特開 2023-156551 糖飢餓条件下での植物体においてタンパク質を生産する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023156551

(43)【公開日】2023-10-25

(54)【発明の名称】糖飢餓条件下での植物体においてタンパク質を生産する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/02 20060101AFI20231018BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20231018BHJP

   C12N 15/82 20060101ALI20231018BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20231018BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20231018BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20231018BHJP

【ＦＩ】

C12P21/02 H

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/82 150Z

A01H1/00 A

C12N15/19

C12N5/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022065963

(22)【出願日】2022-04-13

(71)【出願人】

【識別番号】000253503

【氏名又は名称】キリンホールディングス株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504143441

【氏名又は名称】国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100182305

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 鉄平

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100221958

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 真希恵

(74)【代理人】

【識別番号】100192441

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 仁

(72)【発明者】

【氏名】加藤 晃

(72)【発明者】

【氏名】山▲崎▼ 将太朗

(72)【発明者】

【氏名】佐藤（窪村） 有紗

(72)【発明者】

【氏名】山口（西村） 明日香

(72)【発明者】

【氏名】小原 一朗

【テーマコード（参考）】

2B030

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AB03

2B030AD04

2B030AD07

2B030AD20

2B030CB02

4B064AG13

4B064CA11

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA11

4B065AA88X

4B065AA88Y

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC03

4B065CA24

4B065CA53

(57)【要約】      （修正有）

【課題】糖飢餓条件下での植物体においてタンパク質を生産する方法を提供する。
【解決手段】特定の配列に示されるイネ由来アミラーゼ３Ｄの５’ＵＴＲのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの上流に連結されているプロモーターと、該ポリヌクレオチドの下流に作動可能に連結されている遺伝子と、ターミネーターとを含む発現カセットが導入された植物体を、糖飢餓条件下で培養することを含む、糖飢餓条件下での前記遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法であって、前記遺伝子における転写が前記ポリヌクレオチドの一番目のヌクレオチド残基より開始されることを特徴とする、前記方法。

【請求項2】

プロモーターが、配列番号１におけるヌクレオチド番号１～９８３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

植物体が、イネ由来細胞である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

遺伝子が、ｂＦＧＦ遺伝子である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド（以下、「本件ポリヌクレオチド」ということがある）と、該ポリヌクレオチドの上流に連結されているプロモーターと、該ポリヌクレオチドの下流に作動可能に連結されている遺伝子と、ターミネーターとを含む発現カセットが導入された植物体（以下、「本件植物体」ということがある）を、糖飢餓条件下で培養することを含む、糖飢餓条件下での前記遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法であって、前記遺伝子における転写が前記ポリヌクレオチドの一番目のヌクレオチド残基より開始されることを特徴とする、前記方法（以下、「本件方法」ということがある）に関する。

【背景技術】

【0002】

植物細胞において、目的タンパク質を発現する発現カセットを遺伝子導入し、形質転換体を得た後、当該形質転換体を培養することにより、目的タンパク質を産生することができる。

【0003】

一方で、形質転換体を培養する際、環境ストレスにより目的タンパク質の翻訳効率が低下することが知られている。特許文献１には、シロイヌナズナの６種類の遺伝子の５’ＵＴＲ（five prime untranslated region）が、ストレス条件下でのタンパク質の翻訳抑制を回避する作用を有することが開示されている。また、特許文献２には、イネの４種類の遺伝子の５’ＵＴＲが、単子葉植物において組み換えタンパク質の高発現を可能にする作用を有することが開示されている。しかしながら、イネの糖飢餓ストレス下でタンパク質の高発現を可能にする作用は明らかにされていない。

【0004】

アミラーゼ３Ｄプロモーターの制御下の遺伝子は、糖類の存在下でｍＲＮＡの蓄積が抑制されるのに対して（非特許文献１）、糖飢餓ストレス条件下では発現が誘導されることが報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、当該遺伝子に関するどの領域が、糖飢餓ストレス条件下での遺伝子発現に必要であるのかについては不明であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１３／０３１８２１号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２０１９／１９８７２４号パンフレット

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】E. E. Karrer et al., Metabolic regulation ofrice alpha-amylase and sucrose synthase genes in planta. Plant J., 1992;2(4):517-523.

【非特許文献2】Y.-S. Hwang et al., Three cis-elements required for rice α-amylase Amy3D expression during sugar starvation. Plant Mol Biol., 1998;36:331-341.

