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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023158322
(43)【公開日】2023-10-30
(54)【発明の名称】変異タウ蛋白及びそれをコードする変異遺伝子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20231023BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20231023BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231023BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231023BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231023BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20231023BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C07K14/47
A61P25/28
A61P43/00
A61K48/00
A61K38/16
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022068086
(22)【出願日】2022-04-18
(71)【出願人】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(71)【出願人】
【識別番号】591063394
【氏名又は名称】公益財団法人東京都医学総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】下中 翔太郎
(72)【発明者】
【氏名】本井 ゆみ子
(72)【発明者】
【氏名】長谷川 成人
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA22
4C084BA44
4C084CA53
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA161
4C084ZA162
4C084ZC511
4C084ZC512
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA21
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制し、タウオパチー治療薬として有用な物質を提供すること。
【解決手段】配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白、その部分ペプチド、又はそれらをコードする変異遺伝子。
【選択図】なし
【解決手段】配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白、その部分ペプチド、又はそれらをコードする変異遺伝子。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子。
【請求項2】
前記置換又は欠失が、Ｎ末端側から３２６～３２９番目の４アミノ酸残基の欠失、３３４～３３７番目の４アミノ酸残基の欠失、３２８～３２９番目の２アミノ酸残基の欠失、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失、３４８～３４９番目の２アミノ酸欠失、３５０～３５１番目の２アミノ酸欠失、３５２～３５３番目の２アミノ酸欠失、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、あるいは３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換である請求項１記載の変異遺伝子。
【請求項3】
前記置換又は欠失が、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２８番目、３３７番目、３４８番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失する請求項１記載の変異遺伝子。
【請求項4】
前記３２８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであり、前記欠失又は置換が当該イソロイシンの欠失、又はアラニン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸への置換である請求項１記載の変異遺伝子。
【請求項5】
前記３３７番目のアミノ酸残基がバリンであり、前記欠失又は置換が当該バリンの欠失、又はアラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸への置換である請求項１記載の変異遺伝子。
【請求項6】
前記３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、前記欠失又は置換が当該アスパラギン酸の欠失、又はロイシンへの置換である請求項１記載の変異遺伝子。
【請求項7】
前記３５２番目のアミノ酸基がセリンであり、前記欠失が当該セリンの欠失である請求項１記載の変異遺伝子。
【請求項8】
前記３５３番目のアミノ酸基がリジンであり、前記欠失又は当該リジンの欠失である請求項１記載の変異遺伝子。
【請求項9】
配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
【請求項10】
前記置換又は欠失が、Ｎ末端側から３２６～３２９番目の４アミノ酸残基の欠失、３３４～３３７番目の４アミノ酸残基の欠失、３２８～３２９番目の２アミノ酸残基の欠失、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失、３４８～３４９番目の２アミノ酸欠失、３５０～３５１番目の２アミノ酸欠失、３５２～３５３番目の２アミノ酸欠失、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、あるいは３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換である請求項９記載の変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
【請求項11】
前記置換又は欠失が、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２８番目、３３７番目、３４８番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失する請求項９記載の変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
【請求項12】
前記３２８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであり、前記欠失又は置換が当該イソロイシンの欠失、又はアラニン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸への置換である請求項９記載の変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
【請求項13】
前記３３７番目のアミノ酸残基がバリンであり、前記欠失又は置換が当該バリンの欠失、又はアラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸への置換である請求項９記載の変異蛋白又はその部分ペプチド。
