(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023159768
(43)【公開日】2023-11-01
(54)【発明の名称】ピラノベンゾピランを基本骨格とする化合物
(51)【国際特許分類】
C07D 493/04 20060101AFI20231025BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20231025BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20231025BHJP
A61P 25/00 20060101ALN20231025BHJP
A61K 36/73 20060101ALN20231025BHJP
【ＦＩ】
C07D493/04 106A
A61K31/352
A23L33/105
A61P25/00
A61K36/73
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022069684
(22)【出願日】2022-04-20
(71)【出願人】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(72)【発明者】
【氏名】櫻田 剛史
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 知倫
【テーマコード（参考）】
4B018
4C071
4C086
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B018MD08
4B018MD61
4B018ME14
4B018MF01
4C071AA01
4C071AA07
4C071BB01
4C071CC12
4C071EE07
4C071FF17
4C071GG03
4C071HH05
4C071HH08
4C071HH09
4C071KK17
4C071LL01
4C086AA03
4C086CA01
4C086GA15
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA55
4C086NA14
4C086ZA02
4C088AB51
4C088AC01
4C088BA11
4C088CA06
4C088CA14
4C088MA52
4C088MA55
4C088NA14
4C088ZA02
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
化学式１で表される化合物。
（化学式１）
【化1】
【請求項2】
化学式２で表される化合物。
（化学式２）
【化2】
（化学式２）
【請求項3】
化学式３で表される化合物。
（化学式３）
【化3】
【請求項4】
化学式４で表される化合物。
（化学式４）
【化4】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ピラノベンゾピランを基本骨格とする新規化合物に関する。
【背景技術】
【0002】
キンミズヒキ（金水引、学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃａ ）は、バラ科キンミズヒキ属の多年草である。キンミズヒキは、漢方生薬として古くから利用されており、様々な薬理活性が知られている。また安全性も熟知されている。
キンミズヒキの抽出物は、アレルゲン不活化剤としての利用（特許文献１）、抗男性ホルモン剤および乳頭細胞増殖促進剤（特許文献２）、美白及び抗皮膚老化剤（特許文献３）、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤（特許文献４）、β－グルクロニダーゼ阻害剤（特許文献５）、中性エンドペプチダーゼ阻害剤（特許文献６）など、様々な医薬用途が提案されている。
しかし、上記に例示した先行技術にあっては、いずれも、その活性物質が何であるか特定していない。
キンミズヒキの抽出物は、アレルゲン不活化剤としての利用（特許文献１）、抗男性ホルモン剤および乳頭細胞増殖促進剤（特許文献２）、美白及び抗皮膚老化剤（特許文献３）、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤（特許文献４）、β－グルクロニダーゼ阻害剤（特許文献５）、中性エンドペプチダーゼ阻害剤（特許文献６）など、様々な医薬用途が提案されている。
しかし、上記に例示した先行技術にあっては、いずれも、その活性物質が何であるか特定していない。
【0003】
本願の発明者らは、キンミズヒキの抽出物を用いて薬理作用の研究を行っている。その過程で、キンミズヒキの水又はエタノール抽出物に神経活性化作用を見出し、神経活性化剤として特許出願を行った（特許文献７）。キンミズヒキ抽出物は、神経伝達に関与する神経細胞中のリン酸化ＣａＭＫＩＩ（ｐＣａＭＫＩＩ）及びリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ１／２）の増加をもたらし、ｃ－ｆｏｓ、ＡｒｃなどのＩＥＧ （ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ 最初期遺伝子）の発現を増強して、記憶に関わる神経を活性化し、記憶を改善する作用を有する（特許文献７参照）ことが確認されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２００８－１７４５２９号公報
【特許文献2】特開２０１０－６５００８号公報
【特許文献3】特開２０１０－６５００９号公報
【特許文献4】特開２０１０－１９５７３１号公報
【特許文献5】特開２０１０－２２０６４１号公報
【特許文献6】特開２０１１－１９０２１４号公報
