▶ アドヴァンスド エクストラセルラー ヴェシクル アプリケーションズ エス．アール．エル．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023153946
(43)【公開日】2023-10-18
(54)【発明の名称】生体材料から細胞外小胞を単離する方法および固定相
(51)【国際特許分類】
C12N 1/02 20060101AFI20231011BHJP
【ＦＩ】
C12N1/02 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023127203
(22)【出願日】2023-08-03
(62)【分割の表示】P 2020534599の分割
【原出願日】2018-12-19
(31)【優先権主張番号】102017000146281
(32)【優先日】2017-12-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(71)【出願人】
【識別番号】521160649
【氏名又は名称】アドヴァンスド エクストラセルラー ヴェシクル アプリケーションズ エス．アール．エル．
(74)【代理人】
【識別番号】100166338
【弁理士】
【氏名又は名称】関口 正夫
(72)【発明者】
【氏名】ダゴスティーノ ヴィト ジュゼッペ
(72)【発明者】
【氏名】プロヴェンザーニ アレッサンドロ
(72)【発明者】
【氏名】クアットローネ アレッサンドロ
(72)【発明者】
【氏名】ズカル キアラ
(72)【発明者】
【氏名】ノタランジェロ ミケーラ
(72)【発明者】
【氏名】モデルスカ アンジェリカ
(72)【発明者】
【氏名】ペスチェ イザベッラ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】種々の生物学的流体から細胞外小胞（ＥＶ）を単離する方法を提供する。
【解決手段】ニッケル及びアルミニウムからなる群から選択される陽イオンで官能化され、３０～８０ｍＶの正の正味電荷を有し、マイクロメトリック又はナノメトリックサイズの磁性又は非磁性粒子からなることを特徴とする固定相を用いた、種々の生物学的流体から生理学的ｐＨでの寸法的に不均一な細胞外小胞（ＥＶ）を迅速かつ測定可能に単離する方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】ニッケル及びアルミニウムからなる群から選択される陽イオンで官能化され、３０～８０ｍＶの正の正味電荷を有し、マイクロメトリック又はナノメトリックサイズの磁性又は非磁性粒子からなることを特徴とする固定相を用いた、種々の生物学的流体から生理学的ｐＨでの寸法的に不均一な細胞外小胞（ＥＶ）を迅速かつ測定可能に単離する方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
固定相であって、ニッケルおよびアルミニウムからなる群から選択される陽イオンで官能化され、３０～８０ｍＶの正の正味電荷を有し；前記固定相は、マイクロメトリックまたはナノメトリックサイズの磁性または非磁性粒子からなることを特徴とする固定相。
【請求項2】
前記固定相が、磁性または非磁性のいずれかのアガロースまたはシリコンビーズ、アルギン酸塩マトリックス、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）用ポリマー、ニッケルキレート受容体ビーズ、陰イオン性またはカーボンスチレンポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の固定相。
【請求項3】
マイクロメートルサイズにおける場合は平均サイズ２５～４０μｍの粒子を有する、請求項１または２に記載の固定相。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の固定相の調製方法であって、前記方法は、官能化されていない固定相を、１５～１００ｍＭのニッケルまたはアルミニウム塩を含む生理学的ｐＨで緩衝された生理食塩水溶液中に懸濁することを含む、方法。
【請求項5】
生理学的ｐＨで緩衝された前記生理食塩水溶液が、ＰＢＳまたはｐＨ７～７．５の任意の他の緩衝液である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
懸濁液を緩やかな軌道回転で室温でインキュベートする、請求項４～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
真核細胞または原核細胞によって分泌される細胞外小胞（ＥＶ）を生体液体中で単離する方法であって、前記方法が、請求項１～３のいずれか一項に記載の官能化された固定相の使用を含む方法。
【請求項8】
前記固定相を生体液体の表面に滴加する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
生体液体中でインキュベートした後、穏やかな遠心分離およびデカンテーションによって前記ビーズを分離する、請求項７～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
少なくとも２種類の異なるキレート剤を含む生理学的ｐＨで２種類の生理食塩水溶液を混合することによって、使用の数分前に調製した溶出溶液の少なくとも等容量でインキュベーションすることによって、ＥＶを前記固定相から除去する、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡおよびクエン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記最終的な溶出溶液において、ＥＤＴＡが３～６ｍＭ濃度を有し、クエン酸ナトリウムが１～３００μＭ濃度を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
溶出溶液との前記インキュベーションが２０～３７℃で軌道回転下で維持される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記生体液体が、細胞培養培地、生理学的緩衝液、細菌培養培地、ヒト－動物血液、ヒト－動物組織滲出物からなる群より選択される、請求項７～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記単離されたＥＶが、次いで、ＥＶからのタンパク質および核酸抽出（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、特異的抗体と組み合わせた抗原検出技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）による関連する、および／または小胞を含有する核酸の検出および定量、小滴デジタルＰＣＲによる関連する、および／または小胞を含有する核酸の検出および定量のためのプロトコルに供される、請求項７～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
以下：
請求項１～３のいずれか一項に記載の固定相を含む容器、または
マイクロメトリックもしくはナノメトリックサイズの磁気および非磁気粒子からなる官能化されていない固定相を含む容器；ならびに
ニッケルもしくはアルミニウム塩を含む容器
を含む、キット。
請求項１～３のいずれか一項に記載の固定相を含む容器、または
マイクロメトリックもしくはナノメトリックサイズの磁気および非磁気粒子からなる官能化されていない固定相を含む容器；ならびに
ニッケルもしくはアルミニウム塩を含む容器
を含む、キット。
【請求項17】
以下：
生理学的ｐＨで緩衝された生理食塩水溶液を含む容器；
各々が種々のキレート剤を含む少なくとも２つの容器
をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
生理学的ｐＨで緩衝された生理食塩水溶液を含む容器；
各々が種々のキレート剤を含む少なくとも２つの容器
をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞培養培地または生物学的流体からの細胞外小胞単離の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞外小胞（ＥＶ）は、エキソソーム（８０～２００ｎｍ）、微小胞（１００～６００μｍ）およびアポトーシス小体（８００～５０００ｎｍ）を含む膜粒子である。この分類は、主に小胞の大きさに基づいているが、その生合成には種々の機構が提唱されている。腫瘍学において、ＥＶは、腫瘍微小環境および免疫学的監視の調節を研究する、腫瘍から放出された情報および／もしくはバイオマーカーを捕捉する、または治療薬の担体として利用される可能性を保持する。
【0003】
生物学的および生物医学的研究は、様々な生理学的および病理学的プロセスにおけるＥＶの役割にますます焦点が当てられている。したがって、生物学的材料からのＥＶ分離のための多くの技術が現在までに提案されているが、その多くはあまり効率的ではなく、標準化可能でもない（非特許文献１；非特許文献２）。
【0004】
ＥＶ単離のためにこれまでに報告された技術は、大部分がエキソソーム精製、すなわち、５０～２００ｎｍのサイズのより小さなＥＶに関連している。広く引用されている技術は、以下のように報告されている：
－ 示差超遠心法（非特許文献３）；
－ 密度勾配遠心法（非特許文献４；非特許文献５）；
－ 精密濾過（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）；
－ マイクロフルイディクス（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）；
－ 合成ペプチド（非特許文献１３）、ヘパリン（非特許文献１４）、膜を認識する抗体の組み合わせ（非特許文献１５；非特許文献１６）タンパク質（クラスター分化もしくは抗原もしくは成分）、またはＴｉｍ４タンパク質（非特許文献１７）；
－ ポリマーまたは溶媒ベースの沈殿／単離（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）；
－ 超音波（非特許文献２１）；
－ ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、全エキソソーム単離試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ｍｉＲＣＵＲＹ（商標）エキソソーム単離キット（Ｅｘｉｑｏｎ）、ｅｘｏＥａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｅｘｏ－ｓｐｉｎ（商標）（Ｃｅｌｌ Ｇｕｉｄａｎｃｅ）、ＭＥ（商標）キット（ＮＥＰ）を含むカラムに基づく商業的な系。
－ 示差超遠心法（非特許文献３）；
－ 密度勾配遠心法（非特許文献４；非特許文献５）；
－ 精密濾過（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）；
－ マイクロフルイディクス（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）；
－ 合成ペプチド（非特許文献１３）、ヘパリン（非特許文献１４）、膜を認識する抗体の組み合わせ（非特許文献１５；非特許文献１６）タンパク質（クラスター分化もしくは抗原もしくは成分）、またはＴｉｍ４タンパク質（非特許文献１７）；
－ ポリマーまたは溶媒ベースの沈殿／単離（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）；
－ 超音波（非特許文献２１）；
－ ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、全エキソソーム単離試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ｍｉＲＣＵＲＹ（商標）エキソソーム単離キット（Ｅｘｉｑｏｎ）、ｅｘｏＥａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｅｘｏ－ｓｐｉｎ（商標）（Ｃｅｌｌ Ｇｕｉｄａｎｃｅ）、ＭＥ（商標）キット（ＮＥＰ）を含むカラムに基づく商業的な系。
【0005】
超遠心分離は、現在では、代替の密度勾配遠心法および沈殿法がＥＶの収率、組成および完全性に干渉する化学剤を使用するという事実により、一次単離法として最も効果的かつ広く適用されている（ゴールドスタンダード）（非特許文献２；非特許文献２２）と考えられている；免疫親和性捕捉は、ＥＶ亜集団の差次的分離（したがって、不均一性が低い）につながり、抗体が関与するため高価である；排除クロマトグラフィーには、かなりの量の生体試料が必要であり、非常に低収率である；カラムベースおよび遠心分離ベースの系は、ＥＶの完全性を強度に損なう。
【0006】
しかしながら、超遠心分離においても重大な問題がある：それらは、手間、処理すべき重要な試料容量とタイミング（６～１２時間）、得られた試料の純度、使用する器具、操作者の経験、ＥＶと共沈する高レベルの汚染物質（タンパク質凝集体）、処理時間による生体分子の分解に関する（非特許文献２３、非特許文献２）。
【0007】
最新技術では、ヒスチジンタグを有する組換えタンパク質の精製または認識のために設計されたＮｉ２＋官能化固定相（例えば固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、ニッケルキレート受容体ビーズ、ダイナビーズ）が知られている。これらの官能化された固定相では、官能化に由来する陽性の正味電荷は、製造者によってほとんどかつて記述されておらず、代わりに異なるｐＨ（非常に可変）での安定性指数を報告しており、それは、幅広いサイズ（数ｋＤａから数百ｋＤａ）のタンパク質に対する溶液中の結合効率に影響を及ぼす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｔｈｅｒｙ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００６
【非特許文献2】Ｇａｒｄｉｎｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１６
【非特許文献3】Ｌｉｖｓｈｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５
【非特許文献4】Ｖａｎ Ｄｅｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，２０１４
【非特許文献5】Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．，２０１６
【非特許文献6】Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ．２０１０
【非特許文献7】Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１
【非特許文献8】Ｈｙｕｎ－Ｋｙｕｎｇ Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１７
【非特許文献9】Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１２
【非特許文献10】Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１４
【非特許文献11】Ｋａｎｗａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１４
【非特許文献12】Ｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１５
【非特許文献13】Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１４
【非特許文献14】Ｂａｌａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５
【非特許文献15】Ｐｕｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１５
【非特許文献16】Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００８
【非特許文献17】Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６
【非特許文献18】Ｄｅｒｅｇｉｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６
【非特許文献19】Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１１
