示す。

【図66E】発現研究を示す図である。様々な濃度のＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図66F】発現研究を示す図である。様々な濃度のＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図66G】発現研究を示す図である。様々な濃度のＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞におけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを示す。

【図67】ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞における、ＡＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ｅｃＣＥＢＰＡ、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＳＴＡＴ３、及びＴＰ５３の相対発現を示す図である。

【図68A】用量反応研究を示す図である。修飾ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞における、ＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図68B】用量反応研究を示す図である。修飾ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞における、ｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図68C】用量反応研究を示す図である。修飾ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞における、アルブミンのｍＲＮＡレベルを示す。

【図68D】用量反応研究を示す図である。修飾ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞における、ＡＦＰのｍＲＮＡレベルを示す。

【図68E】用量反応研究を示す図である。修飾ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞における、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを示す。

【図69A】用量反応研究を示す図である。修飾ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞における、ＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図69B】用量反応研究を示す図である。修飾ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞における、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを示す。

【図69C】用量反応研究を示す図である。Ａｈａ１－ｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞における、Ａｈａ１ ｍＲＮＡレベルを示す。

【図70A】時間経過研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡで単回トランスフェクションした、又は２つのＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡの組み合わせでトランスフェクションした２４時間、４８時間、及び７２時間後の、ＨｅｐＧ２細胞における、ＣＥＢＰＡ、アルブミン、ｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図70B】時間経過研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡで二重トランスフェクションした、又は２つのＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡの組み合わせでトランスフェクションした２４時間、４８時間、及び７２時間後の、ＨｅｐＧ２細胞における、ＣＥＢＰＡ、アルブミン、ｐ２１のｍＲＮＡレベルを示す。

【図71】ＣＥＢＰＡ－ルシフェラーゼリポーターアッセイの結果を示す図である。

【図72A】サイトカイン研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのトランスフェクション後のヒトＰＢＭＣにおける、ＴＮＦ－アルファ応答を示す。

【図72B】サイトカイン研究を示す図である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのトランスフェクション後のヒトＰＢＭＣにおける、ＩＦＮ－アルファ応答を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、治療の目的でＣ／ＥＢＰα遺伝子発現及び／又は機能を調節するための組成物、方法、及びキットを提供する。これら組成物、方法、及びキットは、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とする核酸構築体を含む。

【0016】

Ｃ／ＥＢＰαタンパク質は、代謝プロセス及び細胞増殖の重要な制御因子として知られている。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子を調節することは、治療目的に非常に有望である。本発明は、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とする、修飾されている又は修飾されていない一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡを含んでいてもよい核酸構築体を提供することによりこの必要性に取り組むものである。

【0017】

本明細書の状況では、用語「標的」又は「標的とする」は、Ｃ／ＥＢＰα転写物に対して効果を及ぼすことを意味する。効果は、直接的でもよく、又は間接的であってもよい。直接的効果は、Ｃ／ＥＢＰα転写物との完全な又は部分的なハイブリダイゼーションにより引き起こされてもよい。間接的効果は、上流であってもよく、又は下流であってもよい。

【0018】

本明細書の状況では、用語「Ｃ／ＥＢＰα転写物」、「Ｃ／ＥＢＰα標的転写物」、又は「標的転写物」は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のいずれかの鎖、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のアンチセンスＲＮＡ、Ｃ／ＥＢＰαタンパク質をコードするＣ／ＥＢＰα ｍＲＮＡ、又はＣ／ＥＢＰα遺伝子発現を制御する非コードＲＮＡに位置していてもよい。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現を制御する非コードＲＮＡの１つの例は、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のアンチセンスＲＮＡは、本明細書の下記では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物と呼ばれている。

【0019】

１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的する核酸構築体は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現及び／又は機能を調節する。
本明細書の状況では、用語「調節する」は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現及び／又は機能を上方制御又は下方制御することを含んでいてもよい。

【0020】

本明細書の状況では、用語「遺伝子発現」は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子からＣ／ＥＢＰα ｍＲＮＡを生成する転写ステップ、又はＣ／ＥＢＰα ｍＲＮＡからＣ／ＥＢＰαタンパク質を生成する翻訳ステップを含んでいてもよい。Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡの増加及びＣ／ＥＢＰαタンパク質の増加は両方とも、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現の増加又は正の効果を示す。

【0021】

Ｉ．本発明の組成物
本発明の１つの態様は、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とする核酸構築体、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。そのような核酸構築の１つの例は、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）であり、以下では「Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ」又は「本発明のｓａＲＮＡ」と呼ばれ、本出願では同義的に使用される。

【0022】

本明細書の状況では、用語「低分子活性化ＲＮＡ」又は「ｓａＲＮＡ」は、特定遺伝子の遺伝子発現を上方制御するか又は正の効果を示す、典型的には５０個ヌクレオチド未満の一本鎖又は二本鎖ＲＮＡを意味する。上記遺伝子は、上記ｓａＲＮＡの標的遺伝子と呼ばれる。例えば、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの標的遺伝子である。

【0023】

ｓａＲＮＡ設計
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とする。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の標的アンチセンスＲＮＡ転写物に相補的であるように設計されており、標的アンチセンスＲＮＡ転写物を下方制御することによりＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現及び／又は機能にその効果を及ぼすことができる。

【0024】

本発明の状況では、用語「相補的」は、ストリンジェントな条件下で標的アンチセンスＲＮＡ転写物とハイブリダイズすることができることを意味する。
本発明の状況において、核酸配列の記載に使用される場合、用語「センス」は、その配列が、遺伝子のコード鎖の配列と同一性を有することを意味する。本発明の状況において、核酸配列の記載に使用される場合、用語「アンチセンス」は、その配列が、遺伝子のコード鎖の配列と相補性を有することを意味する。

【0025】

標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の最大１００、８０、６０、４０、２０、又は１０ｋｂ上流にある遺伝子座から、又はＣ／ＥＢＰα遺伝子の転写終止部位の最大１００、８０、６０、４０、２０、又は１０ｋｂ下流にある遺伝子座から転写されてもよい。１つの実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位の最大１ｋｂ上流にある遺伝子座から、又はＣ／ＥＢＰα遺伝子の転写終止部位の最大１ｋｂ下流にある遺伝子座から転写される。別の実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位の最大５００、２５０、又は１００個ヌクレオチド上流にある遺伝子座から、又はＣ／ＥＢＰα遺伝子の転写終止部位の最大５００、２５０、又は１００個ヌクレオチド下流にある遺伝子座から転写される。好ましくは、遺伝子座は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位から５００個ヌクレオチド以下の上流に又は下流にある。

【0026】

用語「［特定の遺伝子座］から転写される」は、本発明の標的アンチセンスＲＮＡ転写物の文脈では、「標的ＲＮＡ転写物の転写開始部位が、［特定の遺伝子座］に見出される」ことを意味する。１つの実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の転写開始部位及び転写終止部位は両方とも、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位の最大１００ｋｂ上流又はＣ／ＥＢＰα遺伝子の転写終止部位の最大１００ｋｂ下流のいずれかに別々に位置する。

【0027】

標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のゲノム配列のコード鎖に相補的であり、本明細書で「ゲノム配列」を参照する場合はいずれも、「ゲノム配列のコード鎖」の省略である。

【0028】

遺伝子の「コード鎖」は、その遺伝子のｍＲＮＡのコード配列を含む鎖である。遺伝子の「テンプレート鎖」は、その遺伝子のｍＲＮＡのコード配列を含まない鎖である。
したがって、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位の１００、８０、６０、４０、２０、又は１０ｋｂ上流と、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写終止部位の１００、８０、６０、４０、２０、又は１０ｋｂ下流との間にあるゲノム配列に相補的な配列を含んでいてもよい。１つの実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位の１ｋｂ上流と、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写終止部位の１ｋｂ下流との間にあるゲノム配列に相補的な配列を含む。別の実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位の５００、２５０、又は１００個ヌクレオチド上流と、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写終止部位の５００、２５０、又は１００個ヌクレオチド下流との間にあるゲノム配列に相補的な配列を含む。標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のコード領域を含むゲノム配列に相補的な配列を含んでいてもよい。最も好ましくは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域のゲノム配列に相補的な配列を含む。したがって、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、好ましくは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域に相補的な配列を含む。

【0029】

遺伝子は、複数のプロモーター領域を有していてもよく、その場合には、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、プロモーター領域の１つ又は２つ以上とオーバーラップしていてもよい。注釈付き遺伝子座のオンラインデータベースを使用して、遺伝子のプロモーター領域を特定してもよい。

【0030】

標的アンチセンスＲＮＡ転写物とＣ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域との間のオーバーラップ領域、つまり、相補的領域は、部分的であってもよく、長さが単一ヌクレオチドと短くともよいが、好ましくは長さが少なくとも１５個ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも２５個ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも５０個ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも７５個ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも１００個ヌクレオチドである。以下の特定の構成の各々は、用語「オーバーラップ」の範囲以内に入ることが意図される。

【0031】

ａ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物及びＣ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域は、長さが同一であり、オーバーラップしている（つまり、それらは、それらの全長にわたって相補的である）。

【0032】

ｂ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域よりも短く、その全長にわたってＣ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域とオーバーラップしている（つまり、それは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域内の配列に対して、その全長にわたって相補的である）。

【0033】

ｃ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域よりも長く、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域が、それと完全にオーバーラップしている（つまり、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物内の配列に対して、その全長にわたって相補的である）。

【0034】

ｄ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物及びＣ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域は、長さが同一又は異なっており、オーバーラップの領域は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の長さ及びＣ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域の長さの両方と比べて短い。

【0035】

上述した「オーバーラップ」の定義は、本明細書の全体にわたって他のオーバーラップ配列の記載に準用される。むろん、標的アンチセンスＲＮＡ転写物が、プロモーター領域以外のＣ／ＥＢＰα遺伝子の領域とオーバーラップすると記載されている場合、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の配列は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域内ではなく、その領域内の配列に対して相補的である。

【0036】

１つの実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位を含むゲノム配列に相補的な配列を含む。言いかえれば、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位とオーバーラップする配列を含む。

【0037】

１つの実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、長さが、少なくとも１ｋｂ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｋｂ、例えば、２０、２５、３０、３５、又は４０ｋｂである。

【0038】

１つの実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のコード鎖の配列に対して、その全長にわたって少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％相補的な配列を含む。

【0039】

本発明は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物を標的とするｓａＲＮＡを提供し、そのような標的アンチセンスＲＮＡ転写物を効果的に及び特異的に下方制御することができる。これは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物内の配列に対して高度な相補性を有するｓａＲＮＡにより達成することができる。ｓａＲＮＡは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物内の配列に、５つ以下、好ましくは４つ又は３つ以下、より好ましくは２つ以下、更により好ましくは１つ以下のミスマッチを有し、最も好ましくはミスマッチを有していないだろう。

【0040】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対して少なくとも９５、９８、９９、又は１００％の相補性を有する、少なくとも１３個ヌクレオチドの配列を含む。好ましくは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対して少なくとも９５、９８、９９、又は１００％の相補性を有する上記配列は、長さが、少なくとも１５、１６、１７、１８、又は１９個ヌクレオチドであり、好ましくは１８～２２個又は１９～２１個、最も好ましくはちょうど１９個である。また本発明のｓａＲＮＡは、ＵＵ又はＵＵＵであってもよい３’尾部を含んでいてもよい。

【0041】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、二本鎖を形成する２本の鎖を有していてもよく、一方の鎖は、ガイド鎖である。本発明のｓｉＲＮＡは、標的転写物の領域に対してｓｉＲＮＡ様の相補性を有していてもよい。すなわち、ｓａＲＮＡ二本鎖のガイド鎖の５’末端からヌクレオチド２～６と標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域との相補性が１００％であってもよい。加えて、ｓａＲＮＡの他のヌクレオチドは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対して、少なくとも７０、８０、９０、９５、９９、又は１００％の相補性を有していてもよい。例えば、ｓａＲＮＡのヌクレオチド７（５’末端から数えて）から３’末端までは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対して、少なくとも７０、８０、９０、９５、９９、又は１００％の相補性を有していてもよい。

【0042】

用語「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、本発明の状況では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与し、特定の遺伝子の発現を干渉又は阻害する、典型的には長さが２０～２５個ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを意味する。上記遺伝子は、上記ｓｉＲＮＡの標的遺伝子である。例えば、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の発現に干渉するｓｉＲＮＡは、「Ｃ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡ」と呼ばれ、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子は、標的遺伝子である。Ｃ／ＥＢＰαの発現に干渉するｓｉＲＮＡは、「Ｃ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡ」と呼ばれ、Ｃ／ＥＢＰαは、標的遺伝子である。ｓｉＲＮＡは、通常、長さが約２１個ヌクレオチドであり、二本の鎖の各末端には３’突出（２個ヌクレオチド）を有する。

【0043】

ｓｉＲＮＡは、上記遺伝子の１つ又は複数のＲＮＡ転写物に特定の配列に結合して切断を促進することにすることにより、標的遺伝子の発現を阻害する。典型的には、ＲＮＡｉでは、ＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡであり、したがってｍＲＮＡの切断は、遺伝子発現の下方制御をもたらす。本発明では、いかなる理論にも束縛されることは望まないが、考え得る機序の１つは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが、標的アンチセンスＲＮＡ転写物を切断することにより、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現を調節することができるということである。

【0044】

当業者であれば、ｓａＲＮＡがＣ／ＥＢＰα遺伝子発現を調節する機序に関わらず、標的アンチセンスＲＮＡ転写物を参照することにより本発明のｓａＲＮＡを規定することが便利であることを認識するだろう。しかしながら、その代わりに、本発明のｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子を参照することにより規定してもよい。標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のコード鎖のゲノム領域に相補的であり、ひいては、本発明のｓａＲＮＡは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域に相補的であり、したがって、本発明のｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のコード鎖の領域に対して配列同一性を有すると規定することができる。標的アンチセンスＲＮＡ転写物を参照することによる本発明のｓａＲＮＡの規定に関して本明細書で考察されている特徴は全て、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子を参照することによる本発明のｓａＲＮＡの規定に準用される。したがって、標的アンチセンスＲＮＡ転写物に対する相補性のあらゆる考察は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のゲノム配列に対する同一性を含むと理解されるべきである。したがって、本発明のｓａＲＮＡは、好ましくは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のゲノム配列に対して、高い同一性パーセント、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％、好ましくは１００％の同一性を有する。ゲノム配列は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写開始部位の最大５００個ヌクレオチド上流に又は下流にあることが好ましい。最も好ましくは、ゲノム配列は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域内にある。したがって、ｓａＲＮＡは、好ましくは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のプロモーター領域内にある配列に対して配列同一性を有する。

【0045】

本発明のｓａＲＮＡは、一本鎖であってもよく、又は好ましくは二本鎖であってもよい。二本鎖分子は、第１の鎖及び第２の鎖を含む。二本鎖の場合、好ましくは、二本鎖の各鎖は、長さが、少なくとも１４個、より好ましくは少なくとも１８個ヌクレオチド、例えば、長さが１９、２０、２１、又は２２個ヌクレオチドである。好ましくは、二本鎖は、少なくとも１２個、より好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは１７個、更により好ましくは少なくとも１９個ヌクレオチドの長さにわたってハイブリダイズしている。各鎖は、長さがちょうど１９個ヌクレオチドであってもよい。好ましくは、ｓａＲＮＡの長さは、３０個ヌクレオチド未満である。それは、この長さを超えるオリゴヌクレオチド二本鎖では、インターフェロン応答を誘導するリスクが増加する場合があるからである。ｓａＲＮＡ二本鎖を形成する鎖は、長さが等しくともよく、又は等しくなくともよい。

【0046】

本発明のｓａＲＮＡは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物に相補的でない短い３’又は５’配列を含んでいてもよい。１つの実施形態では、そのような配列は、３’である。上記配列は、長さが１～５個、好ましくは２又は３個のヌクレオチドであってもよい。上記配列は、好ましくはウラシルを含み、したがって、好ましくは２又は３個ウラシルの３’伸長である。この非相補性配列は「尾部」と呼ばれる場合がある。３’尾部が存在する場合、鎖はより長くともよく、例えば、１９個ヌクレオチド＋３’尾部であってもよく、３’尾部は、好ましくはＵＵ又はＵＵＵである。本発明のｓａＲＮＡは、ダイサー基質配列又はドローシャ基質配列を更に含んでいてもよい。

【0047】

本発明のｓａＲＮＡは、フランキング配列を含んでいてもよい。フランキング配列は、本発明のｓａＲＮＡの３’末端又は５’末端に挿入されていてもよい。１つの実施形態では、フランキング配列は、ｍｉＲＮＡの配列であり、ｓａＲＮＡにｍｉＲＮＡ構成を付与し、ドローシャ及びダイサーで切断することができる。非限定的な例では、本発明のｓａＲＮＡは、２本の鎖を有し、ｍｉＲ－３０骨格フランキング配列にクローニングされている。

【0048】

本発明のｓａＲＮＡは、制限酵素基質又は認識配列を含んでいてもよい。制限酵素認識配列は、本発明のｓａＲＮＡの３’末端又は５’末端に存在していてもよい。制限酵素の非限定的な例としては、ＮｏｔＩ及びＡｓｃＩが挙げられる。

【0049】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、互いに安定的に対合し、各鎖の３’末端にある幾つかの非対合ヌクレオチドが３’突出を形成する２本の鎖からなる。各鎖の３’突出を形成する非対合ヌクレオチドの数は、好ましくは１～５個ヌクレオチドの範囲であり、より好ましくは１～３個ヌクレオチド、及び最も好ましくは２個ヌクレオチドである。３’突出は、上記で言及した３’尾部に形成されていてもよく、したがって、３’尾部は、３’突出であってもよい。

【0050】

したがって、本発明のｓａＲＮＡは、好ましくは、（ｉ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対して少なくとも９５％の相補性を有する配列、及び（ｉｉ）好ましくはウラシル残基を含む１～５個ヌクレオチドの３’尾部からなる。本発明のｓａＲＮＡは、好ましくは、存在する場合は３’尾部を除き、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対してその全長にわたって相補性を有する。上記で言及したように、本発明のｓａＲＮＡは、「標的アンチセンスＲＮＡ転写物に相補的」である代わりに、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のコード鎖に対して「同一性」を有すると規定することもできる。

【0051】

ｓａＲＮＡの設計は、以下の文献にも開示されている：同時係争中の国際出願第ＧＢ２０１２／０５１４２２号、同時係争中の米国特許出願公開第２０１３／０１６４８４６号明細書（ｓａＲＮＡアルゴリズム）、米国特許第８，３２４，１８１号明細書、及びコーリーらの米国特許第７，７０９，５６６号明細書、Ｌｉらの米国特許出願公開第２０１０／０２１０７０７号明細書、及びＶｏｕｔｉｌａら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、１巻、ｅ３５（２０１２年）。これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0052】

本明細書に記載したように、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の配列を使用して、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを設計する。標的Ｃ／ＥＢＰα転写物の配列は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを設計するためのＣ／ＥＢＰα遺伝子の配列から決定することができる。しかしながら、そのようなＣ／ＥＢＰα転写物の存在を決定する必要はない。本発明の好適なＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの好ましい配列は、表１に提供されている。したがって、配列番号２、４、６、８、１０、及び１２から選択される配列を含む第１の鎖を有するＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが提供される。任意選択で、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、これら配列の３’末端に３’尾部を含んでいてもよい。

【0053】

一本鎖Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、第１の鎖のみからなり、二本鎖Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、第２の鎖も有する。したがって、二本鎖Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、及び１１から選択される配列を含む第２の鎖を有していてもよい。

【0054】

配列番号２の第１の鎖及び配列番号１の第２の鎖を有する二本鎖Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが好ましい。

【0055】

【表1】

【0056】

また、二機能性又は二重機能性オリゴヌクレオチドは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現を上方制御し、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子発現を下方制御するように設計される。二重機能性オリゴヌクレオチドの一方の鎖は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現を活性化し、他方は、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子発現を阻害する。好ましい二重機能性オリゴヌクレオチド配列は、表２Ａに示されている。各鎖は、表２Ｂに示されるようなダイサー基質配列を更に含んでいてもよい。

【0057】

【表2A】

【0058】

【表2B】

【0059】

本発明のｓａＲＮＡは、任意の好適な方法により、例えば、合成的に生産してもよく、又は当業者に周知の標準的な分子生物学的技法を使用した細胞での発現により生産してもよい。例えば、本発明のｓａＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して、化学的に合成してもよく又は組換え的に産生してもよい。

【0060】

ｓａＲＮＡの化学修飾
本明細書では、ｓａＲＮＡの場合、用語「修飾」又は適切な場合は「修飾された」は、Ａ、Ｇ、Ｕ、又はＣリボヌクレオチドに対する構造的及び／又は化学的な修飾を指す。本発明のｓａＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド等の非標準ヌクレオチドを含んでいてもよい。本発明のｓａＲＮＡは、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間連結等に（例えば、連結リン酸に／リン酸ジエステル結合に／ホスホジエステル骨格に）、任意の有用な修飾を含んでいてもよい。ピリミジン核酸塩基の１つ又は複数の原子は、任意選択で置換されたアミノ、任意選択で置換されたチオール、任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル又はエチル）、又はハロ（例えば、クロロ又はフルオロ）と交換又は置換されていてもよい。ある実施形態では、修飾（例えば、１つ又は複数の修飾）は、糖及びヌクレオシド間連結の各々に存在する。本発明による修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）を、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に、トレオース核酸（ＴＮＡ）に、グリコール核酸（ＧＮＡ）に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に、ロックド核酸（ＬＮＡ）に、又はそれらのハイブリッドに修飾することであってもよい。非限定的な例では、Ｕの２’－ＯＨが、－ＯＭｅに置換される。

【0061】

本発明のｓａＲＮＡは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間連結への修飾の組み合わせを含むことができる。これらの組み合わせにとしては、、本明細書に記載されているもの、又は２０１２年１０月３日に出願された国際出願第２０１３／０５２５２３号に記載されているもの、特に式（Ｉａ）～（Ｉａ－５）、（Ｉｂ）～（Ｉｆ）、（ＩＩａ）～（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ－１）、（ＩＩｂ－２）、（ＩＩｃ－１）～（ＩＩｃ－２）、（ＩＩｎ－１）、（ＩＩｎ－２）、（ＩＶａ）～（ＩＶｌ）、及び（ＩＸａ）～（ＩＸｒ））の任意の１つ又は複数の修飾が挙げられる。これら文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0062】

本発明のｓａＲＮＡは、分子の全長にわたって一様に修飾されていてもよく、又はされていなくともよい。例えば、本発明のｓａＲＮＡ中の１つ若しくは複数の又は全てのタイプのヌクレオチド（例えば、プリン若しくはピリミジン、或いはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃの任意の１つ若しくは複数又は全て）は、一様に修飾されていてもよく又はされていなくともよい。幾つかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡ中の全てのヌクレオチドＸが修飾されており、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、又は組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、若しくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであってもよい。

【0063】

異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間連結（例えば、骨格構造）が、ｓａＲＮＡの種々の位置に存在してもよい。当業者であれば、ヌクレオチド類似体又は他の修飾（複数可）は、ｓａＲＮＡの機能を実質的に低減させずに、ｓａＲＮＡの任意の位置（複数可）に配置することができることを認識するだろう。本発明のｓａＲＮＡは、約１％から約１００％までの（全ヌクレオチド含有量に対して、又は１つ若しくは複数のタイプのヌクレオチド、つまりＡ、Ｇ、Ｕ、又はＣの１つ又は複数に対して）又はその間の任意のパーセントの修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい（例えば、１％から２０％まで、１％から２５％まで、１％から５０％まで、１％から６０％まで、１％から７０％まで、１％から８０％まで、１％から９０％まで、１％から９５％まで、１０％から２０％まで、１０％から２５％まで、１０％から５０％まで、１０％から６０％まで、１０％から７０％まで、１０％から８０％まで、１０％から９０％まで、１０％から９５％まで、１０％から１００％まで、２０％から２５％まで、２０％から５０％まで、２０％から６０％まで、２０％から７０％まで、２０％から８０％まで、２０％から９０％まで、２０％から９５％まで、２０％から１００％まで、５０％から６０％まで、５０％から７０％まで、５０％から８０％まで、５０％から９０％まで、５０％から９５％まで、５０％から１００％まで、７０％から８０％まで、７０％から９０％まで、７０％から９５％まで、７０％から１００％まで、８０％から９０％まで、８０％から９５％まで、８０％から１００％まで、９０％から９５％まで、９０％から１００％まで、及び９５％から１００％まで）。

【0064】

幾つかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、球状核酸（ＳＮＡ）又は環状核酸になるように修飾されていてもよい。本発明のｓａＲＮＡの端末を化学試薬又は酵素により連結して、自由末端を有しない球状のｓａＲＮＡを産生してもよい。球状のｓａＲＮＡは、その線形形態よりも安定しており、ＲＮａｓｅ Ｒエキソヌクレアーゼによる消化に耐性があると予想される。球状のｓａＲＮＡは、Ａ、Ｇ、Ｕ、又はＣリボヌクレオチドに、他の構造的及び／又は化学的修飾を更に含んでいてもよい。

【0065】

幾つかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、逆位脱塩基修飾（inverted abasic modification）を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、逆位脱塩基修飾は、５’末端にあってもよい。

【0066】

ｓａＲＮＡ結合体及び組み合わせ
結合は、安定性の増加及び／又は半減期の増加をもたらす場合があり、細胞、組織、又は生物の特定の部位に対して、本発明のｓａＲＮＡを標的化するのに特に有用であり得る。本発明のｓａＲＮＡは、以下のものと結合するように設計することができる：他のポリヌクレオチド、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、ミトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、ホスファート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］_２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性同位体標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収ファシリテータ（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的親和性を有する分子、又は抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、若しくは骨細胞等の指定の細胞タイプに結合する抗体、ホルモン、及びホルモン受容体、脂質等の非ペプチド種、レクチン、炭水化物、ビタミン、コファクター、又は薬物。核酸分子に好適な結合体は、２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号に開示されており、この文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0067】

本発明によると、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、１つ又は複数のＲＮＡｉ剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、エンハンサーＲＮＡ、エンハンサー由来ＲＮＡ、又はエンハンサー駆動ＲＮＡ（ｅＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成、アプタマー、又はベクター等を誘導して、様々な機能を達成するＲＮＡと共に投与してもよく、又は更にコードしていてもよい。上記の１つ又は複数のＲＮＡｉ剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成、アプタマー、又はベクターを誘導するＲＮＡは、少なくとも１つの修飾又は置換を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、修飾は、核酸の糖位置の化学的置換、リン酸位置の化学的置換、及び塩基位置の化学的置換から選択される。他の実施形態では、化学的修飾は、修飾ヌクレオチドの組み込み；３’キャッピング；高分子量の非免疫原性化合物との結合；親油性化合物との結合；及びリン酸骨格へのホスホロチオアートの組み込みから選択される。好ましい実施形態では、高分子量の非免疫原性化合物は、ポリアルキレングリコールであり、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

【0068】

１つの実施形態では、導入遺伝子を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから同時発現させることができるように、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡに結合させてもよい。非限定的な例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）に結合されている。

【0069】

１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーと結合させて、それによりＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－アプタマー結合体を生成してもよい。アプタマーは、高い選択性、親和性、及び安定性を有するオリゴヌクレオチド又はペプチドである。アプタマーは、特定の安定した三次元形状をとり、それにより標的分子との非常に特異的で強固な結合を供給する。アプタマーは、低分子、タンパク質、核酸、及び更に細胞、組織、及び生物等の種々の分子標的に結合するように、反復ラウンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択、即ち同義的にはＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）により遺伝子操作されている核酸種であってもよい。核酸アプタマーは、古典的ワトソン－クリック型塩基対以外の相互作用により、分子に対する特異的結合親和性を有する。核酸アプタマーは、ファージディスプレイ又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により生成されるペプチドのように、選択した標的に特異的に結合すること可能であり、結合することにより、それらの標的が機能する能力を阻止する。また、ある場合には、アプタマーは、ペプチドアプタマーであってもよい。任意の特定の分子標的の場合、核酸アプタマーは、核酸のコンビナトリアルライブラリから、例えばＳＥＬＥＸにより特定することができる。ペプチドアプタマーは、酵母ツーハイブリッド系を使用して特定してもよい。したがって、当業者であれば、本発明のｓａＲＮＡ又は細胞を、肝細胞等の標的細胞に送達するために好適なアプタマーを設計することができる。ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、及びペプチドアプタマーが企図される。肝臓に特異的なアプタマーを使用して、本発明のｓａＲＮＡを肝臓に投与することが、特に好ましい。

【0070】

本明細書で使用される場合、典型的な核酸アプタマーは、サイズがおよそ１０～１５ｋＤａ（２０～４５個ヌクレオチド）であり、少なくともナノモルの親和性でその標的と結合し、密接に関連する標的を区別する。核酸アプタマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はリボ核酸及びデオキシリボ核酸の混合であってもよい。アプタマーは、一本鎖のリボ核酸、デオキシリボ核酸、又はリボ核酸及びデオキシリボ核酸の混合であってもよい。アプタマーは、少なくとも１つの化学的修飾を含んでいてもよい。

【0071】

アプタマーの好適なヌクレオチド長は、約１５から約１００個ヌクレオチド（ｎｔ）までの範囲であり、種々の他の好ましい実施形態では、長さが、１５～３０ｎｔ、２０～２５ｎｔ、３０～１００ｎｔ、３０～６０ｎｔ、２５～７０ｎｔ、２５～６０ｎｔ、４０～６０ｎｔ、２５～４０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ｎｔのいずれか、又は４０～７０ｎｔである。しかしながら、その配列は、本明細書に記載の距離にある２つの標的とアプタマーとの相互作用を収容することができる十分な可撓性を有するように設計することができる。アプタマーは、ヌクレアーゼ及び他の酵素活性からの保護を提供するように更に修飾されていてもよい。アプタマー配列は、当技術分野で知られている任意の好適な方法により修飾することができる。

【0072】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－アプタマー結合体は、直接化学結合形成、ストレプトアビジン等のリンカーによる連結等の、２つの部分を連結する任意の公知の方法も使用して形成することができる。

【0073】

１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、抗体に結合されていてもよい。標的細胞表面受容体に対する抗体を生成する方法は、周知である。本発明のｓａＲＮＡ分子は、公知の方法により、例えばＲＮＡ担体タンパク質を使用して、そのような抗体に結合することができる。その後、その結果生じた複合体を対象体に投与し、受容体媒介性エンドサイトーシスにより標的細胞に取り込まれてもよい。

【0074】

１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、以下のものに結合されていてもよい：コレステロール部分等の脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．米国、１９８９年、８６巻：６５５３～６５５６頁）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４年、４巻：１０５３～１０６０頁）、チオエーテル、例えば、ベリル－５－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２年、６６０巻：３０６～３０９頁；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３年、３巻：２７６５～２７７０頁）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２年、２０巻：５３３～５３８頁）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ、１９９１年、１０巻：１１１１～１１１８頁；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０年、２５９巻：３２７～３３０頁；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３年、７５巻：４９～５４頁）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール、又はトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈホスホナート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻：３６５１～３６５４頁；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０年、１８巻：３７７７～３７８３頁）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５年、１４巻：９６９～９７３頁）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻：３６５１～３６５４頁）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５年、１２６４巻：２２９～２３７頁）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６年、２７７巻：９２３～９３７頁）。これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0075】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの米国特許出願公開第２０１３０１８４３２８号明細書に開示されているリガンドと結合されている。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。結合体は、式：リガンド－［リンカー］_任意選択－［テザー］_任意選択－オリゴヌクレオチド剤を有する。オリゴヌクレオチド剤は、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの米国特許出願公開第２０１３０１８４３２８号明細書に開示されている式（Ｉ）を有するサブユニットを含んでいてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0076】

そのような核酸／脂質結合体の調製を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：米国特許第４，８２８，９７９号明細書；第４，９４８，８８２号明細書；第５，２１８，１０５号明細書；第５，５２５，４６５号明細書；第５，５４１，３１３号明細書；第５，５４５，７３０号明細書；第５，５５２，５３８号明細書；第５，５７８，７１７号明細書、第５，５８０，７３１号明細書；第５，５９１，５８４号明細書；第５，１０９，１２４号明細書；第５，１１８，８０２号明細書；第５，１３８，０４５号明細書；第５，４１４，０７７号明細書；第５，４８６，６０３号明細書；第５，５１２，４３９号明細書；第５，５７８，７１８号明細書；第５，６０８，０４６号明細書；第４，５８７，０４４号明細書；第４，６０５，７３５号明細書；第４，６６７，０２５号明細書；第４，７６２，７７９号明細書；第４，７８９，７３７号明細書；第４，８２４，９４１号明細書；第４，８３５，２６３号明細書；第４，８７６，３３５号明細書；第４，９０４，５８２号明細書；第４，９５８，０１３号明細書；第５，０８２，８３０号明細書；第５，１１２，９６３号明細書；第５，２１４，１３６号明細書；第５，０８２，８３０号明細書；第５，１１２，９６３号明細書；第５，２１４，１３６号明細書；第５，２４５，０２２号明細書；第５，２５４，４６９号明細書；第５，２５８，５０６号明細書；第５，２６２，５３６号明細書；第５，２７２，２５０号明細書；第５，２９２，８７３号明細書；第５，３１７，０９８号明細書；第５，３７１，２４１号明細書、５，３９１，７２３号明細書；第５，４１６，２０３号明細書、第５，４５１，４６３号明細書；第５，５１０，４７５号明細書；第５，５１２，６６７号明細書；第５，５１４，７８５号明細書；第５，５６５，５５２号明細書；第５，５６７，８１０号明細書；第５，５７４，１４２号明細書；第５，５８５，４８１号明細書；第５，５８７，３７１号明細書；第５，５９５，７２６号明細書；第５，５９７，６９６号明細書；第５，５９９，９２３号明細書；第５，５９９，９２８号明細書；及び第５，６８８，９４１号明細書。これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0077】

本発明のｓａＲＮＡは、考慮されている特定の方法に有効であることが知られている他の活性成分との組み合わせで提供することもできる。他の活性成分は、本発明のｓａＲＮＡと同時に、別々に、又は連続して投与されてもよい。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、異なる標的遺伝子を調節するｓａＲＮＡと共に投与される。非限定的な例としては、アルブミン、インスリン、又はＨＮＦ４Ａ遺伝子を調節するｓａＲＮＡが挙げられる。任意の遺伝子の調節は、単一のｓａＲＮＡ、又は２つ以上の異なるｓａＲＮＡの組み合わせを使用して達成することができる。本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと共に投与することができるｓａＲＮＡの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：２０１２年６月２０日に出願された国際公開第２０１２／１７５９５８号に開示されている、アルブミン又はＨＮＦ４Ａを調節するｓａＲＮＡ、両方とも２０１１年１０月１０日に出願された国際公開第２０１２／０４６０８４号及び第２０１２／０４６０８５号に開示されている、インスリンを調節するｓａＲＮＡ、２００６年１１月１３日に出願された米国特許第７，７０９，４５６号明細書、及び２０１０年４月２３日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０２７３８６３号明細書に開示されている、ヒトプロゲステロン受容体、ヒト主要ヴォールトタンパク質（ｈＭＶＰ）、Ｅ－カドヘリン遺伝子、ｐ５３遺伝子、又はＰＴＥＮ遺伝子を調節するｓａＲＮＡ、及び２００６年４月１１日に出願された国際公開第２００６／１１３２４６号に開示されている、ｐ２１遺伝子を標的とするｓａＲＮＡ。これらに文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0078】

１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子、つまりＣ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡの発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡと共に与される。本発明の好適なｓｉＲＮＡの好ましい配列は、表３に提供されている。

【0079】

【表3】

【0080】

１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、代謝、特に肝機能を制御する１つ又は複数の薬物と共に投与される。非限定的な例では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、スタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、クロフィブレート、フェノフィブリン（fenofibric）、トコトリエノール、植物ステロール、胆汁酸捕捉剤、プロブコール、又はそれらの組み合わせ等の、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール値を減少させる薬物と共に投与される。また、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｏｒｖｉｇらの米国特許第６２８７５８６号明細書に開示されているバナジウムビグアニド複合体と共に投与されてもよい。別の例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｒｈｏｄｅｓらの国際公開第２０１１０２８３８号に開示されている組成物と共に投与して、血清コレステロールを低下させることができる。この文献の内容は、それらの全体が参照により組み込まれる。この組成物は、ＰＣＳＫ９タンパク質に選択的に結合及び阻害する抗原結合タンパク質；及び細胞でのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するＲＮＡエフェクター剤を含む。更に別の例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＡＢＣ１生物活性を有するＡＢＣ１ポリペプチド、又はＢｒｏｏｋｓ－Ｗｉｌｓｏｎらの欧州特許第１８５４８８０号明細書に記載の、コレステロールレベルを調節するＡＢＣ１活性を有するＡＢＣ１ポリペプチドをコードする核酸と共に投与してもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0081】

別の実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、メトホルミン、スルホニル尿素、非スルホニル尿素分泌促進剤、αグルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グルカゴン様ペプチド－１類似体、及びジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤、又はそれらの組み合わせ等の、インスリン感受性を増加させるか又はＩＩ型糖尿病を治療する薬物と共に投与される。本発明のｓａＲＮＡと組み合わせて投与することができる他の肝保護剤は、Ａｄａｍｓら、Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、８２巻、３１５～３２２頁（２００６年）に開示されている。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0082】

ガンキリン及びＦＸＲタンパク質
肝細胞癌（ＨＣＣ）の進行は、肝臓過剰増殖及び肝臓癌に結び付く遺伝子発現の漸進的変化を伴う多段階プロセスである。肝臓癌の発癌中は、腫瘍抑制因子タンパク質Ｒｂ、ｐ５３、肝細胞核内因子４α（ＨＮＦ４α）、及びＣ／ＥＢＰ－αが中和されている。これらタンパク質の除去は、癌により活性化される２６Ｓプロテアソームの小サブユニットであるガンキリンにより媒介される。Ｗａｎｇらは、ガンキリンが、Ｃ／ＥＢＰαのＳ１９３－ｐｈアイソフォームと相互作用し、それを標的としてユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）媒介性分解を起こすことを開示している。ガンキリンレベルは、肝臓癌進行の初期段階中に上昇する（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、１２０巻（７号）：２５４９～２５６２頁（２０１０年）、この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、ガンキリン遺伝子（ＰＳＭＤ１０遺伝子としても知られている）のｓｉＲＮＡ及び／又はガンキリン阻害剤を使用して、ガンキリンを阻害することにより、ＨＣＣを予防及び／又は治療することができる。