【特許文献7】特開２０１８－８８８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは、神経活性化物質を特定するため、研究を行い、新規化合物を見出した。
本発明は、新規化合物を提供することを課題とする。
本発明は、新規化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の主な構成は次の通りである。
（１）化学式１で表される化合物。
（１）化学式１で表される化合物。
【0007】
【化1】
【0008】
（２）化学式２で表される化合物。
【0009】
【化2】
【0010】
（３）化学式３で表される化合物。
【0011】
【化3】
（化学式３）
【0012】
（４）化学式４で表される化合物。
【0013】
【化4】
【発明の効果】
【0014】
本発明により、ピラノベンゾピラン（Ｐｙｒａｎｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ）を基本骨格に持つ新規化合物が提供される。本発明の化合物は、ｃ－ｆｏｓなどのＩＥＧ （ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ 最初期遺伝子）の発現を増強して、記憶に関わる神経を活性化し、記憶を改善する作用を有する。
したがって、本発明の化合物は、記憶に関わる神経系の活性化に有用であり、さらに神経系活性研究の試薬として利用できる。また記憶や神経活性化剤を得るための化学合成医薬品の出発物質、あるいは研究用試薬として利用できる。さらには、本発明の化合物を含有する飲食品や医薬品として利用することができる。
したがって、本発明の化合物は、記憶に関わる神経系の活性化に有用であり、さらに神経系活性研究の試薬として利用できる。また記憶や神経活性化剤を得るための化学合成医薬品の出発物質、あるいは研究用試薬として利用できる。さらには、本発明の化合物を含有する飲食品や医薬品として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ＫＭ１－１のキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析結果
【図2】ＫＭ１－２のキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析結果
【図3】ＫＭ２－１のキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析結果
【図4】ＫＭ２－２のキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析結果
【図5】ＫＭ３－１のキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析結果
【図6】ＫＭ３－２のキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析結果
【図7】ＫＭ４－１のキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析結果
【図8】ＫＭ４－２のキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析結果
【図9】ＫＭ１－１を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＫＭ１－１、溶媒は省略）
【図10】ＫＭ１－１の相対立体構造
【図11】ＫＭ１－２を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＫＭ１－２、溶媒は省略）
【図12】ＫＭ１－２の相対立体構造
【図13】ＫＭ２－１を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＫＭ２－１、溶媒は省略）
【図14】ＫＭ２－１の相対立体構造
【図15】ＫＭ２－２を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＫＭ２－２、溶媒は省略）
【図16】ＫＭ２－２の相対立体構造
【図17】ＫＭ３－１を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＫＭ３－１、溶媒は省略）
【図18】ＫＭ３－１の相対立体構造
【図19】ＫＭ３－２を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＫＭ３－２、溶媒は省略）
【図20】ＫＭ３－２の相対立体構造
【図21】ＫＭ４－１を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＫＭ４－１、溶媒は省略）
【図22】ＫＭ４－１の相対立体構造
【図23】ＫＭ４－２を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＫＭ４－２、溶媒は省略）
【図24】ＫＭ４－２の相対立体構造
【図25】Ｒ１３を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＲ１３溶媒は省略）
【図26】Ｒ１３の絶対立体構造
【図27】Ｒ１４を取込んだ結晶スポンジの非対称単位構造（点線内が取り込まれたＲ１４溶媒は省略）
【図28】Ｒ１４の絶対立体構造
【図29】Ｒ１～Ｒ１６の絶対立体構造
【図30】ＫＭ１－１～ＫＭ４－１の最初期遺伝子発現増強作用
【図31】キンミズヒキから抽出精製、単離全体の分離・精製フローチャート