【非特許文献20】Ｇａｌｌａｒｔ－Ｐａｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５
【非特許文献21】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１５
【非特許文献22】Ａｌ－Ｎｅｄａｗｉ Ｋ ａｎｄ Ｒｅａｄ Ｊ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１６
【非特許文献23】Ｌｏｂｂ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、細胞外小胞（ＥＶ）を単離するための新しい手段として、適当な官能化された固定相、およびそれを官能化し、利用する関連する方法を提供することである；前記方法は、超遠心分離よりも速く、より労力が少なく、より効率的でなければならず、現在の方法と比較してさらなる利点を提示する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、Ｎｉ２＋またはＡｌ３＋陽イオンで官能化された、マイクロメトリックまたはナノメトリックサイズの磁性または非磁性粒子からなり得、３０～８０ｍＶの正の正味電荷を有し、以下に示すような不均一なＥＶ単離に関する効率と関連することを特徴とする固定相を提供する。
【0011】
本発明による固定相（例えば、アガロースビーズ）は、５０～２０００ｎｍのサイズ範囲を有する広範囲の分散性によって特徴付けられる全ＥＶの迅速かつ効率的な単離を可能にし、それ故、生体液中のエキソソームおよび微小胞の両方を捕捉することを可能にする。
【0012】
一態様では、本発明は、上述の固定相を調製する方法に関し、前記方法は、Ｎｉ２＋またはＡｌ３＋塩の最小１５ｍＭから最大１００ｍＭまでを含む生理学的ｐＨ（固定相容量に基づき、かつ不均一ＥＶの単離に関して以下に示す効率を得るために）で緩衝化された生理食塩水溶液中に、ならびにいずれの場合においても使用する固定相の容量および得られた正味の正電荷に従って、官能化されていない固定相を懸濁することを含む。
【0013】
一態様では、本発明は、培養培地または生物学的流体中で真核細胞または原核細胞（細菌）によって分泌されるＥＶを単離するための方法に関し、前記方法は、上述のニッケルイオンで官能化された固定相の使用を含む。本発明の方法は、以下、ＮＢＩ（ニッケルベースの単離）と呼ばれる。
【0014】
細胞外小胞（ＥＶ）は、その脂質二重層構造ならびに脂質およびタンパク質組成に依存して、構造、大きさ、浮遊密度、光学特性および動電位（ゼータ電位）などの物理化学的特性を提示する（Ｙａｎｅｚ－Ｍｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１５）。
【0015】
本明細書に提示する本発明の方法の原理は、それらの単離および精製のためのニッケルイオンによる固定相（アガロース、ケイ素、磁気ビーズなど）官能化と組み合わせたＥＶ動電位（以下、ＺＰと称する）の利用に基づいている。
【0016】
最近発表されたいくつかの報告では、ＰＢＳの生理学的溶液において、細胞外小胞のＺＰは－１７～－３５ｍＶであることが示されており（Ｒｕｐｅｒｔ ＤＬ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１７）、中等度～良好な安定性および良好な分散性の指標である（Ｃｏｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４）。
【0017】
本発明によれば、ＥＶ精製に使用されるゴールドスタンダード技術（ＵＣ）に関するＮＢＩ法の利点は、以下である：
－ 迅速性：適用時間が６０分未満；
－ 簡単さ：特定の手段の使用は、いくつかの手順的ステップでは必要ない；
－ 適応性：官能化されたビーズの量は、出発生物学的材料の体積（数十ミリリットルから数リットル）に適応される；
－ 効率：未変化のＥＶの高回収率；
－ 不均一性／分散性：限定された凝集現象を伴う不均一なＥＶ（典型的には５０～８００ｎｍの寸法範囲）の同時析出；
－ 安定性：ＮＢＩにより精製された多分散ＥＶは、ＵＣにより精製されたものより安定である；
－ 標識／ポリマー非含有：開始生体試料に添加された疎水性ポリマーがないか、またはＮＢＩの全手順中に添加されない；
－ 生理学的ｐＨ：ｐＨ７．４で緩衝した塩溶液を用いて全手順を行う；
－ 純度：ＮＢＩは、タンパク質に富んだ生体液体からＥＶを選択的に精製することを可能にする；
－ 組み合わせ：ＮＢＩは、ＥＶを単離するように設計され、他の物理化学的原理に基づいた他のシステムに結合することができ、特に、同一の開始生体試料から来る異なるサイズのＥＶサブ集団を得るためである；
－ 汎用性：ＮＢＩは、トリプシン、プロテイナーゼＫ、ＤＮＡ分解酵素、種々のＲＮＡ分解酵素のようなタンパク質または核酸分解酵素に曝露された生体試料に適用可能である；ＮＢＩで処理後、蛍光親油性プローブで生体試料を標識する可能性がある。
－ ＮＢＩで精製した細胞外小胞のｉｎ ｖｉｖｏ注射／注入に対する耐容性。
－ 迅速性：適用時間が６０分未満；
－ 簡単さ：特定の手段の使用は、いくつかの手順的ステップでは必要ない；
－ 適応性：官能化されたビーズの量は、出発生物学的材料の体積（数十ミリリットルから数リットル）に適応される；
－ 効率：未変化のＥＶの高回収率；
－ 不均一性／分散性：限定された凝集現象を伴う不均一なＥＶ（典型的には５０～８００ｎｍの寸法範囲）の同時析出；
－ 安定性：ＮＢＩにより精製された多分散ＥＶは、ＵＣにより精製されたものより安定である；
－ 標識／ポリマー非含有：開始生体試料に添加された疎水性ポリマーがないか、またはＮＢＩの全手順中に添加されない；
－ 生理学的ｐＨ：ｐＨ７．４で緩衝した塩溶液を用いて全手順を行う；
－ 純度：ＮＢＩは、タンパク質に富んだ生体液体からＥＶを選択的に精製することを可能にする；
－ 組み合わせ：ＮＢＩは、ＥＶを単離するように設計され、他の物理化学的原理に基づいた他のシステムに結合することができ、特に、同一の開始生体試料から来る異なるサイズのＥＶサブ集団を得るためである；
－ 汎用性：ＮＢＩは、トリプシン、プロテイナーゼＫ、ＤＮＡ分解酵素、種々のＲＮＡ分解酵素のようなタンパク質または核酸分解酵素に曝露された生体試料に適用可能である；ＮＢＩで処理後、蛍光親油性プローブで生体試料を標識する可能性がある。
－ ＮＢＩで精製した細胞外小胞のｉｎ ｖｉｖｏ注射／注入に対する耐容性。
【0018】
一態様では、本発明はまた、以下を含むキットに関する：
前述の固定相を含む容器。
前述の固定相を含む容器。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明による固定相は、好ましくは、ニッケルで官能化されている。
【0020】
固定相は、好ましくは、磁性または非磁性のいずれかのアガロースまたはケイ素ビーズ、アルギン酸塩マトリックス、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）用のポリマー、ニッケルキレート受容体ビーズ、陰イオン性（スチレンジビニルベンゼンとして）またはカーボン（グラフェンとして）スチレンポリマーからなる群から選択される。アガロースビーズが、特に好ましい。
【0021】
マイクロメートルサイズでは、０．５～１０００μｍを意味し、ナノメートルサイズでは、１～５００ｎｍを意味する。
【0022】
本発明の方法は、以下、ニッケルイオンで官能化された既知の公称サイズ（好ましくは２５～４０μｍ）のアガロースビーズ、すなわち、正に荷電され、したがって、生理学的溶液中での負に荷電したナノ粒子および微粒子への結合を可能にする実施形態に基づいて記載される。使用されるビーズの濃度に曝露されたニッケルイオンの量は、ビーズが生理学的リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で４℃で貯蔵される場合、少なくとも６ヶ月間安定である、３０～８０ｍＶの正の正味電荷をもたらす電気化学特性をそれらに付与する。アジ化ナトリウムまたは２０％エタノールなどのあらゆる保存剤は、固定相を使用する前にＰＢＳで広範囲に洗浄した後、保存液に添加することができる。
【0023】
生理学的ｐＨでの生理食塩水溶液は、好ましくはＰＢＳであるが、二価の陽イオン、例えばニッケル（遷移において、または検出可能な形態で安定化される）に干渉せず、生理学的ｐＨ７．４で緩衝化された任意の他の緩衝溶液（トリズマ塩基、ＨＥＰＥＳなど）で置換されてもよい。Ｎｉ２＋イオンを含む緩衝生理食塩水溶液は、好ましくは、０．２μｍフィルターでさらに滅菌する。
【0024】
本発明によるアガロースビーズは、好ましくは、ｐＨ７．４でのＰＢＳ中のニッケル塩（好ましくは、硫酸ニッケル、または塩化ニッケル、酸化ニッケル、または、アルミニウム、硫酸アルミニウム、塩化アルミニウム、酸化アルミニウムおよび／もしくはケイ酸アルミニウムによる官能化の場合）の１５～３０ｍＭ溶液中でのインキュベーションにより、０．２μｍフィルターで滅菌して、官能化されていないビーズから調製される。
【0025】
好ましくは、ニッケル塩溶液中のビーズの混合物を、室温（２０～２５℃）で、かつ穏やかな軌道回転で最低１～３分間インキュベートする。
【0026】
インキュベーション後、ビーズを、遠心分離により溶液から分離する。
【0027】
上清を除去し、ビーズを緩衝生理食塩水溶液で洗浄し、好ましくは滅菌する。好ましくは、洗浄は、２～３回繰り返して、懸濁、遠心分離および上清除去によってニッケルイオン微量および残留対イオンを除去してもよい。
【0028】
洗浄後、ビーズは、好ましくは、生理学的ｐＨで緩衝され、好ましくは０．２μｍフィルターで滅菌された生理食塩水の、好ましくはビーズの体積に等しい体積で懸濁され、それら（以下、ＣＢｅａｄｓと称する）を、４℃で保存することができる。
【0029】
固定相が（市販されているように）Ｎｉ２＋またはＡｌ３＋陽イオンで官能化されている場合は、前述のように官能化する前に、２００～３００ｍＭのＮａＣｌもしくはＫＣｌ、１００～３００ｍＭのＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡ、３００～５００ｍＭのイミダゾールを添加した水溶液、または広いｐＨ範囲（一般に５～８）の陽イオン性キレート剤を含む溶液で１回以上洗浄し、二蒸留水（１８．２ＭΩｃｍ－１）で１回以上洗浄することによるストリッピングに供することが必要である。
【0030】
本発明による方法は、好ましくは２８００ｒｃｆでの遠心分離によって細胞破片によって清澄化され、任意のサイズのチューブに収集され、室温で最低３０分間インキュベートされる生体液体の表面に滴加することができるＣＢｅａｄの使用を含む。ＣＢｅａｄを、試料１ｍｌ当たり１０～３０μｌの容量比で添加し、その過剰を生体液中に見出される粒子の数に基づいて経験的に確立する。
【0031】
生体液体は、以下であり得る：
－ ＮＢＩ手順にそれ自体で用いるべきウシ胎児血清（ＦＢＳ）の最大１．５％を含む細胞培養培地。ＦＢＳの割合がより高い場合は、ｐＨ７．４でＰＢＳで希釈することが好ましい；
－ 細菌培養培地（ＬＢ、またはペプトン、糖および／もしくは酵母抽出物を含む）；
－ 生理学的緩衝液；
－ ヒトまたは動物由来の液体生検試料（全血または血清または血漿、尿、脳脊髄液、乳汁、唾液、組織滲出物）。この場合でも、培地の粘度を、適切なＰＢＳ体積で希釈することができる。
－ ＮＢＩ手順にそれ自体で用いるべきウシ胎児血清（ＦＢＳ）の最大１．５％を含む細胞培養培地。ＦＢＳの割合がより高い場合は、ｐＨ７．４でＰＢＳで希釈することが好ましい；
－ 細菌培養培地（ＬＢ、またはペプトン、糖および／もしくは酵母抽出物を含む）；
－ 生理学的緩衝液；
－ ヒトまたは動物由来の液体生検試料（全血または血清または血漿、尿、脳脊髄液、乳汁、唾液、組織滲出物）。この場合でも、培地の粘度を、適切なＰＢＳ体積で希釈することができる。
【0032】
生体試料ＣＢｅａｄ＋ＥＶと共にインキュベートした後、デカンテーションにより分離する。最高速度３００ｒｃｆでの弱い遠心分離は、ステップをスピードアップさせ、同時に、ＮＢＩ手順中のＥＶおよび固定相の完全性を保存することを可能にする。
【0033】
ＣＢｅａｄからのＥＶの脱離は、使用前にＰＢＳでｐＨ７．４で新たに調製した溶液（これからＥｌｕｔｉｏｎと定義）を添加し、少なくとも２種の異なるキレート剤を含む２種の溶液ＡおよびＢを混合して得て行う。
【0034】
前記溶液Ａは、好ましくは、ｐＨ８．０で３～６ｍＭのＥＤＴＡを含み；より好ましくは、溶液Ａは、ｐＨ８．０で３～６ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳである。
【0035】
前記溶液Ｂは、好ましくは３０～３００μＭのクエン酸ナトリウムを含み；より好ましくは、溶液Ｂは、３０～３００μＭのクエン酸ナトリウムおよび５０～１００ｍＭのＮａＣｌを添加したＰＢＳである。Ａ溶液とＢ溶液の両方について、使用できる他のキレート剤は、イミダゾール、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ、アミドキシム、Ｎｉ２＋との共有結合および／または競合的結合を確立し、従って、固定相からのＥＶ放出のステップを多かれ少なかれ効率的に促進することができる、当該目的のために設計された分子またはペプチドである。
【0036】
溶液ＡとＢを混合した後、適切な量のＫＨ２ＰＯ４が添加され（ＥＤＴＡが３．２ｍＭであり、ＮａＣｌが６０ｍＭであり、クエン酸ナトリウムが４５μＭである場合、８μｌのＫＨ２ＰＯ４が添加される）、または生理学的ＰＨ７．４に緩衝し、同時に、ニッケルイオンおよび／またはＥＶの形態的－生化学的特性に干渉しない他の任意の食塩水溶液が添加される。
【0037】
ＣＢｅａｄ＋ＥＶは、好ましくは、少なくとも同体積のＥｌｕｔｉｏｎ溶液と共にインキュベートされ、前記インキュベーションは、好ましくは、２０～３７℃、好ましくは２８℃で最低１０～２０分間、軌道回転においてである。
【0038】
ＣＢｅａｄをＥｌｕｔｉｏｎ＋ＥＶ溶液から分離するためには、傾斜ロータ中で最低３００ｒｃｆで約１分間遠心分離することが好ましい。全体ＥＶおよび多分散ＥＶ（一般に５０～２０００ｎｍに分布）を含む上清を、好ましくは低結合試料管に移す。
【0039】
アガロースビーズを参照した上記の説明は、本発明による他のいずれの固定相についても、明らかな調整を加えて妥当である。
【0040】
その全てのステップにおいて記載された前述の手順は、安定性または移動性の条件（カラム、マトリックス、フィルターなど）において、上で特定した生化学的条件に従うあらゆる性質の固定相を含むのに適したさらなる修正または手段的結合により支持され得、それにより、単純化または手順的最適化が可能となる。
【0041】
上述の方法は、ＥＶからのＲＮＡ抽出、抗体に基づくＥＶ沈殿および／または選別、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるＥＶに含有または吸着された核酸の増幅およびその技術的変形、真核細胞におけるＥＶのトランスフェクション、核酸でのＥＶ工学、核酸、ペプチドまたは薬理学的剤担体としてのＥＶ利用などの下流の用途と適合性である。
【0042】
一態様では、本発明は、以下を含むキットに関する：
上記の固定相を含む容器、または代替として、
マイクロメトリックもしくはナノメトリックサイズの磁気および非磁気粒子からなる官能化されていない固定相を含む容器；ならびに
Ｎｉ２＋もしくはＡｌ３＋塩を含む容器。
上記の固定相を含む容器、または代替として、
マイクロメトリックもしくはナノメトリックサイズの磁気および非磁気粒子からなる官能化されていない固定相を含む容器；ならびに
Ｎｉ２＋もしくはＡｌ３＋塩を含む容器。
【0043】
好ましくは、キットは、さらに以下を含む：
生理学的ｐＨで緩衝された生理食塩水溶液を含む容器；
各々が異なるキレート剤を含む少なくとも２つの容器。
生理学的ｐＨで緩衝された生理食塩水溶液を含む容器；
各々が異なるキレート剤を含む少なくとも２つの容器。
【0044】
好ましくは、キットは、さらに以下を含む：
生理学的ｐＨでキレート剤の混合物を緩衝する調整ｐＨ食塩水溶液を含む少なくとも１つの容器。
生理学的ｐＨでキレート剤の混合物を緩衝する調整ｐＨ食塩水溶液を含む少なくとも１つの容器。
【0045】
好ましくは、キットは、さらに以下を含むことができる：
微量遠心低結合試料管。
微量遠心低結合試料管。
【0046】
上記のキットは、好ましくは以下である：
固定相は、２５～４０μｍのアガロースビーズからなる；
ニッケル塩はＮｉＳＯ４であり、またはアルミニウム塩はＡｌ２Ｏ３もしくはアルミノケイ酸塩である；
生理学的ｐＨで緩衝された生理食塩水溶液は、ＰＢＳである；
キレート剤は、陽イオンがＮｉ２＋である場合にはＥＤＴＡであり、または陽イオンがＡｌ３＋である場合にはＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４のようなマグネシウム塩である；
