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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023160200
(43)【公開日】2023-11-02
(54)【発明の名称】バイオマス由来ムコン酸の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/44 20060101AFI20231026BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231026BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231026BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20231026BHJP
【ＦＩ】
C12P7/44 ZNA
C12N1/21
C12N15/31
C12N15/52 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022070375
(22)【出願日】2022-04-21
(71)【出願人】
【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504229284
【氏名又は名称】国立大学法人弘前大学
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100172557
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 啓靖
(72)【発明者】
【氏名】栗原 宏征
(72)【発明者】
【氏名】鶴谷 篤生
(72)【発明者】
【氏名】園木 和典
(72)【発明者】
【氏名】樋口 雄大
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD15
4B064BJ04
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA01Y
4B065AA29Y
4B065AA41X
4B065AA44Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA11
4B065CA54
4B065CA55
(57)【要約】
【課題】バイオマス原料からムコン酸を高効率に製造する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】以下の工程（１）および（２）を含む、ムコン酸の製造方法。
工程（１）：リグニン含有バイオマスをアルカリ処理し、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られた抽出液にＣａｔＢ酵素およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させ、前記細菌により前記酢酸を生育炭素源として代謝させるとともに、前記細菌により前記クマル酸および前記フェルラ酸をムコン酸に変換させる工程
【選択図】図１
【解決手段】以下の工程（１）および（２）を含む、ムコン酸の製造方法。
工程（１）：リグニン含有バイオマスをアルカリ処理し、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られた抽出液にＣａｔＢ酵素およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させ、前記細菌により前記酢酸を生育炭素源として代謝させるとともに、前記細菌により前記クマル酸および前記フェルラ酸をムコン酸に変換させる工程
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程（１）および（２）を含む、ムコン酸の製造方法。
工程（１）：リグニン含有バイオマスをアルカリ処理し、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られた前記抽出液にＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させ、前記細菌により前記酢酸を生育炭素源として代謝させるとともに、前記細菌により前記クマル酸および前記フェルラ酸をムコン酸に変換させる工程
工程（１）：リグニン含有バイオマスをアルカリ処理し、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られた前記抽出液にＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させ、前記細菌により前記酢酸を生育炭素源として代謝させるとともに、前記細菌により前記クマル酸および前記フェルラ酸をムコン酸に変換させる工程
【請求項2】
前記リグニン含有バイオマスがバガスである、請求項１に記載のムコン酸の製造方法。
【請求項3】
工程（１）で得られた前記抽出液が酢酸を２ｇ／Ｌ以上含む、請求項１に記載のムコン酸の製造方法。
【請求項4】
工程（１）で得られた前記抽出液が糖を実質的に含まない、請求項１に記載のムコン酸の製造方法。
【請求項5】
前記シュードモナス属細菌が、ＡｒｏＹ酵素発現、ＫｐｄＢ酵素発現、ＣａｔＡ酵素発現、ＶａｎＡおよびＢ酵素発現ならびにＰｏｂＡ酵素発現から選択される１種または２種以上の酵素発現が強化されたシュードモナス属細菌である、請求項１に記載のムコン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオマスを原料とするムコン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ムコン酸は、分子内に二重結合を含む炭素数６個のジカルボン酸であり、化学変換により、アジピン酸やテレフタル酸などのバイオモノマーへの変換が可能である。また、ムコン酸誘導体は、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱効果性プラ、コーティング剤としても使用される。
【0003】
ムコン酸は、バイオマス由来の糖や芳香族化合物から微生物による変換にて製造できることが知られている。例えば、非特許文献１では、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｕ ｐｕｔｉｄａ）のｐｃａＨＧ遺伝子などを破壊し、ｐ－クマル酸によるムコン酸を製造したことが記載されている（非特許文献１）。
【0004】
一方、バイオマスからフェルラ酸、クマル酸などのヒドロキシ桂皮酸類を製造する方法が知られており、原料としてサトウキビ絞り粕であるバガスが利用できることが開示されている（特許文献１）。
【0005】
また、コーンストーバーをアルカリ抽出することで、フェルラ酸およびクマル酸を含む抽出液を調製し、この抽出液にｐｃａＨＧ遺伝子およびｃａｔＲＢＣ遺伝子が破壊されたシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｕ ｐｕｔｉｄａ）を投入し、フェルラ酸およびクマル酸からムコン酸を製造する方法が開示されている（非特許文献２）。但し、微生物の増殖や培養には、副原料としてグルコースなどの炭素源をアルカリ抽出液以外の成分として添加する必要があった
