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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023157312
(43)【公開日】2023-10-26
(54)【発明の名称】エンベロープウイルス不活性化組成物
(51)【国際特許分類】
A01N 33/12 20060101AFI20231019BHJP
A01N 31/02 20060101ALI20231019BHJP
A01P 1/00 20060101ALI20231019BHJP
【ＦＩ】
A01N33/12 101
A01N31/02
A01P1/00
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022067133
(22)【出願日】2022-04-14
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002620
【氏名又は名称】弁理士法人大谷特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】白石 晶子
(72)【発明者】
【氏名】早瀬 温子
(72)【発明者】
【氏名】高田 郁実
【テーマコード（参考）】
4H011
【Ｆターム（参考）】
4H011AA04
4H011BA06
4H011BB03
4H011BB04
4H011DA13
4H011DG05
(57)【要約】
【課題】高頻度に使用しても、肌荒れ、皮膚炎、アレルギーなどを引き起こすことがなく、消防法などの制約を受けることのない、ＩＶＡやＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を不活化できる消毒剤を提供すること。
【解決手段】次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有するエンベロープウイルス不活化組成物。
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％
【選択図】なし
【解決手段】次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有するエンベロープウイルス不活化組成物。
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有するエンベロープウイルス不活化組成物。
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％
【請求項2】
成分（Ｂ）の含有量が１５～２７ｗ／ｗ％である請求項１記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項3】
成分（Ａ）の含有量が０．０３～０．０７ｗ／ｖ％である請求項１又は２記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項4】
エンベロープウイルスが、インフルエンザウイルス及び／又はＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である請求項１～３のいずれか１項記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項5】
皮膚用エンベロープウイルス不活化液である請求項１～４のいずれか１項記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項6】
さらに乳酸塩を含有する請求項１～５のいずれか１項記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項7】
さらに非イオン性界面活性剤を含有する請求項１～６のいずれか１項記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エンベロープウイルス不活性化組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の主要な感染経路はインフルエンザウイルスＡ（ＩＶＡ）等の他の呼吸器感染ウイルス同様に飛沫及び接触を介するとされる。新型コロナウイルス肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）の感染リスク低減のためにマスク着用、手洗い、換気、清掃・環境消毒、３密回避等の対策が推奨され、ワクチン接種や検査が推奨されている。接触感染は唾液等の飛沫に含まれるウイルスが手を介して口・鼻・目へ伝播することによって発生するため、手指洗浄剤や手指消毒剤を用いた手指衛生が接触感染リスク低減のために重要な役割を果たす。
【0003】
手指消毒剤に関しては高濃度エタノール（ＥｔＯＨ）消毒剤の擦り込み式が効果的と世界／日本の公的機関より推奨されている。ＷＨＯは６０－８０ｖｏｌ％エタノールが効果的で様々な細菌の殺菌やＩＶＡやヘルペス等のエンベロープウイルスの不活化に有効であるとしている（非特許文献１）。ＣＤＣは６０ｖｏｌ％以上のエタノールが細菌やウイルスの消毒に有用で，全ての脂溶性ウイルス（ＩＶＡ・ヘルペスウイルス等）に不活化効果を有するとしている（非特許文献２）。厚生労働省は品質・有効性・人体への安全性が確認された「医薬品・医薬部外品」７０－９５ｖｏｌ％エタノール製剤を推奨する一方、６０ｖｏｌ％台のエタノールでも一定の効果があるとしていて、具体的な細菌やウイルスの種類は例示していない（非特許文献３）。実際にエタノールではＩＶＡ（非特許文献４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（非特許文献５）に対する不活化効果が検証されている。