他のキレート剤は、陽イオンがＮｉ２＋である場合はクエン酸ナトリウムであり、または陽イオンがＡｌ３＋である場合はＣａＣｌ２もしくはＣａ３（ＰＯ４）２のようなカルシウム塩である；
ｐＨ調整生理食塩水溶液は、ＫＨ２ＰＯ４またはＫ２ＨＰＯ４である。
固定相は、２５～４０μｍのアガロースビーズからなる；
ニッケル塩はＮｉＳＯ４であり、またはアルミニウム塩はＡｌ２Ｏ３もしくはアルミノケイ酸塩である；
生理学的ｐＨで緩衝された生理食塩水溶液は、ＰＢＳである；
キレート剤は、陽イオンがＮｉ２＋である場合にはＥＤＴＡであり、または陽イオンがＡｌ３＋である場合にはＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４のようなマグネシウム塩である；
他のキレート剤は、陽イオンがＮｉ２＋である場合はクエン酸ナトリウムであり、または陽イオンがＡｌ３＋である場合はＣａＣｌ２もしくはＣａ３（ＰＯ４）２のようなカルシウム塩である；
ｐＨ調整生理食塩水溶液は、ＫＨ２ＰＯ４またはＫ２ＨＰＯ４である。
【0047】
本発明は、以下の実施形態に照らしてより良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】種々の起源の生物学的材料から出発した、本発明によるＮＢＩによる使用者に優しいアプローチおよびＥＶ単離のステップを示す図式。
【図2】超遠心分離またはＮＢＩによって単離された粒子（０．５μｍ超）の数間の比較を示すフローサイトメトリー分析。Ａ）ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ）機器を、直径１および１０μＭのポリスチレンビーズ（Ｆ１３８３８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で校正した。Ｂ）官能化されていないビーズ（陰性対照）を用いてＮＢＩ法を用いて捕獲した粒子の数。Ｃ）１９ｍＭ硫酸ニッケルで官能化したアガロースビーズを用いて超遠心（５６．６％）またはＮＢＩ（５８．８％）後に得られた０．５μｍ超（Ｐ２）の粒子の数。グラフは、２つの独立した実験の代表である。
【図3A】ヒスチジンタグによるタンパク質の精製。組換えタンパク質の１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル後のクーマシー染色は、以下を示す：Ｍ：前発色タンパク質ラダー；１：Ｔ７ｐ０７タンパク質、１０５ｋＤａ（ゲル上に２μｇ負荷）；２：ＨｕＲタンパク質、３６ｋＤａ（ゲル上に３００ｎｇ負荷）；３：ＹＴＨＤＦ１タンパク質、２３ｋＤａ（ゲル上に２μｇ負荷）。
【図3B】大腸菌ＤＨ５α総タンパク質抽出物５００μｇ／ｍｌで、およびＡ（Ｔ７ｐ０７、ＨｕＲ、ＹＴＨＤＦ１）に示される合計１５０μｇ／ｍｌの組換えタンパク質で濃縮した無血清細胞培養培地で実施した競合アッセイ。ヒスチジンタグに対する抗体を用いたＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色またはウェスタンブロット法後に、２つの平行ゲルを展開した。ＦＴ（フロースルー）はＮＢＩビーズへの曝露後の培地であり、グラフは示されたナノポアを用いたｑＮＡＮＯ（ｉＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）による解析からの結果である。１Ｘ溶液は、タンパク質濃縮系においてＥＶの最大選択的溶出を可能にする。
【図3C】溶出緩衝液中のキレート剤および塩の濃度上昇は、ＥＶの完全性を１．５Ｘ超に変化させる。ｑＮＡＮＯ分析により得られたグラフは、２つの独立した実験の代表であり、数およびサイズの低下は、ＥＶ有害効果を示す。
【図4】Ａ）溶出緩衝液中で２．５％パラホルムアルデヒドで固定した後の、ＮＢＩにより得られたＥＶの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による獲得。Ｂ）１８×１０６（ＮＢＩ１）または９×１０６（ＮＢＩ２）またはＵ８７細胞全細胞溶解物（ＴＣＬ）の１％からの回収したＥＶ溶解物のウェスタンブロット分析。
【図5】超遠心法（ＵＣ）またはＮＢＩにより回収した直径１８１±２３．８ｎｍの４．２×１０９リポソームの混合物。同じ実験を、ホスファチジルエタノールアミン－ローダミン（ＰＥ－Ｒｈｏ、５ｎｇ／ｍｌ）によるリポソーム染色後に再現した。
【図6】無血清培地３ｍｌ中で培養したＵ８７細胞から単離し、ＵＣまたはＮＢＩにより直後（ｔ０）または２４日後（ｔ２４、４℃で保存）に分析した微小胞。次に、繰り返しのｇＮＡＮＯ計測を、精製後５２日まで行い、微小胞集団の半減期を、時間ｔ０と比較してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ．５を用いて算出した。
【図7】ＮＢＩ法の再現性は、示されているように、６ウェルプレートに、種々の密度で播種したＵ８７細胞による無血清培地を用いて試験した（ＮＢＩ１、２、および３）。１０％超遠心血清条件（ｄＦＢＳ）は、ＮＢＩ１試料で得られた結果とかなりの重複を示した。グラフは３つの独立した実験の代表であり、全体の変動係数（ＣＶ）は６．１％であり、この方法の優れた再現性を示した。
【図8】６ウェルプレート（１ｍｌ）における細胞密度の関数としての単離したＥＶは、培養培地における種々の放出動態を明らかにする。Ａ）２４時間後にＮＢＩによりＥＶを精製し、細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、播種細胞の数を示すＤＮＡ染色に曝露した。画像は、「高含有量」分析システム、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアｖ４．１およびＯｐｅｒｅｔｔａ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で取得した。Ｂ）Ａに記載した培地をＮＢＩで処理し、ここでＬｏｇ２に示したエキソソームおよび微小胞の数を、ｑＮＡＮＯ（ｉＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した。標準偏差を、ここでは３つの独立した実験に言及する。
【図9】ＮＢＩによって単離されたＥＶの数およびサイズを、示されているように、いくつかの腫瘍細胞株について分析した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞のみが、両ＥＶ集団の放出の実質的減少を示した（＊＊Ｐ値＝０．００６、Ｆ＝７０．１３、および＊＊＊＜０．０００１、Ｆ＝３０．８４、ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ後試験を用いた）。標準偏差を、ここでは３つの独立した実験に言及する。
【図10】グラム陰性菌によって放出される小胞の単離においても、ＮＢＩの汎用性が確認されている。大腸菌ＤＨ５α細胞を、ＯＤ６００＝０．７まで全ＬＢ培地中で成長させた。細菌を４０００ｒｃｆで１５分間遠心分離することによってペレット化し、上清をＮＢＩ処理に用いた。粒子は、ＮＰ１５０およびＮＰ２００ナノポアを用いてｑＮＡＮＯで分析し、最大の検出された個体群は、直径９２±２９ｎｍを示した。グラフは、２つの独立した実験の代表である。
【図11】フローレンスのマイヤー小児病院で平均年齢４５歳の健常ドナー４７人から採取した血液小体要素計数を、製造指示に従って、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ－５０００血液分析器（Ｓｙｓｍｅｘ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）により実施した。
【図12】同一ドナー血漿および血清からＮＢＩにより単離された微粒子（５００ｎｍ以上）の数間の比較。フローサイトメーター事象を２分間取得し、同じ粒子集団の相対パーセンテージを示す。
【図13】Ａ）ＮＢＩを０．５ｍｌの血漿に適用し、ＴＲＰＳ分析を行ったところ、示された小胞の数およびサイズが検出された。エキソソームの数は、赤血球（ＲＢＣ）と相関した、ピアソン係数＝０．９９。Ｂ）Ａで行った同じ解析を、微小胞計数に適用し、血小板（ＰＬＴ）との相関は、０．９８であった。
【図14】それぞれ既知の血小板または小球マーカーに対して向けられたＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａビオチン化抗体を、「ＥＶ系列」を探索するために利用した。ＮＢＩで精製した溶液中の小胞の各試料を、２つの等しい部分に分けて、それぞれ抗体またはビオチン（陰性対照）と共にインキュベートした。ストレプトアビジン共役磁気ビーズによる沈殿後、溶液中の残りの小胞を、ｑＮＡＮＯで特性化した。示された粒子の数は、相対的陰性対照に対して標準化される。＊Ｐ値＜０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１；＊＊＊Ｐ値＜０．００１。
【図15】４７人のドナーの血漿からのＮＢＩ精製小胞から抽出した０．１～４ｎｇのＲＮＡから出発して合成したｃＤＮＡ２０のうち２マイクロリットル。液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、ＥｖａＧｒｅｅｎ化学および以下のプライマーと共に使用した：５'－ＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡ（配列番号１）および５'－ＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧ（配列番号２）。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（ＢＩＯＲＡＤ）で解析した後、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのコピーの絶対数を求めた。
【図18】ＮＢＩ方法で使用される緩衝溶液は、Ｖ６００Ｅ突然変異を含む特異的ＲＮＡの定量分析のためにＳＫ－ＭＥＬ－２８黒色腫細胞から精製された全ＥＶに直接使用される液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）と適合性である。
【図19】Ａ）ニッケル（陽性）とＥＶ（陰性）との間の反対符号の電荷間の初期結合は、ＮＢＩとアルファ技術との間の結合を可能にし、ニッケル－受容体ビーズは、ビオチン化抗体およびストレプトアビジンビーズ－供与体と組み合わせて使用され、ＥＶの表面上の特異的抗原を捕捉および検出する。Ｂ）ヒト血漿中を循環するＥＶ上に存在する特異的抗原（ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４５）の認識および定量の例。ＣＤ１４６抗原は、実験的陰性対照として作用する上皮起源の細胞のマーカーである。
【図20】ＮＢＩに使用される緩衝液は、変性条件下でタンパク質を検出するための従来の技術、例えばウェスタンブロット法とも適合する。
【実施例0049】
実施例１－ニッケルイオン官能化ビーズの調製
ビーズ官能化のための手順は、以下のように実施される：
－ 市販のＮｉＮＴＡセファロース高速ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品コード７１－５０２７－６７または１７－５２６８－０１）を、開始ビーズとした；正味荷電値を測定し、結果として、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を用いて検出されるように、ＰＢＳ中２２～２５℃で３～２５ｍＶの範囲になった。
－ 開始ビーズを、２００～３００ｍＭのＮａＣｌもしくはＫＣｌ、１００～３００ｍＭのＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡ、３００～５００ｍＭのイミダゾールを添加した水溶液、または広いｐＨ範囲（一般に５～８の間）のカチオン性キレート剤を含む溶液での１つ以上の洗浄、および二蒸留水（１８．２ＭΩｃｍ－１）での１つ以上の洗浄によるストリッピングに供する；
－ あらかじめ５０ｍｌチューブにアリコートしたストリッピング処理を施した開始ビーズ（ＮｉＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－５２６８－０１，３４μｍ既知公称サイズ）の４０ｍｇ／ｍｌ懸濁液を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の濃縮１９ｍＭ硫酸ニッケル溶液の２倍体積（ビーズ体積に関連する）に再懸濁し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌する。
－ 硫酸ニッケル溶液中のビーズ混合物を、室温で、かつ穏やかな軌道回転で２分間インキュベートする。
－ ５０ｍｌチューブを傾斜ローターで２００ｒｃｆで１分間遠心し、ビーズをチューブの底部に集める。
－ 上清を穏やかに吸引し、廃棄し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌したｐＨ７．４でのＰＢＳの３倍体積（ビーズ体積に関して）を、ビーズに加える。
－ ビーズを前述のように再び遠心分離し、上清を吸引し、廃棄する。
－ ビーズへのＰＢＳ付加と除去のステップは、残存硫酸塩またはニッケルイオンの微量を除去するために、さらに２回連続して繰り返される。
－ ｐＨ７．４でＰＢＳの同容積（ビーズ容積に関して）にビーズを再懸濁し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌し、これらのビーズ（以下、ＣＢｅａｄと称する）を４℃で保存する。
ビーズ官能化のための手順は、以下のように実施される：
－ 市販のＮｉＮＴＡセファロース高速ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品コード７１－５０２７－６７または１７－５２６８－０１）を、開始ビーズとした；正味荷電値を測定し、結果として、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を用いて検出されるように、ＰＢＳ中２２～２５℃で３～２５ｍＶの範囲になった。
－ 開始ビーズを、２００～３００ｍＭのＮａＣｌもしくはＫＣｌ、１００～３００ｍＭのＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡ、３００～５００ｍＭのイミダゾールを添加した水溶液、または広いｐＨ範囲（一般に５～８の間）のカチオン性キレート剤を含む溶液での１つ以上の洗浄、および二蒸留水（１８．２ＭΩｃｍ－１）での１つ以上の洗浄によるストリッピングに供する；
－ あらかじめ５０ｍｌチューブにアリコートしたストリッピング処理を施した開始ビーズ（ＮｉＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－５２６８－０１，３４μｍ既知公称サイズ）の４０ｍｇ／ｍｌ懸濁液を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の濃縮１９ｍＭ硫酸ニッケル溶液の２倍体積（ビーズ体積に関連する）に再懸濁し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌する。
－ 硫酸ニッケル溶液中のビーズ混合物を、室温で、かつ穏やかな軌道回転で２分間インキュベートする。
－ ５０ｍｌチューブを傾斜ローターで２００ｒｃｆで１分間遠心し、ビーズをチューブの底部に集める。
－ 上清を穏やかに吸引し、廃棄し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌したｐＨ７．４でのＰＢＳの３倍体積（ビーズ体積に関して）を、ビーズに加える。
－ ビーズを前述のように再び遠心分離し、上清を吸引し、廃棄する。
－ ビーズへのＰＢＳ付加と除去のステップは、残存硫酸塩またはニッケルイオンの微量を除去するために、さらに２回連続して繰り返される。
－ ｐＨ７．４でＰＢＳの同容積（ビーズ容積に関して）にビーズを再懸濁し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌し、これらのビーズ（以下、ＣＢｅａｄと称する）を４℃で保存する。
【0050】
ビーズに曝露されたニッケルイオンの量は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）生理学的溶液中で、室温で少なくとも６ヶ月間安定な、４０～６０ｍＶの正の正味電荷を生じる電気化学的特性を与える。
【0051】
実施例２－生体試料からのＥＶ単離法
ＣＢｅａｄを、任意のサイズのチューブに収集した生体液体（２８００ｒｃｆ遠心分離によって細胞破片によって清澄化された）の表面に滴加し、２０μｌ／ｍｌの体積比で３０分間室温でインキュベートすることができる。