【0083】

Ｊｉａｎｇらは、胆汁酸受容体（ＢＡＲ）又はＮＲ１Ｈ４としても知られているファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）が、ＨＤＡＣ１－Ｃ／ＥＢＰβ複合体によりガンキリンプロモータをサイレンシングすることにより、静止肝臓におけるガンキリンの発現を阻害することを見出した（Ｊｉａｎｇら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５７巻（３号）：１０９８～１１０６頁（２０１３年）、この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。マウスにおけるＦＸＲシグナル伝達の欠失は、１２月齢でガンキリンプロモータの抑制解除及び肝臓癌の自然発生に結び付く。また、野生型マウスのジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）媒介性肝臓癌は、ＦＸＲの低減及びガンキリンの活性化を伴う。高齢マウスの肝臓癌及びヒト患者の肝臓癌を調査すると、肝臓癌の自然発生中、ＦＸＲが低減する一方で、ガンキリンは上昇することが明らかになった。Ｊｉａｎｇらは、ＦＸＲが、Ｃ／ＥＢＰβ－ＨＤＡＣ１複合体によりガンキリンプロモータを阻害することによって肝臓癌を予防し、ひいては腫瘍抑制因子タンパク質を分解から保護することに結び付くと結論付けた。ＦＸＲの安定化及び核内移行は、ガンキリンを阻害する。例えば、ＦＸＲアゴニスト若しくは活性化因子、又はＮＲ１Ｈ４遺伝子の活性化因子を使用して、ＦＸＲを活性化することにより、ＨＣＣを予防及び／又は治療することができる。

【0084】

本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ガンキリンを下方制御するか又はＦＸＲを上方制御する治療剤の１つ又は複数と組み合わせて使用してもよい。この組み合わせは、ＨＣＣの予防及び／又は治療に相乗効果を示すことができる。幾つかの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ガンキリン－ｓｉＲＮＡと組み合わせて使用してもよい。二本鎖ガンキリン－ｓｉＲＮＡは、Ｈｉｇａｓｈｉｔｓｕｊｉらの「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ’ｓｅｃｔｉｏｎ」より開示されている方法を使用して産生することができる（Ｈｉｇａｓｈｉｔｓｕｊｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、８巻：７５～８７頁（２００５年）、この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。幾つかの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＦＸＲアゴニストと組み合わせて使用してもよい。ＦＸＲアゴニスト又は活性化因子の非限定的な例としては、タウロコール酸、オベチコール酸（ＯＣＡ）、ＩＮＴ－７６７（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、ＩＮＴ－７７７（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、及び以下のものに開示されている任意のＦＸＲアゴニスト又は活性化因子が挙げられる：米国特許出願公開第２０１４００５７８８６号明細書、米国特許第８５４６３６５号明細書、米国特許第７９３２２４４号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１００２０９号明細書、米国特許第８４４５４７２号明細書、米国特許第８１１４８６２号明細書、米国特許出願公開第２０１４００９４４４３号明細書、米国特許第８４１００８３号明細書、米国特許第８７９６２４９号明細書、米国特許出願公開第２０１４００２４６３１号明細書、米国特許第８３７７９１６号明細書、米国特許第８２５８２６７号明細書、米国特許第７７８６１０２号明細書、米国特許第７１３８３９０号明細書、米国特許第７９９４３５２号明細書、米国特許第７８５８６０８号明細書、米国特許第７８１２０１１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１４８４２８号明細書、及び米国特許出願公開第２００６０２５２６７０号明細書（これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0085】

製剤、送達、投与、及び用量
医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤を更に含んでいてもよく、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：所望の特定の剤形に適切なありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体媒体、分散助剤、又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤、又は乳化剤、保存剤等。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤、及び組成物を調製するための技法は、当技術分野で知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年を参照；この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。従来の賦形剤の使用は、任意の従来の賦形剤が、任意の望ましくない生物学的効果をもたらすこと、又はそうでなければ医薬組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様式で相互作用すること等により、物質又はその誘導体と適合しない可能性がある場合を除いて、本開示の範囲内で企図されていてもよい。

【0086】

幾つかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、又は対象体に投与される。本開示の目的では、語句「活性成分」は、一般的に、本明細書に記載のように送達されるＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを指す。

【0087】

本明細書で提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒト投与に好適な医薬組成物に関するが、当業者であれば、そのような組成物は、一般的に、任意の他の動物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることを理解するだろう。組成物を種々の動物への投与に好適なものするために、ヒト投与に好適な医薬組成物を改変することは、十分に理解されており、通常技術の獣医学薬理学者であれば、必要に応じて単なる通常の実験作業を行って、そのような改変を設計及び／又は実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象体としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ヒト及び／若しくは他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／又はラット等の商業関連哺乳動物を含む哺乳動物；並びに／又は家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／若しくはシチメンチョウ等の商業関連鳥類を含む鳥類。

【0088】

本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で知られているか又は下記で開発された任意の方法により調製することができる。一般的に、そのような調製方法は、活性成分を、賦形剤及び／又は１つ若しくは複数の他の副成分と結合させ、その後必要に応じて及び／又は望ましい場合、製品を、分割、成形、及び／又は包装して、所望の単一用量単位及び／又は複数用量単位にするステップを含む。

【0089】

本発明による医薬組成物は、単一単位用量として及び／又は複数の単一単位用量として、調製、包装、及び／又はバルクで販売されてもよい。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む、個別の量の医薬組成物である。活性成分の量は、一般的に、対象体に投与されることになる活性成分の用量、及び／又は例えばそのような用量の２分の１又は３分の１等の、そのような用量の便利な画分と等しい。

【0090】

本発明による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／又は任意の追加成分の相対量は、治療される対象体の種類、大きさ、及び／又は状態に応じて、更に組成物が投与されることになる径路に応じて様々であろう。例としては、組成物は、０．１％～１００％の、例えば、５～５０％の、１～３０％の、５～８０％の、少なくとも８０％（重量／重量）の活性成分を含んでいてもよい。

【0091】

幾つかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つのｓａＲＮＡを含んでいてもよい。非限定的な例として、製剤は、異なる配列を有する１、２、３、４、又は５つのｓａＲＮＡを含んでいてもよい。１つの実施形態では、製剤は、異なる配列を有する少なくとも３つｓａＲＮＡを含む。１つの実施形態では、製剤は、異なる配列を有する少なくとも５つｓａＲＮＡを含む。

【0092】

本発明のｓａＲＮＡは、以下のための１つ又は複数の賦形剤を使用して製剤化することができる：（１）安定性を増加させる；（２）細胞トランスフェクションを増加させる；（３）持続放出又は遅延放出を可能にする（例えば、ｓａＲＮＡのデポー製剤からの）；（４）生体内分布を変化させる（例えば、特定の組織又は細胞タイプにｓａＲＮＡを標的化する）；（５）コードタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を増加させる；及び／又は（６）コードタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイルを変化させる。ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体媒体、分散助剤、又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤、又は乳化剤、保存剤等の従来の賦形剤に加えて、本発明の賦形剤としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる：リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア－シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ｓａＲＮＡでトランスフェクションされた細胞（例えば、対象体に移植するための）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、及びそれらの組み合わせ。したがって、本発明の製剤は、各々が、ｓａＲＮＡの安定性及び／又はｓａＲＮＡによる細胞トランスフェクションを共に増加させる量の１つ又は複数の賦形剤を含むことができる。更に、本発明のｓａＲＮＡは、自己組織化核酸ナノ粒子を使用して製剤化してもよい。本発明のｓａＲＮＡを有する製剤に使用することができる、核酸用の薬学的に許容される担体、賦形剤、及び送達剤は、２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号に開示されている。この文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0093】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、長さが２１個ヌクレオチドであり、各々がアニーリングして、活性成分としての二本鎖Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを形成する２つの一本鎖ＲＮＡを含む。組成物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５ｍＭ ＥＤＴＡで構成される塩緩衝液を更に含む。

【0094】

別の実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、デンドリマーを用いて送達されてもよい。デンドリマーは、高度に分岐した巨大分子である。好ましい実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、標的化ｉｎ ｖｉｖｏ送達用の構造的に可撓性のポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーと複合体化される。複合体は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーと呼ぶ。デンドリマーは、高度な分子均一性、狭い分子量分布、特定のサイズ及び形状特徴、並びに高度に官能化された末端表面を有する。製造プロセスは、中心イニシエータコアから開始される一連の反復ステップである。その後の成長ステップは各々、より大きな分子直径及び分子量、並びにその前の生成よりも反応性の表面部位を有するポリマーの新たな生成である。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、それらの表面に一級アミン基及び更に構造の内部に三級アミン基を担持する効率的なヌクレオチド送達系である。一級アミン基は、ヌクレオチド結合に寄与し、それらの細胞取り込みを促進し、内部の三級アミノ基は、エンドソームでプロトンスポンジとしての役割を果たし、細胞質への核酸の放出を増強する。これらデンドリマーは、それらが担持するｓａＲＮＡをリボヌクレアーゼ分解から保護し、効率的な遺伝子標的化のために、長期間にわたってエンドサイトーシスにより相当量のｓａＲＮＡ放出を達成する。これらナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ効力は、以前に評価されており、生体内分布研究によると、デンドリマーは、末梢血単核細胞に優先的に蓄積し、識別できる毒性を示さずに残存することが示されている（Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒ．２０１１年、１９巻、２２２８～２２３８頁を参照、この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）コア、ジアミノブタン（ＤＡＢ）コア、シスタミンコア、ジアミノヘキサン（ＨＥＸ）コア、ジアモノドデカン（diamonododecane）（ＤＯＤＥ）コア、又はエチレンジアミン（ＥＤＡ）コアを含んでいてもよい。好ましくは、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、ＴＥＡコア又はＤＡＢコアを含む。

【0095】

リピドイド
リピドイドの合成は、広く一般に記載されており、これら化合物を含有する製剤は、特に、オリゴヌクレオチド又は核酸の送達に適切である（Ｍａｈｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０１０年 ２１巻：１４４８～１４５４頁；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０年 ２６７巻：９～２１頁；Ａｋｉｎｃら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８年 ２６巻：５６１～５６９頁；Ｌｏｖｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国、 ２０１０年 １０７巻：１８６４～１８６９頁；Ｓｉｅｇｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国、 ２０１１年 １０８巻：１２９９６～３００１頁を参照。これらの文献は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0096】

これらリピドイドは、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子をげっ歯動物及び非ヒト霊長類に効果的に送達するために使用されているが（Ａｋｉｎｃら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８年 ２６巻：５６１～５６９頁；Ｆｒａｎｋ－Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国、 ２００８年 １０５巻：１１９１５～１１９２０頁；Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９年 １７巻：８７２～８７９頁；Ｌｏｖｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国、 ２０１０年 １０７巻：１８６４～１８６９頁；Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１年 ２９巻：１００５～１０１０頁を参照。これらの文献は全て、それらの全体が本明細書に組込まれる）、本開示は、ｓａＲＮＡの送達におけるそれらの製剤化及び使用を記載するものである。これらリピドイドを含む複合体、ミセル、リポソーム、又は粒子を調製することができ、したがって、局所的な及び／又は全身性の投与経路によりリピドイド製剤を注射して、ｓａＲＮＡの効果的な送達をもたらすことができる。ｓａＲＮＡのリピドイド複合体は、これらに限定されないが、静脈内径路、筋肉内径路、又は皮下径路を含む種々の手段により投与することができる。

【0097】

核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達は、これらに限定されないが、製剤組成物、粒子ペグ化の性質、負荷量の度合い、オリゴヌクレオチド対脂質の比率、及びこれに限定されないが、粒径を含む生物物理学的パラメータを含む、多くのパラメータにより影響を受ける（Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９年 １７巻：８７２～８７９頁。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長をわずかに変化させると、ｉｎ ｖｉｖｏ効力が著しく影響を受ける場合がある。これらに限定されないが、ペンタ［３－（１－ラウリルアミノプロピオニル）］－トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ－５ＬＡＰ；別名 ９８Ｎ１２－５、Ｍｕｒｕｇａｉａｈら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０１巻：６１頁（２０１０年）を参照。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｃ１２－２００（誘導体及び変異体を含む）、及びＭＤ１を含む、様々なリピドイドを有する製剤のｉｎ ｖｉｖｏ活性を試験することができる。

【0098】

本明細書で「９８Ｎ１２－５」と呼ばれているリピドイドは、Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９年 １７巻：８７２～８７９頁に開示されており、この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。（図２を参照）
本明細書では「Ｃ１２－２００」と呼ばれているリピドイドは、Ｌｏｖｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国、 ２０１０年 １０７巻：１８６４～１８６９頁（図２を参照）並びにＬｉｕ及びＨｕａｎｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０年 ６６９～６７０頁（図２を参照）に開示されており、これらの文献の内容は両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。リピドイド製剤は、ｓａＲＮＡに加えて、３又は４つ以上のいずれかの成分を含む粒子を含むことができる。一例として、９８Ｎ１２－５を含むが、それに限定されない、あるリピドイドを有する製剤は、４２％リピドイド、４８％コレステロール、及び１０％ＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有していてもよい。別の例として、Ｃ１２－２００を含むが、これに限定されない、あるリピドイドを有する製剤は、５０％リピドイド、１０％ジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％コレステロール、及び１．５％ＰＥＧ－ＤＭＧを含有していてもよい。

【0099】

１つの実施形態では、全身性静脈内投与用の、リピドイドと共に製剤化したｓａＲＮＡは、肝臓を標的とすることができる。例えば、ｓａＲＮＡを使用し、４２％ ９８Ｎ１２－５、４８％コレステロール、及び１０％ＰＥＧ－脂質の脂質モル組成を含み、総脂質対ｓａＲＮＡの最終重量比が、約７．５対１であり、ＰＥＧ脂質のアルキル鎖長がＣ１４であり、平均粒径がおよそ５０～６０ｎｍである、最終的な最適化された静脈用製剤は、９０％を超える肝臓への製剤分布をもたらすことができる（Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９年 １７巻：８７２～８７９頁を参照。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の例では、Ｃ１２－２００（米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号明細書及び国際公開第２０１０１２９７０９号を参照。これらの文献の各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）リピドイドを使用する静脈用製剤は、５０／１０／３８．５／１．５のモル比のＣ１２－２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧを有し、総脂質対核酸の重量比が７対１であり、平均粒径が８０ｎｍであってもよく、ｓａＲＮＡを効率的に送達することができる（Ｌｏｖｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国、 ２０１０年 １０７巻：１８６４～１８６９頁を参照。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、ＭＤ１リピドイド含有製剤を使用して、ｓａＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで効果的に肝細胞に送達することができる。筋肉内又は皮下径路用の最適化リピドイド製剤の特徴は様々であり、標的細胞タイプ、及び製剤が細胞外マトリックスから血流へと拡散する能力に著しく依存する場合がある。効果的な肝細胞送達には、内皮開口部の大きさを考慮すると１５０ｎｍ未満の粒径が望ましいが（Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ．２００９年 １７巻：８７２～８７９頁を参照。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、内皮細胞、骨髄系細胞、及び筋細胞を含むが、それらに限定されない他の細胞タイプに製剤を送達するためのリピドイド製剤化ｓａＲＮＡの使用は、同様のサイズ制限を受けない場合がある。ｓｉＲＮＡを骨髄系細胞及び内皮等の他の非肝細胞にｉｎ ｖｉｖｏ送達するためのリピドイド製剤の使用は、報告されている（Ａｋｉｎｃら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８年 ２６巻：５６１～５６９頁；Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１年 ２９巻：１００５～１０１０頁；Ｃｈｏら、Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２００９年 １９巻：３１１２～３１１８頁；８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｕｄａｈ Ｆｏｌｋｍａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州 ２０１０年１０月８～９日を参照。これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。単球等の骨髄系細胞への効果的な送達には、リピドイド製剤は、同様の成分モル比を有していてもよい。様々な比率のリピドイド、並びにジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含むが、それらに限定されない他の成分を使用して、肝細胞、骨髄系細胞、筋細胞等を含むが、それらに限定されない様々な細胞タイプに送達するためにｓａＲＮＡ製剤を最適化することができる。例えば、成分モル比は、これらに限定されないが、５０％Ｃ１２－２００、１０％ジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％コレステロール、及び１．５％ＰＥＧ－ＤＭＧを含んでいてもよい（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１１年 ２９巻：１００５～１０１０頁を参照。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。皮下送達又は筋肉内送達のいずれかにより核酸を細胞（これらに限定されないが、脂肪細胞及び筋細胞を含む）に局所送達するためのリピドイド製剤の使用は、全身性送達に望ましい製剤成分の全てを必要とするとは限らない場合があり、したがって、リピドイド及びｓａＲＮＡのみを含んでいてもよい。

【0100】

リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
本発明のｓａＲＮＡは、１つ又は複数のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。１つの実施形態では、ｓａＲＮＡの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二分子膜で構成されていてもよく、栄養分及び医薬製剤を投与するための送達媒体として使用することができる人工的に調製された小胞である。リポソームは、これらに限定されないが、直径が数百ナノメートルであってもよく、狭い水性区画により離間されている一連の同心状二分子膜を含んでいてもよい多重膜小胞（ＭＬＶ）、直径が５０ｎｍ未満であってもよい小型単一セル小胞（ＳＵＶ）、及び直径が５０～５００ｎｍであってもよい大型単層膜小胞（ＬＵＶ）等、様々サイズであり得る。リポソームの構成は、不健康な組織に対するリポソームの結合を向上するために、又はエンドサイトーシスを含むが、それに限定されない事象を活性化するために、これらに限定されないが、オプソニン又はリガンドを含んでいてもよい。リポソームは、医薬製剤の送達を向上させるために、高ｐＨ又は低ｐＨを含有していてもよい。

【0101】

リポソームの形成は、これらに限定されないが、封入された医薬製剤、並びにリポソーム成分、脂質小胞が分散されている媒体の性質、封入された物質の有効濃度及びその毒性の可能性、小胞の適用及び／又は送達中に伴う任意の追加プロセス、最適化サイズ、目的応用のための小胞の多分散性及び保管寿命、並びに安全で効率的なリポソーム製品の大規模生産のバッチ間再現性及び可能性等の、物理化学的特徴に依存する場合がある。

【0102】

１つの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物としては、限定ではないが、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製（ボセル、ワシントン州）のＤｉＬａ２リポソーム、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ＭＣ３（米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号明細書；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びこれらに限定されないが、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製（Ｈｏｒｓｈａｍ、ペンシルベニア州）のＤＯＸＩＬ（登録商標）等の低分子薬を送達することができるリポソームで形成されたもの等のリポソームが挙げられる。

【0103】

１つの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物としては、限定ではないが、以前に記載されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが記載及び示されている安定化プラスミド－脂質粒子（ＳＰＬＰ）又は安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成で形成されたもの等のリポソームが挙げられる（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９年 ６巻：２７１～２８１頁；Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９年 ６巻：１４３８～１４４７頁；Ｊｅｆｆｓら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００５年 ２２巻：３６２～３７２頁；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年 ２巻：１００２～１００７；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ．２００６年 ４４１巻：１１１～１１４頁；Ｈｅｙｅｓら、Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ．２００５年 １０７巻：２７６～２８７頁；Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０年 ２８巻：１７２～１７６頁；Ｊｕｄｇｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９年 １１９巻：６６１～６７３頁；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８年 １９巻：１２５～１３２頁を参照。これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｗｈｅｅｌｅｒらによる初期製造方法は、界面活性剤透析法であり、その後Ｊｅｆｆｓらにより改良された。これは、自発性小胞形成方法と呼ばれている。リポソーム製剤は、ｓａＲＮＡに加えて３～４つの脂質成分で構成されていてもよい。一例として、リポソームは、これらに限定されないが、Ｊｅｆｆｓらにより記載されているように、５５％コレステロール、２０％ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１０％ＰＥＧ－Ｓ－ＤＳＧ、及び１５％１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有することができる。別の例では、あるリポソーム製剤は、これらに限定されないが、Ｈｅｙｅｓらにより記載されているように、４８％コレステロール、２０％ＤＳＰＣ、２％ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、及び３０％陽イオン性脂質を含有していてもよく、上記陽イオン性脂質は、１，２－ジステアルロキシ（distearloxy）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、又は１，２－ジリノレニルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であってもよい。別の例では、核酸－脂質粒子は、Ｍａｃｌａｃｈｌａｎらの国際公開第２００９１２７０６０号に記載のように、約５０ｍｏｌ％から約８５ｍｏｌ％までの在粒子総脂質を含む陽イオン性脂質；約１３ｍｏｌ％から約４９．５ｍｏｌ％までの在粒子総脂質を含む非陽イオン性脂質；及び約０．５ｍｏｌ％から約２ｍｏｌ％までの在粒子総脂質を含む、粒子の凝集を阻害する複合脂質を含んでいてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。別の例では、核酸－脂質粒子は、Ｍａｃｌａｃｈｌａｎらの米国特許出願第２００６００８９１０号明細書に開示されている任意の核酸－脂質粒子であってもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、核酸－脂質粒子は、式Ｉの陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、及び粒子の凝集を阻害する複合脂質を含んでいてもよい。

【0104】

１つの実施形態では、ｓａＲＮＡは、官能化された脂質二分子膜間が架橋されていてもよい脂質小胞で製剤化してもよい。
１つの実施形態では、リポソームは、Ｂａｌｌｙらの米国特許第５５９５７５６号明細書に開示されている糖修飾脂質を含有していてもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。脂質は、約１０ｍｏｌパーセントの量のガングリオシド及びセレブロシドであってもよい。

【0105】

１つの実施形態では、ｓａＲＮＡは、陽イオン性脂質を含むリポソームで製剤化されていてもよい。リポソームは、国際公開第２０１３００６８２５号に記載のように、陽イオン性脂質中のチッ素原子対ｓａＲＮＡ中のホスファートのモル比（Ｎ：Ｐ比）が、１：１～２０：１であってもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、リポソームは、Ｎ：Ｐ比が、２０：１超又は１：１未満である。

【0106】

１つの実施形態では、ｓａＲＮＡは、脂質－ポリカチオン複合体で製剤化されていてもよい。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で知られている方法及び／又は米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号明細書に記載の方法により達成することができる。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、ポリカチオンとしては、これらに限定されないが、ポリリシン、ポリオルニチン、及び／又はポリアルギニン、及び国際公開第２０１２０１３３２６号明細書に記載の陽イオン性ペプチド等の、陽イオン性ペプチド又はポリペプチドが挙げられる場合がある。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、ｓａＲＮＡは、これらに限定されないが、コレステロール又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等の中性脂質を更に含んでいてもよい脂質－ポリカチオン複合体で製剤化してもよい。

【0107】

リポソーム製剤は、これらに限定されないが、陽イオン性脂質成分の選択、陽イオン性脂質の飽和度、ペグ化の性質、全成分の比率、及びサイズ等の生物物理学的パラメータにより影響を受ける場合がある。Ｓｅｍｐｌｅら（Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０年 ２８巻：１７２～１７６頁；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）による１つの例では、リポソーム製剤は、５７．１％陽イオン性脂質、７．１％ジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％コレステロール、及び１．４％ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡで構成されていた。

【0108】

幾つかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤中のＰＥＧ比率を、増加又は減少させてもよく、及び／又はＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に改変して、ＬＮＰ製剤の薬物動態及び／又は生体内分布を変更してもよい。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、及びコレステロールと比較して、１～５％の脂質モル比のＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧを含有していてもよい。別の実施形態では、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧは、これらに限定されないが、ＰＥＧ－ＤＳＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、又はＰＥＧ－ＤＰＧ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）等のＰＥＧ脂質と置換されていてもよい。陽イオン性脂質は、これらに限定されないが、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、Ｃ１２－２００、及びＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ等の、当技術分野で知られている任意の脂質から選択することができる。

【0109】

１つの実施形態では、ｓａＲＮＡは、国際公開第２０１２１７０９３０号に記載の脂質ナノ粒子等の脂質ナノ粒子で製剤されていてもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0110】

１つの実施形態では、本発明の製剤に使用することができる陽イオン性脂質は、これらに限定されないが、以下の文献に記載されている陽イオン性脂質から選択してもよい：国際公開第２０１２０４０１８４号、国際公開第２０１１１５３１２０号、国際公開第２０１１１４９７３３号、国際公開第２０１１０９０９６５号、国際公開第２０１１０４３９１３号、国際公開第２０１１０２２４６０号、国際公開第２０１２０６１２５９号、国際公開第２０１２０５４３６５号、国際公開第２０１２０４４６３８号、国際公開第２０１００８０７２４号、国際公開第２０１０２１８６５号、及び国際公開第２００８１０３２７６号、米国特許第７，８９３，３０２号明細書、第７，４０４，９６９号明細書、及び第８，２８３，３３３号明細書、米国特許出願公開第２０１０００３６１１５号明細書、及び第２０１２０２０２８７１号明細書。これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、陽イオン性脂質は、これらに限定されないが、以下の文献に記載の式Ａから選択してもよい：国際公開第２０１２０４０１８４号、国際公開第２０１１１５３１２０号、国際公開第２０１１１４９７３３号、国際公開第２０１１０９０９６５号、国際公開第２０１１０４３９１３号、国際公開第２０１１０２２４６０号、国際公開第２０１２０６１２５９号、国際公開第２０１２０５４３６５号、及び国際公開第２０１２０４４６３８号。これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。更に別の実施形態では、陽イオン性脂質は、これらに限定されないが、国際公開第２００８１０３２７６号の式ＣＬＩ～ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号明細書の式ＣＬＩ～ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号明細書の式ＣＬＩ～ＣＬＸＸＸＸＩＩ、及び米国特許出願公開第２０１０００３６１１５号明細書の式Ｉ～ＶＩから選択してもよい。これらの文献の各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。更に別の実施形態では、陽イオン性脂質は、Ｇａｕｃｈｅｒｏｎらの米国特許第７２２３８８７号明細書に開示されている陽イオン性脂質等の多価陽イオン性脂質であってもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。陽イオン性脂質は、Ｇａｕｃｈｅｒｏｎらの米国特許第７２２３８８７号明細書に記載されているように、２つの四級アミン基を含む正荷電頭部基及び４つの炭化水素鎖を含む疎水性部分を有していてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。更に別の実施形態では、陽イオン性脂質は、Ｍａｉｅｒらの米国特許出願公開第２０１３０１９５９２０号明細書に開示されている生分解性脂質のように生分解性であってもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。陽イオン性脂質は、Ｍａｉｅｒらの米国特許出願第２０１３０１９５９２０号明細書の式Ｉ～ＩＶに記載されているように、陽イオン性脂質の脂質部分に位置する１つ又は複数の生分解性基を有していてもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、陽イオン性脂質は、以下のものから選択してもよい：（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ５Ｎ－ジメチルペンタコサ－ｌ６，１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘンイコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ζ、１８Ζ）－Ν、Ν－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ、２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－ｌ０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－ｌ－ノニルイコサ（nonylicosa）－１１，１４－ジエン－ｌ－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－２０－エン－ｌ０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエプタコサ－１５－エン－ｌ０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１４－エン－ｌ０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１７－エン－ｌ０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコンタ－２４－エン－ｌ０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０－エン－ｌ０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２－エン－ｌ０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘンイコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－ｌ３，１６－ジエン－ｌ－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］エプタデカン－８－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘンイコサン－ｌ０－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（ｌＲ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ν、Ν－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ν，Ν－ジメチル－［（ｌＲ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ、２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ν、Ν－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクタ－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチロキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν、Ν－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν、Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ν，Ν－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－ｌ３，１６－ジエン－ｌ－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルオクチル（metoyloctyl））オキシ］－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ、２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－｛［８－（２－オクリルシクロプロピル（oclylcyclopropyl））オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、及び（１ｌＥ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－ｌ１，２０，２－トリエン－１０－アミン、又はそれらの薬学的に許容される塩若しくは立体異性体。

【0111】

１つの実施形態では、脂質は、国際公開第２０１２１７０８８９号記載されているもの等の切断可能な脂質であってもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0112】

１つの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、本明細書に記載されている及び／又は当技術分野で知られている少なくとも１つの陽イオン性ポリマーを含んでいてもよい。

【0113】

１つの実施形態では、陽イオン性脂質は、当技術分野で知られている方法により、及び／又は以下の文献に記載されている方法により合成してもよい：国際公開第２０１２０４０１８４号、国際公開第２０１１１５３１２０号、国際公開第２０１１１４９７３３号、国際公開第２０１１０９０９６５号、国際公開第２０１１０４３９１３号、国際公開第２０１１０２２４６０号、国際公開第２０１２０６１２５９号、国際公開第２０１２０５４３６５号、国際公開第２０１２０４４６３８号、国際公開第２０１００８０７２４号、及び国際公開第２０１０２１８６５号。これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0114】

１つの実施形態では、ｓａＲＮＡのＬＮＰ製剤は、３％の脂質モル比のＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧを含有していてもよい。別の実施形態では、ｓａＲＮＡのＬＮＰ製剤は、１．５％の脂質モル比のＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧを含有していてもよい。

【0115】

１つの実施形態では、ｓａＲＮＡの医薬組成物は、国際公開第２０１２０９９７５５号に記載されているペグ化脂質の少なくとも１つを含んでいてもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0116】

１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホホエタノールアミン（phophoethanolamine）－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）を含有していてもよい。１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、当技術分野で知られている陽イオン性脂質であるＰＥＧ－ＤＭＧ２０００及び少なくとも１つの他の成分を含有していてもよい。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、当技術分野で知られている陽イオン性脂質であるＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含有していてもよい。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含有していてもよい。別の非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを、２：４０：１０：４８のモル比で含んでいてもよい（例えば、Ｇｅａｌｌら、Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ、ＰＮＡＳ ２０１２年；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４を参照。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の非限定的な例として、本明細書に記載のｓａＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１２０２０７８４５号明細書に記載のような、非経口径路により送達されるナノ粒子で製剤化されていてもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、陽イオン性脂質は、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの米国特許出願公開第２０１３０１５６８４５号明細書及びＭａｎｏｈａｒａｎらの米国特許出願公開第２０１３０１２９７８５号明細書、Ｗａｓａｎらの国際公開第２０１２０４７６５６号、Ｃｈｅｎらの国際公開第２０１０１４４７４０号、Ａｎｓｅｌｌらの国際公開第２０１３０８６３２２号、又はＭａｎｏｈａｒａｎらの国際公開第２０１２０１６１８４号に開示されている陽イオン性脂質であってもよい。,これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0117】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｈｏｐｅらの米国特許出願公開第２０１３００１７２２３号明細書に記載のような第１及び第２の陽イオン性脂質等の、複数の陽イオン性脂質で製剤化されていてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。第１の陽イオン性脂質は、第１の特性に基づいて選択することができ、第２の陽イオン性脂質は、第２の特性に基づいて選択することができ、上記特性は、米国特許出願公開第２０１３００１７２２３号明細書で概説されているように決定することができる。この文献内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。１つの実施形態では、第１及び第２の特性は、補完的である。

【0118】

別の実施形態では、ｓａＲＮＡは、１つ又は複数の陽イオン性脂質、及び１つ又は複数の第２の脂質、及び１つ又は複数の核酸を含む脂質粒子で製剤化されてもよく、上記脂質粒子は、Ｃｕｌｌｉｓらの米国特許出願公開第２０１２０２７６２０９号明細書に記載されているような中実コアを含む。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0119】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎらの欧州特許第２２９８３５８号明細書に記載のもの等の、水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョン中で陽イオン性両親媒性物質と複合体化されていてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。陽イオン性両親媒性物質は、陽イオン性脂質、修飾又は未修飾スペルミン、ブピバカイン、又は塩化ベンザルコニウムであってもよく、油は、植物油であってもよく、又は動物油であってもよい。非限定的な例として、少なくとも１０％の核酸－陽イオン性両親媒性物質複合体は、水中油型エマルジョンの油相にあってもよい（例えば、Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎらの欧州特許公開第２２９８３５８号明細書に記載の複合体を参照。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0120】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、陽イオン性化合物及び中性脂質の混合物を含む組成物で製剤化されてもよい。非限定的な例として、陽イオン性化合物は、Ａｎｓｅｌｌらの国際公開第１９９９０１０３９０号に開示されている式（Ｉ）であってもよく、この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれており、中性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、及びスフィンゴミエリンからなる群から選択されてもよい。

【0121】

１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１１１２７２５５号又は国際公開第２００８１０３２７６号に記載の方法により製剤化されてもよい。これら文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、本発明のｓａＲＮＡは、国際公開第２０１１１２７２５５号及び／又は国際公開第２００８１０３２７６号に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のいずれかに封入されていてもよい。これら文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0122】

１つの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含んでいてもよい。非限定的な例として、ポリカチオン組成物は、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書の式１～６０から選択されてもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、ポリカチオン組成物を含むＬＮＰ製剤を、本明細書に記載のｓａＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ送達に使用してもよい。

【0123】

１つの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、透過性エンハンサー分子を更に含んでいてもよい。非限定的な透過性エンハンサー分子は、米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書に記載されている。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0124】

１つの実施形態では、医薬組成物は、これらに限定されないが、以下のもの等のリポソームで製剤化されてもよい；ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ボセル、ワシントン州）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）／ＮＯＶ３４０（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ボセル、ワシントン州）、中性ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）に基づくリポソーム（例えば、卵巣癌へのｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６年 ５巻（１２号）１７０８～１７１３頁）；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びヒアルロナン被覆リポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、Ｉｓｒａｅｌ）。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、Ｐａｎｚｎｅｒの国際公開第２００８／０４３５７５号及びＥｓｓｌｅｒらの米国特許第８５８０２９７号明細書に開示されている任意の両性リポソームで製剤化されてもよい。これらの文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。両性リポソームは、陽イオン性両親媒性物質、陰イオン性両親媒性物質、及び任意選択の１つ又は複数の中性両親媒性物質を含む脂質の混合物を含んでいてもよい。両性リポソームは、その頭部が１つ又は複数の両性基で置換されている、両親媒性分子に基づく両性化合物を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、Ｅｓｓｌｅｒらの米国特許出願公開第２０１４０２２７３４５号明細書に開示されているような、４～９の等電点を有する１つ又は複数の両性基を含む両性脂質で製剤化されてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0125】

ナノ粒子製剤は、炭水化物担体及び核酸分子（例えば、ｓａＲＮＡ）を含む炭水化物ナノ粒子であってもよい。非限定的な例として、炭水化物担体としては、これらに限定されないが、無水物修飾フィトグリコーゲン又はグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルスクシナート、フィトグリコーゲンベータデキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータデキストリンを挙げることができる。（例えば、国際公開第２０１２１０９１２１号を参照；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0126】

脂質ナノ粒子製剤は、陽イオン性脂質を、迅速除去脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ、ｒａｐｉｄｌｙ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）として知られている生分解性陽イオン性脂質に置換することにより改良されてもよい。これらに限定されないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ等のイオン性陽イオン性脂質は、時間と共に血漿及び組織に蓄積することが示されており、毒性源となる可能性があり得る。迅速除去脂質の迅速な代謝は、ラットでは１ｍｇ／ｋｇ用量から１０ｍｇ／ｋｇ用量までも、脂質ナノ粒子の耐容性及び治療指数を向上させることができる。酵素分解性エステル結合を組み込むことにより、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持させつつ、陽イオン性成分の分解及び代謝プロファイルを向上させることができる。エステル結合は、脂質鎖内に内部的位置していてもよく、又は脂質鎖の末端に末端的に位置していてもよい。内部エステル結合は、脂質鎖の任意の炭素を置換してもよい。

【0127】

１つの実施形態では、ｓａＲＮＡは、限定ではないが、以下のもの等のリポプレックスとして製剤化されてもよい：Ｓｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（ロンドン、英国）のＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系、及び他のｓｉＲＮＡ－リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）社製（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、及び核酸のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はプロタミンに基づく標的送達及び非標的送達（Ａｌｅｋｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８年 ６８巻：９７８８～９７９８頁；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２年 ５０巻：７６～７８頁；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６年 １３巻：１２２２～１２３４頁；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６年 １３巻：１３６０～１３７０頁；Ｇｕｔｂｉｅｒら、Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０年 ２３巻：３３４～３４４頁；Ｋａｕｆｍａｎｎら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０年 ８０巻：２８６～２９３頁 Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９年 ３２巻：４９８～５０７頁；Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８年 ３１巻：１８０～１８８頁；Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４巻：１２８５～１２９４頁；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋら、２０１１年 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４巻：１～１５頁；Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年、２３巻：７０９～７１７頁；Ｐｅｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国、 ２００７年 ６；１０４：４０９５～４１００頁；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８年 １９巻：１２５～１３２頁；これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0128】

また、１つの実施形態では、そのような製剤は、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、及び白血球を含むが、それらに限定されない様々な細胞タイプに対して、ｉｎ ｖｉｖｏで受動的に又は能動的に指向するように構築されていてもよく、そのように組成が変更されていてもよい（Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０年 １８巻：１３５７～１３６４頁；Ｓｏｎｇら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年 ２３巻：７０９～７１７頁；Ｊｕｄｇｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９年 １１９巻：６６１～６７３頁；Ｋａｕｆｍａｎｎら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０年 ８０巻：２８６～２９３頁；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６年 １３巻：１２２２～１２３４頁；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６年 １３巻：１３６０～１３７０頁；Ｇｕｔｂｉｅｒら、Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０年 ２３巻：３３４～３４４頁；Ｂａｓｈａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１年 １９巻：２１８６～２２００頁；Ｆｅｎｓｋｅ及びＣｕｌｌｉｓ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８年 ５巻：２５～４４頁；Ｐｅｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８年 ３１９巻：６２７～６３０頁；Ｐｅｅｒ及びＬｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１年 １８巻：１１２７～１１３３頁；これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。肝細胞に対して製剤を受動標的化する１つの例としては、アポリポタンパク質Ｅに結合し、これらの製剤の肝細胞との結合及び肝細胞による取り込みをｉｎ ｖｉｖｏで促進することが示されている、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡに基づく脂質ナノ粒子製剤が挙げられる（Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０年 １８巻：１３５７～１３６４頁；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。また、製剤は、限定ではないが、葉酸、トランスフェリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に代表されるような様々なリガンドをそれらの表面に発現させることにより、及び抗体標的化手法により選択的に標的化することができる（Ｋｏｌｈａｔｋａｒら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１年 ８巻：１９７～２０６頁；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ及びＴｏｒｃｈｉｌｉｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１年 １６巻：１３８８～１４１２頁；Ｙｕら、Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ
Ｂｉｏｌ．２０１０年 ２７巻：２８６～２９８頁；Ｐａｔｉｌら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２００８年 ２５巻：１～６１頁；Ｂｅｎｏｉｔら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１年 １２巻：２７０８～２７１４頁；Ｚｈａｏら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８年 ５巻：３０９～３１９頁；Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０年 １８巻：１３５７～１３６４頁；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２年 ８２０巻：１０５～１１６頁；Ｂｅｎ－Ａｒｉｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２年 ７５７巻：４９７～５０７頁；Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０巻：６３～６８頁；Ｐｅｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国、 ２００７年 １０４巻：４０９５～４１００頁；Ｋｉｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１年 ７２１巻：３３９～３５３頁；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０年 １８巻：２０２８～２０３７頁；Ｓｏｎｇら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年 ２３巻：７０９～７１７頁；Ｐｅｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８年 ３１９巻：６２７～６３０頁；Ｐｅｅｒ及びＬｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１年 １８巻：１１２７～１１３３頁；これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0129】