【非特許文献3】S. B. Poudel et al., Localsupplementation with plant-derived recombinant human FGF2 protein enhances bone formation in critical-sized calvarial defects. J Bone Miner Metab., 2019;37:900-912.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、イネ由来アミラーゼ３Ｄ遺伝子の開始コドンより上流の領域に含まれ、植物体を糖飢餓条件下で培養したときに、タンパク質の翻訳抑制を回避する作用を有する領域を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、糖飢餓条件下での植物体において、イネ由来アミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下にある遺伝子の転写開始点を解析し、それらが１か所に集中すること、またその遺伝子の転写産物が、糖飢餓条件下でも活発な翻訳状態にあることを見出した。また、糖飢餓条件下では当該上流配列からの転写産物が、一定の５’ＵＴＲのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２に示されるヌクレオチド配列）を保持しており、そのことが高効率な転写産物の産生に寄与していることや、転写産物からの翻訳に必要な領域（すなわち、翻訳エンハンサー）であることを確認した。本発明はこれらの知見に基づき、完成するに至ったものである。

【0009】

すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの上流に連結されているプロモーターと、該ポリヌクレオチドの下流に作動可能に連結されている遺伝子と、ターミネーターとを含む発現カセットが導入された植物体を、糖飢餓条件下で培養することを含む、糖飢餓条件下での前記遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法であって、前記遺伝子における転写が前記ポリヌクレオチドの一番目のヌクレオチド残基より開始されることを特徴とする、前記方法；
〔２〕プロモーターが、配列番号１におけるヌクレオチド番号１～９８３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕植物体が、イネ由来細胞である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕遺伝子が、ｂＦＧＦ遺伝子である、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法；

【発明の効果】

【0010】

本件ポリヌクレオチドは、植物体において転写開始点の機能を有し、また、翻訳エンハンサー機能を有するため、本件ポリヌクレオチドを目的のタンパク質の発現カセットに挿入し、該発現カセットを植物体へ遺伝子導入することにより、当該植物体を糖飢餓条件下で培養したときに、高効率で目的のタンパク質を発現させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；basic fibroblast growth factor）発現カセットの模式図である。

【図2】本培養のサンプリングポイントにおけるＢｒｉｘ（ショ糖の重量％）を測定した結果を示す図である。

【図3】図３（Ａ）は、ｂＦＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ蓄積量を測定した結果を示す図である。図３（Ｂ）は、イネ由来アミラーゼ３ＤのｍＲＮＡ蓄積量を測定した結果を示す図である。

【図4】ｂＦＧＦタンパク質の上清発現量（図４（Ａ））及び細胞内蓄積量（図４（Ｂ））を測定した結果を示す図である。

【図5】同定されたイネ由来アミラーゼ３Ｄの上流配列の転写開始点の模式図である。より具体的には、発現カセットのうち転写開始点周辺の拡大図である。発現カセットの構成要素をバーで示す。転写開始点は、ＣＡＧＥ解析によって同定された培養０日目のデータを黒三角で、１０日目のデータを白三角で、ＲＡＰ－ＤＢ上に登録されている情報を灰三角で記載している。最も使用頻度が高い転写開始点（ＴＳＳ）は1st-TSS、２番目に高い転写開始点は2nd-TSS、３番目に高い転写開始点は3rd-TSS、ＲＡＰ－ＤＢ上に登録されている転写開始点はdb-TSSと記した。

【図6】図６（Ａ）は、全遺伝子について、糖飢餓条件下でのＴＰＭ値の分布を示す図である。矢印はイネ由来アミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下の転写産物の位置を示す。図６（Ｂ）は、全遺伝子について、糖飢餓条件下での発現変動（Fold change値）分布を示す図である。矢印はイネ由来アミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下の転写産物の位置を示す。

【図7】ｂＦＧＦのＰＲ値（図７（Ａ））及びイネ由来アミラーゼ３ＤのＰＲ値（図７（Ｂ））を測定した結果を示す図である。

【図8】４種類の遺伝子（Os11g0546900［図７（Ａ）］、Os01g0191100［図７（Ｂ）］、Os02g0284600［図７（Ｃ）］、及びOs03g0685900［図７（Ｄ）］）のＰＲ値を測定した結果を示す図である。

【図9】ポリソームプロファイルを示す図である。

【図10】イネ由来アミラーゼ３Ｄの上流配列の転写開始点の特性をまとめた図である。より具体的には、図１０（Ａ）は、rTSS-usageの分布とイネ由来アミラーゼ３Ｄの上流配列の転写開始点の位置を示す図である。図１０（Ｂ）は、遺伝子全体のShifting scoreの分布とイネ由来アミラーゼ３Ｄの上流配列の転写開始点の位置を示す図である。

