特開 2023-155889 質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023155889

(43)【公開日】2023-10-23

(54)【発明の名称】質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/531 20060101AFI20231016BHJP

   G01N 33/532 20060101ALI20231016BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20231016BHJP

【ＦＩ】

G01N33/531 A

G01N33/532 Z

G01N33/574 D

【審査請求】有

【請求項の数】2

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023038920

(22)【出願日】2023-03-13

(31)【優先権主張番号】202210375754.X

(32)【優先日】2022-04-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】523092449

【氏名又は名称】ヂェァジィァン プルオッティング ヘルス テクノロジー カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｕｌｕｏｔｉｎｇ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３０２， ３ｒｄ Ｆｌｏｏｒ， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ５， Ｎｏ．２６２２， Ｙｕｈａｎｇｔａｎｇ Ｒｏａｄ， Ｃａｎｇｑｉａｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｙｕｈａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｃｉｔｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ３１００２３ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001841

【氏名又は名称】弁理士法人ＡＴＥＮ

(72)【発明者】

【氏名】リン チォン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ チェンシォン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせを提供する。
【解決手段】本発明は初めてＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体を採用し、且つＣＤ４５抗体を結合して二段階ゲーティングを行い、質量分析フローサイトメーターと組み合わせて、従来のフロー式のＣＤ４５／ＳＳＣの骨髄における成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、有核赤血球亜集団、リンパ球亜集団、原始及び幼若細胞亜集団、異常細胞亜集団等の各亜集団に対する区別を代替することができる。質量分析フロー式が血液腫瘍細胞分析においてＳＳＣを検出できないという技術的難題を克服し、質量分析フロー式のマルチパラメータ・ハイスループットの特性を結合し、現在の血液腫瘍の免疫表現型検査の深さを向上させることができる。
【選択図】図３Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体の組み合わせはＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体であり、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体はそれぞれ金属タグを有し、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体が有する金属タグは異なる、ことを特徴とする質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせ。

【請求項2】

前記金属タグは８９Ｙ、１１５Ｉｎ、１３９Ｌａ、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ、１７６Ｙｂ、１９５Ｐｔ、１９７Ａｕ、１９８Ｐｔ、２０９Ｂｉから選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は質量分析フローサイトメトリーの技術分野に関し、具体的には質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせに関する。

【背景技術】

【0002】

血液腫瘍の精密なタイピングは、治療レジメンの正確な選択の前提条件である。現在、国際的に共通しているのは、細胞形態学、免疫学、細胞遺伝学及び分子生物学のタイピング、すなわちＭＩＣＭタイピングの方法である。免疫学的タイピングのマルチパラメトリックフローサイトメトリーは重要な役割を果たし、当該方法は患者腫瘍細胞の免疫標識に基づき、具体的な疾患タイプの鑑別精度を向上させた。

【0003】

マルチパラメトリックフローサイトメトリーは、骨髄細胞表面上のＣＤ分子、例えば、幹細胞／前駆細胞抗原、骨髄細胞系関連抗原、赤血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、巨核球などの関連抗原を蛍光抗体によって検出する。一般的に使用される抗体の組合せは、三色または四色スキームであり、３種類又は４種類のフルオレセインを用いてそれぞれ抗体を標識する。血液腫瘍型のフロー式解析は、一般的にゲーティングの方式を用いて行い、すなわち段階的に細胞亜集団を深く区別し、例えばＴ細胞において、まずＣＤ３でＴ細胞を区別し、さらにＣＤ４とＣＤ８でＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を区別する。フローサイトメーターの側方散乱光（ＳＳＣ）信号も大きな役割を果たしている。現在、フロー式検出結果の分析には、第一段階のゲーティング戦略はＣＤ４５とＳＳＣをそれぞれ横・縦座標とし、ＣＤ４５陰性の有核赤血球亜集団、ＣＤ４５ｄｉｍＳＳＣ低の原始及び幼若細胞亜集団、ＣＤ４５ｄｉｍＳＳＣ高の成熟顆粒球亜集団、ＣＤ４５＋ＳＳＣ低のリンパ球亜集団、及びＣＤ４５＋ＳＳＣ中レベルの単球亜集団を区別し、さらに異なる抗体により、各亜集団に対して深い分析を行う。