【0004】
エタノールは、ＩＶＡやＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への効果に優れ、独特の塗布感や匂いによって消毒効果への安心感を付与する一方、高濃度エタノールが皮膚乾燥の原因となり肌荒れを引き起こし（非特許文献６）、皮膚炎やアレルギーを引き起こすこともある。高頻度の使用は肌が弱い生活者に適するものでない。また６０重量％以上のエタノール製剤は引火性が高いため消防法・ＵＮ危険物に該当し、製造・輸送・保管の様々な制限故に一般の倉庫で大量保管できない。その結果，消毒剤を短期・大量に必要とするパンデミック下での市中感染対策の使用が困難であり、実際ＣＯＶＩＤ－１９パンデミック初期にその需給バランス悪化が大きな社会問題となった。
【0005】
指定医薬部外品の外皮消毒剤としては、エタノール製剤（有効成分：エタノール７６．９－８１．４ｖｏｌ％）以外にも、塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）製剤（有効成分：０．０５ｗ／ｖ％ＢＣ）がある。ＢＣはその効果がエタノールに比べてやや緩和であるものの、低濃度で幅広い細菌に対して高い殺菌効果を持つ。ウイルスに対してもＩＶＡ（非特許文献７）やＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（非特許文献８）等に対する不活化効果を併せ持つ。ＢＣ製剤は添加剤としてエタノールを含むことが多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】ＷＨＯ（２００９）Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＶＩＤ－１９）：ＷＨＯ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｈａｎｄ ｈｙｇｉｅｎｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ
【非特許文献2】ＣＤＣ（２００８）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ （２００８），
【非特許文献3】厚労省（２０２０）新型コロナウイルスの消毒・除菌方法について
【非特許文献4】感染症学雑誌，５５（５）：３５５－３６６．
【非特許文献5】Ｂｉｏｃｏｎｔ Ｓｃｉ，２６（３），１７７－１８０．
【非特許文献6】ＣＤＣ（２００２）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｈａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ－Ｃａｒｅ Ｓｅｔｔｉｎｇｓ（２００２）
【非特許文献7】Ｊｐｎ Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ６０（６），３４２－３４６．
【非特許文献8】感染制御と予防衛生，４（１）：３０－３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、高頻度に使用しても、肌荒れ、皮膚炎、アレルギーなどを引き起こすことがなく、消防法などの制約を受けることのない、ＩＶＡやＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を不活化できる消毒剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
そこで、本発明者は、塩化ベンザルコニウムと低濃度のエタノールを配合した組成物について、エンベロープウイルスに対する不活化効果を検討したところ、塩化ベンザルコニウムにエタノール１５～４０ｗ／ｗ％を併用すると、エンベロープウイルスに対する不活化効果が相乗的に増強され、エタノール高濃度含有製剤の肌荒れなどの副作用のない安全なエンベロープウイルス不活化組成物が得られることを見出し、本発明を完成した。
【0009】
すなわち、本発明は、次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有するエンベロープウイルス不活化組成物を提供するものである。
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％。
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％。
【発明の効果】
【0010】
本発明のエンベロープウイルス不活化組成物は、塩化ベンザルコニウムとエタノールの相乗効果により、優れたエンベロープウイルス不活化効果を有し、かつ高頻度に使用しても、肌荒れ、皮膚炎、アレルギーなどを引き起こすことがなく、消防法などの制約を受けることがない。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明のエンベロープウイルス不活化組成物は、次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する。
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％。
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％。
【0012】
本発明のエンベロープウイルス不活化組成物の成分（Ａ）は、塩化ベンザルコニウムである。塩化ベンザルコニウムは、化学名アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドであり、前記のようにエンベロープウイルスに対して不活化効果を有するとされている。塩化ベンザルコニウムのアルキル側鎖の炭素数は、エンベロープウイルス不活化効果の観点から、８～１８が好ましく、１０～１８がより好ましく、１２～１６がさらに好ましい。