【図11】本願実施例の実験によって判明した情報を追記した、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；basic fibroblast growth factor）発現カセットの模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本件タンパク質を生産する方法（本件方法）は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド（すなわち、本件ポリヌクレオチド）と、該本件ポリヌクレオチドの上流に連結されているプロモーターと、該本件ポリヌクレオチドの下流に作動可能に連結されている遺伝子と、ターミネーターとを含む発現カセットが導入された植物体（すなわち、本件植物体）を、糖飢餓条件下で培養することを含む、糖飢餓条件下での前記遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法であって、前記遺伝子における転写が前記本件ポリヌクレオチドの一番目のヌクレオチド残基より開始される、前記方法であれば特に制限されない。本件方法を実施すると、本件ポリヌクレオチドによる効果（具体的には、植物体における転写開始機能および翻訳エンハンサー機能）により、糖飢餓条件において、前記遺伝子がコードするタンパク質の生産を高効率で行うことができる。

【0013】

本明細書において、「植物体」とは、植物の一部又は全体を意味し、ここで植物の一部としては、例えば、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁、種子、実）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束）、植物細胞、植物細胞から細胞壁を取り除いた細胞（すなわち、プロトプラスト）等を挙げることができ、植物細胞が好ましい。

【0014】

上記植物体における植物としては、例えば、トマト、ピーマン、トウガラシ、ナス、タバコ等のナス類；キュウリ、カボチャ、スイカ等のウリ類；キャベツ、ブロッコリー、ハクサイ、シロイヌナズナ等の菜類；セルリー、パセリー、レタス等の生菜・香辛菜類；ネギ、タマネギ、ニンニク等のネギ類；ダイズ、ラッカセイ、インゲン、エンドウ、アズキ、リョクトウ、ササゲ、ソラマメ等の豆類；イチゴ、メロン等のその他果菜類；ダイコン、カブ、ニンジン、ゴボウ等の直根類；サトイモ、キャッサバ、ジャガイモ、サツマイモ、ナガイモ等のイモ類；イネ、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、オオムギ、ライムギ、ミナトカモジグサ、ソバ等の穀類；アスパラガス、ホウレンソウ、ミツバ等の柔菜類；トルコギキョウ、ストック、カーネーション、キク等の花卉類；ベントグラス、コウライシバ等の芝類；ナタネ、ラッカセイ、セイヨウアブラナ、ナンヨウアブラギリ等の油料作物類；ワタ、イグサ等の繊維料作物類；クローバー、デントコーン、タルウマゴヤシ等の飼料作物類；リンゴ、ナシ、ブドウ、モモ、キウイフルーツ等の落葉性果樹類；ウンシュウミカン、オレンジ、レモン、グレープフルーツ等の柑橘類；サツキ、ツツジ、スギ、ポプラ、パラゴムノキ、イチョウ、マツ等の木本類；などを挙げることができ、穀類が好ましく、イネがより好ましい。したがって、上記植物体としては、イネ由来細胞を好適に例示することができる。

【0015】

本明細書において、「プロモーター」とは、植物体において、植物体由来の転写開始複合体（すなわち、転写基本因子群及びＲＮＡポリメラーゼからなる複合体）が結合し、その下流に位置する遺伝子がコードするｍＲＮＡの転写を開始させる領域を意味する。なお、本発明において、プロモーターは、本件ポリヌクレオチドの上流に連結されている。

【0016】

上記プロモーターとしては、イネ由来アミラーゼ３Ｄプロモーター（配列番号１におけるヌクレオチド番号１～９８３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド）であってもよいし、別のプロモーターであってもよい。ここで別のプロモーターとしては、例えば、グルテリン遺伝子のプロモーター（Takaiwa,F.et al.,Plant Mol.Biol.,17,875-885,1991）、グリシニン遺伝子のプロモーター、ファゼオリン遺伝子のプロモーター（Murai,N.et al.,Science,222,476-482,1983）、クルシフェリン遺伝子のプロモーター（Rodin,J.et al.,Plant Mol.Biol.,20,559-563,1992）、後述する本実施例で同定された４種類の遺伝子（Os11g0546900、Os01g0191100、Os02g0284600、又はOs03g0685900）のプロモーター等を挙げることができる。