ＣＢｅａｄを、任意のサイズのチューブに収集した生体液体（２８００ｒｃｆ遠心分離によって細胞破片によって清澄化された）の表面に滴加し、２０μｌ／ｍｌの体積比で３０分間室温でインキュベートすることができる。
【0052】
生体液体は、ｐＨ７．４の希釈で１．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）－ＰＢＳをほとんど含む細胞培養培地であり得、ＦＢＳのパーセンテージがより高い場合可能になる；液体生検試料（全血または血清または血漿、尿、脳脊髄液、乳汁、唾液）。
【0053】
生体試料からのＥＶ分離は、以下のように行われる：
－ ＣＢｅａｄを、生体試料と共に、穏やかな軌道回転（３００～６００ｒｐｍ）で室温で３０分間インキュベートし、その末端でチューブを垂直位に安定させて、チューブ底部のＣＢｅａｄ（７～１５分）の重力沈降または弱い遠心分離（１００～４００ｒｃｆ）を可能にする。
－ 上清は完全に吸い上げられ、廃棄される。
－ ＣＢｅａｄを、生体試料と共に、穏やかな軌道回転（３００～６００ｒｐｍ）で室温で３０分間インキュベートし、その末端でチューブを垂直位に安定させて、チューブ底部のＣＢｅａｄ（７～１５分）の重力沈降または弱い遠心分離（１００～４００ｒｃｆ）を可能にする。
－ 上清は完全に吸い上げられ、廃棄される。
【0054】
ＥＶ精製、すなわちビーズからのそれらの除去は、キレート剤を含むＡおよびＢの２つの溶液の混合物によって与えられる、ｐＨ７．４でＰＢＳ中で使用する数分前に調製された溶液（これからＥｌｕｔｉｏｎと定義される）によって促進される。
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ａ：最終３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０でのＰＢＳサプリメント。
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂ：６０ｍＭのＮａＣｌ、４５μＭのクエン酸ナトリウムでの完全なＰＢＳ。
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ａ：最終３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０でのＰＢＳサプリメント。
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂ：６０ｍＭのＮａＣｌ、４５μＭのクエン酸ナトリウムでの完全なＰＢＳ。
【0055】
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ ＡおよびＢ緩衝液を混合した後（Ｅｌｕｔｉｏｎ １Ｘ溶液を得る）、ＥＶ溶出直前のＥｌｕｔｉｏｎ溶液に８μｌ／ｍｌのＫＨ２ＰＯ４を加える。
【0056】
Ｅｌｕｔｉｏｎ溶液は、溶液中の元素間のイオン交換を可能にし、ＥＶの完全性、サイズおよび形態を保存しながら、アガロースビーズからの迅速なＥＶ分離を促進する。
【0057】
ＥＶの精製は、以下のように行われる：
－ Ｅｌｕｔｉｏｎ溶液のＣＢｅａｄと等しい体積を滴下し、穏やかにＣＢｅａｄに加える。
－ ＣＢｅａｄ＋Ｅｌｕｔｉｏｎ混合物を含むチューブを、軌道回転（５００ｒｐｍ）で１５分間、好ましくは２８℃でインキュベートする。
－ チューブを傾斜ローターで１８００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
－ Ｅｌｕｔｉｏｎ溶液のＣＢｅａｄと等しい体積を滴下し、穏やかにＣＢｅａｄに加える。
－ ＣＢｅａｄ＋Ｅｌｕｔｉｏｎ混合物を含むチューブを、軌道回転（５００ｒｐｍ）で１５分間、好ましくは２８℃でインキュベートする。
－ チューブを傾斜ローターで１８００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
【0058】
全ＥＶと多分散ＥＶ（一般に５０～８００ｎｍに分布）を含む上清を、低結合チューブに移す。
【0059】
実施例３－ＵＣまたはＮＢＩによって単離された粒子数（０．５μｍ超）の比較
ＮＢＩを、Ｕ８７グリオーマ細胞から放出された小胞を単離するために適用し、直径０．５μｍ以上の粒子数（フローサイトメトリーにより推定）は、官能化されていないビーズにより捕捉された少数の事象とは異なり、差次的ＵＣを用いて得られたものと同等である（図２Ａ）。
ＮＢＩを、Ｕ８７グリオーマ細胞から放出された小胞を単離するために適用し、直径０．５μｍ以上の粒子数（フローサイトメトリーにより推定）は、官能化されていないビーズにより捕捉された少数の事象とは異なり、差次的ＵＣを用いて得られたものと同等である（図２Ａ）。
【0060】
実施例４－粒子集団の分析および溶出ステップの精密化
粒子集団を分析し、溶液中でのＥＶ濃縮を可能にした溶出ステップを精密化するために、調整可能な抵抗性パルスセンシング（ＴＲＰＳ）を、ｑＮＡＮＯ機器と共に系統的に使用した。
粒子集団を分析し、溶液中でのＥＶ濃縮を可能にした溶出ステップを精密化するために、調整可能な抵抗性パルスセンシング（ＴＲＰＳ）を、ｑＮＡＮＯ機器と共に系統的に使用した。
【0061】
溶出の選択性を評価するために、Ｎｉ２＋との最も強い相互作用を与えることが知られているタグである６Ｘヒスチジンを有する組み換えタンパク質を含むタンパク質濃縮系で、競合試験を行った。ＤＨ５α大腸菌細胞の未加工の抽出物（５００μｇ／ｍｌ）および種々の精製タンパク質（各５０μｇ／ｍｌ、Ｔ７ｐ０７、１０５ｋＤａ、ＨｕＲ、３６ｋＤａ；ＹＴＨ、２３ｋＤａ、図３Ａ）を添加したＵ８７細胞の無血清培地を、Ｅｌｕｔｉｏｎ １Ｘ溶液（３．２ｍＭのＥＤＴＡ、４５μＭのクエン酸ナトリウムおよび６０ｍＭのＮａＣｌ）を基準として保持して、緩衝液溶出勾配に従いＮＢＩに供した。最小量のＨｕＲおよびＹＴＨＤＦ１でＴ７ｐ０７に濃縮された最高分子量（ＭＷ）タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｒｕｂｙ ＳＹＰＲＯ染色および抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット法を示すように、１．５Ｘ Ｅｌｕｔｉｏｎ溶液（４．８ｍＭのＥＤＴＡ、９０ｍＭのＮａＣｌおよび６７．５μＭのＮａＣｉｔｒ）で始まり、次第に溶出した（図３Ｂ）。対照的に、ＥＶの大部分は１Ｘ溶出緩衝液で溶出し、減少した量の化学的剤は溶液中のニッケル汚染なしにＥＶ／Ｎｉ－ビーズ相互作用を置換するのに十分であり、１００ｍＭ超のＥＤＴＡを必要とする事象であることを実証した。特に、ＥＶ形態は種々の溶出緩衝液に従って変化し、１．５Ｘ溶液から始まるそれらのサイズおよび分散に影響した（図３Ｃ）。
【0062】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）（２０５００×および８７０００×倍率、図４Ａ）は、ＮＢＩ試料中の低いタンパク質レベルを確認し、１Ｘ溶液がＥＶ形態および広い分散を保持し、動的光散乱（ｎ＝３）によって評価されるように直径５４１±１２０ｎｍおよび０．６１±０．０５の分散指数を示すことを示した。これらのデータは、少数の９×１０６個のＵ８７細胞に起因するＥＶ溶解物中の膜関連タンパク質またはエンドソームタンパク質に対する陽性についてのウェスタン解析と結合し（図４Ｂ）、不均一なＥＶ回収におけるＮＢＩの有効性が確認された。
【0063】
実施例５－ＮＢＩ手順中の機械的力および塩平衡の影響
ＮＢＩ手順中の機械的力および塩平衡の影響を分析するために、エキソソームに類似したリポソームを、４つの異なる平均サイズ（１４９、１７７、１９６、２０２ｎｍ）で作製し、その混合物を１０ｍｌのＤＭＥＭ培地に添加し、その後ＮＢＩで処理した（図５）。ＮＢＩおよびＵＣの両方は、粒子の完全な回収（９８．６％）を可能にした。対照的に、本発明者らは、ホスファチジルエタノールアミン－ローダミンで前染色し、超遠心分離（ＰＥ－Ｒｈｏ ＵＣ）したリポソームは、ＰＥ－Ｒｈｏ ＮＢＩ粒子とは対照的に融合挙動（４０ｎｍ超の変位）を有し、おそらくＵＣにより生じたより大きな膜損傷または湾曲に因ることを観察した。これらのデータは、ＮＢＩがＥＶ形態をより良好に保存し、辺縁干渉を有するリン脂質結合染色と組み合わせて使用できることを示している。
ＮＢＩ手順中の機械的力および塩平衡の影響を分析するために、エキソソームに類似したリポソームを、４つの異なる平均サイズ（１４９、１７７、１９６、２０２ｎｍ）で作製し、その混合物を１０ｍｌのＤＭＥＭ培地に添加し、その後ＮＢＩで処理した（図５）。ＮＢＩおよびＵＣの両方は、粒子の完全な回収（９８．６％）を可能にした。対照的に、本発明者らは、ホスファチジルエタノールアミン－ローダミンで前染色し、超遠心分離（ＰＥ－Ｒｈｏ ＵＣ）したリポソームは、ＰＥ－Ｒｈｏ ＮＢＩ粒子とは対照的に融合挙動（４０ｎｍ超の変位）を有し、おそらくＵＣにより生じたより大きな膜損傷または湾曲に因ることを観察した。これらのデータは、ＮＢＩがＥＶ形態をより良好に保存し、辺縁干渉を有するリン脂質結合染色と組み合わせて使用できることを示している。
【0064】
実施例６－ＮＢＩ対ＵＣによる単離ＥＶの安定性の増加
生物材料は種々の保存条件にさらされるため、本発明者らは、ＮＢＩまたはＵＣによる精製後に４℃で保存された微小胞のターンオーバーを解析した（図６）。単離後２４日（ｔ２４）のＵＣ試料では、最初に分析された６００ｎｍ集団は、約３００ｎｍ集団に置き換えられた。驚くべきことに、最初のＥＶ集団の８６％のＮＢＩ試料では、同じナノポアを用いてなお検出可能であり（図６、中央）、系統的な微小胞分析では、ＵＣからのＥＶの７．３５日とは対照的に、ＮＢＩからのＥＶの半減期５０日超が示された（図６、右）。要約すると、ＮＢＩは最初のＥＶ形態とその分散を保持し、溶液中でより良好な安定性をもたらす。
生物材料は種々の保存条件にさらされるため、本発明者らは、ＮＢＩまたはＵＣによる精製後に４℃で保存された微小胞のターンオーバーを解析した（図６）。単離後２４日（ｔ２４）のＵＣ試料では、最初に分析された６００ｎｍ集団は、約３００ｎｍ集団に置き換えられた。驚くべきことに、最初のＥＶ集団の８６％のＮＢＩ試料では、同じナノポアを用いてなお検出可能であり（図６、中央）、系統的な微小胞分析では、ＵＣからのＥＶの７．３５日とは対照的に、ＮＢＩからのＥＶの半減期５０日超が示された（図６、右）。要約すると、ＮＢＩは最初のＥＶ形態とその分散を保持し、溶液中でより良好な安定性をもたらす。
【0065】
実施例７－細胞系におけるＮＢＩ法の頑健性
細胞系におけるＮＢＩの頑健性を評価するために、種々の密度で播種したＵ８７細胞培地から６ウェルプレート上で３つ１組でＥＶを独立して精製した（図７）。回収された粒子は播種した細胞の数に比例し、エキソソーム（１９７±２６ｎｍ）および微小胞（５９５±３７ｎｍ）の両方について６．１４％（ＮＢＩ １、２および３についてｎ＝９）の全般的変動係数（ＣＶ）を示した；本発明者らは、無血清培養培地（ＮＢＩ １）からのＥＶと無小胞超遠心（ｄＦＢＳ）血清との間に統計的に有意な変動（Ｐ＝０．４５９）を観察しなかった。興味深いことに、小容量に適用可能な迅速なＮＢＩ手順は、１０３細胞／ｃｍ２のようなより少ない細胞を用いて小胞放出に従うことを可能にした（図８）。本発明者らは、細胞密度の関数としてエキソソームの直線的放出、一方で、微小胞に対して異なる動力学を有するコヒーレントな放出を観察し、おそらく粒子サイズに関連する種々の生体遺伝学的機構、安定性および／または細胞媒介ターンオーバーと関連した。
細胞系におけるＮＢＩの頑健性を評価するために、種々の密度で播種したＵ８７細胞培地から６ウェルプレート上で３つ１組でＥＶを独立して精製した（図７）。回収された粒子は播種した細胞の数に比例し、エキソソーム（１９７±２６ｎｍ）および微小胞（５９５±３７ｎｍ）の両方について６．１４％（ＮＢＩ １、２および３についてｎ＝９）の全般的変動係数（ＣＶ）を示した；本発明者らは、無血清培養培地（ＮＢＩ １）からのＥＶと無小胞超遠心（ｄＦＢＳ）血清との間に統計的に有意な変動（Ｐ＝０．４５９）を観察しなかった。興味深いことに、小容量に適用可能な迅速なＮＢＩ手順は、１０３細胞／ｃｍ２のようなより少ない細胞を用いて小胞放出に従うことを可能にした（図８）。本発明者らは、細胞密度の関数としてエキソソームの直線的放出、一方で、微小胞に対して異なる動力学を有するコヒーレントな放出を観察し、おそらく粒子サイズに関連する種々の生体遺伝学的機構、安定性および／または細胞媒介ターンオーバーと関連した。
【0066】
次に、単離したＥＶを、ＭＣＦ－７、ＰＣ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ腫瘍細胞株からのＮＢＩ方法と比較した。すべての場合において、両方の小胞集団の放出が弱かったＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を除き、対応するサイズの小胞の同等の分布が観察された（図９）。ＮＢＩの一般的な汎用性は、グラム陰性菌（ＤＨ５α大腸菌細胞）が産生する小胞の精製においても実証されており、直径９２±２９ｎｍの集団を検出している（図１０）。
【0067】
実施例８－液体生検でのＮＢＩ性能
ＥＶは多くの種類の血液細胞から放出され、バイオマーカーとして研究され得るため、赤血球要素の既知の数を有する健常ドナーからの液体生検でのＮＢＩの性能を評価した（図１１）。血漿中のＥＶ濃縮が血清（図１２）と比較して観察され、血漿（０．５ｍｌ）上のＮＢＩが、４５±１０歳の平均年齢の４７人の被験者に対して系統的に行われた。図１３Ａに示すように、３０．５６±２５．７８×１０９のエキソソーム／ｍｌが、平均サイズ２４９．５±３６．７１ｎｍで回収され、５．４９±３．０９×１０８の微小胞／ｍｌが平均サイズ５６４．４±５７．３ｎｍで回収され、約５５：１のエキソソーム／微小胞比が得られた。回収されたエキソソームの数は、赤血球数（ＲＢＣ）（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９９８、Ｐ値＜０．０００１）、血小板（ＰＬＴ、Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９５８）および白血球（ＷＢＣ、Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９７０）と相関し、一方Ｐｅａｒｓｏｎ ｒは、それぞれ好酸球または好塩基球の亜種の％と０．７４または０．７２に低下する。一方（図１３Ｂ）、微小胞の数は、ＰＬＴ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９８９、Ｐ値＜０．０００１）、ＲＢＣ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９７６）およびＷＢＣ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９１２）の数とより良好に相関し、好酸球（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．５８）または好塩基球（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．３５）のパーセンテージと低い一貫性を示している。
ＥＶは多くの種類の血液細胞から放出され、バイオマーカーとして研究され得るため、赤血球要素の既知の数を有する健常ドナーからの液体生検でのＮＢＩの性能を評価した（図１１）。血漿中のＥＶ濃縮が血清（図１２）と比較して観察され、血漿（０．５ｍｌ）上のＮＢＩが、４５±１０歳の平均年齢の４７人の被験者に対して系統的に行われた。図１３Ａに示すように、３０．５６±２５．７８×１０９のエキソソーム／ｍｌが、平均サイズ２４９．５±３６．７１ｎｍで回収され、５．４９±３．０９×１０８の微小胞／ｍｌが平均サイズ５６４．４±５７．３ｎｍで回収され、約５５：１のエキソソーム／微小胞比が得られた。回収されたエキソソームの数は、赤血球数（ＲＢＣ）（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９９８、Ｐ値＜０．０００１）、血小板（ＰＬＴ、Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９５８）および白血球（ＷＢＣ、Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９７０）と相関し、一方Ｐｅａｒｓｏｎ ｒは、それぞれ好酸球または好塩基球の亜種の％と０．７４または０．７２に低下する。一方（図１３Ｂ）、微小胞の数は、ＰＬＴ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９８９、Ｐ値＜０．０００１）、ＲＢＣ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９７６）およびＷＢＣ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．９１２）の数とより良好に相関し、好酸球（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．５８）または好塩基球（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．３５）のパーセンテージと低い一貫性を示している。