本発明のエンベロープウイルス不活化組成物中の塩化ベンザルコニウムの含有量は、エンベロープウイルス不活化効果及び皮膚への刺激性の観点から、０．０３～０．０７ｗ／ｖ％が好ましく、０．０４～０．０６ｗ／ｖ％がより好ましく、０．０５～０．０６ｗ／ｖ％がさらに好ましく、０．０５ｗ／ｖ％がよりさらに好ましい。本明細書で、塩化ベンザルコニウムのｗ／ｖ％は、２５℃、１気圧における体積を用いて測定する。
本発明のエンベロープウイルス不活化組成物中の塩化ベンザルコニウムの含有量は、エンベロープウイルス不活化効果及び皮膚への刺激性の観点から、０．０３～０．０７ｗ／ｖ％が好ましく、０．０４～０．０６ｗ／ｖ％がより好ましく、０．０５～０．０６ｗ／ｖ％がさらに好ましく、０．０５ｗ／ｖ％がよりさらに好ましい。本明細書で、塩化ベンザルコニウムのｗ／ｖ％は、２５℃、１気圧における体積を用いて測定する。
【0013】
本発明のエンベロープウイルス不活化組成物の成分（Ｂ）はエタノールであり、当該組成物中の含有量は、成分（Ａ）との併用によるエンベロープウイルス不活化相乗効果を得る観点及び肌荒れなどを防止する観点から１５～４０ｗ／ｗ％が好ましい。また、エタノールの含有量は、前記と同様の観点から、１５～３５ｗ／ｗ％がより好ましく、１５～３０ｗ／ｗ％がさらに好ましく、１５～２７ｗ／ｗ％がよりさらに好ましい。なお、エタノールのｖｏｌ％，ｗ／ｖ％，ｗ／ｗ％の換算については、例えば独立行政法人医薬品医療機器総合機構（ＰＭＤＡ）の「エタノール換算表」を用いることができる。
【0014】
本発明のエンベロープウイルス不活化組成物には、前記成分（Ａ）及び（Ｂ）以外に、非イオン性界面活性剤、ｐＨ調整剤、湿潤剤、多価アルコール、水などを含有していてもよい。
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンＣ８～Ｃ１８アルキルエーテル、ＨＬＢ１０～１８のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。当該非イオン性界面活性剤の含有量は、起泡性、べたつきのなさなどの観点から０．００１～２ｗ／ｗ％が好ましく、０．００５～１ｗ／ｗ％がより好ましく、０．０１～０．７ｗ／ｗ％がさらに好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンＣ８～Ｃ１８アルキルエーテル、ＨＬＢ１０～１８のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。当該非イオン性界面活性剤の含有量は、起泡性、べたつきのなさなどの観点から０．００１～２ｗ／ｗ％が好ましく、０．００５～１ｗ／ｗ％がより好ましく、０．０１～０．７ｗ／ｗ％がさらに好ましい。
【0015】
ｐＨ調整剤としては、乳酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩などが挙げられ、乳酸塩がより好ましい。当該ｐＨ調整剤の含有量は、０．０１～３ｗ／ｗ％が好ましく、０．０２～２ｗ／ｗ％がより好ましい。
また、本発明のエンベロープウイルス不活化組成物のｐＨは、手に塗布する観点から３～１１が好ましく、３～９がさらに好ましい。
また、本発明のエンベロープウイルス不活化組成物のｐＨは、手に塗布する観点から３～１１が好ましく、３～９がさらに好ましい。
【0016】
湿潤剤、多価アルコールとしては、グリセリン、グリコール類、トリグリセリド、Ｎ－（テトラデシルオキシヒドロキシプロピル）－Ｎ－ヒドロキシエチルデカナミドなどが挙げられる。
【0017】
後記の実施例に示すように、本発明の組成物は、成分（Ａ）と少量の成分（Ｂ）の併用により、相乗的に優れたエンベロープウイルス不活化効果を示す。ここで、エンベロープウイルスとしては、エンベロープを有し、核酸としてＲＮＡを有するウイルスが好ましく、ＩＶＡ、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がより好ましく、ＩＶＡ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して特に優れた相乗効果を示す。
従って、本発明の組成物は、これらのエンベロープウイル不活化組成物として有用であり、更に皮膚用エンベロープウイルス不活化組成物として有用である。具体的には、手指用エンベロープウイルス不活化組成物として特に有用である。
従って、本発明の組成物は、これらのエンベロープウイル不活化組成物として有用であり、更に皮膚用エンベロープウイルス不活化組成物として有用である。具体的には、手指用エンベロープウイルス不活化組成物として特に有用である。
【0018】
本発明において、ウイルスの不活化とは、ウイルスの活性を低減又は消失し、宿主細胞への感染力を消失させる作用を意味する。
なお、ウイルスの不活化作用は、例えば、試験品とウイルスを接触させた後、ウイルスを宿主細胞に感染させ、そのウイルス感染力価を測定すること等により確認することができる。ここで、宿主細胞としては、対象となるウイルスが増殖可能な細胞であればよく、インフルエンザウイルスであれば、例えば、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）、アヒル胚性幹細胞由来株化細胞（ＥＢ６６）、ヒトコロナウイルスであれば、例えば、ヒト回盲腺癌細胞（ＨＣＴ－８）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（ＶｅｒｏＥ６）、ヒト肝臓がん由来株化細胞（Ｈｕｈ７）を用いることができる。