【請求項14】
前記３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、前記欠失又は置換が当該アスパラギン酸の欠失、又はロイシンへの置換である請求項９記載の変異ペプチド又はその部分ペプチド。
【請求項15】
前記３５２番目のアミノ酸基がセリンであり、前記欠失が当該セリンの欠失である請求項９記載の変異蛋白又はその部分ペプチド。
【請求項16】
前記３５３番目のアミノ酸基がリジンであり、前記欠失が当該リジンの欠失である請求項９記載の変異蛋白又はその部分ペプチド。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又はその部分ペプチドを含有することを特徴とするタウオパチー治療用医薬組成物。
【請求項18】
タウオパチー治療用医薬組成物製造のための、請求項１～１６のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又はその部分ペプチドの使用。
【請求項19】
タウオパチー治療に用いるための請求項１～１６のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又は部分ペプチド。
【請求項20】
請求項１～１６のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又はその部分ペプチドを投与することを特徴とする、タウオパチーの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、変異タウ蛋白、それをコードする変異遺伝子及びそれらの利用に関する。
【背景技術】
【0002】
タウ蛋白は、アルツハイマー病だけでなく皮質基底核変性症（ＣＢＤ）や進行性核上性麻痺(ＰＳＰ）といった神経変性疾患脳内にも凝集・蓄積しタウ蛋白蓄積症と総称される神経変性疾患の原因蛋白である。タウ蛋白凝集は、既存の凝集タウを鋳型とし疾患特異的に脳内に広がり神経変性をおこしてゆく。タウの蓄積は、まず正常タウが異常を起こして互いに凝集した後、これが凝集核（ｓｅｅｄ）となってさらに他の正常タウの凝集を誘発するというｐｒｉｏｎ－ｌｉｋｅな様式で起こるとされている。この「タウのｓｅｅｄ依存性凝集」モデルは実験的にも確認されており（図１）、治療戦略において有力な標的であると考えられている。
【0003】
一方、過剰なリン酸化がなされたタウが神経細胞へ蓄積し、神経原線維変性を引き起こすことが知られていることから、リン酸化タウに対する抗体（特許文献１、２）、タウのリン酸化を抑制又は減少する薬剤（特許文献３、４）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表２０１５－５２１１５８号公報
【特許文献2】特表２０１８－５３１５８０号公報
【特許文献3】特開２０１６－８８８５１号公報
【特許文献4】国際公開第２０１８／２２１７３１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、リン酸化タウに対する抗体やタウのリン酸化を抑制する薬剤は、未だその有効性は確認されていない。
従って、本発明の課題は、前記タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制し、タウオパチー治療薬として有用な物質を提供することにある。
従って、本発明の課題は、前記タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制し、タウオパチー治療薬として有用な物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
そこで本発明者は、実際のタウオパチーの一種であるＣＢＤ及びＰＳＰ患者由来のタウをｓｅｅｄとして用いることで、これらの疾患に特有のタウ病理形成を再現した細胞モデルを作製し、タウ配列中の凝集に不可欠な部位の同定を行った。その結果、タウ蛋白のアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換されるか又は欠失した配列を有する変異タウ蛋白、その部分ペプチド及びそれらをコードする変異遺伝子を見出し、さらに当該変異蛋白又はその部分ペプチドを発現した細胞はタウ凝集が強く抑制されることを見出し、本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、次の発明［１］～［２０］を提供するものである。
［１］配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子。
［２］前記置換又は欠失が、Ｎ末端側から３２６～３２９番目の４アミノ酸残基の欠失、３３４～３３７番目の４アミノ酸残基の欠失、３２８～３２９番目の２アミノ酸残基の欠失、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失、３４８～３４９番目の２アミノ酸欠失、３５０～３５１番目の２アミノ酸欠失、３５２～３５３番目の２アミノ酸欠失、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、あるいは３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換である［１］記載の変異遺伝子。
［３］前記置換又は欠失が、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２８番目、３３７番目、３４８番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失する［１］記載の変異遺伝子。
［４］前記３２８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであり、前記欠失又は置換が当該イソロイシンの欠失、又はアラニン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸への置換である［１］記載の変異遺伝子。
［５］前記３３７番目のアミノ酸残基がバリンであり、前記欠失又は置換が当該バリンの欠失、又はアラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸への置換である［１］記載の変異遺伝子。
［６］前記３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、前記欠失又は置換が当該アスパラギン酸の欠失、又はロイシンへの置換である［１］記載の変異遺伝子。
［７］前記３５２番目のアミノ酸基がセリンであり、前記欠失が当該セリンの欠失である［１］記載の変異遺伝子。
［８］前記３５３番目のアミノ酸基がリジンであり、前記欠失が当該リジンの欠失である［１］記載の変異遺伝子。
［９］配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
［１０］前記置換又は欠失が、Ｎ末端側から３２６～３２９番目の４アミノ酸残基の欠失、３３４～３３７番目の４アミノ酸残基の欠失、３２８～３２９番目の２アミノ酸残基の欠失、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失、３４８～３４９番目の２アミノ酸欠失、３５０～３５１番目の２アミノ酸欠失、３５２～３５３番目の２アミノ酸欠失、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、あるいは３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換である［９］記載の変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