【0068】
赤血球ＣＤ２３５ａマーカーまたは血小板ＣＤ４１ａマーカーを用いた精製した小胞の免疫補充は、溶液中のエキソソームまたは微小胞の存在を減少させ（図１４）、ヒト血漿中のＥＶ生理学的存在量を推定する可能性を示した。重要なことには、特定の膜タンパク質に対する陽性を用いて、最初の細胞型に基づいて異なる「ＥＶ線」を順序付けすることができた。
【0069】
最後に、４７の供与体ＥＶから抽出し、ｃＤＮＡに変換したＲＮＡを用いて、液滴デジタルＰＣＲアッセイのためのＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ／約３×１０９ＥＶの絶対数を計算した（図１５および図１６）。ｍＲＮＡコピーの数はＰＬＴ数と相関しており（Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ：０．６２３）、おそらくかなりの量のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡがＰＬＴによって産生された微小胞に含まれていることが示唆され（図１７）、形質細胞はすでにＧＡＰＤＨの主要な産生菌として認識されている。また、ＥＶ含有／関連ＲＮＡの解析は、核酸分子の過去の抽出なしに、しかしオイル反応液滴に直接封入したＮＢＩ精製ＥＶを用いて、ＥｖａＧｒｅｅｎ化学（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いて、液滴デジタルＰＣＲで行い（図１８）、ＮＢＩ方法が核酸の高感度分析のための技術が利用する下流側の化学反応に適合することを示している。
【0070】
ここに提示したＮＢＩ法は、ＥＶ表面に存在し得る抗原（タンパク質）の超高感度検出に使用される他の技術とも適合する。正の（ニッケルまたはアルミニウムなどの金属）および負の（ＥＶなど）正味電荷との間の相互作用の原理によれば、ＮＢＩは、ニッケルキレート化受容体ビーズおよび供与体ビーズによって認識されるビオチン化抗体を用いて、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）技術と結合することができる（図１９Ａ）。したがって、ヒト血漿中を循環するＥＶは、図１９Ｂに示される抗体を用いて直接検出することができ、これは、α技術に関連するＮＢＩの直接適用を表す。
【0071】
ＮＢＩ方法により、ウェスタンブロット方法によるＥＶ関連タンパク質の存在のさらなる検証が可能であり、その実験結果は、ＥＶに遍在的に発現するタンパク質を認識する抗体を用いて、図２０に示した。
【0072】
結論として、ＮＢＩは、細胞外小胞単離のための次世代手段である。
【0073】
材料および方法
細胞培養
Ｕ８７－ＭＧヒトグリオーマ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１４（商標））、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｄｉｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２６６（商標））およびＰＣ－３前立腺腺癌（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１４３５（商標））を、ＡＴＣＣバンク（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。代わりに、ＩＲＣＣＳ Ａｚｉｅｎｄａ Ｏｓｐｅｄａｌｉｅｒａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉａ Ｓａｎ Ｍａｒｔｉｎｏ－ＩＳＴ Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ ｐｅｒ ｌａ Ｒｉｃｅｒｃａ ｓｕｌ Ｃａｎｃｒｏの生物バンクにより、乳腺癌ＭＣＦ７（ＩＣＬＣ；ＨＴＬ９５０２１）およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＩＣＬＣ；ＨＴＬ９９００４）の細胞株が提供された。これらの細胞は接着性に成長し、ＲＰＭＩ １６４０培地で培養に保持したＰＣ－３細胞を除き、他のすべての系統をＤＭＥＭ培地で増殖させ、両方に１０％のＦＢＳ（ｖ／ｖ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン＋１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加し、３７℃で５％ＣＯ２と共にインキュベートした。細胞外小胞含有培地を得るために、最初に、細胞を、７５％コンフルエンスに達するまで（通常、４８時間で）全培地中で培養し；続いて、ＰＢＳで２回穏やかに洗浄した後、細胞を、ＦＢＳ非含有培地中で２４時間インキュベートした。細胞は、実施する試験に従って、異なった平板およびフラスコフォーマットで蒔いたが、密度は、図面の説明に特に記載のない限り、３．２±０．２×１０４／ｃｍ２で一定に保たれた。
細胞培養
Ｕ８７－ＭＧヒトグリオーマ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１４（商標））、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｄｉｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２６６（商標））およびＰＣ－３前立腺腺癌（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１４３５（商標））を、ＡＴＣＣバンク（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。代わりに、ＩＲＣＣＳ Ａｚｉｅｎｄａ Ｏｓｐｅｄａｌｉｅｒａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉａ Ｓａｎ Ｍａｒｔｉｎｏ－ＩＳＴ Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ ｐｅｒ ｌａ Ｒｉｃｅｒｃａ ｓｕｌ Ｃａｎｃｒｏの生物バンクにより、乳腺癌ＭＣＦ７（ＩＣＬＣ；ＨＴＬ９５０２１）およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＩＣＬＣ；ＨＴＬ９９００４）の細胞株が提供された。これらの細胞は接着性に成長し、ＲＰＭＩ １６４０培地で培養に保持したＰＣ－３細胞を除き、他のすべての系統をＤＭＥＭ培地で増殖させ、両方に１０％のＦＢＳ（ｖ／ｖ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン＋１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加し、３７℃で５％ＣＯ２と共にインキュベートした。細胞外小胞含有培地を得るために、最初に、細胞を、７５％コンフルエンスに達するまで（通常、４８時間で）全培地中で培養し；続いて、ＰＢＳで２回穏やかに洗浄した後、細胞を、ＦＢＳ非含有培地中で２４時間インキュベートした。細胞は、実施する試験に従って、異なった平板およびフラスコフォーマットで蒔いたが、密度は、図面の説明に特に記載のない限り、３．２±０．２×１０４／ｃｍ２で一定に保たれた。
【0074】
ＮＢＩ手順を開始する前に、採取した培養培地を２８００ｒｃｆで１０分間遠心分離し、新たな管に穏やかに移した。図７に記載した実験の場合、ｄＦＢＳ条件とは、１０％濃度に加えて１００，０００ｒｃｆの超遠心ＦＢＳを含む培養培地上で実施されるＮＢＩを指す。次にこの培養培地を１：１０ＰＢＳ希釈して、溶液粘度を低下させた。
【0075】
図９の細胞密度試験のために、Ｕ－８７－ＭＧ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ、ＭＣＦ７、およびＰＣ－３細胞株を、以下のウェル数：３．４×１０５；１．７×１０５；８．５×１０４；４．２×１０４；２．１×１０４および１．０×１０４で、６ウェルプレートに３つ１組で蒔いた。全培地中で４８時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＮＢＩプロトコルを継続する前にＦＢＳ無添加培地中で２４時間インキュベートした。この場合、ＥＶ含有培地を採取した後、接着した細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を標識し、ＰＢＳで洗浄し、その後定量イメージングシステムＯｐｅｒｅｔｔａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を通して画像を取得した。１０倍の拡大率で画像を取得し、ウェルあたり５０の場をＨａｒｍｏｎｙソフトウェアによって解析した。その後、ｑＮａｎｏ（ＩＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、調整可能な抵抗パルスセンシングを用いてＥＶを分析した。
【0076】
示差超遠心法によるＥＶ分離
Ｔ１５０フラスコ（ＣＬＳ４３０８２３－５０ＥＡ）中で培養したＵ８７－ＭＧ細胞により産生されたＥＶは、小さな変更を加えて、Ｄｉ（Ｖｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２０１２；１５：１５７３－８４）に記載されたプロトコルに準じた示差超遠心法により単離された。簡単に言うと、ＦＢＳを含まない培地中で２４時間インキュベートした後、上清をファルコンチューブで採取し、４℃で２８００ｒｃｆで遠心して、細胞破片を除去した。次に上清を超遠心管（Ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ Ｑｕｉｃｋ－Ｓｅａｌ遠心管２５×８９ｍｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に移し、ＳＷ ３２ Ｔｉローター付きＯｐｔｉｍａ ＸＥ－９０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）機器中で４℃、１００００ｒｃｆで３０分間遠心分離した。このステップは、ろ過したＰＢＳ中で穏やかに再懸濁した微小胞の優先的沈殿を可能にした。次に、Ｔｈｅｒｙ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２）に記載されているプロトコルに従って、採取した上清を、０．２２μｍ使い捨てフィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してろ過して、微小胞の汚染物または凝集体を除去し、４℃で７０分間１００，０００ｒｃｆで遠心分離して、エキソソームを優先的にペレット化した。ペレットを、ろ過したＰＢＳに再懸濁した。示差超遠心分離から得たＥＶを組み合わせ、－８０℃で保存するか、またはＴＲＰＳで分析する前に４℃に保った。
Ｔ１５０フラスコ（ＣＬＳ４３０８２３－５０ＥＡ）中で培養したＵ８７－ＭＧ細胞により産生されたＥＶは、小さな変更を加えて、Ｄｉ（Ｖｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２０１２；１５：１５７３－８４）に記載されたプロトコルに準じた示差超遠心法により単離された。簡単に言うと、ＦＢＳを含まない培地中で２４時間インキュベートした後、上清をファルコンチューブで採取し、４℃で２８００ｒｃｆで遠心して、細胞破片を除去した。次に上清を超遠心管（Ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ Ｑｕｉｃｋ－Ｓｅａｌ遠心管２５×８９ｍｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に移し、ＳＷ ３２ Ｔｉローター付きＯｐｔｉｍａ ＸＥ－９０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）機器中で４℃、１００００ｒｃｆで３０分間遠心分離した。このステップは、ろ過したＰＢＳ中で穏やかに再懸濁した微小胞の優先的沈殿を可能にした。次に、Ｔｈｅｒｙ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２）に記載されているプロトコルに従って、採取した上清を、０．２２μｍ使い捨てフィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してろ過して、微小胞の汚染物または凝集体を除去し、４℃で７０分間１００，０００ｒｃｆで遠心分離して、エキソソームを優先的にペレット化した。ペレットを、ろ過したＰＢＳに再懸濁した。示差超遠心分離から得たＥＶを組み合わせ、－８０℃で保存するか、またはＴＲＰＳで分析する前に４℃に保った。
【0077】
ＮＢＩ試薬（好ましく使用する）：
０．２μｍ使い捨てフィルター膜で濾過したＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１００１００２３）（ＮＢＩプロトコル全体にわたって使用）。
ＮｉＳＯ４［０．１Ｍ］（Ｓｉｇｍａ，６５６８９５）
ＮａＣｌ［５Ｍ］（Ｓｉｇｍａ，４５０００６）
クエン酸ナトリウム［０．２Ｍ］（Ｓｉｇｍａ，Ｃ８５３２）
ＥＤＴＡ［０．５］Ｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ｐＨ８．０、１５５７５０２０）
ＫＨ２ＰＯ４［１Ｍ］（Ｓｉｇｍａ，Ｐ９７９１）
ストリッピング緩衝液：ＰＢＳ＋０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ａ：最終濃度３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０のＰＢＳで体積まで。
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂ：６０ｍＭのＮａＣｌ、４５μＭのクエン酸ナトリウムでＰＢＳで体積まで。
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝液ＡおよびＢ（１Ｘ溶出液）を混合した後、８μｌ／ｍｌのＫＨ２ＰＯ４を１Ｘ液に添加し、その後ＥＶ溶出を進めた。
０．２μｍ使い捨てフィルター膜で濾過したＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１００１００２３）（ＮＢＩプロトコル全体にわたって使用）。
ＮｉＳＯ４［０．１Ｍ］（Ｓｉｇｍａ，６５６８９５）
ＮａＣｌ［５Ｍ］（Ｓｉｇｍａ，４５０００６）
クエン酸ナトリウム［０．２Ｍ］（Ｓｉｇｍａ，Ｃ８５３２）
ＥＤＴＡ［０．５］Ｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ｐＨ８．０、１５５７５０２０）
ＫＨ２ＰＯ４［１Ｍ］（Ｓｉｇｍａ，Ｐ９７９１）
ストリッピング緩衝液：ＰＢＳ＋０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ａ：最終濃度３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０のＰＢＳで体積まで。
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂ：６０ｍＭのＮａＣｌ、４５μＭのクエン酸ナトリウムでＰＢＳで体積まで。
ＥＶ－Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝液ＡおよびＢ（１Ｘ溶出液）を混合した後、８μｌ／ｍｌのＫＨ２ＰＯ４を１Ｘ液に添加し、その後ＥＶ溶出を進めた。
【0078】
微小胞フローサイトメトリー分析
示差超遠心法またはＮＢＩ由来の小胞を、０．２２μｍのろ過したＰＢＳで希釈した。背景シグナルは、ろ過したＰＢＳの取得に基づいて設定され、光散乱閾値は、１秒当たり５事象以下の事象率を有する取得を可能にするように補正された。
示差超遠心法またはＮＢＩ由来の小胞を、０．２２μｍのろ過したＰＢＳで希釈した。背景シグナルは、ろ過したＰＢＳの取得に基づいて設定され、光散乱閾値は、１秒当たり５事象以下の事象率を有する取得を可能にするように補正された。
【0079】