なお、ウイルスの不活化作用は、例えば、試験品とウイルスを接触させた後、ウイルスを宿主細胞に感染させ、そのウイルス感染力価を測定すること等により確認することができる。ここで、宿主細胞としては、対象となるウイルスが増殖可能な細胞であればよく、インフルエンザウイルスであれば、例えば、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）、アヒル胚性幹細胞由来株化細胞（ＥＢ６６）、ヒトコロナウイルスであれば、例えば、ヒト回盲腺癌細胞（ＨＣＴ－８）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（ＶｅｒｏＥ６）、ヒト肝臓がん由来株化細胞（Ｈｕｈ７）を用いることができる。
【0019】
本発明のエンベロープウイル不活化組成物の形態としては、皮膚用エンベロープ不活化液、好ましくは手指用エンベロープ不活化液が挙げられる。当該不活化液は、手指に塗布又は噴霧し、当該手指を擦り合わせて使用するのが好ましい。また、当該不活化液をフォーマー容器に充填し、吐出時に泡で出てくる形態とすることもできる。
【実施例0020】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【0021】
実施例１
（１）試料と方法
（試料）
モデル水溶液には、エタノール（ＥｔＯＨ）（冨士フィルム和光純薬株式会社）及び塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）（サニゾールＣ（登録商標），花王株式会社）を用い、それぞれｖｏｌ％（ｖ／ｖ％）及びｗ／ｖ％で調製した。
市販手指消毒剤（いずれも指定医薬部外品）には、製剤Ａ（花王株式会社ビオレガード薬用泡で出る消毒液（登録商標），有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ，４４ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有）、製剤Ｂ（同社ビオレガード薬用消毒タオル（登録商標）の絞り液，有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ，５４ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有），製剤Ｃ（同社ビオレガード薬用消毒シート（登録商標）の絞り液，有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ，５２ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有），製剤Ｄ（同社ビオレｕ 薬用手指の消毒液（登録商標），有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ， ６５ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有），製剤Ｅ（同社ビオレガード薬用手指消毒スプレー（登録商標）， 有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ， ６５ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有），製剤Ｆ（同社ビオレガード薬用手指消毒スプレーα（登録商標）， 有効成分７９．７ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ）を用いた。製剤Ａ、Ｄ～Ｆの組成を表１に示す。
（１）試料と方法
（試料）
モデル水溶液には、エタノール（ＥｔＯＨ）（冨士フィルム和光純薬株式会社）及び塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）（サニゾールＣ（登録商標），花王株式会社）を用い、それぞれｖｏｌ％（ｖ／ｖ％）及びｗ／ｖ％で調製した。
市販手指消毒剤（いずれも指定医薬部外品）には、製剤Ａ（花王株式会社ビオレガード薬用泡で出る消毒液（登録商標），有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ，４４ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有）、製剤Ｂ（同社ビオレガード薬用消毒タオル（登録商標）の絞り液，有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ，５４ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有），製剤Ｃ（同社ビオレガード薬用消毒シート（登録商標）の絞り液，有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ，５２ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有），製剤Ｄ（同社ビオレｕ 薬用手指の消毒液（登録商標），有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ， ６５ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有），製剤Ｅ（同社ビオレガード薬用手指消毒スプレー（登録商標）， 有効成分０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ， ６５ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ含有），製剤Ｆ（同社ビオレガード薬用手指消毒スプレーα（登録商標）， 有効成分７９．７ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ）を用いた。製剤Ａ、Ｄ～Ｆの組成を表１に示す。
