▶ 花王株式会社の特許一覧 ▶ 株式会社Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023156196
(43)【公開日】2023-10-24
(54)【発明の名称】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231017BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20231017BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231017BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231017BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20231017BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/10 ZNA
A61K39/395 N
A61P31/14
G01N33/569 L
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022065933
(22)【出願日】2022-04-12
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】516255448
【氏名又は名称】株式会社Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】松村 佑太
(72)【発明者】
【氏名】稲浦 峻亮
(72)【発明者】
【氏名】西口 大貴
(72)【発明者】
【氏名】熊地 重文
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体及びその利用法を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる、ＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は変異株のＮタンパク質に対しても普遍的に結合することができることから、当該抗体を用いることにより、変異株を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出、すなわちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の迅速な検出が可能となる。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる、ＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は変異株のＮタンパク質に対しても普遍的に結合することができることから、当該抗体を用いることにより、変異株を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出、すなわちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の迅速な検出が可能となる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【請求項2】
Ｎ－タンパク質に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項3】
ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項4】
ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項5】
ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である請求項３記載の抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項記載の抗体をコードする核酸。
【請求項7】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項記載の抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項記載の抗体を含有する医薬。
【請求項10】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための請求項９記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２，；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）やＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同様ベータコロナウイルス属に属し、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行（パンデミック）を引き起こしている。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度で、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。また、ウイルス粒子（ビリオン）は、５０～２００ｎｍほどの大きさである。一般的なコロナウイルスと同様に、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質として知られる４つのタンパク質と、ＲＮＡより構成されている。このうちヌクレオカプシドタンパク質がＲＮＡと結合してヌクレオカプシドを形成し、脂質と結合したスパイクタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する（非特許文献２、３）。
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質（以下、Ｎタンパク質）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムに結合するタンパク質である。ウイルスゲノムのフォールディング・ウイルスタンパク質のアセンブリ・ウイルスの出芽といったウイルス粒子形成に関与するほか、宿主細胞の応答を抑制する機能があることが報告されている（非特許文献４）。
【0005】
ＣＯＶＩＤ－１９のウイルス学的診断には主に遺伝子増幅法（ＰＣＲ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子検出が行われている。ＰＣＲ検査は、現時点で使えるウイルス検査の中では最も高感度に検出することができるとされている。また、その他の検出法として、ウイルス表面のタンパク質（例えば、スパイクタンパク質など）の断片を検出する抗原検査も存在する。抗原検査としては、イムノクロマト法やＥＬＩＳＡ法を原理とした検出キットが既に市販されており、一般的にＰＣＲ検査よりも検出感度は劣るものの、所要時間の短さや簡便性の点において優れている。
【0006】
ウイルス検査においては、偽陽性および偽陰性の無い検査法が求められる。偽陽性に関しては標的分子に対しての高い特異性をもつ測定原理であることが重要であり、また、偽陰性に関しては検査法の検出感度が重要となる。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者由来の体液（唾液や咽頭粘液など）や下水中にも、低濃度ながらウイルス構造体の一部が存在しており、これらのウイルスを検出するためには、既存のＰＣＲ検査および抗原検査の方法では充分ではない場合もある。そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＣＲ検査および抗原検査が既に汎用技術となっている一方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をより特異的かつ高感度に検出するための技術開発が強く求められている。
【0007】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、そのウイルスを構成するタンパク質の中で最も数の多いタンパク質の一つであることが報告されている（非特許文献４）。Ｎタンパク質の数は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面に露出しているスパイクタンパク質よりも遥かに多いため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原検査では、特に検出感度の点において、標的分子として好ましいタンパク質である。さらに、Ｎタンパク質はヌクレオカプシドとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムと結合した状態で存在する。そのため、例えばＮタンパク質を標的とし、選択的かつ強力に結合することができる抗体を開発し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質－ＲＮＡゲノム複合体を濃縮すること出来れば、ＰＣＲ検査においても、より高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能になる。また、同様にＮタンパク質を濃縮する工程を抗原検査と組み合わせることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原検査の高感度化も可能となる。
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、感染細胞内で主に発現するタンパク質の一つであり、強い免疫原性を示す。２００２年１１月より流行したＳＡＲＳ－ＣｏＶのＮタンパク質に対するＥＬＩＳＡ法では、高い特異性で感染初期と見られる患者も診断できたことが報告されている（非特許文献５）。
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質は、感染細胞内で主に発現するタンパク質の一つであり、強い免疫原性を示す。２００２年１１月より流行したＳＡＲＳ－ＣｏＶのＮタンパク質に対するＥＬＩＳＡ法では、高い特異性で感染初期と見られる患者も診断できたことが報告されている（非特許文献５）。
【0008】
通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）は重鎖と軽鎖の２つの可変領域で抗原と結合するが、ラクダ科動物の血清中から見いだされた重鎖抗体は１つの可変領域のみで結合活性と抗原特異性を示す。この抗体の可変領域はＶＨＨ(Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ) と呼ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量（通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）の１０分の１程度）とされる（非特許文献６）。ＶＨＨ抗体の機能面における特徴として、１）通常の抗体同等以上の結合活性を有すること、２）通常の抗体ではアクセスできない部分に入り込めること、３）生理的構造の形成と再生の容易性が高いこと、４）一本鎖のペプチドであるため、非常にシンプルな構造をもつことが挙げられる。特に３）の理由からＶＨＨ抗体は熱や圧に対する安定性が非常に高く、また従来は困難であった機能的な抗体の原核生物（大腸菌、枯草菌、コリネ菌など）での大量生産が可能である。また４）の理由より、タンパク質工学や化学修飾による機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製しやすいという特徴を有する。
【0009】
このように、ＶＨＨ抗体は通常の抗体（ＩｇＧ抗体など）と比較して性状面、生産面において多くの利点を有している。そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を標的とするＶＨＨ抗体を用いた検出技術は、従来のＩｇＧ抗体を用いた技術よりも性能面、価格面において有利に提供できると期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020 Mar;579(7798):270-273.
【非特許文献2】A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020 Mar;579(7798):265-269.
【非特許文献3】The Coronavirus Nucleocapsid Is a Multifunctional Protein. Viruses. Volume 6、Issue 8、August 2014、Pages 2991-3018.
【非特許文献4】The SARS-CoV nucleocapsid protein: A protein with multifarious activities. Infection, Genetics and Evolution. Volume 8、July 2008、Pages 397-405.
【非特許文献5】Diagnosis of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) by Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Antibodies in an Antigen-Capturing Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Clinical Microbiology. Volume 41、No. 12、December 2003、Pages 5781-5782.