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の各新規化合物は、キンミズヒキ（金水引、学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃａ）を原料として抽出・精製工程を経ることにより得ることができる。また、化学合成によって得ることも可能である。さらにまた、キンミズヒキ以外の植物であっても、本発明の化合物を含有することが確認できた他の植物体からの抽出物や粗精製物、又は植物体の乾燥物や植物体のペーストを用いて、発明の化合物を単離精製することも可能である。
【0017】
キンミズヒキから本発明の化合物を抽出・精製する場合、通常工業的に用いるいずれの抽出・精製工程であっても適宜組み合わせて用いることができる。原料である植物の葉、茎、根、花等を、適切な時期に採取した後、そのまま、若しくは通常通風乾燥等の乾燥工程に付し、抽出原料とする。上記の乾燥した植物体から抽出を行う場合は、公知の抽出方法を採用することができる。
【0018】
すなわち、原料を粉砕若しくは細切した後、溶媒を用いて抽出を行う。抽出溶媒としては、水、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、ヘキサン、クロロホルム等の親油性の溶媒を、単独若しくは混合溶媒として用いることができる。好ましくはエタノールと水の混合溶媒である。抽出温度は、通常０～１００℃、好ましくは５～５０℃である。抽出時間は、１時間～１０日間程度であり、溶媒量は、乾燥原料あたり通常１～３０倍重量、好ましくは５～１０倍重量である。抽出操作は、攪拌によっても、浸漬放置によっても良い。
抽出操作は、必要に応じて２～３回繰り返しても良い。また市販されているキンミズヒキの抽出エキス品を化合物の単離・精製の原料としても良い。
上記の操作で得られた粗抽出液から、不溶性残渣を濾過若しくは遠心分離により取り除いた抽出液、あるいは植物の搾汁液からの各化合物の精製は、公知の生薬の分離精製方法であればどのようなものでも良い。通常は、二相溶媒分配法、向流分配法、カラムクロマトグラフィー法、分取高速液体クロマトグラフィー法等を単独又は組み合わせて用いることが好ましい。
例えば二相溶媒分配法としては、前記の抽出液からｎ－ヘキサン、クロロホルム、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸メチル等の溶媒と水との分配により、溶媒相へ目的化合物を回収する方法等があげられる。カラムクロマトグラフィー法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィー法、担体として順相系、又は逆相系シリカゲルを用いる方法、ダイヤイオンＨＰ－２０等を用いる吸着カラムクロマトグラフィー法、担体としてセファデックスＬＨ－２０等の修飾デキストランゲルを用いるゲルろ過法等があげられる。これらを単独若しくは組み合わせて、また、反復して実施する。分取高速液体クロマトグラフィー法としては、オクタデシルシリカ等を用いる逆相系のカラムを用いる方法、シリカゲル等を用いる順相系のカラムを用いる方法等があげられる。
抽出操作は、必要に応じて２～３回繰り返しても良い。また市販されているキンミズヒキの抽出エキス品を化合物の単離・精製の原料としても良い。
上記の操作で得られた粗抽出液から、不溶性残渣を濾過若しくは遠心分離により取り除いた抽出液、あるいは植物の搾汁液からの各化合物の精製は、公知の生薬の分離精製方法であればどのようなものでも良い。通常は、二相溶媒分配法、向流分配法、カラムクロマトグラフィー法、分取高速液体クロマトグラフィー法等を単独又は組み合わせて用いることが好ましい。
例えば二相溶媒分配法としては、前記の抽出液からｎ－ヘキサン、クロロホルム、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸メチル等の溶媒と水との分配により、溶媒相へ目的化合物を回収する方法等があげられる。カラムクロマトグラフィー法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィー法、担体として順相系、又は逆相系シリカゲルを用いる方法、ダイヤイオンＨＰ－２０等を用いる吸着カラムクロマトグラフィー法、担体としてセファデックスＬＨ－２０等の修飾デキストランゲルを用いるゲルろ過法等があげられる。これらを単独若しくは組み合わせて、また、反復して実施する。分取高速液体クロマトグラフィー法としては、オクタデシルシリカ等を用いる逆相系のカラムを用いる方法、シリカゲル等を用いる順相系のカラムを用いる方法等があげられる。
【0019】
本発明の化合物を含む飲食の形態としては、キンミズヒキ乾燥物を用いたお茶、各化合物の純品、当該新規化合物の部分精製品、キンミズヒキからの粗抽出物を配合した食品などがあげられる。
【0020】
お茶としては、単独又は他の茶原料と混合して用いても良い。他の茶原料としては、緑茶、ウーロン茶、プーアル茶、紅茶、ほうじ茶、玄米茶、杜仲茶、柿の葉茶、桑の葉茶など、通常お茶として食されるものであれば、どのようなものであっても用いることができる。
【0021】
本発明の化合物を含む飲食品の形態としては、お茶のほか、ドリンク剤、ゼリー、ビスケット、錠剤、丸剤、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等、通常食品として提供可能な形態であれば、いずれの形態も用いることができる。副原料として、賦形剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることもできる。
【0022】
本発明の化合物を含有する食品による各新規化合物の有効摂取量は、摂取形態、対象者の健康状態、対象者の年齢等により異なるが、通常成人一日あたり通常０．００１～１００ ｍｇ、好ましくは０．０１～１０ ｍｇ、さらに好ましくは０．１～１ ｍｇである。
【0023】