１つの実施形態では、ｓａＲＮＡは、中実脂質ナノ粒子として製剤化される。中実脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、１０～１０００ｎｍの平均直径を有する球状であってもよい。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤及び／又は乳化剤で安定化させることができる中実脂質コアマトリクスを有する。更なる実施形態では、脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質－ポリマーナノ粒子であってもよい（Ｚｈａｎｇら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２００８年、２巻（８号）、１６９６～１７０２頁を参照；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0130】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、制御放出及び／又は標的送達用に製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「制御放出」は、治療結果を達成するための特定の放出パターンに従う医薬組成物又は化合物の放出プロファイルを指す。１つの実施形態では、ｓａＲＮＡは、本明細書に記載されているか及び／又は当技術分野で知られている、制御放出及び／又は標的送達用の送達剤に封入されていてもよい。本明細書で使用される場合、用語「封入する」は、包囲する、取り囲む、又は包み込むことを意味する。本発明の化合物の製剤に関する場合、封入は、実質的でもよく、完全にでもよく、又は部分的にであってもよい。用語「実質的に封入される」は、本発明の医薬組成物又は化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９超、又は９９．９９９％超が、送達剤内に包囲され、取り囲まれ、又は包み込まれていてもよいことを意味する。用語「部分的に封入される」は、本発明の医薬組成物又は化合物の１０、１０、２０、３０、４０、又は５０未満が、送達剤内に包囲され、取り囲まれ、又は包み込まれていてもよいことを意味する。有利には、封入は、蛍光顕微鏡及び／又は電子顕微鏡を使用して、本発明の医薬組成物又は化合物の漏出又は活性を測定することにより決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物又は化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、又は９９．９９％超が送達剤に封入されている。

【0131】

別の実施形態では、ｓａＲＮＡを、脂質ナノ粒子又は迅速除去脂質ナノ粒子に封入してもよく、その後、脂質ナノ粒子又は迅速除去脂質ナノ粒子を、本明細書に記載されている及び／又は当技術分野で知られているポリマー、ヒドロゲル、及び／又は外科的封止材に封入してもよい。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲル、又は外科的封止材は、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．社、アラチュア、フロリダ州）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、フィブリノゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．社、コルネリア、ジョージア州）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ社、ディアフィールド、イリノイ州）、ＰＥＧ系封止材、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ社、ディアフィールド、イリノイ州）等の外科的封止材であってもよい。

【0132】

別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象体に注射されるとゲルを形成することができる、当技術分野で知られている任意のポリマーに封入されてもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であってもよいポリマーマトリックスに封入されてもよい。

【0133】

また、１つの実施形態では、制御放出及び／又は標的送達用のｓａＲＮＡ製剤は、少なくとも１つの制御放出コーティングを含んでいてもよい。制御放出コーティングとしては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／ビニルアセタートコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）、及びエチルセルロース水性分散剤（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）及びＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））等のセルロース誘導体。

【0134】

１つの実施形態では、制御放出及び／又は標的送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含んでいてもよい少なくとも１つ分解性ポリエステルを含んでいてもよい。分解性ポリエステルとしては、これらに限定されないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、分解性ポリエステルとしては、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧ結合体を挙げることができる。

【0135】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｍａｎｏｈａｒａｎら米国特許出願公開第２０１３０２０２６５２号明細書に開示されている標的部分等の標的化部分を有する標的化脂質で製剤化してもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの米国特許出願公開第２０１３０２０２６５２号明細書の式Ｉの標的化部分を、所望の器官、組織、細胞、細胞タイプ若しくはサブタイプ、又は細胞器官に脂質を局在化しやすくするために選択してもよい。本発明で企図される非限定的な標的化部分としては、トランスフェリン、アニスアミド、ＲＧＤペプチド、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、フコース、抗体、又はアプタマーが挙げられる。

【0136】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、治療用ナノ粒子に封入されもよい。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載の方法により、及びこれらに限定されないが、以下のもの等の、当技術分野で知られている方法により製剤化してもよい：国際公開第２０１０００５７４０号、国際公開第２０１００３０７６３号、国際公開第２０１０００５７２１号、国際公開第２０１０００５７２３号、国際公開第２０１２０５４９２３号、米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号明細書、米国特許出願公開第２０１００１０４６４５号明細書、米国特許出願公開第２０１０００８７３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１０００６８２８５号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２７４７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１０００６８２８６号明細書、及び米国特許出願公開第２０１２０２８８５４１号明細書、米国特許第８，２０６，７４７号明細書、第８，２９３，２７６号明細書、第８，３１８，２０８号明細書、及び第８，３１８，２１１号明細書；これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、治療用ポリマーナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２０１４０７９０号明細書に記載の方法により特定してもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0137】

１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、持続放出用に製剤化されてもよい。本明細書で使用される場合、「持続放出」は、特定の期間にわたってある放出速度に従う医薬組成物又は化合物を指す。期間としては、これらに限定されないが、数時間、数日間、数週間、数か月間、及び数年間を挙げることができる。非限定的な例として、持続放出性ナノ粒子は、ポリマー、及びこれらに限定されないが、本発明のｓａＲＮＡ等の治療剤を含んでいてもよい（国際公開第２０１００７５０７２号、並びに米国特許出願公開第２０１００２１６８０４号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２１７３７７号明細書、及び米国特許出願公開第２０１２０２０１８５９号明細書を参照。これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。

【0138】

１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、標的特異的であるように製剤化されてもよい。非限定的な例として、治療用ナノ粒子としては、コルチコステロイドを挙げることができる（国際公開第２０１１０８４５１８号を参照；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、癌特異的であるように製剤化されてもよい。非限定的な例として、治療のナノ粒子は、以下のものに記載のナノ粒子で製剤化されてもよい：国際公開第２００８１２１９４９号、国際公開第２０１０００５７２６号、国際公開第２０１０００５７２５号、国際公開第２０１１０８４５２１号、米国特許出願公開第２０１０００６９４２６号明細書、米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書、及び米国特許出願公開第２０１００１０４６５５号明細書；これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0139】

１つの実施形態では、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでいてもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、これらに限定されないが、以下のもの等の、２つ以上のポリマーを含んでいてもよい、ポリエチレン、ポリカルボナート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメラート（polypropylfumerate）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリシアノアクリラート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、又はそれらの組み合わせ。

【0140】

１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含む。１つの実施形態では、ジブロックコポリマーは、これらに限定されないが、以下のもの等のポリマーとの組み合わせたＰＥＧを含んでいてもよい：ポリエチレン、ポリカルボナート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメラート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリシアノアクリラート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、又はそれらの組み合わせ。

【0141】

非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマーを含む（米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書及び米国特許第８，２３６，３３０号明細書を参照；これらの文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。別の非限定的な例では、治療用ナノ粒子は、ＰＥＧ及びＰＬＡ、又はＰＥＧ及びＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（米国特許第８，２４６，９６８号明細書及び国際公開第２０１２１６６９２３号を参照；これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0142】

１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、これらに限定されないが、米国特許第８，２６３，６６５号明細書及び第８，２８７，９１０号明細書に記載のマルチブロックコポリマー等の、マルチブロックコポリマーを含んでいてもよい。これらの文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0143】

１つの実施形態では、本明細書に記載のブロックコポリマーは、非ポリマー性ミセル及びブロックコポリマーを含むポリイオン複合体に含まれていてもよい。（例えば、米国特許出願公開第２０１２００７６８３６号明細書を参照；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0144】

１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのアクリルポリマーを含んでいてもよい。アクリルポリマーとしては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸及びメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸メチルコポリマー、エトキシエチルメタクリラート、シアノエチルメタクリラート、アミノアルキルメタクリラートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリラート、及びそれらの組み合わせ。

【0145】

１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、これらに限定されないが、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（ベータ－アミノエステル）（例えば、米国特許第８，２８７，８４９号明細書を参照；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びそれらの組み合わせ等の、少なくとも１つのアミン含有ポリマーを含んでいてもよい。

【0146】

１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有してもよい少なくとも１つの分解性ポリエステルを含んでいてもよい。分解性ポリエステルとしては、これらに限定されないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、分解性ポリエステルとしては、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧ結合体を挙げることができる。

【0147】

別の実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つの標的化リガンドの結合を含んでいてもよい。標的化リガンドは、モノクローナル抗体を含むが、それに限定されない、当技術分野で知られている任意のリガンドであってもよい。（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６年 ６６巻：６７３２～６７４０頁；この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0148】

１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、癌を標的とするために使用することができる水溶液で製剤化されてもよい（国際公開第２０１１０８４５１３号及び米国特許出願公開第２０１１０２９４７１７号明細書を参照；これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。

【0149】

１つの実施形態では、ｓａＲＮＡは、合成ナノ担体に封入、連結、及び／又は結合されていてもよい。合成ナノ担体としては、これらに限定されないが、以下のものに記載されているものが挙げられる：国際公開第２０１０００５７４０号、国際公開第２０１００３０７６３号、国際公開第２０１２１３５０１号、国際公開第２０１２１４９２５２号、国際公開第２０１２１４９２５５号、国際公開第２０１２１４９２５９号、国際公開第２０１２１４９２６５号、国際公開第２０１２１４９２６８号、国際公開第２０１２１４９２８２号、国際公開第２０１２１４９３０１号、国際公開第２０１２１４９３９３号、国際公開第２０１２１４９４０５号、国際公開第２０１２１４９４１１号、国際公開第２０１２１４９４５４号、及び国際公開第２０１３０１９６６９号、及び米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号明細書、米国特許出願公開第２０１００１０４６４５号明細書、米国特許出願公開第２０１０００８７３３７号明細書、及び米国特許出願公開第２０１２０２４４２２２号明細書；これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。合成ナノ担体は、当技術分野で知られている方法より、及び／又は本明細書に記載されている方法により製剤化することができる。非限定的な例として、合成ナノ担体は、以下のものに記載されている方法により製剤化されてもよい：国際公開第２０１０００５７４０号、国際公開第２０１００３０７６３号、及び国際公開第２０１２１３５０１号、及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号明細書、米国特許出願公開第２０１００１０４６４５号明細書、米国特許出願公開第２０１０００８７３３７号明細書、及び米国特許出願公開第２０１２０２４４２２号明細書；これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、合成ナノ担体製剤は、国際公開第２０１１０７２２１８号及び米国特許第８，２１１，４７３号明細書に記載の方法により凍結乾燥されてもよい。これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0150】

１つの実施形態では、合成ナノ担体は、本明細書に記載のｓａＲＮＡを放出するための反応性基を含有してもよい（国際公開第２０１２０９５２５５２号及び米国特許出願公開第２０１２０１７１２２９号明細書を参照；これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。

【0151】

１つの実施形態では、合成ナノ担体は、標的放出用に製剤化されてもよい。１つの実施形態では、合成ナノ担体は、指定のｐＨで及び／又は所望の時間間隔後にｓａＲＮＡを放出するように製剤化されていてもよい。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、２４時間後に及び／又はｐＨ４．５でｓａＲＮＡを放出するように製剤化されてもよい（国際公開第２０１０１３８１９３号及び国際公開第２０１０１３８１９４、並びに米国特許出願公開第２０１１００２０３８８号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００２７２１７号明細書を参照；これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。

【0152】

１つの実施形態では、合成ナノ担体は、本明細書に記載のｓａＲＮＡの制御放出及び／又は持続放出用に製剤化されていてもよい。非限定的な例として、持続放出用の合成ナノ担体は、当技術分野で知られている方法により、本明細書に記載の方法により、及び／又は国際公開第２０１０１３８１９２号及び米国特許出願公開第２０１００３０３８５０号明細書に記載の方法により製剤化されていてもよい。これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0153】

１つの実施形態では、ナノ粒子は、経口投与用に最適化されていてもよい。ナノ粒子は、これらに限定されないが、キトサン又はその誘導体等の、少なくとも１つの陽イオン性生体高分子を含んでいてもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、米国特許出願公開２０１２０２８２３４３号明細書に記載の方法により製剤化されていてもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0154】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの米国特許第８５７５１２３号明細書に記載のもの等のモジュール式組成物で製剤化されてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、モジュール式組成物は、核酸、例えば本発明のｓａＲＮＡ、少なくとも１つのエンドソーム溶解性成分、及び少なくとも１つの標的化リガンドを含んでいてもよい。モジュール式組成物は、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの米国特許第８５７５１２３号明細書に記載の任意の処方等の処方を有していてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0155】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓらの米国特許第８５４６５５４号明細書に記載のもの等の、安定的核酸－脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を形成する脂質製剤で封入されていてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。脂質は、陽イオン性であってもよく、又は非陽イオン性であってもよい。１つの非限定的な例では、脂質対核酸比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｓａＲＮＡ比）は、約１：１から約５０：１まで、約１：１から約２５：１まで、約３：１から約１５：１まで、約４：１から約１０：１まで、約５：１から約９：１まで、又は約６：１から９：１までの範囲、又は５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、若しくは１１：１であろう。別の例では、ＳＮＡＬＰは、４０％ ２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（リピドＡ）、１０％ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、４０％コレステロール、１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－Ｃ－ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、粒径は６３．０±２０ｎｍであり、核酸／脂質比は０．０２７である。別の実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｌａｍらの米国特許第７１８９７０５号明細書に開示されているようなエンドソーム膜不安定化剤を含む核酸－脂質粒子で製剤化されてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、エンドソーム膜不安定化剤は、Ｃａ^２＋イオンであってもよい。

【0156】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ａｋｉｎｅらの米国特許第８１４８３４４号明細書に開示されている製剤化脂質粒子（ＦＬｉＰ）で製剤化されてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ａｋｉｎｅらには、ＦＬｉＰが、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含み、上記オリゴヌクレオチドは、脂肪親和性物、及びエマルジョン又はリポソームの少なくとも１つと結合されており、結合されたオリゴヌクレオチドが、それらと凝集、混合、会合することが教示されている。これら粒子は、驚くべきことに、Ａｋｉｎｅらの米国特許第８１４８３４４号明細書に開示されているように、オリゴヌクレオチドを心臓、肺、及び筋肉に効果的に送達することが示されている。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0157】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｔａｍらの米国特許第６０８６９１３号明細書に記載のように、脂質製剤中に発現ベクターを含む組成物を使用して、細胞に送達してもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｔａｍにより開示された組成物は、血清安定性であり、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）に由来する第１及び第２の逆方向反復配列、ＡＡＶに由来するｒｅｐ遺伝子、及び核酸断片を含む発現ベクターを含む。Ｔａｍの発現ベクターは、脂質と複合体化されている。

【0158】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓらの米国特許出願公開第２０１２０２７０９２１号明細書に開示されている脂質製剤で製剤化されてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。１つの非限定的な例では、脂質製剤は、米国特許出願公開第２０１２０２７０９２１号明細書に記載の式Ａを有する陽イオン性脂質を含んでいてもよい。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の非限定的な例では、米国特許出願公開第２０１２０２７０９２１号明細書の表Ａに開示されている例示的な核酸－脂質粒子の組成物を、本発明のｓａＲＮＡと共に使用することができる。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0159】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｍａｕｒｅｒらの米国特許出願公開第２０１２０２７６２０７号明細書に開示されている脂質粒子に完全に封入されてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。粒子は、事前形成脂質小胞、荷電治療剤、及び不安定化剤を含み、小胞を破壊せずに事前形成脂質小胞の膜を効果的に不安定化する不安定化溶媒中で事前形成小胞及び治療剤の混合物を形成する脂質組成物を含んでいてもよい。

【0160】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、複合脂質で製剤化されてもよい。非限定的な例では、複合脂質は、Ｌｉｎらの米国特許出願公開第２０１２０２６４８１０号明細書に記載のもの等の処方を有していてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。複合脂質は、陽イオン性脂質、中性脂質、及び凝集を低減可能な脂質を更に含む脂質粒子を形成することができる。

【0161】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄらの米国特許出願公開第２０１２０２４４２０７号明細書に開示されているもの等の中性リポソーム製剤で製剤化されてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。語句「中性リポソーム製剤」は、生理学的なｐＨで中性付近又は中性の表面電荷を有するリポソーム製剤を指す。生理学的なｐＨは、例えば、約７．０～約７．５、又は例えば約７．５、又は例えば７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、若しくは７．５、又は例えば７．３、又は例えば７．４であってもよい。中性リポソーム製剤の一例は、イオン性脂質ナノ粒子（ｉＬＮＰ）である。中性リポソーム製剤は、イオン性陽イオン性脂質、例えばＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを含んでいてもよい。

【0162】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、荷電脂質又はアミノ脂質で製剤化されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「荷電脂質」は、１つ又は２つの脂肪アシル又は脂肪アルキル鎖及び四級アミノ頭部基を有する脂質を含むこと意味する。四級アミンは、恒久的な陽電荷を担持する。頭部基は、任意選択で、生理学的なｐＨでプロトン化されていてもよい一級、二級、又は三級アミン等のイオン性基を含んでいてもよい。四級アミンが存在すると、四級アミンを欠如する構造的に類似する化合物（例えば、四級アミンが、三級アミンで置換されている）の基のｐＫａと比べて、イオン性基のｐＫａを変化させることができる。幾つかの実施形態では、荷電脂質は「アミノ脂質」と呼ばれる。非限定的な例では、アミノ脂質は、Ｈｏｐｅらの米国特許出願公開第２０１１０２５６１７５号明細書に記載のアミノ脂質であってもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。例えば、アミノ脂質は、Ｈｏｐｅらの米国特許出願公開第２０１１０２５６１７５号明細書に開示されている構造（ＩＩ）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡとして開示されている構造を有していてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。別の例では、アミノ脂質は、Ｍｕｔｈｉａｈらの国際公開第２００９１３２１３１号に記載されているような、構造（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）、又は４－（Ｒ）－ＤＵｎ－Ｋ－ＤＭＡ（ＶＩ）、４－（Ｓ）－ＤＵｎ－Ｋ－ＤＭＡ（Ｖ）を有していてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。別の例では、本明細書に記載の製剤のいずれかで使用される荷電脂質は、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの欧州特許第２５０９６３６号明細書に記載の任意の荷電脂質であってもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0163】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、脂質、リポソーム、又はリポプレックスを含有する会合複合体で製剤化されてもよい。非限定的な例では、会合複合体は、Ｍａｎｏｈａｒａｎらの米国特許第８０３４３７６号明細書に開示されているように、各々が、式（Ｉ）により規定される構造、式（ＸＶ）により規定される構造を有するＰＥＧ脂質、ステロイド、及び核酸を有する１つ又は複数の化合物を含む。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ｓａＲＮＡは、米国特許第８０３４３７６号明細書に記載の任意の会合複合体で製剤化されてもよく、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0164】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、逆頭部基脂質（reverse head group lipid）で製剤化されてもよい。非限定的な例として、ｓａＲＮＡは、Ｌｅｕｎｇらの国際公開第２０１１０５６６８２号に記載の構造（Ａ）又は構造（Ｉ）を有する脂質等の、正電荷がアシル鎖領域の付近に位置し、負電荷が頭部基の遠位端部に位置する頭部基を含む双性イオン脂質で製剤化されてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0165】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、脂質二分子膜担体で製剤化されてもよい。非限定的な例として、Ｃｕｌｌｉｓらの国際公開第１９９９０１８９３３号に記載のように、ｓａＲＮＡを、約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の量の凝集防止剤、約０．５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の量の陽イオン性脂質、及び膜融合性脂質、及び界面活性剤の脂質混合物を含む脂質－界面活性剤混合物と組み合わせて、核酸－脂質－界面活性剤混合物を提供し；その後、上記核酸－脂質－界面活性剤混合物を、緩衝化塩溶液に対して透析して、上記界面活性剤を除去し、上記核酸を脂質二分子膜担体に封入し、脂質二分子膜－核酸組成物を提供してもよく、その場合、上記緩衝化塩溶液は、約４０％から約８０％までの上記核酸を封入するのに十分なイオン強度を有する。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0166】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、心臓、肝臓、又は腫瘍組織部位に対してｓａＲＮＡを選択的に標的化することが可能な核酸－脂質粒子で製剤化してもよい。例えば、核酸－脂質粒子は、Ｃｕｌｌｉｓらの欧州特許第１３２８２５４号明細書に記載のように、（ａ）核酸；（ｂ）１．０モル％～４５モル％の陽イオン性脂質；（ｃ）０，０モル％～９０モル％の別の脂質；（ｄ）１，０モル％～１０モル％の二分子膜安定化成分；（ｅ）０，０モル％～６０モル％のコレステロール；及び（ｆ）０，０モル％～１０モル％の陽イオン性ポリマー脂質を含んでいてもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｃｕｌｌｉｓは、上記の陽イオン性脂質、二分子膜安定化成分、別の脂質、コレステロール、及び陽イオン性ポリマー脂質の各々の量は、心臓、肝臓、又は腫瘍組織部位に対して組織選択性を付与し、それにより上記心臓、肝臓、又は腫瘍組織部位に対して核酸を選択的に標的化することが可能な核酸－脂質粒子を特定することができる。

【0167】

送達
本開示は、ｓａＲＮＡを、薬物送達科学の進歩の可能性を考慮した任意の適切な経路により、治療用、医薬品用、診断用、又は画像化用に送達することを包含する。送達は、ネイキッドであってもよく、製剤化されていてもよい。

【0168】

本発明のｓａＲＮＡは、ネイキッドのままで細胞に送達してもよい。本明細書で使用される場合、「ネイキッド」は、トランスフェクションを促進する作用剤を含まないｓａＲＮＡを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるｓａＲＮＡは、修飾を含んでいなくともよい。ネイキッドｓａＲＮＡは、当技術分野で知られている投与経路及び本明細書に記載されている投与経路を使用して細胞に送達することができる。

【0169】

本発明のｓａＲＮＡは、本明細書に記載の方法を使用して製剤化してもよい。製剤は、修飾されていてもよく及び／又は未修飾であってもよいｓａＲＮＡを含有していてもよい。製剤は、これらに限定されないが、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生物分解性又は生体適合性ポリマー、溶媒、並びに持続放出送達デポー剤を更に含んでいてもよい。製剤化ｓａＲＮＡは、当技術分野で知られている投与経路及び本明細書に記載されている投与経路を使用して細胞に送達することができる。

【0170】

また、組成物は、これらに限定されないが、直接浸漬又は直接浴、カテーテルによること、ゲル剤、散剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、及び／又は滴剤によること、上記組成物でコーティングした又は上記組成物を含浸させた布材料又は生物分解性材料等の基材を使用すること等によることを含む、当技術分野の幾つかの方法のいずれかを用いて器官又は組織に直接送達するために製剤化してもよい。また、本発明のｓａＲＮＡを、レトロウイルス複製ベクター（ＲＲＶ）にクローニングして、細胞に形質導入してもよい。

【0171】

投与
本発明のｓａＲＮＡは、治療上有効な結果をもたらす任意の経路で投与することができる。投与経路としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる；腸内、胃腸内、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜上）、大脳内（大脳に）、脳室内（脳室に）、上皮（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体に）、皮下（皮膚の下に）経鼻投与（鼻から）、静脈内（静脈に）、動脈内（動脈に）、筋肉内（筋肉に）、心臓内（心臓に）、骨内注入（骨髄に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入又は注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼に）、海綿体内注射（陰茎の基部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（無傷皮膚から拡散させて全身に分布させる）、径粘膜（粘膜からの拡散）、吹送（鼻で吸う）、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上に）、又は点耳。特定の実施形態では、組成物は、組成物が、血液脳関門、血管関門、又は他の上皮性関門を越えることを可能にするように投与される。２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号に開示されている投与経路を使用して、本発明のｓａＲＮＡを投与してもよい。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0172】

剤形
本明細書に記載の医薬組成物は、局所、鼻腔内、気管内、又は注射可能な（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下）等の、本明細書に記載の剤形に製剤化することができる。２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号に記載の液体剤形、注射可能な調製物、肺用形態、及び固形剤形を、本発明のｓａＲＮＡの剤形として使用することができる。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0173】

ＩＩ．使用方法
本発明の１つの態様は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ、並びに上記Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を使用するための方法を提供する。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現を調節する。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの非存在下でのＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２０、３０、及び４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、更により好ましくは少なくとも８０％増加する。更なる好ましい実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの非存在下でのＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、更により好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍増加する。

【0174】

代謝調節
肝細胞は、一般的に、幾つかの生命機能の維持に重要であると考えられている。例えば、肝細胞は、炭水化物及び脂質の代謝、並びに外来性及び内因性化合物の解毒を制御することができる。Ｃ／ＥＢＰαは、様々な組織で発現され、脂肪細胞、ＩＩ型肺胞細胞、及び肝細胞を含む多数の細胞タイプの分化に重要な役割を果たす。マウスでは、Ｃ／ＥＢＰαは、脂肪組織、肝臓組織、及び肺組織で最も大量に見出される。Ｃ／ＥＢＰαの機能的役割としては、これらに限定されないが、アルファ１－アンチトリプシン、トランスサイレチン、及びアルブミンの制御が挙げられる。更に、肝細胞株（ＨｅｐＧ２）でのＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現は、内因性基質の代謝に寄与し、主要な生体異物の解毒及び代謝活性化に重要な役割を果たすモノオキシゲナーゼのスーパーファミリーであるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）のレベル増加をもたらす［Ｊｏｖｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４３１巻（２号）、２２７～２３０頁（１９９８年）、この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる］。

【0175】

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、主要な世界的健康関心事であり、合衆国では３人に１人が影響をうけている。ＮＡＦＬＤは、過剰なアルコール摂取で引き起こされるものではない、肝細胞における過剰な脂肪（脂質）蓄積である。肝臓重量の５％～１０％超が脂肪である場合、脂肪肝（脂肪症）と呼ばれる。ＮＡＦＬＤは、脂肪性肝炎、肝硬変、及び肝臓癌に進行する場合がある。ＮＡＦＬＤは、メタボリック症候群、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、高脂血症、高血圧、肥満等の代謝障害に伴う。治療方法としては、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルを低下させること、インスリン感受性を向上させること、代謝危険因子を治療すること、及び体重を減少させること等が挙げられる。［アダムズら、Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、８２巻、３１５～３２２頁（２００６年）；Ｍｕｓｓｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．２２巻（６号）、４８９～４９６頁（２０１１年）、これらの文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる］。

【0176】

Ｃ／ＥＢＰαタンパク質は、肝機能及び代謝の制御に重要な役割を果たす。肝臓に対するＣ／ＥＢＰαの主要効果は、図１に示されており、以下のものが含まれる：ＣＤ３６タンパク質レベルの低下による脂肪酸取り込みの減少、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、炭水化物応答エレメント結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ）、及び脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）タンパク質レベルの低下による新規脂質生合成の減少、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲα）及びペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ共活性化因子１アルファ＆ベータ（ＰＧＣ１α＆β）タンパク質レベルの増加によるβ－酸化の増加、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）及び低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質レベルの低下による過負荷肝臓脂質の減少、ＰＧＣ－１βタンパク質レベルの増加による線維症への進行の減少、ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）タンパク質レベルの増加によるインスリン抵抗性の減少。更に、Ｃ／ＥＢＰαは、図２に示されるように、脂肪組織に対して副次的効果を有する。白色脂肪組織（ＷＡＴ）は、脂質生成及び脂肪貯蔵組織であるだけでなく、エネルギー恒常性、脂質代謝、食欲、受精能、並びに免疫及びストレス応答を制御する重要な内分泌器官でもある。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、ＷＡＴと比較して、多数のより小さな脂質滴及び非常に多数の鉄含有ミトコンドリアを含有している。褐色脂肪組織は、栄養学的エネルギー、エネルギー収支、及び体重に重要な役割を果たす。ＢＡＴの萎縮は、肥満と関連しているという証拠がある。特に、ＢＡＴの熱産生障害が、げっ歯動物の肥満病因論において重要であることを示す研究がなされている［Ｔｒａｙｈｕｒｎ Ｐ、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１８巻（２号）、１６１～１７３頁（１９９３年）］。Ｃ／ＥＢＰαは、肝臓脂肪症及びインスリン抵抗性を減少させ、ＰＧＣ－１αタンパク質レベルを増加させ、ひいては、ＷＡＴ褐色化、ＷＡＴのＢＡＴへの変換を引き起こし、その後ＢＡＴを活性化させ、体脂肪及び体重を低減させることができる。したがって、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、肝機能を制御し、脂肪症を低減し、血清脂質を低減し、ＮＡＦＬＤを治療し、インスリン抵抗性を治療し、エネルギー消費を増加させ、肥満を治療することができる。

【0177】

１つの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡによる治療により、肝臓代謝遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで制御するための方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡによる治療により、ＮＡＦＬＤに関与する肝臓遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで制御するための方法が提供される。上記遺伝子としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ステロール調節エレメント結合因子１（ＳＲＥＢＦ－１又はＳＲＥＢＦ）、分化クラスタ３６（ＣＤ３６）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＡＣＢ）、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ共活性化因子１アルファ（ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１α又はＰＰＡＲＧＣ１Ａ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ共活性化因子１ベータ（ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１β又はＰＥＲＣ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ１（ＡＣＡＣＡ）、炭水化物応答エレメント結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ又はＭＬＸ１ＰＬ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲα又はＰＰＡＲＡ）、ＦＡＳＮ（脂肪酸シンターゼ）、ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ－２（ＤＧＡＴ２）、及び哺乳動物ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＳＲＥＢＦ－１遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＣＤ３６遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＡＣＡＣＢ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＡＰＯＣ３遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＭＴＰ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１α遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、２００％、２５０％、３００％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＰＰＡＲγ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、２００％、２５０％、３００％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＰＰＡＲα遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、２００％、２５０％、３００％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＭＬＸＩＰＬ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＦＡＳＮ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＤＧＡＴ２遺伝子の発現を、少なくとも１０％、２０％、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％減少させる。

【0178】

また、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞において、上記で開示した肝臓代謝遺伝子の発現を調節する。別の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＳＲＥＢＰ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＣＤ３６遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＬＤＬＲ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＡＰＯＣ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９９％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＡＣＡＣＢ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＰＥＲＣ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＡＣＡＣＡ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＭＬＸＰ１遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＭＴＯＲ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％、７５％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＰＰＡＲＡ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＦＡＳＮ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞でのＤＧＡＴ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも２００％、２５０％、３００％増加させる。

【0179】

また、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞において、上記で開示した肝臓代謝遺伝子の発現を調節する。別の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＳＲＥＢＰ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＣＤ３６遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＬＤＬＲ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＭＴＰ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、より好ましくは少なくとも５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、１０．０倍増加させる。１つの実施形態では、１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＡＰＯＣ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９９％増加させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＡＣＡＣＢ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＰＥＲＣ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＡＣＡＣＡ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、９５％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＭＬＸ１ＰＬ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＭＴＯＲ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％、７５％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＦＡＳＮ遺伝子の発現を、少なくとも５％、１０％、好ましくは少なくとも１５％、２０％減少させる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞でのＤＧＡＴ遺伝子の発現を、少なくとも１０％、２０％、３０％、より好ましくは４０％、５０％減少させる。

【0180】

別の実施形態では、その必要性のある患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、インスリン抵抗性（ＩＲ）を低減又はインスリン感受性を増加させる方法が提供される。また、その必要性のある患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、ＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、及び脂肪症を治療する方法が提供される。肝細胞が、インスリンに対して耐性であり、インスリンを効果的に使用することができない場合、高血糖症が発症する。すると、膵臓のベータ細胞は、インスリンの産生を増加させ、高インスリン血症及びＩＩ型糖尿病に結び付く。多数の制御因子が、肝細胞のインスリン抵抗性に影響を及ぼす。例えば、ステロール調節エレメント結合タンパク質１（ＳＲＥＢＰ１又はＳＲＥＢＰ）は、コレステロールの主制御因子であり、インスリン抵抗性の増加と関連する。コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）の上方制御は、インスリン抵抗性の増加と関連する。肝性脂肪酸トランスロカーゼ／分化クラスタ３６（ＦＡＴ／ＣＤ３６）の上方制御は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）患者におけるインスリン抵抗性、高インスリン血症、脂肪症の増加と関連する。リポタンパク質リパーゼ遺伝子（ＬＰＬ）の肝臓特異的過剰発現は、肝臓特異的インスリン抵抗性を引き起こす。肝臓Ｘ受容体遺伝子（ＬＸＲ）は、肝臓における、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）－１ｃ－誘導性脂肪酸合成のインスリン媒介性活性化に中心的な役割を果たす。他の因子としては、トリグリセリド合成を制御するジグリセリドアシルトランスフェラーゼ－２（ＤＧＡＴ２）、及び脂肪酸生合成を制御する脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）が挙げられる。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子の発現を、未処置の肝細胞と比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、更により好ましくは９０％低減させる。別の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＬＰＬ遺伝子の発現を、未処置の肝細胞と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、より好ましくは少なくとも１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、及び４００％増加させる。別の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝細胞でのＬＸＲ遺伝子の発現を、未処置の肝細胞と比較して、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、より好ましくは少なくとも１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、及び４００％、更により好ましくは少なくとも４５０％、５００％、５５０％、６００％増加させる。別の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＳＲＥＢＰ１遺伝子発現を減少させる。別の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＤＧＡＴ２遺伝子発現を減少させる。別の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＣＥＴＰ遺伝子発現を減少させる。更に別の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＦＡＳＮ遺伝子発現を減少させる。

【0181】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで調節することができるＮＡＦＬＤ及びＩＲ遺伝子の要約は、表４に示されている。表４の略語：ＮＡＦＬＤ：非アルコール性脂肪肝疾患；ＩＲ：インスリン抵抗性；ＤＮＬ：新規脂質生成；ＦＡ：脂肪酸；ＴＧ：トリグリセリド；ＬＰＬ：リポタンパク質リパーゼ；ＨＰ：肝性リパーゼ；ＣＨＯＬ：コレステロール。

【0182】

【表4-1】

【0183】

【表4-2】

【0184】

本発明の１つの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置することにより、血清コレステロールレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで低下させる方法が提供される。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを用いると血清コレステロールレベルは、未処置の血清コレステロールレベルと比較して、少なくとも２５％、好ましくは５０％、より好ましくは７５％低減される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにて肝細胞のＬＤＬ及びトリグリセリドのレベルを低下させ、ＬＤＬの循環レベルを増加させる方法が提供される。循環ＬＤＬレベルは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下での循環ＬＤＬレベルと比較して、少なくとも２倍、好ましくは３倍、好ましくは４倍、好ましくは５倍、好ましくは１０倍、好ましくは１５倍増加させることができる。肝臓トリグリセリドレベルは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下での肝臓トリグリセリドレベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、又は７０％低減させることができる。肝臓ＬＤＬレベルは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下での肝臓ＬＤＬレベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、又は７０％低減させることができる。

【0185】

本発明の１つの実施形態では、その必要性のある患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、ＮＡＦＬＤを治療し、脂肪肝サイズを低減させる方法が提供される。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療した患者の脂肪肝のサイズは、未治療の患者と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％低減される。また、その必要性のある患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、体重を減少させ、肥満を治療する方法が提供される。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療した患者の体重は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療しない患者の体重よりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、又は７０％低い。本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、１用量、２用量、３用量、又はそれを超える用量で投与してもよい。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより、肝臓の遊離脂肪酸取り込みを減少させる方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより、白色脂肪組織（ＷＡＴ）炎症を低減する方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより、新規脂質生合成を低減する方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより、肝臓のベータ－酸化を増加させる方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより、肝臓の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を増加させる方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより、肝臓の脂質取り込みを低減する方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより、ＷＡＴでの脂質生合成を減少させる方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより、肝臓での脂質貯蔵を減少させる方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することにより、肝臓での脂質過負荷を低減させる方法が提供される。

【0186】

別の実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、肝機能を増加させるために使用される。１つの非限定的な例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、アルブミン遺伝子発現を増加させ、それにより血清アルブミン及び非抱合型ビリルビンのレベルを増加させる。アルブミン遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの非存在下でのアルブミン遺伝子の発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、更により好ましくは少なくとも８０％増加させてもよい。更なる好ましい実施形態では、アルブミン遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの非存在下でのアルブミン遺伝子の発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、更により好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍増加される。別の非限定的な例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アルファフェクトプロテイン（alphafectoprotein）（ＡＦＰ）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の量を減少させる。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＦＰ、又はＨＧＦの量は、本発明のｓａＲＮＡの非存在下でのＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＦＰ、又はＨＧＦのいずれかの量と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、更により好ましくは少なくとも８０％減少してもよい。

【0187】

別の実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与して、Ｃ／ＥＢＰファミリーの他のメンバーのレベルを制御する。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの用量に応じて、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びＣ／ＥＢＰζの発現を増加させる。更に別の実施形態では、細胞中のＣ／ＥＢＰα又はＣ／ＥＢＰβタンパク質アイソフォームの比は、上記細胞を本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと接触させることにより制御される。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰαの４２ＫＤａアイソフォームが増加される。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰβの３０ＫＤａアイソフォームが増加される。