【非特許文献6】The Therapeutic Potential of Nanobodies. BioDrugs. Volume 34、November 2019、Pages 11-26.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体及びその利用法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合するＶＨＨ抗体を得るべく検討した結果、特定のアミノ酸数を有するＣＤＲ１～３をコンストラクトに含むＶＨＨ抗体ライブラリーから、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対して反応性の高いクローンを得ることに成功した。
【0013】
すなわち、本発明は以下の１）～５）に係るものである。
１）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
２）１）の抗体をコードする核酸。
３）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
４）１）の抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
５）１）の抗体を含有する医薬。
１）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
２）１）の抗体をコードする核酸。
３）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
４）１）の抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
５）１）の抗体を含有する医薬。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、反応性の高い抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗体を提供することができる。本発明の抗体は変異株のＮタンパク質に対しても普遍的に結合することができることから、当該抗体を用いることにより、変異株を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出、すなわちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の迅速な検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】スクリーニングにより得られたＥＮ２、ＥＮ３及びＥＮ４のアミノ酸配列と各ＣＤＲ変異体のアミノ酸配列のアライメント図。背景が灰色に示されたアミノ酸が変異したアミノ酸を示す。
【図2】スクリーニングにより取得されたＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１及びＥＮ１２のアミノ酸配列と各ＣＤＲ変異体のアミノ酸配列のアライメント図。背景が灰色に示されたアミノ酸が変異したアミノ酸を示す。
【図3】ＳＤＳ―ＰＡＧＥによるＨｉｓタグ付きＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１及びＥＮ１２の検出。
【図4】ＥＬＩＳＡ法によるＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１及びＥＮ１２のコロナウイルスのＮタンパク質に対する結合特異性評価。
【図5】ＥＬＩＳＡ法によるＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１及びＥＮ１２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株コロナウイルスのＮタンパク質に対する結合特異性評価。
【図6】ＥＬＩＳＡ法によるＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１及びＥＮ１２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株コロナウイルスのＮタンパク質に対する結合特異性評価。
【図7】ＥＬＩＳＡ法によるＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１及びＥＮ１２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株コロナウイルスのＮタンパク質に対する結合特異性評価。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する）は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲ１～３を含む構造ドメインを１つ以上有する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
【0017】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となる、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスであり、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体であるが、詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合する抗体である。
【0018】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有する。ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；相補性決定領域）とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域とも云われる。本発明の抗体の構造ドメインにおいて、３つのＣＤＲは、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順で存在する。
【0019】
なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能は、当業者に公知の方法により評価できる。具体的には、後述する実施例に示すように、表面プラズモン共鳴法により、平衡乖離定数ＫＤを求めることにより評価できる。また、例えばＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、バイオレイヤー干渉法等を用いた方法によっても評価できる。
【0020】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の両端にフレームワーク領域を有するものであってもよい。フレームワーク領域とは、抗体分子の可変領域において相補性決定領域を除く領域であり、保存性の高い領域を指す。
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
ＦＲ１：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＱＫＬＳＣＴＴＳ（配列番号１９）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２０）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＴＡＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳ（配列番号２２）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＴＣＶＡＳ（配列番号２４）
ＦＲ２：
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号２５）
ＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号２６）
ＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡ（配列番号２７）
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＡＶＳ（配列番号２８）
ＦＲ３：
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＲＨ（配列番号２９）、
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＳＴＶＹＬＱＭＮＮＬＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＧ（配列番号３０）、
ＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＳＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡ（配列番号３１）、
ＹＤＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＡ（配列番号３２）、
ＹＧＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＩＡ（配列番号３３）、
ＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＨＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＡ（配列番号３４）
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＨＩＳＲＤＫＴＫＮＴＶＤＬＦＩＲＳＬＫＰＥＤＳＧＶＹＹＣＲＡ（配列番号３５）
ＦＲ４：
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３６）
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＴＳ（配列番号３７）
ＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３８）
ＷＧＰＧＴＱＶＴＶＳＥ（配列番号３９）
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
ＦＲ１：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＱＫＬＳＣＴＴＳ（配列番号１９）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２０）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＴＡＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳ（配列番号２２）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号２３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＴＣＶＡＳ（配列番号２４）
ＦＲ２：
ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ（配列番号２５）
ＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号２６）
ＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡ（配列番号２７）
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＡＶＳ（配列番号２８）
ＦＲ３：
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＲＨ（配列番号２９）、
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＳＴＶＹＬＱＭＮＮＬＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＧ（配列番号３０）、
ＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＳＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡ（配列番号３１）、
ＹＤＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＡ（配列番号３２）、
ＹＧＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＩＡ（配列番号３３）、
ＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＨＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＡ（配列番号３４）
ＹＡＤＳＶＫＧＲＦＨＩＳＲＤＫＴＫＮＴＶＤＬＦＩＲＳＬＫＰＥＤＳＧＶＹＹＣＲＡ（配列番号３５）
ＦＲ４：
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３６）
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＴＳ（配列番号３７）
ＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号３８）