【0022】
【表1】
【0023】
（方法）
モデル水溶液の不活化効果はＡＳＴＭ 国際ガイドラインの標準ＡＳＴＭ Ｅ１０５２－２０「懸濁液中のウイルスに対する殺菌剤の活性を評価するための標準試験法」に記載された懸濁試験手順（ＡＳＴＭＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０２０）に基づき，ＩＶＡ（Ｈ１Ｎ１， Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４株，ＡＴＣＣ ＶＲ－１４６９）に対する殺ウイルス活性を調べることにより実施した。具体的には，最小必須培地に懸濁したウイルス液５μＬに試験溶液４５μＬを２２℃で混合し，３０秒後にＳＣＤＬＰ溶液９５０μＬを添加して停止した。この反応溶液の１０倍希釈系列を調製した後，各５００μＬをコンフルエントにしたＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来細胞，ＡＴＣＣＶＲ－１４６９）を播種した１２ウェルプレートに添加し３０分間吸着させた。無血清培地で洗浄後，５％ＣＯ２，３７℃で１８－２２時間培養し，抗インフルエンザＮＰ抗体（マウス，ハイブリドーマ上清）を用いて発光法により感染細胞を染色し，感染力価（ＦＦＵ／ｍＬ）を算出した。具体的には、１次抗体としてＰＢＳで２０００倍希釈した抗インフルエンザＮ－ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）抗体（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＮＰ Ａａｎｔｉｂｏｄｙ， Ａｂｃａｍ ｐｌｃ）を用い、２次抗体としてＰＢＳで２０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）-ｌｉｎｋｅｄ ｇｏａｔＡａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。ＤＥＰＤＡ（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｅｔｈｙｌ－ｐ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）溶液を基質として反応させることにより発色させて感染細胞のフォーカスを算出した。
製剤のウイルス不活化効果試験は欧州統一規格ＥＮ１４４７６：２０１３＋Ａ２：２０１９に記載された定量的懸濁試験手順（ＣＥＮ，２０１９）に基づき，ＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＪＰＮ／ＴＹ／ＷＫ－５２１）に対する殺ウイルス活性を調べることにより実施した。ＩＶＡに関しては，最小必須培地に懸濁したウイルス液５μＬ，３ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液５μＬ及び試験溶液４０μＬを２２℃で混合して反応液した。その他の条件及び操作はモデル水溶液と同様に行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２については，最小必須培地で調整したウイルス液１００μＬ，３ｇ／ＬＢＳＡ水溶液１００μＬ，及び試験溶液８００μＬを２５℃で混合し３０秒静置した。この反応溶液１００μＬに，事前検証で不活化を確認した２ｇ／Ｌウシ胎児血清水溶液を含む最小必須培地で１０倍希釈したＳＣＤＬＰ溶液９００μＬを添加した。反応溶液の１０倍希釈系列を調製し，Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ＴＭＰＲＳＳＪＣＲＢ １８１９）を播種したウェルプレートに添加し９０分間吸着させた。ウイルス感染力価（ＰＦＵ／ｍＬ）はプラーク測定法で求めた。
いずれの試験も蒸留水での試験結果を対照とし，対照との差分を不活化量とした。測定は３回繰り返し試験の結果を平均値とした。試験溶液が細胞毒性を有さないことは試験溶液と蒸留水（対照）の試験で生存細胞数を比較することにより行った。
モデル水溶液の不活化効果はＡＳＴＭ 国際ガイドラインの標準ＡＳＴＭ Ｅ１０５２－２０「懸濁液中のウイルスに対する殺菌剤の活性を評価するための標準試験法」に記載された懸濁試験手順（ＡＳＴＭＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０２０）に基づき，ＩＶＡ（Ｈ１Ｎ１， Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４株，ＡＴＣＣ ＶＲ－１４６９）に対する殺ウイルス活性を調べることにより実施した。具体的には，最小必須培地に懸濁したウイルス液５μＬに試験溶液４５μＬを２２℃で混合し，３０秒後にＳＣＤＬＰ溶液９５０μＬを添加して停止した。この反応溶液の１０倍希釈系列を調製した後，各５００μＬをコンフルエントにしたＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来細胞，ＡＴＣＣＶＲ－１４６９）を播種した１２ウェルプレートに添加し３０分間吸着させた。無血清培地で洗浄後，５％ＣＯ２，３７℃で１８－２２時間培養し，抗インフルエンザＮＰ抗体（マウス，ハイブリドーマ上清）を用いて発光法により感染細胞を染色し，感染力価（ＦＦＵ／ｍＬ）を算出した。