【0004】

血液腫瘍のタイピングを達成するために、３０個以上のＣＤ分子抗体及びいくつかの他のタイピング用抗体を検出することがしばしば必要である。現在臨床で一般的に使用されるフローサイトメーターは４－６色であるため、すなわち一回で一つの細胞における４－６種類のタンパク質を検出することができ、３０個以上の抗体検出を完了するために一本の骨髄を８－１０本のサンプルに分けてそれぞれ染色及び分析する必要がある（一部の抗体は、細胞亜集団を特定するために複数回の反復検出を必要とする）。サンプルの使用量が多く、プロセスが煩雑で、しかも単一細胞に対して３０個の蛋白以上のパラメーターの同時分析を行うことができない。マルチパラメトリックフローサイトメトリーもサンプルバックグラウンド蛍光の干渉、及び異なるフルオレセイン間の発光波長の重なりを受けやすく、フィルタを使用しても、補償調整を行う必要がある。

【0005】

質量分析フローサイトメトリー技術は新型のマルチパラメトリックフローサイトメトリーであり、希土類金属元素などの生体内存在量が非常に低い金属を用いて抗体を標識する。飛行時間型質量分析により、各細胞の金属含有量を正確に検出する。質量分析計の検出特性に起因し、異なる金属信号間の干渉はほとんどなく、補償調整は不要である。単管検出のみで、４３種類の抗体（ＣＤ分子を含む）を同時に単一細胞上で検出することができる。複雑なタイプの細胞タイピングに対して方法論的な利点を有し、現在の４－６色の従来のフロー式の不足を補い、血液腫瘍免疫検出プラットフォームとする潜在力を備えている。

【0006】

従来のフロー式は血液腫瘍を検出する時、ＣＤ４５とＳＳＣを用いてゲーティングを行うことにより、有核赤血球亜集団、原始及び幼若細胞亜集団、単球亜集団、リンパ球亜集団、成熟顆粒球亜集団などを迅速に区別することができる。質量分析フロー式は質量分析の方法論を使用するので、細胞は完全にイオン化されており、したがって、検出の過程で従来のフロー式のＳＳＣを含まない。血液腫瘍に応用する場合、フロー式のような第１段階のゲーティング、すなわちＣＤ４５とＳＳＣの結合ゲーティングを行うことができず、各大細胞亜集団を区別することができず、質量分析フロー式が血液腫瘍分野における臨床応用及び科学研究を制限する。抗体の組み合わせを開発する必要があり、従来のＳＳＣを代替することができ、質量分析フロー式のこの不足をよく補うことができ、そのマルチパラメータ同期検出の優位性をよりよく発揮し、質量分析フロー式を血液腫瘍の免疫表現型検査によりよく応用させる。

【発明の概要】

【0007】

本発明の目的は質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせを提供し、従来技術の不足を解決することである。

【0008】

本発明は以下の技術的解決手段を採用する：
本発明の第一の態様は、質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせを提供する。上記抗体の組み合わせはＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ（ラクトフェリン）抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ（リゾチーム）抗体であり、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体はそれぞれ金属タグを有し、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体が有する金属タグは異なる。

【0009】

さらに、上記金属タグは８９Ｙ、１１５Ｉｎ、１３９Ｌａ、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ、１７６Ｙｂ、１９５Ｐｔ、１９７Ａｕ、１９８Ｐｔ、２０９Ｂｉから選択される。

【0010】

本発明の第二の態様は、質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における上記抗体の組み合わせの応用を提供する。
さらに、以下のステップを含む：
（１）成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体及びＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体によって区別される。
（２）他の細胞亜集団は、原始及び幼若細胞亜集団および／または異常細胞亜集団、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団を含み、さらにＣＤ４５抗体により区別される。
（３）血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体による関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断する。
そのうち、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ抗体、ＣＤ４５抗体、血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体はそれぞれ金属タグを付け、各抗体が付ける金属タグは異なる。

【0011】

さらに、上記金属タグは８９Ｙ、１１５Ｉｎ、１３９Ｌａ、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ、１７６Ｙｂ、１９５Ｐｔ、１９７Ａｕ、１９８Ｐｔ、２０９Ｂｉから選択される。

【0012】

本発明の第三の態様は、質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査のゲーティング方法を提供し、以下のステップを含む：
（１）成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体及びＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体によって区別される。
（２）他の細胞亜集団は、原始及び幼若細胞亜集団および／または異常細胞亜集団、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団を含み、さらにＣＤ４５抗体により区別される。
（３）血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体による関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断する。
そのうち、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ抗体、ＣＤ４５抗体、血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体はそれぞれ金属タグを付け、各抗体が付ける金属タグは異なる。