【0017】

本明細書において、転写開始点とは、植物体に導入された本件ポリヌクレオチドのうち、プロモーター及びエンハンサーの下流に作動可能に連結されている遺伝子がｍＲＮＡに転写されるにあたり、第一番目のヌクレオチド残基となるヌクレオチドを意味する。

【0018】

本明細書において、「本件ポリヌクレオチドの下流に作動可能に連結されている遺伝子」とは、遺伝子がコードするｍＲＮＡが転写されるように、プロモーター及び本件ポリヌクレオチドの下流に連結されている遺伝子を意味する。

【0019】

本明細書において、「遺伝子」としては、植物由来の遺伝子であっても、非植物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、サル等）由来の遺伝子であってもよく、例えば、光合成関連遺伝子；医療適用されているペプチド又はポリペプチド（例えば、ｂＦＧＦ、成長ホルモン［ＧＨ］ペプチド、副甲状腺ホルモン［ＰＴＨ］ペプチド、エリスロポエチン［ＥＰＯ］ペプチド、グルカゴン様ペプチド１受容体［ＧＬＰ－１Ｒ］リガンドペプチド、ナトリウム利尿ペプチド等）生産遺伝子；糖代謝関連遺伝子；耐病虫害性（例えば、昆虫食害抵抗性、カビ［菌類］及び細菌病抵抗性、ウイルス抵抗性等〕遺伝子；環境ストレス（例えば、低温、高温、乾燥、光障害、紫外線等）耐性関連遺伝子；植物生長制御（促進／抑制）遺伝子；遺伝子治療用関連遺伝子；抗体遺伝子；などを挙げることができ、後述する本実施例でその効果が実証されているため、ｂＦＧＦ産生遺伝子（すなわち、ｂＦＧＦ遺伝子）を好適に例示することができる。

【0020】

本明細書において、「ターミネーター」とは、本件発現カセットにおいて、遺伝子の転写を終了させる作用を有する核酸配列であれば特に制限されない。かかるターミネーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のターミネーター、シロイヌナズナ由来ＨＳＰ［heat shock protein］遺伝子のターミネーターなどが挙げられる。

【0021】

本明細書において、「発現カセット」（以下、「本件発現カセット」ということがある）とは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドと、該本件ポリヌクレオチドの上流に連結されているプロモーターと、該本件ポリヌクレオチドの下流に作動可能に連結されている遺伝子と、ターミネーターとを含むポリヌクレオチドを意味する。

【0022】

本件発現カセットとしては、発現カセットそれ自体であってもよいが、本件発現カセットを含むベクターであることが好ましく、本件発現カセットを含むプラスミドであることがより好ましく挙げられる。

【0023】

上記ベクターとしては、本件ポリヌクレオチドと、該本件ポリヌクレオチドの上流に連結されているプロモーターと、該本件ポリヌクレオチドの下流に作動可能に連結されている遺伝子と、ターミネーターに加えて、さらに、シグナルペプチド（例えば、イネ由来αアミラーゼのシグナルペプチド、イネ由来グルテリン［glutelin］のシグナルペプチド、植物の病原菌誘導プロテアーゼのシグナルペプチド）をコードするポリヌクレオチド、イントロン、ポリＡ付加シグナル、５’ＵＴＲ配列、ベクターが導入された植物体を選択するためのマーカー遺伝子（すなわち、選択マーカー遺伝子）（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子）等が、連結されたものであってもよいし、連結されないものであってもよい。なお、本明細書において、「上流」とは、本件発現カセットにおける遺伝子の転写方向に対して上流側を意味し、また、「下流」とは、本件発現カセットにおける遺伝子の転写方向に対して下流側を意味する。

【0024】

上記ベクターは、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非ウイルスベクター（例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、人工染色体ベクター）やウイルスベクターを挙げることができる。また、ベクターは、環状のものであっても線状のものであってもよい。

【0025】

本件ポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。本件ポリヌクレオチドは、その下流に連結された遺伝子がコードするタンパク質が発現する際の転写開始点を有し、翻訳エンハンサー機能も有するポリヌクレオチドである。転写開始点は本件ポリヌクレオチドの一番目のヌクレオチド残基である。配列番号２のヌクレオチド配列は、イネ由来アミラーゼ３Ｄ遺伝子の５’ＵＴＲ配列であり、転写開始点の機能と、翻訳エンハンサーの機能を有している。本件ポリヌクレオチドの中でも、配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが好ましく挙げられる。