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】ＷＯ２０１７／１７０５４９号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｃ．Ｗ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ３， １１１－１１９，２０１６
【非特許文献2】Ｄａｖｉｎｉａ Ｓａｌｖａｃｈｕａ ｅｔ ａｌ．Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０２１），５００７－５０１９，２０１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、バイオマス原料からムコン酸を高効率に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は、バイオマス原料であるリグニン含有バイオマスのアルカリ抽出液に含まれるヒドロキシ桂皮酸類に着目して鋭意検討を重ねた結果、ＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌は、リグニン含有バイオマスのアルカリ抽出液に含まれる酢酸を生育炭素源として代謝して生育しながら、同じくリグニン含有バイオマスのアルカリ抽出液に含まれるクマル酸およびフェルラ酸をムコン酸（例えばｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸）に変換することを見出し、本発明を完成した。
【0010】
すなわち、本発明は以下の［１］～［５］を包含する。
［１］以下の工程（１）および（２）を含む、ムコン酸の製造方法。
工程（１）：リグニン含有バイオマスをアルカリ処理し、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られた前記抽出液にＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させ、前記細菌により前記酢酸を生育炭素源として代謝させるとともに、前記細菌により前記クマル酸および前記フェルラ酸をムコン酸に変換させる工程
［２］前記リグニン含有バイオマスがバガスである、［１］に記載のムコン酸の製造方法。
［３］工程（１）で得られた前記抽出液が酢酸を２ｇ／Ｌ以上含む、［１］または［２］に記載のムコン酸の製造方法。
［４］工程（１）で得られた前記抽出液が糖を実質的に含まない、［１］～［３］のいずれかに記載のムコン酸の製造方法。
［５］前記シュードモナス属細菌が、ＡｒｏＹ酵素発現、ＫｐｄＢ酵素発現、ＣａｔＡ酵素発現、ＶａｎＡおよびＢ酵素発現ならびＰｏｂＡ酵素発現から選択される１種または２種以上の酵素発現が強化されたシュードモナス属細菌である、［１］～［４］のいずれかに記載のムコン酸の製造方法。
［１］以下の工程（１）および（２）を含む、ムコン酸の製造方法。
工程（１）：リグニン含有バイオマスをアルカリ処理し、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られた前記抽出液にＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させ、前記細菌により前記酢酸を生育炭素源として代謝させるとともに、前記細菌により前記クマル酸および前記フェルラ酸をムコン酸に変換させる工程
［２］前記リグニン含有バイオマスがバガスである、［１］に記載のムコン酸の製造方法。
［３］工程（１）で得られた前記抽出液が酢酸を２ｇ／Ｌ以上含む、［１］または［２］に記載のムコン酸の製造方法。
［４］工程（１）で得られた前記抽出液が糖を実質的に含まない、［１］～［３］のいずれかに記載のムコン酸の製造方法。
［５］前記シュードモナス属細菌が、ＡｒｏＹ酵素発現、ＫｐｄＢ酵素発現、ＣａｔＡ酵素発現、ＶａｎＡおよびＢ酵素発現ならびＰｏｂＡ酵素発現から選択される１種または２種以上の酵素発現が強化されたシュードモナス属細菌である、［１］～［４］のいずれかに記載のムコン酸の製造方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明では、ＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌により、リグニン含有バイオマスのアルカリ抽出液に含まれる酢酸が生育炭素源として代謝されるとともに、同じ抽出液中のクマル酸およびフェルラ酸がムコン酸に変換される。すなわち、酢酸は、ムコン酸の製造における不純物であり、シュードモナス属細菌により除去される。また、リグニン含有バイオマスのアルカリ抽出液には、ギ酸、乳酸、アミノ酸などその他の不純物も含まれ得るが、シュードモナス属細菌より除去される。これらの効果により、純度の高いムコン酸を少ない精製ステップで得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
＜工程（１）＞
工程（１）は、リグニン含有バイオマスをアルカリ処理し、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得る工程である。以下、工程（１）について説明する。
＜工程（１）＞
工程（１）は、リグニン含有バイオマスをアルカリ処理し、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得る工程である。以下、工程（１）について説明する。
【0014】
本発明において、リグニン含有バイオマスとは、少なくともリグニン成分を含む生物資源のことを指す。リグニン含有バイオマスの具体例としては、バガス、コーンコブ、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなどの草本系バイオマス；樹木、廃建材などの木質系バイオマス；木質系バイオマスから得られるパルプ；藻類、海草など水生環境由来のバイオマス；コーン外皮、小麦外皮、大豆外皮、籾殻などの穀物外皮バイオマスなどが挙げられる。
【0015】
本発明において、アルカリ処理とは、リグニン含有バイオマス１ｇ重量あたりアルカリ成分を０．１～１ｇ添加して、常温または加温下で、一定時間放置する処理である。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニアなどを使用することができる。アルカリ処理の温度は、常温～３００℃の範囲において、クマル酸、フェルラ酸および酢酸の抽出量が最大になるように設定すればよい。アルカリ処理の温度は、好ましくは５０℃以上１００℃未満、より好ましくは６５℃以上９０℃以下である。アルカリ処理におけるリグニン含有バイオマスの固形分濃度は、好ましくは１～２５重量％、より好ましくは５～２０重量％の範囲となるように加水をして調整される。アルカリ処理の反応後、アルカリ抽出液には、クマル酸、フェルラ酸および酢酸が溶解して含まれるため、固形分を分離除去することにより、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得ることができる。固液分離の方法は、特に限定されないが、スクリューデカンタなどによる遠心分離；フィルタープレスなどによる膜分離；ベルトプレス、ベルトフィルター、自然沈降などによる分離；メッシュスクリーン、不織布、ろ紙などによるろ過法などにより固液分離を行うことができる。前記操作によって得られた、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液は、シュードモナス属細菌を投入する前に酸を投入し、中和することが好ましい。中和することにより、細菌の成育に適するｐＨに調整することができる。中和後のｐＨは、好ましくはｐＨ６～８の範囲である。前記操作によって得られた、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液に対して、工程（２）で使用する前に成分濃度の調整を行ってもよい。