【0013】

さらに、上記金属タグは８９Ｙ、１１５Ｉｎ、１３９Ｌａ、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ、１７６Ｙｂ、１９５Ｐｔ、１９７Ａｕ、１９８Ｐｔ、２０９Ｂｉから選択される。

【0014】

本発明の第四の態様は、質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査のキットを提供し、４３種類の金属タグ付きのモノクローナル抗体で構成され、具体的には以下の表に示す：

ここで、番号１、３、１２、１４、１７、２３、２６、３４、３８は細胞内抗体であり、その他は細胞外抗体である。

【0015】

本発明の第五の態様は上記キットが質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における応用を提供する。
さらに、以下のステップを含む：
（１）骨髄試料に前処理を行い、骨髄試料中の成熟赤血球を除去する。
（２）質量分析フローサイトメーターにより骨髄試料中の４３個の抗体に対応する抗原の発現存在量を検出する。
（３）骨髄試料における４３個の抗体に対応する抗原の発現存在量に基づき、フローサイトメトリー解析用ソフトウェアを用いて分析し、上記フローサイトメトリー解析用ソフトウェアはＦｌｏｗｊｏ解析用ソフトウェアを含み、具体的には以下のとおりである：
（３．１）成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体及びＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体によって区別される。
（３．２）他の細胞亜集団は、原始及び幼若細胞亜集団および／または異常細胞亜集団、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団を含み、さらにＣＤ４５抗体により区別される。
（３．３）他の抗体による関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断する。

【発明の効果】

【0016】

１、本発明は質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせを提供する。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体で構成される抗体組み合わせを利用して従来のフロー式側方散乱光信号を代替し、質量分析フローサイトメーターにおいて従来のフローサイトメーターのＳＳＣ検出機能を実現した。当該抗体組み合わせはＣＤ４５抗体と結合し、質量分析フロー式を採用する血液腫瘍免疫表現型検査に応用され、従来のフロー式ＳＳＣとＣＤ４５の２次元作図の効果を実現することができる。さらに他の血液腫瘍免疫表現型検査によく用いられる抗体と結合し、血液腫瘍免疫表現型検査をさらに行うことができ、骨髄細胞を大きな集団に分け、且つ異常な亜集団を発見する。
２、本発明は、質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査のゲーティング方法を提供する。まず成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体及びＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体によって区別されており、そして、他の細胞亜集団は、原始及び幼若細胞亜集団および／または異常細胞亜集団、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団を含み、さらにＣＤ４５抗体により区別されており、続いて血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体による関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断し、質量分析フロー式の血液腫瘍に対する免疫表現型検査を実現する。本発明は初めてＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体を採用し、且つＣＤ４５抗体を結合して二段階ゲーティングを行い、質量分析フローサイトメーターと組み合わせて、従来のフロー式のＣＤ４５／ＳＳＣの骨髄における成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、有核赤血球亜集団、リンパ球亜集団、原始及び幼若細胞亜集団、異常細胞亜集団等の各亜集団に対する区別を代替することができる。質量分析フロー式が血液腫瘍細胞分析においてＳＳＣを検出できないという技術的難題を克服し、質量分析フロー式のマルチパラメータ・ハイスループットの特性を結合し、現在の血液腫瘍の免疫表現型検査の深さを向上させることができ、臨床医が従来のフロー式モードで血液腫瘍を分析しやすい。
３、本発明は、質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査のキットを提供し、４３種類の金属タグ付きのモノクローナル抗体で構成される。本発明のキットは質量分析フロー式が血液腫瘍細胞分析においてＳＳＣを検出できないという技術的難題を克服し、質量分析フロー式が血液腫瘍細胞に対する正確なタイピングを実現する。単一の血液腫瘍細胞に同時に４３個のタンパク質マーカーを検出することができ、検出の感度、正確性及び経済性を向上させる。本発明のキットは単管検出をテストすることによって従来のフローサイトメーターが８－１０本を用いて検出することによって実現できる効果を実現できる。血液腫瘍関連免疫表現型分析の範囲及び能力を拡大する。各チャネル単一染色対照を必要とせず、蛍光補償を調整する必要がなく、実験操作ステップ及びサンプル量需要を減少させ、血液腫瘍免疫表現型検査のインテリジェント化及び自動化をさらに実現するために基礎を定める。本発明の試薬キットを利用し、且つ質量分析フローサイトメーターの補助を借り、血液腫瘍細胞の種類・性質を迅速且つ正確に分析し、陽性細胞のレベルを判断することができ、予後予測及び臨床治療手段の作成に重要な指導意義を有する。同時に検査サンプルを節約し、単一細胞に対してより多くのマーカーを同時に検出することができ、血液腫瘍の研究により多くの豊富な資料を提供した。
４、本発明の抗体組み合わせ、ゲーティング方法及びキットを利用し、質量分析フロー式を血液腫瘍免疫表現型検査の標準化、正規化、自動化及びインテリジェント化に応用することに有利である。