【0188】

ｅｃＣＥＢＰＡ
過剰コード化（extra coding）ＣＥＢＰＡ（ｅｃＣＥＢＰＡ）、ＣＥＢＰＡ遺伝子座から転写される機能的ｎｃＲＮＡは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）と相互作用することにより、ＣＥＢＰＡメチル化を制御し、したがってＣＥＢＰＡ遺伝子メチル化を防止する。ｅｃＣＥＢＰＡをノックダウンすると、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ発現が減少し、ＤＮＡメチル化が著しい増加がもたらされたことが見出されている（Ｒｕｓｃｉｏら、Ｎａｔｕｒｅ、５０３巻：３７１～３７６頁（２０１３年）；この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる）。別の実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、ｅｃＣＥＢＰＡレベルを上方制御する。

【0189】

外科ケア
肝切除術、肝臓又は肝組織の外科的切除は、肝不全、アルブミン及び凝固因子の産生の低減引き起こす場合がある。肝切除術後には、適切な外科ケアが必要である。幾つかの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、肝切除術後の外科ケアに使用して、肝再生を促進し、生存率を増加させる。

【0190】

過剰増殖障害
本発明の１つの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、過剰増殖性細胞の細胞増殖を低減させる。過剰増殖性細胞の例としては、癌細胞、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、及び芽細胞腫が挙げられる。そのような癌細胞は、良性であってもよく、又は悪性であってもよい。過剰増殖性細胞は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、又は乾癬等の自己免疫状態に起因する場合がある。また、過剰増殖性細胞は、アレルゲンと接触した過敏免疫系を有する患者内で生じる場合がある。過敏免疫系に関与するそのような状態としては、これらに限定されないが、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、及びアレルギー性アナフィラキシー等のアレルギー反応が挙げられる。１つの実施形態では、腫瘍細胞発生及び／又は増殖が阻害される。好ましい実施形態では、固形腫瘍細胞増殖が阻害される。別の好ましい実施形態では、腫瘍細胞の転移が予防される。別の好ましい例では、未分化腫瘍細胞増殖が阻害される。

【0191】

細胞増殖の阻害又は増殖の低減は、増殖が低減されるか又は完全に停止することを意味する。したがって、「増殖の低減」は、「増殖の阻害」の実施形態である。細胞の増殖は、本発明のｓａＲＮＡで治療する前の上記細胞の増殖と比較して、又は同等の未処置細胞の増殖と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２０％、３０％、若しくは４０％、又は好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、若しくは７５％、更により好ましくは少なくとも８０、９０、若しくは９５％低減される。過剰増殖性細胞の細胞増殖が阻害される実施形態では、「同等の」細胞も過剰増殖性細胞である。好ましい実施形態では、増殖は、同等の健康な（非過剰増殖性）細胞の増殖速度と同等の速度に低減される。別の観点では、「細胞増殖の阻害」の好ましい実施形態は、過剰増殖を阻害又は細胞増殖を調節して、正常で健康なレベルの増殖に到達させることである。

【0192】

１つの非限定的な例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、白血病細胞及びリンパ腫細胞の増殖を低減させる。好ましくは、細胞としては、ジャーカット細胞（急性Ｔ細胞性リンパ腫細胞株）、Ｋ５６２細胞（赤白血病細胞株）、Ｕ３７３細胞（神経膠芽腫細胞株）、及び３２Ｄｐ２１０細胞（骨髄性白血病細胞株）が挙げられる。

【0193】

別の非限定的な例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、卵巣癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、ラット肝臓癌細胞、及びインスリノーマ細胞の増殖を低減させる。好ましくは、細胞としては、ＰＥＯ１及びＰＥＯ４（卵巣癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌細胞株）、Ｐａｎｃ１（ヒト膵臓癌細胞株）、ＭＣＦ７（ヒト乳腺癌細胞株）、ＤＵ１４５（ヒト転移性前立腺癌細胞株）、ラット肝臓癌細胞、及びＭＩＮ６（ラットインスリノーマ細胞株）が挙げられる。

【0194】

別の非限定的な例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと組み合わせて使用して、腫瘍細胞増殖を低減させる。腫瘍細胞としては、ＨｅｐＧ２細胞等の肝細胞癌細胞、及びＭＣＦ７細胞等の乳癌細胞を挙げることができる。

【0195】

１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡを使用して、過剰増殖性障害を治療する。腫瘍及び癌は、特に目的とする過剰増殖性障害であり、あらゆるタイプの腫瘍及び癌、例えば、固形腫瘍及び血液学的癌が含まれる。癌の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、腎臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、消化官癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、及び慢性骨髄性白血病等）、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠芽腫、髄芽細胞腫）、神経芽腫、肉腫、結腸癌、直腸癌、胃癌、肛門癌、膀胱癌、子宮内膜癌、形質細胞腫、リンパ腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、メラノーマ、及び他の皮膚癌。肝臓癌としては、これらに限定されないが、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、又は肝細胞癌（ＨＣＣ）が挙げられる。ＨＣＣが特に目的である。

【0196】

原発性肝癌は、世界で５番目に多い癌であり、癌関連死亡の３番目に多い原因である。原発性肝癌の大部分は、ＨＣＣである［Ｅｌ－Ｓｅｒａｇら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１３２巻（７号）、２５５７～２５７６頁（２００７年）；この文献の内容は、それらの全体が本明細書に開示されている］。ＨＣＣは、癌細胞生物学、免疫系、及び様々な病原学（ウイルス、毒性、及び一般的）に関与する幾つかの因子の相互作用により影響を受ける。ＨＣＣの患者の大多数は、肝硬変の病歴があると悪性腫瘍を発症する。現在、ほとんどの患者は進行期で診断される。したがって、大多数のＨＣＣ患者の５年の生存率は、依然として不良である。現在、外科的切除、局所領域切除、及び肝移植のみが、ＨＣＣの治療に有望な治療選択肢である。しかしながら、個々の肝機能及び腫瘍量の評価に基づくと、患者のわずか約５～１５％しか外科的処置の対象にならない。Ｃ／ＥＢＰ転写因子ファミリーの結合部位は、正常な肝細胞機能の維持及び傷害に対する応答（アルブミン、、インターロイキン６応答、エネルギー恒常性、オルニチン回路制御、及び血清アミロイドＡ発現を含む）に関与する多数の遺伝子のプロモーター領域に存在する。本発明では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現を調節し、肝硬変及びＨＣＣを治療する。

【0197】

本発明の方法は、腫瘍容積を、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％低減することができる。好ましくは、１つ又は複数の新しい腫瘍の発生が阻害される、例えば、本発明により治療された対象体は、より少数の腫瘍及び／又はより小さな腫瘍しか発生させない。より少数の腫瘍は、対象体が、設定期間にわたって、同等の対象体よりも少数の腫瘍を発生させることを意味する。例えば、対象体は、同等の対照（未治療）対象体よりも、少なくとも１、２、３、４、又は５個少ないの腫瘍しか発症させない。より小さな腫瘍は、上記腫瘍が、同等の対象体の腫瘍よりも、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％少ない重量及び／又は容積であることを意味する。本発明の方法は、腫瘍量を、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％低減する。

【0198】

設定期間は、任意の好適な期間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０か月又は年であってもよい。
１つの非限定的な例では、細胞、組織、器官、又は対象体を、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡと接触することを含む、未分化腫瘍を治療する方法が提供される。未分化腫瘍は、一般的に、分化腫瘍と比較して、不良な予後を示す。腫瘍における分化の度合いは、予後と関連するため、分化誘導性生物因子の使用は、有益な抗増殖薬でありうると仮定される。Ｃ／ＥＢＰαは、急性骨髄白血病では、骨髄分化を回復させ、造血細胞の過剰増殖を防止することが知られている。好ましくは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療することができる未分化腫瘍としては、未分化小細胞肺癌、未分化膵臓腺癌、未分化ヒト膵臓癌、未分化ヒト転移性前立腺癌、及び未分化ヒト乳癌が挙げられる。

【0199】

１つの非限定的な例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、標的化ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、ＰＡＭＡＭデンドリマーと複合体化され、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーと呼ばれる。静脈注射したＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの治療効果は、実施例１に示されているように、臨床的に意義のあるラット肝腫瘍モデルで実証されている。４８時間間隔での尾静脈注射による３用量後、治療した硬変症ラットは、１週間以内に血清アルブミンレベルの有意な増加を示した。肝腫瘍量は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡデンドリマー治療群で有意に減少した。この研究は、低分子活性化ＲＮＡ分子による遺伝子標的化を、全身性静脈内投与により使用して、ＨＣＣを有する硬変症ラットの肝機能を改善し、同時に腫瘍量を低減することができることを、初めて実証するものである。

【0200】

１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子を制御する。好ましくは、癌遺伝子の発現を下方制御してもよい。癌遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下での発現と比較して、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％低減される。更なる好ましい実施形態では、癌遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下での発現と比較して、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、更により好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍低減される。好ましくは、腫瘍抑制遺伝子の発現を阻害してもよい。腫瘍抑制遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下での発現と比較して、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、更により好ましくは少なくとも１００％増加する。更なる好ましい実施形態では、腫瘍抑制遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下での発現と比較して、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、更により好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍増加される。癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：Ｂｃｌ－２－結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）、ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）、ディスエイブルドホモログ２相互作用タンパク質（disabled homolog 2-interacting protein）（ＤＡＢ２１Ｐ）、肝臓癌欠失１（ＤＬＣ１）、Ｆａｓ表面デス受容体（ＦＡＳ）、脆弱ヒスチジントライアド（ＦＨＩＴ）、成長停止及びＤＮＡ損傷誘導性ベータ（growth arrest and DNA-damage-inducible-beta）（ＧＡＤＤ４５Ｂ）、ヘッジホッグ相互作用タンパク質（ＨＨＩＰ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１）、ホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）、タンパク質チロシンキナーゼ２（ＰＴＫ２）、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、ｒｕｎｔ関連転写因子３（ＲＵＮＸ３）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）、サイトカインシグナル伝達抑制因子（３ＳＯＣＳ３）、形質転換増殖因子、ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲ２）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１０（ＴＮＦＳＦ１０）、Ｐ５３、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１７（ＡＤＡＭ１７）、ｖ－ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子相同体１（ＡＫＴ１）、アンギオポエチン２（ＡＮＧＰＴ２）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２）、ＢＣＬ２様１（ＢＣＬ２Ｌ１）、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有２（ＢＩＲＣ２）、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有５（ＢＩＲＣ５）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、サイクリンＤ２（ＣＣＮＤ２）、カドヘリン１（ＣＤＨ１）、カドヘリン１３（ＣＤＨ１３）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ（ＣＤＫＮ１Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｂ（ＣＤＫＮ１Ｂ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、ＣＡＳＰ８及びＦＡＤＤ様アポトーシス制御因子（ＣＦＬＡＲ）、カテニン（カドヘリン関連タンパク質）ベータ１（ＣＴＮＮＢ１）、ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００（ＥＰ３００）、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）結合デスドメイン（Fas (TNFRSF6)-associated via death domain）（ＦＡＤＤ）、ｆｍｓ－関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）、ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体７（ＦＺＤ７）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼｐｉ１（ＧＳＴＰ１）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ハーベイラット肉腫ウイルス癌遺伝子相同体（ＨＲＡＳ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１）、キナーゼインサートドメイン受容体（ＫＤＲ）、骨髄系細胞白血病配列１（ＭＣＬ１）、ｍｅｔ癌原遺伝子（ＭＥＴ）、及びｍｕｔＳ相同体２（ＭＳＨ２）、ｍｕｔＳ相同体３（ＭＳＨ３）、メタドヘリン（ＭＴＤＨ）、ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子相同体（ＭＹＣ）、Ｂ細胞カッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサー核内因子１（nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1）（ＮＦＫＢ１）、神経芽腫ＲＡＳウイルス（ｖ－ｒａｓ）癌遺伝子相同体（ＮＲＡＳ）、オピオイド結合タンパク質／細胞接着分子様（ＯＰＣＭＬ）、血小板由来増殖因子受容体、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ペプチジルプロリルイｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼ３、ＮＩＭＡ相互作用１（ＰＩＮ１）、プロスタグランジン－エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、ＰＹＤ及びＣＡＲＤドメイン含有（ＰＹＣＡＲＤ）、ｒａｓ－関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ＲＡＣ１）、Ｒａｓ結合（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ－６）ドメインファミリーメンバー１（ＲＡＳＳＦ１）、リーリン（ＲＥＬＮ）、ｒａｓ相同体ファミリーメンバーＡ（ＲＨＯＡ）、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、ＳＭＡＤファミリーメンバー７（ＳＭＡＤ７）、サイトカインシグナル伝達抑制因子１（ＳＯＣＳ１）、シグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）、転写因子４（ＴＣＦ４）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦＡ）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、トール様受容体４（ＴＬＲ４）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、Ｘ連鎖アポトーシス阻害因子（ＸＩＡＰ）、及びＹｅｓ関連タンパク質１（ＹＡＰ１）。

【0201】

１つの実施形態では、その必要性のある患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、白血球数を増加させる方法が提供される。また、敗血症又は慢性炎症疾患（例えば、肝炎及び肝硬変）を有する患者、及び免疫不全患者（例えば、化学療法を受けている患者）の白血球減少症を、上記患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより治療する方法が提供される。また、その必要性のある患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、白血病及びリンパ腫を含む、プレＢ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法が提供される。また、その必要性のある患者に本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを投与することにより、白血球細胞、造血性幹細胞、又は間葉系幹細胞を動員する方法が提供される。１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療された患者の白血球数は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで治療しなかった場合と比較して、少なくとも５０％、７５％、１００％、より好ましくは少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５倍、より好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０倍増加する。

【0202】

１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、肝細胞癌の治療に使用して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ）を制御する。マイクロＲＮＡは、遺伝子発現を制御する低分子非コードＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、重要な生理機能に関与し、発癌の１つ１つのステップに関与し得る。マイクロＲＮＡは、典型的には、２１個のヌクレオチドを有し、ｍＲＮＡの３’－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に結合することにより、そのｍＲＮＡの翻訳を阻止するか又はそのｍＲＮＡの分解を誘導することにより、転写後レベルで遺伝子発現を制御する。

【0203】

腫瘍では、ｍｉＲＮＡ発現の制御は、腫瘍発生に影響を及ぼす。ＨＣＣでは、他の癌と同様に、ｍｉＲＮＡは、細胞増殖及び成長、細胞代謝及び細胞分化、アポトーシス、血管新生、転移、及び最終的には予後に影響を及ぼす癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子のいずれかとして機能する。［Ｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、３７５巻、３１５～３２０頁（２００８年）；Ｋｕｔａｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９９巻、６７１～６７８頁（２００６年）；Ｍｅｎｇら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１３３巻（２号）、６４７～６５８頁（２００７年）、これらの文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる］。本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現及び／又は機能を調節し、また、ＨＣＣ細胞のｍｉＲＮＡレベルを制御する。本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより制御することができるｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－５ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－３２－５ｐ。

【0204】

１つの非限定的な例では、ｍｉＲＮＡは、発癌性ｍｉＲＮＡであり、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下と比較して、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、１、１．５、２、２．５、及び３倍、下方制御される。別の非限定的な例では、ｍｉＲＮＡは、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡであり、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下と比較して、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、１倍、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、更により好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍、上方制御される。

【0205】

幹細胞制御
本発明の幾つかの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、自己再生多能性因子を制御し、幹細胞分化に影響を及ぼす。目的タンパク質を発現するために又は細胞を異なる細胞表現型に変更するために、細胞の表現型を変更することは、様々な臨床、治療、及び研究環境で使用されている。細胞表現型の変更は、現在、ＤＮＡ又はウイルスベクターからタンパク質を発現させることより達成されている。現在、パーキンソン病及び糖尿病等の種々の疾患、及び脊髄傷害等の傷害の治療選択肢としてのヒト胚幹細胞の使用を評価するための研究が行われている。胚幹細胞は、あらゆる分化細胞タイプを生成する多能性を維持しつつ、無限に増殖する能力を有する。

【0206】

個別化再生医療、細胞療法、及び他の疾患療法の分野に有用な細胞表現型の変更には、多能性因子、細胞表現型変更因子、分化転換因子、分化因子、及び脱分化因子等の多数の因子が使用される。例えば、幹細胞の自己再生及び多能性特性は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＫＬＦ遺伝子を含む、中核制御回路の転写因子及びクロマチンリモデリング酵素等の多くの遺伝子により制御される［Ｂｏｕｒｉｌｌｏｔら、ＢＭＣ Ｂｉｏｌｏｇｙ、８巻：１２５頁（２０１０年）、この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる］。また、自己調節ネットワークのこの制御回路は、下流遺伝子に影響を及ぼす。中核制御回路を制御するために、オリゴヌクレオチドが利用されている。Ｘｕらは、ｍｉＲＮＡ－１４５が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４の３’－ＵＴＲを標的とすることを開示した。ｍｉＲＮＡ－１４５の低減は、分化を妨害し、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４を上昇させる。［Ｘｕら、Ｃｅｌｌ、１３７巻、１～１２頁（２００９年）、この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる］。

【0207】

１つの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、自己再生多能性遺伝子を制御する。多能性遺伝子の非限定的な例としては、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ｃＫｉｔ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＮＡＮＯＧ、ＣＤＸ２、及びＳＡＬＬ４が挙げられる。１つの実施形態では、多能性遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下と比較して、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２０、３０、又は４０％、又はより好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、又は７５％、更により好ましくは少なくとも８０、９０、又は９５％低減される。別の実施形態では、多能性遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下と比較して、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、更により好ましくは少なくとも８０％増加される。好ましい実施形態では、多能性遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの非存在下での発現と比較して、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの存在下では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、更により好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍増加される。

【0208】

１つの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを使用して、細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ）を制御する。幾つかの腫瘍は、自己再生することができ、癌細胞を様々な系統へと分化させることにより腫瘍開始能力を維持することができる癌幹細胞又は癌幹様細胞を含有している。ＥＭＴは、癌幹様細胞、腫瘍侵襲性及び転移性、及び腫瘍再発に関連することが示されれている。［Ｋｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒｓ、３巻（１号）、７１６～７２９頁（２０１１年）］ｍｉＲ－２００及びｍｉＲ－１３４等のｍｉＲＮＡ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の増殖因子、並びにＮｏｔｃｈ－１シグナル経路及びＷｎｔシグナル経路等の因子を含む多数の因子が、ＥＭＴを制御する。１つの非限定的な例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ｍｉＲ－１３４の発現を調節することによりＥＭＴを制御する。別の非限定的な例では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＲＵＮＸ３、ＣＴＮＢ１、ＨＧＦ、ＳＭＡＤ７、又はＴＧＦＢ１遺伝子の発現を調節することにより、ＥＭＴを制御する。

【0209】

ＩＩＩ．キット及びデバイス
キット
本発明は、本発明の方法を便利に及び／又は効果的に実行するための様々なキットを提供する。典型的には、キットは、ユーザが対象体（複数可）の複数の治療を実施すること及び／又は複数の実験を実施することを可能にする、十分な量の及び／又は数の成分を含むだろう。

【0210】

１つの実施形態では、本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ、又はＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ、他の遺伝子を調節するｓａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡの組み合わせを含む、遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ制御するためのキットを提供する。キットは、パッケージング及び説明書及び／又は製剤組成物を形成するための送達剤を更に含んでいてもよい。送達剤は、生理食塩水、緩衝化溶液、リピドイド、デンドリマー、又は本明細書に開示されている任意の送達剤を含んでいてもよい。遺伝子の非限定的な例としては、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰファミリーの他のメンバー、アルブミン遺伝子、アルファフェクトプロテイン遺伝子、肝臓特異的因子遺伝子、増殖因子、核内因子遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、多能性因子遺伝子が挙げられる。

【0211】

１つの非限定的な例では、緩衝化溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩、及び／又はＥＤＴＡを含んでいてもよい。別の非限定的な例では、緩衝化溶液は、これらに限定されないが、生理食塩水、２ｍＭカルシウムを有する生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウムを有する５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを有する５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムを有する塩化ナトリウム、及びマンノースを含んでいてもよい（米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号明細書；この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。更に別の非限定的な例では、緩衝化溶液は、沈殿していてもよく、又は凍結乾燥されていてもよい。各成分の量は、一貫して再現性があるより高い濃度の生理食塩水又は単純な緩衝液配合を可能にするように様々であってもよい。また、成分は、ある期間にわたって及び／又は様々な条件下で緩衝化溶液中のｓａＲＮＡの安定性を増加させるために、様々であってもよい。

【0212】

別の実施形態では、本発明は、細胞に導入した際にその細胞の増殖を阻害するのに有効な量で提供されている本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ；任意選択で標的細胞の増殖を更に制御するｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ；並びにパッケージング及び説明書及び／又は製剤組成物を形成するための送達剤を含む、細胞増殖を制御するためのキットを提供する。

【0213】

別の実施形態では、本発明は、本発明のｓａＲＮＡ分子；任意選択でＬＤＬを低減する薬物；並びにパッケージング及び説明書及び／又は製剤組成物を形成するための送達剤を含む、細胞のＬＤＬレベルを低減するためのキットを提供する。

【0214】

別の実施形態では、本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ；任意選択でｓｉＲＮＡ、ｅＲＮＡｓ、及びｌｎｃＲＮＡ；並びにパッケージング及び説明書及び／又は製剤組成物を形成するための送達剤を含む、細胞のｍｉＲＮＡ発現レベルを制御するためのキットを提供する。

【0215】

デバイス
本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを組み込むことができるデバイスを提供する。これらデバイスは、ヒト患者等の、その必要性のある対象体に直ちに送達することができる安定製剤を含有する。そのような対象体の非限定的な例としては、癌、腫瘍、又は肝硬変等の過剰増殖性障害を有する対象体；及びＮＡＦＬＤ、肥満、高ＬＤＬコレステロール、又はＩＩ型糖尿病等の代謝障害を有する対象体が挙げられる。

【0216】

デバイスの非限定的な例としては、ポンプ、カテーテル、針、経皮貼布、加圧嗅覚器官送達デバイス、イオン泳動デバイス、多層マイクロ流体デバイスが挙げられる。デバイスは、単一用量、複数用量、又は分割用量の投与計画に従って、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを送達するために使用することができる。デバイスは、本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、生物組織を越えて、皮内に、皮下に、又は筋肉内に送達するために使用することができる。オリゴヌクレオチドを送達するために好適なデバイスのより多くの例は、２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号に開示されており、この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0217】

定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用されている、ある用語及び語句の意味は、下記に提供されている。本明細書の他の部分での用語の使用と、この節で提供されているその定義との間に明らかな矛盾がある場合、この節の定義が優先するものとする。

【0218】

約：本明細書で使用される場合、用語「約」は、示されている値の＋／－１０％を意味する。
併用して投与される：本明細書で使用される場合、用語「併用して投与される」又は「併用投与」は、２つ以上の作用剤、例えばｓａＲＮＡが、対象体に対する各作用剤の効果が重なり合うことができるように、同時に又はある間隔内で対象体に投与されることを意味する。幾つかの実施形態では、２つ以上の作用剤は、互いに約６０、３０、１５、１０、５、又は１分以内に投与される。幾つかの実施形態では、作用剤の投与は、組み合わせ効果（例えば、相乗効果）が達成されるように、十分に短い間隔で投与される。

【0219】

アミノ酸：本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」及び「アミノ酸（複数）」は、あらゆる天然Ｌ－アルファ－アミノ酸を指す。アミノ酸は、以下のように１文字命名法又は３文字命名法のいずれかにより特定される：アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、リジン（Ｌｙｓ：Ｋ）、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）、メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）。上記では、アミノ酸がまず列挙され、その後の括弧内に３文字コード及び１文字コードがそれぞれ示されている。

【0220】

動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。幾つかの実施形態では、「動物」は、あらゆる発達段階のヒトを指す。幾つかの実施形態では、「動物」は、あらゆる発達段階の非ヒト動物を指す。ある実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、又はブタ）である。幾つかの実施形態では、動物としては、これらに限定されないが、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、魚、及び虫が挙げられる。幾つかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、又はクローンである。

【0221】

およそ：本明細書で使用される場合、１つ又は複数の目的の値に適用されている用語「およそ」又は「約」は、記載の参照値に類似する値を指す。ある実施形態の中で、用語「およそ」又は「約」は、別様の記述がない限り又は状況からそうでないことが明らかでない限り（そのような数が、１００％を超えるあり得ない値となってしまう場合を除く）、いずれかの方向（超又は未満）で、記載の参照値の、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％以下以内に入る一連の値を指す。

【0222】

結合される：本明細書で使用される場合、２つ以上の部分に関して使用される際の用語「結合される」「抱合される」、「連結される」、「繋止される」は、それら部分が、直接的に、又はリンカー剤としての役割を果たす１つ又は複数の部分を介してのずれかで、互いに物理的に結合又は接続されて、十分に安定な構造を形成し、その構造が使用される条件下で、例えば生理学的条件下でそれら部分が物理的に結合したままであることを意味する。「結合」は、厳密に直接的共有結合での化学結合である必要がない。また、結合は、イオン結合又は水素結合、又は「結合する」実体が物理的に結合したままであるように十分に安定したハイブリダイゼーションに基づくものを示唆する場合がある。

【0223】

二機能性：本明細書で使用される場合、用語「二機能性」は、少なくとも２つの機能を維持することが可能な任意の物質、分子、又は部分を指す。機能は、同じ結果を生じさせてもよく、又は異なる結果を生じさせてもよい。機能を生じさせる構造は、同じであってもよく、又は異なっていてもよい。

【0224】

生体適合性：本明細書で使用される場合、用語「生体適合性」は、傷害、毒性、又は免疫系による拒絶のリスクをほとんど又は全く示さずに、生細胞、組織、器官、又は系と適合することを意味する。

【0225】

生分解性：本明細書で使用される場合、用語「生分解性」は、生物の作用により無害な産物に分解されることが可能であることを意味する。
生物学的に活性な：本明細書で使用される場合、語句「生物学的に活性な」は、生物系及び／又は生物中で活性を有する任意の物質の特徴を参照する。例えば、生物に投与した場合に、その生物に対して生物学的作用を示す物質は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ｓａＲＮＡの一部でさえが、生物学的に活性であるか、又は生物学的に意義が有るとみなされる活性を模倣する場合、生物学的に活性があるとみなすことができる。

【0226】

癌：本明細書で使用される場合、個体の「癌」という用語は、制御されていない増殖、不死、転移能、急速な増殖及び成長速度、及びある特徴的な形態学的特徴等の、癌を引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞が存在することを指す。多くの場合、癌細胞は、腫瘍の形態をしているだろう。しかし、そのような細胞は、個体内に単独で存在してもよく、白血病細胞等の独立した細胞として血流中に循環していてもよい。

【0227】

細胞増殖：本明細書で使用される場合、用語「細胞増殖」は、主に細胞数の増加を伴い、それは、増殖の速度が細胞死（例えば、アポトーシス又はネクローシスによる）の速度よりも速い細胞繁殖（つまり、増殖）により起こり、細胞集団のサイズの増加をもたらすが、その増殖の少部分は、ある環境では個々の細胞の細胞サイズ又は細胞質容積が増加するためであってもよい。したがって、細胞増殖を阻害する作用剤は、対立する２つのプロセス間の平衡が変更されるように、増殖の阻害又は細胞死の刺激のいずれかにより又は両方により、細胞増殖を阻害することができる。

【0228】

細胞タイプ：本明細書で使用される場合、用語「細胞タイプ」は、所与の供給源（例えば、組織、器官）に由来する細胞、又は所与の分化状態にある細胞、又は所与の病理学又は遺伝子構造に関連する細胞を指す。

【0229】

染色体：本明細書で使用される場合、用語「染色体」は、細胞に見出されるＤＮＡ及びタンパク質の組織化構造を指す。
相補的：本明細書で使用される場合、核酸に関する用語「相補的」は、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２本の鎖間、又は相補的であるオリゴヌクレオチプローブと標的との間等の、ヌクレオチド間又は核酸間のハイブリダイゼーション又は塩基対合を指す。

【0230】

症状：本明細書で使用される場合、用語「症状」は、任意の細胞、器官、臓器系、又は生物の状態を指す。症状は、疾患状態、又は単に実体の生理学的症状又は状況を反映していてもよい。症状は、疾患の肉眼的症状等の表現型症状、又はその症状に関連する根本的な遺伝子又はタンパク質発現プロファイル等の遺伝子型症状として特徴付けられてもよい。症状は、良性であってもよく、悪性であってもよい。

【0231】

制御放出：本明細書で使用される場合、用語「制御放出」は、治療結果を達成するための特定のパターンでの放出に従う、医薬組成物又は化合物の放出プロファイルを指す。
細胞増殖抑制：本明細書で使用される場合、「細胞増殖抑」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、又はそれらの組み合わせの増殖、分裂、又は複製を阻害、低減、抑制することを指す。

【0232】

細胞毒性：本明細書で使用される場合、「細胞毒性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、又はそれらの組み合わせを死滅させるか、又は傷害性、毒性、若しくは致命的な効果を引き起こすことを指す。

【0233】

送達：本明細書で使用される場合、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、カーゴ、又はペイロードを送達する行為又は様式を指す。
送達剤：本明細書で使用される場合、「送達剤」は、本発明のｓａＲＮＡの標的細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ送達を、少なくとも部分的に促進するあらゆる物質を指す。

【0234】

不安定化：本明細書で使用される場合、用語「不安定な」又は「不安定化する」又は「不安定化領域」は、同じ領域又は分子の開始野生型又は天然型ほど安定していない領域又は分子を意味する。

【0235】

検出可能な標識：本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」は、エックス線撮影、蛍光、化学ルミネセンス、酵素活性、及び吸光度等を含む当技術分野で知られている方法により直ちに検出される別の実体に結合されている、組み込まれている、又は会合されている１つ又は複数のマーカー、シグナル、又は部分を指す。検出可能な標識としては、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びハプテン等のリガンド、量子ドット等が挙げられる。検出可能な標識は、ペプチド、タンパク質、又はポリヌクレオチド、例えば、本明細書で開示されているｓａＲＮＡの任意の位置に位置していてもよい。検出可能な標識は、Ｎ－末端若しくはＣ－末端又は場合に応じて５’末端若しくは３’末端に位置するアミノ酸、ペプチド、タンパク質、又はポリヌクレオチド内にあってもよい。

【0236】

封入する：本明細書で使用される場合、用語「封入する」は、包囲する、取り囲む、又は包み込むこと指す。
操作される：本明細書で使用される場合、構造的か又は化学的かに関わらず、それらが、開始点、野生型、又は天然分子と異なる特徴又は特性を有するように設計されている場合、本発明の実施形態は、「操作されている」。

【0237】

同等の対象体：本明細書で使用される場合、「同等の対象体」は、例えば、年齢、性別、及び肝臓健康又は癌病期等の健康状態が類似している対象体であってもよく、又は本発明により治療する前の同一の対象体であってもよい。同等の対象体は、本発明によるｓａＲＮＡでの治療を受けない点で「未治療」である。しかしながら、同等の対象体は、従来の抗癌治療を受けてもよいが、ただし、本発明のｓａＲＮＡで治療されている対象体は、同一又は同等の従来の抗癌治療を受ける。

【0238】

エキソソーム:本明細書で使用される場合、「エキソソーム」は、哺乳動物細胞により分泌される小胞である。
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象の１つ又は複数を指す：（１）ＤＮＡ塩基配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写により）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡのポリペプチド又はタンパク質への翻訳；及び（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。

【0239】

特徴：本明細書で使用される場合、「特徴」は、特色、特性、又は特有の要素を指す。
製剤：本明細書で使用される場合、「製剤」は、少なくとも本発明のｓａＲＮＡ及び送達剤を含む。

【0240】

断片：本明細書で使用される場合、「断片」は、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離される全長タンパク質の消化により得られるポリペプチドを含んでいてもよい。

【0241】

機能的な：本明細書で使用される場合、「機能的な」生体分子は、それが特徴とする特性及び／又は活性を示す形態の生体分子である。
遺伝子：本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチド又は前駆体を産生するために必要な制御配列及び最も多くの場合はコード配列を含む核酸配列を指す。しかしながら、遺伝子は、翻訳されなくともよく、その代わりに、制御ＲＮＡ分子又は構造ＲＮＡ分子をコードしてもよい。

【0242】

遺伝子は、植物、真菌、動物、細菌のゲノム又はエピソーム、真核生物、核、又はプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は化学的に合成されたＤＮＡを含む、当技術分野で知られている任意の供給源から、全体が又は一部が由来してもよい。遺伝子は、コード領域、又は発現産物の生物学的活性若しくは化学構造、発現の速度、若しくは発現制御の様式に影響を及ぼし得る非翻訳領域のいずれかに、１つ又は複数の修飾を含有していてもよい。そのような修飾としては、これらに限定されないが、１つ又は複数のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、及び置換が挙げられる。遺伝子は、一続きのコード配列を構成していてもよく、又は適切なスプライスジャンクションにより結合されている１つ又は複数のイントロンを含んでいてもよい。

【0243】

遺伝子発現：本明細書で使用される場合、用語「遺伝子発現」は、核酸配列の転写及びほとんどの場合では翻訳が成功して、タンパク質又はペプチドが産生されるプロセスを指す。明確にしておくが、「遺伝子発現」の測定が言及される場合、測定は、転写の核酸産物、例えばＲＮＡ又はｍＲＮＡの測定であってもよく、又は翻訳のアミノ酸産物、例えばポリペプチド又はペプチドの測定であってもよいことを意味することが理解されるべきである。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、及びペプチドの量又はレベルを測定する方法は、当技術分野で周知である。

【0244】

ゲノム：用語「ゲノム」は、核内ＤＮＡ成分、染色体ＤＮＡ、又は細胞質ＤＮＡ、並びに細胞質ドメイン（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ）を含む生物のＤＮＡ相補体全体を含むことが意図されている。

【0245】

相同性：本明細書で使用される場合、用語「相同性」は、ポリマー分子間の、例えば、核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。幾つかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一又は類似している場合、互いに「相同性」であるとみなされる。用語「相同的」は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列）間の比較を指す。本発明によると、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つの伸長に対して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は更に９９％である場合、相同的であるとみなされる。幾つかの実施形態では、相同的なポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の一意的に指定されるアミノ酸の伸長をコードする能力を特徴とする。長さが６０個ヌクレオチド未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４～５個の一意的に指定されるアミノ酸の伸長をコードする能力により決定される。本発明によると、２つのタンパク質配列は、それらタンパク質が、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つの伸長に対して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％同一である場合、相同的であるとみなされる。

【0246】

用語「過剰増殖性細胞」は、同等の健康細胞（「対照」と呼ばれる場合がある）の増殖速度と比較して、異常に速い速度で増殖しているあらゆる細胞を指すことができる。「同等の健康」細胞は、細胞の正常で健康な対応物である。したがって、「同等の健康」細胞は、例えば、同じ器官に由来する同じタイプの細胞であり、比較細胞と同じ機能（複数可）を果たす。例えば、過剰増殖性肝細胞の増殖は、健康な肝細胞と比較することにより評価されるべきであり、過剰増殖性前立腺細胞の増殖は、健康な前立腺細胞と比較することにより評価されるべきである。

【0247】

「異常に速い」増殖速度とは、同等の健康な（非過剰増殖性の）細胞の増殖速度と比較して、過剰増殖性細胞の増殖速度が、少なくとも２０、３０、４０％、又は少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、又は少なくとも８０％増加することを意味する。また、「異常に速い」増殖速度は、同等の健康な細胞の増殖速度と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、又は少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、又は少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍増加した速度を指してもよい。

【0248】

用語「過剰増殖性細胞」は、本明細書で使用される場合、ほとんどの細胞と比較して、天然でより速い速度で増殖するが、健康細胞である細胞を指さすものではない。生涯にわたって絶えず分割することが知られている細胞の例は、皮膚細胞、胃腸管の細胞、血液細胞、及び骨髄細胞である。しかしながら、そのような細胞は、それらの健康な対応物よりも速い速度で増殖する場合、過剰増殖性である。

【0249】

過剰増殖性障害：本明細書で使用される場合、「過剰増殖性障害」は、上記定義されているような過剰増殖性細胞に関与する任意の障害であってもよい。過剰増殖性障害の例としては、癌等の新生物障害、乾癬性関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患等の胃過剰増殖性障害、乾癬を含む皮膚障害、ライター症候群、毛孔性紅色ひこう疹、及び角質化の変異型過剰増殖性障害が挙げられる。

【0250】

当業者であれば、過剰増殖性細胞を特定する方法を十分に承知している。動物内の過剰増殖性細胞の存在は、Ｘ線、ＭＲＩ、又はＣＴスキャン等のスキャンを使用して特定可能であってもよい。また、ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＭＴＳ、又はＷＳＴ－１アッセイ等の細胞増殖アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試料を培養することにより、過剰増殖性細胞を特定してもよく、又は細胞の増殖をアッセイしてもよい。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖はフローサイトメトリーを使用して決定してもよい。

【0251】

同一性：本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、ポリマー分子間の、例えば、オリゴヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、比較を最適にするために２つの配列をアラインメントすることにより実施することができる（例えば、アラインメントを最適化するために、第１及び第２の核酸配列の一方に又は両方にギャップを導入してもよく、非同一配列を、比較のために無視してもよい）。ある実施形態では、比較のためにアラインメントする配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。その後、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置にあるヌクレオチドと同一のヌクレオチドで占められている場合、それら分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一位置の数の関数である。配列の比較、及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、以下の文献に記載されているもの等の方法を使用して決定することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年；これらの文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、４巻：１１～１７頁）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティは１２、ギャップペナルティは４を用いて決定することができる。或いは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に使用される方法としては、これらに限定されないが、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８巻：１０７３頁（１９８８年）に開示されているものが挙げられる；この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにプログラムされている。２つの配列間の相同性を決定する例示的なコンピューターソフトウェアとしては、これらに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻（１号）、３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３頁（１９９０年））が挙げられる。

【0252】

遺伝子の発現を阻害する：本明細書で使用される場合、語句「遺伝子の発現を阻害する」は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよく、又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであってもよい。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、そこから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡ又はタンパク質を測定するための標準技法を使用して決定することができる。

【0253】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、生物（例えば、動物、植物、又は微生物）内ではなく、人工的環境、例えば、試験管又は反応槽、細胞培養、ペトリ皿等で生じる事象を指す。

【0254】

ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、生物（例えば、動物、植物、若しくは微生物、又はそれらの細胞若しくは組織）内で生じる事象を指す。