【0016】
好ましい一実施形態において、工程（１）は、バガスをアルカリ処理した後、中和し固形分を除去して、クマル酸、フェルラ酸および酢酸を含む抽出液を得る工程である。
【0017】
工程（１）で得られた抽出液のクマル酸濃度は、例えば１～１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０～２００ｍｇ／Ｌである。工程（１）で得られた抽出液のフェルラ酸濃度は、例えば１～１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０～２００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０～５０ｍｇ／Ｌである。クマル酸およびフェルラ酸はいずれもムコン酸に変換できるため、クマル酸およびフェルラ酸濃度は高い方が好ましい。
【0018】
工程（１）で得られた抽出液の酢酸濃度は、好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２ｇ／Ｌ以上含まれる。酢酸濃度の上限は特に制限はないが、好ましくは５０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。これらの上限はそれぞれ、上述の下限のいずれと組み合わせてもよい。
【0019】
工程（１）で得られた抽出液は、クマル酸およびフェルラ酸に加えて、バニリン酸、バニリンなどのその他の芳香族化合物を含んでいてもよい。これらの芳香族化合物は、工程（２）において、本発明のシュードモナス属細菌の生育炭素源として利用される。工程（１）で得られた抽出液のバニリン酸濃度は、例えば０～１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは０～１０ｍｇ／Ｌである。工程（１）で得られた抽出液のバニリン濃度は、例えば０～１００ｍｇ／ｍ、好ましくは０～１０ｍｇ／Ｌである。なお、バニリンおよび／またはバニリン酸濃度が１００ｍｇ／Ｌを超えると、微生物増殖が阻害されることがある。
【0020】
工程（１）で得られた抽出液は、通常、ムコン酸を含まない。
【0021】
工程（１）で得られた抽出液の糖濃度は、好ましくは５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは１ｇ／Ｌ以下、より好ましくは検出限界以下である。本発明において、「抽出液が糖を実質的に含まない」とは、抽出液の糖濃度が検出限界以下であることを意味し、「検出限界以下」は、参考例１に記載のＨＰＬＣ条件で測定した場合に検出限界以下であることを意味する。工程（１）で得られた抽出液の糖濃度が５ｇ／Ｌ以上であると、ムコン酸生成速度および／またはムコン酸収率が減少する。これはシュードモナス属細菌が糖を炭素源として優先消費するためである。ここで、糖とは、単糖（例えば、グルコール、フルクトース、キシロース、マンノース、アラビノースなど）、二糖（例えば、スクロースなど）、オリゴ糖、多糖などを意味する。糖は、単糖および二糖から選択される１種または２種以上の糖であることが好ましい。工程（１）で得られた抽出液が２種以上の糖を含む場合、糖濃度は、当該２種以上の糖の合計濃度を意味する。
【0022】
工程（１）で得られた抽出液は、酢酸の他に、ギ酸および乳酸からなる群から選択される１種または２種の有機酸を含むことが好ましい。これらの有機酸は、工程（２）において、本発明のシュードモナス属細菌のための生育炭素源として利用される。有機酸は、ムコン酸生成速度、ムコン酸収率を下げることなくシュードモナス属細菌の生育炭素源として利用され得る。工程（１）で得られた抽出液中の酢酸以外の有機酸の濃度は、例えば１～１０，０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０～２，０００ｍｇ／Ｌである。工程（１）で得られた抽出液が酢酸以外の２種以上の有機酸を含む場合、酢酸以外の有機酸の濃度は、酢酸以外の２種以上の有機酸の合計濃度を意味する。
【0023】
＜工程（２）＞
工程（２）は、工程（１）で得られた抽出液にＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させ、前記細菌により前記酢酸を生育炭素源として代謝させるとともに、前記細菌により前記クマル酸および前記フェルラ酸をムコン酸に変換させる工程である。以下、工程（２）について説明する。
工程（２）は、工程（１）で得られた抽出液にＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させ、前記細菌により前記酢酸を生育炭素源として代謝させるとともに、前記細菌により前記クマル酸および前記フェルラ酸をムコン酸に変換させる工程である。以下、工程（２）について説明する。
【0024】
ＣａｔＢ酵素は、ムコン酸シクロイソメラーゼ活性を有するタンパク質であり、ムコン酸を（Ｓ）－ムコノラクトンに変換する。ムコン酸は、通常、（Ｓ）－ムコノラクトンを経由してＴＣＡ回路に入り、代謝される。したがって、ＣａｔＢ酵素発現を欠損させることにより、ムコン酸を蓄積できるようになる。一般的に、芳香族化合物の分解能を有するシュードモナス属細菌は、内因性ＣａｔＢ酵素を保有することが知られている。
【0025】
シュードモナス属細菌が保有する内因性ＣａｔＢ酵素としては、例えば、以下の（ａ１）または（ｂ１）のタンパク質が挙げられる。
（ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＣａｔＢ酵素活性を有するタンパク質
（ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＣａｔＢ酵素活性を有するタンパク質
【0026】
配列番号２に記載のアミノ酸配列は、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株由来のＣａｔＢ酵素のアミノ酸配列である。
【0027】
シュードモナス属細菌が保有するＣａｔＢ酵素をコードする内因性遺伝子（以下「ｃａｔＢ遺伝子」という。）としては、例えば、以下の（ｃ１）または（ｄ１）のＤＮＡが挙げられる。
（ｃ１）配列番号１に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ１）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＣａｔＢ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ１）配列番号１に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ１）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＣａｔＢ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【0028】
配列番号１に記載の塩基配列は、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株由来のｃａｔＢ遺伝子の塩基配列である。
【0029】
ｃａｔＢ遺伝子は、ＣａｔＢ酵素をコードする限り、配列番号１の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。例えば、ｃａｔＢ遺伝子は、コドンの縮重に基づいて、あるコドンがそれと等価のコドンに置換されたＤＮＡであってもよい。