【図面の簡単な説明】

【0017】

図１Ａ－１Ｉは、実施例１における健康なヒトの骨髄細胞の免疫表現型検査である。

【図1A】図１Ａは、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ３３と、ＣＤ１１ｂと、ＣＤ１５とを発現する。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団であり、単球マーカーのＣＤ１４と、ＣＤ６４とを発現する。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団である。

【図1B】図１Ｂにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ１３、ＣＤ１１ｂを発現する。

【図1C】図１Ｃにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ１５、ＣＤ３３を発現する。

【図1D】図１Ｄにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団であり、単球マーカーのＣＤ１４と、ＣＤ６４とを発現する。

【図1E】図１Ｅにおいて、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５＋のリンパ球亜集団およびＣＤ４５－の有核赤血球亜集団を得る。

【図1F】図１Ｆにおいて、ＣＤ１９およびＣＤ３を用いてＣＤ４５＋リンパ球を群分け、ＣＤ３＋ＣＤ１９－のＴ細胞、ＣＤ３－ＣＤ１９＋のＢ細胞、およびＣＤ３－ＣＤ１９－のＮＫ細胞を得る。

【図1G】図１Ｇにおいて、ＫａｐｐａおよびＬａｍｂｄａを用いてＣＤ３－ＣＤ１９＋のＢ細胞を群分け、Ｋａｐｐａ＋Ｂ細胞およびＬａｍｂｄａ＋Ｂ細胞を得る。

【図1H】図１Ｈにおいて、ＣＤ４およびＣＤ８を用いてＣＤ３＋ＣＤ１９－のＴ細胞を群分け、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を得る。

【図1I】図１Ｉにおいて、ＣＤ１９およびＣＤ５６を用いてＣＤ３－ＣＤ１９－のＮＫ細胞を群分け、ＣＤ３－ＣＤ１９－ＣＤ５６＋のＮＫ細胞を得る。図２Ａ－２Ｉは、実施例２における急性リンパ芽球性白血病患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。

【図2A】図２Ａは、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団である。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団である。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。

【図2B】図２Ｂにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ３３、ＣＤ１１ｂを発現する。

【図2C】図２Ｃにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ１３、ＣＤ３３を発現する。

【図2D】図２Ｄにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団であり、単球マーカーのＣＤ１４と、ＣＤ６４とを発現する。

【図2E】図２Ｅにおいて、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５弱陽性の異常細胞亜集団、及びＣＤ４５＋のリンパ球亜集団を得る。

【図2F】図２Ｆにおいて、ＣＤ１９およびＣＤ３を用いてＣＤ４５＋リンパ球を群分け、ＣＤ３＋ＣＤ１９－のＴ細胞、ＣＤ３－ＣＤ１９＋のＢ細胞、およびＣＤ３－ＣＤ１９－のＮＫ細胞を得る。

【図2G】図２Ｇにおいて、異常細胞はＣＤ３４およびＣＤ１１７を発現し、原始Ｂ細胞の特徴を持つ。

【図2H】図２Ｈにおいて、異常細胞はＣＤ３４およびＨＬＡ－ＤＲを発現する。

【図2I】図２Ｉにおいて、異常細胞はＣＤ１９を発現する。図３Ａ－３Ｍは、実施例３における急性骨髄性白血病患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。

【図3A】図３Ａは、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団である。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団である。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、有核赤血球亜集団、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。

【図3B】図３Ｂにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ１５、ＣＤ３３を発現する。

【図3C】図３Ｃにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ１３、ＣＤ３３を発現する。

【図3D】図３Ｄにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団であり、単球マーカーのＣＤ１４と、ＣＤ６４とを発現する。

【図3E】図３Ｅにおいて、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５＋のリンパ球亜集団、ＣＤ４５弱陽性の異常細胞亜集団、及びＣＤ４５陰性の有核赤血球亜集団を得る。