［１１］前記置換又は欠失が、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２８番目、３３７番目、３４８番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失する［９］記載の変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
［１２］前記３２８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであり、前記欠失又は置換が当該イソロイシンの欠失、又はアラニン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸への置換である［１１］記載の変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
［１３］前記３３７番目のアミノ酸残基がバリンであり、前記欠失又は置換が当該バリンの欠失、又はアラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸への置換である［１１］記載の変異蛋白又はその部分ペプチド。
［１４］前記３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、前記欠失又は置換が当該アスパラギン酸の欠失、又はロイシンへの置換である［１１］記載の変異ペプチド又はその部分ペプチド。
［１５］前記３５２番目のアミノ酸基がセリンであり、前記欠失が当該セリンの欠失である［１１］記載の変異蛋白又はその部分ペプチド。
［１６］前記３５３番目のアミノ酸基がリジンであり、前記欠失が当該リジンの欠失である［１１］記載の変異蛋白又はその部分ペプチド。
［１７］［１］～［１６］のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又はその部分ペプチドを含有することを特徴とするタウオパチー治療用医薬組成物。
［１８］タウオパチー治療用医薬組成物製造のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又はその部分ペプチドの使用。
［１９］タウオパチー治療に用いるための、［１］～［１６］のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又は部分ペプチド。
［２０］［１］～［１６］のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又はその部分ペプチドを投与することを特徴とする、タウオパチーの治療方法。
［１］配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子。
［２］前記置換又は欠失が、Ｎ末端側から３２６～３２９番目の４アミノ酸残基の欠失、３３４～３３７番目の４アミノ酸残基の欠失、３２８～３２９番目の２アミノ酸残基の欠失、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失、３４８～３４９番目の２アミノ酸欠失、３５０～３５１番目の２アミノ酸欠失、３５２～３５３番目の２アミノ酸欠失、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、あるいは３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換である［１］記載の変異遺伝子。
［３］前記置換又は欠失が、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２８番目、３３７番目、３４８番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失する［１］記載の変異遺伝子。
［４］前記３２８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであり、前記欠失又は置換が当該イソロイシンの欠失、又はアラニン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸への置換である［１］記載の変異遺伝子。
［５］前記３３７番目のアミノ酸残基がバリンであり、前記欠失又は置換が当該バリンの欠失、又はアラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸への置換である［１］記載の変異遺伝子。
［６］前記３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、前記欠失又は置換が当該アスパラギン酸の欠失、又はロイシンへの置換である［１］記載の変異遺伝子。
［７］前記３５２番目のアミノ酸基がセリンであり、前記欠失が当該セリンの欠失である［１］記載の変異遺伝子。
［８］前記３５３番目のアミノ酸基がリジンであり、前記欠失が当該リジンの欠失である［１］記載の変異遺伝子。
［９］配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
［１０］前記置換又は欠失が、Ｎ末端側から３２６～３２９番目の４アミノ酸残基の欠失、３３４～３３７番目の４アミノ酸残基の欠失、３２８～３２９番目の２アミノ酸残基の欠失、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失、３４８～３４９番目の２アミノ酸欠失、３５０～３５１番目の２アミノ酸欠失、３５２～３５３番目の２アミノ酸欠失、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、あるいは３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換である［９］記載の変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
［１１］前記置換又は欠失が、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２８番目、３３７番目、３４８番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失する［９］記載の変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
［１２］前記３２８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであり、前記欠失又は置換が当該イソロイシンの欠失、又はアラニン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸への置換である［１１］記載の変異タウ蛋白又はその部分ペプチド。
［１３］前記３３７番目のアミノ酸残基がバリンであり、前記欠失又は置換が当該バリンの欠失、又はアラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸への置換である［１１］記載の変異蛋白又はその部分ペプチド。
［１４］前記３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、前記欠失又は置換が当該アスパラギン酸の欠失、又はロイシンへの置換である［１１］記載の変異ペプチド又はその部分ペプチド。
［１５］前記３５２番目のアミノ酸基がセリンであり、前記欠失が当該セリンの欠失である［１１］記載の変異蛋白又はその部分ペプチド。
［１６］前記３５３番目のアミノ酸基がリジンであり、前記欠失が当該リジンの欠失である［１１］記載の変異蛋白又はその部分ペプチド。
［１７］［１］～［１６］のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又はその部分ペプチドを含有することを特徴とするタウオパチー治療用医薬組成物。