具体的には、１次抗体としてＰＢＳで２０００倍希釈した抗インフルエンザＮ－ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＰ）抗体（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＮＰ Ａａｎｔｉｂｏｄｙ， Ａｂｃａｍ ｐｌｃ）を用い、２次抗体としてＰＢＳで２０００倍希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）-ｌｉｎｋｅｄ ｇｏａｔＡａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。ＤＥＰＤＡ（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｅｔｈｙｌ－ｐ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）溶液を基質として反応させることにより発色させて感染細胞のフォーカスを算出した。
製剤のウイルス不活化効果試験は欧州統一規格ＥＮ１４４７６：２０１３＋Ａ２：２０１９に記載された定量的懸濁試験手順（ＣＥＮ，２０１９）に基づき，ＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＪＰＮ／ＴＹ／ＷＫ－５２１）に対する殺ウイルス活性を調べることにより実施した。ＩＶＡに関しては，最小必須培地に懸濁したウイルス液５μＬ，３ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液５μＬ及び試験溶液４０μＬを２２℃で混合して反応液した。その他の条件及び操作はモデル水溶液と同様に行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２については，最小必須培地で調整したウイルス液１００μＬ，３ｇ／ＬＢＳＡ水溶液１００μＬ，及び試験溶液８００μＬを２５℃で混合し３０秒静置した。この反応溶液１００μＬに，事前検証で不活化を確認した２ｇ／Ｌウシ胎児血清水溶液を含む最小必須培地で１０倍希釈したＳＣＤＬＰ溶液９００μＬを添加した。反応溶液の１０倍希釈系列を調製し，Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ＴＭＰＲＳＳＪＣＲＢ １８１９）を播種したウェルプレートに添加し９０分間吸着させた。ウイルス感染力価（ＰＦＵ／ｍＬ）はプラーク測定法で求めた。
いずれの試験も蒸留水での試験結果を対照とし，対照との差分を不活化量とした。測定は３回繰り返し試験の結果を平均値とした。試験溶液が細胞毒性を有さないことは試験溶液と蒸留水（対照）の試験で生存細胞数を比較することにより行った。
【0024】
（２）結果
モデル水溶液でのＩＶＡの不活化試験結果を表２に示す。
０．００ｗ／ｖ％ ＢＣ及び３０ｖｏｌ％以下 ＥｔＯＨではＩＶＡに対する不活化量が０．１６ｌｏｇ１０以下であったが，４０ｖｏｌ％以上のＥｔＯＨ は４ｌｏｇ１０以上の不活化量を示した。０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ共存系では０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨで２．１１ｌｏｇ１０の不活化量，２０ｖｏｌ％以上 ＥｔＯＨで３．７８ｌｏｇ１０以上の不活化量を示した。いずれの試験でも細胞毒性が認められなかった（データ示さず）。
ＢＣとＥｔＯＨを因子とする二元配置分散分析（Ｒ ｖｅｒ．４．０．５にて解析）によって，２０ｖｏｌ％及び３０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨでは有意な交互作用があり，組合せによる相乗的作用が確認された。
製剤Ａ－ＦでのＩＶＡの不活化試験結果を表３に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の不活化試験結果を表４に、それぞれ示す。ＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対しては，全ての製剤で不活化量が４ｌｏｇ１０以上であった。全試験で細胞毒性が認められなかった（データ示さず）。
０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣと２０－６０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ を組み合わせたモデル水溶液で高いＩＶＡ 活化効果が認められた。
モデル水溶液でのＩＶＡの不活化試験結果を表２に示す。
０．００ｗ／ｖ％ ＢＣ及び３０ｖｏｌ％以下 ＥｔＯＨではＩＶＡに対する不活化量が０．１６ｌｏｇ１０以下であったが，４０ｖｏｌ％以上のＥｔＯＨ は４ｌｏｇ１０以上の不活化量を示した。０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ共存系では０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨで２．１１ｌｏｇ１０の不活化量，２０ｖｏｌ％以上 ＥｔＯＨで３．７８ｌｏｇ１０以上の不活化量を示した。いずれの試験でも細胞毒性が認められなかった（データ示さず）。
ＢＣとＥｔＯＨを因子とする二元配置分散分析（Ｒ ｖｅｒ．４．０．５にて解析）によって，２０ｖｏｌ％及び３０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨでは有意な交互作用があり，組合せによる相乗的作用が確認された。
製剤Ａ－ＦでのＩＶＡの不活化試験結果を表３に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の不活化試験結果を表４に、それぞれ示す。ＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対しては，全ての製剤で不活化量が４ｌｏｇ１０以上であった。全試験で細胞毒性が認められなかった（データ示さず）。