本発明の化合物を含有する医薬品の投与経路としては、特に限定されない。経口投与・直腸内投与等の経腸投与、経鼻投与などの粘膜投与、静脈内投与・皮下投与などの注射投与等を例示できる。本発明の医薬品の剤型としては、投与方法に適した製剤の形態をとることができる。錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末、丸剤、トローチ剤等の固形剤、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤などの液剤、ゲル状の製剤などが例示できる。各化合物の純品、精製物、粗精製物等をそのまま投与しても良いが、薬理的に許容される賦形剤とともに投与しても良い。また記憶等に係る神経の活性化に関する有効成分として、本発明の化合物のみを含有させることができる。そして、さらにその他の神経系の活性化に関する有効成分を併用できる。
賦形剤としては、単糖類、二糖類、多糖類、無機塩、油脂、蒸留水などの製剤として一般に使用可能なものであればいずれも用いることができる。製剤化する際には、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤等の添加剤を用いることもできる。
賦形剤としては、単糖類、二糖類、多糖類、無機塩、油脂、蒸留水などの製剤として一般に使用可能なものであればいずれも用いることができる。製剤化する際には、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤等の添加剤を用いることもできる。
【0024】
本発明の各化合物を含む医薬品としての投与量は、投与経路、剤形、疾患の症状、対象者の年齢等により異なる。一般的に、成人一日あたり０．１～１０００ ｍｇ、好ましくは０．５～３００ ｍｇ、さらに好ましくは１～１００ ｍｇである。
【実施例0025】
以下に、本発明の各化合物をキンミズヒキから抽出精製し、単離した化合物を特定した実施例を示す。また精製した各化合物を用いた神経細胞の活性化試験例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。
【0026】
抽出・分離・精製
乾燥キンミズヒキ（Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃａ）の粉砕物５ ｋｇを１０倍量の９９．５％エタノールにて２時間還流抽出を行った。得られた抽出液を減圧濃縮し、エタノール抽出固形７５０ ｇを得た。エタノール抽出固形をＤＩＡＮＩＯＮ ＨＰ－２０（三菱ケミカル）を充填したオープンカラム（３５ｃｍ×１１ｃｍ Ｉ．Ｄ．）に供し、水、８０％メタノール、メタノール、アセトンの順に通液した。メタノール、アセトン溶出部をまとめて減圧濃縮し、メタノール＋アセトン溶出固形（６２ ｇ）を得た。クロロフィルを除去するため、メタノール＋アセトン溶出固形を９５％エタノール１ Ｌに再溶解し、活性炭３０ ｇを加え、４５℃下で３０分間撹拌した。その後、濾液を減圧濃縮し活性炭処理物２４ ｇを得た。活性単処理物をＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ（富士シリシア）を充填したオープンカラム（５０ ｃｍ×５ ｃｍ Ｉ．Ｄ．）に供し、メタノール－水混液（メタノール： 水＝６０： ４０ → １００： ０）を通液し、８０％メタノール溶出画分４．４ ｇを得た。８０％メタノール溶出画分をＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填したオープンカラム（１０ ｃｍ×５ ｃｍ Ｉ．Ｄ．）に供し、ヘキサン－酢酸エチル混液（ヘキサン： 酢酸エチル＝８０： ２０ → ０：１００）を通液し、ヘキサン：酢酸エチル＝８０： ２０溶出画分２．４ ｇを得た。ヘキサン：酢酸エチル＝８０： ２０溶出画分を分取ＨＰＬＣに供し、ＫＭ １－４を得た。全体の分離・精製フローチャートを図３１に示す。分取ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
乾燥キンミズヒキ（Ａｇｒｉｍｏｎｉａ ｐｉｌｏｓａ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃａ）の粉砕物５ ｋｇを１０倍量の９９．５％エタノールにて２時間還流抽出を行った。得られた抽出液を減圧濃縮し、エタノール抽出固形７５０ ｇを得た。エタノール抽出固形をＤＩＡＮＩＯＮ ＨＰ－２０（三菱ケミカル）を充填したオープンカラム（３５ｃｍ×１１ｃｍ Ｉ．Ｄ．）に供し、水、８０％メタノール、メタノール、アセトンの順に通液した。メタノール、アセトン溶出部をまとめて減圧濃縮し、メタノール＋アセトン溶出固形（６２ ｇ）を得た。クロロフィルを除去するため、メタノール＋アセトン溶出固形を９５％エタノール１ Ｌに再溶解し、活性炭３０ ｇを加え、４５℃下で３０分間撹拌した。その後、濾液を減圧濃縮し活性炭処理物２４ ｇを得た。活性単処理物をＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ（富士シリシア）を充填したオープンカラム（５０ ｃｍ×５ ｃｍ Ｉ．Ｄ．）に供し、メタノール－水混液（メタノール： 水＝６０： ４０ → １００： ０）を通液し、８０％メタノール溶出画分４．４ ｇを得た。８０％メタノール溶出画分をＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填したオープンカラム（１０ ｃｍ×５ ｃｍ Ｉ．Ｄ．）に供し、ヘキサン－酢酸エチル混液（ヘキサン： 酢酸エチル＝８０： ２０ → ０：１００）を通液し、ヘキサン：酢酸エチル＝８０： ２０溶出画分２．４ ｇを得た。ヘキサン：酢酸エチル＝８０： ２０溶出画分を分取ＨＰＬＣに供し、ＫＭ １－４を得た。全体の分離・精製フローチャートを図３１に示す。分取ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