［１８］タウオパチー治療用医薬組成物製造のための、［１］～［１６］のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又はその部分ペプチドの使用。
［１９］タウオパチー治療に用いるための、［１］～［１６］のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又は部分ペプチド。
［２０］［１］～［１６］のいずれかに記載の変異遺伝子、変異タウ蛋白又はその部分ペプチドを投与することを特徴とする、タウオパチーの治療方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明の変異蛋白又はその部分ペプチドを発現した細胞は、タウ凝集が強く抑制されることから、本発明の変異遺伝子、タウ変異蛋白又はその部分ペプチドは、前記タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制し、タウオパチー治療薬として有用である。また、本発明においては、タウの凝集能の喪失を、大きな領域を削るのではなく必要最小限のアミノ酸のみを除く又は置換することで実現しているところに特徴がある。タウは通常、ＭＡＰ（微小管結合タンパク）として微小管の安定化に働いており、改変する領域を極力小さくすることによって、この本来の働きを妨げることなく、凝集のみを選択的に抑制することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】タウ凝集の細胞モデルの概要を示す図である。
【図2】正常タウ蛋白の各アイソフォームが有する領域を示す図である。
【図3】３２２～３３７番目の１６アミノ酸のうちの４アミノ酸欠失変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【図4】３２６～３３７番目の１２アミノ酸のうちの２アミノ酸欠失変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【図5】３２８、３２９、３３６又は３３７番目のアミノ酸の欠失変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【図6】３３８～３５３番目の１５アミノ酸のうちの２アミノ酸欠失変異体のＰＳＰ ｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【図7】３４８～３５３番目の６アミノ酸のうちの１アミノ酸欠失変異体のＰＳＰ ｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【図8】ＣＢＤ別症例によるｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【図9】ＰＳＰ別症例によるｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【図10】３２８番目のアミノ酸の置換変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【図11】３３７番目のアミノ酸の置換変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【図12】３４８番目のアミノ酸の置換変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の変異遺伝子の一態様は、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
また、本発明のタウ変異蛋白又はその部分ペプチドの一態様は、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチドである。
また、本発明のタウ変異蛋白又はその部分ペプチドの一態様は、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチドである。
【0011】
本発明の変異タウ蛋白の変異前のタウ蛋白は、正常なタウ蛋白であり、配列番号１～６のいずれかに示すアミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸配列は、ヒトタウ蛋白の６つのアイソフォームのアミノ酸配列であり、配列番号１は２Ｎ４Ｒアイソフォーム（４４１アミノ酸）、配列番号２は１Ｎ４Ｒアイソフォーム（４１１アミノ酸）、配列番号３は０Ｎ４Ｒアイソフォーム（３８２アミノ酸）、配列番号４は２Ｎ３Ｒアイソフォーム（４１０アミノ酸）、配列番号５は１Ｎ３Ｒアイソフォーム（３８０アミノ酸）、配列番号６は０Ｎ３Ｒアイソフォーム（３５１アミノ酸）をそれぞれ示す。
タウ蛋白のアミノ酸残基に言及するときは、２Ｎ４Ｒアイソフォーム（配列番号１：４４１アミノ酸）を基準とする。従って、本発明におけるアミノ酸残基の変異箇所は、このアイソフォームのアミノ酸配列（配列番号１）を基準にＮ末端側から数えたアミノ酸残基を示す。
タウ蛋白のアミノ酸残基に言及するときは、２Ｎ４Ｒアイソフォーム（配列番号１：４４１アミノ酸）を基準とする。従って、本発明におけるアミノ酸残基の変異箇所は、このアイソフォームのアミノ酸配列（配列番号１）を基準にＮ末端側から数えたアミノ酸残基を示す。
【0012】
本発明のタウ変異蛋白は、配列番号１～６のいずれかに示すアミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか又は欠失した配列を有する。
具体的な変異（置換又は欠失）の例としては、Ｎ末端側から３２６～３２９番目の４アミノ酸残基の欠失、３３４～３３７番目の４アミノ酸残基の欠失、３２８～３２９番目の２アミノ酸残基の欠失、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失、３４８～３４９番目の２アミノ酸欠失、３５０～３５１番目の２アミノ酸欠失、３５２～３５３番目の２アミノ酸欠失、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換などが挙げられる。
これらの変異（置換又は欠失）のうち、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換が、変異が少ない点でより好ましい。
具体的な変異（置換又は欠失）の例としては、Ｎ末端側から３２６～３２９番目の４アミノ酸残基の欠失、３３４～３３７番目の４アミノ酸残基の欠失、３２８～３２９番目の２アミノ酸残基の欠失、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失、３４８～３４９番目の２アミノ酸欠失、３５０～３５１番目の２アミノ酸欠失、３５２～３５３番目の２アミノ酸欠失、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換などが挙げられる。
これらの変異（置換又は欠失）のうち、３２８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸へ置換、３３７番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３４８番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５２番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸への置換、３５３番目のアミノ酸残基の欠失又は他のアミノ酸残基への置換が、変異が少ない点でより好ましい。
【0013】
タウ蛋白のＮ末端側から３２８番目のアミノ酸残基は、配列番号１～６ではイソロイシンであるが、本発明の一態様では当該イソロイシンが他のアミノ酸残基に置換されているか又は欠失している。ある態様では、このイソロイシンは、アラニン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸に置換しているか、又は欠失しているのが好ましい（Ｉ３２８Ａ（例えば配列番号８）、Ｉ３２８Ｎ（例えば配列番号２０）、Ｉ３２８Ｄ（例えば配列番号２１）、Δ３２８Ｉ）。