【0030】
ＰｃａＨＧ酵素は、プロトカテク酸３，４－ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質であり、プロトカテク酸のベンゼン環の開環反応を触媒する。ＰｃａＨＧ酵素は、ＰｃａＨ（βサブユニット）およびＰｃａＧ（αサブユニット）からなるヘテロオリゴマーである。したがって、ＰｃａＨＧ酵素を欠損させることにより（すなわち、ＰｃａＨおよび／またはＰｃａＧを欠損させることにより）、プロトカテク酸が、ムコン酸を経由してＴＣＡ回路へ入ることを防ぐことができる。一般的に、芳香族化合物の分解能を有するシュードモナス属細菌は、内因性ＰｃａＨＧ酵素を保有することが知られている。
【0031】
シュードモナス属細菌が保有する内因性ＰｃａＨとしては、例えば、以下の（ａ２）または（ｂ２）のタンパク質が挙げられる。
（ａ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰｃａＨＧ酵素のαサブユニットとの共存下でＰｃａＨＧ酵素活性を発現するタンパク質
（ａ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰｃａＨＧ酵素のαサブユニットとの共存下でＰｃａＨＧ酵素活性を発現するタンパク質
【0032】
配列番号４に記載のアミノ酸配列は、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株由来のＰｃａＨＧ酵素のβサブユニットのアミノ酸配列である。
【0033】
シュードモナス属細菌が保有するＰｃａＨをコードする内因性遺伝子（以下「ｐｃａＨ遺伝子」という。）としては、例えば、以下の（ｃ２）または（ｄ２）のＤＮＡが挙げられる。
（ｃ２）配列番号３に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ２）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＰｃａＨＧ酵素のαサブユニットとの共存下でＰｃａＨＧ酵素活性を発現するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ２）配列番号３に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ２）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＰｃａＨＧ酵素のαサブユニットとの共存下でＰｃａＨＧ酵素活性を発現するタンパク質をコードするＤＮＡ
【0034】
配列番号３に記載の塩基配列は、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株由来のｐｃａＨ遺伝子の塩基配列である。
【0035】
ｐｃａＨ遺伝子は、ＰｃａＨをコードする限り、配列番号３の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。例えば、ｐｃａＨ遺伝子は、コドンの縮重に基づいて、あるコドンがそれと等価のコドンに置換されたＤＮＡであってもよい。
【0036】
シュードモナス属細菌が保有する内因性ＰｃａＧとしては、例えば、以下の（ａ３）または（ｂ３）のタンパク質が挙げられる。
（ａ３）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号６に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰｃａＨＧ酵素のβサブユニットとの共存下でＰｃａＨＧ酵素活性を発現するタンパク質
（ａ３）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号６に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰｃａＨＧ酵素のβサブユニットとの共存下でＰｃａＨＧ酵素活性を発現するタンパク質
【0037】
配列番号６に記載のアミノ酸配列は、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株由来のＰｃａＨＧ酵素のαサブユニットのアミノ酸配列である。
【0038】
シュードモナス属細菌が保有するＰｃａＧをコードする内因性遺伝子（以下「ｐｃａＧ遺伝子」という。）としては、例えば、以下の（ｃ３）または（ｄ３）のＤＮＡが挙げられる。
（ｃ３）配列番号５に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ３）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＰｃａＨＧ酵素のβサブユニットとの共存下でＰｃａＨＧ酵素活性を発現するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ３）配列番号５に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ３）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＰｃａＨＧ酵素のβサブユニットとの共存下でＰｃａＨＧ酵素活性を発現するタンパク質をコードするＤＮＡ
【0039】
配列番号５に記載のアミノ酸配列は、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株由来のｐｃａＧ遺伝子の塩基配列である。
【0040】
ｐｃａＧ遺伝子は、ＰｃａＧをコードする限り、配列番号５の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。例えば、ｐｃａＧ遺伝子は、コドンの縮重に基づいて、あるコドンがそれと等価のコドンに置換されたＤＮＡであってもよい。
【0041】
本発明は、ＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を利用することを特徴とする。ＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌とは、ＣａｔＢ酵素およびＰｃａＨＧ酵素を発現するシュードモナス属細菌（例えば、野生型のシュードモナス属細菌）と比較して、ＣａｔＢ酵素活性およびＰｃａＨＧ酵素活性が低下または消失しているシュードモナス属細菌のことを指す。具体例として、標的遺伝子（ｃａｔＢ遺伝子ならびにｐｃａＨ遺伝子および／またはｐｃａＧ遺伝子）の破壊（例えば、破壊カセットの標的遺伝子への挿入、破壊カセットでの標的遺伝子の置換、標的遺伝子の欠失（削除）等）、標的遺伝子への変異の導入、標的遺伝子の制御領域のブロックなどにより、ＣａｔＢ酵素およびＰｃａＨＧ酵素を機能的に不活化させたシュードモナス属細菌が挙げられる。ＰｃａＨＧ酵素発現の欠損には、ＰｃａＨ発現およびＰｃａＧ発現のうちの一方の欠損および両方の欠損が包含される。一方の欠損であっても、両方の欠損であっても、ＰｃａＨＧ酵素を機能的に不活化させ、ＰｃａＨＧ酵素活性を低下または消失させることができる。
【0042】
シュードモナス属細菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・アガリシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｇａｒｉｃｉ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｒｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・アルカリフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ）等が挙げられるが、好ましくは、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である。