【0026】

本明細書において、「少なくとも９０％の配列同一性」とは、対象の配列全体に対する配列同一性が９０％以上であることを意味し、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、特により好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の同一性を意味する。

【0027】

本明細書において、「配列同一性」との用語は、ポリヌクレオチド配列の近似性の程度（これは、クエリー配列と他の好ましくは同一の型の配列（核酸若しくはタンパク質配列）とのマッチングにより決定される）を意味する。「配列同一性」を計算及び決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧ ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（Altschulet al.,J.Mol.Biol.1990,215:403-410;Altschul et al.,Nucleic Acids Res.1997,25:3389-3402;Devereux et al.,Nucleic Acid Res.1984,12:387）、並びにＢＬＡＳＴＮ ２．０（Gish W.,http://blast.wustl.edu,1996-2002）、並びにＦＡＳＴＡ（Pearson及びLipman,Proc. Natl.Acad.Sci.USA1988,85:2444-2448）、並びに最も長く重複した一対のコンティグを決定及びアライメントするＧＣＧ ＧｅｌＭｅｒｇｅ（Wibur及びLipman,SIAMJ.Appl.Math.1984,44:557-567;Needleman及びWunsch,J.Mol.Biol.1970,48:443-453）を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0028】

本明細書において、「配列番号Ｘのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する」とは、換言すると、配列番号Ｘのヌクレオチド配列において、０、１若しくは数個のヌクレオチド残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたヌクレオチド配列を有し、且つ、配列番号Ｘのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと同等の機能を有することを意味する。ここで、「１若しくは数個のヌクレオチド残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１～３０個の範囲内、好ましくは１～２０個の範囲内、より好ましくは１～１５個の範囲内、さらに好ましくは１～１０個の範囲内、さらにより好ましくは１～５個の範囲内、特に好ましくは１～３個の範囲内、最も好ましくは１～２個の範囲内の数のヌクレオチド残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたヌクレオチド配列を意味する。これらヌクレオチド残基の変異処理は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発等の当業者に既知の任意の方法により行うことができる。

【0029】

本件植物体は、本件ポリヌクレオチド等を含む本件発現カセットを、植物体の種類や性質に応じた任意の遺伝子導入法を用いて、植物体に導入することにより得ることができる。かかる遺伝子導入方法としては、特に制限されず、例えば、プラスミド等のベクターを使用した方法や、直接導入法が挙げられる。プラスミド等のベクターを使用した方法としては、アグロバクテリウム法などを挙げることができる。前述の直接導入法としては、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、ウイスカ直接導入法等を挙げることができる。本発明においては、プラスミドを使用する方法が好ましく、中でも、本件発現カセットを含むベクター（以下、本件ベクターともいう）、好ましくは本件発現カセットを含むプラスミドをアグロバクテリウム法で導入する方法が好ましい。

【0030】

本件発現カセットを植物体へ導入する方法としては、このように本件ベクターを使用して、または使用しないで本件発現カセットを植物体に導入する方法以外に、例えば、まず、ゲノムＤＮＡ内に本件発現カセットを保持する植物体（すなわち、本件植物体）を作出し、次いで、本件植物体と植物体を交配させる方法を挙げることができる。一旦、ゲノムＤＮＡ内に本件発現カセットが導入された形質転換植物体（すなわち、本件植物体）が得られれば、該植物体から有性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該形質転換植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本件ポリヌクレオチドを用いることにより、本件発現カセットから発現した遺伝子産物を、本件植物体中に高度に蓄積させることができる。これにより、本件植物体中に蓄積させる遺伝子産物の特性に応じて、例えば、植物体の栄養性、加工特性、健康増進特性などを効果的に改変することができるし、また、前述した、医療適用されているペプチド又はポリペプチドを植物体中に蓄積させることにより、効率的に医薬品を製造することも可能となる。

【0031】

本件方法における培養は、例えば、ゲランガム、アガロース等により固化した培養培地の上又は液体状の培養培地中に、本件植物体を静置又は振盪し、適切な培養培地、適切な培養温度、適切な明暗条件、適切な酸素濃度（例えば、正常酸素濃度［例えば、１８～２２％Ｏ_２］）、適切な培養期間などの条件下で行うことができる。上記培養培地としては、本件植物体の生存、増殖（生育）可能な培地であれば特に制限されず、主成分をチュー（Ｎ６）培地用混合塩類、ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類とする培地を挙げることができ、主成分に加えて、グリシン、ピリドキシン塩酸塩、ニコチン酸、チアミン塩酸塩、myo-イノシトール、Ｌ－プロリン、バクトカザミノ酸等の有機成分；2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、カイネチン等の植物ホルモン；アカルボース、スタキオース等の四糖類；デキストラン等の多糖類；エリトリトール、グリセリン、ヒドロキシエチルスターチ、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール；スクロース等の炭素源などの任意成分をさらに含むものを挙げることができる。なお、本件ベクターが選択マーカー遺伝子を含む場合、上記培養培地には、その遺伝子に対応する薬剤（例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、ビアラホス、ブラストサイジンＳ、カルベニシリン）が含まれる。