【0255】

単離された：本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、それが関連する（自然界の環境又は実験環境に関わらず）成分の少なくとも幾つかから分離された物質又は実体を指す。単離された物質は、それらが関連していた物質に関して様々な純度レベルを有していいてもよい。単離された物質及び／又は実体は、それらが最初に関連していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％又はそれ以上から分離されている。幾つかの実施形態では、単離された作用剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約９９％を超える純度である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分が実質的に存在しない場合、「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」は、化合物が、それが形成又は検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分的な分離としては、例えば、本開示の化合物が豊富に存在する組成物が挙げられる。実質的な分離としては、本開示の化合物又はその塩の、重量で、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％を含有する組成物が挙げられる。化合物及びそれらの塩を単離する方法は、当技術分野で日常的である。

【0256】

標識：用語「標識」は、物質、化合物、又は物体を検出可能にするために、物体に組み込まれる物質又は化合物を指す。
リンカー：本明細書で使用される場合、リンカーは、例えば１０～１，０００個原子の原子団を指し、これらに限定されないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミン等の原子又は基で構成されていてもよい。リンカーは、第１の端部が、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドの核酸塩基又は糖部分に結合され、第２の端部が、ペイロード、例えば検出可能な又は治療用の作用剤に結合されていてもよい。リンカーは、核酸配列への組み込みと干渉しないような十分な長さであってもよい。リンカーは、本明細書に記載のような、ｓａＲＮＡ結合体の形成並びにペイロードの投与等の、任意の有用な目的に使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、これらに限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、又はヘテロシクリルが挙げられ、それらの各々は、本明細書に記載のように、任意選択で置換されていてもよい。リンカーの例としては、これらに限定されないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレン又はプロピレングリコールモノマーユニット、例えばジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、又はテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマー、及びそれらの誘導体が挙げられる。他の例は、リンカー内に、これらに限定されないが、例えば、ジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）又はアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）等の切断可能な部分を含んでおり、それらは、還元剤又は光分解を使用して切断することができる。選択的に切断可能な結合の非限定的な例としては、例えば、ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用して、又は他の還元剤及び／又は光分解により切断することができるアミド結合が挙げられ、並びに例えば、酸性又は塩基性加水分解により切断することができるエステル結合が挙げられる。

【0257】

転移：本明細書で使用される場合、用語「転移」は、原発腫瘍として最初に発生した場所から、体内の遠くの位置へと癌が広がるプロセスを意味する。また、転移は、原発腫瘍の拡散に起因する癌を指す。例えば、乳癌を有する者は、リンパ系、肝臓、硬骨、又は肺に転移を示す場合がある。

【0258】

修飾された：本明細書で使用される場合、「修飾された」は、本発明の分子の変化した状態又は構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的を含む、多くの様式で修飾することができる。１つの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡ分子は、非天然ヌクレオシド及び／又はヌクレオチドの導入により修飾されている。

【0259】

天然：本明細書で使用される場合、「天然」は、人為的な手を加えずに自然界に存在することを意味する。
核酸：本明細書中に使用される場合、用語「核酸」は、１つ又は複数のヌクレオチド、つまりリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はその両方で構成されている分子を指す。この用語は、ポリマーの場合には５’－３’連結により、互いに結合されているリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドのモノマー及びポリマーを含む。リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドのポリマーは、一本鎖であってもよく、又は二本鎖であってもよい。しかしながら、連結は、例えば、５’－３’連結を含む核酸を含む、当技術分野で知られている連結のいずれを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、天然であってもよく、又は天然の塩基対で塩基対関係を形成することが可能な合成的に生成された類似体であってもよい。塩基対関係を形成することが可能な非天然塩基の例としては、これらに限定されないが、アザ及びデアザピリミジン類似体、アザ及びデアザプリン類似体、及び他のヘテロ環式塩基類似体が挙げられ、ピリミジン環の炭素原子及びチッ素原子の１つ又は複数は、ヘテロ原子、例えば酸素、硫黄、セレン、及びリン等により置換されている。

【0260】

患者：本明細書で使用される場合、「患者」は、治療を求めていてもよく、又は治療の必要性があってもよく、治療を必要とし、治療を受けている、治療を受けることになる対象体、又は特定の疾患又は状態について、訓練された専門家によるケアを受けている対象体を指す。

【0261】

ペプチド：本明細書で使用される場合、「ペプチド」は、長さが５０個アミノ酸以下であり、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個アミノ酸である。

【0262】

薬学的に許容される：語句「薬学的に許容される」は、本明細書では、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合い、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは困難なく、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適であり、健全な医学的判断の範囲内にある、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために使用される。

【0263】

薬学的に許容される賦形剤：語句「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されている化合物以外の、患者に実質的に無毒性及び非炎症性であるという特性を有する任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁又は溶解することが可能な媒体）を指す。賦形剤としては、以下のものを挙げることができる：例えば、接着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、薄膜形成剤又はコーティング、香味料、香料、流動促進剤（フローエンハンサー）、潤滑剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤、分散剤、甘味料、及び水和の水。例示的な賦形剤としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトール。

【0264】

薬学的に許容される塩：本開示は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、既存の酸又は塩基部分をその塩形態に変換することにより（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることにより）親化合物が修飾されている、本開示の化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、これらに限定されないが、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩又は有機酸塩、及びカルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩又は有機塩等が挙げられる。代表的な酸付加塩としては、以下のものが挙げられる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩（heptonate）、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩及び、吉草酸塩等。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩としては、以下のものが挙げられる：ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム等、並びにこれらに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンを含む、無毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及びアミン陽イオン等。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、無毒性無機酸又は有機酸から形成される、親化合物の従来の無毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法により塩基性部分又は酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般的に、そのような塩は、水中で、又は有機溶媒中で、又はその２つの混合液中で、これら化合物の遊離酸形態又は遊離塩基形態を、化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させることにより調製することができ、一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５年、１４１８頁、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ及びＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編）、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００８年、及びＢｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６巻、１～１９頁（１９７７年）に見出される。これらの文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0265】

薬学的に許容される溶媒和物：用語「薬学的に許容される溶媒和物」は、本明細書で使用される場合、好適な溶媒の分子が、その結晶格子に組み込まれている本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される用量で生理学的に許容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、又はそられの混合液を含む溶液からの結晶化、再結晶化、又は析出により調製することができる。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、及び安息香酸ベンジル等である。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と呼ばれる。

【0266】

薬理学的効果：本明細書で使用される場合、「薬理学的効果」は、生物又は系が外来性作用剤と接触又は暴露された後で生じる、その生物又は系での測定可能な生物学的現象である。薬理学的効果は、治療、１つ又は複数の症状、診断、予防の改善、及び疾患、障害、状態、又は感染の発症の遅延等の、治療上有効な結果をもたらすことができる。そのような生物学的現象の測定は、定量的、定性的、又は別の生物学的現象との比較であってもよい。定量的測定は、統計的に有意であってもよい。定性的測定は、度合い又は種類であってもよく、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％又はそれ以上以上異なっていてもよい。それらは、存在又は非存在、より良好又はより不良、多い又は少ないとして観察可能であってもよい。外来性作用剤は、薬理学的効果に関する場合、全体的に又は部分的に生物又は系に対して外来性である作用剤である。例えば、野生型生体分子を修飾すると、構造的か又は化学的かに関わらず、外来性作用剤がもたらされるだろう。また、同様に、生物又は系に天然では見出されない化合物、分子、又は物質に野生型分子を組み込むか、又はそれらと野生型分子を組み合わせると、外来性作用剤がもたらされるだろう。本発明のｓａＲＮＡは、外来性作用剤を含む。薬理学的効果の例としては、これらに限定されないが、以下の細胞の増加又は減少等の細胞数の変化が挙げられる：好中球、網状赤血球、顆粒球、赤血球（赤血球細胞）、巨核球、血小板、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、小神経膠細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、又は網状赤血球。また、薬理学的効果としては、血液化学、ｐＨ、ヘモグロビン、ヘマトクリットの変化、これらに限定されないが、肝酵素ＡＳＴ及びＡＬＴ等の酵素レベルの変化、脂質プロファイル、電解質、代謝マーカー、ホルモン、又は当業者に知られている他のマーカー若しくはプロファイルの変化が挙げられる。

【0267】

物理化学的：本明細書で使用される場合、「物理化学的」は、物理的な及び／又は化学的な特性を意味するか又は関する。
予防：本明細書で使用される場合、用語「予防」は、感染、疾患、障害、及び／又は状態の発症を部分的に又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／又は状態の１つ又は複数の症状、特徴、又は臨床徴候の発症を部分的に又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／又は状態の１つ又は複数の症状、特徴、又は徴候の発症を部分的に又は完全に遅延させること；感染、特定の疾患、障害、及び／又は状態からの進行を部分的に又は完全に遅延させること；及び／又は感染、疾患、障害、及び／又は状態と関連する病理が発生するリスクを減少させることを指す。

【0268】

プロドラッグ：また、本開示は、本明細書に記載した化合物のプロドラッグを含む。本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」は、その物質、分子、又は実体が、化学的又は物理的に変更されると治療剤として作用することになる形態のあらゆる物質、分子、又は実体を指す。プロドラッグは、共有結合で結合されていてもよく、又はある様式で隔離されていてもよく、哺乳類対象体への投与前、投与時、又は投与後に放出されるか、又は活性薬物部分へと変換される。プロドラッグは、日常的な操作で又はｉｎ ｖｉｖｏでのいずれかで修飾が切断されて、親化合物になるように、化合物に存在する官能基を修飾することにより調製することができる。プロドラッグとしては、ヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、又はカルボキシル基が、哺乳動物対象体に投与されると、切断されて、それぞれ遊離ヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、又はカルボキシル基を形成する任意の基に結合されている化合物が挙げられる。プロドラッグの調製及び使用は、以下の文献で考察されている：Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ、「Ｐｒｏ－ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓの１４巻、及びＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；この文献は両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる。

【0269】

予後：本明細書で使用される場合、用語「予後」は、特定の生物学的事象が、将来、生じることになる、又は生じる可能性が非常に高いと宣言又は主張することである。
進行：本明細書で使用される場合、用語「進行」又は「癌進行」は、疾患又は状態が進行すること、又は疾患又は状態に向かって悪化することを意味する。

【0270】

増殖する：本明細書で使用される場合、用語「増殖する」は、成長、拡大、若しくは増加すること、又は急速に成長、拡大、又は増加することを意味する。「増殖性」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に、対抗するか又は不適切である特性を有することを意味する。

【0271】

タンパク質：「タンパク質」は、ペプチド結合によって共に結合されているアミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。しかしながら、タンパク質は、典型的には、長さが少なくとも５０個アミノ酸であろう。幾つかの例では、コードされたタンパク質は、約５０個アミノ酸よりも小さい。この場合、このポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。タンパク質が短いペプチドである場合、それは、長さが少なくとも約１０個アミノ酸残基であろう。タンパク質は、天然、組換え、又は合成であってもよく、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。また、タンパク質は、天然タンパク質又はペプチドの断片を含んでいてもよい。タンパク質は、単一分子であってもよく、又は多分子複合体であってもよい。また、タンパク質という用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーに該当する場合がある。

【0272】

タンパク質発現：用語「タンパク質発現」は、検出可能なレベルのアミノ酸配列又はタンパク質が発現されるように、核酸配列が翻訳されるプロセスを指す。
精製された：本明細書で使用される場合、「精製する」「精製された」「精製」は、不要な成分、物質汚染、混合物、又は欠陥物から実質的に純粋な又は清浄なものにすることを意味する。

【0273】

退縮：本明細書で使用される場合、用語「退縮」又は「退縮度」は、表現型又は遺伝子型のいずれかでの、癌進行の反転を指す。癌進行を遅延又は停止させることは、退縮とみなすことができる。

【0274】

試料：本明細書で使用される場合、用語「試料」又は「生体試料」は、その組織、細胞、又は構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、及び精液を含むが、それらに限定されない体液）のサブセットを指す。試料としては、生物全体、又は例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外部区画、呼吸器、腸、及び尿生殖器管、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含むが、それらに限定されないその組織、細胞、若しくは構成部分のサブセット又はそれらの画分若しくは部分から調製されたホモジネート、溶解産物、又は抽出物が、更に挙げられる。更に、試料は、タンパク質又は核酸分子等の細胞成分を含有していてもよい、栄養ブロス又はゲル等の培地を指す。

【0275】

シグナル配列：本明細書で使用される場合、語句「シグナル配列」は、タンパク質の輸送又は局在化を指図することができる配列を指す。
単一単位用量：本明細書で使用される場合、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点で、つまり単一投与事象で投与される任意の治療剤の用量である。

【0276】

類似性：本明細書で使用される場合、用語「類似性」は、ポリマー分子間の、例えば、核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の相互の類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算では、当技術分野で理解されているような保存的置換が考慮されている以外は、同一性パーセントの計算と同じ様式で実施することができる。

【0277】

分割用量：本明細書で使用される場合、「分割用量」は、単一単位用量又は総１日用量を２つ以上の用量に分割することである。
安定的：本明細書で使用される場合、「安定的」は、反応混合物から有用な程度の純度へと単離することに耐えるほど十分にロバストであり、好ましくは、効果的な治療剤へと製剤化することが可能である化合物を指す。

【0278】

安定化された：本明細書で使用される場合、用語「安定化する」「安定化された」「安定化領域」は、安定的する又は安定的になることを意味する。
対象体：本明細書で使用される場合、用語「対象体」又は「患者」は、本発明による組成物を、例えば、実験、診断、予防、及び／又は治療目的で投与することができる、任意の生物を指す。典型的な対象体としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒト等の哺乳動物）及び／又は植物が挙げられる。

【0279】

実質的に：本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、目的の特徴又は特性の完全な又はほぼ完全な程度又は度合いを示す質的状態を指す。生物学的技術分野の当業者であれば、生物学的な及び化学的な現象は、たとえあったとしても、ほとんどは完全には終了せず、及び／又は完璧には進行せず、又は絶対的な結果を達成若しくは回避しないことを理解するだろう。したがって、用語「実質的」は、本明細書では、多くの生物学的な及び化学的な現象に本来的な完全性の潜在的な欠如に留意するために使用される。

【0280】

実質的に等しい：本明細書で使用される場合、この用語は、投与間の時間的差異に関する際には、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：本明細書で使用される場合、この用語は、複数回の投与に関する際には、２秒以内を意味する。

【0281】

～を罹患する：疾患、障害、及び／又は状態を「罹患している」個体は、疾患、障害、及び／又は状態であると診断されているか、又はそれらの１つ若しくは複数の症状を提示している。

【0282】

～に感受性：疾患、障害、及び／又は状態に「感受性」である個体は、疾患、障害、及び／又は状態であると診断されていないか、及び／又は疾患、障害、及び／又は状態の症状を示していなくともよいが、疾患又はその症状を発症する傾向を内包する。幾つかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態（例えば、癌）に感受性である個体、下記の１つ又は複数を特徴としていてもよい：（１）疾患、障害、及び／又は状態の発症に関連する遺伝子突然変異；（２）疾患、障害、及び／又は状態の発症に関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、及び／又は状態に関連するタンパク質及び／又は核酸の発現及び／又は活性の増加及び／又は減少；（４）疾患、障害、及び／又は状態の発症に関連する習慣及び／又はライフスタイル；（５）疾患、障害、及び／又は状態の家族歴；並びに（６）疾患、障害、及び／又は状態の発症に関連する微生物との接触及び／又は感染。幾つかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態に感受性である個体は、疾患、障害、及び／又は状態を発症するだろう。幾つかの実施形態では、疾患、障害、及び／又は状態に感受性である個体は、疾患、障害、及び／又は状態を発症しないだろう。

【0283】

持続放出：本明細書で使用される場合、用語「持続放出」は、特定の期間にわたってある放出速度に従う医薬組成物又は化合物の放出プロファイルを指す。
合成：用語「合成」は、人の手で生成、調製、及び／又は製造することを指す。本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド又は他の分子の合成は、化学的であってもよく、又は酵素的であってもよい。

【0284】

標的細胞：本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、任意の１つ又は複数の目的細胞を指す。細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ｉｎ ｓｉｔｕで、又は生物の組織若しくは器官で見出される。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、及び最も好ましくは患者であってもよい。

【0285】

治療剤：用語「治療剤」は、対象体に投与した際に、治療的、診断的、及び／又は予防的な効果を示し、並びに／又は所望の生物学的及び／若しくは薬学的効果を誘発する任意の作用剤を指す。

【0286】

治療上有効な量：本明細書で使用される場合、用語「治療上有効な量」は、感染、疾患、障害、及び／又は状態を罹患しているか又は感受性がある対象体に投与した際に、その感染、疾患、障害、及び／又は状態を治療、症状を改善、診断、予防し、及び／又は発症を遅延させるのに十分な、送達される作用剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断薬、予防薬等）の量を意味する。

【0287】

治療上有効な結果：本明細書で使用される場合、用語「治療上有効な結果」は、感染、疾患、障害、及び／又は状態を罹患しているか又は感受性がある対象体において、その感染、疾患、障害、及び／又は状態を治療、症状を改善、診断、予防し、及び／又は発症を遅延させるのに十分な結果を意味する。

【0288】

総１日用量：本明細書で使用される場合、「総１日用量」は、２４時間に与えられる又は処方される量である。総１日用量は、単一単位用量として投与されてもよい。
転写因子：本明細書で使用される場合、用語「転写因子」は、例えば、転写の活性化又は抑制により、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質を指す。幾つかの転写因子は、単独で転写の制御を達成するが、他の転写因子は、他のタンパク質と協調して作用する。幾つかの転写因子は、ある条件下では転写の活性化及び抑制を両方とも達成することができる。一般的には、転写因子は、特定の標的配列、又は標的遺伝子の制御領域の特定のコンセンサス配列に高度に類似した配列に結合する。転写因子は、単独で又は他の分子との複合体で、標的遺伝子の転写を制御することができる。

【0289】

治療：本明細書で使用される場合、用語「治療」は、特定の感染、疾患、障害、及び／又は状態の１つ又は複数の症状又は特徴を部分的に又は完全に、緩和、寛解、改善、軽減、発症を遅延、進行を阻害、重症度を低減、及び／又は発生を低減することを指す。例えば、癌を「治療する」は、腫瘍の生存、増殖、及び／又は拡散を阻害することを指すことができる。治療は、疾患、障害、及び／又は状態の徴候を示していない対象体に、及び／又は疾患、障害、及び／又は状態の初期徴候を示しているに過ぎない対象体に、その疾患、障害、及び／又は状態に関連する病理の発症リスクを減少させるために施してもよい。

【0290】

語句「治療方法」又はそれと同等の語句は、例えば癌に適用される場合、個体の癌細胞の数を低減、除去、若しくは予防するか、又は癌の症状を緩和することを目的とする手順又は治療計画を指す。癌又は別の増殖性疾患を「治療する方法」は、癌細胞又は他の障害が、実際に完全に除去されることになること、細胞又は障害の数が実際に低減されることになること、又は癌又は他の障害の症状が実際に緩和されことになることを必ずしも意味しない。多くの場合、癌を治療する方法は、成功の可能性が低い場合でさえ実施されることになるが、個体の病歴及び推定余命を考慮した場合、それにもかかわらず全体的に有益な治療計画であるとみなされる。

【0291】

腫瘍増殖：本明細書で使用される場合、用語、「腫瘍増殖」又は「腫瘍転移増殖」は、別様の指定がない限り、腫瘍学で一般的に使用されている通りに使用される。この用語は、主に腫瘍細胞増殖の結果として増加する腫瘍又は腫瘍転移の質量又は容積に主に関する。

【0292】

腫瘍量：本明細書で使用される場合、用語「腫瘍量」は、対象体が有する、直径が３ｍｍを超える腫瘍小結節全ての総腫瘍容積を指す。
腫瘍容積：本明細書で使用される場合、用語「腫瘍容積」は、腫瘍のサイズを指す。腫瘍容積（ｍｍ^３）は、式：容積＝（幅）^２×長さ／２により計算される。

【0293】

未修飾：本明細書で使用される場合、「未修飾」は、任意の様式で変更される前の任意の物質、化合物、又は分子を指す。未修飾は、いつもそうとは限らないが、生体分子の野生型又は天然型を指す。分子は、一連の修飾を受けている場合があり、それにより各修飾分子は、その後の修飾の「未修飾」開始分子としての役目を果たす場合がある。

【0294】

均等物及び範囲
当業者であれば、単なる日常的な実験作業を使用して、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態の多数の均等物があることを認識することになるか又は確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることが意図されておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に示されている通りである。

【0295】

請求項では、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」等の冠詞は、状況と矛盾することが示されない限り、又は状況から明らかにそうではないと示されない限り、１つ又は複数を意味する。群の１つ又は複数のメンバー間に「又は」を含む請求項又は記載は、状況と矛盾することが示されない限り、又は状況から明らかにそうではないと示されない限り、その群のメンバーの１つ、２つ以上、又は全てが、所与の産物又はプロセスに存在するか、使用されるか、又はそうでなければ関連している場合、満たされるとみなされる。本発明は、群の厳密に１つのメンバーが、所与の産物又はプロセスに存在するか、使用されるか、又はそうでなければ関連している実施形態を含む。本発明は、群のメンバーの２つ以上又は全てが、所与の産物又はプロセスに存在するか、使用されるか、又はそうでなければ関連している実施形態を含む。

【0296】

また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包含的であることが意図されており、追加の要素又はステップの包含を許容することが留意される。
範囲が示されている場合、終点が含まれる。更に、別様の指定がない限り、又は状況から及び当業者の理解から明らかにそうではないと示されない限り、範囲として表わされている値は、本発明の様々な実施形態に提示されている範囲内のあらゆる特定の値又は部分範囲を、状況が明白にそうではないと示さない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで想定することができることが理解されるべきである。

【0297】

加えて、従来技術内に入る本発明のあらゆる特定の実施形態は、請求項の任意の１つ又は複数から明示的に除外される場合があることが理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者に知られているとみなされるため、排除が本明細書に明示的に示されなくとも、それらは除外される場合がある。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸又はそれによりコードされるタンパク質；任意の生産方法；任意の使用方法；等）は、従来技術の存在に関するか否かに関わらず、任意の１つ又は複数の請求項から理由の如何に関わらず除外することができる。

【0298】

引用源、例えば文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び本明細書で引用した技術は全て、引用時に明示的に表記されていない場合でも、参照により本出願に組み込まれる。引用源及び本出願の記載が矛盾する場合、本出願の記載が優先するものとする。

【0299】

本発明は、以下の非限定的な例により更に例示される。
実施例
物質及び手順：
ＨｅｐＧ２及びラット肝臓上皮細胞株へのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのトランスフェクション
ＨｅｐＧ２は、既知の肝臓指向性ウイルス因子を含まない、多種多様な肝臓特異的代謝機能に関与する遺伝子を発現するヒト肝芽腫に由来する肝細胞株である。ＨｅｐＧ２細胞を、１００単位／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン（ＳＩＧＭＡ社）、及び１０％ウシ胎仔血清（ＬＡＢＴＥＣＨ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社）で補完されたロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）で培養した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションの場合、細胞を２４ウェルプレートで６０％の集密度まで増殖させてから、製造業者のプロトコールに従ってナノフェクタミン（ＰＡＡ社、英国）を使用して、５、１０、及び２０ｎｍｏｌのｓａＲＮＡをトランスフェクションした。このプロセスを１６時間の間隔で３回繰り返してから、ｍＲＮＡ分析用に全ＲＮＡを分離するために細胞を回収した。

【0300】

アルブミンＥＬＩＳＡ
ラット肝臓上皮細胞及びＨｅｐＧ２細胞を、活性炭処理ＦＣＳの存在下で無フェノールレッドＲＰＭＩ培地にて培養した。８時間、１６時間、及び２４時間の３セットのｓａＲＮＡトランスフェクション後、製造業者の説明書に従って、全マウスアルブミンＥＬＩＳＡ（ＡＳＳＡＹ ＭＡＸ、ＡＳＳＡＹ ＰＲＯ社 米国）のために、培養培地を収集した。

【0301】

ＷＳＴ－１アッセイ
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションの１６、２４、及び９６時間後に、製造業者のガイドライン（ＲＯＣＨＥ社、英国）に従ってＷＳＴ－１試薬を使用して、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ発現分析を行うことにより、細胞増殖を定量化した。簡潔に述べると、ＷＳＴ－１試薬を、１：１００希釈でプレートに使用し、１時間インキュベートした。酵素反応を、ＢＩＯ－ＴＥＫ ＥＬＩＳＡ測定機を使用して、４５０ｎｍで測定した。

【0302】

細胞株からの全ＲＮＡの分離
細胞株からの全ＲＮＡ抽出は、製造業者の説明書に従ってＲＮＡＱＵＥＯＵＳ－ＭＩＣＲＯキット（ＡＭＢＩＯＮ社、英国）を使用して実施した。簡潔に述べると、細胞を、溶解緩衝液（ＡＭＢＩＯＮ社、英国）中で出力３にて３回パルスで超音波処理した後、穏やかに遠心分離した。その後、細胞溶解産物を、ＲＮＡ結合カラムを通して処理し、その後、複数回洗浄して溶出した。単離した全ＲＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ ２０００分光光度計で定量化した。５００ｎｇの全抽出ＲＮＡを処理してゲノムＤＮＡを除去してから、ＱＩＡＧＥＮ社製のＱＵＡＮＴＩＴＥＣＴ（登録商標）逆転写キットを使用して逆転写を行った。

【0303】

動物実験
以前に記載されている臨床的に意義のあるラット肝腫瘍モデルを使用した［Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１６巻、１６８１～１６８７頁（２００８年）、この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる］。ｉｎ ｖｉｖｏ治療の場合、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、１００ｕｌのＴＥＡコアＰＡＭＡＭデンドリマー（Ｃｅｎｔｒｅ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｉｒｅ ｄｅ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ｄｅ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、１３２８８ マルセイユ、フランス）で再構成した。第１週では、尾静脈注射により３×用量で１０匹の硬変症動物を処置した。対照動物（ｎ＝１０）には、等容積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はスクランブル－ｓａＲＮＡを注射した。動物は全て、全米科学アカデミーが準備し、国立衛生研究所により出版された「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ刊行物８６－２３、１９８５年改訂）に概説されている基準に従って人道的に取り扱った。以下の配列のスクランブル－ｓａＲＮＡを使用した：
スクランブルｓａＲＮＡ＿ＳＳ：ＡＣＵＡＣＵＧＡＧＵＧＡＣＡＧＵＡＧＡＵＵ （配列番号３３）
スクランブルｓａＲＮＡ＿ＡＳ：ＵＣＵＡＣＵＧＵＣＡ－ＣＵＣＡＧＵＡＧＵＵ （配列番号３４）
遺伝子マイクロアレイプロファイル
ヒト肝臓癌ＲＴ^２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ社、ジャーマンタウン、メリーランド州）を使用して、肝細胞癌の進行に関与する８４個の重要遺伝子の発現をプロファイルした。偏りのない逆転写を行うためのランダム六量体及びオリゴ－ｄＴプライマーを使用し、ＲＴ^２ Ｆｒｉｓｔ Ｓｔｒａｎｄキット（ＱＩＡＧＥＮ社、ジャーマンタウン、メリーランド州）を用いて、５００ｎｇの精製ＲＮＡを１５分間逆転写した。その後、ファーストストランド（Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ）で合成したｃＤＮＡを、アレイプレートに移し、７９００ＨＴ型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製リアルタイムサイクラーで、ＲＴ^２ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＲＯＸ（商標）ｑＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ社、ジャーマンタウン、メリーランド州）を使用し、９５℃で１０分間の１サイクル及び４０サイクル（９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間）で増幅し、蛍光データを収集した。各ウェルの閾値サイクル（Ｃ_Ｔ）を、手作業で算出し、データ分析用にエクスポートし、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓアレイ専用データ分析ソフトウェア（ＱＩＡＧＥＮ社、ジャーマンタウン、メリーランド州）を使用してクラスタリングした。

【0304】

腫瘍量の評価
処置後の腫瘍進行を評価するために、処置動物は全て、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを注射した１週間後に死亡させた。体重、肝臓、肺、及び脾臓を計量し、臓器全ての様子を記録した。動物を死亡させた後、肝葉を全て速やかに取り出して計量し、５ｍｍ切片の肝臓表面にある肉眼で視認できる小結節全ての直径を測定した。腫瘍量は、＞３ｍｍの直径を有する腫瘍小結節全ての総容積で評価した。

【0305】

実施例１．肝硬変及びＨＣＣの治療におけるＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの治療効果
追加の実験手順は、２０１３年８月８日のＨｅｐａｔｏｌｏｇｙに発表されたＲｅｅｂｙｅらの受理原稿に見出すことができる。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0306】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞でのＣ／ＥＢＰα及びアルブミンの発現レベル
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションのＣ／ＥＢＰα及びアルブミンの転写物レベルに対する効果を評価した。Ｃ／ＥＢＰαを標的とする以下のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ二本鎖（センス／アンチセンス）をこの研究に使用した：
ＡＷ１センス鎖：ＣＧＧＵＣＡＵＵＧＵＣＡＣＵＧＧＵＣＡ（配列番号１）
ＡＷ１アンチセンス鎖：ＵＧＡＣＣＡＧＵＧＡＣＡＡＵＧＡＣＣＧ（配列番号２）
ｓａＲＮＡ分子の特性は、以下の通りである。

【0307】

【表5】

【0308】

２０ｎＭ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡをトランスフェクションすると、Ｃ／ＥＢＰα転写物（図３Ａ）及びアルブミンｍＲＮＡ転写物（図３Ｂ）は両方とも、２倍超に増加した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ（５、１０、及び２０ｎＭ）用量の量を増加させると、それに依存してＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡ転写物レベル（図３Ｃ）が増強された。アルブミンの最大発現は、５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで達成され、より高いｓａＲＮＡレベルでは、更なる用量依存的増加は見られなかった（図３Ｄ）。Ｃ／ＥＢＰαのプロモーター領域（図３Ｅ）、アルブミンプロモーター（アルブミンＤ－ボックス）結合タンパク質（ＤＢＰ）（図３Ｆ）及びアルブミン（図３Ｇ）の結合ボックスを分析すると、コアＣ／ＥＢＰα結合モチーフ（ＧＣＡＡＴ）の存在が示された。また、ＥＰＩＴＥＣＴ（商標）メチルＰＣＲアッセイは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのトランスフェクション後に、Ｃ／ＥＢＰＡプロモーター及びＤＢＰプロモーターの両方のＣｐＧ島でメチル化が低減されたことを示した（図４Ａ及び図４Ｂ）。

【0309】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションＨｅｐＧ２細胞でのアルブミンｍＲＮＡ転写物増加の生物学的な意義を決定するために、ヒトアルブミン特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施した。分泌アルブミンペプチドが、トランスフェクション細胞の培養培地で検出された（図４Ｃ）。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡによるＨｅｐＧ２細胞でのアルブミン分泌の増強が、他の肝細胞特異的機能及び肝細胞分化の維持にも影響を及ぼしたか否かを確立するために、オルニチン回路酵素オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）及びアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現レベルを、ｍＲＮＡ転写物レベルの測定により、各々測定した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＯＴＣ発現レベルの増加を引き起こし（図４Ｄ）、尿素産生の能力向上を示唆した。減少したＡＦＰの発現レベル（図４Ｅ）は、正常な肝細胞で典型的に観察される負の調節を示している。上述の遺伝子発現変化の観察に加えて、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが、ＨｅｐＧ２細胞増殖の著しい下方制御を引き起こしたことも観察された（図４Ｆ）。この観察は、Ｃ／ＥＢＰαの既知の抗増殖効果と一致する。

【0310】

肝硬変／肝細胞癌（ＨＣＣ）を坦持する雄ウィスターラットにＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを静脈内注射すると、アルブミンの循環レベルの増加、肝機能の回復、及び腫瘍量の低減が促進された。

【0311】

Ｃ／ＥＢＰα－ＲＮＡを、静脈内送達用に、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーに組み込んだ。これをＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーと呼ぶ。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの安定性は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置マウスに由来する血液試料を使用して、ヌクレアーゼ活性アッセイを実施することにより、まず循環血清中で試験した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ二本鎖の安定性の著しい低減が４８時間までに観察された（図５Ａ及び図５Ｂ）。したがって、硬変症ラットには、１週間の期間にわたって、２００ｕＬの０．１ｎｍｏｌ／ｕＬ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを反復用量で注射した。標準用量は、５０ｕＬの第５世代トリエタノールアミン（ＴＥＡ）－コアＰＡＭＡＭデンドリマー及び１００ｕＬの無ＲＮａｓｅ／Ｄｎａｓｅ水と混合した５０ｕＬの２０ナノモルＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで製作した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの濃度は、０．１ｎｍｏｌ／ｕＬだった。

【0312】

循環アルブミンの測定は、２００ｕＬの０．１ｎｍｏｌ／ｕＬ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの３用量を注射した後、ＰＢＳ対照群又スクランブル－ｓａＲＮＡ－デンドリマー対照群と比較して、３０％を超える有意な増加を示した（図５Ｃ）。更なる血液分析は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー処置群のビリルビンレベルが、両対照群と比較して、少なくとも１７％有意により低かったことを示した（図５Ｄ）。また、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー処置群では、両対照群と比較して、それぞれ少なくとも１０％及び３０％だけ、肝酵素アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルが有意に低下した（図５Ｅ及び図５Ｆ）。肝臓の組織学的検査は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー注射ラットの腫瘍小結節が、両対照群と比較して有意に減少したこと示した（図６Ａ及び図６Ｂ）。これらの結果は、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ－ｐ）の胎盤形態を染色したＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置ラット肝臓に由来する組織切片の免疫組織学研究と一致した。独立した分析は、ＰＢＳ対照群又はスクランブル－ｓａＲＮＡ－デンドリマー対照群と比較して、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーによる処置により発癌が低減された証拠があることを示唆した。更に、ＰＢＳ対照群、スクランブル－ｓａＲＮＡ－デンドリマー処置群、又はＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー処置群間には、肝線維症に差異はなかった（図６Ｃ）。対照群のＧＳＴ－ｐ陽性染色の平均密度は、７０（±５．０％）であり、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー注射ラットの平均密度は、３２（±６．５％）だった。ＧＳＴ－ｐの過剰発現は、ラット肝臓の前腫瘍状態及び悪性形質転換中に観察されるため、このデータは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー処置がこのプロセスを低減することができることを示唆する。

【0313】

各群７匹の動物の肝生検から抽出された全ＲＮＡを、アルブミン（図７Ａ）、Ｃ／ＥＢＰα（図７Ｂ）、肝細胞核内因子４－アルファ（ＨＮＦ４α）（図７Ｃ）、及び肝細胞核内因子１－アルファ（ＨＮＦ１α）（図７Ｄ）のｍＲＮＡ転写物レベルについてスクリーニングした。ｍＲＮＡレベルの有意な増加が、全ての因子で観察された。これは、肝細胞分化におけるＨＮＦ４αの役割、並びにアルブミン発現の促進におけるＣ／ＥＢＰα及びＨＮＦ１αの役割と一致した。まとめると、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のｍＲＮＡレベルがより低く（図７Ｅ）、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＤ１）（図７Ｆ）及びプラスミノーゲン（図７Ｇ）のレベルが増加したことは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーで処置した硬変症ラットの肝機能が改善したことを示唆した。したがって、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡによる処置は、癌治療に有用であることを示すだけでなく、肝臓の臓器機能の改善も示している。

【0314】

経路遺伝子マイクロアレイ分析は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが、腫瘍抑制遺伝子の上方制御に寄与し、遺伝子の下方制御が肝臓癌に関与することを示唆する。
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡに応答して影響を受ける可能性のある他の肝臓特異的因子を調査するために、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションＨｅｐＧ２細胞における、一群の８４個の肝臓癌特異的遺伝子の遺伝子発現プロファイル（ＱＩＡＧＥＮ／ＳＡＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社製ヒト肝臓癌ＲＴ^２ ＰＲＯＦＩＬＥＲ（商標））を分析した（図８）。特に興味深いことに、２０個の遺伝子で上方制御が観察された（表５）。それらのうちの１８個は、網膜芽細胞腫（ＲＢ）を含むＨＣＣの既知腫瘍抑制遺伝子である（表７）。最も著しく上方制御された（３倍を超える）ものとしては、デスアゴニスト遺伝子ＢＨ３相互作用ドメイン（ＢＩＤ）、及びｐ５３をコードする腫瘍タンパク質５３遺伝子（ＴＰ５３）があった。ＢＩＤは、ＢＣｌ２結合Ｘタンパク質（ＢＡＸ）と相互作用し、ひいては野生型ｐ５３により上方制御され、ＤＮＡの損傷に応答して細胞周期停止及びアポトーシスを制御する。下方制御された遺伝子は、表６に示されている。

【0315】

【表6】

【0316】

【表7-1】

【0317】

【表7-2】

【0318】

【表7-3】

【0319】

成長停止及びＤＮＡ損傷誘導性４５ベータ（ＧＡＤＤ４５Ｂ）も上方制御されたが、これは、細胞増殖制御に関連する成長停止ＤＮＡ損傷誘導性遺伝子ファミリーのメンバーであり、ｐ５３と共にＨｅｐＧ２細胞の肝保護を誘導する。肝臓癌欠失１（ＤＬＣ１）遺伝子は、細胞増殖及び成長を阻害し、並びにアポトーシスを誘導するヒト肝臓癌の腫瘍抑制因子として報告されている。このデータは、ＤＬＣ１が、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションＨｅｐＧ２細胞では上方制御されることを示唆する（表７）。

【0320】

【表8】

【0321】

Ｒｕｎｔ関連転写因子３（ＲＵＮＸ３）は、転写因子のＲｕｎｔドメインファミリーのメンバーであり、ＨＣＣにおいて頻繁に観察されており、その発現は、周囲の正常組織よりも著しく低い。ＲＵＮＸ３の異所的発現は、ＨＣＣ細胞での上皮間葉転換（ＥＭＴ）を反転させるため、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションＨｅｐＧ２細胞では、ＲＵＮＸ３の上方制御（表６）、及びＥＭＴに関与する４つの遺伝子の下方制御も観察された。それらには、ＣＴＮＢ１（β－アテニン（β-atenin）をコードする）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スモールボディサイズマザーデカペンタプレジック相同体７（ＳＭＡＤ７、Small body size mothers against decapentaplegic homolog 7）、及び形質転換因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）が含まれていた（表８）。