ＷＧＰＧＴＱＶＴＶＳＥ（配列番号３９）
【0021】
配列番号１９～３９で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域としては、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域が挙げられる。
【0022】
ここで、アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。配列の同一性は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを用いて解析を行なうことにより算出できる。
【0023】
本発明の抗体のうち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４０）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３７で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４１）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３８で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４２）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２２）で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４３）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４４）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号１６で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１８で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４５）を有する抗体、及びＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３がＳＧＴで示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３９で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４６）を有する抗体は、それぞれ、後述する実施例において、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローン（配列番号４０がＥＮ２、配列番号４１がＥＮ３、配列番号４２がＥＮ４、配列番号４３がＥＮ５、配列番号４４がＥＮ６、配列番号４５がＥＮ１１、配列番号４６がＥＮ１２である。）であり、好適な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
【0024】
本発明の抗体は、上記の構造ドメインを少なくとも１つ有するものであればその形態は限定されず、ＶＨＨ抗体のようなシングルドメイン抗体（ナノボディーとも呼ばれる）の他、一本鎖抗体、重鎖抗体、可変領域断片をペプチドリンカーなどで結合させた多量体、例えば二量体、更には、可変領域断片と抗原特異性の異なる可変領域断片の１または複数を連結した多量体であってもよい。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
【0025】
本発明の抗体の作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、本発明の抗体をコードする核酸をコドン最適化などの工程を経ることにより宿主細胞における目的の抗体の発現に最適化された人工遺伝子を設計し、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換え抗体として産生させる方法が好ましい。
【0026】
組換え抗体として産生において使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、カビ、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞等が挙げられる。 抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の大腸菌と枯草菌で共用することができるシャトルベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
【0027】
発現させた本発明の抗体を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的の抗体を取得することができる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【0028】
本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合することから、これを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有するか、または含有する可能性のある被験試料と接触させることによって、当該試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を含む抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
【0029】
被験試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液，咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、ウイルスが付着している可能性のある固体表面、例えばドアノブ、便器等から採取された試料が挙げられる。被験試料は、Ｎタンパク質への結合の点から、被験試料中のウイルスを界面活性剤等を含む溶液で溶解し、当該溶液中で抗体と結合させるのが好ましい。抗体は固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
【0030】
また、本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用キットの構成成分となり得る。当該キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の診断薬として、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬の開発用のツールとして使用可能である。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識するＮタンパク質抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば本発明の抗体を認識する抗体又は本発明の抗体とは異なるエピトープを認識するＮタンパク質抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
【0031】
また、本発明の抗体は、細胞膜透過性ペプチドを導入する等して細胞内に移行させることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に結合し、細胞内でのウイルスの複製を阻害することが考えられる。したがって、本発明の抗体は、哺乳動物に投与し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療するための医薬として利用することも可能である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等が挙げられるが、ヒトが好ましい。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
【0032】
斯かる医薬において、その組成物中における本発明の抗体の含有量は適宜調整できる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
【0033】
本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
＜１＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜２＞Ｎ－タンパク質に結合する、＜１＞の抗体。
＜３＞ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、＜１＞又は＜２＞の抗体。
＜４＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である＜３＞の抗体。
＜５＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを２つ連結した二量体である＜３＞の抗体。
＜６＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である＜３＞の抗体。
＜１＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜２＞Ｎ－タンパク質に結合する、＜１＞の抗体。
＜３＞ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、＜１＞又は＜２＞の抗体。
＜４＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である＜３＞の抗体。
＜５＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを２つ連結した二量体である＜３＞の抗体。
＜６＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である＜３＞の抗体。
【0034】
＜７＞構造ドメインが、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものである、＜１＞～＜９＞のいずれかの抗体。
＜８＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜７＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号１９、２０、２１、２２、２３又は２４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号２５、２６、２７又は２８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号３６、３７、３８又は３９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜９＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４０）を有する、＜７＞の抗体。
＜１０＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３７で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４１）を有する、＜７＞の抗体。
＜１１＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３８で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４２）を有する、＜７＞の抗体。
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４３）を有する、＜７＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４４）を有する、＜７＞の抗体。
＜１４＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１６で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１８で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４５）を有する、＜７＞の抗体。
＜１５＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３がＳＧＴで示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３９で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４６）を有する、＜７＞の抗体。
＜１６＞＜１＞の抗体をコードする核酸。
＜１７＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜１８＞＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
＜１９＞＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有する医薬。
＜２０＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有する医薬。
＜８＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜７＞の抗体。
