▶ カトリック ユニバーシティ インダストリー アカデミック コーオペレイション ファウンデーションの特許一覧
特開2023-156486フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023156486
(43)【公開日】2023-10-24
(54)【発明の名称】フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20231017BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231017BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231017BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231017BHJP
C07K 14/195 20060101ALN20231017BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231017BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61P35/00 ZNA
A61P37/06
A61P43/00 111
A61P43/00 105
C07K14/195
C12N15/31
【審査請求】有
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023134162
(22)【出願日】2023-08-21
(62)【分割の表示】P 2021556768の分割
【原出願日】2020-03-26
(31)【優先権主張番号】10-2019-0035521
(32)【優先日】2019-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】510058863
【氏名又は名称】ザ カトリック ユニバーシティ オブ コリア インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョ、ソック
(72)【発明者】
【氏名】イム、ゴニル
(72)【発明者】
【氏名】キム、ナヨン
(72)【発明者】
【氏名】チョン、ヨンウ
(72)【発明者】
【氏名】ナム、ヨンソン
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ユンジン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジュンソク
(57)【要約】 （修正有）
【課題】白血病、骨髄腫、リンパ腫および再生不良性貧血のような血液癌の治療のために同種造血母細胞を移植する過程で発生する移植片対宿主疾患を、抗腫瘍効果を増強しながら治療するための医薬組成物を提供する。
【解決手段】フラジェリンから誘導された特定の配列を有するＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む、移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物、ならびに前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む、移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】フラジェリンから誘導された特定の配列を有するＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む、移植片対宿主疾患の予防または治療用組成物、ならびに前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む、移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
移植片対宿主病を治療または予防し、さらに移植片対腫瘍効果を増大させるための医薬組成物であって、
（ｉ）治療有効量のＴＬＲ５アゴニスト；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含有し、
ここで、該ＴＬＲ５アゴニストは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
（ｉ）治療有効量のＴＬＲ５アゴニスト；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含有し、
ここで、該ＴＬＲ５アゴニストは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項2】
前記ＴＬＲ５アゴニストがフラジェリンのＤ０ドメインおよびＤ１ドメインを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＴＬＲ５アゴニストが、Ｄ１ドメイン内に、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記ＴＬＲ５アゴニストが、宿主由来のＩＬ－２２およびＩＬ－２３の産生を促進する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記ＴＬＲ５アゴニストが、宿主の腸管幹細胞の減少を抑制する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
ＴＬＲ５アゴニストを有効成分として含有する、移植片対宿主病を緩和し、かつ移植片対腫瘍効果を増強するための機能性食品組成物であって、
ここで、該ＴＬＲ５アゴニストは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、機能性食品組成物。
ここで、該ＴＬＲ５アゴニストは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、機能性食品組成物。
【請求項7】
前記ＴＬＲ５アゴニストがフラジェリンのＤ０ドメインおよびＤ１ドメインを含む、請求項６に記載の機能性食品組成物。
【請求項8】
前記ＴＬＲ５アゴニストが、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドを含む、請求項６に記載の機能性食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む移植片対
宿主疾患の予防または治療用組成物に関する。
宿主疾患の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）は、ヒトにおけるＴＬＲ５遺伝
子によって暗号化されたタンパク質であって（ＰＮＡＳ．９５（２）：５８８－９３）、
ＴＬＲ（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーの一員である。ＴＬＲ５は
、侵入する運動性バクテリアのフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を認識できることが
知られている（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２９（３）
：２７５－８８）。ＴＬＲ５は、炎症性腸疾患を含めて多様な疾患の開始に関与すること
が知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌｏｇｙ．６０Ｓｕｐｐｌ４：７１－５）。
子によって暗号化されたタンパク質であって（ＰＮＡＳ．９５（２）：５８８－９３）、
ＴＬＲ（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーの一員である。ＴＬＲ５は
、侵入する運動性バクテリアのフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を認識できることが
知られている（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２９（３）
：２７５－８８）。ＴＬＲ５は、炎症性腸疾患を含めて多様な疾患の開始に関与すること
が知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌｏｇｙ．６０Ｓｕｐｐｌ４：７１－５）。
【0003】
フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）は、運動細胞小器官である、バクテリア鞭毛のフ
ィラメントを構成する主要構造タンパク質である。数万個のフラジェリン分子が螺旋状に
重合されて長い鞭形状のフラジェラフィラメントを形成する。フラジェリンは、Ｄ０ドメ
イン（ｄｏｍａｉｎ）、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ３ドメインを含み、そのうち、
Ｄ０ドメインとＤ１ドメインのフィラメントの組立に必要である。フラジェリンのＤ０お
よびＤ１ドメインは、多様なバクテリア種にわたって構造および配列が高度に保存されて
おり、宿主にバクテリア感染を知らせる、鞭毛を有するバクテリアの共通分子パターンと
して機能をする。フラジェリンはＴＬＲ５によって認識されて、ＮＦ－κＢシグナル伝達
メカニズムを活性化させて、先天性免疫刺激、細胞保護および放射線抵抗性を誘導すると
知られている。
ィラメントを構成する主要構造タンパク質である。数万個のフラジェリン分子が螺旋状に
重合されて長い鞭形状のフラジェラフィラメントを形成する。フラジェリンは、Ｄ０ドメ