光散乱検出は対数スケールで設定し、前方散乱および側方散乱に割り当てた電圧はそれぞれ３００および３１０Ｖであり、しきい値は両方のシグナルに対して２００に設定した。取得は低流速で行い、群れ効果および事象の一致を避けるために試料を注意深く希釈した。標準の１および１０μｍポリスチレンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、微小胞のゲートを設定した。各試料の分析のために可能性のある１０，０００の事象を計数した場合、時間取得に基づいて、少なくとも１分の取得を記録した。試料取得はＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、データはＢＤ Ｄｉｖａ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ソフトウェアを用いて分析した。
【0080】
ＴＲＰＳ（可変抵抗パルス感知）
ＥＶサイズおよび濃度を、ｑＮａｎｏ（ＩＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）ツールを用いてＴＲＰＳによって特性化した。６ウェルプレートの実験（図９、図３Ｃおよび図８）について、または粒子速度が１００粒子／分未満で、少なくとも２分間の記録を分析した試料の場合を除き、各試料について平均５００粒子を計数した。ＮＰ２００ナノ多孔（Ａ４０９４８、Ａ４３５４５、Ａ４３６６７、Ａ４３６６７）、ＮＰ４００（Ａ４３５９２、Ａ４４１１７、Ａ４４１１６）、ＮＰ８００（Ａ４０５４２、Ａ３６１６４、Ａ４０５４８、Ａ４４１１８）およびＮ１０００（Ａ４０５７２）を、Ｉ ４５．５～Ｉ ４７ｍｍのストレッチで用いた。電圧は、９５～１３０ｎＡ範囲で定常電流強度を維持するために０．１２～０．６８Ｖに設定し、背景ノイズは７～１２ｐＡより低く、線状粒子計数率であった。それぞれ１１４ｎｍ、２１０ｎｍ、５００ｎｍ、７１０ｎｍおよび９４０ｎｍの平均直径を有する校正粒子ＣＰＣ１００Ｂ（バッチＩＤ：Ｂ８７４８Ｎ）、ＣＰＣ２００Ｂ（バッチＩＤ：Ｂ６４８１Ｍ）、ＣＰＣ５００Ｅ（バッチＩＤ：６５９５４３Ｂ）、ＣＰＣ８００Ｅ（バッチＩＤ：６３４５６１Ｂ）およびＣＰＣ１０００Ｆ（バッチＩＤ：６６９５８２Ｂ）を、ｉＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅによって購入した。ｑＮＡＮＯによる解析に関連するデータはすべて、Ｉｚｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｕｉｔｅ ｖ．３ソフトウェアにより記録し、解析した。
ＥＶサイズおよび濃度を、ｑＮａｎｏ（ＩＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）ツールを用いてＴＲＰＳによって特性化した。６ウェルプレートの実験（図９、図３Ｃおよび図８）について、または粒子速度が１００粒子／分未満で、少なくとも２分間の記録を分析した試料の場合を除き、各試料について平均５００粒子を計数した。ＮＰ２００ナノ多孔（Ａ４０９４８、Ａ４３５４５、Ａ４３６６７、Ａ４３６６７）、ＮＰ４００（Ａ４３５９２、Ａ４４１１７、Ａ４４１１６）、ＮＰ８００（Ａ４０５４２、Ａ３６１６４、Ａ４０５４８、Ａ４４１１８）およびＮ１０００（Ａ４０５７２）を、Ｉ ４５．５～Ｉ ４７ｍｍのストレッチで用いた。電圧は、９５～１３０ｎＡ範囲で定常電流強度を維持するために０．１２～０．６８Ｖに設定し、背景ノイズは７～１２ｐＡより低く、線状粒子計数率であった。それぞれ１１４ｎｍ、２１０ｎｍ、５００ｎｍ、７１０ｎｍおよび９４０ｎｍの平均直径を有する校正粒子ＣＰＣ１００Ｂ（バッチＩＤ：Ｂ８７４８Ｎ）、ＣＰＣ２００Ｂ（バッチＩＤ：Ｂ６４８１Ｍ）、ＣＰＣ５００Ｅ（バッチＩＤ：６５９５４３Ｂ）、ＣＰＣ８００Ｅ（バッチＩＤ：６３４５６１Ｂ）およびＣＰＣ１０００Ｆ（バッチＩＤ：６６９５８２Ｂ）を、ｉＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅによって購入した。ｑＮＡＮＯによる解析に関連するデータはすべて、Ｉｚｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｕｉｔｅ ｖ．３ソフトウェアにより記録し、解析した。
【0081】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
小胞は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて可視化した。簡単に言うと、２．５％ホルムアルデヒドで溶出緩衝液中に固定した各ＥＶ試料の５μｌアリコートを、薄い炭素膜で被覆した銅およびニッケル中の３００方形メッシュグリッド上に置いた。次いで、グリッドをｐＨ４．５の１％酢酸ウラニル緩衝液で陰性に標識し、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｍｏｒａｄａカメラ（使用倍率：２０５００×および８７０００×）を備えた１００ｋＶ ＴＥＭ ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ顕微鏡を使用して観察した。
小胞は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて可視化した。簡単に言うと、２．５％ホルムアルデヒドで溶出緩衝液中に固定した各ＥＶ試料の５μｌアリコートを、薄い炭素膜で被覆した銅およびニッケル中の３００方形メッシュグリッド上に置いた。次いで、グリッドをｐＨ４．５の１％酢酸ウラニル緩衝液で陰性に標識し、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｍｏｒａｄａカメラ（使用倍率：２０５００×および８７０００×）を備えた１００ｋＶ ＴＥＭ ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ顕微鏡を使用して観察した。
【0082】
その後、抗ＣＤ６３抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１９３３４９）、抗フロチリン－１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１０８２１）、抗Ａｌｉｘ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，＃２１７１）を用いて、ウエスタンブロット法による解析を行った。
【0083】
競合アッセイ
ＥＶ溶出ステップを、ヒスチジンで標識し、精製した（Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌ、１１０ｋＤａ；ＨｕＲ、３６ｋＤａ；ＹＴＨ、２３ｋＤａ）、ＤＨ５α大腸菌からのタンパク質抽出物３０μｇ／ｍｌおよび組み換えタンパク質１５μｇ／ｍｌを、Ｕ８７－ＭＧ細胞に由来するＥＶを含む１０ｍｌ培地に加えた競合アッセイにより試験した。簡単に述べると、ＤＨ５α細胞を、ＯＤ６０００．５に達するまでＬＢ培地中で培養に保持し、６０００ｒｃｆで５分間遠心分離により収集した。ペレットは、３ｍｌのＤＭＥＭ培地＋１μｇ／ｍｌのリソザイム中に再懸濁し、７サイクル（４０超音波増幅、７秒オン、１０秒オフ）の熱静的浴で４℃で超音波処理した。この溶解物を、１３，０００ｒｃｆで２０分間遠心分離することによって清澄化し、次いでＥＶ含有培地に添加する前に０．２μｍ使い捨てフィルター膜でろ過した。ヒスチジンＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで標識した組換えタンパク質は、Ｓ．Ｍａｎｓｙ博士の研究室（ＣＩＢＩＯ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｅｎｔｏ）から好意的に提供され、組換えタンパク質ＨｕＲ（Ｄ'Ａｇｏｓｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１３年８月１２日；８（８）：ｅ７２４２６）およびＹＴＨ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２０１５年１０月９日；２９０：２４９０２－１３）が、参考文献に記載されているように製造および精製された。
ＥＶ溶出ステップを、ヒスチジンで標識し、精製した（Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌ、１１０ｋＤａ；ＨｕＲ、３６ｋＤａ；ＹＴＨ、２３ｋＤａ）、ＤＨ５α大腸菌からのタンパク質抽出物３０μｇ／ｍｌおよび組み換えタンパク質１５μｇ／ｍｌを、Ｕ８７－ＭＧ細胞に由来するＥＶを含む１０ｍｌ培地に加えた競合アッセイにより試験した。簡単に述べると、ＤＨ５α細胞を、ＯＤ６０００．５に達するまでＬＢ培地中で培養に保持し、６０００ｒｃｆで５分間遠心分離により収集した。ペレットは、３ｍｌのＤＭＥＭ培地＋１μｇ／ｍｌのリソザイム中に再懸濁し、７サイクル（４０超音波増幅、７秒オン、１０秒オフ）の熱静的浴で４℃で超音波処理した。この溶解物を、１３，０００ｒｃｆで２０分間遠心分離することによって清澄化し、次いでＥＶ含有培地に添加する前に０．２μｍ使い捨てフィルター膜でろ過した。ヒスチジンＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで標識した組換えタンパク質は、Ｓ．Ｍａｎｓｙ博士の研究室（ＣＩＢＩＯ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｅｎｔｏ）から好意的に提供され、組換えタンパク質ＨｕＲ（Ｄ'Ａｇｏｓｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１３年８月１２日；８（８）：ｅ７２４２６）およびＹＴＨ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２０１５年１０月９日；２９０：２４９０２－１３）が、参考文献に記載されているように製造および精製された。
【0084】
ＮＢＩは、図３Ｂに示された溶出勾配溶液を除いて、インキュベーション時間および既に記載された試薬に続いて実施された。タンパク質試料は、それぞれのプロトコルの指示に従い、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）およびＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて定量した。等容量の溶出液を、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥに負荷させ、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ染色または一次抗ヒスチジン抗体（ａｂ１１８７）の１：１０００希釈を使用するウェスタンブロッティングに供した。
【0085】
ＮＰ８００、ＮＰ４００、およびＮＰ２００ナノポアを用いて、試料の不均一性を考慮して、回収粒子の数とサイズを、ＴＲＰＳにより分析した。
【0086】
グラム陰性菌からのＥＶ単離
ＤＨ５α大腸菌細胞を、ＯＤ６００が０．７に達するまで全ＬＢ培地中で培養した。細胞を４０００ｒｃｆで１５分間ペレット化し、上清を採取してＮＢＩプロトコルに従って処理した。粒子は、ＮＰ１５０およびＮＰ２００ナノポアを用いてｑＮＡＮＯ機器によって計数した。
ＤＨ５α大腸菌細胞を、ＯＤ６００が０．７に達するまで全ＬＢ培地中で培養した。細胞を４０００ｒｃｆで１５分間ペレット化し、上清を採取してＮＢＩプロトコルに従って処理した。粒子は、ＮＰ１５０およびＮＰ２００ナノポアを用いてｑＮＡＮＯ機器によって計数した。
【0087】
リポソーム製剤
真核生物小胞の脂質組成と類似した脂質組成を有するリポソーム脂質組成は、以下である：２０％ホスファチジルコリン分子、１０％ホスファチジルエタノールアミン分子、１５％オレオホスファチジルセリン分子、１５％スフィンゴミエリン分子、４０％コレステロール（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ ２０１３；１８３１：１３０２－９；Ｈａｒａｓｚｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ，Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１６；５：３２５７０）分子。脂質溶液から有機溶媒（例えば、クロロホルム）を回転エバポレータ機器および少なくとも１時間の減圧乾燥により除去する脂質膜を作製した。脂質を最終濃度１ｍｇ／ｍＬでＤＰＢＳに再懸濁し、渦で激しく撹拌して、多重層リポソームを形成し、これを、さらに６回の凍結融解サイクルに曝露した。最終的なリポソーム形態は、２シリンジ押し出し装置（ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ Ｂａｓｉｃ Ｕｎｉｔ，Ａｖｅｓｔｉｎ Ｉｎｃ．）を用いて多層リポソームの懸濁液を押し出すことにより得た。サイズの異なる小胞を得るために、サイズの異なる２つの積み重ねたポリカーボネートフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して３１のステップを実施し（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ １９９１；１０６１：２９７－３０３）、続いてＺｅｔａ Ｓｉｚｅｒ機器（Ｎａｎｏ－ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）による光子相関分光法により検証した。
真核生物小胞の脂質組成と類似した脂質組成を有するリポソーム脂質組成は、以下である：２０％ホスファチジルコリン分子、１０％ホスファチジルエタノールアミン分子、１５％オレオホスファチジルセリン分子、１５％スフィンゴミエリン分子、４０％コレステロール（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ ２０１３；１８３１：１３０２－９；Ｈａｒａｓｚｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ，Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１６；５：３２５７０）分子。脂質溶液から有機溶媒（例えば、クロロホルム）を回転エバポレータ機器および少なくとも１時間の減圧乾燥により除去する脂質膜を作製した。脂質を最終濃度１ｍｇ／ｍＬでＤＰＢＳに再懸濁し、渦で激しく撹拌して、多重層リポソームを形成し、これを、さらに６回の凍結融解サイクルに曝露した。最終的なリポソーム形態は、２シリンジ押し出し装置（ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ Ｂａｓｉｃ Ｕｎｉｔ，Ａｖｅｓｔｉｎ Ｉｎｃ．）を用いて多層リポソームの懸濁液を押し出すことにより得た。サイズの異なる小胞を得るために、サイズの異なる２つの積み重ねたポリカーボネートフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して３１のステップを実施し（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ １９９１；１０６１：２９７－３０３）、続いてＺｅｔａ Ｓｉｚｅｒ機器（Ｎａｎｏ－ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）による光子相関分光法により検証した。
【0088】
血液試料
健康なドナーから全血試料を、Ｍｅｙｅｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌで採取した。血漿試料を市販のＥＤＴＡ処理チューブで採取し、その後、コールドチェーンに従って病院生物バンクから研究所に発送した。試料分析前にドナーからインフォームドコンセントを得た。
健康なドナーから全血試料を、Ｍｅｙｅｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌで採取した。血漿試料を市販のＥＤＴＡ処理チューブで採取し、その後、コールドチェーンに従って病院生物バンクから研究所に発送した。試料分析前にドナーからインフォームドコンセントを得た。
【0089】