【図3F】図３Ｆにおいて、有核赤血球亜集団は、ＣＤ７１およびＣＤ２３５ａｂを発現する。

【図3G】図３Ｇにおいて、ＣＤ１９およびＣＤ３を用いてＣＤ４５＋リンパ球を群分け、ＣＤ３＋ＣＤ１９－のＴ細胞、ＣＤ３－ＣＤ１９＋のＢ細胞、およびＣＤ３－ＣＤ１９－のＮＫ細胞を得る。

【図3H】図３Ｈにおいて、異常細胞はＣＤ３４、ＣＤ１１７を発現する。

【図3I】図３Ｉにおいて、異常細胞はＣＤ３４、ＨＬＡ－ＤＲを発現する。

【図3J】図３Ｊにおいて、異常細胞はＣＤ３３、ＣＤ１３を発現する。

【図3K】図３Ｋにおいて、異常細胞はＣＤ３３を発現し、ＣＤ１４を発現しない。

【図3L】図３Ｌにおいて、異常細胞はＣＤ３３を発現し、ＣＤ１５を発現しない。

【図3M】図３Ｍにおいて、異常細胞はＣＤ３３、ＣＤ１２３を発現する。図４Ａ－４Ｌは、実施例４における骨髄異形成症候群患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。

【図4A】図４Ａは、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団である。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団である。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。

【図4B】図４Ｂにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ１５、ＣＤ３３を発現する。

【図4C】図４Ｃにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ１３、ＣＤ３３を発現する。

【図4D】図４Ｄにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団であり、単球マーカーのＣＤ１４と、ＣＤ６４とを発現する。

【図4E】図４Ｅにおいて、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５＋のリンパ球亜集団、およびＣＤ４５弱陽性の異常細胞亜集団を得る。

【図4F】図４Ｆにおいて、ＣＤ１９およびＣＤ３を用いてＣＤ４５＋リンパ球を群分け、ＣＤ３＋ＣＤ１９－のＴ細胞、ＣＤ３－ＣＤ１９＋のＢ細胞、およびＣＤ３－ＣＤ１９－のＮＫ細胞を得る。

【図4G】図４Ｇにおいて、ＣＤ４およびＣＤ８を用いてＣＤ３＋ＣＤ１９－のＴ細胞を群分け、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を得る。

【図4H】図４Ｈにおいて、異常細胞はＣＤ３４、ＣＤ１１７を発現しない。

【図4I】図４Ｉにおいて、異常細胞はＣＤ１９を発現し、ＣＤ７９ａを発現しない。

【図4J】図４Ｊにおいて、異常細胞はＣＤ３３、ＣＤ１５を発現する。

【図4K】図４Ｋにおいて、異常細胞はＣＤ６４を発現し、ＣＤ１４を発現しない。

【図4L】図４Ｌにおいて、異常細胞はＣＤ１３を発現し、少量のＣＤ１１ｂを発現する。 図５Ａ－５Ｍは、実施例５における多発性骨髄腫患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。

【図5A】図５Ａは、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団である。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団である。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。

【図5B】図５Ｂにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ１５、ＣＤ３３を発現する。

【図5C】図５Ｃにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋およびＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ１３、ＣＤ３３を発現する。

【図5D】図５Ｄにおいて、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団であり、単球マーカーのＣＤ１４と、ＣＤ６４とを発現する。

【図5E】図５Ｅにおいて、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５＋のリンパ球亜集団、及びＣＤ４５陰性の異常細胞亜集団を得る。

【図5F】図５Ｆにおいて、ＣＤ１９およびＣＤ３を用いてＣＤ４５＋リンパ球を群分け、ＣＤ３＋ＣＤ１９－のＴ細胞、ＣＤ３－ＣＤ１９＋のＢ細胞、およびＣＤ３－ＣＤ１９－のＮＫ細胞を得る。

【図5G】図５Ｇにおいて、ＣＤ４およびＣＤ８を用いてＣＤ３＋ＣＤ１９－のＴ細胞を群分け、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を得る。

【図5H】図５Ｈにおいて、異常細胞はＣＤ３８、ＣＤ１３８を発現する。

【図5I】図５Ｉにおいて、異常細胞はＫａｐｐａを発現する。

【図5J】図５Ｊにおいて、異常細胞はＣＤ１９及びＣＤ４５を発現しない。

【図5K】図５Ｋにおいて、異常細胞はＣＤ３３及びＣＤ１１７を発現しない。

【図5L】図５Ｌにおいて、異常細胞はＣＤ４５及びＣＤ５６を発現しない。

【図5M】図５Ｍにおいて、異常細胞はＣＤ１３を発現せず、少量の異常細胞はＣＤ２０を発現する。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下では、実施例および添付図面に関連して、本発明をさらに説明する。以下の実施例は、本発明を説明するためにのみ使用されるが、本発明の実施の範囲を限定するために使用されるものではない。