イン（ｄｏｍａｉｎ）、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ３ドメインを含み、そのうち、
Ｄ０ドメインとＤ１ドメインのフィラメントの組立に必要である。フラジェリンのＤ０お
よびＤ１ドメインは、多様なバクテリア種にわたって構造および配列が高度に保存されて
おり、宿主にバクテリア感染を知らせる、鞭毛を有するバクテリアの共通分子パターンと
して機能をする。フラジェリンはＴＬＲ５によって認識されて、ＮＦ－κＢシグナル伝達
メカニズムを活性化させて、先天性免疫刺激、細胞保護および放射線抵抗性を誘導すると
知られている。
【0004】
移植片対宿主疾患（Ｇｒａｆｔ－Ｖｅｒｓｕｓ－Ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ
）は、白血病、骨髄腫、リンパ腫および再生不良性貧血のような血液癌の治療のために同
種造血母細胞を移植する過程で発生するが、移植や輸血により輸血されたリンパ球が免疫
機能の低下した宿主を攻撃しながら発生する。輸血されたリンパ球は一般的に宿主の免疫
機序によって破壊されるが、宿主の免疫機能が低下した場合、宿主の免疫体系がかかる機
能を行えないことからＧＶＨＤが発生する。一方、宿主の免疫抑制の程度が高いほど、Ｇ
ＶＨＤの可能性は高まるが、移植片対宿主疾患と抗腫瘍（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔ
ｕｍｏｒ、ＧＶＴ）効果は互いに密接に関連づけられており、移植後に免疫抑制の強度を
高める場合、ＧＶＨＤの発生は減少するものの、ＧＶＴ効果も弱くなり、結局、白血病の
再発が増加する。したがって、ＧＶＨＤを抑制しながらＧＶＴ効果は極大化できる新たな
治療剤の開発が切実なのが現状である。
）は、白血病、骨髄腫、リンパ腫および再生不良性貧血のような血液癌の治療のために同
種造血母細胞を移植する過程で発生するが、移植や輸血により輸血されたリンパ球が免疫
機能の低下した宿主を攻撃しながら発生する。輸血されたリンパ球は一般的に宿主の免疫
機序によって破壊されるが、宿主の免疫機能が低下した場合、宿主の免疫体系がかかる機
能を行えないことからＧＶＨＤが発生する。一方、宿主の免疫抑制の程度が高いほど、Ｇ
ＶＨＤの可能性は高まるが、移植片対宿主疾患と抗腫瘍（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔ
ｕｍｏｒ、ＧＶＴ）効果は互いに密接に関連づけられており、移植後に免疫抑制の強度を
高める場合、ＧＶＨＤの発生は減少するものの、ＧＶＴ効果も弱くなり、結局、白血病の
再発が増加する。したがって、ＧＶＨＤを抑制しながらＧＶＴ効果は極大化できる新たな
治療剤の開発が切実なのが現状である。
【0005】
本明細書で言及された特許文献および参考文献は、それぞれの文献が参照により個別的
かつ明確に特定されたものと同じ程度で本明細書に参照として取り込まれる。
かつ明確に特定されたものと同じ程度で本明細書に参照として取り込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Seminars in Immunopathology. 29 (3): 275－88
【非特許文献2】Journal of Physiology and Pharmacology. 60 Suppl 4: 71－5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を効果的に抑制しながら同時に抗腫瘍（Ｇ
ｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔｕｍｏｒ、ＧＶＴ）効果は極大化できる治療剤物質を開発す
るために研究努力した。その結果、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ－ｌ
ｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）の新規なペプチド作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）を開発し、こ
のＴＬＲ５作用剤が移植片対宿主疾患を効果的に抑制することを実験的に確認して、本発
明を完成するに至った。
ｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔｕｍｏｒ、ＧＶＴ）効果は極大化できる治療剤物質を開発す
るために研究努力した。その結果、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ－ｌ
ｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）の新規なペプチド作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）を開発し、こ
のＴＬＲ５作用剤が移植片対宿主疾患を効果的に抑制することを実験的に確認して、本発
明を完成するに至った。
【0008】
したがって、本発明の目的は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤の治療学的
有効量；および薬学的に許容される担体を含む、移植片対宿主疾患の治療または予防用薬
学的組成物を提供することである。
有効量；および薬学的に許容される担体を含む、移植片対宿主疾患の治療または予防用薬
学的組成物を提供することである。
【0009】
また、本発明の他の目的は、前記フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成
分として含む、移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物を提供することである。
分として含む、移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物を提供することである。
【0010】
本発明の他の目的および技術的特徴は以下の発明の詳細な説明、特許請求の範囲および
図面によってより具体的に提示される。
図面によってより具体的に提示される。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明の一態様によれば、（ｉ）フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤（ａｇｏｎ
ｉｓｔ）の治療学的有効量；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、移植片対宿
主疾患の治療または予防用薬学的組成物を提供する。
本発明で使われる用語「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」は、バクテリアの
フラジェリンタンパク質に由来するか、これを変形させたものであって、ＴＬＲ５（Ｔｏ
ｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）によるシグナル伝達を活性化させる活性を有する
タンパク質またはポリペプチドをすべて含む意味である。
ｉｓｔ）の治療学的有効量；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、移植片対宿
主疾患の治療または予防用薬学的組成物を提供する。
本発明で使われる用語「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」は、バクテリアの
フラジェリンタンパク質に由来するか、これを変形させたものであって、ＴＬＲ５（Ｔｏ
ｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）によるシグナル伝達を活性化させる活性を有する
タンパク質またはポリペプチドをすべて含む意味である。
【0012】
本発明で使われる用語「フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）」は、バクテリア鞭毛の
フィラメントを構成する主要タンパク質を指す。フラジェリンは、Ｄ０ドメイン（ｄｏｍ
ａｉｎ）、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ３ドメインを含んでなる。フラジェリンはＴ
ＬＲ５によって認識されて、ＮＦ－κＢシグナル伝達メカニズムを活性化させて、先天性
免疫刺激、細胞保護および放射線抵抗性を誘導することが知られている。
フィラメントを構成する主要タンパク質を指す。フラジェリンは、Ｄ０ドメイン（ｄｏｍ
ａｉｎ）、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ３ドメインを含んでなる。フラジェリンはＴ
ＬＲ５によって認識されて、ＮＦ－κＢシグナル伝達メカニズムを活性化させて、先天性
免疫刺激、細胞保護および放射線抵抗性を誘導することが知られている。
【0013】
本発明の一実施形態によれば、前記「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」は
、ペプチド物質としてフラジェリンのＤ０ドメインおよびフラジェリンのＤ１ドメインを
含むことができる。
、ペプチド物質としてフラジェリンのＤ０ドメインおよびフラジェリンのＤ１ドメインを
含むことができる。
【0014】
本発明の他の実施形態によれば、前記「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤」