【0043】
シュードモナス属細菌においてＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現を欠損させる方法としては、相同組換えにより、標的遺伝子（ｃａｔＢ遺伝子ならびにｐｃａＨ遺伝子および／またはｐｃａＧ遺伝子）を破壊する方法などが知られている。その他に、例えば、標的遺伝子への変異の導入、標的遺伝子の不活性化などの方法も知られている。シュードモナス属細菌においてＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現を欠損させる際、ファージ・トランスダクション法、相同組換え法、プラスミドベクター挿入法などの遺伝子操作を利用することができる。相同組換えを利用した方法として、遺伝子破壊のための遺伝子ノックアウトや、変異の導入のための遺伝子ノックインなどを用いることができる。
【0044】
一実施形態では、シュードモナス属細菌においてＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現を欠損させる方法として、相同組換えにより、野生型シュードモナス属細菌の標的遺伝子（ｃａｔＢ遺伝子ならびにｐｃａＨ遺伝子および／またはｐｃａＧ遺伝子）を破壊する方法が用いられる。標的遺伝子の破壊は、相同組換えによる破壊カセットの挿入であってもよいし、相同組換えによる破壊カセットによる標的遺伝子の置換または欠失であってもよい。ベクターとしては、例えば、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＦＪ４３７２３９．１）（Ｇｅｎｅ，１４５，６９－７３（１９９４））等のプラスミドを用いることができる。野生型シュードモナス属細菌へのベクターの導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈降法、リポフェクション、マイクロインジェクション、酢酸リチウム法等を用いることができる。破壊カセットは、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子など）などの選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターに含まれていてもよい。相同組換えが生じた形質転換細胞は、選択マーカー遺伝子に対応する薬剤（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコールなど）で細胞を選抜することにより取得することができる。取得された形質転換細胞において、相同組換えによる標的遺伝子への挿入あるいは標的遺伝子の置換または欠失が生じていることは、標的遺伝子を増幅可能なプライマーを用いたＰＣＲにより確認することができる。
【0045】
本発明で使用されるシュードモナス細菌は、ＶａｎＡおよびＢ酵素発現、ＣａｔＡ酵素発現、ＡｒｏＹ酵素発現、ＫｐｄＢ酵素発現ならびにＰｏｂＡ酵素発現から選択される１種または２種以上の酵素発現が強化されたシュードモナス属細菌であることが好ましい。なお、ＶａｎＡおよびＢ酵素発現は、ＶａｎＡ酵素発現およびＶａｎＢ酵素発現の組合せを意味する。
【0046】
ＶａｎＡ酵素は、バニリン酸デメチラーゼオキシゲナーゼコンポーネントであり、オキシドレダクターゼコンポーネントを経て供給されるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ由来の電子と、分子状酸素由来の酸素原子を利用してバニリン酸を脱メチルし、プロトカテク酸に変換する。
【0047】
ＶａｎＢ酵素は、バニリン酸デメチラーゼオキシドレダクターゼコンポーネントであり、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから電子を引き抜き、オキシゲナーゼコンポーネントであるＶａｎＡ酵素へと伝達する。
【0048】
したがって、ＶａｎＡ酵素と共にＶａｎＢ酵素の発現を強化することにより、フェルラ酸からプロトカテク酸の生成速度を高めることができる。発現が強化されるＶａｎＡおよびＶａｎＢ酵素は、それぞれ、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＶａｎＡおよびＶａｎＢ酵素であってもよいし、シュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＶａｎＡおよびＶａｎＢ酵素であってもよい。
【0049】
ＶａｎＡ酵素としては、例えば、以下の（ａ４）または（ｂ４）のタンパク質が挙げられる。
（ａ４）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ４）配列番号８に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＶａｎＡ酵素活性を有するタンパク質
（ａ４）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ４）配列番号８に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＶａｎＡ酵素活性を有するタンパク質
【0050】
配列番号８記載のアミノ酸配列は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のＶａｎＡ酵素のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０１５４５１）である。
【0051】
（ｂ４）のタンパク質には、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＶａｎＡ酵素およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＶａｎＡ酵素が包含される。
【0052】
ＶａｎＡ酵素をコードする遺伝子（以下「ｖａｎＡ遺伝子」という。）としては、例えば、以下の（ｃ４）または（ｄ４）のＤＮＡが挙げられる。
（ｃ４）配列番号７に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ４）配列番号７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＶａｎＡ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ４）配列番号７に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ４）配列番号７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＶａｎＡ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【0053】
配列番号７に記載の塩基配列は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のｖａｎＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０１５４５１）である。
【0054】