【0027】
［分取ＨＰＬＣ条件］］
得られたＫＭ １－４をリサイクル分取ＨＰＬＣに供し、各ＫＭ１－１～ＫＭ４－２を得た。リサイクル分取ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
得られたＫＭ １－４をリサイクル分取ＨＰＬＣに供し、各ＫＭ１－１～ＫＭ４－２を得た。リサイクル分取ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
【0028】
［ＫＭ １、ＫＭ ２のリサイクル分取ＨＰＬＣ条件］
【0029】
［ＫＭ ３、ＫＭ ４のリサイクル分取ＨＰＬＣ条件］
得られたＫＭ１－１～ＫＭ ４－２を更にキラルカラムを用いて光学純度を調査した。その結果、ＫＭ １－１はＲ１、Ｒ２からなるラセミ体、ＫＭ１－２はＲ３、Ｒ４からなるラセミ体、ＫＭ２－１はＲ５、Ｒ６からなるラセミ体、ＫＭ２－２はＲ７、Ｒ８からなるラセミ体、ＫＭ３－１はＲ９、Ｒ１０からなるラセミ体、ＫＭ３－２はＲ１１、Ｒ１２からなるラセミ体、ＫＭ４－１はＲ１３、Ｒ１４からなるラセミ体、ＫＭ４－２はＲ１５、Ｒ１６からなるラセミ体であることが明らかとなった（図１－８）。ＨＰＬＣ条件は下記の通りである。
得られたＫＭ１－１～ＫＭ ４－２を更にキラルカラムを用いて光学純度を調査した。その結果、ＫＭ １－１はＲ１、Ｒ２からなるラセミ体、ＫＭ１－２はＲ３、Ｒ４からなるラセミ体、ＫＭ２－１はＲ５、Ｒ６からなるラセミ体、ＫＭ２－２はＲ７、Ｒ８からなるラセミ体、ＫＭ３－１はＲ９、Ｒ１０からなるラセミ体、ＫＭ３－２はＲ１１、Ｒ１２からなるラセミ体、ＫＭ４－１はＲ１３、Ｒ１４からなるラセミ体、ＫＭ４－２はＲ１５、Ｒ１６からなるラセミ体であることが明らかとなった（図１－８）。ＨＰＬＣ条件は下記の通りである。
【0030】
［ＫＭ １－１～ＫＭ ４－２のキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析条件］
【0031】
平面構造決定
ＫＭ－１－１～ＫＭ ４－２の平面構造は質量分析法（エレクトロスプレーイオン－飛行時間型質量分析計（ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ）、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ／ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｔｏｆ、Ｗａｔｅｒｓ）と核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ、ＪＮＭ－ＥＣＳ ４００、日本電子）により決定した。
分離、精製した各化合物の１次元ＮＭＲ（１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ）、二次元ＮＭＲ（ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＮＯＥＳＹ）、高分解能ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）データより決定した平面構造式を以下に示す。
ＫＭ－１－１～ＫＭ ４－２の平面構造は質量分析法（エレクトロスプレーイオン－飛行時間型質量分析計（ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ）、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ／ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｔｏｆ、Ｗａｔｅｒｓ）と核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ、ＪＮＭ－ＥＣＳ ４００、日本電子）により決定した。
分離、精製した各化合物の１次元ＮＭＲ（１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ）、二次元ＮＭＲ（ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＮＯＥＳＹ）、高分解能ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）データより決定した平面構造式を以下に示す。
【0032】
【化5】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ： Ｃ２５Ｈ３０Ｏ９
ＨＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｉｏｎ ＥＳＩ－ＭＳ： ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２５Ｈ３１Ｏ９ ： ｍ／ｚ ４７５．１９６８ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋， ｆｏｕｎｄ： ４７５．１９５３
【0033】
【化6】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ： Ｃ２５Ｈ３０Ｏ９
ＨＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｉｏｎ ＥＳＩ－ＭＳ： ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２５Ｈ３１Ｏ９ ： ｍ／ｚ ４７５．１９６８ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋， ｆｏｕｎｄ： ４７５．１９６７