は、フラジェリンのＤ０ドメイン、フラジェリンのＤ１ドメイン、およびリンカーペプチ
ドを含むことができる。
は、フラジェリンのＤ０ドメイン、フラジェリンのＤ１ドメイン、およびリンカーペプチ
ドを含むことができる。
【0015】
本発明の他の実施形態によれば、前記リンカーペプチドは、Ｄ１ドメインの内部に含ま
れる。
本発明の他の実施形態によれば、前記リンカーペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列
を含むことができる。
れる。
本発明の他の実施形態によれば、前記リンカーペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列
を含むことができる。
【0016】
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作
用剤」は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
用剤」は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【0017】
本発明において、治療対象疾患である「移植片対宿主疾患（Ｇｒａｆｔ－Ｖｅｒｓｕｓ
－Ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）」は、輸血されたリンパ球が免疫機能の低下し
た宿主を攻撃して現れる全身性疾患であって、供与者（ｄｏｎｏｒ）のＴ細胞が宿主（ｈ
ｏｓｔ）の臓器、例えば、肝、小腸、大腸、皮膚などを損傷させる。輸血されたリンパ球
は一般的に宿主の免疫機序によって破壊されるが、宿主の免疫機能が低下した場合、宿主
の免疫体系がかかる機能を行えないことから発生する。免疫抑制を多くするほど、輸血に
よる移植片対宿主疾患の可能性が高まる。悪性血液癌（急性白血病やホジキン病など）や
先天性免疫欠乏症により不可避に造血母細胞の移植を受けなければならない患者に現れ、
合併症免疫抑制を多くするほど、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の可能性は高まる。骨髄
移植後に発生する移植片対宿主疾患は急性と慢性の２種類があり、輸血後に発生する移植
片対宿主疾患は急性の形態で発生する。症状は、発熱、発疹、かゆみ症、黄疸、肝機能異
常、下痢、出血、汎血球減少症（白血球、赤血球、血小板がすべて減少した状態）などで
あり、輸血後４～３０日の間に発生する。
－Ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）」は、輸血されたリンパ球が免疫機能の低下し
た宿主を攻撃して現れる全身性疾患であって、供与者（ｄｏｎｏｒ）のＴ細胞が宿主（ｈ
ｏｓｔ）の臓器、例えば、肝、小腸、大腸、皮膚などを損傷させる。輸血されたリンパ球
は一般的に宿主の免疫機序によって破壊されるが、宿主の免疫機能が低下した場合、宿主
の免疫体系がかかる機能を行えないことから発生する。免疫抑制を多くするほど、輸血に
よる移植片対宿主疾患の可能性が高まる。悪性血液癌（急性白血病やホジキン病など）や
先天性免疫欠乏症により不可避に造血母細胞の移植を受けなければならない患者に現れ、
合併症免疫抑制を多くするほど、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の可能性は高まる。骨髄
移植後に発生する移植片対宿主疾患は急性と慢性の２種類があり、輸血後に発生する移植
片対宿主疾患は急性の形態で発生する。症状は、発熱、発疹、かゆみ症、黄疸、肝機能異
常、下痢、出血、汎血球減少症（白血球、赤血球、血小板がすべて減少した状態）などで
あり、輸血後４～３０日の間に発生する。
【0018】
一方、移植片対腫瘍（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔｕｍｏｒ）は、移植された骨髄や
組織に存在する供与者の免疫細胞が、授与者の持っている癌組織に起こす免疫反応である
。骨髄移植などでは供与者と授与者の相性が合わない場合、移植した白血球が授与者の正
常体細胞を攻撃し、これによって移植片対宿主疾患をもたらす。免疫異常である移植片対
宿主疾患（ＧＶＨＤ）の抑制のために免疫抑制剤を投与するが、癌細胞を攻撃する移植片
対腫瘍効果（ＧＶＴ効果）まで必然的に低下させて、白血病の再発の原因になりうる。し
たがって、移植片対宿主疾患と移植片対腫瘍（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔｕｍｏｒ、
ＧＶＴ）効果は互いに密接に関連づけられているといえる。
組織に存在する供与者の免疫細胞が、授与者の持っている癌組織に起こす免疫反応である
。骨髄移植などでは供与者と授与者の相性が合わない場合、移植した白血球が授与者の正
常体細胞を攻撃し、これによって移植片対宿主疾患をもたらす。免疫異常である移植片対
宿主疾患（ＧＶＨＤ）の抑制のために免疫抑制剤を投与するが、癌細胞を攻撃する移植片
対腫瘍効果（ＧＶＴ効果）まで必然的に低下させて、白血病の再発の原因になりうる。し
たがって、移植片対宿主疾患と移植片対腫瘍（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｔｕｍｏｒ、
ＧＶＴ）効果は互いに密接に関連づけられているといえる。
【0019】
本明細書の実施例で実験結果として立証されているように、本発明のフラジェリンから
誘導されたＴＬＲ５作用剤は、ＧＶＨＤ誘導された動物モデルにおいて優れたＧＶＨＤ治
療効果を示した。
誘導されたＴＬＲ５作用剤は、ＧＶＨＤ誘導された動物モデルにおいて優れたＧＶＨＤ治
療効果を示した。
【0020】
また、本明細書の実施例で他の実験結果として立証されているように、本発明のフラジ
ェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、宿主由来のＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－
２２およびＩＬ－２３の生産を促進させる効果を示した。したがって、本発明のフラジェ
リンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、前記宿主由来のＩＬ－２２およびＩＬ－２３の生
産を促進させることにより、移植片対宿主疾患を有する宿主において腸幹細胞（ｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）が減少することを抑制することができる。
ェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、宿主由来のＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－
２２およびＩＬ－２３の生産を促進させる効果を示した。したがって、本発明のフラジェ
リンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、前記宿主由来のＩＬ－２２およびＩＬ－２３の生
産を促進させることにより、移植片対宿主疾患を有する宿主において腸幹細胞（ｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）が減少することを抑制することができる。
【0021】
本明細書の実施例で実験結果として立証されているように、本発明のフラジェリンから
誘導されたＴＬＲ５作用剤は、ＧＶＨＤおよびＧＶＴ誘導された動物モデルにおいて優れ
た移植片対腫瘍効果の増加を示した。
誘導されたＴＬＲ５作用剤は、ＧＶＨＤおよびＧＶＴ誘導された動物モデルにおいて優れ
た移植片対腫瘍効果の増加を示した。
【0022】
本発明の組成物は、（ｉ）フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤の治療学的有効
量；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物の形態で提供される。
量；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物の形態で提供される。
【0023】
本明細書において、用語「治療学的有効量」は、有効成分である「フラジェリンから誘
導されたＴＬＲ５作用剤」を対象患者に投与して移植片対宿主疾患を治療または予防する
のに適した量を意味し、具体的には、前記「治療学的有効量」は、治療される疾患または
状態の１つ以上の症状をある程度緩和させる、投与される薬剤または化合物の十分な量を
意味する。
導されたＴＬＲ５作用剤」を対象患者に投与して移植片対宿主疾患を治療または予防する
のに適した量を意味し、具体的には、前記「治療学的有効量」は、治療される疾患または
状態の１つ以上の症状をある程度緩和させる、投与される薬剤または化合物の十分な量を
意味する。
【0024】
前記（ｉ）フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤の治療学的有効量；および（ｉ
ｉ）薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物の好ましい投与量は、適宜調節可能で
ある。前記組成物は、好ましくは、１日投与量を基準として２５～１００ｕｇ／ｋｇであ
ってもよい。
ｉ）薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物の好ましい投与量は、適宜調節可能で