【0032】

上記培養温度としては、特に制限されず、例えば、２０～４０℃の範囲内であり、好ましくは２５～３５℃、より好ましくは２７～２９℃である。

【0033】

上記培養期間としては、特に制限されず、例えば、３～４０日間の範囲内、好ましくは３～３５日間、より好ましくは３～３０日間、さらに好ましくは３～２５日間、特に好ましくは３～２１日間である。

【0034】

本件植物体を振盪条件下で培養する場合の振盪速度としては、例えば、６０～２２０ｒｐｍの範囲内、好ましくは８０～１３０ｒｐｍ、より好ましくは１００～１２０ｒｐｍである。

【0035】

本明細書において、「糖飢餓条件」とは、通常のＢｒｉｘ（すなわち、ショ糖の重量％（％））よりも低下した条件、又は糖類が存在しない条件を意味し、ここでＢｒｉｘとしては、例えば、全糖類の濃度が、０～２５（ｇ／Ｌ）の範囲内、好ましくは０～２０（ｇ／Ｌ）、より好ましくは０～１５（ｇ／Ｌ）、さらにより好ましくは０～１０（ｇ／Ｌ）である。また、上記「通常の糖類の濃度よりも低下した条件」としては、例えば、通常の糖類の濃度に対して８０％以下（好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、さらにより好ましくは５０％以下、特に好ましくは４０％以下、特により好ましくは３５％以下）低下した条件を挙げることができる。

【0036】

本明細書において、「糖類」とは、単糖類又は二糖類を意味する。単糖類としては、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アロース、フコース等を挙げることができ、二糖類としては、例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、ラクトース等を挙げることができる。糖類には、Ｄ体、Ｌ体、又はラセミ体が含まれる。

【0037】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

【実施例0038】

（１）アミラーゼ３Ｄの上流配列を使用したｂＦＧＦ発現イネ形質転換細胞の取得
ア）方法及び結果
実施例１で使用する培地は、主要成分として、チュー（Ｎ６）培地用混合塩類又はムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類；有機物として、グリシン、ピリドキシン塩酸塩、ニコチン酸、チアミン塩酸塩、myo-イノシトール、Ｌ－プロリン、及びバクトカザミノ酸；植物ホルモンとして、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、及びカイネチン；炭素源として、スクロース及びソルビトール；固体培地のゲル化剤として、ゲランガム；並びに、形質転換細胞を選択するための抗生物質として、ハイグロマイシン及びカルベニシリン二ナトリウム；を、実験目的に合わせて表１に示すとおりに調製し、水酸化カリウム溶液でｐＨ５．７に合わせて使用した。イネ由来アミラーゼ３Ｄ（Ａｍｙ３Ｄ）遺伝子（Accession No. BAT05863）において、５’ＵＴＲ（5’ untranslated region）を含むアミラーゼ３Ｄの開始コドンから上流１０７５ｂｐの範囲の配列（配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド）（表２）の下流に、イネ由来グルテリン（Accession No. AY585231）のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、ヒト由来ｂＦＧＦ（Accession No. NM_001361665）遺伝子、及びシロイヌナズナ由来ＨＳＰ（heat shock protein）（Accession No. At5g59720）遺伝子のターミネーターを挿入し、図１の発現カセットを構築した。株式会社のうけんより購入したイネ（Oryza sativa cv. Nipponbare）種子を表１のカルス増殖用培地上で２８℃、暗所で３～４週間培養し、得られた培養細胞に対して、アグロバクテリウム法で図１の発現カセットを遺伝子導入した。表１の選抜用培地上にて２８℃、暗所で３～４週間培養し、イネ形質転換Ｔ_０細胞を取得した。表１の再分化用培地を用いて形質転換Ｔ_０細胞を３０℃、明所で３～４週間培養し、再分化したＴ_０植物体を２８℃、「１６時間明期－８時間暗期」の条件で栽培し、Ｔ_１種子を獲得した。Ｔ_１種子を表１の選抜用培地上で２８℃、暗所で３～４週間培養し、得られたイネ形質転換Ｔ_１細胞を以下の試験に供した。