【0019】

以下の実施例に係る抗体を表１に示す：
表１

ここで、番号１、３、１２、１４、１７、２３、２６、３４、３８のｃＣＤ３、ｃＩｇＭ、ＭＰＯ、Ｌａｍｂｄａ、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ、Ｋａｐｐａ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、ＣＤ７９ａ、ＴｄＴ抗体は細胞内抗体であり、他は細胞外抗体である。

【0020】

実施例１
健康なヒトの骨髄細胞の免疫表現型検査である。
１）、健康なヒトの新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
２）、１－３×１０＾６個の細胞を取り、ＰＢＳで再懸濁し、体積を１ｍＬに調節し、５０μｌ－１ｍＬの１９４Ｐｔ（０．１－１μＭ）を加え、室温で２分間染色し、細胞の死活を区別する。
３）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、５０μＬのブロッキング液を加え、氷上で２０分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、０．５μＬのヒト免疫グロブリン溶液（ヒト免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのマウス免疫グロブリン溶液（マウス免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのラット免疫グロブリン溶液（ラット免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのハムスター免疫グロブリン溶液（ハムスター免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、及び４８μＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）からなる。
４）、５０μＬの細胞外抗体混合液（表１において３４種類の細胞外抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）３３μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間染色する。
５）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を添加し、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、０．５ｖ／ｖ‰の単細胞指示薬１９１／１９３Ｉｒを含む固定－破膜溶液１ｍｌを添加し、細胞を再懸濁し、４℃で一晩放置する。
６）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に５０μＬの固定－破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に５０μＬの細胞内抗体混合液（表１において９種類の細胞内抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）４５．５μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間放置する。
７）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
８）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
９）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１０）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１１）、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図１Ａに示すように、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団であり、成熟顆粒球マーカーのＣＤ３３と、ＣＤ１１ｂと、ＣＤ１５とを発現する（図１Ｂ、図１Ｃ）。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団であり、単球マーカーのＣＤ１４と、ＣＤ６４とを発現する（図１Ｄ）。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団である。図１Ｅに示すように、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍeが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５＋のリンパ球亜集団およびＣＤ４５－の有核赤血球亜集団を得る。図１Ｆに示すように、ＣＤ１９およびＣＤ３を用いてＣＤ４５＋リンパ球を群分け、ＣＤ３＋ＣＤ１９－のＴ細胞（図１Ｈ）、ＣＤ３－ＣＤ１９＋のＢ細胞（図１Ｇ）、およびＣＤ３－ＣＤ１９－のＮＫ細胞（図１Ｉ）を得る。

【0021】

実施例２
急性リンパ芽球性白血病患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。
１）、急性リンパ芽球性白血病患者の新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
２）、１－３×１０＾６個の細胞を取り、ＰＢＳで再懸濁し、体積を１ｍＬに調節し、５０μｌ－１ｍＬの１９４Ｐｔ（０．１－１μＭ）を加え、室温で２分間染色し、細胞の死活を区別する。
３）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、５０μＬのブロッキング液を加え、氷上で２０分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、０．５μＬのヒト免疫グロブリン溶液（ヒト免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのマウス免疫グロブリン溶液（マウス免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのラット免疫グロブリン溶液（ラット免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのハムスター免疫グロブリン溶液（ハムスター免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、及び４８μＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）からなる。
４）、５０μＬの細胞外抗体混合液（表１において３４種類の細胞外抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）３３μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間染色する。
５）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を添加し、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、０．５ｖ／ｖ‰の単細胞指示薬１９１／１９３Ｉｒを含む固定－破膜溶液１ｍｌを添加し、細胞を再懸濁し、４℃で一晩放置する。
６）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に５０μＬの固定－破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に５０μＬの細胞内抗体混合液（表１において９種類の細胞内抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）４５．５μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間放置する。
７）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
８）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
９）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１０）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１１）、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図２Ａに示すように、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団（図２Ｂ、図２Ｃ）である。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団（図２Ｄ）である。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。図２Ｅに示すように、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５＋のリンパ球亜集団（図２Ｆ）およびＣＤ４５弱陽性の異常細胞亜集団を得る。当該異常細胞はＣＤ３４と、ＣＤ１１７と、ＨＬＡ－ＤＲと、ＣＤ１９とを発現する（図２Ｇ、図２Ｈ、図２Ｉ）。