Ｎ末端側から３３７番目のアミノ酸残基は、配列番号１～６ではバリンであるが、本発明の一態様では当該バリンが他のアミノ酸残基に置換されているか又は欠失している。ある態様では、このバリンは、アラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸に置換しているか、又は欠失しているのが好ましい（Ｖ３３７Ａ（例えば配列番号１１）、Ｖ３３７Ｔ（例えば配列番号２４）、Ｖ３３７Ｄ（例えば配列番号２５）、Δ３３７Ｖ）。
Ｎ末端側から３４８番目のアミノ酸残基は、配列番号１～６では、アスパラギン酸であるが、本発明の一態様では当該アスパラギン酸が他のアミノ酸残基に置換されているか又は欠失している。ある態様では、このアスパラギン酸は、ロイシンに置換しているか、又は欠失しているのが好ましい（Ｄ３４８Ｌ（例えば配列番号３０）、Δ３４８Ｄ（例えば配列番号１２））。
Ｎ末端側から３５２番目のアミノ酸残基は、配列番号１～６ではセリンであるが、本発明の一態様では当該セリンが他のアミノ酸に置換しているか又は欠失している。ある態様では、このセリンは、欠失しているのが好ましい（Δ３５２Ｓ（例えば配列番号１６））。
Ｎ末端側から３５３番目のアミノ酸残基は、配列番号１～６ではリジンであるが、本発明の一態様では、このセリンは、欠失しているのが好ましい（Δ３５３Ｋ（例えば配列番号１７））。
Ｎ末端側から３３７番目のアミノ酸残基は、配列番号１～６ではバリンであるが、本発明の一態様では当該バリンが他のアミノ酸残基に置換されているか又は欠失している。ある態様では、このバリンは、アラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸に置換しているか、又は欠失しているのが好ましい（Ｖ３３７Ａ（例えば配列番号１１）、Ｖ３３７Ｔ（例えば配列番号２４）、Ｖ３３７Ｄ（例えば配列番号２５）、Δ３３７Ｖ）。
Ｎ末端側から３４８番目のアミノ酸残基は、配列番号１～６では、アスパラギン酸であるが、本発明の一態様では当該アスパラギン酸が他のアミノ酸残基に置換されているか又は欠失している。ある態様では、このアスパラギン酸は、ロイシンに置換しているか、又は欠失しているのが好ましい（Ｄ３４８Ｌ（例えば配列番号３０）、Δ３４８Ｄ（例えば配列番号１２））。
Ｎ末端側から３５２番目のアミノ酸残基は、配列番号１～６ではセリンであるが、本発明の一態様では当該セリンが他のアミノ酸に置換しているか又は欠失している。ある態様では、このセリンは、欠失しているのが好ましい（Δ３５２Ｓ（例えば配列番号１６））。
Ｎ末端側から３５３番目のアミノ酸残基は、配列番号１～６ではリジンであるが、本発明の一態様では、このセリンは、欠失しているのが好ましい（Δ３５３Ｋ（例えば配列番号１７））。
【0014】
本発明のタウ変異蛋白の変異（置換又は欠失）箇所は、配列番号１～６のいずれかに示すアミノ酸配列における、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上の箇所であるが、これらの変異のうちいずれか１カ所の変異でもよく、２カ所の変異でもよく、４カ所の変異でもよく、すべての箇所の変異でもよい。変異する箇所の数を少なくするのが、タウ蛋白の本来の機能を損なわない点から好ましく、１～４カ所の変異がより好ましく、１～２カ所の変異がより好ましく、１カ所の変異がさらに好ましい。
【0015】
本発明の変異タウ蛋白の部分ペプチドとしては、本発明の変異タウ蛋白の変異箇所がＣ末端側（３２８番目以降）にあること及びタウの凝集領域を考慮すると、少なくともＮ末端側から２４０～３９０番目のアミノ酸を有する部分ペプチドが好ましく、少なくともＮ末端側から２７０～３９０番目のアミノ酸を有する部分ペプチドがより好ましく、少なくともＮ末端側から２７０～３８０番目のアミノ酸を有する部分ペプチドがさらに好ましい。
【0016】
配列番号１～６におけるＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換するか又は欠失させる方法としては、従来公知の遺伝子工学的手法を適宜使用することができる。例えば、変異導入対象の蛋白をコードする野生型の遺伝子の塩基配列を特定し、部位特異的突然変異導入キット等を用いて上記置換後の蛋白をコードするように変異を導入することができる。また、変異を導入した遺伝子は、定法に従って、例えば発現ベクターに組み込んだ状態で回収することができる。遺伝子に変異を導入するには、例えばプラスミドＤＮＡを鋳型として、目的の変異を持ったプライマーを背中合わせになるように設計し、プラスミド全周を増幅するインバースＰＣＲ法が用いられる。その際には、市販の変異導入用キット（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ，ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異が導入される。
【0017】
本発明の変異遺伝子は、前記のタウ変異蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。具体的には、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２６番目、３２７番目、３２８番目、３２９番目、３３４番目、３３５番目、３３６番目、３３７番目、３４８番目、３４９番目、３５０番目、３５１番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
好ましい一態様は、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２８番目、３３７番目、３４８番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３２８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであり、前記欠失又は置換が当該イソロイシンの欠失、又はアラニン、アスパラギン若しくはスパラギン酸への置換である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３３７番目のアミノ酸残基がバリンであり、前記欠失又は置換が当該バリンの欠失、又はアラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸への置換である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、前記欠失又は置換が当該アスパラギン酸の欠失、又はロイシンへの置換である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３５２番目のアミノ酸基がセリンであり、前記欠失が当該セリンの欠失である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３５３番目のアミノ酸基がリジンであり、前記欠失が当該リジンの欠失である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