ＦＲ１：配列番号１９、２０、２１、２２、２３又は２４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号２５、２６、２７又は２８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号３６、３７、３８又は３９で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜９＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号２９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４０）を有する、＜７＞の抗体。
＜１０＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３０で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３７で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４１）を有する、＜７＞の抗体。
＜１１＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２７で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３１で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３８で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４２）を有する、＜７＞の抗体。
＜１２＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３２で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４３）を有する、＜７＞の抗体。
＜１３＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２８で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３３で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４４）を有する、＜７＞の抗体。
＜１４＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１６で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１７で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号１８で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３６で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４５）を有する、＜７＞の抗体。
＜１５＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３がＳＧＴで示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号３５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号３９で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号４６）を有する、＜７＞の抗体。
＜１６＞＜１＞の抗体をコードする核酸。
＜１７＞以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）で示されるＣＤＲを含む構造ドメインを１つ以上有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
（ａ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＰＷＧＹ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｂ）ＧＦＴＦＳＨＹＦＭＨ（配列番号４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＴＩＧＳＳＳＴＦ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＴＬＱＹＹＴＧＬＨＬＮＩＶＧＴ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｃ）ＲＳＩＳＲＦＮＶＷＡ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＳＩＴＫＳＧＤＴＮ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＡＶＦＲＧＩＴＬＹＴＹ（配列番号９）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｄ）ＧＲＡＦＳＳＹＭＭＧ（配列番号１０）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＧＷＳＴＹ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＮＨＲＦＴＧＲＶＹ（配列番号１２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｅ）ＧＦＴＦＳＶＹＷＭＦ（配列番号１３）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＶＩＮＰＤＧＳＳＴＨ（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＧＩＳＳＴＭＤＭＤＰＷＩＳＬＨＹ（配列番号１５）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｆ）ＡＲＴＩＨＲＩＥＭＧ（配列番号１６）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＧＩＲＷＮＮＶＳＴＹ（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＬＡＬＳＳＤＲＬＧＬＹＡＹ（配列番号１８）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
（ｇ）ＧＬＴＦＲＴＹＴＭＧ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＩＴＰＳＧＧＮＴＡ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びＳＧＴで示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３
＜１８＞＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
＜１９＞＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有する医薬。
＜２０＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための＜１＞～＜１５＞のいずれかの抗体を含有する医薬。
【実施例0035】
（実施例１）ＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイ調整用のｃＤＮＡ作製
完全長アルパカ由来抗体の可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＶＨＨ）コード化ＤＮＡライブラリの作製
ＲｅＰＨＡＧＥＮ社より提供されている２種類のアルパカ由来ナイーブＶＨＨライブラリ遺伝子であるＳヒンジ及びＬヒンジを鋳型として、ＳヒンジＶＨＨ特異的プライマーペア（配列番号４７、４８）及びＬヒンジＶＨＨ特異的プライマーペア（配列番号４７、４９）にてＰＣＲで増幅した後、Ｔ７プロモーター、オメガ（ω）エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ＶＨＨ遺伝子、Ｈｉｓタグ、およびリンカーハイブリダイゼーション領域（Ｙタグ）からなるＤＮＡ断片へと調整するため、オーバーラップＰＣＲ用プライマー（配列番号５０、５１）を用いて伸長ＰＣＲを行って伸長させ、全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリーを作製した。
完全長アルパカ由来抗体の可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＶＨＨ）コード化ＤＮＡライブラリの作製
ＲｅＰＨＡＧＥＮ社より提供されている２種類のアルパカ由来ナイーブＶＨＨライブラリ遺伝子であるＳヒンジ及びＬヒンジを鋳型として、ＳヒンジＶＨＨ特異的プライマーペア（配列番号４７、４８）及びＬヒンジＶＨＨ特異的プライマーペア（配列番号４７、４９）にてＰＣＲで増幅した後、Ｔ７プロモーター、オメガ（ω）エンハンサー、コザックコンセンサス配列、ＶＨＨ遺伝子、Ｈｉｓタグ、およびリンカーハイブリダイゼーション領域（Ｙタグ）からなるＤＮＡ断片へと調整するため、オーバーラップＰＣＲ用プライマー（配列番号５０、５１）を用いて伸長ＰＣＲを行って伸長させ、全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリーを作製した。
【0036】
（実施例２）ｃＤＮＡディスプレイの作製
それぞれのｃＤＮＡディスプレイを以下の（１）～（５）の手順に従い、調製した。使用するバッファーは表１に記載した。
それぞれのｃＤＮＡディスプレイを以下の（１）～（５）の手順に従い、調製した。使用するバッファーは表１に記載した。
【0037】
【表1】
【0038】
（１）転写
実施例１で作製した全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリーを、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って転写した。使用したＤＮＡ量は６．６μｇとした。その後のセレクション毎のＤＮＡ量は、２ｎｄラウンド以降は０．１～１μｇとした。得られた転写産物は、ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。精製産物はＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）により濃度定量した。
実施例１で作製した全長ＶＨＨコード化ＤＮＡライブラリーを、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って転写した。使用したＤＮＡ量は６．６μｇとした。その後のセレクション毎のＤＮＡ量は、２ｎｄラウンド以降は０．１～１μｇとした。得られた転写産物は、ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。精製産物はＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）により濃度定量した。
【0039】
（２）ライゲーション
精製した２０ｐｍｏｌ ｍＲＮＡ及び２０ｐｍｏｌ ピューロマイシン・リンカーであるｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ リンカー（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）に、ＮａＣｌ（終濃度 ０．２Ｍ）及びＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、終濃度 ０．０５Ｍ）を加え、９０℃で１分間インキュベートした。その後、０．１℃／秒の速度で７０℃まで降温させ、７０℃で１分間インキュベートした。次いで、０．１℃／秒の速度で２５℃まで降温させ、２℃／秒の速度で１０℃まで降温させ、ｃｎｖＫリンカーをｍＲＮＡの３'末端側にハイブリダイズさせた。
その後、ＵＶＰ ＣｒｏｓｓＬｉｎｋｅｒ（ＣＬ―３０００），３６５ｎｍ，１００―１１５Ｖ （Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ）を使用して、３６５ｎｍのＵＶを４０６０ ｍＪ／ｃｍ２照射し、ｃｎｖＫリンカーとｍＲＮＡを光架橋させ、ｍＲＮＡ－リンカー複合体を得た。
精製した２０ｐｍｏｌ ｍＲＮＡ及び２０ｐｍｏｌ ピューロマイシン・リンカーであるｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ リンカー（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）に、ＮａＣｌ（終濃度 ０．２Ｍ）及びＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、終濃度 ０．０５Ｍ）を加え、９０℃で１分間インキュベートした。その後、０．１℃／秒の速度で７０℃まで降温させ、７０℃で１分間インキュベートした。次いで、０．１℃／秒の速度で２５℃まで降温させ、２℃／秒の速度で１０℃まで降温させ、ｃｎｖＫリンカーをｍＲＮＡの３'末端側にハイブリダイズさせた。
その後、ＵＶＰ ＣｒｏｓｓＬｉｎｋｅｒ（ＣＬ―３０００），３６５ｎｍ，１００―１１５Ｖ （Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ）を使用して、３６５ｎｍのＵＶを４０６０ ｍＪ／ｃｍ２照射し、ｃｎｖＫリンカーとｍＲＮＡを光架橋させ、ｍＲＮＡ－リンカー複合体を得た。