（ｄ４）のＤＮＡには、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ｖａｎＡ遺伝子およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ｖａｎＡ遺伝子が包含される。
【0055】
ｖａｎＡ遺伝子は、ＶａｎＡ酵素をコードする限り、配列番号７の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。例えば、ｖａｎＡ遺伝子は、コドンの縮重に基づいて、あるコドンがそれと等価のコドンに置換されたＤＮＡであってもよい。
【0056】
ＶａｎＢ酵素としては、例えば、以下の（ａ５）または（ｂ５）のタンパク質が挙げられる。
（ａ５）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ５）配列番号１０に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＶａｎＢ酵素活性を有するタンパク質
（ａ５）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ５）配列番号１０に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＶａｎＢ酵素活性を有するタンパク質
【0057】
配列番号１０記載のアミノ酸配列は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のＶａｎＢ酵素のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０１５４５１）である。
【0058】
（ｂ５）のタンパク質には、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＶａｎＢ酵素およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＶａｎＢ酵素が包含される。
【0059】
ＶａｎＢ酵素をコードする遺伝子（以下「ｖａｎＢ遺伝子」という。）としては、例えば、以下の（ｃ５）または（ｄ５）のＤＮＡが挙げられる。
（ｃ５）配列番号９に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ５）配列番号９に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＶａｎＢ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ５）配列番号９に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ５）配列番号９に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＶａｎＢ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【0060】
配列番号９に記載の塩基配列は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のｖａｎＢ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０１５４５１）である。
【0061】
（ｄ５）のＤＮＡには、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ｖａｎＢ遺伝子およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ｖａｎＢ遺伝子が包含される。
【0062】
ｖａｎＢ遺伝子は、ＶａｎＢ酵素をコードする限り、配列番号９の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。例えば、ｖａｎＢ遺伝子は、コドンの縮重に基づいて、あるコドンがそれと等価のコドンに置換されたＤＮＡであってもよい。
【0063】
ＣａｔＡ酵素は、カテコール１，２―ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質であり、カテコールのベンゼン環を開環し、ムコン酸に変換する。したがって、ＣａｔＡ酵素発現を強化することにより、ムコン酸の生成速度を高めることができる。芳香族化合物の分解能を有するシュードモナス属細菌は、一般的に、内因性ＣａｔＡ酵素を保有することが知られている。発現が強化されるＣａｔＡ酵素は、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＣａｔＡ酵素であってもよいし、シュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＣａｔＡ酵素であってもよい。
【0064】
ＣａｔＡ酵素としては、例えば、以下の（ａ６）または（ｂ６）のタンパク質が挙げられる。
（ａ６）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ６）配列番号１２に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＣａｔＡ酵素活性を有するタンパク質
（ａ６）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ６）配列番号１２に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＣａｔＡ酵素活性を有するタンパク質
【0065】
配列番号１２記載のアミノ酸配列は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のＣａｔＡ酵素のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０１５４５１）である。
【0066】
（ｂ６）のタンパク質には、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＣａｔＡ酵素およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＣａｔＡ酵素が包含される。
【0067】
ＣａｔＡ酵素をコードする遺伝子（以下「ｃａｔＡ遺伝子」という。）としては、例えば、以下の（ｃ６）または（ｄ６）のＤＮＡが挙げられる。
（ｃ６）配列番号１１に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ６）配列番号１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＣａｔＡ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ６）配列番号１１に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ６）配列番号１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＣａｔＡ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【0068】
配列番号１１に記載の塩基配列は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のｃａｔＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＥ０１５４５１）である。
【0069】