ある。前記組成物は、好ましくは、１日投与量を基準として２５～１００ｕｇ／ｋｇであ
ってもよい。
【0025】
本発明の薬学的組成物は、有効成分である「フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用
剤」のほかに、薬学的に許容される担体を含むことができ、このような担体は、製剤時に
通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール
、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン
、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、
シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベン
ゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、メントールおよびミネラルオイルなどを含
むが、これらに限定されるものではない。
剤」のほかに、薬学的に許容される担体を含むことができ、このような担体は、製剤時に
通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール
、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン
、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、
シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベン
ゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、メントールおよびミネラルオイルなどを含
むが、これらに限定されるものではない。
【0026】
本発明の薬学的組成物は、前記成分のほかに、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化
剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含むことができる。好適な薬学的に許容される担体お
よび製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含むことができる。好適な薬学的に許容される担体お
よび製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【0027】
本発明の薬学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、
性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因に
よって多様に処方可能である。
性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因に
よって多様に処方可能である。
【0028】
本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与することができ、非経口投与される場
合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる
。
合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる
。
【0029】
一方、本発明の薬学的組成物が移植片対宿主疾患の治療または予防のために適用される
点を勘案すれば、本発明の薬学的組成物の投与は、経口または非経口の多様な経路で投与
可能である。
本発明の薬学的組成物に含まれる有効成分の濃度は、治療目的、患者の状態、必要期間な
どを考慮して決定することができ、特定範囲の濃度に限定されない。
点を勘案すれば、本発明の薬学的組成物の投与は、経口または非経口の多様な経路で投与
可能である。
本発明の薬学的組成物に含まれる有効成分の濃度は、治療目的、患者の状態、必要期間な
どを考慮して決定することができ、特定範囲の濃度に限定されない。
【0030】
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が
容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製
剤化することにより、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に入れて製造さ
れてもよい。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形
態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよいし
、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製
剤化することにより、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に入れて製造さ
れてもよい。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形
態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよいし
、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【0031】
本発明の他の態様によれば、本発明は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を
有効成分として含む、移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物を提供する。
有効成分として含む、移植片対宿主疾患の改善用機能性食品組成物を提供する。
【0032】
本発明の機能性食品組成物は、食品の製造時に通常添加される成分を含み、例えば、タ
ンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素および調味剤を含む。例えば、有効成分としてのフラ
ジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤のほかに、香味剤または天然炭水化物を追加成分
として含むことができる。例えば、天然炭水化物は、モノサッカライド（例えば、グルコ
ース、フルクトースなど）；ジサッカライド（例えば、マルトース、スクロースなど）；
オリゴ糖；ポリサッカライド（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど）；およ
び糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなど）を含む。
香味剤として、天然香味剤（例えば、タウマチン、ステビア抽出物など）および合成香味
剤（例えば、サッカリン、アスパルテームなど）を用いることができる。
ンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素および調味剤を含む。例えば、有効成分としてのフラ
ジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤のほかに、香味剤または天然炭水化物を追加成分
として含むことができる。例えば、天然炭水化物は、モノサッカライド（例えば、グルコ
ース、フルクトースなど）；ジサッカライド（例えば、マルトース、スクロースなど）；
オリゴ糖；ポリサッカライド（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど）；およ
び糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなど）を含む。
香味剤として、天然香味剤（例えば、タウマチン、ステビア抽出物など）および合成香味
剤（例えば、サッカリン、アスパルテームなど）を用いることができる。
【0033】
本発明の利点をまとめると、次の通りである：
（ｉ）本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、優れた移植片対宿主疾患
（ＧＶＨＤ）の治療効果を示す。
（ｉｉ）本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、移植片対宿主疾患の治
療、予防または改善用組成物の活性成分として開発できる。
（ｉ）本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、優れた移植片対宿主疾患
（ＧＶＨＤ）の治療効果を示す。
（ｉｉ）本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤は、移植片対宿主疾患の治
療、予防または改善用組成物の活性成分として開発できる。
【発明の効果】
【0034】
本発明は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む移植片対
宿主疾患の予防または治療用組成物に関する。本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬ
Ｒ５作用剤は、優れた移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療効果を示すので、移植片対宿
主疾患の治療、予防または改善用組成物の活性成分として開発できる。