【0040】
（３）ｍＲＮＡディスプレイの調製
６ｐｍｏｌのｍＲＮＡ－リンカー複合体を、５０μＬスケールの無細胞翻訳系（Ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｔｒｅａｔｅｄ）、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＭｇＣＬ２及びＫＣＬをそれぞれ最終濃度７５ｍＭ、９００ｍＭとなるように加えて３７℃で１時間インキュベートし、ｍＲＮＡ－リンカー上のピューロマイシンにｍＲＮＡに対応するペプチドをディスプレイした。次いで、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を最終濃度７０ｍＭ になるように加えて、４℃で５分間インキュベートし、ｍＲＮＡディスプレイを調製した。
６ｐｍｏｌのｍＲＮＡ－リンカー複合体を、５０μＬスケールの無細胞翻訳系（Ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｔｒｅａｔｅｄ）、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＭｇＣＬ２及びＫＣＬをそれぞれ最終濃度７５ｍＭ、９００ｍＭとなるように加えて３７℃で１時間インキュベートし、ｍＲＮＡ－リンカー上のピューロマイシンにｍＲＮＡに対応するペプチドをディスプレイした。次いで、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を最終濃度７０ｍＭ になるように加えて、４℃で５分間インキュベートし、ｍＲＮＡディスプレイを調製した。
【0041】
（４）ｃＤＮＡディスプレイの調製
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｂｉｎｄ Ｔｕｂｅに、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を６０μＬ入れ、２００μＬの結合バッファーで洗浄した後、上記（１）－（４）の方法で調製したｍＲＮＡディスプレイを加え、２５℃で３０分間撹拌した。２００μＬの結合バッファーで洗浄し後、表２に示す組成の反応液中にて４２℃，３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行い、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ―ＶＨＨ連結体を調製した。２００μＬの結合バッファーで洗浄後、３９μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーと、１μＬの１，０００Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ Ｔ１とを加え３７℃１５分撹拌することによってｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ―ＶＨＨ連結体（ｃＤＮＡディスプレイ）をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１から溶出した。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｂｉｎｄ Ｔｕｂｅに、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を６０μＬ入れ、２００μＬの結合バッファーで洗浄した後、上記（１）－（４）の方法で調製したｍＲＮＡディスプレイを加え、２５℃で３０分間撹拌した。２００μＬの結合バッファーで洗浄し後、表２に示す組成の反応液中にて４２℃，３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行い、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ―ＶＨＨ連結体を調製した。２００μＬの結合バッファーで洗浄後、３９μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーと、１μＬの１，０００Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ Ｔ１とを加え３７℃１５分撹拌することによってｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ―ＶＨＨ連結体（ｃＤＮＡディスプレイ）をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１から溶出した。
【0042】
【表2】
【0043】
（５）ｃＤＮＡディスプレイの精製
エッペンドルフチューブにＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を３０μＬ入れ、２００μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーで洗浄した後、上記（１）－（５）の方法で調製したｃＤＮＡディスプレイを加え、２５℃で３０分間撹拌した。２００μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーで洗浄後、３０μＬのＨｉｓタグ溶出バッファーを加え３７℃１５分撹拌することによってｃＤＮＡディスプレイを溶出した。
エッペンドルフチューブにＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を３０μＬ入れ、２００μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーで洗浄した後、上記（１）－（５）の方法で調製したｃＤＮＡディスプレイを加え、２５℃で３０分間撹拌した。２００μＬのＨｉｓタグ結合／洗浄バッファーで洗浄後、３０μＬのＨｉｓタグ溶出バッファーを加え３７℃１５分撹拌することによってｃＤＮＡディスプレイを溶出した。
【0044】
（実施例３）ＶＨＨのセレクション
（１）試験管内淘汰実験
実施例２で取得したライブラリから調製したｃＤＮＡディスプレイを用いて、セレクションを行った。各セレクションラウンドで使用したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリの合成スケールを表３に示す。
（１）試験管内淘汰実験
実施例２で取得したライブラリから調製したｃＤＮＡディスプレイを用いて、セレクションを行った。各セレクションラウンドで使用したＶＨＨ提示ｃＤＮＡディスプレイライブラリの合成スケールを表３に示す。
【0045】
【表3】
【0046】
（１－１） セレクションサイクル１（Ｒ（ラウンド）１）のスクリーニング手順
ＳＡＲＳ―ＣｏＶ２（２０１９―ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ―Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ， ＢｉｏｔｉｎｙＬａｔｅｄ （ＳｉｎｏＢｉｏＬｏｇｉｃａＬ）（以降、ビオチン化Ｎタンパク質と記す）をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１に加え４℃、３０分間転倒混和し、ＳＡＲＳ―ＣｏＶ２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ固層化ビーズを作製した。実施例２と同様の方法で表３の合成スケールで調製したｃＤＮＡディスプレイを、５ｍｇ/ｍＬのヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ―Ｔで２００μＬに希釈後、１００μＬを５０ｐｍｏｌ分のビオチン化Ｎタンパク質が固層化されたビーズに加え４℃、３０分間転倒混和した。
残りの１００μＬのｃＤＮＡディスプレイ溶液を５０ｐｍｏｌのビオチン化Ｎタンパク質と混合し、４℃、３０分間転倒混和した。その後、混合液をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１に加え４℃、３０分間転倒混和してｃＤＮＡディスプレイ―Ｎタンパク質複合体を含むビオチン化Ｎタンパク質をビーズに固定した。ビーズをすべて１つにまとめた後、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄した。その後、結合しているｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。
精製した溶液はｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａ（配列番号５２）とT７ ｏｍｅｇａｎｅｗ（配列番号５３）をプライマーとして用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ）によりアニーリング温度６５℃、伸長反応１０秒の条件でＰＣＲを行った後、ＰＣＲ産物を４％変性ＰＡＧＥで解析した。
ＰＣＲ産物をＡＭｐｕｒｅ ＸＰを使用し、添付されたマニュアルに従って精製したあと、得られた精製物Ｒ１ライブラリをセレクションの２ｎｄラウンドに供した。
ＳＡＲＳ―ＣｏＶ２（２０１９―ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ―Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ， ＢｉｏｔｉｎｙＬａｔｅｄ （ＳｉｎｏＢｉｏＬｏｇｉｃａＬ）（以降、ビオチン化Ｎタンパク質と記す）をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１に加え４℃、３０分間転倒混和し、ＳＡＲＳ―ＣｏＶ２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ固層化ビーズを作製した。実施例２と同様の方法で表３の合成スケールで調製したｃＤＮＡディスプレイを、５ｍｇ/ｍＬのヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ―Ｔで２００μＬに希釈後、１００μＬを５０ｐｍｏｌ分のビオチン化Ｎタンパク質が固層化されたビーズに加え４℃、３０分間転倒混和した。
残りの１００μＬのｃＤＮＡディスプレイ溶液を５０ｐｍｏｌのビオチン化Ｎタンパク質と混合し、４℃、３０分間転倒混和した。その後、混合液をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１に加え４℃、３０分間転倒混和してｃＤＮＡディスプレイ―Ｎタンパク質複合体を含むビオチン化Ｎタンパク質をビーズに固定した。ビーズをすべて１つにまとめた後、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄した。その後、結合しているｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。
精製した溶液はｃｎｖＫ ＮｅｗＹｔａｇ ｆｏｒ ｐｏｌｙ Ａ（配列番号５２）とT７ ｏｍｅｇａｎｅｗ（配列番号５３）をプライマーとして用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ）によりアニーリング温度６５℃、伸長反応１０秒の条件でＰＣＲを行った後、ＰＣＲ産物を４％変性ＰＡＧＥで解析した。
ＰＣＲ産物をＡＭｐｕｒｅ ＸＰを使用し、添付されたマニュアルに従って精製したあと、得られた精製物Ｒ１ライブラリをセレクションの２ｎｄラウンドに供した。
【0047】
（１－２）セレクションサイクル２（Ｒ２）のスクリーニング手順
Ｒ１ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製し、５０μＬの５ｍｇ/ｍＬのヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ―Ｔで希釈し、２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に加え４℃、３０分間転倒混和した。その上清を、１０ｐｍｏｌ分のビオチン化Ｎタンパク質と混合し、室温で６０分間転倒混和した。混合液を２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１に加え４℃、３０分間転倒混和してｃＤＮＡディスプレイ―Ｎタンパク質複合体を含むビオチン化Ｎタンパク質をビーズに固定した。ビーズを２００μＬのＰＢＳ―Ｔで４回洗浄後、結合しているｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。精製液を実施例３の（１－１）と同等の条件でＰＣＲ反応させ、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰを使用し、添付されたマニュアルに従って精製しＲ２ライブラリとした。
Ｒ１ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製し、５０μＬの５ｍｇ/ｍＬのヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ―Ｔで希釈し、２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に加え４℃、３０分間転倒混和した。その上清を、１０ｐｍｏｌ分のビオチン化Ｎタンパク質と混合し、室温で６０分間転倒混和した。混合液を２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１に加え４℃、３０分間転倒混和してｃＤＮＡディスプレイ―Ｎタンパク質複合体を含むビオチン化Ｎタンパク質をビーズに固定した。ビーズを２００μＬのＰＢＳ―Ｔで４回洗浄後、結合しているｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。精製液を実施例３の（１－１）と同等の条件でＰＣＲ反応させ、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰを使用し、添付されたマニュアルに従って精製しＲ２ライブラリとした。