血漿は、冷蔵遠心分離機（４℃）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５７０２ Ｒ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を用いて２０００ｒｃｆで１０分間遠心分離した後、細胞を除去して得た。血液を凝固させ、室温で３０分間撹乱させないようにして、血清試料を採取した。冷蔵遠心分離機（４℃）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５７０２ Ｒ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を用いて２０００ｒｃｆで遠心分離して、凝固塊を除去した。Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ－５０００フローサイトメーター（Ｓｙｓｍｅｘ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）を用いて、完全な血球計算を分析した。分析手順は、プロトコルの指示に従って実施した。
【0090】
ＮＢＩによって精製された小胞の免疫多重化は、それぞれ、抗ＣＤ２３５ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－１００－２７１）および抗ＣＤ４１ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－１０５－６０８）ビオチン化抗体、およびストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１２０５Ｄ）を用いて行った。小胞は、ビーズの沈殿後ｑＮａｎｏで分析し、ビオチン（Ｓｉｇｍａ，Ｂ４５０１）の定量的当量でそれぞれの対照試料中の粒子の数で標準化した。
【0091】
ＲＮＡ抽出
ＱＩＡｚｏｌ試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、いくつかの変形例を加えて同封されている指示に従った。簡単に述べると、ＥＶ溶出ステップの前に１００μｌのＱＩＡｚｏｌを直接ビーズに加え、続いて渦で撹拌し、室温で５分間インキュベートした。次にクロロホルム２０μｌを加えた。１５秒間激しく混合した後、試料を室温で３分間インキュベートした。相を、４℃で１５分間１２，０００ｒｃｆでの遠心分離によって分離し、水相を排出した。１μｌのグリコーゲン（２０ｍｇ／ｍｌ）および１００μｌのイソプロパノールを添加した後、ＲＮＡを－８０℃で一晩沈殿させた。１２，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離した後、ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、上記のように遠心分離し、１０μｌのＲＮＡ分解酵素非含有水に再懸濁した。プロトコルの指示に従って、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡを定量した。
ＱＩＡｚｏｌ試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、いくつかの変形例を加えて同封されている指示に従った。簡単に述べると、ＥＶ溶出ステップの前に１００μｌのＱＩＡｚｏｌを直接ビーズに加え、続いて渦で撹拌し、室温で５分間インキュベートした。次にクロロホルム２０μｌを加えた。１５秒間激しく混合した後、試料を室温で３分間インキュベートした。相を、４℃で１５分間１２，０００ｒｃｆでの遠心分離によって分離し、水相を排出した。１μｌのグリコーゲン（２０ｍｇ／ｍｌ）および１００μｌのイソプロパノールを添加した後、ＲＮＡを－８０℃で一晩沈殿させた。１２，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離した後、ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、上記のように遠心分離し、１０μｌのＲＮＡ分解酵素非含有水に再懸濁した。プロトコルの指示に従って、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡを定量した。
【0092】
逆転写反応と液滴デジタルＰＣＲ
逆転写反応は、以下の反応組成物：２．３μｌの５Ｘ反応緩衝液、１．１５μｌの酵素混合物、０．５μｌの合成ＲＮＡスパイクインおよび７．５μｌの鋳型全ＲＮＡを有するプロトコルの指示に従って、ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＴ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＰＣＲキット、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｅｘｉｑｏｎ）を用いて実施した。ＱＸ２００ＴＭ Ｄｒｏｐｌｅｔ ＤｉｇｉｔａｌＴＭ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、ＥｖａＧｒｅｅｎ化学および以下のプライマーを用いてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを定量化した：５'－ＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡ－３'（配列番号．１）および５'－ＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧ－３'（配列番号．２）。
逆転写反応は、以下の反応組成物：２．３μｌの５Ｘ反応緩衝液、１．１５μｌの酵素混合物、０．５μｌの合成ＲＮＡスパイクインおよび７．５μｌの鋳型全ＲＮＡを有するプロトコルの指示に従って、ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＴ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＰＣＲキット、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｅｘｉｑｏｎ）を用いて実施した。ＱＸ２００ＴＭ Ｄｒｏｐｌｅｔ ＤｉｇｉｔａｌＴＭ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、ＥｖａＧｒｅｅｎ化学および以下のプライマーを用いてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを定量化した：５'－ＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡ－３'（配列番号．１）および５'－ＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧ－３'（配列番号．２）。
【0093】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ
反応は、３８４－Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で２０μｌの最終容量で行った。連続的抗体希釈物を有する１５μｇ／ｍｌのニッケル－キレート受容体ビーズおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン－供与体ビーズを使用して、アッセイをＰＢＳ中で最適化して、付着点を同定した。表在性マーカーの存在は、以前にＴＲＰＳによって特徴付けられたＥＶ連続希釈による用量－応答において分析された。健常なドナー血漿または血清非含有腫瘍細胞試料からＮＢＩによりＥＶを精製した。室温で暗所で９０分間インキュベートした後、Ｅｎｓｐｉｒｅ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって蛍光シグナルを最終的に検出した。
反応は、３８４－Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で２０μｌの最終容量で行った。連続的抗体希釈物を有する１５μｇ／ｍｌのニッケル－キレート受容体ビーズおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン－供与体ビーズを使用して、アッセイをＰＢＳ中で最適化して、付着点を同定した。表在性マーカーの存在は、以前にＴＲＰＳによって特徴付けられたＥＶ連続希釈による用量－応答において分析された。健常なドナー血漿または血清非含有腫瘍細胞試料からＮＢＩによりＥＶを精製した。室温で暗所で９０分間インキュベートした後、Ｅｎｓｐｉｒｅ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって蛍光シグナルを最終的に検出した。
【0094】
統計解析
独立した実験のデータおよび数を、図面の関連するキャプションに示す。アノバ、ｔ検定、ピアソンｒ係数は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５．１ソフトウェアを用いて算出し、結果は、Ｐ値が０．０５未満（＊）、０．０１未満（＊＊）、０．００１未満（＊＊＊）である場合に統計学的に有意と考慮した。
独立した実験のデータおよび数を、図面の関連するキャプションに示す。アノバ、ｔ検定、ピアソンｒ係数は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５．１ソフトウェアを用いて算出し、結果は、Ｐ値が０．０５未満（＊）、０．０１未満（＊＊）、０．００１未満（＊＊＊）である場合に統計学的に有意と考慮した。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
真核細胞または原核細胞によって分泌される細胞外小胞（ＥＶ）を生体液体中で単離する方法であって、前記方法が、ニッケル及びアルミニウムからなる群から選択される陽イオンで官能化され、３０～８０ｍＶの正の正味電荷を有し、かつマイクロメトリック又はナノメトリックサイズの磁性又は非磁性粒子からなる固定相の使用を含む方法。
【請求項2】
前記固定相が、磁性又は非磁性のいずれかのアガロース又はシリコンビーズ、アルギン酸塩マトリックス、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）用ポリマー、ニッケルキレート受容体ビーズ、陰イオン性又はカーボンスチレンポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記固定相が、マイクロメートルサイズにおける場合は平均サイズ２５～４０μｍの粒子を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記固定相を生体液体の表面に滴加する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
生体液体中でインキュベートした後、穏やかな遠心分離およびデカンテーションによって前記ビーズを分離する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
少なくとも２種類の異なるキレート剤を含む生理学的ｐＨで２種類の生理食塩水溶液を混合することによって、使用の数分前に調製した溶出溶液の少なくとも等容量でインキュベーションすることによって、ＥＶを前記固定相から除去する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡおよびクエン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
最終的な溶出溶液において、ＥＤＴＡが３～６ｍＭ濃度を有し、クエン酸ナトリウムが１～３００μＭ濃度を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
溶出溶液との前記インキュベーションが２０～３７℃で軌道回転下で維持される、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記生体液体が、細胞培養培地、生理学的緩衝液、細菌培養培地、ヒト－動物血液、ヒト－動物組織滲出物からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記単離されたＥＶが、次いで、ＥＶからのタンパク質および核酸抽出（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、特異的抗体と組み合わせた抗原検出技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）による関連する、および／または小胞を含有する核酸の検出および定量、小滴デジタルＰＣＲによる関連する、および／または小胞を含有する核酸の検出および定量のためのプロトコルに供される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
以下：
ニッケル及びアルミニウムからなる群から選択される陽イオンで官能化され、３０～８０ｍＶの正の正味電荷を有し、かつマイクロメトリック又はナノメトリックサイズの磁性又は非磁性粒子からなる固定相を含む容器、または
マイクロメトリックもしくはナノメトリックサイズの磁気および非磁気粒子からなる官能化されていない固定相を含む容器；ならびに
ニッケルもしくはアルミニウム塩を含む容器
を含む、キット。
ニッケル及びアルミニウムからなる群から選択される陽イオンで官能化され、３０～８０ｍＶの正の正味電荷を有し、かつマイクロメトリック又はナノメトリックサイズの磁性又は非磁性粒子からなる固定相を含む容器、または
マイクロメトリックもしくはナノメトリックサイズの磁気および非磁気粒子からなる官能化されていない固定相を含む容器；ならびに
ニッケルもしくはアルミニウム塩を含む容器
を含む、キット。
【請求項13】
前記固定相が、磁性又は非磁性のいずれかのアガロース又はシリコンビーズ、アルギン酸塩マトリックス、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）用ポリマー、ニッケルキレート受容体ビーズ、陰イオン性又はカーボンスチレンポリマーからなる群から選択される、請求項１２に記載のキット。
【請求項14】
前記固定相が、マイクロメートルサイズにおける場合は平均サイズ２５～４０μｍの粒子を有する、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項15】
以下：
生理学的ｐＨで緩衝された生理食塩水溶液を含む容器；
各々が種々のキレート剤を含む少なくとも２つの容器
をさらに含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のキット。
生理学的ｐＨで緩衝された生理食塩水溶液を含む容器；
各々が種々のキレート剤を含む少なくとも２つの容器
をさらに含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のキット。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0048】
【図1】種々の起源の生物学的材料から出発した、本発明によるＮＢＩによる使用者に優しいアプローチおよびＥＶ単離のステップを示す図式。
【図2】超遠心分離またはＮＢＩによって単離された粒子（０．５μｍ超）の数間の比較を示すフローサイトメトリー分析。Ａ）ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ）機器を、直径１および１０μｍのポリスチレンビーズ（Ｆ１３８３８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で校正した。Ｂ）官能化されていないビーズ（陰性対照）を用いてＮＢＩ法を用いて捕獲した粒子の数。Ｃ）１９ｍＭ硫酸ニッケルで官能化したアガロースビーズを用いて超遠心（５６．６％）またはＮＢＩ（５８．８％）後に得られた０．５μｍ超（Ｐ２）の粒子の数。グラフは、２つの独立した実験の代表である。
【図3A】ヒスチジンタグによるタンパク質の精製。組換えタンパク質の１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル後のクーマシー染色は、以下を示す：Ｍ：前発色タンパク質ラダー；１：Ｔ７ｐ０７タンパク質、１０５ｋＤａ（ゲル上に２μｇ負荷）；２：ＨｕＲタンパク質、３６ｋＤａ（ゲル上に３００ｎｇ負荷）；３：ＹＴＨＤＦ１タンパク質、２３ｋＤａ（ゲル上に２μｇ負荷）。
【図3B】大腸菌ＤＨ５α総タンパク質抽出物５００μｇ／ｍｌで、およびＡ（Ｔ７ｐ０７、ＨｕＲ、ＹＴＨＤＦ１）に示される合計１５０μｇ／ｍｌの組換えタンパク質で濃縮した無血清細胞培養培地で実施した競合アッセイ。ヒスチジンタグに対する抗体を用いたＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色またはウェスタンブロット法後に、２つの平行ゲルを展開した。ＦＴ（フロースルー）はＮＢＩビーズへの曝露後の培地であり、グラフは示されたナノポアを用いたｑＮＡＮＯ（ｉＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）による解析からの結果である。１Ｘ溶液は、タンパク質濃縮系においてＥＶの最大選択的溶出を可能にする。