（ｄ６）のＤＮＡには、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ｃａｔＡ遺伝子およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ｃａｔＡ遺伝子が包含される。
【0070】
ｃａｔＡ遺伝子は、ＣａｔＡ酵素をコードする限り、配列番号１１の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。例えば、ｃａｔＡ遺伝子は、コドンの縮重に基づいて、あるコドンがそれと等価のコドンに置換されたＤＮＡであってもよい。
【0071】
ＡｒｏＹ酵素は、プロトカテク酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質であり、プロトカテク酸の脱炭酸を触媒し、カテコールに変換する。したがって、ＡｒｏＹ酵素発現を強化することにより、ムコン酸の生成速度を高めることができる。発現が強化されるＡｒｏＹ酵素は、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＡｒｏＹ酵素であってもよいが、通常、シュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＡｒｏＹ酵素である。外来性ＡｒｏＹ酵素としては、例えば、クレブシエラ属細菌、エンテロバクター属細菌、セディメントバクター属細菌等に由来するＡｒｏＹ酵素が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、例えば、クレブシエラ・アエロジェネシス、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・クアシニューモニエ等が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・クロアカ等が挙げられる。セディメントバクター属細菌としては、例えば、セディメントバクター・ヒドロキシベンゾイカス等が挙げられる。
【0072】
ＡｒｏＹ酵素としては、例えば、以下の（ａ７）または（ｂ７）のタンパク質が挙げられる。
（ａ７）配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ７）配列番号１４に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＡｒｏＹ酵素活性を有するタンパク質
（ａ７）配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ７）配列番号１４に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＡｒｏＹ酵素活性を有するタンパク質
【0073】
配列番号１４に記載のアミノ酸配列は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ Ａ１７０－４０株由来のＡｒｏＹ酵素のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ４７９３８４）である。
【0074】
（ｂ７）のタンパク質には、クレブシエラ属細菌、エンテロバクター属細菌、セディメントバクター属細菌等に由来するＡｒｏＹ酵素が包含される。
【0075】
ＡｒｏＹ酵素をコードする遺伝子（以下「ａｒｏＹ遺伝子」という。）としては、例えば、以下の（ｃ７）または（ｄ７）のＤＮＡが挙げられる。
（ｃ７）配列番号１３に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ７）配列番号１３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＡｒｏＹ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ７）配列番号１３に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ７）配列番号１３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＡｒｏＹ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【0076】
配列番号１３に記載の塩基配列は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ Ａ１７０－４０株由来のａｒｏＹ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ４７９３８４）である。
【0077】
（ｄ７）のＤＮＡには、クレブシエラ属細菌、エンテロバクター属細菌、セディメントバクター属細菌等に由来するａｒｏＹ遺伝子が包含される。
【0078】
ａｒｏＹ遺伝子は、ＡｒｏＹ酵素をコードする限り、配列番号１３の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。例えば、ａｒｏＹ遺伝子は、コドンの縮重に基づいて、あるコドンがそれと等価のコドンに置換されたＤＮＡであってもよい。
【0079】
ＫｐｄＢ酵素は、４－ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢとも呼ばれる、フラビンプレニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であり、プロトカテク酸脱炭酸酵素の補因子であるプレニル－ＦＭＮの合成反応を触媒する（具体的には、ジメチルアリル一リン酸（ＤＭＡＰ）からジメチルアリル構造をフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のフラビン骨格へと結合し、プレニル－ＦＭＮを合成する反応を触媒する）。したがって、ＫｐｄＢ酵素発現を強化することにより、プロトカテク酸脱炭酸反応速度を高めることができる。発現が強化されるＫｐｄＢ酵素は、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＫｐｄＢ酵素であってもよいし、シュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＫｐｄＢ酵素であってもよい。
【0080】
ＫｐｄＢ酵素としては、例えば、以下の（ａ８）または（ｂ８）のタンパク質が挙げられる。
（ａ８）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ８）配列番号１６に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＫｐｄＢ酵素活性を有するタンパク質
（ａ８）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ８）配列番号１６に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＫｐｄＢ酵素活性を有するタンパク質
【0081】
配列番号１６記載のアミノ酸配列は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブシピーシーズ・ニューモニエ ＮＢＲＣ１４１９０株由来のＫｐｄＢ酵素のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ９２０３４６）である。
【0082】
（ｂ８）のタンパク質には、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＫｐｄＢ酵素およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＫｐｄＢ酵素が包含される。