【0048】
（１－３）セレクションサイクル（Ｒ３）のスクリーニング手順
Ｒ２ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製し、５０μＬの５ｍｇ/ｍＬのヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ―Ｔで希釈し、２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に加え４℃、３０分間転倒混和した。その上清の半量を、１０ｐｍｏｌ分のビオチン化Ｎタンパク質と混合し、室温で６０分間転倒混和した。混合液を２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１に加えｃＤＮＡディスプレイ―Ｎタンパク質複合体を含むビオチン化Ｎタンパク質を４℃、３０分間転倒混和してビーズに固定した。ビーズを２００μＬのＰＢＳ―Ｔで３回洗浄後、２０μＬのＰＢＳＴを加え２５℃、３０分間転倒混和して洗浄した。その後、結合しているｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。精製液を実施例３の（１－１）と同等の条件でＰＣＲ反応させ、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰを使用し、添付されたマニュアルに従って精製しＲ３ライブラリとした。
Ｒ２ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製し、５０μＬの５ｍｇ/ｍＬのヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ―Ｔで希釈し、２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に加え４℃、３０分間転倒混和した。その上清の半量を、１０ｐｍｏｌ分のビオチン化Ｎタンパク質と混合し、室温で６０分間転倒混和した。混合液を２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１に加えｃＤＮＡディスプレイ―Ｎタンパク質複合体を含むビオチン化Ｎタンパク質を４℃、３０分間転倒混和してビーズに固定した。ビーズを２００μＬのＰＢＳ―Ｔで３回洗浄後、２０μＬのＰＢＳＴを加え２５℃、３０分間転倒混和して洗浄した。その後、結合しているｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用し、添付されたマニュアルに従って精製した。精製液を実施例３の（１－１）と同等の条件でＰＣＲ反応させ、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰを使用し、添付されたマニュアルに従って精製しＲ３ライブラリとした。
【0049】
（１－４）セレクションサイクル４（Ｒ４）のスクリーニング手順
Ｒ３ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製し、５０μＬの５ｍｇ/ｍＬのヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ―Ｔで希釈し、２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に加え４℃、３０分間転倒混和した。その上清の半量を、５ｐｍｏｌ分のビオチン化Ｎタンパク質と混合してＰｏｓｉｔｉｎｅ溶液、残りの半分は何も加えずにＮｅｇａｔｉｖｅ溶液として、それぞれを室温で３０分間転倒混和した。それぞれの混合液を２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１に加えｃＤＮＡディスプレイ―Ｎタンパク質複合体を含むビオチン化Ｎタンパク質を４℃、３０分間転倒混和してビーズに固定した。それぞれのビーズを１μＭビオチンを含む２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄後、１μＭのビオチン、１２．５ｐｍｏｌビオチン化Ｎタンパク質を含む２０μＬのＰＢＳＴを加え２５℃、５分間転倒混和して洗浄した。その後、１２．５ｐｍｏｌビオチン化Ｎタンパク質を含む２０μＬのＰＢＳＴを加え、２５℃、６０分間転倒混和して競合溶出した。その後、結合しているｃＤＮＡディスプレイを回収し、それぞれの溶液をＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で、添付されたマニュアルに従って精製した。それぞれの精製液を実施例３の（１－１）と同等の条件でＰＣＲ反応させ、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰを使用し、添付されたマニュアルに従って精製しＲ４ライブラリとした。
Ｒ３ライブラリから上記と同様の方法によりｃＤＮＡディスプレイライブラリを表３の合成スケールで調製し、５０μＬの５ｍｇ/ｍＬのヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ―Ｔで希釈し、２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に加え４℃、３０分間転倒混和した。その上清の半量を、５ｐｍｏｌ分のビオチン化Ｎタンパク質と混合してＰｏｓｉｔｉｎｅ溶液、残りの半分は何も加えずにＮｅｇａｔｉｖｅ溶液として、それぞれを室温で３０分間転倒混和した。それぞれの混合液を２０μＬ分のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１に加えｃＤＮＡディスプレイ―Ｎタンパク質複合体を含むビオチン化Ｎタンパク質を４℃、３０分間転倒混和してビーズに固定した。それぞれのビーズを１μＭビオチンを含む２００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄後、１μＭのビオチン、１２．５ｐｍｏｌビオチン化Ｎタンパク質を含む２０μＬのＰＢＳＴを加え２５℃、５分間転倒混和して洗浄した。その後、１２．５ｐｍｏｌビオチン化Ｎタンパク質を含む２０μＬのＰＢＳＴを加え、２５℃、６０分間転倒混和して競合溶出した。その後、結合しているｃＤＮＡディスプレイを回収し、それぞれの溶液をＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で、添付されたマニュアルに従って精製した。それぞれの精製液を実施例３の（１－１）と同等の条件でＰＣＲ反応させ、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰを使用し、添付されたマニュアルに従って精製しＲ４ライブラリとした。
【0050】
（２）次世代シーケンサー解析
試験管内淘汰サイクルによるＤＮＡライブラリの収束度を詳細に確かめるために、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を利用したシーケンス解析を行った。シーケンスサンプルの調製は、イルミナ社が提供している２－ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎの方法を参考に実施した。最初に、各セレクション後のＰＣＲ産物を鋳型として、ＮＧＳ Ｆｗ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５４）、ＮＧＳ Ｒｖ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５５）をプライマーとしてを用いて、Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、６２℃で５秒間、７２℃で３５秒を１５サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰの説明書に従って精製した後、イルミナ社の説明書に従いＩｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰの説明書に従って精製した後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）により濃度定量し、イルミナ社の説明書に従いＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）及びＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ ｋｉｔ ｖ２（５００サイクル）を用いて配列解析を実施した。
試験管内淘汰サイクルによるＤＮＡライブラリの収束度を詳細に確かめるために、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を利用したシーケンス解析を行った。シーケンスサンプルの調製は、イルミナ社が提供している２－ｓｔｅｐ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎの方法を参考に実施した。最初に、各セレクション後のＰＣＲ産物を鋳型として、ＮＧＳ Ｆｗ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５４）、ＮＧＳ Ｒｖ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５５）をプライマーとしてを用いて、Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間の後、９８℃で１０秒間、６２℃で５秒間、７２℃で３５秒を１５サイクル、そして７２℃で１分間の条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰの説明書に従って精製した後、イルミナ社の説明書に従いＩｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰの説明書に従って精製した後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）により濃度定量し、イルミナ社の説明書に従いＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）及びＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ ｋｉｔ ｖ２（５００サイクル）を用いて配列解析を実施した。
【0051】
得られたＤＮＡ配列をＶＨＨのアミノ酸配列に翻訳し、出現頻度で順位付けした。その結果、表４がＮタンパク質との親和性が高い代表的なＶＨＨとして選抜された。さらに、Ｒ４のセレクション工程を経たライブラリを解析した結果、ＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１及びＥＮ１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列において、アミノ酸配列の変異（置換、挿入、欠損を含む）を含むＶＨＨが選抜された（これらのＶＨＨをＣＤＲ変異体と呼ぶ。）。ＥＮ２（配列番号４０）のＣＤＲ変異体として配列番号７７～９８、ＥＮ３（配列番号４１）のＣＤＲ変異体として配列番号９９～１０６、ＥＮ４（配列番号４２）のＣＤＲ変異体として配列番号１０７～１１９、ＥＮ５（配列番号４３）のＣＤＲ変異体として配列番号１２０～１２６、ＥＮ６（配列番号４４）のＣＤＲ変異体として配列番号１２７～１３４、ＥＮ１１（配列番号４５）のＣＤＲ変異体として配列番号１３５、ＥＮ１２（配列番号４６）のＣＤＲ変異体として配列番号１３６～１５０が選抜された（図１及び図２）。これらのＣＤＲ変異体もセレクションの工程を経て選抜されたＶＨＨであることから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対して結合活性を示す可能性が高いと考えられる。
【0052】
【表4】
【0053】
（実施例４） プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産
（１）遺伝子の人工合成