【0039】

【表1】

【0040】

【表2】

【0041】

（２）糖飢餓状態での翻訳状況
ア）目的
アミラーゼ３Ｄの上流配列による糖飢餓誘導発現を利用したｂＦＧＦタンパク質の分泌発現系における、ｂＦＧＦ遺伝子のｍＲＮＡの翻訳状況を調べる。

【0042】

イ）方法
サンプリングを行う本培養に先立ち、２回の前培養を行った。具体的には、上記（１）で得た０．１６～１．４ｍｍの大きさのＴ_１細胞を、フラスコ内に０．１ｇ置床して、表１の液体培養用培地３０ｍＬに、カルベニシリン及びハイグロマイシンを各々終濃度５０ｍｇ／Ｌになるよう添加して前培養（１）を行った。２週間後、前培養（１）の培養上清を全量抜き取った後、新たな液体培養用培地を３０ｍＬ加え、前培養（２）を５日間行った。５日後、前培養（２）の培養上清を全量抜き取り、新たな液体培養用培地を３０ｍＬ加え、本培養を３週間行った。本培養開始後０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、及び２１日目に、培養上清１ｍＬ（残糖度測定用、タンパク質発現量確認用）と、細胞０．７ｇ（ＲＮＡ抽出用及びタンパク質抽出用）を各フラスコよりサンプリングした。前培養（１）及び前培養（２）と、本培養は、２８℃、暗期、旋回速度１１０ｒｐｍ（ＥＹＥＬＡ：MULTI SHAKER）の条件で培養した。サンプリング日数分のフラスコ（２連）を使用して培養し、サンプリング日ごとに別のフラスコからサンプリングした。
本培養でサンプリングした培養上清を使用し、残糖度を屈折計（ＡＴＡＧＯ：RX-5000i-Plus）で測定した。
本培養でサンプリングした細胞０．１ｇから、ＲＮＡ抽出キットRNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN：74904）を用いて全ＲＮＡを抽出後、逆転写反応キットSuperScript IVFirst-Strand Synthesis System（Thermo Fisher Scientific：18091050）で逆転写反応を行い、ＰＣＲ試薬TB Green Premix ExTaq II（Tli RNaseH Plus）（Takara：RR820S）でリアルタイムＰＣＲ反応を実施することにより、３種類の遺伝子（外来性ｂＦＧＦ遺伝子、内在性アミラーゼ３Ｄ遺伝子、及びユビキチン５［ＵＢＱ５］［Accession No.Q9ARZ9］遺伝子）のｍＲＮＡの蓄積量を調べた。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーは表３のとおりである。なお、ＵＢＱ５遺伝子のｍＲＮＡの蓄積量は、内部標準として用いた。
また、本培養でサンプリングした細胞０．１ｇを使用し、プロテアーゼインヒビター（Sigma：P9599）を加えたリン酸緩衝液０．３ｍＬで細胞内の粗タンパク質を抽出した。ＥＬＩＳＡキットFGF2 Human ELISA Kit（Thermo Fisher Scientific：KHG0021）を用いて、ｂＦＧＦタンパク質の細胞内蓄積量と培養上清中の発現量を調べた。

【0043】

【表3】

【0044】

ウ）結果
培地中の残糖度（すなわち、ショ糖の重量％）（表１）のモニタリングの結果、少なくとも本培養３日目において、本培養開始当初のＢｒｉｘ（３０ｇ／Ｌ）から約１／３（１０ｇ／Ｌ）まで低下しており（図２）、糖飢餓状態となっていることがわかった。なお、各サンプリングポイントの独立した２フラスコ間で、糖度に大きな差はなかった。
また、ｂＦＧＦ遺伝子のｍＲＮＡは、本培養１０日目及び１４日目に蓄積量のピークを迎え（図３（Ａ））、アミラーゼ３Ｄ遺伝子のｍＲＮＡは、本培養１４日目及び１７日目に蓄積量のピークを迎えた（図３（Ｂ））。
一方、培養上清中のｂＦＧＦタンパク質発現量は、本培養７日目（糖飢餓条件下で４日間培養）、本培養１７日目（糖飢餓条件下で１４日間培養）、及び本培養２１日目（糖飢餓条件下で１８日間培養）にピークを迎え（図４（Ａ））、細胞内のｂＦＧＦタンパク質蓄積量は、培養１７日目にピークを迎えた（図４（Ｂ））。
上述のとおり、培養３日目以降は糖飢餓ストレスに晒された状態である。一般的に糖飢餓ストレス下では、糖代謝・呼吸や、硝酸還元・同化、タンパク質合成に関わる酵素活性が低下することが知られている（文献「S-M Yu, Cellular and Genetic Responses of Plants to Sugar Starvation.Plant Physiol., 1999;121(3):687-693.」）。そのようなストレス条件下である培養３日目以降においても、アミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下での２種類の遺伝子（外来性ｂＦＧＦ及び内在性アミラーゼ３Ｄ）のｍＲＮＡは、蓄積量を増加させてピークを迎え、またアミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下での外来性ｂＦＧＦタンパク質の発現量も、培養３日目以降にピークを迎えた。