宿主疾患の予防または治療用組成物に関する。本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬ
Ｒ５作用剤は、優れた移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療効果を示すので、移植片対宿
主疾患の治療、予防または改善用組成物の活性成分として開発できる。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】ＧＶＨＤマウス動物モデルにおいて配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチドであるＴＬＲ５作用剤（以下、配列番号２のＴＬＲ５作用剤を「ＫＭＲＣ０１１」と称して記載する）の投与によるＧＶＨＤの抑制効果を示す実験結果の写真である。ＧＶＨＤマウス動物モデルは、ＭＨＣクラス（ｃｌａｓｓ）が互いに異なるＣ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｋｂ）マウス（供与者）とＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｋｄ）マウス（授与者）を用いて供与者の骨髄細胞と脾臓細胞を授与者の静脈に移植することによって得た。
【図2】ＧＶＨＤマウス動物モデルにおいてＫＭＲＣ０１１によるＧＶＨＤの抑制効果を示す実験結果である。グラフでは、ＧＶＨＤマウスモデルの生存率、体重およびＧＶＨＤ臨床評価指標を測定した結果を示す。
【図3】ＧＶＨＤマウスモデルにおいてＫＭＲＣ０１１の投与によるＧＶＨＤの抑制効果を示す結果であって、免疫組織化学染色による組織学的相違を示す写真である。
【図4】ＧＶＨＤマウスモデルにおいてＫＭＲＣ０１１によるＧＶＨＤの抑制効果を示す結果であって、ＫＭＲＣ０１１の投与によるＩＬ－２２とＩＬ－２３の発現増加および腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）の保護効果を示す。
【図5】ＴＬＲ５遺伝子の形質感染によって生成されたＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞においてＫＭＲＣ０１１とフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）の生物学的活性度を測定した結果であって、ＩＬ－８反応を光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で確認した結果を示す図である。
【図6】ＴＬＲ５遺伝子の形質感染によって生成されたＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞においてＫＭＲＣ０１１とフラジェリンの生物学的活性度を測定した結果であって、ＮＦ－κＢ反応をアルカリンホスファターゼ活性（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＡＰ）反応測定方法で確認した結果を示す図である。
【図7】ＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデルにおいてＫＭＲＣ０１１の投与によるＧＶＨＤの抑制効果を示す結果である。
【図8】ＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデルにおいてＫＭＲＣ０１１の投与によるＧＶＴの上昇効果を示す結果であって、生体内蛍光分光分析器（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ）を用いて腫瘍を追跡、観察した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0036】
本明細書で説明された具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態または例示を代表す
る意味であり、これによって本発明の範囲が限定されない。本発明の変形と他の用途が本
明細書の特許請求の範囲に記載された発明の範囲を逸脱しないことは当業者にとって自明
である。
る意味であり、これによって本発明の範囲が限定されない。本発明の変形と他の用途が本
明細書の特許請求の範囲に記載された発明の範囲を逸脱しないことは当業者にとって自明
である。
【実施例0037】
実験方法
１．マウスモデルの確立
（１）ＧＶＨＤマウスモデル
ＭＨＣクラス（ｃｌａｓｓ）が互いに異なるＣ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｋｂ）とＢＡＬＢ／
ｃ（Ｈ－２ｋｄ）マウス６－８週齢を用いて、授与者マウスであるＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２
ｋｄ）は８００ｃＧｙで全身放射線を照射し、２４時間以内に供与者マウスであるＣ５７
ＢＬ／６（Ｈ－２ｋｂ）の骨髄細胞（５×１０６細胞）と脾臓細胞（５×１０６細胞）を
分離して、同種の授与者マウスの静脈に移植してＧＶＨＤ動物モデルを誘導した。次いで
、ＧＶＨＤマウスは体重、姿勢、活動性、毛状態および皮膚密度を各２点ずつ計１０点満
点のＧＶＨＤ臨床評価基準（下記表１参照）により１週間に２回ずつ観察および評価した
。下記表１は、ＧＶＨＤマウスモデルの体重、姿勢、活動性、毛状態および皮膚密度の臨
床評価基準を記載した。
１．マウスモデルの確立
（１）ＧＶＨＤマウスモデル
ＭＨＣクラス（ｃｌａｓｓ）が互いに異なるＣ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｋｂ）とＢＡＬＢ／
ｃ（Ｈ－２ｋｄ）マウス６－８週齢を用いて、授与者マウスであるＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２
ｋｄ）は８００ｃＧｙで全身放射線を照射し、２４時間以内に供与者マウスであるＣ５７
ＢＬ／６（Ｈ－２ｋｂ）の骨髄細胞（５×１０６細胞）と脾臓細胞（５×１０６細胞）を
分離して、同種の授与者マウスの静脈に移植してＧＶＨＤ動物モデルを誘導した。次いで
、ＧＶＨＤマウスは体重、姿勢、活動性、毛状態および皮膚密度を各２点ずつ計１０点満
点のＧＶＨＤ臨床評価基準（下記表１参照）により１週間に２回ずつ観察および評価した
。下記表１は、ＧＶＨＤマウスモデルの体重、姿勢、活動性、毛状態および皮膚密度の臨
床評価基準を記載した。
【0038】
【表1】
【0039】
（２）ＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデル
分子映像手法を導入して腫瘍細胞の移動経路、生存率、増殖率および抗腫瘍効果にＫＭＲ
Ｃ０１１の作用の影響を確認することにより、腫瘍患者を対象にするＧＶＨＤ治療剤の有
効性を同時に検証すべく、腫瘍を保有したマウスに同種造血母細胞の移植によるＧＶＨＤ
およびＧＶＴ同時誘発モデルを確立した。
分子ラベリングにより腫瘍追跡が可能な癌細胞株（Ａ２０ １ｘ１０６）をマウスに静脈
注射し、７日後に放射線照射（８Ｇｙ）および同種移植を行ってＧＶＴモデルを確立した
。ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを注入した動物のｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙを生きている状態で生体内
蛍光分光分析器（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ）を用いてイメージングを実施し、
ＧＶＨＤ評価を進行させた。
分子映像手法を導入して腫瘍細胞の移動経路、生存率、増殖率および抗腫瘍効果にＫＭＲ
Ｃ０１１の作用の影響を確認することにより、腫瘍患者を対象にするＧＶＨＤ治療剤の有
効性を同時に検証すべく、腫瘍を保有したマウスに同種造血母細胞の移植によるＧＶＨＤ
およびＧＶＴ同時誘発モデルを確立した。
分子ラベリングにより腫瘍追跡が可能な癌細胞株（Ａ２０ １ｘ１０６）をマウスに静脈
注射し、７日後に放射線照射（８Ｇｙ）および同種移植を行ってＧＶＴモデルを確立した
。ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを注入した動物のｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙを生きている状態で生体内
蛍光分光分析器（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ）を用いてイメージングを実施し、
ＧＶＨＤ評価を進行させた。
【0040】
２．免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
パラフィンに包埋された組織から４μｍの連続切片を得て、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）
で３回処理してパラフィンを除去し、９５％、９０％、７０％エタノール（ｅｔｈａｎｏ
ｌ）で段階的に含水させた後、０．５％過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄ
ｅ）で内因性ペルオキシダーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を除去
した後、正常ヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で３０分間処理し、一次抗体を３％ＢＳ