好ましい一態様は、配列番号１～６のいずれかに示すミノ酸配列において、配列番号１を基準としてＮ末端側から３２８番目、３３７番目、３４８番目、３５２番目及び３５３番目から選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されるか若しくは欠失した配列を有する変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３２８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであり、前記欠失又は置換が当該イソロイシンの欠失、又はアラニン、アスパラギン若しくはスパラギン酸への置換である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３３７番目のアミノ酸残基がバリンであり、前記欠失又は置換が当該バリンの欠失、又はアラニン、スレオニン若しくはアスパラギン酸への置換である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３４８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、前記欠失又は置換が当該アスパラギン酸の欠失、又はロイシンへの置換である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３５２番目のアミノ酸基がセリンであり、前記欠失が当該セリンの欠失である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
より好ましい一態様は、前記３５３番目のアミノ酸基がリジンであり、前記欠失が当該リジンの欠失である変異タウ蛋白又はその部分ペプチドをコードする変異遺伝子である。
【0018】
後記実施例に示すように、本発明の変異タウ蛋白又はその部分ペプチドを発現した細胞は、タウ凝集が強く抑制されることから、本発明の変異遺伝子、タウ変異蛋白又はその部分ペプチドは、前記タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制し、タウオパチー治療薬として有用である。また、本発明においては、タウの凝集能の喪失を、大きな領域を削るのではなく必要最小限のアミノ酸のみを除くことで実現しているところに特徴がある。タウは通常、ＭＡＰ（微小管結合タンパク）として微小管の安定化に働いており、改変する領域を極力小さくすることによって、この本来の働きを妨げることなく、凝集のみを選択的に抑制することが可能となる。
本発明における治療の対象となるタウオパチーとしては、アルツハイマー病、ピック病、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺(ＰＳＰ）などが挙げられる。
本発明における治療の対象となるタウオパチーとしては、アルツハイマー病、ピック病、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺(ＰＳＰ）などが挙げられる。
【0019】
本発明の変異遺伝子又はタウ変異蛋白を用いるタウオパチーの治療手段としては、例えば、本発明の変異遺伝子を無毒性のウイルスやプラスミドに組み込んでウイルスベクター又はプラスミドベクターとして、筋肉内、吸入、塗布などにより投与して、治療対象細胞に変異遺伝子を到達させる方法が挙げられる。用いられるウイルスとしては、神経細胞への到達性の高いアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどが挙げられる。
【実施例0020】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【0021】
実施例１
タウのＣ末端側断片（２４３－４４１ａａ）の一部を欠失あるいはＡｌａ置換によって潰した変異体の系列をヒト神経芽細胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙに発現させ、ｓｅｅｄとしてＣＢＤおよびＰＳＰ患者脳由来タウを加えて凝集を誘導した。ここで、潰した部位がもしｓｅｅｄとの反応に必要な部位であれば、ｓｅｅｄを加えても凝集が起こらなくなることが期待される。こうして重要部位を同定した後、その部位内にさらに小さい変異を入れていき、ＣＢＤ、ＰＳＰ タウによるｓｅｅｄｉｎｇに重要な部位の絞り込みを行った。
タウのＣ末端側断片（２４３－４４１ａａ）の一部を欠失あるいはＡｌａ置換によって潰した変異体の系列をヒト神経芽細胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙに発現させ、ｓｅｅｄとしてＣＢＤおよびＰＳＰ患者脳由来タウを加えて凝集を誘導した。ここで、潰した部位がもしｓｅｅｄとの反応に必要な部位であれば、ｓｅｅｄを加えても凝集が起こらなくなることが期待される。こうして重要部位を同定した後、その部位内にさらに小さい変異を入れていき、ＣＢＤ、ＰＳＰ タウによるｓｅｅｄｉｎｇに重要な部位の絞り込みを行った。
【0022】
（方法）
（１）患者脳ｓｅｅｄの調製
ＣＢＤ及びＰＳＰ患者の凍結脳０．２５ｇを１ｍＬのＡ６８バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０％ ｓｕｃｒｏｓｅ，０．８Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＧＴＡ）に浸し、氷冷しながら超音波破砕機（ＶＰ－０５０Ｎ，ＴＡＩＴＥＣ）で１分間、念入りにホモジナイズした。その後、１．５ｍＬチューブに移し替え、高速冷蔵式微量遠心機（５４２７Ｒ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で３０００ｘｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した。遠心後の上清のみを新しい１．５ｍＬチューブに回収し、これを患者脳ｓｅｅｄとして用いた。
（１）患者脳ｓｅｅｄの調製
ＣＢＤ及びＰＳＰ患者の凍結脳０．２５ｇを１ｍＬのＡ６８バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０％ ｓｕｃｒｏｓｅ，０．８Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＧＴＡ）に浸し、氷冷しながら超音波破砕機（ＶＰ－０５０Ｎ，ＴＡＩＴＥＣ）で１分間、念入りにホモジナイズした。その後、１．５ｍＬチューブに移し替え、高速冷蔵式微量遠心機（５４２７Ｒ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で３０００ｘｇ、４℃の条件下で１０分間遠心した。遠心後の上清のみを新しい１．５ｍＬチューブに回収し、これを患者脳ｓｅｅｄとして用いた。
【0023】
（２）細胞培養
ＳＨ－ＳＹ５Ｙは１０％ウシ胎児血清、ＭＥＭ 非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地を用い、ＣＯ2インキュベータ内で３７℃にて培養した。
ＳＨ－ＳＹ５Ｙは１０％ウシ胎児血清、ＭＥＭ 非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地を用い、ＣＯ2インキュベータ内で３７℃にて培養した。
【0024】
（３）プラスミドのトランスフェクションと患者脳ｓｅｅｄの細胞内導入
ＳＨ－ＳＹ５Ｙを６ウェルプレート上で７０％コンフルエントになるまで培養した後、トランスフェクション試薬としてＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ９（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、メーカーのマニュアルに従って１ウェル辺り１μｇのプラスミドを細胞内に導入した。患者脳ｓｅｅｄはトランスフェクション試薬であるＭｕｌｔｉｆｅｃｔａｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、メーカーのマニュアルに従って１ウェル辺り３μＬ分を細胞内に導入した。翌日に培地交換を行い、さらに２日間培養した。