【0045】

エ）結論
アミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下での外来性ｂＦＧＦ遺伝子の転写と翻訳、及びアミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下での内在性アミラーゼ３Ｄの転写は、糖飢餓状態下でも抑制されなかった。

【実施例0046】

ＣＡＧＥ（Cap Analysis of Gene Expression）解析による転写開始点の同定
ア）目的
ストレス条件下での遺伝子発現抑制の原因の一つに転写開始点の分散現象が示唆されている。糖飢餓ストレス下においてもｂＦＧＦの発現抑制が確認されない現象について考察するため、アミラーゼ３Ｄプロモーターの糖飢餓ストレス条件下での転写開始点を同定することとした。

【0047】

イ）方法：
ＣＡＧＥ解析は、対象となる細胞で産生されるｍＲＮＡをゲノムデータベースと照合し、解析することで、ゲノム上の転写開始点の同定と転写開始点毎の転写産物（ｍＲＮＡ）量の定量を行う方法である（文献「M. Murata et al., Detecting Expressed Genes Using CAGE. Methods MolBiol., 2014;1164:67-85.」）。
実施例１でサンプリングした本培養開始後０日目及び１０日目の細胞０．５ｇから、ＲＮＡ抽出キットRNeasy Plant MiniKit（QIAGEN：74904）を用いて全ＲＮＡを抽出後、ランダムプライマーと逆転写反応試薬を使って逆転写し、得られたｃＤＮＡをビオチン化した。系に残存したＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩ処理（Promega:M4261）を施し、ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズでＣａｐトラッピングを行った。これにより、Ｃａｐを有するｍＲＮＡの末端まで逆転写が伸長したｃＤＮＡのみが得られた。その後、得られたｃＤＮＡにアダプター配列の付加と、相補鎖合成を行い、ＣＡＧＥライブラリーを調製した。得られたライブラリーについて、次世代シーケンサー（Illumina社製：Genome Analyzer IIx & Hiseq 2000）を用いて５’アダプター側からシングルリードでのシーケンスを行うことで、ＣＡＧＥリードに供するデータを取得した。
ＣＡＧＥリード用データは、ＲＡＰ－ＤＢ（The Rice Annotation Project Database、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構［農研機構］より提供）にて提供されているＩＲＧＳＰ－１．０（International Rice Genome Sequencing Project 1.0、国際イネゲノム塩基配列解読プロジェクト）の配列情報を基にマッピングを行った。さらに、データ処理を行い転写開始点の同定を行った。

【0048】

ウ）結果
アミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下の外来性ｂＦＧＦ遺伝子及び内在性アミラーゼ３Ｄ遺伝子について、転写開始点を解析した。
その結果、最も使用頻度が高い転写開始点として、内在性遺伝子Os08g0473900の２番（Os08t0473900-02）と３番（Os08t0473900-03）のアイソフォームのＲＡＰ－ＤＢ上に登録されている転写開始点が同定された。具体的には、アミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下で転写される外来性ｂＦＧＦ遺伝子及び内在性アミラーゼ３Ｄ遺伝子の全ｍＲＮＡのうち、本培養後０日目及び１０日目においてそれぞれ７４％及び８４％がこの位置から転写されていることがわかった（図５）。転写開始点が一致しない場合でも、この位置とかなり近い位置に集中して存在していた（図５）。
したがって、糖飢餓ストレス下におけるアミラーゼ３Ｄの上流配列の制御下の遺伝子の転写開始点は分散傾向が低く、転写の正確性が維持されていることが示唆された。