０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣと２０－６０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ を組み合わせたモデル水溶液で高いＩＶＡ 活化効果が認められた。
【0025】
【表2】
【0026】
【表3】
【0027】
【表4】
【0028】
ＥｔＯＨのエンベロープウイルスに対する作用に関し，非特許文献４ではＩＶＡを１０秒以上で不活化するには６０％ＥｔＯＨが必要で，５０％ ＥｔＯＨでは不活化に１分以上の暴露を要し，４０％ ＥｔＯＨでは５分間暴露でも不活化されないと報告している。非特許文献８は同じエンベロープウイルスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対し，５０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨでは１分及び１０分の暴露で不活化されるが，４０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨでは１分の暴露で不活化できないとしている。一方、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２６（７）， １５９２－１５９５は３０－４０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨにおいてもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を３０秒間で不活化できると報告している。
これら報告と前記の結果を総じると，エンベロープウイルスに対する不活化効果が急激に変化する領域が３０－５０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ 付近にあって，調製方法やウイルス状態の違いによってその不活化効果が大きな影響を受けるものと推察された。従って相乗効果が実験的に観察された２０－３０ ｖｏｌ％ ＥｔＯＨのみならず，それを超える３０－５０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨに対しても０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣとの組合せがＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を安定的に不活化するために役割を果たすだろうと考察された。
なお前記の結果では，０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ水溶液は３０秒間の短い暴露時間で約２ｌｏｇ１０の弱い不活化効果しか示さなかった（表２）。しかしながらＢＣは長時間暴露であればＩＶＡ不活化効果を示し（非特許文献７），手指適用後の短時間で揮発してしまうＥｔＯＨ と異なり持続的な不活化効果を有する。
市販手指消毒剤の製剤Ａ－Ｆは、全て４ｌｏｇ１０以上の高い不活化効果を示した（表３及び４）。製剤Ｂ－Ｆは０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣと５０ｖｏｌ％以上のＥｔＯＨの組合せもしくは約８０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨであり，既報におけるＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の不活化効果から想定内の結果であった。
注目すべきは製剤Ａの０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ 及び４４ｖｏｌ％ ＥｔＯＨの組合せであった。少なくとも０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ存在下であれば４４ｖｏｌ％までＥｔＯＨ濃度が低くともＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ に対する不活化効果が得られることを証明できた。モデル溶液の結果（表２）から，ＥｔＯＨ濃度を更に減少させても不活化効果が得られるように想起されるが，製剤では実用場面も考慮されるべきである。つまり手指消毒剤で推奨されている１０－２０秒程度の擦り込みを行うと，体温や蒸気圧故にＥｔＯＨが水に先んじて蒸発しＥｔＯＨ濃度が徐々に減少するということである。従って最小限の２０－３０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨより若干高い４４ｖｏｌ％ ＥｔＯＨは妥当な濃度と考えられる。
これら報告と前記の結果を総じると，エンベロープウイルスに対する不活化効果が急激に変化する領域が３０－５０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨ 付近にあって，調製方法やウイルス状態の違いによってその不活化効果が大きな影響を受けるものと推察された。従って相乗効果が実験的に観察された２０－３０ ｖｏｌ％ ＥｔＯＨのみならず，それを超える３０－５０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨに対しても０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣとの組合せがＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を安定的に不活化するために役割を果たすだろうと考察された。