【0022】

実施例３
急性骨髄性白血病患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。
１）、急性骨髄性白血病患者の新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
２）、１－３×１０＾６個の細胞を取り、ＰＢＳで再懸濁し、体積を１ｍＬに調節し、５０μｌ－１ｍＬの１９４Ｐｔ（０．１－１μＭ）を加え、室温で２分間染色し、細胞の死活を区別する。
３）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、５０μＬのブロッキング液を加え、氷上で２０分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、０．５μＬのヒト免疫グロブリン溶液（ヒト免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのマウス免疫グロブリン溶液（マウス免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのラット免疫グロブリン溶液（ラット免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのハムスター免疫グロブリン溶液（ハムスター免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、及び４８μＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）からなる。
４）、５０μＬの細胞外抗体混合液（表１において３４種類の細胞外抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）３３μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間染色する。
５）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を添加し、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、０．５ｖ／ｖ‰の単細胞指示薬１９１／１９３Ｉｒを含む固定－破膜溶液１ｍｌを添加し、細胞を再懸濁し、４℃で一晩放置する。
６）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に５０μＬの固定－破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に５０μＬの細胞内抗体混合液（表１において９種類の細胞内抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）４５．５μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間放置する。
７）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
８）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
９）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１０）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１１）、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図３Ａに示すように、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団（図３Ｂ、図３Ｃ）である。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団（図３Ｄ）である。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、有核赤血球亜集団、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。図３Ｅに示すように、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５＋のリンパ球亜集団（図３Ｇ）、ＣＤ４５弱陽性の異常細胞亜集団、及びＣＤ４５陰性の有核赤血球亜集団（図３Ｆ）を得る。当該異常細胞はＣＤ３４と、ＣＤ１１７と、ＨＬＡ－ＤＲと、ＣＤ３３と、ＣＤ１３と、ＣＤ１２３とを発現する。（図３Ｈ、図３Ｉ、図３Ｊ、図３Ｋ、図３Ｌ、図３Ｍ）

【0023】

実施例４
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。
１）、骨髄異形成症候群患者の新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
２）、１－３×１０＾６個の細胞を取り、ＰＢＳで再懸濁し、体積を１ｍＬに調節し、５０μｌ－１ｍＬの１９４Ｐｔ（０．１－１μＭ）を加え、室温で２分間染色し、細胞の死活を区別する。
３）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、５０μＬのブロッキング液を加え、氷上で２０分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、０．５μＬのヒト免疫グロブリン溶液（ヒト免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのマウス免疫グロブリン溶液（マウス免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのラット免疫グロブリン溶液（ラット免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのハムスター免疫グロブリン溶液（ハムスター免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、及び４８μＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）からなる。
４）、５０μＬの細胞外抗体混合液（表１において３４種類の細胞外抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）３３μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間染色する。
５）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を添加し、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、０．５ｖ／ｖ‰の単細胞指示薬１９１／１９３Ｉｒを含む固定－破膜溶液１ｍｌを添加し、細胞を再懸濁し、４℃で一晩放置する。
６）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に５０μＬの固定－破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に５０μＬの細胞内抗体混合液（表１において９種類の細胞内抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）４５．５μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間放置する。
７）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
８）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
９）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１０）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１１）、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図４Ａに示すように、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団（図４Ｂ、図４Ｃ）である。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団（図４Ｄ）である。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。図４Ｅに示すように、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５＋のリンパ球亜集団（図４Ｆ、図４Ｇ）、及びＣＤ４５弱陽性の異常細胞亜集団を得る。当該異常細胞はＣＤ３３と、ＣＤ１５と、ＣＤ１３と、ＣＤ１１ｂと、ＣＤ１９と、ＣＤ６４とを発現する（図４Ｈ、図４Ｉ、図４Ｊ、図４Ｋ、図４Ｌ）。