【0034】
【化7】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ： Ｃ２５Ｈ３０Ｏ９
ＨＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｉｏｎ ＥＳＩ－ＭＳ： ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２５Ｈ３１Ｏ９ ： ｍ／ｚ ４７５．１９６８ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋， ｆｏｕｎｄ： ４７５．１９７１
【0035】
【化8】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ： Ｃ２５Ｈ３０Ｏ９
ＨＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｉｏｎ ＥＳＩ－ＭＳ： ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２５Ｈ３１Ｏ９ ： ｍ／ｚ ４７５．１９６８ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋， ｆｏｕｎｄ： ４７５．１９６７
【0036】
【化9】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ： Ｃ２６Ｈ３２Ｏ９
ＨＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｉｏｎ ＥＳＩ－ＭＳ： ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ３３Ｏ９ ： ｍ／ｚ ４８９．２１２５ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋， ｆｏｕｎｄ： ４８９． ２１３７
【0037】
【化10】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ： Ｃ２６Ｈ３２Ｏ９
ＨＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｉｏｎ ＥＳＩ－ＭＳ： ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ３３Ｏ９ ： ｍ／ｚ ４８９．２１２５ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋， ｆｏｕｎｄ： ４８９．２１３５
【0038】
【化11】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ： Ｃ２６Ｈ３２Ｏ９
ＨＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｉｏｎ ＥＳＩ－ＭＳ： ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ３３Ｏ９ ： ｍ／ｚ ４８９．２１２５ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋， ｆｏｕｎｄ： ４８９．２１４６
【0039】
【化12】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ： Ｃ２６Ｈ３２Ｏ９
ＨＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｉｏｎ ＥＳＩ－ＭＳ： ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ３３Ｏ９ ： ｍ／ｚ ４８９．２１２５ ［Ｍ＋Ｈ］ ＋， ｆｏｕｎｄ： ４８９．２１３６
【0040】
相対立体構造決定
ラセミ体であるＫＭ１－１～ＫＭ４－２について、それぞれ結晶スポンジ法を用いて相対立体構造を決定した。結晶スポンジは、２，４，６－トリ（４－ピリジル）－１，３，５－トリアジンと塩化亜鉛からＣｈｅｍ． Ｅｕｒ． Ｊ． ２０１７， ２３， １５０３５-１５０４０に記載の方法に従って作製した。結晶スポンジへの各化合物の取込（ソーキング）はＩＵＣｒＪ ２０１６， ３， １３９-１５１に記載の方法に準じた。すなわち、結晶スポンジ１粒をｎ－ｈｅｘａｎｅ ４５μＬとともに１．２ ｍＬ Ｖ底マイクロバイアルに添加し、そこに各化合物を溶解したジメトキシエタン溶液を５μＬ添加した。バイアルにキャップをし５０℃でインキュベートした。このときバイアルに針を刺して１～４日かけて緩やかに溶媒を揮発させた。各化合物のソーキング条件を表１に示す。
ラセミ体であるＫＭ１－１～ＫＭ４－２について、それぞれ結晶スポンジ法を用いて相対立体構造を決定した。結晶スポンジは、２，４，６－トリ（４－ピリジル）－１，３，５－トリアジンと塩化亜鉛からＣｈｅｍ． Ｅｕｒ． Ｊ． ２０１７， ２３， １５０３５-１５０４０に記載の方法に従って作製した。結晶スポンジへの各化合物の取込（ソーキング）はＩＵＣｒＪ ２０１６， ３， １３９-１５１に記載の方法に準じた。すなわち、結晶スポンジ１粒をｎ－ｈｅｘａｎｅ ４５μＬとともに１．２ ｍＬ Ｖ底マイクロバイアルに添加し、そこに各化合物を溶解したジメトキシエタン溶液を５μＬ添加した。バイアルにキャップをし５０℃でインキュベートした。このときバイアルに針を刺して１～４日かけて緩やかに溶媒を揮発させた。各化合物のソーキング条件を表１に示す。
【0041】