【0322】

サイトカインシグナル伝達抑制因子３（ＳＯＣＳ３）も検出された。ＳＯＣＳ３は、サイトカインシグナル伝達の負の制御因子として機能するＳＴＡＴ誘導性ＳＴＡＴ阻害因子（ＳＳＩ）のメンバーである。ＳＯＣＳ３発現の減少は、ＨＣＣでのＳＴＡＴ３のリン酸化増加と相関している。更に、ＳＯＣＳ３は、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、並びにＸＩＡＰ、サバイビン（ＢＩＲＣ５）、及び骨髄性白血病細胞分化タンパク質（ＭＣＬ１）を含む抗アポトーシス遺伝子の負の制御に関与すると考えられている。ここで、ＳＯＣＳ３発現の著しい増加（表７）、並びにＳＴＡＴ３、ＣＣＮＤ１、ＸＩＡＰ、ＢＩＲＣ５、及びＭＣＬ１発現の著しい減少（表８）が観察された。また、アレイデータにより、ＧＳＴＰ１発現の下方制御が確認された（表８）。

【0323】

全体として、下方制御された遺伝子は、アポトーシス及び細胞死の負の制御（ジーンオントロジー（ＧＯ）ターム ＧＯ：００４３０６６及びＧＯ：００６０５４８；ｐ値 それぞれ２×１０^－９及び２×１０^－９）と関連する機能が強く強化され、上方制御された遺伝子は、細胞分化の正の制御（ＧＯ：００４５５９７；ｐ＝５×１０^－３）に関連する機能が強化された。結果的に、このデータは、Ｃ／ＥＢＰαのレベル及びシグナルの制御が、肝臓癌中の治療介入点であり得ることを示唆する。

【0324】

【表9-1】

【0325】

【表9-2】

【0326】

ＨｅｐＧ２へのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのトランスフェクションは、ＨｅｐＧ２細胞のＳＴＡＴ３、ＩＬ６Ｒ、及びｃＭｙｃを抑制する。
以前に発表されている報告によると、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）は、シグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）を直接活性化し、ひいてはｃ－Ｍｙｃの発現を上方制御することにより肝臓発癌を促進することが示されている。これら３つの遺伝子のＣｈＩＰ－Ｓｅｑ分析により、それらのプロモーター領域内にＣ／ＥＢＰα結合部位が存在することが示されたため（図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃ）、本発明者らは、ＨｅｐＧ２細胞へのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのトランスフェクションが、これら３つの因子の発現レベルに影響を及ぼすことになるか否かを調査した。

【0327】

非トランスフェクション細胞と比較して、ＳＴＡＴ３（図９Ｄ）、ｃＭｙｃ（図９Ｅ）、及びＩＬ６Ｒ（図９Ｆ）のｍＲＮＡレベルの有意な低減が観察された。ＨｅｐＧ２細胞を、２０ｎＭ終濃度のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ又はスクランブル－ｓａＲＮＡのいずれかでトランスフェクションした。３セットのトランスフェクション後、細胞を回収して、全ＲＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを除去した。ｍＲＮＡを逆転写した後、定量ＰＣＲ分析を実施して、ＳＴＡＴ３、ＭＹＣ、及びＩＬ６Ｒの転写物レベルを検出した。この遺伝子低減傾向は、本発明者らの上述の遺伝子発現アレイにおいてＭＹＣ及びＳＴＡＴでも観察された（表５）。ＳＴＡＴ３（図１０Ａ）、ＭＹＣ（図１０Ｂ）、及びＩＬ６Ｒ（図１０Ｃ）のプロモーター領域にあるＣｐＧ島のメチル化状態を、ＥＰＩＴＥＣＴ（商標）メチルＩＩ ＰＣＲアッセイ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用して評価すると、３つの遺伝子全てのプロモーターでメチル化状態の増加が検出された。また、ウエスタンブロットにより、残基７０５及び７２７でのＳＴＡＴ３のリン酸化ス状態の低減、及びＩＬ６Ｒのタンパク質レベルの低減が確認された（図１０Ｄ）。まとめると、Ｃ／ＥＢＰαのｉｎ ｖｉｖｏ送達は、硬変症／ＨＣＣ状況での肝機能支援及び異常な細胞増殖の減少に正の効果を示すことができることが示された。

【0328】

要約すると、Ｃ／ＥＰＢαの周知の抗増殖効果を、臨床的に意義のある硬変症／ＨＣＣモデルで確認した。Ｃ／ＥＰＢαが、細胞増殖を制御するＣ／ＥＰＢαの既知標的の制御に加えて、多数の他の癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子を標的とすることを、肝臓癌特異的遺伝子アレイを使用して示した。したがって、Ｃ／ＥＰＢα－ｓａＲＮＡの調節は、肝臓癌を治療するために、転写レベルで非常に大きな効果を示すことができる。現在、手術、化学療法、放射線療法、及び生物学的製剤等のほとんどの治療分野は、多かれ少なかれ肝機能障害の減少を伴う。ここで示されたデータは、肝臓癌細胞の標的化に新しい手法を提供する。

【0329】

実施例２．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー遺伝子発現分析
Ｈｕｈ７肝細胞株でのＣ／ＥＢＰα発現を、対照、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ単独、様々なデンドリマー、及び様々なＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ：デンドリマー比のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを用いて試験した。臨床等級のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡをトランスフェクションに使用した。図１１の結果は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現が、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーでのみ増加したことを示す。

【0330】

実施例２ｂ．ｓａＲＮＡデンドリマーの安定性
また、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの安定性を試験した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを、１時間、１２時間、２４時間、及び４８時間室温でインキュベートしてから、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションした。その後、Ｃ／ＥＢＰαｍＲＮＡの転写物レベルを、５ｎｍｏｌ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの３×用量後、図１２に示されているように各時点で測定した。最適な効果は、１時間で観察された。これは、１２～２４時間で少なくとも５０％低減される。４８時間では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーは、安定性をほとんど失った。

【0331】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー複合体を注射した後、マウスの血清アルブミンレベルを１週間試験した。結果は図１３に示されている。各群は、５匹のマウスを含む。群１は未処置であり、血清アルブミンレベルを１日目に試験した。群２は未処置であり、血清アルブミンレベルを８日目に試験した。群Ａは、３×用量の５ｎｍｏｌ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを０．１ｎｍｏｌ／ｕＬの濃度で処置し、血清アルブミンレベルを２日目に試験した。群Ｂ、Ｃ、及びＤは全て、同じ量のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーで処置し、血清アルブミンレベルを、それぞれ３日目、５日目、及び８日目に試験した。群Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの血清アルブミンレベルは、群２よりも高く、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの影響が、投与後少なくとも８日目まで続いたことが示された。

【0332】

実施例３．正常動物でのｉｎ ｖｉｖｏ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー薬物標的化
肝臓疾患のないマウスに静脈注射したＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの生化学的効果を評価するために、肝臓特異的因子の循環血清を分析し、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ注射マウスの肝細胞を対照マウスと比較して、組織病理学的変化を研究した。

【0333】

１０匹の雄Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ、８週齢マウスを実験に使用した（対照群Ｎ＝５）。組織内及び地域の規制団体から承認を受け、手順は全て、現在有効な国家規制に従った。０．１ｎｍｏｌ／ｕＬ濃度の５ｎｍｏｌ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、無ＲＮａｓｅ／Ｄｎａｓｅ Ｈ_２Ｏで再構成して、総容積を１００ｕＬにした。５０ｕＬの複合体Ａ（Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ）及び５０ｕＬの複合体Ｂ（ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社、カリフォルニア州、米国）を混合し、５０℃で３０分間インキュベートし、その結果生じた混合物を尾静脈注射に使用した。対照動物には等容積のＰＢＳを注射し、陽性対照動物には、第ＶＩＩ因子に対するｓｉＲＮＡを投与した。合計で５匹の対照動物及び５匹の実験動物に注射した。

【0334】

肝臓疾患の非存在下では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの注射は、アルブミンの循環レベル（図１４Ａ）及び非抱合型ビリルビンレベル（図１４Ｂ）を有意に増加させ、肝機能が増加したことが示された。アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）（図１４Ｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（図１４Ｄ）、及びガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）（図１４Ｅ）の血清レベルは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ注射マウスでは減少した。

【0335】

ヘマトキシリン及びエオジンで染色した肝生検の病理学的検査を実施した。対照群と治療群との間に、識別可能な又は顕著な形態学的差異は観察されなかった。一般的に、肝腺房の構造は、保存されていた。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの注射後、著しい門脈炎症又は線維症はなかった。胆管は、両群で正常であることが観察され、病巣又は卵形細胞増殖の痕跡、又は肝臓壊死性炎症性活性の病巣はなかった。

【0336】

中央細静脈及び洞様毛細血管は、両群で正常であることが観察された。クッパー細胞が活性化されたことを示唆する形態学的証拠はなく、血管の変化又は内皮の変化の徴候もなかった。膨張及び脂肪症を含む細胞障害の目に見える証拠はなかった。肝細胞増殖の増加（有糸分裂、プレート肥厚化、又は核密集）を示唆する知見はなかった。しかしながら、１つの一貫した観察は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置群の帯域１では、細胞質が、よりコンパクトでわずかにより好塩基性であることだった。帯域１は、肝臓でのアルブミン合成の優先領域とみなされる（図１４Ｆ）。

【0337】

実施例４．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの急性毒性研究
動物へのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー注射の濃度増加の効果を研究した。
４２７ 研究は、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｔｈｅｎｓの動物設備で実施し、動物実験に必要なギリシア国の法的要件の要求に従って、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｔｈｅｎｓの認可（許可番号４１４／０７－０２－２０１３）を受けた。

【0338】

動物
Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ブラックソーン、英国）から購入し、動物設備センターで飼育し、平均体重が３０３．３±２８．５ｇ（平均±１ＳＤ）であり、年齢が１２～１４週歳の３１匹の雄ウィスター非近交系ラット（ＨｓｄＯｌａ：ＷＩ）を研究に使用した。動物は、実験動物の管理と使用に関する指針、及び実験動物の管理と使用に関する欧州委員会の関連する推奨に従って、標準的な条件で飼育し、標準的なラット餌（Ｔｅｋｌａｄ２９１８、Ｈａｒｌａｎ社、ウディネ、イタリア）を与え、自由に水を与えた。

【0339】

設備のラットは全て、欧州連合実験動物科学協会の推奨に準拠する健康管理プログラムを使用することにより定期的にスクリーニングし、キルハムラットウイルス、ラットパルボウィルス、Ｔｏｏｌａｎ Ｈ１ウイルス、センダイウィルス、マウス肺炎ウイルス、ＩＩＩ型レオウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ラット唾液腺涙腺炎ウイルス、ラット微小ウイルス、ハンタンウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ＣＡＲバチルス（cilia-associated respiratory bacillus)、マウスアデノウィルスタイプ１型及び２型、ラットロタウイルス、ラットコロナウイルス、マイコプラズマ・プルモニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌｍｏｎｉｓ）、クロストリジウム・ピリホルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｉｌｉｆｏｒｍｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パスツレラ種、毛皮ダニ（fur mites）、及びギョウチュウを含む広範囲の病原体は検出されなかった。

【0340】

方法
対照群（群Ｃ）は１０匹の動物、及び他の群は全て７匹の動物からなる４つの群に、動物を無作為化した。対照群では、１００μＬのＰＢＳを尾静脈から動物に投与した。ＰＢＳ中０．１ｎｍｏｌ／ｕＬの濃度のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの１００μＬの基準用量溶液、２×用量溶液、及び３×用量溶液を、それぞれ群１×、群２×、及び群３×の動物に投与した。注射は、一日おきに３回連続で繰り返した。

【0341】

動物の体重を、安楽死直前の手順開始時及び終了時に測定した。
最後のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー注射の３日後に、吸入麻酔薬（イソフルラン）を使用してラットに麻酔をかけ、尾部大静脈から血液を採取した。

【0342】

３ｍｌの血液試料をチューブに採取して、ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビン、直接ビリルビン、クレアチニン、尿素、アルブミン、及び総コレステロールの血清レベルを、各群の実験期間の終了時に測定した。市販のキット（Ｈｕｍａｎｅ社、ドイツ）を使用した比色酵素法により、採取した血液を、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清を、生化学的分析機（Ｃｈｅｍｗｅｌｌ ２９１０、Ａｗａｒｅｎｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社、パームシティ、フロリダ州、米国）で分析した。

【0343】

別の３ｍｌの血液試料をチューブに採取し、血液学的分析機（ＭＥＫ６３１８、日本光電工業、東京、日本）を使用して血液学的分析を行った。
組織学的分析
剖検肝臓では、各動物に由来する脾臓及び腎臓を収集し、１０％ホルマリンで固定した。固定した後、標本を日常的に処理し（エタノール溶液での段階的な脱水、及びキシレン溶液でのクリアランス）、パラフィンに包埋し、５μｍに切片化し、ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ－Ｅ）で染色した。

【0344】

統計分析
ウィンドウズ（登録商標）用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを統計分析に使用した。一元配置分散分析及びボンフェローニの多重比較検定を使用して、様々な用量のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの投与による差異を比較した。変数は全て、平均±ＳＤとして表されている。ｐ＜０．０１の値を、統計的有意差を示すとみなした。

【0345】

結果
溶液の注射剤中に死亡は起きなかった。体重（図１５Ａ）又はコレステロール（図１５Ｂ）の群内での変化は認められなかった。１００ｕＬ、２００ｕＬ、及び３００ｕＬの０．１ｎｍｏｌ／ｕＬ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの用量による動物の処置は、ヘモグロビン（Ｈｂ）レベル（正常範囲１６ｇ／ｄＬ）に影響を一切及ぼさなかった（図１５Ｃ）。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの漸増用量による処置は、白血球細胞（ＷＢＣ）数を、対照群の値から変化させなかった（図１５Ｄ）。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの漸増用量による処置は、血小板数を、対照群から変化させなかった。しかしながら、最高用量（３×用量）による処置は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社のパラメータにより規定される「正常範囲」により近い血小板数への復帰を示した（図１５Ｅ）。

【0346】

肝機能の生化学的分析は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー処置群のガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）レベルが、全ての用量レベルにおいて、対照と比較して、正常範囲（Ｈａｒｌａｎパラメータにより規定されるような）により接近していることを明らかにした。これは、処置群内で肝機能が改善されたことを示唆する（図１５Ｆ）。血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）又はアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルは、対照群と比べて処置群では変化を示さなかった（図１５Ｇ）。血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）又はアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルは、１×及び２×のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー処置動物では、正常範囲により接近していた。３×のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー処置群でのレベルは、対照群と同等だった（図１５Ｈ）。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の循環レベルは、対照動物と処置動物との間で差異を示さなかった（図１５Ｉ）。処置動物の非抱合型ビリルビンの循環レベルは、正常範囲から変化しなかった（図１５Ｊ）。尿素及びクレアチニンのレベルを使用して、腎臓機能を評価した。対照と処置動物とで変化は観察されなかった（図１５Ｋ及び図１５Ｌ）。

【0347】

したがって、このデータは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー分子が、関連毒性の証拠を示さずに肝機能を正に制御することができることを示す。
１×から３×までの漸増用量でのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー投与は、肝臓、脾臓、又は腎臓のいずれの組織学的外観にも影響を及ぼさなかった。群１×、群２×、又は群３×の動物から採取した肝臓標本は、対照群と比較して、細胞構成に変化を示さなかった。肝臓サイズがより小さく、結合組織の量が減少していたため（種特徴的）、小葉構成をはっきりと観察することができなかった。しかしながら、軽度の充血とは別に、他の病変（脂肪浸潤、炎症、又はネクローシス等）は観察されなかった（図１６）。

【0348】

腎臓組織学的検査は、実験群と対照群とで変化を示さなかった。標本は全て、正常な腎小体及び典型的な近位及び遠位尿細管上皮内層を示した。炎症性病変又は変性病変は、糸球体及び尿細管周囲毛細血管及び小葉間血管の両方における軽症の充血（肝臓標本のような）を除いて観察されなかった（図１７）。

【0349】

脾臓の微視的な評価（肝臓及び腎臓と全く同様な）は、異常な組織構成を示さなかった。群は全て、容易に観察可能なリンパ結節及び動脈周囲リンパ鞘を有する正常な白色髄を示した。しかしながら、動物は全て充血性の赤色髄を示した。充血は、脾臓結節の胚中心（ａｋａ周辺帯）近傍にさえ存在する。加えて、大血管は、赤血球細胞で満たされ、全体的な脾臓うっ血を示していた（図１８）。

【0350】

このデータは、肝臓癌を有する又は肝臓癌を有していない肝不全の患者の治療におけるＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの安全性及び効力の全体的なプロファイルを支持する。
実施例５．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置した癌細胞の細胞増殖アッセイ
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、高分化癌タイプ及び未分化の癌タイプを表わす一群の細胞株で試験した（要確認）。ＷＳＴ－１細胞増殖アッセイを、線維芽細胞ＨＬ６０（急性骨髄白血病（ＡＭＬ））で実施した。Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、ジャーカット（急性Ｔ細胞性リンパ腫）、Ｕ９３７（組織球性リンパ腫）、Ｕ３７３（神経膠芽腫）、３２ＤＺ２１０（骨髄性白血病）は、図１９に示されており、ＨｅｐＧ２（ヒトＨＣＣ）、ラット肝臓癌細胞、Ｐａｎｃ１（ヒト膵臓類上皮癌）、ＭＣＦ７（ヒト乳腺癌）、ＤＵ１４５（ヒト転移性前立腺癌）、及びＭＩＮ６（ラットインスリノーマ）は、図２１に示されている。これら細胞を、３×用量の２０ｎＭ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで２時間、４８時間、及び７２時間で処置した。細胞増殖を測定した。結果は、図２０及び図２２に示されている。結果は、３２Ｄｐ２１０（骨髄性白血病）、Ｕ３７３（神経膠芽腫）、Ｋ５６２（ＣＭＬ）、ジャーカット（急性Ｔ細胞性リンパ腫）、ＤＵ１４５（ヒト転移性前立腺癌）、ｐａｎｃ１（ヒト膵臓癌）、ラット肝臓癌細胞、ＨｅｐＧ２、及びＭＣＦ７（ヒト乳癌）の優れた阻害を示している。

【0351】

卵巣癌におけるＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの関与を、シスプラチン感受性のＰＥＯ１細胞及びシスプラチン耐性の分化不良ＰＥＯ４細胞で試験した。ＰＥＯ１及びＰＥＯ４細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ由来の同質遺伝子細胞株ペアである（図２３）。細胞を接種し、２０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及びスクランブル－ｓａＲＮＡ対照で３回トランスフェクションした。ＷＳＴ－１アッセイを、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間で実施した。図２４の結果は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが、シスプラチン感受性（ＰＥＯ１）卵巣癌細胞及びシスプラチン耐性（ＰＥＯ４）卵巣癌細胞の細胞生存を両方とも低下させることを示す。

【0352】

加えて、ＷＳＴ－１細胞増殖アッセイは、スクランブル－ｓａＲＮＡ対照での処置と比較して、小細胞肺癌及び膵臓腺癌の阻害を示した。しかしながら、対照的に、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、高分化ラットインスリノーマの増殖抑制には効果的ではなかった。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、高分化乳癌（ＭＣＦ７）細胞株の増殖を３１％低減したに過ぎなかった。ｑＰＣＲ及びウエスタンブロットを使用して、Ｃ／ＥＢＰαの内因性レベルを比較すると、未分化腫瘍細胞株は、高分化株と比較してより低いレベルで発現したことが示された。データはここには示されていない。

【0353】

ここで示された結果は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが、分化の度合いが様々な腫瘍を治療するための重要な因子であり得ることを示した。更に、これは、この新規療法から利益を得ることができる患者を選択するために使用することができる可能性がある。

【0354】

実施例６．腫瘍の治療におけるＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及びＣ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡの組み合わせ
この研究では、本発明のＣＥＢＰα－ｓｉＲＮＡを、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子発現を阻害するｓｉＲＮＡと共に投与した。ＨｅｐＧ２細胞増殖及びＭＣＦ７細胞増殖を、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ＋Ｃ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後、製造業者のガイドラインに従ってＷＳＴ－１試薬を使用して、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ発現を分析することにより、それぞれ１６、２４、４８、７２、９６、及び１２０時間で定量化した。２０ｎＭスクランブルｓｉＲＮＡ、５０ｎＭスクランブル－ｓａＲＮＡ、２０ｎＭスクランブルｓｉＲＮＡ＋５０ｎＭスクランブル－ｓａＲＮＡ、２０ｎＭ Ｃ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡ単独、及び５０ｎＭ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ単独での細胞増殖を試験した。ＨｅｐＧ２細胞（図２５Ａ）の場合、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ単独及びＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ＋Ｃ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡは両方とも、腫瘍細胞増殖を阻害する。ＭＣＦ７細胞の場合、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ＋Ｃ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡは、細胞増殖を１２０時間で５０％低減した（図２６Ａ）。したがって、Ｃ／ＥＢＰβ－ｓｉＲＮＡと併用したＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＨＣＣ及び乳癌の治療に有望な治療剤である。

【0355】

実施例７．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ｍｉＲＮＡレベルを制御する
最近、ｍｉＲＮＡと癌の進行及び予後との相関性が、幾つかの研究で評価されている。ＨＣＣの場合、幾つかのｍｉＲＮＡは、それらが最初に発見されて以降、広範に研究されてきた（例えば、ｍｉＲ－２１又はｍｉＲ－１２２）。しかしながら、実際には、膨大な数のｍｉＲＮＡが、癌の発生及び進行に関与している。ｍｉＲＮＡ及び癌には強い関連性があり、それらは、癌遺伝子特異的療法に使用することができる。この研究の目標は、ｍｉＲＮＡ発現の制御によるＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの抗癌効果の可能性を評価することだった。

【0356】

ＨｅｐＧ２細胞を、２０ｎＭ終濃度のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで培養及び処置した。ｍｉＲＮＡ発現レベルを、マイクロアレイにより検出し、両群のリアルタイムＰＣＲにより検証した。動物実験の場合、臨床的に意義のあるラット肝腫瘍モデルを使用し、動物を、尾静脈注射により０．１ｎｍｏｌ／ｕＬのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーで処置した。対照動物には、等容積のＰＢＳ又はスクランブル－ｓａＲＮＡを注射した。

【0357】

本研究で実施した実験手順は、下記に記載されている。
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの２本の鎖を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して、９０℃で変性させるステップ、その後室温へと徐々にアニーリングさせるステップで、アニーリングさせた。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、ＨｅｐＧ２及びラット肝臓上皮細胞株にトランスフェクションし、全ＲＮＡを細胞から単離した。

【0358】

細胞株からの成熟ｍｉＲＮＡの単離
細胞ペレットを、フェノール／グアニジンに基づく溶解緩衝液を使用して溶解し、クロロホルムを使用して水相及び有機相に分離した。その後、製造業者のプロトコール（ｍｉＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社、ジャーマンタウン、メリーランド州）に従って、ｍｉＲＮＡを多く含む画分を全ＲＮＡから分離した。

【0359】

成熟ｍｉＲＮＡマイクロアレイプロファイル
ヒト癌ＰＡＴＨＷＡＹＦＩＮＤＥＲ ＭＩＳＣＲＩＰＴ（商標）ｍｉＲＮＡ ＰＣＲアレイ（ＱＩＡＧＥＮ／ＳＡ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社、ＭＩＨＳ１０２ＺＡ）を使用して、正常組織と比べて、腫瘍で示差的に発現された８４個のｍｉＲＮＡの発現をプロファイルした。５００ｎｇの精製ＲＮＡを、ＭＩＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴ２キット（ＱＩＡＧＥＮ社）で、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）及び核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を効率的に逆転写するためのＭＩＳＣＲＩＰＴ ＨＩＳＰＥＣ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用して１５分間逆転写した。その後、ｃＤＮＡを、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＰＣＲアレイプレートに移し、７９００ＨＴ型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製リアルタイムサイクラーで、ｍｉＳｃｒｉｐｔユニバーサルプライマー及びＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、９５℃で１０分間の１サイクル及び４０サイクル（９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間）で増幅し、蛍光データを収集した。

【0360】

各ウェルの閾値サイクルを、手作業で計算し、データ分析用にエクスポートし、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓアレイ専用データ分析ソフトウェア（ＱＩＡＧＥＮ社、ジャーマンタウン、メリーランド州）を使用してクラスタリングした。ジーンオントロジー（ＧＯ）濃縮解析（enrichment analyse） Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ， ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ、ベテスダ、メリーランド州）ツールを使用して、上方制御された遺伝子及び下方制御された遺伝子の中で著しく濃縮された機能カテゴリーを特定した。

【0361】

マイクロＲＮＡ標的分析
ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮトータルコンテキストスコア予測データを、ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮウェブサイトからダウンロードした［Ｇｒｉｍｓｏｎら、Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ、２７巻、９１～１０５頁（２００７年）、この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる］。ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮデータベースの各遺伝子について、上方制御されたｍｉＲＮＡ全てのコンテキストスコアの合計を算出した。同様に、各遺伝子について、下方制御されたｍｉＲＮＡ全てのコンテキストスコアの合計を算出した。最後に、所与の遺伝子について、下方制御されたｍｉＲＮＡと比較した上方制御されたｍｉＲＮＡの予測寄与は、上方制御されたｍｉＲＮＡの合計コンテキストスコア分布におけるその遺伝子のランクから、下方制御されたｍｉＲＮＡの合計コンテキスト分布におけるその遺伝子のランクを引いたものである。０．４を超える相対的ランクの絶対値変化を有する遺伝子を、上方制御されたｍｉＲＮＡ又は下方制御されたｍｉＲＮＡにより強く影響されるとみなした。

【0362】

結果
癌ｍｉＲＮＡ分析は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが、肝臓癌に関与するｍｉＲＮＡ媒介性脱制御を示唆する。

【0363】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクション細胞での異常なｍｉＲＮＡ制御の潜在的な寄与を研究するために、８４個の癌特異的成熟ｍｉＲＮＡの発現をプロファイルした。

【0364】

処置細胞と未処置細胞とで発現パターンが大きく変化した（図２７及び図２８Ａ～図２８Ｂ）。全体的に腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡは上方制御されたが、発癌性ｍｉＲＮＡは抑制された（表９）。

【0365】

ｍｉＲＮＡ標的予測は、特定された示差的発現ｍＲＮＡのほとんどが、示差的発現ｍｉＲＮＡの幾つかにより制御されたことを示した。どのｍＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ発現の変化により影響を受ける可能性が最も高かったかを特定するために、下方制御されたｍｉＲＮＡと比較して、上方制御されたｍｉＲＮＡにより最も強く標的とされることが予想されたｍＲＮＡを特定した。１つの下方制御された遺伝子（ＢＩＲＣ２）及び３つの上方制御された遺伝子（ＲＵＮＸ３、ＰＴＫ２、ＦＨＩＴ）が、下方制御されたｍｉＲＮＡにより最も影響を受けると予測された。対照的に、４つの下方制御された遺伝子（ＢＩＲＣ５、ＣＣＬ５、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＡＤＤ、及びＲＡＣ１）が、ｍｉＲ－１２２（ＢＩＲＣ５及びＣＣＬ５）及びｍｉＲ－１３４（ＣＤＫＮ２Ａ及びＦＡＤＤ）を含む上方制御されたｍｉＲＮＡにより最も影響を受けると予測された。ｍｉＲ－１２２は、脂質代謝、Ｃ型肝炎ウイルス複製を調節し、アポトーシスを阻害することが知られている肝臓特異的ｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ１２２は、通常、成体肝臓への肝臓分化中に検出される。ｍｉＲ－１２２発現の喪失は、肝腫瘍の肝臓内転移の促進に関与し、その異所性回復は、細胞遊走、侵襲、及びｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍形成の低減に著しい効果示す。

【0366】

ｍｉＲ－１２２は、通常、ＨＣＣでは抑制されるため、その発現が、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのＨｅｐＧ２細胞へのトランスフェクション後に増加したことは特筆すべきことである（表１０）。ｍｉＲ－１２２は、Ａ－ジスチンテグリン（Distintegrin）及びＡ－メタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）を含む複数の標的遺伝子を負に制御する。ＡＤＡＭ１７の発現増加は、ＨＣＣの発生に重要な役割を果たす。転写プロファイリング解析は、ＡＤＡＭ１７が、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションＨｅｐＧ２細胞で抑制されたことを示した。ＡＤＡＭ１７は、細胞増殖、遊走、及びアポトーシスの制御に関与する膜係留受容体を切断するため、癌細胞の分子病理に重要な意味合いを持つ。したがって、こうした結果は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ－１２２を制御することにより、細胞増殖、遊走、及びアポトーシスを制御することができることを示唆する。

【0367】

ｍｉＲ－１３４も、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのトランスフェクション後、上方制御された。ｍｉＲ－１３４は、ｍｉＲＮＡ腫瘍抑制因子ネットワークの一部として、ｐ５３／ｐ７３／ｐ６３ファミリーのメンバーにより調節されることが以前に報告されている。非小細胞肺癌の機能研究により、ｍｉＲ－１３４のレベル増加が、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害することが示されている。［Ｂｌｏｏｍｉｎａｔｈａｎ、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５巻、ｅ１０６１５（２０１０年）、この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる］。最近の研究によると、ｍｉＲ－１３４は、腫瘍タンパク質ＫＲＡＳを下方制御することにより、ＨＣＣ悪性疾患に劇的な抑制効果を及ぼすことが示されている。ｍｉＲ－１３４は、ＨＣＣ腫瘍形成性を著しく減少させ、ｉｎ ｖｉｖｏで著しい抗腫瘍効果を示した。加えて、内因性ｍｉＲ－１３４の阻害は、ＫＲＡＳ発現及びＨＣＣ悪性腫瘍に対するＨＮＦ４αの抑制効果を部分的に反転させた。ＨＣＣにおけるｍｉＲ－１３４又はその標的の機能は、まだ完全には解明されていないが、ＥＭＴに関連する遺伝子であるＨＧＦ及びＳＭＡＤ７の転写物のレベル低減は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの検出された治療可能性に妥当性のある作用機序を供給する。

【0368】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、細胞分化及び細胞増殖に関与するｍｉＲＮＡを制御した
ＨＣＣでは、幾つかのｍｉＲＮＡが、癌細胞の抗アポトーシス特性の獲得に関与することが示された（図２９）。ｍｉＲ－１００、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１３４、及びｍｉＲ－１４０－５ｐは、ＨＣＣでは、通常、下方制御される。これらは、細胞成長及び細胞増殖を制御する。加えて、ｍｉＲ－１２２及びｍｉＲ－１４０－５ｐは、肝細胞分化を制御することが報告された（図２９）。Ｃ／ＥＢＰαは、ＨｅｐＧ２処置細胞において、これらのアポトーシス促進性ｍｉＲＮＡの発現を誘導することが、本明細書で決定された。

【0369】

ｍｉＲ－３７２は、細胞増殖、細胞侵襲、及び細胞遊走を促進するため、ＨＣＣでは癌遺伝子として機能する。本研究では、ｍｉＲ－３７２は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより下方制御された。

【0370】

発表されている結果とは逆に、ｍｉＲ－１２５ｂは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより下方制御されたことが見出されたが、従来の研究では、細胞増殖を抑制することができ、その高発現は、ＨＣＣ患者のより長期生存と相関し得ると報告されている。

【0371】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、癌細胞の上皮間葉転換に関与するマイクロＲＮＡを制御した。
ｍｉＲ－１２４は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害することが報告されている（図２８）。腫瘍進行及び悪性転換中のＥＭＴ様事象は、初発癌細胞に侵襲性及び転移性特性を付与する。ｍｉＲ－１２４は、通常、ＨＣＣでは下方制御される。ｍｉＲ－１２４は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより上方制御されることが、本明細書で見出された。

【0372】

更に、ｍｉＲ－１９１は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより上方制御され、ｍｉＲ－１４８ａは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより下方制御されたことが見出された。しかしながら、文献には、ｍｉＲ－１９１は、ＨＣＣでは上方制御され、ＥＭＴを誘導するが、ｍｉＲ－１４８ａは、ＨＣＣでは下方制御され、分化を制御し、ＥＭＴを阻害することが報告されている（図２８）。したがって、こうした結果により、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ｍｉＲ－１２４及びｍｉＲ－１９１を制御することにより、癌細胞のＥＭＴを制御することができる可能性があることが示唆される。

【0373】

Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、転移プロセスに関与するｍｉＲＮＡを制御した。
転移プロセスは、癌細胞が循環に侵入することで始まる。様々なｍｉＲＮＡが、正常細胞では、運動性、侵襲性、及び転移を抑制し、又は癌細胞では、運動性、侵襲性、及び転移を促進する（図２９）。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、転移プロセスに関与するほとんどのｍｉＲＮＡに正の効果を示したことが、本明細書で示された。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、癌細胞の侵襲性を阻害することができるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－２３ｂ、ｍｉＲ－１００、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｌｅｔ－７ｇ）を回復させ、転移促進性ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－３７２）のレベルを抑制した（表９）。他方では、ｍｉＲ－１０ｂは、ＨｅｐＧ２処置細胞で上方制御されたことが見出された。文献では、ｍｉＲ－１０ｂは、通常、ＨＣＣでは上方制御され、その発現は、ＨＣＣ患者の予後不良及び短期生存と相関することが報告されている。

【0374】

考察
本研究は、４２個のｍｉＲＮＡが、処置ＨｅｐＧ２細胞ではＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより上方制御され、腫瘍抑制因子として作用することを明らかにした。その一方で、３４個のｍｉＲＮＡは、処置ＨｅｐＧ２細胞ではＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより下方制御されたため、癌遺伝子として作用する。８個のｍｉＲＮＡｓは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの注射により影響を受けなかったことも見出された。こうした結果により、複数のｍｉＲＮＡがＨＣＣに関与することが確認された。

【0375】

ｍｉＲ－１３４は、Ｃ／ＥＰＢα－ｓａＲＮＡトランスフェクション後に、正の制御を示した。このｍｉＲＮＡは、癌細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ）を防止する腫瘍抑制因子ネットワークの一部として機能する。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクション後にｍｉＲ－１３４の発現が増加することは、ＥＭＴ転換に関与する複数の遺伝子（ＨＧＦ、ＳＭＡＤ７、及び程度はより低いがＣＴＮＮＢ１）が抑制されるＣ／ＥＰＢα－ｓａＲＮＡの効果に対する別の重要な寄与因子があることを示唆する。

【0376】

また、ｍｉＲ－２３ｂの発現は、Ｃ／ＥＰＢα－ｓａＲＮＡトランスフェクション細胞では増加した。ｍｉＲ－２３ｂは、ＨＣＣでは、通常、下方制御され、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）及びｃ－Ｍｅｔの上方制御に結び付き、したがって、細胞遊走及び細胞増殖を増加させる。また、ＨｅｐＧ２細胞をＣ／ＥＰＢα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションした後、ｌｅｔ７ｇのレベル増加が見られた。Ｌｅｔ７ｇ発現は、通常、ＨＣＣの転移進行中に失われる。

【0377】

また、Ｃ／ＥＰＢα－ｓａＲＮＡトランスフェクションＨｅｐＧ２細胞でのｍｉＲ－２１の喪失は、以前の報告では、ＨＣＣ腫瘍及び細胞株ではその機能獲得が見られることが示唆されているため、特筆すべきことである。ｍｉＲ－２１の抑制は、ホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）腫瘍抑制因子活性を増強すると考えられる。

【0378】

ｍｉＲ－２１５又はｍｉＲ－１９３等の、処置細胞においてＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより影響を受けることが見出された幾つかのｍｉＲＮＡは、ＨＣＣに関与することが以前には報告されていない。

【0379】

本発明者らの知見は、未処置ＨｅｐＧ２細胞と比較して、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより影響を受けることが見出された４つのｍｉＲＮＡに関して、文献とは一致しない。（つまり、ｍｉＲ－１０ｂ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ、及びｍｉＲ－１９１）。

【0380】

結論として、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの発現を明らかに制御する。ＨＣＣ並びに他の癌におけるｍｉＲＮＡの関与及び機能に関して本明細書で提供されている理解は、ｍｉＲＮＡを予後因子として使用することを支持するだけでなく、癌の診断、病期判定、及び治療における役割を果たす可能性があることを強調するものである。

【0381】

【表10-1】

【0382】

【表10-2】

【0383】

【表11】

【0384】

【表12】

【0385】

【表13】

【0386】

実施例８．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、コレステロール及びＬＤＬのレベル、インスリン抵抗性遺伝子を制御し、非アルコール性脂肪肝疾患、インスリン抵抗性、及び脂肪症を治療し、ＢＡＴ及びＷＡＴの代謝遺伝子を制御する。

【0387】

本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを、０．１ｎｍｏｌ／ｕＬ標準用量、２×用量、及び３×用量でマウスに投与した。血中のＬＤＬレベルを測定した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの用量増加は、コレステロール（図３０Ａ）及びＬＤＬ（図３０Ｂ）の循環レベルを変化させた。このデータは、ＬＤＬ循環レベルが増加し、肝細胞内部のＬＤＬレベルが減少したことを示す。

【0388】

更に、ｉｎ ｖｉｖｏでの非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療として、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを試験する研究を実施した。ラットを、高脂肪食で４週間処置して、ＮＡＦＬＤを誘導した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、１００ｕｌのＴＥＡ－コアＰＡＭＡＭデンドリマーで再構成して、０．１ｎｍｏｌ／ｕＬ Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの濃度にした。ＮＡＦＬＤのラットを、尾静脈注射剤により、３×用量でデンドリマー担持Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ（Ｒ）（Ｒ＋Ｄ）で７日間処置した。対照群のＮＡＦＬＤラットは、ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ）、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ単独（Ｒ）、デンドリマー単独（Ｄ）、経口エゼチミブ単独（Ｅ）、デンドリマーを有するスクランブル－ｓａＲＮＡ（Ｓｃ）（Ｓｃ＋Ｄ）、又は経口エゼチミブを有するＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ（Ｒ＋Ｅ）で処置した。エゼチミブは、血漿コレステロールレベルを低下させる薬物であり、陽性対照として使用される。図３１Ａ及び図３２Ａ～Ｃに示されているように、マウスの体重、並びにトリグリセリドレベル、コレステロールレベル、及び肝臓サイズ、及び肝臓外観を含む脂肪肝状態を記録及び分析した。図３１Ａは、デンドリマーで製剤化したＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ処置したラット、及び経口エゼチミブを有するＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラットの体重が、他の群よりも有意に少なかったことを示す。図３２Ａ及び図３２Ｂは、デンドリマーで製剤化したＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラットの肝臓のトリグリセリド及びコレステロールレベルが、それぞれ低減されたことを示す。また、デンドリマーにより担持されたＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで処置したラットの肝臓サイズは、図３２Cに示されているように、対照群と比較して最も小さく低減された。肝臓組織の組織病理学的染色画像は、図３２Ｄに示されている。ＰＢＳで処置したマウス及びＳｃ＋Ｄ対照で処置したマウスの肝臓組織は、高脂肪食で飼育した肥満ラットが脂肪肝であるため大部分は赤色である。その一方で、ｓａＲＮＡ－Ｃ／ＥＢＰα－デンドリマー（Ｒ＋Ｄ）を投与した実験群のラットの肝臓組織の組織病理は、脂肪消失のため大部分は青色である。