【0024】

実施例５
多発性骨髄腫患者の骨髄細胞の免疫表現型検査である。
１）、多発性骨髄腫患者の新鮮な骨髄を準備し、成熟赤血球を除去する。
２）、１－３×１０＾６個の細胞を取り、ＰＢＳで再懸濁し、体積を１ｍＬに調節し、５０μｌ－１ｍＬの１９４Ｐｔ（０．１－１μＭ）を加え、室温で２分間染色し、細胞の死活を区別する。
３）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、５０μＬのブロッキング液を加え、氷上で２０分間ブロッキングする。そのうち、ブロッキング溶液は、０．５μＬのヒト免疫グロブリン溶液（ヒト免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのマウス免疫グロブリン溶液（マウス免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのラット免疫グロブリン溶液（ラット免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、０．５μＬのハムスター免疫グロブリン溶液（ハムスター免疫グロブリン１５～２５質量部、アジ化ナトリウム０．１５～０．２５質量部、リン酸緩衝液０．７５～１．２５容量部を含む）、及び４８μＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）からなる。
４）、５０μＬの細胞外抗体混合液（表１において３４種類の細胞外抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）３３μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間染色する。
５）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を添加し、５００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去し、０．５ｖ／ｖ‰の単細胞指示薬１９１／１９３Ｉｒを含む固定－破膜溶液１ｍｌを添加し、細胞を再懸濁し、４℃で一晩放置する。
６）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。対照群に５０μＬの固定－破膜溶液を加えてブランク対照とし、実験群に５０μＬの細胞内抗体混合液（表１において９種類の細胞内抗体はそれぞれ０．５μｌ、各抗体濃度は０．１－１μｇ／μＬ、及びウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）４５．５μｌ）を加え、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間放置する。
７）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
８）、２ｍＬのウシ血清アルブミン溶液（ウシ血清アルブミン３７５～６２５質量部、アジ化ナトリウム１５～２５質量部、リン酸緩衝液７５～１２５容量部を含む）を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
９）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１０）、２ｍＬの脱イオン水を加え、８００ｇ／５分間で遠心分離し、上清を吸引除去する。
１１）、サンプルを濾過し、細胞を計数し、体積を調整し、オンマシンに準備し、質量分析フロー式検出を行う。
分析結果は図５Ａに示すように、ｌｙｓｏｚｙｍｅとＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎを用いて作図し、当該骨髄サンプルは三群に分けられ、そのうちｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ＋とＬｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は成熟顆粒球亜集団（図５Ｂ、図５Ｃ）である。Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎは中程度の強度であり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ＋の細胞集団は単球亜集団（図５Ｄ）である。ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅの低発現細胞集団は、異常細胞亜集団およびリンパ球亜集団である。図５Ｅに示すように、ＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎおよびＬｙｓｏｚｙｍｅが低発現する細胞集団にＣＤ４５を用いて次の段階のゲーティングを行い、ＣＤ４５＋のリンパ球亜集団（図５Ｆ、図５Ｇ）、及びＣＤ４５陰性の異常細胞亜集団を得る。当該異常細胞は、ＣＤ３８と、ＣＤ１３８と、Ｋａｐｐａと、ＣＤ２０とを発現する。一方、ＣＤ５６、ＣＤ４５は陰性である（図５Ｈ、図５Ｉ、図５Ｊ、図５Ｋ、図５Ｌ、図５Ｍ）。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図3K】

【図3L】

【図3M】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図5J】

【図5K】

【図5L】

【図5M】

【手続補正書】

【提出日】2023-07-25

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体の組み合わせはＬａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体であり、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体はそれぞれ金属タグを有し、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体とＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体が有する金属タグは異なり、
質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における前記抗体の組み合わせの応用は、以下のステップを含み、
（１）成熟顆粒球亜集団、単球亜集団、及び他の細胞亜集団は、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体及びＬｙｓｏｚｙｍｅ抗体によって区別され、
（２）他の細胞亜集団は、原始及び幼若細胞亜集団および／または異常細胞亜集団、有核赤血球亜集団およびリンパ球亜集団を含み、さらにＣＤ４５抗体により区別され、
（３）血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体による関連亜集団の抗原発現を分析し、関連亜集団の抗原に異常発現が存在するかどうかを判断し、
そのうち、Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ抗体、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ抗体、ＣＤ４５抗体、血液腫瘍免疫表現型検査に一般的に使用される他の抗体はそれぞれ金属タグを付け、各抗体が付ける金属タグは異なる、ことを特徴とする質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせ。

【請求項2】

前記金属タグは８９Ｙ、１１５Ｉｎ、１３９Ｌａ、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ、１７６Ｙｂ、１９５Ｐｔ、１９７Ａｕ、１９８Ｐｔ、２０９Ｂｉから選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の質量分析フロー式血液腫瘍の免疫表現型検査における側方散乱光信号を代替する抗体組み合わせ。