【図3C】溶出緩衝液中のキレート剤および塩の濃度上昇は、ＥＶの完全性を１．５Ｘ超に変化させる。ｑＮＡＮＯ分析により得られたグラフは、２つの独立した実験の代表であり、数およびサイズの低下は、ＥＶ有害効果を示す。
【図4】Ａ）溶出緩衝液中で２．５％パラホルムアルデヒドで固定した後の、ＮＢＩにより得られたＥＶの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による獲得。Ｂ）１８×１０６（ＮＢＩ１）または９×１０６（ＮＢＩ２）またはＵ８７細胞全細胞溶解物（ＴＣＬ）の１％からの回収したＥＶ溶解物のウェスタンブロット分析。
【図5】超遠心法（ＵＣ）またはＮＢＩにより回収した直径１８１±２３．８ｎｍの４．２×１０９リポソームの混合物。同じ実験を、ホスファチジルエタノールアミン－ローダミン（ＰＥ－Ｒｈｏ、５ｎｇ／ｍｌ）によるリポソーム染色後に再現した。
【図6】無血清培地３ｍｌ中で培養したＵ８７細胞から単離し、ＵＣまたはＮＢＩにより直後（ｔ０）または２４日後（ｔ２４、４℃で保存）に分析した微小胞。次に、繰り返しのｇＮＡＮＯ計測を、精製後５２日まで行い、微小胞集団の半減期を、時間ｔ０と比較してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ．５を用いて算出した。
【図7】ＮＢＩ法の再現性は、示されているように、６ウェルプレートに、種々の密度で播種したＵ８７細胞による無血清培地を用いて試験した（ＮＢＩ１、２、および３）。１０％超遠心血清条件（ｄＦＢＳ）は、ＮＢＩ１試料で得られた結果とかなりの重複を示した。グラフは３つの独立した実験の代表であり、全体の変動係数（ＣＶ）は６．１％であり、この方法の優れた再現性を示した。
【図8】６ウェルプレート（１ｍｌ）における細胞密度の関数としての単離したＥＶは、培養培地における種々の放出動態を明らかにする。Ａ）２４時間後にＮＢＩによりＥＶを精製し、細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、播種細胞の数を示すＤＮＡ染色に曝露した。画像は、「高含有量」分析システム、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアｖ４．１およびＯｐｅｒｅｔｔａ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で取得した。Ｂ）Ａに記載した培地をＮＢＩで処理し、ここでＬｏｇ２に示したエキソソームおよび微小胞の数を、ｑＮＡＮＯ（ｉＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した。標準偏差を、ここでは３つの独立した実験に言及する。
【図9】ＮＢＩによって単離されたＥＶの数およびサイズを、示されているように、いくつかの腫瘍細胞株について分析した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞のみが、両ＥＶ集団の放出の実質的減少を示した（＊＊Ｐ値＝０．００６、Ｆ＝７０．１３、および＊＊＊＜０．０００１、Ｆ＝３０．８４、ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ後試験を用いた）。標準偏差を、ここでは３つの独立した実験に言及する。
【図10】グラム陰性菌によって放出される小胞の単離においても、ＮＢＩの汎用性が確認されている。大腸菌ＤＨ５α細胞を、ＯＤ６００＝０．７まで全ＬＢ培地中で成長させた。細菌を４０００ｒｃｆで１５分間遠心分離することによってペレット化し、上清をＮＢＩ処理に用いた。粒子は、ＮＰ１５０およびＮＰ２００ナノポアを用いてｑＮＡＮＯで分析し、最大の検出された個体群は、直径９２±２９ｎｍを示した。グラフは、２つの独立した実験の代表である。
【図11】フローレンスのマイヤー小児病院で平均年齢４５歳の健常ドナー４７人から採取した血液小体要素計数を、製造指示に従って、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＥ－５０００血液分析器（Ｓｙｓｍｅｘ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）により実施した。
【図12】同一ドナー血漿および血清からＮＢＩにより単離された微粒子（５００ｎｍ以上）の数間の比較。フローサイトメーター事象を２分間取得し、同じ粒子集団の相対パーセンテージを示す。
【図13】Ａ）ＮＢＩを０．５ｍｌの血漿に適用し、ＴＲＰＳ分析を行ったところ、示された小胞の数およびサイズが検出された。エキソソームの数は、赤血球（ＲＢＣ）と相関した、ピアソン係数＝０．９９。Ｂ）Ａで行った同じ解析を、微小胞計数に適用し、血小板（ＰＬＴ）との相関は、０．９８であった。
【図14】それぞれ既知の血小板または小球マーカーに対して向けられたＣＤ４１ａおよびＣＤ２３５ａビオチン化抗体を、「ＥＶ系列」を探索するために利用した。ＮＢＩで精製した溶液中の小胞の各試料を、２つの等しい部分に分けて、それぞれ抗体またはビオチン（陰性対照）と共にインキュベートした。ストレプトアビジン共役磁気ビーズによる沈殿後、溶液中の残りの小胞を、ｑＮＡＮＯで特性化した。示された粒子の数は、相対的陰性対照に対して標準化される。＊Ｐ値＜０．０５；＊＊Ｐ値＜０．０１；＊＊＊Ｐ値＜０．００１。
【図15】４７人のドナーの血漿からのＮＢＩ精製小胞から抽出した０．１～４ｎｇのＲＮＡから出発して合成したｃＤＮＡ２０のうち２マイクロリットル。液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、ＥｖａＧｒｅｅｎ化学および以下のプライマーと共に使用した：５'－ＣＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡ（配列番号１）および５'－ＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧ（配列番号２）。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（ＢＩＯＲＡＤ）で解析した後、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのコピーの絶対数を求めた。
【図18】ＮＢＩ方法で使用される緩衝溶液は、Ｖ６００Ｅ突然変異を含む特異的ＲＮＡの定量分析のためにＳＫ－ＭＥＬ－２８黒色腫細胞から精製された全ＥＶに直接使用される液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）と適合性である。
【図19】Ａ）ニッケル（陽性）とＥＶ（陰性）との間の反対符号の電荷間の初期結合は、ＮＢＩとアルファ技術との間の結合を可能にし、ニッケル－受容体ビーズは、ビオチン化抗体およびストレプトアビジンビーズ－供与体と組み合わせて使用され、ＥＶの表面上の特異的抗原を捕捉および検出する。Ｂ）ヒト血漿中を循環するＥＶ上に存在する特異的抗原（ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４５）の認識および定量の例。ＣＤ１４６抗原は、実験的陰性対照として作用する上皮起源の細胞のマーカーである。
【図20】ＮＢＩに使用される緩衝液は、変性条件下でタンパク質を検出するための従来の技術、例えばウェスタンブロット法とも適合する。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0049】
実施例１－ニッケルイオン官能化ビーズの調製
ビーズ官能化のための手順は、以下のように実施される：
－ 市販のＮｉＮＴＡセファロース高速ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品コード７１－５０２７－６７または１７－５２６８－０１）を、開始ビーズとした；正味荷電値を測定し、結果として、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を用いて検出されるように、ＰＢＳ中２２～２５℃で３～２５ｍＶの範囲になった。
－ 開始ビーズを、２００～３００ｍＭのＮａＣｌもしくはＫＣｌ、１００～３００ｍＭのＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡ、３００～５００ｍＭのイミダゾールを添加した水溶液、または広いｐＨ範囲（一般に５～８の間）のカチオン性キレート剤を含む溶液での１つ以上の洗浄、および二蒸留水（１８．２ＭΩｃｍ－１）での１つ以上の洗浄によるストリッピングに供する；
－ あらかじめ５０ｍｌチューブにアリコートしたストリッピング処理を施した開始ビーズ（ＮｉＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅビーズ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－５２６８－０１，３４μｍ既知公称サイズ）の４０ｍｇ／ｍｌ懸濁液を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の濃縮１９ｍＭ硫酸ニッケル溶液の２倍体積（ビーズ体積に関連する）に再懸濁し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌する。
－ 硫酸ニッケル溶液中のビーズ混合物を、室温で、かつ穏やかな軌道回転で２分間インキュベートする。
－ ５０ｍｌチューブを傾斜ローターで２００ｒｃｆで１分間遠心し、ビーズをチューブの底部に集める。
－ 上清を穏やかに吸引し、廃棄し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌したｐＨ７．４でのＰＢＳの３倍体積（ビーズ体積に関して）を、ビーズに加える。
－ ビーズを前述のように再び遠心分離し、上清を吸引し、廃棄する。
－ ビーズへのＰＢＳ付加と除去のステップは、残存硫酸塩またはニッケルイオンの微量を除去するために、さらに２回連続して繰り返される。
－ ｐＨ７．４でＰＢＳの同容積（ビーズ容積に関して）にビーズを再懸濁し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌し、これらのビーズ（以下、ＣＢｅａｄと称する）を４℃で保存する。
ビーズ官能化のための手順は、以下のように実施される：
－ 市販のＮｉＮＴＡセファロース高速ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品コード７１－５０２７－６７または１７－５２６８－０１）を、開始ビーズとした；正味荷電値を測定し、結果として、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を用いて検出されるように、ＰＢＳ中２２～２５℃で３～２５ｍＶの範囲になった。
－ 開始ビーズを、２００～３００ｍＭのＮａＣｌもしくはＫＣｌ、１００～３００ｍＭのＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡ、３００～５００ｍＭのイミダゾールを添加した水溶液、または広いｐＨ範囲（一般に５～８の間）のカチオン性キレート剤を含む溶液での１つ以上の洗浄、および二蒸留水（１８．２ＭΩｃｍ－１）での１つ以上の洗浄によるストリッピングに供する；
－ あらかじめ５０ｍｌチューブにアリコートしたストリッピング処理を施した開始ビーズ（ＮｉＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅビーズ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－５２６８－０１，３４μｍ既知公称サイズ）の４０ｍｇ／ｍｌ懸濁液を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の濃縮１９ｍＭ硫酸ニッケル溶液の２倍体積（ビーズ体積に関連する）に再懸濁し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌する。
－ 硫酸ニッケル溶液中のビーズ混合物を、室温で、かつ穏やかな軌道回転で２分間インキュベートする。
－ ５０ｍｌチューブを傾斜ローターで２００ｒｃｆで１分間遠心し、ビーズをチューブの底部に集める。
－ 上清を穏やかに吸引し、廃棄し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌したｐＨ７．４でのＰＢＳの３倍体積（ビーズ体積に関して）を、ビーズに加える。
－ ビーズを前述のように再び遠心分離し、上清を吸引し、廃棄する。
－ ビーズへのＰＢＳ付加と除去のステップは、残存硫酸塩またはニッケルイオンの微量を除去するために、さらに２回連続して繰り返される。
－ ｐＨ７．４でＰＢＳの同容積（ビーズ容積に関して）にビーズを再懸濁し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌し、これらのビーズ（以下、ＣＢｅａｄと称する）を４℃で保存する。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0061】
溶出の選択性を評価するために、Ｎｉ２＋との最も強い相互作用を与えることが知られているタグである６Ｘヒスチジンを有する組み換えタンパク質を含むタンパク質濃縮系で、競合試験を行った。ＤＨ５α大腸菌細胞の未加工の抽出物（５００μｇ／ｍｌ）および種々の精製タンパク質（各５０μｇ／ｍｌ、Ｔ７ｐ０７、１０５ｋＤａ、ＨｕＲ、３６ｋＤａ；ＹＴＨ、２３ｋＤａ、図３Ａ）を添加したＵ８７細胞の無血清培地を、Ｅｌｕｔｉｏｎ １Ｘ溶液（３．２ｍＭのＥＤＴＡ、４５μＭのクエン酸ナトリウムおよび６０ｍＭのＮａＣｌ）を基準として保持して、緩衝液溶出勾配に従いＮＢＩに供した。最小量のＨｕＲおよびＹＴＨＤＦ１でＴ７ｐ０７に濃縮された最高分子量（ＭＷ）タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｒｕｂｙ ＳＹＰＲＯ染色および抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット法が示すように、１．５Ｘ Ｅｌｕｔｉｏｎ溶液（４．８ｍＭのＥＤＴＡ、９０ｍＭのＮａＣｌおよび６７．５μＭのＮａＣｉｔｒ）で始まり、次第に溶出した（図３Ｂ）。対照的に、ＥＶの大部分は１Ｘ溶出緩衝液で溶出し、減少した量の化学的剤は溶液中のニッケル汚染なしにＥＶ／Ｎｉ－ビーズ相互作用を置換するのに十分であり、１００ｍＭ超のＥＤＴＡを必要とする事象であることを実証した。特に、ＥＶ形態は種々の溶出緩衝液に従って変化し、１．５Ｘ溶液から始まるそれらのサイズおよび分散に影響した（図３Ｃ）。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0062】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）（２０５００×および８７０００×倍率、図４Ａ）は、ＮＢＩ試料中の低いタンパク質レベルを確認し、１Ｘ溶液がＥＶ形態および広い分散を保持し、動的光散乱（ｎ＝３）によって評価されるように直径５４１±１２０ｎｍおよび０．６１±０．０５の分散指数を示すことを示した。これらのデータは、少数の９×１０６個のＵ８７細胞に起因するＥＶ溶解物中の膜関連タンパク質またはエンドソームタンパク質に対する陽性についてのウェスタンブロット解析と結合し（図４Ｂ）、不均一なＥＶ回収におけるＮＢＩの有効性が確認された。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0068】
赤血球ＣＤ２３５ａマーカーまたは血小板ＣＤ４１ａマーカーを用いた精製した小胞の免疫枯渇は、溶液中のエキソソームまたは微小胞の存在を減少させ（図１４）、ヒト血漿中のＥＶ生理学的存在量を推定する可能性を示した。重要なことには、特定の膜タンパク質に対する陽性を用いて、最初の細胞型に基づいて異なる「ＥＶ線」を順序付けすることができた。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0090】
ＮＢＩによって精製された小胞の免疫枯渇は、それぞれ、抗ＣＤ２３５ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－１００－２７１）および抗ＣＤ４１ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－１０５－６０８）ビオチン化抗体、およびストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１２０５Ｄ）を用いて行った。小胞は、ビーズの沈殿後ｑＮａｎｏで分析し、ビオチン（Ｓｉｇｍａ，Ｂ４５０１）の定量的当量でそれぞれの対照試料中の粒子の数で標準化した。
【外国語明細書】