表１ 各化合物の結晶スポンジ法分析時のソーキング条件エラー! リンクが正しくありません。ソーキング後の結晶スポンジを単結晶Ｘ線回折装置（Ｓｙｎｅｒｇｙ－Ｒ、Ｒｉｇａｋｕ）にマウントし、１００ Ｋにて回折測定を実施した。データ解析はＩＵＣｒＪ ２０１６， ３， １３９－１５１に記載の方法に準じた。いずれの化合物も結晶スポンジに取り込まれ、その構造を観測することが可能であった。各化合物を取り込んだ結晶スポンジを解析した際の結晶データを表２および３にまとめた。
【0042】
表２ ＫＭ１－１、ＫＭ１－２、ＫＭ２－１、ＫＭ２－２を結晶スポンジ法で解析した際の結晶データ
【0043】
表３ ＫＭ３－１、ＫＭ３－２、ＫＭ４－１、ＫＭ４－２を結晶スポンジ法で解析した際の結晶データ
【0044】
ＫＭ１－１を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図９に、取り込まれたＫＭ１－１の相対立体構造を図１０に示す。
ＫＭ１－２を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１１に、取り込まれたＫＭ１－２の相対立体構造を図１２に示す。
ＫＭ２－１を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１３に、取り込まれたＫＭ２－１の相対立体構造を図１４に示す。
ＫＭ２－２を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１５に、取り込まれたＫＭ２－２の相対立体構造を図１６に示す。
ＫＭ３－１を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１７に、取り込まれたＫＭ３－１の相対立体構造を図１８に示す。
ＫＭ３－２を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１９に、取り込まれたＫＭ３－２の相対立体構造を図２０に示す。
ＫＭ４－１を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図２１に、取り込まれたＫＭ４－１の相対立体構造を図２２に示す。
ＫＭ４－２を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図２３に、取り込まれたＫＭ４－２の相対立体構造を図２４に示す。
ＫＭ１－２を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１１に、取り込まれたＫＭ１－２の相対立体構造を図１２に示す。
ＫＭ２－１を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１３に、取り込まれたＫＭ２－１の相対立体構造を図１４に示す。
ＫＭ２－２を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１５に、取り込まれたＫＭ２－２の相対立体構造を図１６に示す。
ＫＭ３－１を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１７に、取り込まれたＫＭ３－１の相対立体構造を図１８に示す。
ＫＭ３－２を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図１９に、取り込まれたＫＭ３－２の相対立体構造を図２０に示す。
ＫＭ４－１を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図２１に、取り込まれたＫＭ４－１の相対立体構造を図２２に示す。
ＫＭ４－２を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図２３に、取り込まれたＫＭ４－２の相対立体構造を図２４に示す。
【0045】
絶対立体構造決定
ラセミ体ＫＭ４－１を図７に記載したＲ１３およびＲ１４の各エナンチオマーに分割し、エナンチオピュアなＲ１３およびＲ１４、それぞれを同様に結晶スポンジ法で分析した。Ｒ１３もしくはＲ１４を取り込むことで、結晶スポンジの空間群がアキラルなＣ２／ｃからキラルなＣ２へ変化した。各化合物を取り込んだ結晶スポンジを解析した際の結晶データを表４にまとめた。
ラセミ体ＫＭ４－１を図７に記載したＲ１３およびＲ１４の各エナンチオマーに分割し、エナンチオピュアなＲ１３およびＲ１４、それぞれを同様に結晶スポンジ法で分析した。Ｒ１３もしくはＲ１４を取り込むことで、結晶スポンジの空間群がアキラルなＣ２／ｃからキラルなＣ２へ変化した。各化合物を取り込んだ結晶スポンジを解析した際の結晶データを表４にまとめた。
【0046】
【0047】
Ｒ１３を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図２５に、取り込まれたＲ１３の絶対立体構造を図２６に示す。
Ｒ１４を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図２７に、取り込まれたＲ１４の絶対立体構造を図２８に示す。
以上の結果より、図１～図８に記載したキラルカラムを用いた分析条件にて、ピラノベンゾピラン環が４ａＲ，１０ａＳ配置のエナンチオマーが溶出時間の早いピーク、４ａＳ，１０ａＲ配置のエナンチオマーが溶出時間の遅いピークであることが分かった。Ｒ１～Ｒ１６の絶対立体構造をまとめると図２９の通りである。
Ｒ１４を取込んだ結晶スポンジを解析した際の非対称単位を図２７に、取り込まれたＲ１４の絶対立体構造を図２８に示す。
以上の結果より、図１～図８に記載したキラルカラムを用いた分析条件にて、ピラノベンゾピラン環が４ａＲ，１０ａＳ配置のエナンチオマーが溶出時間の早いピーク、４ａＳ，１０ａＲ配置のエナンチオマーが溶出時間の遅いピークであることが分かった。Ｒ１～Ｒ１６の絶対立体構造をまとめると図２９の通りである。
【0048】
最初期遺伝子発現増強作用の検証