ＳＨ－ＳＹ５Ｙを６ウェルプレート上で７０％コンフルエントになるまで培養した後、トランスフェクション試薬としてＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ９（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、メーカーのマニュアルに従って１ウェル辺り１μｇのプラスミドを細胞内に導入した。患者脳ｓｅｅｄはトランスフェクション試薬であるＭｕｌｔｉｆｅｃｔａｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、メーカーのマニュアルに従って１ウェル辺り３μＬ分を細胞内に導入した。翌日に培地交換を行い、さらに２日間培養した。
【0025】
（４）患者脳ｓｅｅｄによって凝集したタウ蛋白の界面活性剤不溶性画分への回収
培養期間を終えたＳＨ－ＳＹ５Ｙを、培地を除いたのちに１ｍＬの１ｘＰＢＳを加えてウェル底から全て剥がし、１．５ｍＬチューブに移した。その後、高速冷蔵式微量遠心機で１４，０００ｘｇ、４℃の条件で１０分間遠心した。上清を除いた後の細胞ペレットを１５０μＬのＡ６８バッファーで懸濁し、氷冷しながら超音波破砕機で１分間ホモジナイズした。細胞ライセートを超遠心機（ＣＳ１００ ＧＸ、日立）にて１００，０００ｘｇ、４℃の条件下で２０分間遠心した後、上清を５０μＬ分取し、そのうち１０μＬをＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ）での総蛋白量の定量に用いた。残りの４０μＬには５ｘＳＤＳ－サンプルバッファー１０μＬを加え、超音波破砕機で１５秒間ホモジナイズし、ヒートブロック上で１００℃にて５分間、熱処理した。これをＡ６８バッファー可溶性画分（Ｓｏｌ．）とした。上清の残りは全て除去し、その後にチューブの底部に残ったペレットに最終濃度１％になるようにＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加したＡ６８バッファー１００μＬを加え、超音波破砕機で１５秒間ホモジナイズした。溶液を超遠心機（ＣＳ１００ ＧＸ、日立）にて１００，０００ｘｇ、４℃の条件下で２０分間遠心した後、上清を除去した。残ったペレットに最終濃度１％になるようにＳａｒｋｏｓｙｌ（Ｎ－ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム，Ｗａｋｏ）を添加したＡ６８バッファー１００μＬを加え、超音波破砕機で１５秒間ホモジナイズした。溶液を超遠心機（ＣＳ１００ ＧＸ、日立）にて１００，０００ｘｇ、４℃の条件下で２０分間遠心した後、上清を除去し、ペレットにＳＤＳサンプルバッファーを加えた。その後、超音波破砕機で１５秒間ホモジナイズし、ヒートブロック上で１００℃にて５分間、熱処理した。これをＳａｒｋｏｓｙｌ不溶性画分（Ｉｎｓｏｌ．）とした。
培養期間を終えたＳＨ－ＳＹ５Ｙを、培地を除いたのちに１ｍＬの１ｘＰＢＳを加えてウェル底から全て剥がし、１．５ｍＬチューブに移した。その後、高速冷蔵式微量遠心機で１４，０００ｘｇ、４℃の条件で１０分間遠心した。上清を除いた後の細胞ペレットを１５０μＬのＡ６８バッファーで懸濁し、氷冷しながら超音波破砕機で１分間ホモジナイズした。細胞ライセートを超遠心機（ＣＳ１００ ＧＸ、日立）にて１００，０００ｘｇ、４℃の条件下で２０分間遠心した後、上清を５０μＬ分取し、そのうち１０μＬをＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ）での総蛋白量の定量に用いた。残りの４０μＬには５ｘＳＤＳ－サンプルバッファー１０μＬを加え、超音波破砕機で１５秒間ホモジナイズし、ヒートブロック上で１００℃にて５分間、熱処理した。これをＡ６８バッファー可溶性画分（Ｓｏｌ．）とした。上清の残りは全て除去し、その後にチューブの底部に残ったペレットに最終濃度１％になるようにＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加したＡ６８バッファー１００μＬを加え、超音波破砕機で１５秒間ホモジナイズした。溶液を超遠心機（ＣＳ１００ ＧＸ、日立）にて１００，０００ｘｇ、４℃の条件下で２０分間遠心した後、上清を除去した。残ったペレットに最終濃度１％になるようにＳａｒｋｏｓｙｌ（Ｎ－ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム，Ｗａｋｏ）を添加したＡ６８バッファー１００μＬを加え、超音波破砕機で１５秒間ホモジナイズした。溶液を超遠心機（ＣＳ１００ ＧＸ、日立）にて１００，０００ｘｇ、４℃の条件下で２０分間遠心した後、上清を除去し、ペレットにＳＤＳサンプルバッファーを加えた。その後、超音波破砕機で１５秒間ホモジナイズし、ヒートブロック上で１００℃にて５分間、熱処理した。これをＳａｒｋｏｓｙｌ不溶性画分（Ｉｎｓｏｌ．）とした。
【0026】
（５）ウェスタンブロッティングによる界面活性剤不溶性画分中の凝集タウの定量
バッファー可溶性画分（Ｓｏｌ．）とＳａｒｋｏｓｙｌ不溶性画分（Ｉｎｓｏｌ．）を１５％ポリアクリルアミドゲル上にアプライし、トリス－グリシンバッファーの系にて、恒温式ミニゲルスラブ電気泳動装置（ＮＡ－１０１２、日本エイドー）を用いて電気泳動を行った。アプライ量はバッファー可溶性画分の総蛋白量を元に統一した。泳動後、２連式ミニ転写装置（ＮＡ－１５１０Ｂ、日本エイドー）を用いてゲル中の蛋白をＰＢＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写し、３％ゼラチンで３０分間ブロッキング処理を行った。その後、１０％ウシ血清中で１，０００倍希釈した抗タウ抗体（Ｔ４６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を膜上にのせ、室温で一晩インキュベートした。その後、膜を１ｘＰＢＳで洗浄し、１０％ウシ血清中で５００倍希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を膜にのせて２時間室温でインキュベートした。膜を１ｘＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＣ染色キット（ｖｅｃｔｏｒ）を用いてタウ蛋白のバンドを染色した。
バッファー可溶性画分（Ｓｏｌ．）とＳａｒｋｏｓｙｌ不溶性画分（Ｉｎｓｏｌ．）を１５％ポリアクリルアミドゲル上にアプライし、トリス－グリシンバッファーの系にて、恒温式ミニゲルスラブ電気泳動装置（ＮＡ－１０１２、日本エイドー）を用いて電気泳動を行った。アプライ量はバッファー可溶性画分の総蛋白量を元に統一した。泳動後、２連式ミニ転写装置（ＮＡ－１５１０Ｂ、日本エイドー）を用いてゲル中の蛋白をＰＢＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写し、３％ゼラチンで３０分間ブロッキング処理を行った。その後、１０％ウシ血清中で１，０００倍希釈した抗タウ抗体（Ｔ４６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を膜上にのせ、室温で一晩インキュベートした。その後、膜を１ｘＰＢＳで洗浄し、１０％ウシ血清中で５００倍希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を膜にのせて２時間室温でインキュベートした。膜を１ｘＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＣ染色キット（ｖｅｃｔｏｒ）を用いてタウ蛋白のバンドを染色した。
【0027】
実施例で使用した変異前のタウ蛋白部分ペプチドのアミノ酸配列（２４３－３９１ａａ）を配列番号７に示す。配列番号７のタウ蛋白部分ペプチドに対して部分変異を行った変異タウ蛋白のアミノ酸配列を配列番号８～３０に示す。