なお前記の結果では，０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ水溶液は３０秒間の短い暴露時間で約２ｌｏｇ１０の弱い不活化効果しか示さなかった（表２）。しかしながらＢＣは長時間暴露であればＩＶＡ不活化効果を示し（非特許文献７），手指適用後の短時間で揮発してしまうＥｔＯＨ と異なり持続的な不活化効果を有する。
市販手指消毒剤の製剤Ａ－Ｆは、全て４ｌｏｇ１０以上の高い不活化効果を示した（表３及び４）。製剤Ｂ－Ｆは０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣと５０ｖｏｌ％以上のＥｔＯＨの組合せもしくは約８０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨであり，既報におけるＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の不活化効果から想定内の結果であった。
注目すべきは製剤Ａの０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ 及び４４ｖｏｌ％ ＥｔＯＨの組合せであった。少なくとも０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ存在下であれば４４ｖｏｌ％までＥｔＯＨ濃度が低くともＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ に対する不活化効果が得られることを証明できた。モデル溶液の結果（表２）から，ＥｔＯＨ濃度を更に減少させても不活化効果が得られるように想起されるが，製剤では実用場面も考慮されるべきである。つまり手指消毒剤で推奨されている１０－２０秒程度の擦り込みを行うと，体温や蒸気圧故にＥｔＯＨが水に先んじて蒸発しＥｔＯＨ濃度が徐々に減少するということである。従って最小限の２０－３０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨより若干高い４４ｖｏｌ％ ＥｔＯＨは妥当な濃度と考えられる。
【0029】
手指消毒の実用場面と想定し得る３０秒間の暴露時間で，低濃度ＥｔＯＨと０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣの組合せによるＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 不活化効果を検討した。その結果２０－３０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨと０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣの組合せによって相乗的な不活化効果が得られることを見出した。安定的な不活化効果という点では２０－５０ｖｏｌ％ ＥｔＯＨと０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣ の組合せが有用と示唆された。市販手指消毒剤を用いた不活化試験では，４４ｖｏｌ％ ＥｔＯＨを０．０５ｗ／ｖ％ ＢＣと組合せることで，３０秒間暴露によりＩＶＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を十分に不活化できることを証明した。このような低濃度ＥｔＯＨ とＢＣの組合せによる手指消毒システムが，院内感染管理を目的とする手指消毒とは異なる形で，感染リスクを低減しつつ，より良いＱＯＬを実現するための市中感染対策に成り得ると期待される。
【産業上の利用可能性】
【0030】
本発明のエンベロープウイルス不活化組成物は、塩化ベンザルコニウムとエタノールの相乗効果により、優れたエンベロープウイルス不活化効果を有し、かつ高頻度に使用しても、肌荒れ、皮膚炎、アレルギーなどを引き起こすことがなく、消防法などの制約を受けることがない。
【手続補正書】
【提出日】2023-09-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有するエンベロープウイルス不活化組成物。
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％
（Ａ）塩化ベンザルコニウム
（Ｂ）エタノール １５～４０ｗ／ｗ％
【請求項2】
成分（Ｂ）の含有量が１５～２７ｗ／ｗ％である請求項１記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項3】
成分（Ａ）の含有量が０．０３～０．０７ｗ／ｖ％である請求項１又は２記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項4】
エンベロープウイルスが、インフルエンザウイルス及び／又はＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である請求項１又は２記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項5】
皮膚用エンベロープウイルス不活化液である請求項１又は２記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項6】
さらに乳酸塩を含有する請求項１又は２記載のエンベロープウイルス不活化組成物。
【請求項7】
さらに非イオン性界面活性剤を含有する請求項１又は２記載のエンベロープウイルス不活化組成物。