妊娠１７日目のＳＤラット（日本エスエルシー）から胎仔を取り出し、大脳皮質と海馬を単離した後、神経細胞分散液キット（住友ベークライト）を用いて添付の説明書に従い、初代神経細胞を調製した。調製したラット初代神経細胞を２％ Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、０．５ ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むニューロベイサル培地（Ｇｉｂｃｏ）で４ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように縣濁し、ポリ－Ｌ－リジンコートの４８ウエルプレート（住友ベークライト）に３５０ μｌずつ播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下で７日間培養した。
ＫＭ１－１ （３ μＭ）、ＫＭ１－２ （３０ μＭ）、ＫＭ２－１ （１０ μＭ）、ＫＭ２－２ （１ μＭ） 、ＫＭ３－１（３ μＭ）、ＫＭ３－２ （３ μＭ）、ＫＭ４－１ （３ μＭ）、ＫＭ４－２ （３ μＭ）になるように添加し１時間、または２時間（ＫＭ１－１、１－２）培養した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。約５０ ｎｇの調製したＲＮＡは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用し、添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
ｃ－ｆｏｓ発現量は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用い、内在性コントロールにはラットＧＡＰＤＨ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いて、次の方法で定量した。１ μｌ ｃＤＮＡ、ラットＧＡＰＤＨ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、ラットｃ－ｆｏｓ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑを所定の割合で混合し、計１０ μＬとなるように混合したものを反応液とした。
調製した反応液は、Ｑｕｎｔｉ Ｓｔｕｄｉｏ ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］ｘ ４５サイクルの反応条件で測定を行った。測定より得られたＣｔ値からＧＡＰＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
妊娠１７日目のＳＤラット（日本エスエルシー）から胎仔を取り出し、大脳皮質と海馬を単離した後、神経細胞分散液キット（住友ベークライト）を用いて添付の説明書に従い、初代神経細胞を調製した。調製したラット初代神経細胞を２％ Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、０．５ ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むニューロベイサル培地（Ｇｉｂｃｏ）で４ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように縣濁し、ポリ－Ｌ－リジンコートの４８ウエルプレート（住友ベークライト）に３５０ μｌずつ播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下で７日間培養した。
ＫＭ１－１ （３ μＭ）、ＫＭ１－２ （３０ μＭ）、ＫＭ２－１ （１０ μＭ）、ＫＭ２－２ （１ μＭ） 、ＫＭ３－１（３ μＭ）、ＫＭ３－２ （３ μＭ）、ＫＭ４－１ （３ μＭ）、ＫＭ４－２ （３ μＭ）になるように添加し１時間、または２時間（ＫＭ１－１、１－２）培養した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。約５０ ｎｇの調製したＲＮＡは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用し、添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
ｃ－ｆｏｓ発現量は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用い、内在性コントロールにはラットＧＡＰＤＨ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いて、次の方法で定量した。１ μｌ ｃＤＮＡ、ラットＧＡＰＤＨ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、ラットｃ－ｆｏｓ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑを所定の割合で混合し、計１０ μＬとなるように混合したものを反応液とした。
調製した反応液は、Ｑｕｎｔｉ Ｓｔｕｄｉｏ ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］ｘ ４５サイクルの反応条件で測定を行った。測定より得られたＣｔ値からＧＡＰＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
【0049】
測定結果を図３０に示した。以上のラット初代神経系培養細胞を用いた試験から、各化合物は、最初期遺伝子であるｃ－ｆｏｓの発現を増加することから神経を活性化することが判明した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】