配列番号８（Ｉ３２８Ａ）、配列番号９（Ｈ３２９Ａ）、配列番号１０（Ｑ３３６Ａ）、配列番号１１（Ｖ３３７Ａ）、配列番号１２（Δ３４８Ｄ）、配列番号１３（Δ３４９Ｒ）、配列番号１４（Δ３５０Ｖ）、配列番号１５（Δ３５１Ｑ）、配列番号１６（Δ３５２Ｓ）、配列番号１７（Δ３５３Ｋ）、配列番号１８（Ｉ３２８Ｖ）、配列番号１９（Ｉ３２８Ｌ）、配列番号２０（Ｉ３２８Ｎ）、配列番号２１（Ｉ３２８Ｄ）、配列番号２２（Ｖ３３７Ｉ）、配列番号２３（Ｖ３３７Ｌ）、配列番号２４（Ｖ３３７Ｔ）、配列番号２５（Ｖ３３７Ｄ）、配列番号２６（Ｖ３３７Ｍ）、配列番号２７（Ｄ３４８Ａ）、配列番号２８（Ｄ３４８Ｎ）、配列番号２９（Ｄ３４８Ｅ）、配列番号３０（Ｄ３４８Ｌ）
配列番号８（Ｉ３２８Ａ）、配列番号９（Ｈ３２９Ａ）、配列番号１０（Ｑ３３６Ａ）、配列番号１１（Ｖ３３７Ａ）、配列番号１２（Δ３４８Ｄ）、配列番号１３（Δ３４９Ｒ）、配列番号１４（Δ３５０Ｖ）、配列番号１５（Δ３５１Ｑ）、配列番号１６（Δ３５２Ｓ）、配列番号１７（Δ３５３Ｋ）、配列番号１８（Ｉ３２８Ｖ）、配列番号１９（Ｉ３２８Ｌ）、配列番号２０（Ｉ３２８Ｎ）、配列番号２１（Ｉ３２８Ｄ）、配列番号２２（Ｖ３３７Ｉ）、配列番号２３（Ｖ３３７Ｌ）、配列番号２４（Ｖ３３７Ｔ）、配列番号２５（Ｖ３３７Ｄ）、配列番号２６（Ｖ３３７Ｍ）、配列番号２７（Ｄ３４８Ａ）、配列番号２８（Ｄ３４８Ｎ）、配列番号２９（Ｄ３４８Ｅ）、配列番号３０（Ｄ３４８Ｌ）
【0028】
（結果）
（１）ＣＢＤに関しては３２２－３３７番目のアミノ酸を対象に欠失及び置換により部位をつぶしていき、界面活性剤不溶性画分（Ｉｎｓｏｌ．）に回収される凝集タウの量が野生型（ＷＴ）と比較して減少する変異体を同定した。
３２２～３３７番目の１６アミノ酸のうちの４アミノ酸欠失変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを図３に示す。図３より、３２６～３２９番目の４アミノ酸欠失体、３３４～３３７番目の４アミノ酸欠失体が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
３２６～３３７番目の１２アミノ酸のうちの２アミノ酸欠失変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを図４に示す。図４より、３２８～３２９番目の２アミノ酸欠失体、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失体が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
３２８、３２９、３３６又は３３７番目のアミノ酸の欠失変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを行った。その結果、３２８番目のアミノ酸欠失体（Δ３２８Ｉ）、３３７番目のアミノ酸欠失体（Δ３３７Ｖ）が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。３２８、３２９、３３６又は３３７番目のアミノ酸をアラニンに置換した変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを行った。その結果、図５に示すように、３２８番目のアミノ酸のアラニン置換体（Ｉ３２８Ａ）、３３７番目のアミノ酸のアラニン置換体（Ｖ３３７Ａ）が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
（１）ＣＢＤに関しては３２２－３３７番目のアミノ酸を対象に欠失及び置換により部位をつぶしていき、界面活性剤不溶性画分（Ｉｎｓｏｌ．）に回収される凝集タウの量が野生型（ＷＴ）と比較して減少する変異体を同定した。
３２２～３３７番目の１６アミノ酸のうちの４アミノ酸欠失変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを図３に示す。図３より、３２６～３２９番目の４アミノ酸欠失体、３３４～３３７番目の４アミノ酸欠失体が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
３２６～３３７番目の１２アミノ酸のうちの２アミノ酸欠失変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを図４に示す。図４より、３２８～３２９番目の２アミノ酸欠失体、３３６～３３７番目の２アミノ酸欠失体が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
３２８、３２９、３３６又は３３７番目のアミノ酸の欠失変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを行った。その結果、３２８番目のアミノ酸欠失体（Δ３２８Ｉ）、３３７番目のアミノ酸欠失体（Δ３３７Ｖ）が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。３２８、３２９、３３６又は３３７番目のアミノ酸をアラニンに置換した変異体のＣＢＤ ｓｅｅｄｉｎｇを行った。その結果、図５に示すように、３２８番目のアミノ酸のアラニン置換体（Ｉ３２８Ａ）、３３７番目のアミノ酸のアラニン置換体（Ｖ３３７Ａ）が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
【0029】
（２）ＰＳＰに関しては３３８－３５３番目のアミノ酸を対象に欠失及び置換により部位をつぶしていき、界面活性剤不溶性画分（Ｉｎｓｏｌ．）に回収される凝集タウの量が野生型（ＷＴ）と比較して減少する変異体を同定した。
３３８～３５３番目の１５アミノ酸のうちの２アミノ酸欠失変異体のＰＳＰ ｓｅｅｄｉｎｇを図６に示す。図６より、３４８～３５３番目のうちの２アミノ酸欠失変異体（３４８－３４９欠失体、３５０－３５１欠失体、３５２－３５２欠失体）が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
３４８～３５３番目の６アミノ酸のうちの１アミノ酸欠失変異体のＰＳＰ ｓｅｅｄｉｎｇを図７に示す。図７より、３４８番目のアミノ酸欠失変異体（Δ３４８Ｄ）、３５２番目のアミノ酸欠失体（Δ３５２Ｓ）、３５３番目のアミノ酸欠失体（Δ３５３Ｋ）が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
３３８～３５３番目の１５アミノ酸のうちの２アミノ酸欠失変異体のＰＳＰ ｓｅｅｄｉｎｇを図６に示す。図６より、３４８～３５３番目のうちの２アミノ酸欠失変異体（３４８－３４９欠失体、３５０－３５１欠失体、３５２－３５２欠失体）が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
３４８～３５３番目の６アミノ酸のうちの１アミノ酸欠失変異体のＰＳＰ ｓｅｅｄｉｎｇを図７に示す。図７より、３４８番目のアミノ酸欠失変異体（Δ３４８Ｄ）、３５２番目のアミノ酸欠失体（Δ３５２Ｓ）、３５３番目のアミノ酸欠失体（Δ３５３Ｋ）が、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
【0030】
（３）ＣＢＤ別症例によるｓｅｅｄｉｎｇを図８に示す。図８より、Ｉ３２８Ａ及びＶ３３７Ａは、ＣＢＤ＿２及びＣＢＤ＿３においても、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
ＰＳＰ別症例によるｓｅｅｄｉｎｇを図９に示す。図９より、ＰＳＰ＿２及びＰＳＰ＿３においても、Δ３４８Ｄは、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
ＰＳＰ別症例によるｓｅｅｄｉｎｇを図９に示す。図９より、ＰＳＰ＿２及びＰＳＰ＿３においても、Δ３４８Ｄは、タウのｓｅｅｄ依存性凝集を抑制した。
【0031】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】