Ａ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれたリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ
）で製造会社の指示通りに希釈して１時間反応させた。発現の差を示す遺伝子に対して発
現蛋白に対する一次抗体の反応後、Ｔｒｉｓ－緩衝塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄し、３％Ｂ
ＳＡで希釈した５μｇ／ｍｌ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ／ａｎ
ｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧに３０分間反応させ、３回Ｔｒｉｓ－緩衝塩水で洗浄した後
、３μｇ／ｍｌホースラディッシュペルオキシダーゼストレプトアビジン（ｈｏｒｓｅｒ
ａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で３０分間放置させ、
ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と過酸化水素を用いて発色した後、Ｍｅｙｅｒ’ｓ ｈｅ
ｍａｔｏｘｙｌｉｎや１％メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ）で対照染色した
。
パラフィンに包埋された組織から４μｍの連続切片を得て、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）
で３回処理してパラフィンを除去し、９５％、９０％、７０％エタノール（ｅｔｈａｎｏ
ｌ）で段階的に含水させた後、０．５％過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄ
ｅ）で内因性ペルオキシダーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を除去
した後、正常ヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で３０分間処理し、一次抗体を３％ＢＳ
Ａ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれたリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ
）で製造会社の指示通りに希釈して１時間反応させた。発現の差を示す遺伝子に対して発
現蛋白に対する一次抗体の反応後、Ｔｒｉｓ－緩衝塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄し、３％Ｂ
ＳＡで希釈した５μｇ／ｍｌ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ／ａｎ
ｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧに３０分間反応させ、３回Ｔｒｉｓ－緩衝塩水で洗浄した後
、３μｇ／ｍｌホースラディッシュペルオキシダーゼストレプトアビジン（ｈｏｒｓｅｒ
ａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で３０分間放置させ、
ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と過酸化水素を用いて発色した後、Ｍｅｙｅｒ’ｓ ｈｅ
ｍａｔｏｘｙｌｉｎや１％メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ）で対照染色した
。
【0041】
３．ＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５（ＮＦ／ＩＬ８）細胞培養
ＴＬＲ５作用剤としては、配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチド（「ＫＭＲＣ０１１
」）を使用した。本発明のＫＭＲＣ０１１とフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）のＴＬ
Ｒ５に反応する生物学的活性を比較するために、ＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５（Ｎ
Ｆ／ＩＬ８）細胞を使用した。ＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ細胞は、ヒトＴＬＲ５（ｈＴＬＲ５
）遺伝子の安定した形質注入とＴＬＲ３およびＴＮＦＲのノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕ
ｔ）で他のＴＬＲおよびサイトカインＴＮＦ－αの干渉なしにｈＴＬＲ５シグナルのみを
研究できる細胞であり、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから分譲を受けて使用した。この細胞は、Ｔ
ＬＲ５シグナルによるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１の誘導が可能なＳＥＡＰ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ
ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）レポーター構造を
安定的に発現し、内生ＩＬ－８プロモーターの制御下にあるルシアルシフェラーゼ（Ｌｕ
ｃｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現する。細胞を１０％ＦＢＳと５０Ｕ／ｍｌペニシ
リン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｉｎ）、１００μｇ／ｍｌノルモシン（Ｎｏｒｍｏｃｉｎ）ＴＭ、１００μｇ／ｍｌ
ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）Ｂ Ｇｏｌｄ、５０μｇ／ｍｌゼオシン（Ｚ
ｅｏｃｉｎ）ＴＭが含まれたＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用
いて５％ＣＯ２および３７℃の条件下で培養した。本発明のＴＬＲ５作用剤（ＫＭＲＣ０
１１）とフラジェリンを１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ
／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌで希釈して、フラットボトム９６ウェルプレート（ｆｌａｔ
－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）にそれぞれ２０μ
ｌずつ添加した。他のウェル（ｗｅｌｌ）に陰性対照群である滅菌水を２０μｌ添加した
。ＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５（ＮＦ／ＩＬ８）細胞懸濁液を用意した後、フラッ
トボトム９６ウェルプレート（ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）
のウェル（ｗｅｌｌ）に細胞懸濁液１８０μｌ（１００００ｃｅｌｌｓ）をそれぞれ添加
し、２０～２４時間５％ＣＯ２および３７℃の条件下で培養した。
ＴＬＲ５作用剤としては、配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチド（「ＫＭＲＣ０１１
」）を使用した。本発明のＫＭＲＣ０１１とフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）のＴＬ
Ｒ５に反応する生物学的活性を比較するために、ＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５（Ｎ
Ｆ／ＩＬ８）細胞を使用した。ＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ細胞は、ヒトＴＬＲ５（ｈＴＬＲ５
）遺伝子の安定した形質注入とＴＬＲ３およびＴＮＦＲのノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕ
ｔ）で他のＴＬＲおよびサイトカインＴＮＦ－αの干渉なしにｈＴＬＲ５シグナルのみを
研究できる細胞であり、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから分譲を受けて使用した。この細胞は、Ｔ
ＬＲ５シグナルによるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１の誘導が可能なＳＥＡＰ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ
ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）レポーター構造を
安定的に発現し、内生ＩＬ－８プロモーターの制御下にあるルシアルシフェラーゼ（Ｌｕ
ｃｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現する。細胞を１０％ＦＢＳと５０Ｕ／ｍｌペニシ
リン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｉｎ）、１００μｇ／ｍｌノルモシン（Ｎｏｒｍｏｃｉｎ）ＴＭ、１００μｇ／ｍｌ
ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）Ｂ Ｇｏｌｄ、５０μｇ／ｍｌゼオシン（Ｚ
ｅｏｃｉｎ）ＴＭが含まれたＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用
いて５％ＣＯ２および３７℃の条件下で培養した。本発明のＴＬＲ５作用剤（ＫＭＲＣ０
１１）とフラジェリンを１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ
／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌで希釈して、フラットボトム９６ウェルプレート（ｆｌａｔ
－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅｌｌ）にそれぞれ２０μ
ｌずつ添加した。他のウェル（ｗｅｌｌ）に陰性対照群である滅菌水を２０μｌ添加した
。ＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５（ＮＦ／ＩＬ８）細胞懸濁液を用意した後、フラッ
トボトム９６ウェルプレート（ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）
のウェル（ｗｅｌｌ）に細胞懸濁液１８０μｌ（１００００ｃｅｌｌｓ）をそれぞれ添加
し、２０～２４時間５％ＣＯ２および３７℃の条件下で培養した。
【0042】
４．ＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５細胞におけるＩＬ－８反応検出
ＱＵＡＮＴＩ－ＬｕｃＴＭはルシフェラーゼ反応に必要な安定化された基質などのすべて
の構成要素を含んでいて、ルシアルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）
の活性を定量的に測定可能な分析試薬である。ルシフェラーゼ反応で生成された発光（ｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）は光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて定量化すること
ができる。フラットボトム９６ウェルプレートのウェル（ｗｅｌｌ）あたりのＨＥＫ－Ｄ
ｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５（ＮＦ－κＢ／ＩＬ８）細胞培養上澄液を１０μｌずつそれぞれ
分注した後、５０μｌのＱＵＡＮＴＩ－ＬｕｃＴＭを添加し、直ちに光度計を用いて発光
を測定した。
ＱＵＡＮＴＩ－ＬｕｃＴＭはルシフェラーゼ反応に必要な安定化された基質などのすべて
の構成要素を含んでいて、ルシアルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）
の活性を定量的に測定可能な分析試薬である。ルシフェラーゼ反応で生成された発光（ｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）は光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて定量化すること
ができる。フラットボトム９６ウェルプレートのウェル（ｗｅｌｌ）あたりのＨＥＫ－Ｄ
ｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５（ＮＦ－κＢ／ＩＬ８）細胞培養上澄液を１０μｌずつそれぞれ
分注した後、５０μｌのＱＵＡＮＴＩ－ＬｕｃＴＭを添加し、直ちに光度計を用いて発光
を測定した。
【0043】
５．ＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５細胞におけるＮＦ－κＢ反応検出
ＱＵＡＮＴＩ－ＢｌｕｅＴＭは、細胞培養上澄液のような生物学的サンプルでアルカリン
ホスファターゼ活性（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、
ＡＰ）を測定するために開発された比色酵素分析試薬であり、ＡＰがある場合、桃色から
紫色－青色に変わる。フラットボトム９６ウェルプレートのウェル（ｗｅｌｌ）あたりの
ＱＵＡＮＴＩ－ＢｌｕｅＴＭ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１８０μｌずつ分注した後、誘導
されたＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５（ＮＦ－κＢ／ＩＬ８）細胞培養上澄液を２０
μｌずつそれぞれ添加した後、５－３０分間常温で反応させた後、６２０－６５５ｎｍで
分光光度計を用いてＳＥＡＰレベルを測定した。
ＱＵＡＮＴＩ－ＢｌｕｅＴＭは、細胞培養上澄液のような生物学的サンプルでアルカリン
ホスファターゼ活性（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、
ＡＰ）を測定するために開発された比色酵素分析試薬であり、ＡＰがある場合、桃色から
紫色－青色に変わる。フラットボトム９６ウェルプレートのウェル（ｗｅｌｌ）あたりの
ＱＵＡＮＴＩ－ＢｌｕｅＴＭ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１８０μｌずつ分注した後、誘導
されたＨＥＫ－ＤｕａｌＴＭ ｈＴＬＲ５（ＮＦ－κＢ／ＩＬ８）細胞培養上澄液を２０
μｌずつそれぞれ添加した後、５－３０分間常温で反応させた後、６２０－６５５ｎｍで
分光光度計を用いてＳＥＡＰレベルを測定した。
【0044】
実験結果
１．ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＴＬＲ５作用剤によるＧＶＨＤの抑制効果の検証
ＧＶＨＤマウスモデルを誘導した後、本発明のＴＬＲ５作用剤（「ＫＭＲＣ０１１」）に
よるＧＶＨＤの抑制効果を観察した。薬物の詳しい投与方法としては、授与者マウスにＫ
ＭＲＣ０１１ ２５μｇ／ｋｇ（▽）、ＫＭＲＣ０１１ ５０μｇ／ｋｇ（◇）、ＫＭＲ
Ｃ０１１ １００μｇ／ｋｇ（△）、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）（対照群；■）で前処
理および２日間隔で計５回腹腔内注射した。
１．ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＴＬＲ５作用剤によるＧＶＨＤの抑制効果の検証
ＧＶＨＤマウスモデルを誘導した後、本発明のＴＬＲ５作用剤（「ＫＭＲＣ０１１」）に
よるＧＶＨＤの抑制効果を観察した。薬物の詳しい投与方法としては、授与者マウスにＫ
ＭＲＣ０１１ ２５μｇ／ｋｇ（▽）、ＫＭＲＣ０１１ ５０μｇ／ｋｇ（◇）、ＫＭＲ
Ｃ０１１ １００μｇ／ｋｇ（△）、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）（対照群；■）で前処
理および２日間隔で計５回腹腔内注射した。
【0045】
各グループのマウスは耳に標識を付けて、１週間に２回ずつ体重、姿勢、活動性、毛状
態および皮膚密度を評価した。評価実験の結果、図１および図２に示されるように、ＧＶ
ＨＤマウスモデルのうち、ビヒクルグループは、体重が減少し、背中が曲がり、活動性が
低下し、毛の様相と皮膚強度に変化が生じた。これに対し、ＫＭＲＣ０１１投与グループ
では、前記の症状が著しく減少することを確認することができた。また、ＫＭＲＣ０１１
投与グループでは、ビヒクルグループに比べて生存率が大きく伸び、ＧＶＨＤ臨床評価指
標において症状が著しく減少することを確認した。
態および皮膚密度を評価した。評価実験の結果、図１および図２に示されるように、ＧＶ
ＨＤマウスモデルのうち、ビヒクルグループは、体重が減少し、背中が曲がり、活動性が
低下し、毛の様相と皮膚強度に変化が生じた。これに対し、ＫＭＲＣ０１１投与グループ
では、前記の症状が著しく減少することを確認することができた。また、ＫＭＲＣ０１１
投与グループでは、ビヒクルグループに比べて生存率が大きく伸び、ＧＶＨＤ臨床評価指
標において症状が著しく減少することを確認した。
【0046】
２．ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＴＬＲ５作用剤投与後の組織学的評価
ＧＶＨＤマウスモデルに、ＫＭＲＣ０１１を投与した後、動物モデルの腸、肝、皮膚、肺
組織を得て、４％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に固定した後、パラフ
ィンブロックを作り、Ｈ＆Ｅ染色で組織学的所見を分析した。その結果、図３に示される
ように、ビヒクルグループの腸では絨毛および粘膜が破壊され、肝および皮膚では炎症性
細胞の浸潤所見が現れているのに対し、ＫＭＲＣ０１１を投与したグループでは、正常な
組織学的所見と類似することが明らかになった。
ＧＶＨＤマウスモデルに、ＫＭＲＣ０１１を投与した後、動物モデルの腸、肝、皮膚、肺
組織を得て、４％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に固定した後、パラフ
ィンブロックを作り、Ｈ＆Ｅ染色で組織学的所見を分析した。その結果、図３に示される
ように、ビヒクルグループの腸では絨毛および粘膜が破壊され、肝および皮膚では炎症性
細胞の浸潤所見が現れているのに対し、ＫＭＲＣ０１１を投与したグループでは、正常な
組織学的所見と類似することが明らかになった。