【0389】

また、肥満ラットのインスリン抵抗性遺伝子に対するＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの効果を研究した。ＦＡＴ／ＣＤ３６、ＬＰＬ、及びＬＸＲを、この研究に選択した。処置ラットの組織試料を使用して、種々の遺伝子の発現レベルを測定した。ＦＡＴ／ＣＤ３６、ＬＰＬ、及びＬＸＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲ ｍＲＮＡ発現レベルによりｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した（図３３Ｂ～Ｄ）。結果は、デンドリマーで製剤化したＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでの処置後に、ＦＡＴ／ＣＤ３６の発現は低減されたが、ＬＰＬ及びＬＸＲの発現は増加したことを示す。血清コレステロールレベルは、低減された（図３４）。別の研究では、デンドリマー単独、スクランブルｓａＲＮＡ、及びＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーで処置した後の肥満ラット肝臓組織におけるＣ／ＥＢＰα、ＳＲＥＢＦ－１、ＣＤ３６、ＡＣＡＣＢ、ＡＰＯＣ３、ＭＴＰ、ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１α、ＬＤＬＲ、ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１β、ＰＰＡＲγ、ＡＣＡＣＡ、ＭＬＸＩＰＬ、ＰＰＡＲα、ＦＡＳＮ、ＤＧＡＴ２のｍＲＮＡ転写物レベルを測定した（図３５Ａ～Ｏ）。エゼチミブを、陽性対照として使用する。ＳＲＥＢＰ１及びＣＥＴＰの発現は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡにより低減された（データ非表示）。

【0390】

更に、ＢＡＴ及びＷＡＴ細胞での代謝遺伝子に対するＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの効果を評価した。ＢＡＴ及びＷＡＴ細胞を、２０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで丁寧にトランスフェクションし、代謝遺伝子のｍＲＮＡレベルを、図３６Ａ～３６Ｍ及び図３７Ａ～３７Ｍに示されているように測定した。試験した代謝遺伝子の発現は、デンドリマー対照及びスクランブルＲＮＡ対照と比較して制御された。

【0391】

また、反復脂肪肝研究を実施した。高脂肪食後、肥満ラットを、実験群及び対照群に無作為に割り当てた。実験群では、肝臓を標的とする２１ｂｐの二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド－デンドリマー（ｓａＲＮＡ－デンドリマー）複合体を、標準低用量で使用して、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の転写活性化を達成した。その後、体重に応じた薬物用量で検証する。体重、脂質、及びエネルギー恒常性に対する、ｓａＲＮＡ－デンドリマー複合体の全身効果及び局所効果を観察した。結果は、表１１－１～表１１－１２、及び図３８～図４０に示した。

【0392】

【表14-1】

【0393】

【表14-2】

【0394】

【表14-3】

【0395】

【表14-4】

【0396】

【表14-5】

【0397】

【表14-6】

【0398】

【表14-7】

【0399】

【表14-8】

【0400】

【表14-9】

【0401】

【表14-10】

【0402】

【表14-11】

【0403】

【表14-12】

【0404】

実験群では、血清コレステロール及び体重は、有意に低減された。高用量のＣ／ＥＢＰαｓ ａＲＮＡは、血清トリグリセリドを顕著に低下させ、血清リポタンパク質プロファイルを向上させ、白色脂肪組織含量を減少させた。遺伝子発現解析により、遺伝子転写活性化は、対照群と比較して実験群で有意に変化したことが示された。肝臓では、Ｃ／ＥＢＰαは、脂肪酸取り込み（ＣＤ３６）及び肝臓新規脂質生成（ＳＲＥＢＰ－１、ＣｈＲＥＢＰ）に関与する遺伝子の発現を有意に減少させたが、ベータ－酸化（ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１α、ＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１β）及びインスリン感性遺伝子（ＰＰＡＲγ）は上方制御された。白色脂肪組織では、ＣＤ３６及びＡＣＡＣＢ遺伝子の発現減少が見出された。これは、それぞれ炎症の低減及びベータ－酸化の増加を示唆した。白色脂肪組織脂質生成に関与する遺伝子の下方制御が認められた（ＳＲＥＢＰ－１、ＡＣＡＣＡ、ｍＴＯＲ）。最後に、白色脂肪組織でのＰＰＡＲγ－ＣｏＡ１αの発現増強も観察された。Ｃ／ＥＢＰαは、ＮＡＦＬＤモデルにおいて、脂肪肝及び肝臓エネルギー代謝を改善し、インスリン抵抗性、代謝異常、及び体脂肪に対する正の全身性効果を示した。低用量のＣ／ＥＢＰα ｓａＲＮＡは、肝臓脂質及びグルコース代謝の改善により及び白色脂肪組織に対する副次的な正の効果により媒介され得る、体重に対する正の効果を示した。高用量のＣ／ＥＢＰα ｓａＲＮＡは、より強い抗脂質異常作用を示した。これは、全身性効果がより広範であったためである可能性が高い。

【0405】

したがって、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ＮＡＦＬＤを治療するための、及び肝細胞のトリグリセリドレベル及びＬＤＬコレステロールレベルを低減するための治療剤として使用することができる。また、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、その必要性のある患者のインスリン抵抗性、全身性脂質血症、高インスリン血症、及び脂肪症を低減するために使用することができる。

【0406】

【表15】

【0407】

実施例９．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは多能性を制御する
本発明のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡをＣＤ３４＋幹細胞に投与し、様々な濃度（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、又は１５０ｎＭ）のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションした後、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、多能性因子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ｃＫｉｔ、ＫＬＦ４、及びＮＡＮＯＧの相対発現を測定した（図４１及び図４２）。Ｃ／ＥＢＰβ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ｃＫｉｔ、ＫＬＦ４の相対発現は低減されたが、Ｃ／ＥＢＰα及びＮＡＮＯＧの発現は増加した。したがって、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、幹細胞の自己再生及び多能性特性を制御する、幹細胞の中核制御回路を制御することができる。

【0408】

【表16】

【0409】

実施例１０．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰαタンパク質アイソフォームを制御する
Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡは、同一のオープンリーディングフレーム内にある異なる開始コドンを使用することにより、２つの異なる翻訳アイソフォーム：全長４２ｋＤａタンパク質及び３０ｋＤａ短縮型を生成する。３０ｋＤａアイソフォームは、Ｎ末端転写活性化ドメイン（ＴＡＤ１）を欠如するが、その中央転写活性化ドメイン（ＴＡＤ２）を依然として保持する。これらアイソフォームは、遺伝子活性化及び細胞増殖において異なる機能を有する。このアイソフォームは両方とも細胞内で検出することができ、アイソフォームの比が、増殖の媒介及び分化の制御に重要である可能性が高い。［Ｃａｌｋｈｏｖｅｎら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１４巻、１９２０～１９３２頁（２０００年）；Ｒａｍｊｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３６５巻（Ｐｔ３）、５６１～５７５頁（２００２年）、これらの文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる］。

【0410】

アイソフォーム比に対するＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの効果を研究するために、ＨｅｐＧ２細胞を、５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ（ＡＷ１）で、又は陰性対照として、スクランブルオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ及びｓａＲＮＡ）を有する２０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。細胞を、０時間、２４時間、及び４８時間時に３回トランスフェクションした。細胞を７２時間で回収し、全タンパク質を抽出した。ブラッドフォードアッセイを実施して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルに負荷した全タンパク質を正規化し、電気泳動で分離した。その後、分離したタンパク質を、ニトロセルロースに固定してウエスタンブロットを行い、Ｃ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰβのタンパク質発現を検出した。タンパク質のＮ末端ドメインを認識するｓｔａｎｄ抗体（抗体クローンＥＰ７０８Ｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）社）を使用して、アイソフォームのいずれかを検出した。図４３Ａの結果によると、内因性レベルのＣ／ＥＢＰαは、未トランスフェクション細胞及びスクランブルトランスフェクション細胞では、主に３０ｋＤａ変異体として発現されると考えられることが示されている。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションは、Ｃ／ＥＢＰαの４２ｋＤａアイソフォームの発現を引き起こした。その後、これは、Ｃ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞では抑制された。未トランスフェクション細胞及びスクランブルトランスフェクション細胞では、内因性Ｃ／ＥＢＰβレベルの３４ｋＤａ変異体（ＬＡＰ、肝臓活性化タンパク質と呼ぶ）が、主要発現形態であると考えられる。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのトランスフェクションは、３０ｋＤａ変異体（ＬＩＰ、肝臓抑制性タンパク質と呼ぶ）の優勢発現を引き起こす。ＬＩＰの発現は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞では抑制された。

【0411】

別の研究では、ＨｅｐＧ２細胞を、５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ（ＡＷ１及びＡＷ２）で、又は陰性対照として、スクランブルオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ及びｓａＲＮＡ）を有する２０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。上記の研究で使用した標準抗体の代わりに、４２ＫＤａ Ｃ／ＥＢＰαアイソフォーム（細胞シグナル伝達抗体＃２８４３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））のみを認識する抗体を使用した。図４３Ｂに示されているウエスタンブロットの結果により、４２ＫＤａ Ｃ／ＥＢＰαアイソフォームは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の活性化により上方制御されることが示されてされた。ＡＷ１及びＡＷ２は両方とも、４２ＫＤａ Ｃ／ＥＢＰαアイソフォーム発現を増加させた。これは、４２ＫＤａ Ｃ／ＥＢＰαアイソフォームの上方制御が、遺伝子特異的であるが、配列特異的ではない可能性を示す。

【0412】

別の研究では、ＭＣＦ７細胞を、５０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで、及び陰性対照として、スクランブルオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ及びｓａＲＮＡ）を有する２０ｎＭのＣ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡでトランスフェクションする。ウエスタンブロットを実施して、Ｃ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰβアイソフォームの発現を研究する。

【0413】

上記の研究は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡが、種々のＣ／ＥＢＰαアイソフォーム及びＣ／ＥＢＰβアイソフォームを調節することを示す。任意の理論に束縛されることは望まないが、４２ｋＤａ Ｃ／ＥＢＰαアイソフォームの増加は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの新規な抗増殖効果及び他の治療効果に寄与する可能性がある。

【0414】

【表17】

【0415】

実施例１１．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及び他のＣ／ＥＢＰファミリーメンバー
ＨｅｐＧ２細胞を、通常のＲＰＭＩ／ＦＢＳ／ＰＳＧ培地に接種し、ナノフェクタミンを用いて、２×用量のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションした。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びＣ／ＥＢＰζのｍＲＮＡレベルを分析した。使用したＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの濃度は、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、及び２５０ｎＭだった。スクランブル－ｓａＲＮＡでトランスフェクションした細胞を、対照として使用した。図４４Ａの結果は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの後、全てのＣ／ＥＢＰファミリーメンバーの相対発現が増加し、この変化が用量依存的であることを示している。

【0416】

更に、ＨｅｐＧ２細胞を、ナノフェクタミンを用いて、２×用量のＣ／ＥＢＰα遺伝子発現阻害性ｓｉＲＮＡ（Ｃ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクションした。図４４Ｂは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のノックダウンを示し、図４４Ｃは、Ｃ／ＥＢＰファミリーの他のメンバーの相対発現も阻害されたことを示す。Ｃ／ＥＢＰα－ｓｉＲＮＡの濃度は２０ｎＭだった。スクランブルｓｉＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から得た。

【0417】

この研究は、Ｃ／ＥＢＰαが、Ｃ／ＥＢＰファミリーの他のメンバーの発現レベルを制御することを示唆する。

【0418】

【表18】

【0419】

実施例１２．Ｕ８７神経膠芽腫細胞でのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ構成の臨床レトロウイルス複製ベクター（ＲＲＶ）にクローニングした。この実験では、Ｕ８７神経膠芽腫細胞において、このベクター－ｍｉＲＮＡ構成が、シトシンデアミナーゼ遺伝子治療との併用で機能するか否かを調査した。レトロウイルスは、ｓａＲＮＡヘアピン配列がｍｉＲ－３０骨格フランキング配列にクローニングされていたｍｉＲＮＡ設計の、Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡと呼ばれるＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの二本鎖配列を発現していた。Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡは、制限酵素認識配列を更に含んでいてもよい。制限酵素の非限定的な例としては、ＧＣＧＧＣＣＧＣの認識配列を有するＮｏｔＩ、及びＧＧＣＧＣＧＣＣの認識配列を有するＡｓｃＩが挙げられる。Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡ配列の１つの非限定的な例は、下記及び図４６に示されており、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－３０であり、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡガイド鎖は、ＡＷ１アンチセンス（配列番号２）であり、パッセンジャー鎖は、ＡＷ１センス（配列番号１）である。Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡは、導入遺伝子に結合されていてもよく、したがって、導入遺伝子を、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターから同時発現させることができる。この研究では、Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡは、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）に結合されていた。ＧＦＰ－Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡは単一の転写物として発現され、Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡは、内因性ｍｉＲ－３０のようにドローシャ及びダイサーによりプロセシングされる。

【0420】

【表19】

【0421】

図４５に示されている結果では、Ｕ８７細胞を、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ（ＣＡＷ１）でトランスフェクションしたか、又はＲＲＶ－Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡ（ｍｉＣＡＷ１）で形質導入し、Ｃ／ＥＢＰαｍＲＮＡ転写物レベルをｑＰＣＲにより測定した。スクランブルｓｉＲＮＡ（ｃｏｎ）、及びホタルルシフェラーゼ（ｍｉｆＬｕｃ）に対する低分子阻害性ヘアピンを送達するレトロウイルスベクターを陰性対照として使用した。４日目に、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクションにより１．５倍に、Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡベクター形質導入により２倍に、上方制御された。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでは、著しい細胞死が見られたが、Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡでは見られなかった。Ｃ／ＥＢＰα－ｍｉＲＮＡは、プロセシングにより多くの時間を必要とする可能性がある。

【0422】

したがって、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、Ｕ８７細胞においてＣ／ＥＢＰα遺伝子発現を上方制御するその機能を依然として保持しつつ、ｍｉＲＮＡ構成のＲＲＶにクローニングすることができる。

【0423】

実施例１３．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのヒト研究
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを臨床研究で試験した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの両鎖は、３’－末端に２’－ＯＭｅ－Ｕ修飾（ｍＵ）を有する。配列及び物理的特性は、下記に示されている。第４世代（Ｇ４）ジアミノブタン（ＤＡＢ）－コア－ＰＡＭＡＭデンドリマー（ＮａｎｏＳｙｎｔｈｏｎｓ ＬＬＣ社、ミシガン州）を使用して、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡとの複合体を形成した。Ｃ／ＥＢＰα－ｓＲＮＡ対ＤＡＢ－コア－ＰＡＭＡＭの比は、重量で１：３だった。このＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー複合体（ＭＴＬ－５０１）は、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｏｒｅ、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ドアルテ、カリフォルニア州で合成された。このＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー複合体は、活性成分のみを含有する凍結乾燥粉末であり、１バイアル当たり５０ｍｇとして供給される。

【0424】

ＣＥＢＰＡ ＡＷ－１センス：
５’－ｒＣｒＧｒＧ ｒＵｒＣｒＡ ｒＵｒＵｒＧ ｒＵｒＣｒＡ ｒＣｒＵｒＧ ｒＧｒＵｒＣ ｒＡｒＵｍＵ－３’（配列番号２４９）
ＣＥＢＰＡ ＡＷ－１アンチセンス：
５’－ｒＵｒＧｒＡ ｒＣｒＣｒＡ ｒＧｒＵｒＧ ｒＡｒＣｒＡ ｒＡｒＵｒＧ ｒＡｒＣｒＣ ｒＧｒＵｍＵ－３’（配列番号２５０）
ＣＥＢＰＡ ＡＷ－１センスの分子量：６６４１．０ｇ／モル
分子量：６６４１．０ｇ／モル
吸光係数：２０１８００Ｌ／（ｍｏｌｅ・ｃｍ）
ｎｍｏｌｅ／ＯＤ_２６０：４．９６
μｇ／ＯＤ_２６０：３２．９１
ＣＥＢＰＡ ＡＷ－１アンチの分子量：６７１０．１ｇ／モル
重量：６７１０．１ｇ／モル
吸光係数：２０９６００Ｌ／（ｍｏｌｅ・ｃｍ）
ｎｍｏｌｅ／ＯＤ_２６０：４．７７
μｇ／ＯＤ_２６０：３２．０１
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマー治療の効果を、硬変症患者で試験した。硬変症患者は、３５～４０ｇ／ｌの正常範囲よりも低い、抑制された血清アルブミンレベルを有する。この低アルブミン血症は、肝細胞の合成減少、並びに細胞外空間のアルブミン含有量を希釈する水及びナトリウム貯留により引き起こされる。硬変症患者へのアルブミンタンパク質の投与は、肝機能及び腎機能を改善させ、循環機能不全を減少させるために広く使用されている［Ｌｅｅ、Ｋｏｒｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２７巻（１号）、１３～１９頁（２０１２年）；Ｂｅｒｎａｒｄｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ、１６巻、２１１～２１７頁（２０１２年）］この研究では、３用量のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーＭＴＬ－５０１を、１日目、３日目、及び５日目に、約０．５ｍｇ／ｋｇで硬変症の患者に投与した。血清アルブミンレベルを、図４７に示されているように３８日目まで測定した。血清アルブミンレベルの有意な増加が、約１５日目で観察され、血清アルブミンレベルが正常範囲へと増加した。血清アルブミンレベルは、３４日目まで正常範囲を維持した。

【0425】

別の研究では、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを、硬変症患者の白血球数を増加させるために使用した。３用量のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーＭＴＬ－５０１を、１日目、３日目、及び５日目に、約０．５ｍｇ／ｋｇで硬変症の患者に投与した。上記患者の白血球数を、図４８に示されているように測定した。患者１に投与した単一用量は、１０ｍｇのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及び３０ｍｇのデンドリマーを含有していた。患者３に投与した単一用量は、２０ｍｇのＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及び６０ｍｇのデンドリマーを含有していた。両患者の場合、第１の用量後、２日目には白血球数の増加が観察され、３用量のＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーＭＴＬ－５０１での処置した後、９日目にはより大きな増加が観察された。

【0426】

ヒト研究結果は、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ－デンドリマーを、肝臓病の患者を治療するための、及びその必要性のある患者の白血球数を増加させるための治療剤として使用することができることを示唆する。

【0427】

実施例１４．鎖選択／特定及び切断研究
５’末端の逆位脱塩基修飾は、Ａｇｏ２複合体のガイド位置への積み込みを防止すると示されている。Ｃ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖（ＡＳ）及びセンス鎖（ＳＳ）を、５’末端の逆位脱塩基修飾（ｂ）で阻止し、Ｃ／ＥＢＰＡ ｍＲＮＡ発現を測定し、ＡＳ鎖及び／又はＳＳ鎖の阻止がＣ／ＥＢＰＡ ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を決定した。ｓａＲＮＡは全て合成であり、水中でアニーリングさせた。ＲＰ－ＨＰＬＣでの純度は９０％である。オリゴヌクレオチド試料の配列を、以下の表に示した。

【0428】

【表20】

【0429】

ＤＵ１４５細胞を、接種時に５０ｎＭオリゴヌクレオチド試料でリバーストランスフェクションし、２４時間後にフォワードトランスフェクションし、７２時間で回収した。Ｃ／ＥＢＰＡ、ＡＬＢ、及びｐ２１ ｍＲＮＡ発現レベルを、図４９Ａ～図４９Ｃに示されているように測定した。同じ研究を、１０ｎＭオリゴヌクレオチド試料で実施し、結果を図４９Ｄ～図４９Ｆに示した。ＡＷ０１－５０００１２は、ＡＷ０１－５０００００と同様に作用した。これは、ＳＳの阻止が上方制御に影響を及ぼさないことを示す。ＡＷ０１－５０００１３及びＡＷ０１－５０００１４は、ＮＣ－５０００００と同様に作用した。これは、ＡＳの阻止が上方制御を弱めることを示す。Ｃ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡは、ＡＳ鎖を介して作用する。

【0430】

ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡの切断に関与する。非切断配列である中央３塩基対の突然変異を試験して（ＣＥＢＰＡ－ＡＷ０１－５００５００）、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡが、標的ＥＳＴ（ＡＷ６６５８１２）を切断するか否かを決定した。中央３塩基対の突然変異は、その鎖がガイドとしての役目を果たすか否かに関わらず、切断不能なｓａＲＮＡをもたらす。ＣＥＢＰＡ－ＡＷ０１－５００５００は、陰性対照ＮＣ－５０００００と比較してＣＥＢＰＡ遺伝子を上方制御することができ、転写物の切断は、ＣＥＢＰＡ上方制御に必要ではないが、上方制御は、陽性対照ＡＷ０１－５０００００未満であることを示唆する。

【0431】

実施例１５．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡは、ｅｃＣＥＢＰＡ ＲＮＡ及びＥＳＴを上方制御する
ＣＥＢＰＡ遺伝子座から転写される機能的ｎｃＲＮＡである過剰コード化ＣＥＢＰＡ（ｅｃＣＥＢＰＡ）は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）と相互作用することにより、ＣＥＢＰＡメチル化を制御し、したがってＣＥＢＰＡ遺伝子メチル化を防止する。ｅｃＣＥＢＰＡのノックダウンは、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ発現の減少、及びＤＮＡメチル化の著しい増加をもたらしたことが見出されている（Ｒｕｓｃｉｏら、Ｎａｔｕｒｅ、５０３巻：３７１～３７６頁（２０１３年）及びＤｉ Ｒｕｓｃｉｏらの米国特許出願公開第２０１４０１７１４９２号明細書、これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる）。ＤＵ１４５細胞を、表１２（上記）のオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。ｅｃＣＥＢＰＡ及びＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡのレベルを測定し、図５０Ａ～図５０Ｂ（５０ｎＭ ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを使用）及び図５０Ｃ～図５０Ｄ（１０ｎＭ ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを使用）に示した。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡｓは全て、陰性対照（ＮＣ－５０００００）を除いて、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ及びｅｃＣＥＢＰＡを両方とも上方制御した。１０ｎＭでは、二重脱塩基修飾オリゴ（ＡＷ０１－５０００１４）は、より低いｅｃＣＥＢＰＡ活性化を示した。

【0432】

更に、ＤＵ１４５細胞における、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ、ＡＷ６６５８１２のＥＳＴのレベルを測定した。ＤＵ１４５細胞を、接種時に表１２（上記）の５０ｎＭオリゴヌクレオチド試料でリバーストランスフェクションし、２４時間後にフォワードトランスフェクションし、７２時間で回収した。図５０Ｅの結果は、２回繰り返したものからだった。図５０Ｅの結果は、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡｓが、ＥＳＴを切断する代わりに、上方制御することを示した。

【0433】

実施例１６．リバーストランスフェクション及びフォワードトランスフェクションによるＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡトランスフェクション法
Ａ．ＨｅｐＧ２細胞
物質
この研究で使用した材料としては、以下のものが含まれていた：培地：ＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ社、Ｒ８７５８／５００ＭＬ）１×Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ社 Ｐ４３３３／１００ＭＬ）１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ社 １００８２１４７）；２４ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ社 Ｚ７０７７９１／１２６ＥＡ）；リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ社 １１６６８０２７）；ＴｒａｎｓＩＴ／Ｘ２（Ｍｉｒｕｓ社 Ｍ６００３）；ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ社 １３７７８０３０）；Ｏｐｔｉｍｅｍ ５００ｍＬ（Ｌｉｆｅ社 １１０５８０２１）；ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社 ７４１３４）；ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖ．転写キット（５０、Ｑｉａｇｅｎ社 ２０５３１１）；Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ７９６５４；ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｆｉｌｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、４３６０９５４）；ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ バーコード付き３８４ウェル反応プレート、０．１ｍＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、４３４６９０６）；ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（１×５ｍＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ社 ４４４４５５６）；ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｆｉｌｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ社 ４３６０９５４）；ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ バーコード付き９６ウェル反応プレート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ社 ４３４６９０６）；５ｍｌ血清用ＰＳピペット（Ｓｔｅｒｉｌｅ，Ｉｎｄ．社 包装、２００／ｃｓ、米国、 Ｓｃｉ社 Ｐ／２８３７／５）；１０ｍｌ血清用ＰＳピペット（Ｓｔｅｒｉｌｅ，Ｉｎｄ．社 包装、２００／ｃｓ、米国、 Ｓｃｉ社 Ｐ／２８３７／１０）；２５ｍｌ血清用ＰＳピペット（Ｓｔｅｒｉｌｅ，Ｉｎｄ．社 包装、２００／ｃｓ、米国、 Ｓｃｉ社 Ｐ／２８３７／２５）；１０００ｕｌチップ（米国、 Ｓｃｉ社 １１１１／２７２１）；２００ｕｌチップ（米国、 Ｓｃｉ社 １１１１－０７００）；及び２０ｕｌ ＴｉｐＯｎｅ ｎａｔｕｒａｌチップ（米国、 Ｓｃｉ社 １１２０－１８１０）。実験で使用したＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイは、ＣＥＢＰＡ ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｈｓ００２６９９７２＿ｓ１）及びＧｕｓＢ内因性対照ＶＩＣ／ＴＡＭＲＡプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍ１）ＡＷ１だった。

【0434】

実験で使用したｓａＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ
実験で使用したオリゴヌクレオチドには、ＡＷ１（ＣＥＢＰＡ／ＡＷ０１／５０００００）、ＡＷ１／ＭＭ（ＣＥＢＰＡ／ＡＷ０１／５００１００）、ＡＷ１／２ＯＭｅ１（ＣＥＢＰＡ／ＡＷ０１／５００００１）、ＡＷ１／２ＯＭｅ２（ＣＥＢＰＡ／ＡＷ０１／５０００１１）、スクランブル２ＯＭｅ１（ＮＣ／５１０００３）、及びＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ＯＮ／ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＣＥＢＰＡ ｓｉＲＮＡが含まれていた。

【0435】

ｓａＲＮＡの処理
オリゴヌクレオチドを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡで再水和して１ｍＭにした。これは、まず、適切な容積の５×アニーリング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｃｌ；１００ｍＭ ＮａＣｌ２；５ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、その後無ＲＮａｓｅ水を添加することにより達成した。混合物を穏やかにボルテックスして再水和を完了させた。当量容積のＡＳ鎖及びＳＳ鎖を、穏やかにボルテックスすることにより共に混合した。混合した鎖を有するチューブを、９５℃のｍｉｌｌｉＱ／水（沸騰はさせなかった）のビーカーに配置した。ビーカーをカバーで覆って、水をゆっくりと室温に冷却させた。アニーリングしたｓａＲＮＡを分割して、／２０℃で保管した。その後、無ＲＮＡｓｅ Ｈ２Ｏを使用して希釈を実施した。

【0436】

ＨｅｐＧ２の維持
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎仔血清で補完されたＲＰＭＩで、定期的に継代して、対数増殖期増殖を維持した。継代数が１０を超えた時点で、培養を中止した。

【0437】

核酸／リポフェクタミン複合体形成
試薬は全て、手順前に室温に戻した。１トランスフェクション当たり、１．５ｕｌのリポフェクタミン２０００を、５０ｕｌ Ｏｐｔｉｍｅｍに添加した。ｓａＲＮＡを、５０ｎＭの終濃度で５０ｕｌ Ｏｐｔｉｍｅｍに添加した。希釈リポフェクタミン及びｓａＲＮＡを穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。

【0438】

トランスフェクション用のＨｅｐＧ２細胞の調製
トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を剥離し、等容積の増殖培地に分散させ、細胞数を決定した。細胞を１０００×ｇで５分間遠心分離し、４００ｕｌの増殖培地が２４ウェルプレートのウェル中で４０％の集密度をもたらすように、細胞ペレットを増殖培地に再懸濁した。核酸／リポフェクタミン複合体を穏やかに細胞に添加し、２４ウェルプレート形式で播種した。細胞、培地、及びトランスフェクション複合体の最終容積は、５００ｕｌだった。２４時間後、細胞は、約４０％～４５％の密集度になるはずである。２４時間後、同じ核酸／リポフェクタミン複合体形成手順に従って、細胞を再トランスフェクションしたが、４００ｕｌ増殖培地を新しく与えた接着細胞に複合体を添加した。２４時間後、新しい増殖培地を細胞に与えた。培地交換の２４時間後に、ＲＮＡ抽出を実施した。トランスフェクションは全て、三重反復で実施した。要約すると、リバーストランスフェクションを行い、その後フォワードトランスフェクションを行った。

【0439】

ＲＮｅａｓｙを使用した全ＲＮＡの精製
増殖培地及び溶解細胞を３５０ｕｌのＲＬＴ緩衝液に吸引し、数回ピペットして、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒチューブに移した。その後、それらをＲＮｅａｓｙスピンカラムに通し、製造業者プロトコールに従って洗浄ステップを実施した。等容積の７０％エタノールを溶解産物に添加し、よく混合した。溶解産物／エタノール混合物を、収集チューブにセットしたフィルターカートリッジにアプライし、１５，０００×ｇで３０秒間遠心した。通過画分を破棄した。７００ｕｌの洗浄溶液＃１をフィルターカートリッジにアプライし、１５，０００×ｇで３０秒間遠心した。５００ｕｌの洗浄溶液＃２／３をフィルターカートリッジにアプライし、１５，０００×ｇで３０秒間遠心した。洗浄溶液＃２／３を使用して、第２の洗浄を繰り返した。通過画分を破棄し、１５，０００×ｇで３０秒間遠心分離して、残留する微量の洗浄溶液を除去した。フィルターカートリッジを、新しい収集チューブにセットした。４０ｕｌのピペット溶出溶液を、フィルターの中心にアプライした。チューブの蓋を閉めた。溶出液を、室温で３０秒間１５，０００×ｇで遠心分離することにより回収した。

【0440】

ＲＮＡ定量化
ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して測定した。
ｃＤＮＡアーカイブの調製
当量のＲＮＡ（５００ｎｇ～２μｇ）を、各ＲＴ反応のインプットとして使用した。量は、ＲＮＡ抽出及び定量化後に決定した。ＲＮＡ分解のリスクを最小限に抑えるために、反応は全て氷上でセットアップした。１）ＲＴプライマーミックスを使用して日常的に逆転写を行う場合、ＲＴプライマーミックス及び５×Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ緩衝液を、１：４の比で事前に混合した。２）ｇＤＮＡ Ｗｉｐｅｏｕｔ緩衝液中に沈殿物がある場合、ボルテックスにより溶解させた。３）テンプレートＲＮＡを氷上で解凍した。ｇＤＮＡ Ｗｉｐｅｏｕｔ緩衝液、Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ緩衝液、ＲＴプライマーミックス、及び無ＲＮａｓｅ水を、室温（１５～２５℃）で解凍した。４）ゲノムＤＮＡ除去反応を、表１２に従って氷上で準備した。５）成分を混合してから、氷上で保管した。

【0441】

【表21】

【0442】

６）．混合物を４２℃でインキュベートし、その後直ちに氷上に置いた。７）．逆転写マスターミックスを、表１４に従って氷上で調製した。

【0443】

【表22】

【0444】

８）．ステップ３のテンプレートＲＮＡ（１４μｌ）を、逆転写マスターミックスを含有する各チューブに添加した。９）．成分を混合し、その後氷上で保管した。１０）．混合物を４２℃で１５分間インキュベートした。１１）．混合物を、９５℃で３分間インキュベートし、Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を不活化した。１２）．終了した各逆転写反応の分割量をリアルタイムＰＣＲミックスに添加した。１３）．逆転写反応を氷上で保管し、そのままリアルタイムＰＣＲに進み、又は長期保存用に－２０℃で保管した。

【0445】

遺伝子発現解析
定量ＰＣＲ評価を使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムで、Ｔａｑｍａｎ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲにより相対的遺伝子発現を測定した。ｑＰＣＲ反応プレートを準備するために必要とされる成分の容積は、下記の表１４を使用して算出した。注：試薬取扱中に生じる喪失を補う余裕をもって容積を提供するために、計算には追加反応を考慮してもよい。

【0446】

マルチチャンネルピペットを使用して、６ｕＬの反応マスターミックスを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ３８４ウェル反応プレートの各ウェルに添加した。マルチチャンネルピペットを使用して、ｃＤＮＡアーカイブ反応プレートのｃＤＮＡを４ｕＬ添加した。プレートを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ接着フィルムを使用して密封した。サーマルサイクラーにかける準備ができるまで、プレートを氷上に置いておいた。ｑＰＣＲ反応は全て、三重反復で実行した。

【0447】

Ｂ）．ＤＵ１４５細胞
ＤＵ１４５培養条件：
Ｄｕ１４５細胞は、ＨｅｐＧ２と比較して、よりロバストに増殖する。Ｄｕ１４５細胞は、トリプシン処理又は過剰集密度によるストレスの影響を受けにくい。常用培地：Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕｔ（Ｓｉｇｍａ社 Ｇ１１４６）及び１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ 社 １００８２１４７）で補完されたＲＰＭ１６４９（Ｓｉｇｍａ社、Ｒ８７５８－５００ＭＬ）。

【0448】

トランスフェクションのＤＵ１４５接種密度：
ＤＵ１４５細胞は、ＨｅｐＧ２細胞より速い倍加速度を有するため、トランスフェクションの初期接種密度はより低いだろう。２４ウェル形式の場合：ＤＵ１４５＝０．８×１０^５細胞／ウェル；６ウェル形式の場合：ＤＵ１４５＝２００×１０^５細胞／ウェル。

【0449】

トランスフェクション
ＤＵ１４５細胞のトランスフェクションは、ＨｅｐＧ２細胞と同じ手順に従った。２４又は６ウェル形式のいずれかに接種した当日に、細胞を「リバーストランスフェクション」ステップにかけ、細胞が単層に接着する前に、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中のリポフェクタミン２０００に基づくｓａＲＮＡ複合体形成物を細胞に添加した。２４時間後、培地を補充してから、フォワードトランスフェクションステップを実施した。これを、更に２４時間インキュベートしてから、下流で応用するために細胞を回収した。

【0450】

ｓａＲＮＡの処理：
オリゴヌクレオチドを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡで再水和して１ｍＭにした。これは、まず、適切な容積の５×アニーリング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ；１００ｍＭ ＮａＣｌ２；５ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、その後無ＲＮａｓｅ水を添加することにより達成した。ボルテックスを穏やかに実施して、再水和を完了させた。当量容積のＡＳ鎖及びＳＳ鎖を、穏やかなボルテックスにより共に混合した。混合した鎖を有するチューブを、９５℃のｍｉｌｌｉＱ水（沸騰はさせなかった）のビーカーに配置した。ビーカーをカバーで覆って、水をゆっくりと室温に冷却させた。アニーリングしたｓａＲＮＡを分割して、－２０℃で保管した。その後、無ＲＮＡｓｅ Ｈ２Ｏを使用して希釈を実施した。

【0451】

核酸／リポフェクタミンの複合体形成
試薬は全て、手順前に室温に戻した。１トランスフェクション当たり、１．５ｕｌ／３ｕｌ（２４ウェルプレート／６ウェルプレートの場合）のリポフェクタミン２０００を、５０ｕｌ／１２５ｕｌのＯｐｔｉｍｅｍに添加した。ｓａＲＮＡを、５０ｎＭの終濃度で５０ｕｌ／１２５ｕｌのＯｐｔｉｍｅｍ（２４ウェルプレート／６ウェルプレートの場合）に添加した。希釈リポフェクタミン及びｓａＲＮＡｓを一緒にし、穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートした。

【0452】

ＤＵ１４５細胞のトランスフェクション
細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで剥離させ、その後、過剰量の完全培地を加えてトリプシンを不活化した。必要に応じて、血球計を使用して細胞数を決定する。細胞を適切な接種密度で播種した。核酸／リポフェクタミン複合体形成物を、液滴として分注し、緩衝液に浸漬したチップで添加物を撹拌することにより、穏やかに細胞に添加した。細胞は、２４時間後に、４０％～５０％程度の集密度になるはずである。２４時間後に、同じ核酸／リポフェクタミン複合体形成手順に従って、細胞を再トランスフェクションしたが、新しい４００ｕｌ増殖培地を与えた接着細胞に複合体を添加した。つまりフォワードトランスフェクションした。２４時間後に、前のステップで使用した同じフォワードトランスフェクション技法を使用して、細胞を再び再トランスフェクションした。第３のトランスフェクションの２４時間後に、ＲＮＡ抽出を実施した。

【0453】

実施例１７．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡの修飾スクリーニング
修飾スクリーニング研究を、種々の修飾を有するＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡで実施した。オリゴヌクレオチド試料の配列を、以下の表に示した。ＤＵ１４５細胞を、５０ｎＭオリゴヌクレオチドを用いて、接種時にリバーストランスフェクションし、２４時間後にフォワードトランスフェクションし、７２時間で回収した。ＣＥＢＰＡ、ＡＬＢ、ｐ２１の相対発現レベルを図５１に示した。２’Ｏ－Ｍｅ修飾は、ＳＳの方が許容されやすかった。ＡＳの５’の反対側のＳＳのミスマッチは、ｓａＲＮＡの効力を増加させた。

【0454】

【表23-1】

【0455】

【表23-2】

【0456】

実施例１８．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
Ａ）．ＨｅｐＧ２細胞
ＨｅｐＧ２細胞を、種々の方法を使用して、Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡでトランスフェクションした。非トランスフェクションＨｅｐＧ２と比較したＨｅｐＧ２細胞におけるＣＥＢＰＡ転写物の発現を、以下で測定した。通常のトランスフェクション（Ｔ）、リバーストランスフェクション（ＲＴ）、ｓａＲＮＡの５０ｎＭ終濃度の１用量（１）、２用量（２）を実施した。細胞を、２４時間、４８時間、及び７２時間で回収した。図５２Ａ～Ｄの結果により、リバーストランスフェクション（ＲＴ）が、通常トランスフェクション（Ｔ）と比較して最適であることが確認される。ｓａＲＮＡの最適な効果は、逆転写又は通常転写を両方とも使用して、７２時間の時点で検出された。二重トランスフェクション（２用量、第１のトランスフェクションの２４時間後に第２のトランスフェクション）は、少なくとも４倍の増加をもたらした。