合成されるＶＨＨのアミノ酸配列には、表４に記載される各ＶＨＨのアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列を介したＨｉｓタグ配列（配列番号５６）を付与した。これにより合成されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＥＮ２（配列番号５７）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ３（配列番号５８）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ４（配列番号５９）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ５（配列番号６０）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ６（配列番号６１）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ１１（配列番号６２）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ１２（配列番号６３）と呼ぶ。尚、これら配列番号５６～６３で示されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＶＨＨと総称する。これらＨｉｓタグ付きＶＨＨを合成するための人工合成遺伝子として、Ｈｉｓタグ付きＥＮ２用人工合成遺伝子（配列番号６４）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ３用人工合成遺伝子（配列番号６５）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ４用人工合成遺伝子（配列番号６６）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ５用人工合成遺伝子（配列番号６７）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ６用人工合成遺伝子（配列番号６８）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ１１用人工合成遺伝子（配列番号６９）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ１２用人工合成遺伝子（配列番号７０）を合成し、実験に供した。
（１）遺伝子の人工合成
合成されるＶＨＨのアミノ酸配列には、表４に記載される各ＶＨＨのアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列を介したＨｉｓタグ配列（配列番号５６）を付与した。これにより合成されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＥＮ２（配列番号５７）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ３（配列番号５８）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ４（配列番号５９）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ５（配列番号６０）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ６（配列番号６１）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ１１（配列番号６２）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ１２（配列番号６３）と呼ぶ。尚、これら配列番号５６～６３で示されるＶＨＨをＨｉｓタグ付きＶＨＨと総称する。これらＨｉｓタグ付きＶＨＨを合成するための人工合成遺伝子として、Ｈｉｓタグ付きＥＮ２用人工合成遺伝子（配列番号６４）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ３用人工合成遺伝子（配列番号６５）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ４用人工合成遺伝子（配列番号６６）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ５用人工合成遺伝子（配列番号６７）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ６用人工合成遺伝子（配列番号６８）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ１１用人工合成遺伝子（配列番号６９）、Ｈｉｓタグ付きＥＮ１２用人工合成遺伝子（配列番号７０）を合成し、実験に供した。
【0054】
（２）ＶＨＨ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換え プラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号７１）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号７２）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号７３）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号７４）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号７５）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号７６）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込み、人工合成ＶＨＨ遺伝子の各々を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換え プラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号７１）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号７２）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号７３）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号７４）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号７５）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号７６）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込み、人工合成ＶＨＨ遺伝子の各々を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。
【0055】
（３）組換え枯草菌の作製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（以下、１６８株という）から、特許第４４８５３４１号に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ、ａｐｒX）の欠損株を作製した。また、特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、上記９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Ｄｐｒ９から、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をＤｐｒ９ΔｓｉｇＦと記載する。
Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（以下、１６８株という）から、特許第４４８５３４１号に記載されている方法に従って、細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ、ａｐｒX）の欠損株を作製した。また、特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、上記９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子を全て欠損している枯草菌株Ｄｐｒ９から、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた。得られた細胞外プロテアーゼ多重欠損株をＤｐｒ９ΔｓｉｇＦと記載する。
Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
【0056】
（４）ＶＨＨ産生
（３）で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。Ｈｉｓタグ付きＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。精製後のタンパク質は３０ｍＭ イミダゾール含有ＰＢＳに溶解した。
（３）で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。Ｈｉｓタグ付きＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。精製後のタンパク質は３０ｍＭ イミダゾール含有ＰＢＳに溶解した。
【0057】
（５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる確認
（４）で回収したサンプルとＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を等量混和後、９９℃で５分間熱処理してサンプルを調製した。ゲルはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。各ウェルに５μＬのサンプルをアプライし、２１０Ｖで２５分間泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでタンパク質のバンドを検出した。リゾチーム標品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をもとに作成した検量線によって検出したタンパク質を定量した。その結果、目的とするＨｉｓタグ付きＶＨＨが合成されていることが確認された（図３）。
（４）で回収したサンプルとＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を等量混和後、９９℃で５分間熱処理してサンプルを調製した。ゲルはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。各ウェルに５μＬのサンプルをアプライし、２１０Ｖで２５分間泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでタンパク質のバンドを検出した。リゾチーム標品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をもとに作成した検量線によって検出したタンパク質を定量した。その結果、目的とするＨｉｓタグ付きＶＨＨが合成されていることが確認された（図３）。
【0058】
（実施例５）ＥＬＩＳＡ法による結合特異性の評価
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＳＡＲＳ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｈｉｓ Ｔａｇ、ＭＥＲＳ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｈｉｓ Ｔａｇ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）（両者ともＡｃｒｏＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１又はＥＮ１２（いずれもＨｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図４）。
その結果、本実施例で使用したＨｉｓタグ付きＶＨＨはいずれもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に最も強く結合することが確認された。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＳＡＲＳ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｈｉｓ Ｔａｇ、ＭＥＲＳ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｈｉｓ Ｔａｇ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）（両者ともＡｃｒｏＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１又はＥＮ１２（いずれもＨｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図４）。
その結果、本実施例で使用したＨｉｓタグ付きＶＨＨはいずれもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に最も強く結合することが確認された。
【0059】
（実施例６）ＥＬＩＳＡ法による変異株Ｎタンパク質に対する結合活性の評価