【0047】
３．ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＴＬＲ５作用剤の投与によるＩＬ－２２とＩＬ－２
３の発現増加および腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の保護効果
ＧＶＨＤマウスモデルに、ＫＭＲＣ０１１を投与した後、ＩＬ－２２およびＩＬ－２３の
発現レベルおよび腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の保護効果を
評価した。図４に示されるように、ＴＬＲ５の発現が脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）と皮膚より小
腸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）で最も高く現れ、ＧＶＨＤマウスモデルにＫＭＲ
Ｃ０１１を投与した場合、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）でのＩＬ－２２とＩＬ－２３の発現
が大きく向上した。また、ＧＶＨＤ動物モデルでは、腸Ｌｇｒ５＋幹細胞（ｉｎｔｅｓｔ
ｉｎａｌ Ｌｇｒ５＋ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の減少が見られたが、ＧＶＨＤ動物モデル
にＫＭＲＣ０１１を投与したグループでは、Ｌｇｒ５＋幹細胞を効果的に保護することが
観察された（図４参照）。
３の発現増加および腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の保護効果
ＧＶＨＤマウスモデルに、ＫＭＲＣ０１１を投与した後、ＩＬ－２２およびＩＬ－２３の
発現レベルおよび腸幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の保護効果を
評価した。図４に示されるように、ＴＬＲ５の発現が脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）と皮膚より小
腸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）で最も高く現れ、ＧＶＨＤマウスモデルにＫＭＲ
Ｃ０１１を投与した場合、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）でのＩＬ－２２とＩＬ－２３の発現
が大きく向上した。また、ＧＶＨＤ動物モデルでは、腸Ｌｇｒ５＋幹細胞（ｉｎｔｅｓｔ
ｉｎａｌ Ｌｇｒ５＋ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の減少が見られたが、ＧＶＨＤ動物モデル
にＫＭＲＣ０１１を投与したグループでは、Ｌｇｒ５＋幹細胞を効果的に保護することが
観察された（図４参照）。
【0048】
４．本発明のＴＬＲ５作用剤とフラジェリンのＴＬＲ５反応活性の比較結果
ＴＬＲ５遺伝子の形質感染によって生成されたＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞においてＫＭＲＣ０
１１とフラジェリンのＴＬＲ５活性化効能を互いに比較した。ＨＥＫ－２９３レポーター
細胞を活用して光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）でＩＬ－８反応を確認した。その結果
、図５に示されるように、低い濃度で（０．００１～０．０１ｎｇ／ｍｌ）、フラジェリ
ンよりＫＭＲＣ０１１の活性化反応がはるかに高く現れた。これに対し、陰性対照群（ｎ
ｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）であるＬＰＳを処理した場合は、ＴＬＲ５の生物学的
活性が観察されなかった（図５）。また、同一の条件でアルカリンホスファターゼ活性（
ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＡＰ）反応測定方法で
ＮＦ－κＢ反応を確認した。その結果、図６に示されるように、０．０１ｎｍ／ｍｌの濃
度からフラジェリンよりＫＭＲＣ０１１の反応性がより高くなることを確認した。
ＴＬＲ５遺伝子の形質感染によって生成されたＨＥＫ－Ｄｕａｌ細胞においてＫＭＲＣ０
１１とフラジェリンのＴＬＲ５活性化効能を互いに比較した。ＨＥＫ－２９３レポーター
細胞を活用して光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）でＩＬ－８反応を確認した。その結果
、図５に示されるように、低い濃度で（０．００１～０．０１ｎｇ／ｍｌ）、フラジェリ
ンよりＫＭＲＣ０１１の活性化反応がはるかに高く現れた。これに対し、陰性対照群（ｎ
ｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）であるＬＰＳを処理した場合は、ＴＬＲ５の生物学的
活性が観察されなかった（図５）。また、同一の条件でアルカリンホスファターゼ活性（
ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＡＰ）反応測定方法で
ＮＦ－κＢ反応を確認した。その結果、図６に示されるように、０．０１ｎｍ／ｍｌの濃
度からフラジェリンよりＫＭＲＣ０１１の反応性がより高くなることを確認した。
【0049】
５．ＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデルにおけるＴＬＲ５作用剤によるＧＶＨＤの抑制
およびＧＶＴの上昇効果の検証
ＫＭＲＣ０１１の投与によるＧＶＨＤの抑制と同時にＧＶＴの上昇効果の極大化効果を
検証した。腫瘍を保有した動物モデルであるＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデルに放射線
照射３時間前にＫＭＲＣ０１１を１回腹腔内注射（５０ｕｇ／ｋｇ）した。ＫＭＲＣ０１
１を投与しないグループ（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＢＭＴグループ）は、体重が減少し、
背中が曲がり、活動性が低下し、毛の様相と皮膚強度に変化が生じてＧＶＨＤが発生した
のに対し、ＫＭＲＣ０１１を投与したグループ（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＢＭＴ＋ＫＭＲ
Ｃ０１１グループ）では、前記の症状が著しく減少することを確認することができた（図
７参照）。
およびＧＶＴの上昇効果の検証
ＫＭＲＣ０１１の投与によるＧＶＨＤの抑制と同時にＧＶＴの上昇効果の極大化効果を
検証した。腫瘍を保有した動物モデルであるＧＶＨＤおよびＧＶＴマウスモデルに放射線
照射３時間前にＫＭＲＣ０１１を１回腹腔内注射（５０ｕｇ／ｋｇ）した。ＫＭＲＣ０１
１を投与しないグループ（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＢＭＴグループ）は、体重が減少し、
背中が曲がり、活動性が低下し、毛の様相と皮膚強度に変化が生じてＧＶＨＤが発生した
のに対し、ＫＭＲＣ０１１を投与したグループ（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＢＭＴ＋ＫＭＲ
Ｃ０１１グループ）では、前記の症状が著しく減少することを確認することができた（図
７参照）。
【0050】
追加的に、生体内蛍光分光分析器（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ）を用いて腫瘍
を追跡、観察した。Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＢＭＴグループでは、一部腫瘍が確認された
のに対し、Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＢＭＴ＋ＫＭＲＣ０１１グループでは、腫瘍が確認さ
れなかった。ＫＭＲＣ０１１は、ＧＶＨＤを抑制すると同時にＧＶＴ効果を上昇させるこ
とができる画期的な治療剤であることを立証した（図８参照）。
を追跡、観察した。Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＢＭＴグループでは、一部腫瘍が確認された
のに対し、Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＢＭＴ＋ＫＭＲＣ０１１グループでは、腫瘍が確認さ
れなかった。ＫＭＲＣ０１１は、ＧＶＨＤを抑制すると同時にＧＶＴ効果を上昇させるこ
とができる画期的な治療剤であることを立証した（図８参照）。
【産業上の利用可能性】
【0051】
本発明は、フラジェリンから誘導されたＴＬＲ５作用剤を有効成分として含む移植片対宿
主疾患の予防または治療用組成物に関し、本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５
作用剤は、優れた移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療効果を示す。
主疾患の予防または治療用組成物に関し、本発明のフラジェリンから誘導されたＴＬＲ５
作用剤は、優れた移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の治療効果を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】