【0457】

Ｂ）経時的研究
ＨｅｐＧ２、ＤＵ１４５、及びＡＭＬ１２細胞を、経時的研究用にＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ（ＣＥＢＰＡ－ＡＷ０１－５０００００）でトランスフェクションした。細胞を、１．３×１０^５細胞／ウェル（ＤＵ１４５の場合、８×１０^４細胞）で２４ウェルプレートに接種し、リバーストランスフェクションし、その２４時間後にフォワードトランスフェクションした。各トランスフェクションの４時間後に培地を交換した。細胞を、接種の２４時間、４８時間、及び７２時間後に回収した。ＣＥＢＰＡ、ＡＬＢ、サイクリン、及びｐ２１のｍＲＮＡレベルを測定した。

【0458】

Ｃ）．ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡによるＨｅｐＧ２、ＤＵ１４５、及びＡＭＬ１２の比較
ＨｅｐＧ２及びＡＭＬ１２の接種は、１．２×１０^５／ウェル（２４ウェルプレート形式）だった。ＤＵ１４５接種は、０．８×１０^５／ウェル（２４ウェルプレート形式）だった。リバーストランスフェクションを０日目に、フォワードトランスフェクションを１日目に実施した。２４時間時点＝３日目。４８時間時点＝４日目。７２時間時点＝５日目。９６時間時点＝６日目。５０ｎＭのｓａＲＮＡ（スクランブル又はＣＥＢＰＡ）をトランスフェクションした。培地を２４時間毎に交換した。ｑＰＣＲを実施して、相対的定量化を測定した（基線＝未トランスフェクション）。ＣＥＢＰＡ、ｐ２１、及びアルブミン発現を測定した。ＨｅｐＧ２データを図５３Ａ～Ｇに、ＤＵ１４５を図５４Ａ～ｇに、及びＡＭＬ１２を図５５Ａ～Ｇに示した。

【0459】

実施例１９．製剤化したＣ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ研究
Ａ）．製剤化したＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション分析
ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを、ＮＯＶ３４０（Ｍａｒｉｎａ社）で製剤化した。ＤＵ１４５及びＨｅｐＧ２細胞を、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、及び３００ｎＭのＮＯＶ３４０－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを用いて、接種時にリバーストランスフェクションし、２４時間後にフォワードトランスフェクションし、７２時間で回収した。図５６Ａ～図５６Ｆの結果は、直接標的であるＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ並びに近位標的であるアルブミンｍＲＮＡ及びｐ２１ ｍＲＮＡの標的結合の証拠を示さなかった。

【0460】

Ｂ）．野生型のマウスにおける製剤化ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ研究
ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを、デンドリマー－ＭＴＬ－５０１及びＮＯＶ３４０（Ｍａｒｉｎａ社）で製剤化した。２つのｉｎ ｖｉｖｏ研究を、野生型マウスで実施した（各研究でｎ＝５）。野生型マウスには、デンドリマー－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ及びＮＯＶ３４０－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを３用量で投与して、最後の用量の２日後に屠殺した（図５７Ａ）。血清アルブミンレベルを、図５７Ｂ及び図５７Ｅに示した。ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡレベルを、図５７Ｃ及び図５７Ｆに示した。アルブミンｍＲＮＡレベルを、図５７Ｄ及び図５７Ｇに示した。血清アルブミンレベル及びアルブミンｍＲＮＡのレベルは上方制御され、近位標的結合を示した。しかしながら、直接標的結合の証拠はなかった。

【0461】

Ｃ）．ＤＥＮラットにおける製剤化ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ研究
１つのｉｎ ｖｉｖｏ研究を、ＤＥＮラットで実施した（ｎ＝６）。ＨＣＣモデルは、肝硬変及び自然発生肝腫瘍を誘導する。ラットにジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を７週間与え、その後水を３週間与えた。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡの種々の製剤による処置は、腫瘍発生直後に開始した。ラットには、５日間で３回のＩＶ注射を施し、その後７日間モニタリングした（図５８Ａ）。その後、ラットを屠殺して、組織学的検査、並びに肝臓ｍＲＮＡ及び血清タンパク質の測定を行った。１２日目の腫瘍量を図５８Ｂに示した。１２日目の血清ビリルビンレベルを、図５８Ｃに示した。ＡＬＴ肝酵素レベルを図５８Ｄに示した。血清アルブミンレベルを、図５８Ｅに示した。１２日目のコレステロールレベルを、図５８Ｆに示した。ＣＥＢＰＡ上方制御、腫瘍増殖の強力な阻害、肝機能（血清ビリルビン及びＡＬＴ）の改善、及び肝臓代謝（血清コレステロール）の改善が観察された。

【0462】

実施例２０． 製剤化Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ比較
Ａ）．野生マウス
ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを、デンドリマー－ＭＴＬ－５０１及びＮＯＶ３４０（Ｍａｒｉｎａ社）－ＣＥＢＰＡ／ＮＯＶ３４０で製剤化した。製剤を野生型マウスに投与した。アルブミンＥＬＩＳＡの結果を、図５９Ａ～図５７Ｂに示した。図５９Ｂは、ＥＬＩＳＡ測定に基づいて血清アルブミンレベルを算出することができることを示した。アルブミンは、ＭＴＬ－５０１及びＣＥＢＰＡ／ＮＯＶ３４０により上方制御された。ＣＥＢＰＡ及びアルブミンのｍＲＮＡレベルを測定した。全ＲＮＡを抽出し、５００ｎｇを逆転写した。ＣＥＢＰＡ及びアルブミンの相対発現レベルを図５９Ｃ～図５９Ｄに示した。こうした結果により、ＣＥＢＰＡ及びアルブミンが、ＭＴＬ－５０１及びＣＥＢＰＡ／ＮＯＶ３４０により上方制御されたことが更に確認された。また、異なる用量レベルのＣＥＢＰＡ／ＮＯＶ３４０（０．５ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）を、野生型マウスに投与した。

【0463】

Ｂ）．ＤＥＮラット
ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを、デンドリマー－ＭＴＬ－５０１及びＮＯＶ３４０（Ｍａｒｉｎａ社）－ＣＥＢＰＡ／ＮＯＶ３４０で製剤化した。製剤を、「動物実験」項に記載されているものと同じ方法を使用して、ＤＥＮラットに投与した。ＤＥＮラットの体重、肝臓重量、腫瘍容積を、下記の表１６、図６０Ａ、及び図６０Ｂに示した。腫瘍容積は、全ての製剤／用量で有意に縮小した。

【0464】

【表24-1】

【0465】

【表24-2】

【0466】

【表25】

【0467】

実施例２１．Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ作用機序の研究
Ｃ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ作用機序を研究するために実験を行った。
１）．抗ビオチンポリクローナル抗体を使用してクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）で濃縮したゲノムＤＮＡを使用したＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の分析：
Ｃ／ＥＢＰα－ｓａＲＮＡ及びスクランブル－ｓａＲＮＡをビオチンで標識した。ＨｅｐＧ２細胞を、ビオチン－Ｓｒａｍｂｌｅ－ｓａＲＮＡ又はビオチンＣ－ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションした。細胞を、１％ホルムアルデヒドで固定し、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を架橋した。核抽出物を超音波処理して、ゲノムＤＮＡを２００／３００ｂｐ断片に煎断した。その後、断片を、抗ビオチンポリクローナル抗体を使用して免疫沈殿した。その後、免疫複合体を精製し、架橋を元に戻し、プロテイナーゼＫと共にインキュベートした。残留ゲノムＤＮＡを、フェノール／クロロホルムを使用して精製し、以下の遺伝子プロモーターの存在についてスクリーニングした：ＣＥＢＰＡ、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）、ＡＦＰ、ＮＡＢ１（陰性対照）、ＩＧＸ１Ａ（ＥｐｉＴｅｃｔ ＣｈＩＰ 陰性対照 Ｑｉａｇｅｎ社）。

【0468】

ウエスタンブロットにより、トランスフェクションＨｅｐＧ２細胞にビオチン標識ｓａＲＮＡが存在することを確認した。トランスフェクション細胞抽出物を、抗ビオチンポリクローナル抗体を使用して免疫沈殿した。結果を図６１Ａに示した。１．図６１Ｂに示されているように、トランスフェクションＨｅｐＧ２細胞に由来する断片化ゲノムＤＮＡを、５％アガロースゲル電気泳動で分離した。

【0469】

ビオチン標識ｓａＲＮＡのＣｈＩＰ－Ｓｅｑを実施して、ｓａＲＮＡが、どのプロモーター領域と結合しているかをゲノム全体にわたって研究した。抗ビオチンを使用してクロマチン免疫沈殿したゲノムＤＮＡを、Ｃ／ＥＢＰＡ、ＡＦＰ、ＣＤＫＮ１Ａ、及びＮＡＢ１のＴＳＳ断片の存在についてスクリーニングした。ＩＧＸ１Ａは、バックグラウンドを評価するための、このアッセイの内部陰性対照である。ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ ＩＧＸ１Ａ陰性対照プライマーにより、ＣｈＩＰ手順中に共沈する非特異的ゲノムＤＮＡの量が測定される。ＩＧＸ１Ａは、ヒト染色体１２ Ｒｅｆ ｓｅｑ：ＮＣ＿００００１２．１１上の、あらゆる既知又は予測構造遺伝子を欠如するＯＲＦ非含有遺伝子間領域又は「無プロモーター地帯（promoter desert）」内の特異的ゲノムＤＮＡ配列を検出する。図６２Ａ～図６２Ｅの結果は、Ｃ／ＥＢＰＡプロモーター領域のみが存在していたことを示す。

【0470】

２）．抗Ｐｏｌ－ＩＩによるＣｈＩＰ－Ｓｅｑを実施して、プロモーター活性化及び転写活性の領域を特定する。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３／Ｈ３ＫＡｃ／Ｈ３Ｋ２７ｍｅ等の後成的変化の証拠については、他の抗体を使用することができる。

【0471】

３）．それらが特定されたら、１）及び２）でのＣｈＩＰ－Ｓｅｑの代わりにＲＩＰを実施して、ｓａＲＮＡの濃縮及びｎｃＲＮＡの種々のタンパク質を測定する。
４）．Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを実施して、２）で特定した遺伝子／プロモーターを検証する。ｓａＲＮＡはビオチン標識されていない。

【0472】

５）．鎖特異的ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＡＣＥ－ＰＣＲ、及びＲＮＡ－ＦＩＳＨを含む実験を実施して、上記で特定したＣ／ＥＢＰＡプロモーター及び他の非特異的プロモーターの潜在的なアンチセンスｎｃＲＮＡの特定及び特徴付けを行った。

【0473】

６）．細胞を、Ａｇｏタンパク質全てに対するｓｉＲＮＡ、並びにＣ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡでトランスフェクションして、どのＡｇｏがＣ／ＥＢＰＡ発現の上方制御に必要であるかを特定する。

【0474】

７）．細胞を、ＣＲＩＳＰＲでトランスフェクションして、翻訳されるタンパク質を突然変異させずに、標的プロモーター配列を突然変異させ、ｓａＲＮＡが、特異的な転写制御により作用しているか否かを判断する。

【0475】

８）．定方向ＲＴ－ＰＣＲは、プロモーター領域での鎖特異的転写物を示している。ｎｃＲＮＡの証拠となるはずである。
９）．転写活性が起こっている箇所をゲノム全体にわたって研究するために、核内走査（nuclear run）を実施する。また、リボソーム遮断剤を使用して、ｓａＲＮＡのあらゆる転写非特異的効果を示す。

【0476】

１０）．細胞を、ｎｃＲＮＡ、例えばＣＥＢＰＡ－ＡＳ１を標的としてｎｃＲＮＡを分解するギャップマーでトランスフェクションする。ｓａＲＮＡトランスフェクション及びＣＥＢＰＡ上方制御を研究して、ｎｃＲＮＡが分解された場合に何らかの影響があるか否かを決定する。

【0477】

実施例２２．外科支援療法のためのＣＥＢＰＡ
動物実験
臨床的に意義のあるラット硬変症モデルを、本明細書に記載のように使用した。６週齢の雄ウィスターラット（１５０～１８０ｇ）を国立台湾大学動物センターから得た。ラットを、標準的条件で収容し、実験は全て、国立台湾大学の組織内実験動物委員会により準備された「実験動物の管理と使用に関する指針」に従って実施した。これら動物には、飲料水の唯一の供給源としてジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）溶液（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州）を、第１週での１００ｐｐｍから開始して毎日、９週間与えた。動物の平均ＢＷを週１回測定して、第１週のＢＷと比較し、ＢＷに比例して動物の飲料水中のＤＥＮの濃度を毎週調整した。ＤＥＮ投与の９週間後、その時点で肝硬変を認めることができた。ラットを、各群１０匹の３群に無作為分割した。群１は、Ｃ／ＥＢＰａ－ｓａＲＮＡ処置を受け、群２は、スクランブル－ｓａＲＮＡ処置を受け、群３は、その代わりにＰＢＳを受容し、対照としての役割を果たした。

【0478】

ｉｎ ｖｉｖｏ治療の場合、Ｃ／ＥＢＰａ－ｓａＲＮＡを、上述のように、１００ｕＬの無ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ Ｈ２Ｏ；５０ｌＬの２０ｎＭ ｓａＲＮＡオリゴヌクレオチド、及び５０ｕＬのＴＥＡコアＰＡＭＡＭデンドリマーで再構成した。

【0479】

１０匹の硬変症動物を、第１週に尾静脈注射による３×用量で処置した。対照動物（ｎ＝１０）には、等容積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はスクランブル－ｓａＲＮＡを注射した。

【0480】

最後のｓａＲＮＡ－Ｃ／ＥＢＰα：デンドリマーを注射した７日後に、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＧＭ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｓｏｎ ＲＭ、“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ：Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅ ｒａｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｒｅｍｏｖａｌ”、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．、１２巻：１８６～２０２頁（１９３１年）の手順に従って、正中葉及び左側葉の無菌除去による正中線開腹術後に部分的（７０％）肝切除術を、全てのラットに対して実施した。この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる。簡潔に述べると、全身麻酔（ケタミン４０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）をかけた背臥位の動物の腹部に上部正中切開を施し、その後、周囲の靭帯を注意深く切除することにより、肝臓の正中葉及び左葉を動かせるようにした。その後、正中葉及び左葉の基部を縛って切除した。その後、回収した肝組織を、その後の組織学的検査のために幾つかの部分に分割し（術後０日目の試料、ＰＯＤ０と表記した）、１０％ホルマリンに浸漬し、残りは、液体窒素で急速冷凍し、２週間後に動物をＣＯ２吸入で屠殺した際に得た組織（術後７日目の試料、ＰＯＤ０と表記した）と比較するためのタンパク質及び分子分析に必要とされるまで、－８０℃で保管した。また、肝切除術中に切除した肝葉、並びに追跡調査期間の終わりに切除したものを計量し、比較のために、肝臓対体重比（ＬＷ／ＢＷ×１００％）を検証した。肝臓重量の変化を、肝性再生率（ＲＲ）として評価した。ＲＲは、安楽死時の体重１００ｇ当りの肝臓体重／体重１００ｇ当りの術前推定肝臓重量と定義されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＪら、“Ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ”、Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ、１９１巻（２号）：３３１～３３８頁（２０１４年）、この文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組みこまれる）。術前推定全肝臓重量は、切除した肝臓重量（術前の全肝臓重量の７０％）から算出した。このモデルでは、復元プロセスの開始は１２～１６時間後に生じ、復元刺激の２４時間後にＤＮＡ合成が最初のピークに達し、その後３６～４８時間に別の強度がより低いピークに達する。除去した肝臓質量の回復は、２～３週以内に起こる。

【0481】

免疫組織化学及び組織学的染色
部分切除術後の肝臓再生能力を検出するために、ラットには全て、肝切除術後の７日目に屠殺する２時間前に、１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量のＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ社；セントルイス、ミズーリ州）を単回ＩＰ注射した。肝切除術中に切除された肝臓葉並びに追跡調査期間の終了時に切除されたものを、以下のように、固定し、パラフィン包埋し、６μｍ切片に加工した。ＢｒｄＵの免疫染色を、肝切除後の肝臓に実施した。ＢｒｄＵで染色するために、切片を、モノクローナルマウス抗ＢｒｄＵ １：１００（ＭＯ７４４クローンＢＵ２０Ａ；ＤＡＫＯ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ社）と共に６０分間インキュベートし、その後、二次抗体、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗マウス１：４００（Ｅ０４６４；ＤＡＫＯ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ社）で２５分間インキュベートした。その後、切片を、ＡＢＣ ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｋｉｔ（ＰＫ６１００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）で３０分間インキュベートし、ＤＡＢ Ｉｍｍｐａｃｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）基質で５分間発色させた。切片を、ヘマトキシリン（マイヤーヘマトキシリン；Ｈｉｓｔｏｌａｂ社、エーテボリ、スウェーデン）で対比染色した。ＢｒｄＵの標識率を、肝細胞の総数に対する、それぞれ陽染色された肝細胞核間の比率として算出した。切片の１５箇所の無作為計数領域の累加平均値を、光顕微鏡検査（４００×）で算出した。

【0482】

Ｋｉ－６７又は増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のＩＨＣを示すために、組織切片の内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、抗原回収溶液（０．０１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）に入れ、６００Ｗで１５分間１００℃にて電子レンジ加熱した。カゼイン阻止でのインキュベーション後、モノクローナルマウス抗ラットＫｉ－６７特異的抗体（クローンＭＩＢ－５、アイソタイプＩｇＧ１；Ｄａｋｏ社、グロストルプ、デンマーク）又はマウスＭＡｂ抗ＰＣＮＡ（クローンＰＣ１０；ＤＡＫＯ社）を、それぞれ１：２０及び１：５０００の希釈で切片にアプライした。切片を、一次抗体と共に４日間４℃にてインキュベートした。切片を洗浄し、陽性シグナルを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス検出系（Ｄａｋｏ社）を使用して視覚化し、切片をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、マウントした。細胞の数を、各スライド当たり５箇所の異なる視野で計数し、ＰＣＮＡ又はＫｉ－６７陽性／総肝細胞の比を算出した。

【0483】

血清の生化学的分析
肝切除術及び屠殺の直前に、静脈穿刺により血液試料を採取し、直ちに１３００×ｇで４℃にて遠心分離し、血漿を生化学的分析用に－２０℃で保管した。アルブミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン、及びガンマ－グルタミルトランスペプチターゼ（γ－ＧＴ）のレベルを、市販の酵素キットを使用して、自動生化学分析機（２００ＦＲ；東芝、日本）で決定した。肝切除術前の血中レベルを、基準レベルとして記載した。

【0484】

結果
実施例１に示されているように、肝硬変／ＨＣＣを担持する雄ウィスターラットにＣ／ＥＢＰａ－ｓａＲＮＡを静脈内注射すると、アルブミンの循環レベルの増加、肝機能の回復、及び腫瘍量の低減が促進された。

【0485】

７０％肝切除術後の硬変症動物の生存：
各群の１０匹のラットを手術して、生存率を検証した。７０％肝切除術後、硬変症動物の生存率をモニターした。対照動物群（５／１０）及びスクランブル－ｓａＲＮＡ群（５／１０）の５０％が、７日目後には死亡していたが、Ｃ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡで処置した動物の生存率は、１００％（１０／１０）だった。Ｃ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ処置後の硬変症動物の手術死亡率の有意な減少が認められた（ｐ＝０．０３、対照群又はスクランブル－ｓａＲＮＡ群との比較、フィッシャー直接検定による）。

【0486】

残存肝再生：
肝切除術の７日後、群１の再生率は、群２（ｐ＝０．００６）及び群３（ｐ＝０．０１）の再生率と比較して、Ｃ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ処置後に有意な上昇を示したが、群２及び群３間には有意差はなかった。肝切除術前後の３群には体重に有意差がなかったため（データ非表示）、群３の速度増加は、体重の変化では説明することはできない。

【0487】

Ｂｒｄ Ｕ標識率：
Ｂｒｄ Ｕ標識細胞の数は、対照群（ｐ＝０．００１）及びスクランブル－ｓａＲＮＡ群（ｐ＝０．０２４）とは対照的に、肝切除術７日後のＣ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ群で非常により高かった。対照群から得た肝臓の幾つかの領域は、Ｂｒｄ Ｕ陽染色細胞を含有していなかった。

【0488】

ＰＣＮＡ及びＫｉ６７アッセイ：
ＰＣＮＡ陽染色細胞の数は、肝切除術７日後のＣ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ群で非常により高かった。ＰＣＮＡ標識率は、対照群（ｐ＝０．０１７）とは対照的に、Ｃ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ群において有意により高かったが、スクランブル－ｓａＲＮＡ群（ｐ＝０．０６）とは有意差はなかった。Ｋｉ－６７標識率は、対照群（ｐ＝０．００１）及びスクランブル－ｓａＲＮＡ群（ｐ＝０．０１４）の両方と対照的に、Ｃ／ＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ群において有意により高かった。

【0489】

処置前肝臓重量／体重、処置後肝臓重量／体重、再生率、及びＢｒｄＵ、ＰＣＮＡ、又はＫｉ－６７標識率の数値を、表１７及び図６３Ａ～６３Ｄに示した。

【0490】

【表26-1】

【0491】

【表26-2】

【0492】

考察
Ｃ／ＥＰＢａ－ｓａＲＮＡの潜在的な治療価値を試験するために、硬変症ラットモデルを使用してｉｎ ｖｉｖｏ研究を引き続き実施した。Ｃ／ＥＰＢａ－ｓａＲＮＡを標的送達するために、二本鎖ＲＮＡ分子を陽イオン性ＰＡＭＡＭデンドリマーに連結した。これらナノ粒子は、以前に評価されており、生体内分布研究によると、ナノ粒子は、末梢血単核細胞及び肝臓に優先的に蓄積し、毒性は認められなかったことが示されている。１週間にわたるＣ／ＥＰＢａ－ｓａＲＮＡ－デンドリマーの静脈内注射は、ＰＢＳ対照群又はスクランブル－ｓａＲＮＡ－デンドリマー群と比較して、７０％肝切除術後の生存率の有意な向上を示した。

【0493】

更に、肝再生の向上が、Ｃ／ＥＢＰａ－ｓａＲＮＡ処置群に由来する肝臓切片におけるＢｒｄ Ｕ、ＰＣＮＡ、及びＫｉ－６７染色の増加により検出された。臨床的視点から、これは、硬変症患者の手術死亡率を減少させ、肝臓切除術からの回復を加速させるために魅力的な治療手段である。

【0494】

上記の結果は、Ｃ／ＥＰＢａ－ｓａＲＮＡの反復処置が、肝臓切除術後のラットの線維症肝臓の再生に肯定的な影響を示すことができ、硬変症動物の手術死亡率を減少させることになることを示唆する。

【0495】

ＣＥＢＰＡ処置に関する仮説
ＨＣＣに関与する遺伝子としては、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、及びＨＮＦ４が挙げられる。いかなる理論にも束縛されることは望まないが、図６４に図示されているように、ＣＥＢＰＡは、分化癌（６０％）及び未分化癌（４０％）を含むＨＣＣ癌だけでなく、アルブミン及び凝固因子の産生不全を引き起こす肝不全にも関与する。また、図６４には、種々の療法の患者階層化が含まれている。チャイルドピューは、肝硬変のスコアリング体系である。Ａは健康、Ｃは非常に不健康である。分化は、ＨＣＣ腫瘍を指す。％は、進行ＨＣＣ患者集団に対する、指定されている分化の割合の推定である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡは、ＣＥＢＰＢ－ＬＩＰ－２０ＫＤ抑止後に低ＣＥＢＰＡ発現を示すＨＣＣ及び高ＣＥＢＰＡを示すＨＣＣ等、別々の増殖条件で使用してもよい。一方、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡは、肝臓切除の大手術後の肝再生を支援するために使用してもよい。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡは、状況に応じて、増殖の停止又は増殖の増強に対して臨床的に有用である能力を有する。このように、ＣＥＢＰＡは、ラット肝臓の７０％除去後の再生率を向上させたため、支持療法として使用することができる。

【0496】

実施例２３．更なるｓａＲＮＡ配列
バイオインフォマティクスホットスポット（ＡＷ１、ＡＷ２、ＰＲ２）周囲でヌクレオチドウォーク（nucleotide walk）を実施した。ｓａＲＮＡ配列を、交差反応性及び潜在的な非特異性最小化効果について、プレスクリーニングした。ｓａＲＮＡｓの配列を、表１８に示した。

【0497】

【表27-1】

【0498】

【表27-2】

【0499】

【表28-1】

【0500】

【表28-2】

【0501】

ｓａＲＮＡを、ＨｅｐＧ２細胞においてｂＤＮＡアッセイ系を用いて四重反復でスクリーニングし、ＣＥＰＢＰＡ ｍＲＮＡ（標的）、アルブミンｍＲＮＡ（下流）、及びｐ２１ ｍＲＮＡ（下流）のレベルを測定した。結果を、図６５Ａ～６５Ｃに示した。また、それらを、ＤＵ１４５細胞においてスクリーニングし、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ（標的）及びｐ２１ ｍＲＮＡ（下流）のレベルを測定した。細胞は全て、０時間でリバーストランスフェクションし、２４時間でフォワードトランスフェクションし、その後、７２時間で回収した。結果を、図６５Ｄ～６５Ｅに示した。２つの濃度のｓａＲＮＡを使用した：８ｎＭ及び５０ｎＭ。

【0502】

幾つかのｓａＲＮＡに関する用量応答研究を、ＨｅｐＧ２細胞及びＤＵ１４５細胞においてｂＤＮＡアッセイ系を用いて四重反復で実施した。ＨｅｐＧ２細胞におけるＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ（図６６Ａ）、アルブミンｍＲＮＡ（図６６Ｂ）、及びｐ２１ ｍＲＮＡ（図６６Ｃ）のレベルを測定した。結果を、ＨｅｐＧ２細胞におけるＧＡＰＤＨレベル及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、図６６Ｄに示した。ＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ（図６６Ｅ）及びｐ２１ ｍＲＮＡ（図６６Ｆ）のレベルを測定した。結果を、ＤＵ１４５細胞におけるＧＡＰＤＨレベル及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、図６６Ｇに示した。細胞は全て、０時間でリバーストランスフェクションし、２４時間でフォワードトランスフェクションし、その後、７２時間で回収した。４つの濃度のｓａＲＮＡを使用した：１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、及び１０ｎＭ。

【0503】

ＨｅｐＧ２細胞を、５０ｎＭ ＣＥＢＰＡ－ＡＷ０１－５１００００（ＸＤ－０３３０２）を用いて、接種時にリバーストランスフェクションし、２４時間後にフォワードトランスフェクションし、７２時間で回収した。図６７に示されているように、ＡＬＢ、ＣＥＢＰＡ、ｅｃＣＥＢＰＡ、及びＳＴＡＴ３の活性化が観察された。

【0504】

表１８のｓａＲＮＡ配列は、表１９に示されているように、例えば、これらに限定されないが、２’Ｏ－Ｍｅ修飾、逆位脱塩基修飾で修飾されていた。ＨｅｐＧ２細胞及びＤＵ１４５細胞を、種々の濃度（５ｎＭ及び１０ｎＭ）の化学的修飾ｓａＲＮＡ配列でトランスフェクションし、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡ、ｐ２１ ｍＲＮＡ、アルブミンｍＲＮＡ、及びＡＦＰ ｍＲＮＡのレベルを、ｂＤＮＡアッセイで測定した。結果を、下記の表（表２０～表２６）並びに図６８Ａ～図６８Ｅ及び図６９Ａ～図６９Ｂに示した。模擬薬で処置した細胞の発現＝１。図中の暗色は、親ｓａＲＮＡだった。図中の淡色は、陰性対照だった。ＤＵ１４５細胞を、Ａｈａ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、Ａｈａ ｍＲＮＡレベルを、トランスフェクション対照として測定した（図６９Ｃ）。

【0505】

【表29-1】

【0506】

【表29-2】

【0507】

【表30-1】

【0508】

【表30-2】

【0509】

【表31】

【0510】

【表32】

【0511】

【表33】

【0512】

【表34】

【0513】

【表35】

【0514】

【表36】

【0515】

【表37】

【0516】

加えて、トランスフェクション最適化研究を、単回トランスフェクション及び二重トランスフェクションで施した。ＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェル形式で接種した（１．０×１０^５細胞／ウェル）。単回トランスフェクションを、種々の量（５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、及び２０ｎＭ）のＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡを使用して実施した。ＡＷ１及びＡＷ１＋１を試験した。この場合、２つのＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡの標的は、ヌクレオチド１個分離れている。ＡＷ１は、ＡＷ０１－５００００００を指し、ＡＷ１＋１は、ＡＷ０１－５１０００（別名 ＡＷ１－５１）を指す。細胞を、２４時間、４８時間、及び７２時間で回収し、ｑＰＣＲ分析を行った。或いは、二重トランスフェクション法を使用した。リバーストランスフェクション及びフォワードトランスフェクション（二重トランスフェクション）を、種々の量のＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ（５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、及び２０ｎＭのＡＷ１＋１－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ）を使用して実施した。細胞を、第２のトランスフェクションの２４時間、４８時間、及び７２時間後に回収し、ｑＰＣＴ分析を行った。単回トランスフェクションの結果を図７０Ａに示し、二重トランスフェクションの結果を図７０Ｂに示した。単回トランスフェクション法又は二重トランスフェクション法のいずれでも、ＡＷ１＋１での至適結果が達成された。

【0517】

ＣＥＢＰ－ルシフェラーゼリポーターアッセイを、ＨｅｇＧ２（Ｐ８）細胞で実施した。ＣＥＢＰ応答性エレメント（ＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴ）を、ｍＣＭＶプロモーターの制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて構築した。これは、二重リポーターカセットであり、したがって、トランスフェクション効率を正規化し、細胞生存率をモニターするための内部対照としてウミシイタケルシフェラーゼを有していた。その後、この二重ＣＥＢＰ（ｌｕｃ）リポーターアッセイにより、ＡＷ５０に応答した細胞でのＣＥＢＰＡ転写活性を、ＡＷ５１と比較して、迅速にモニターすることになる。

【0518】

接種密度は、９６ウェル形式の１．５×１０^５細胞／ウェルだった。１００ｕＬ ＲＰＭＩ中の５％ＦＣＳ（ＰＳＧ非含有）を、リバーストランスフェクションの一次接種に使用した。ＦＣＳは、細胞培養中に基本培地を補完するために使用されるウシ胎仔血清を指す。ＰＳＧは、ペンシリン（Pencillin）、ストレプトマイシン、及びＬ－グルタミンを指す。ペンシリン及びストレプトマイシンの組み合わせは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の増殖を防止する。リポフェクタミン２０００：ｓａＲＮＡ：ルシフェラーゼ構築体複合体は、５０ｕＬのＲＰＭＩ中にあった。総容積／ウェルは、１５０ｕＬだった。スクランブル、ＡＷ－５０（ａｋａ ＣＥＢＰＡ－ＡＷ１－５０００００）、又はＡＷ５１（別名 ＣＥＢＰＡ－ＡＷ１－５１００００）の濃度は、１０ｎｇ／ウェルだった。ＣＥＢＰＡ応答エレメント－Ｌｕｃ－プラスミドは、１００ｎｇ／ウェルだった。ＣＥＢＰＡ応答エレメント（ＣＲＥ）プラスミドは、トランスフェクション効率を検出するために、サイトメガロウィルスプロモーターの下流のウミシイタケに加えて、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にタンデムＣＲＥを含有している。ＣＥＢＰＡは、転写及び翻訳されると、このリポーターカセットに結合し、ルシフェラーゼの発現を引き起こすことになる。ＣＥＢＰ応答エレメントルシフェラーゼ構築体は、Ｑｉａｇｅｎ社から市販されている（カタログＣＣＳ－００１Ｌ）。完全ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋ＰＳＧを、フォワードトランスフェクションに使用した。細胞を、フォワードトランスフェクションの４８時間後又は最初の接種の７２時間後に回収した。２０ｕＬの受動溶解緩衝液、５０ｕＬのＬＡＲＩＩ Ｌｕｃ酵素基質、５０ｕＬのウミシイタケ測定停止反応を使用した。ＬＡＲＩＩは、Ｐｒｏｍｅｇａ社（カタログＥ１９１０）の記載によるとルシフェラーゼ活性化試薬ＩＩである。試薬は、ルシフェラーゼの酵素活性が、細胞から発光を発生させるルシフェリル－ＡＭＰ中間体を生成するために必要なマグネシウム及びＡＴＰに加えて、基質（ルシフェリン）を含有する。測定パラメータは、測定前に２秒間の遅延があり、その後測定時間は１０秒間だった。結果を表２７及び図７１に示した。ＣＥＢＰＡ－Ｌｕｃ応答は、ＡＷ５０（ａｖｖ ＲＬＵ：１４．８７）及びＡＷ５１（ａｖｖ ＲＬＵ：２４．２０）の両方で観察された。スクランブル誘導性ＣＥＢＰＡ－Ｌｕｃ応答は、４．４２のａｖｖ ＲＬＵを示した。したがって、ＡＷ５０（別名 ＣＥＢＰＡ－ＡＷ１－５０００００）及びＡＷ５１（別名 ＣＥＢＰＡ－ＡＷ１－５１００００）は両方とも、ルシフェラーゼリポーターアッセイでは上方制御を示した。

【0519】

【表38】

【0520】

更に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サイトカインアッセイを実施して、免疫能を測定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン産生を、免疫能の指標として測定した。ＰＢＭＣアッセイを、ＡＷ５０及びＡＷ５１の種々の修飾について実施した。２人の匿名ドナーに由来する全血を取得し、感染因子についてプレスクリーニングした。ヒト末梢血単核細胞を遠心分離により単離し、１ウェル当り約１００，０００細胞で播種した。ｓａＲＮＡのトランスフェクションを、ＤＯＴＡＰを使用して実施した。トランスフェクションの約２０時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ－α及びＴＮＦ－αの産生を直ちに分析した。各処置は、２人のドナー全てについて二重反復で分析した。ｓａＲＮＡｓの配列を、下記の表２８に示した。

【0521】

【表39-1】

【0522】

【表39-2】

【0523】

ＴＮＦ－α応答に関するＰＢＭＣアッセイでは、新たに単離したＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰ（ｄｓ－ＲＮＡ）でトランスフェクションした。平滑末端２５量体ＲＮＡ（トランスフェクション）、ＣｐＧ－モティーブ（motive）一本鎖オリゴヌクレオチド（直接インキュベーション）、ｃｈｏｌ結合ｓｉＲＮＡ（直接インキュベーション）を陽性対照として使用した。インキュベーション時間は、２０時間だった。ｈｓＴＮＦ－αについてＥＬＩＳＡを実施した。結果を図７２Ａ及び表２９に示した。

【0524】

【表40-1】

【0525】

【表40-2】

【0526】

ＩＮＦ－α応答に関するＰＢＭＣアッセイでは、新たに単離したＰＢＭＣを、Ｇｅｎｅｐｏｒｔｅｒ－２対照（ｄｓ－ＲＮＡ）でトランスフェクションした。平滑末端２５量体ＲＮＡ（トランスフェクション）、ＣｐＧ－モティーブ一本鎖オリゴヌクレオチド（直接インキュベーション）、ｃｈｏｌ結合ｓｉＲＮＡ（直接インキュベーション）を陽性対照として使用した。インキュベーション時間は、２０時間だった。ｈｓＩＮＦ－αについてＥＬＩＳＡを実施した。結果を図７２Ｂ及び表３０に示した。

【0527】

【表41-1】

【0528】

【表41-2】

【0529】

他の実施形態
本開示は、その詳細な説明と共に記載されているが、上述の説明は例示が目的であり、本開示の範囲を限定するものでなく、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲により規定されることが理解されるべきである。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図32D】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図33D】

【図34】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図35D】

【図35E】

【図35F】

【図35G】

【図35H】

【図35I】

【図35J】

【図35K】

【図35L】

【図35M】

【図35N】

【図35O】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図36D】

【図36E】

【図36F】

【図36G】

【図36H】

【図36I】

【図36J】

【図36K】

【図36L】

【図36M】

【図37A】

【図37B】

【図37C】

【図37D】

【図37E】

【図37F】

【図37G】

【図37H】

【図37I】

【図37J】

【図37K】

【図37L】

【図37M】

【図38A】

【図38B】

【図38C】

【図38D】

【図38E】

【図38F】

【図38G】

【図38H】

【図38I】

【図38J】

【図38K】

【図38L】

【図38M】

【図38N】

【図38O】

【図38P】

【図38Q】

【図38R】

【図38S】

【図38T】

【図38U】

【図38V】

【図38W】

【図39A】

【図39B】

【図39C】

【図39D】

【図39E】

【図39F】

【図39G】

【図39H】

【図39I】

【図39J】

【図40A】

【図40B】

【図40C】

【図41】

【図42】

【図43A】

【図43B】

【図44A】

【図44B】

【図44C】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49A】

【図49B】

【図49C】

【図49D】

【図49E】

【図49F】

【図50A】

【図50B】

【図50C】

【図50D】

【図50E】

【図51】

【図52】

【図53A】

【図53B】

【図53C】

【図53D】

【図53E】

【図53F】

【図53G】

【図54A】

【図54B】

【図54C】

【図54D】

【図54E】

【図54F】

【図54G】

【図55A】

【図55B】

【図55C】

【図55D】

【図55E】

【図55F】

【図55G】

【図56A】

【図56B】

【図56C】

【図56D】

【図56E】

【図56F】

【図57A】

【図57B】

【図57C】

【図57D】

【図57E】

【図57F】

【図57G】

【図58A】

【図58B】

【図58C】

【図58D】

【図58E】

【図58F】

【図59A】

【図59B】

【図59C】

【図59D】

【図60】

【図61】

【図62A】

【図62B】

【図62C】

【図62D】

【図62E】

【図63A】

【図63B】

【図63C】

【図63D】

【図64】

【図65A】

【図65B】

【図65C】

【図65D】

【図65E】

【図66A】

【図66B】

【図66C】

【図66D】

【図66E】

【図66F】

【図66G】

【図67】

【図68A】

【図68B】

【図68C】

【図68D】

【図68E】

【図69A】

【図69B】

【図69C】

【図70A】

【図70B】

【図71】

【図72A】

【図72B】

【配列表】

2023015297000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-11-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

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