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｐ１３Ｌ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｓ１９４Ｌ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｉ２９２Ｔ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３Ｌ，Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ，Ｓ２３５Ｆ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３Ｌ，Ｓ２３５Ｆ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｔ２０５Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｐ８０Ｒ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３７７Ｙ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ａ１２Ｇ，Ｔ２０５Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｒ２０３Ｍ，Ｄ３７７Ｙ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ａ１１９Ｓ，Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ，Ｍ２３４Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。
ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１又はＥＮ１２（いずれもＨｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図５、図６）。
その結果、本実施例で使用したＨｉｓタグ付きＶＨＨはいずれもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株のＮタンパク質に対して、普遍的に結合することが確認された。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｐ１３Ｌ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｓ１９４Ｌ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｉ２９２Ｔ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３Ｌ，Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ，Ｓ２３５Ｆ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３Ｌ，Ｓ２３５Ｆ）－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｔ２０５Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｐ８０Ｒ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｄ３７７Ｙ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ａ１２Ｇ，Ｔ２０５Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｒ２０３Ｍ，Ｄ３７７Ｙ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ａ１１９Ｓ，Ｒ２０３Ｋ，Ｇ２０４Ｒ，Ｍ２３４Ｉ） Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。
ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１又はＥＮ１２（いずれもＨｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図５、図６）。
その結果、本実施例で使用したＨｉｓタグ付きＶＨＨはいずれもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株のＮタンパク質に対して、普遍的に結合することが確認された。
【0060】
（実施例７）バイオレイヤー干渉法による結合活性の測定
各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの濃度はウシ血清アルブミン（富士フイルム和光純薬社製）を標準タンパク質とし、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いたＢＣＡ法により定量を行った。Ｏｃｔｅｔ（商標）ＲＥＤ３８４（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）をもちいてＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ （ＳＡ） Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に固相化したビオチン化Ｎタンパク質に対する各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの結合活性を測定した。各測定は６０μＬの各測定液を３８４ウェルプレートに添加して測定した。測定前にＳＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐの先端を２００μＬのＰＢＳＴに１０分間浸漬させることでセンサーチップを水和させた。まずは
１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定
２）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈し調製した２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．６ｎＭ、３１．３ｎＭ、１５．６ｎＭおよび０ｎＭの各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨで１２０秒間の測定
３）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔ中で２４０秒間の測定
４）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣＬ（ｐＨ２．２）中で５秒間、ＰＢＳ－Ｔ中で５秒間を３回繰り返しの測定
上記１）～４）の工程で各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨのＳＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐへの吸着を測定した。その後、ビオチン化Ｎタンパク質を含むＰＢＳ―Ｔで６００秒測定することでＳＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐへビオチン化Ｎタンパク質を約６．５ｎｍのレスポンスが出るまで固定した。ビオチン化Ｎタンパク質を固定したＳＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐを用いて上記１）～４）の工程を行った。Ｏｃｔｅｔソフトウェアバージョン（１．２．１．５）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの濃度が０ｎＭの測定とビオチン化Ｎタンパク質を固定する前の結果をダブルリファレンスとしてとり、Ｇｌｏｂａｌ Ｆｉｔｔｉｎｇを行い結合及び解離速度を算出した（表５）。
各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの濃度はウシ血清アルブミン（富士フイルム和光純薬社製）を標準タンパク質とし、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いたＢＣＡ法により定量を行った。Ｏｃｔｅｔ（商標）ＲＥＤ３８４（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）をもちいてＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ （ＳＡ） Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に固相化したビオチン化Ｎタンパク質に対する各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの結合活性を測定した。各測定は６０μＬの各測定液を３８４ウェルプレートに添加して測定した。測定前にＳＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐの先端を２００μＬのＰＢＳＴに１０分間浸漬させることでセンサーチップを水和させた。まずは
１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定
２）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈し調製した２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．６ｎＭ、３１．３ｎＭ、１５．６ｎＭおよび０ｎＭの各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨで１２０秒間の測定
３）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳ－Ｔ中で２４０秒間の測定
４）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣＬ（ｐＨ２．２）中で５秒間、ＰＢＳ－Ｔ中で５秒間を３回繰り返しの測定
上記１）～４）の工程で各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨのＳＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐへの吸着を測定した。その後、ビオチン化Ｎタンパク質を含むＰＢＳ―Ｔで６００秒測定することでＳＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐへビオチン化Ｎタンパク質を約６．５ｎｍのレスポンスが出るまで固定した。ビオチン化Ｎタンパク質を固定したＳＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐを用いて上記１）～４）の工程を行った。Ｏｃｔｅｔソフトウェアバージョン（１．２．１．５）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各種Ｈｉｓタグ付きＶＨＨの濃度が０ｎＭの測定とビオチン化Ｎタンパク質を固定する前の結果をダブルリファレンスとしてとり、Ｇｌｏｂａｌ Ｆｉｔｔｉｎｇを行い結合及び解離速度を算出した（表５）。
【0061】
【表5】
【0062】
（実施例８）ＥＬＩＳＡ法によるオミクロン株Ｎタンパク質に対する結合活性の評価
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．５２９（Ｏｍｉｃｒｏｎ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１又はＥＮ１２（いずれもＨｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図７）。
その結果、本実施例で使用したＨｉｓタグ付きＶＨＨはいずれもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株のＮタンパク質に対しても結合することが確認された。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに５０μＬの１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓタグ付きＮタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．５２９（Ｏｍｉｃｒｏｎ）Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＮタンパク質分散液を取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２００μＬのＰｉｅｒｃｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｎタンパク質を固相化した各ウェルに対して５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＥＮ２、ＥＮ３、ＥＮ４、ＥＮ５、ＥＮ６、ＥＮ１１又はＥＮ１２（いずれもＨｉｓタグ付き）／ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｕ，Ｍｓ，Ｒｂ，Ｒａｔ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１．０ｍｇ／ｍＬ）を用いた。ＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）により検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに５０μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した（図７）。
その結果、本実施例で使用したＨｉｓタグ付きＶＨＨはいずれもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株のＮタンパク質に対しても結合することが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】