【0083】
ＫｐｄＢ酵素をコードする遺伝子（以下「ｋｐｄＢ遺伝子」という。）としては、例えば、以下の（ｃ８）または（ｄ８）のＤＮＡが挙げられる。
（ｃ８）配列番号１５に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ８）配列番号１５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＫｐｄＢ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ８）配列番号１５に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ８）配列番号１５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡであって、ＫｐｄＢ酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【0084】
配列番号１５に記載の塩基配列は、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株由来のｋｐｄＢ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ９２０３４６）である。
【0085】
（ｄ８）のＤＮＡには、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ｋｐｄＢ遺伝子およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ｋｐｄＢ遺伝子が包含される。
【0086】
ｋｐｄＢ遺伝子は、ＫｐｄＢ酵素をコードする限り、配列番号１５の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。例えば、ｋｐｄＢ遺伝子は、コドンの縮重に基づいて、あるコドンがそれと等価のコドンに置換されたＤＮＡであってもよい。
【0087】
ＰｏｂＡ酵素は、４－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質であり、安息香酸分解酵素のひとつである。芳香族化合物の分解能を有するシュードモナス属細菌は、一般的に、内因性ＰｏｂＡ酵素を保有することが知られている。発現が強化されるＰｏｂＡ酵素は、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＰｏｂＡ酵素であってもよいし、シュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＰｏｂＡ酵素であってもよい。
【0088】
ＰｏｂＡ酵素としては、例えば、以下の（ａ９）または（ｂ９）のタンパク質が挙げられる。
（ａ９）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ９）配列番号１８に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰｏｂＡ酵素活性を有するタンパク質
（ａ９）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ９）配列番号１８に記載のアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは該アミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰｏｂＡ酵素活性を有するタンパク質
【0089】
配列番号１８に記載のアミノ酸配列は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のＰｏｂＡ酵素のアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｑ８８Ｈ２８）である。
【0090】
（ｂ９）のタンパク質には、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ＰｏｂＡ酵素およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ＰｏｂＡ酵素が包含される。
【0091】
ＰｏｂＡ酵素をコードする遺伝子（以下「ｐｏｂＡ遺伝子」という。）としては、例えば、以下の（ｃ９）または（ｄ９）のＤＮＡが挙げられる。
（ｃ９）配列番号１７に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ９）配列番号１７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡ
（ｃ９）配列番号１７に記載の塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ９）配列番号１７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡ
【0092】
配列番号１７に記載の塩基配列は、シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株由来のｐｏｂＡ遺伝子の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＮ６９１３８）である。
【0093】
（ｄ９）のＤＮＡには、シュードモナス属細菌が本来保有する内因性ｐｏｂＡ遺伝子およびシュードモナス属細菌が本来保有しない外来性ｐｏｂＡ遺伝子が包含される。
【0094】
ｐｏｂＡ遺伝子は、ＰｏｂＡ酵素をコードする限り、配列番号１７の塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むまたは該塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。例えば、ｐｏｂＡ遺伝子は、コドンの縮重に基づいて、あるコドンがそれと等価のコドンに置換されたＤＮＡであってもよい。
【0095】
前述したアミノ酸配列および塩基配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０））などの相同性検索ソフトを用いて計算することができる。
【0096】
前述の（ｄ１）～（ｄ９）のＤＮＡは、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５および１７に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いて取得することができる。より具体的には、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、コロニーまたはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌの存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）の中、６５℃でフィルターを洗浄することにより取得することができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載の方法などの公知の方法を用いて行うことができる。温度が高いほど、または、塩濃度が低いほど、ストリンジェンシーは高くなり、より相同性（配列同一性）の高いポリヌクレオチドを単離することができる。
【0097】
本発明において好ましく使用されるＶａｎＡ酵素発現、ＶａｎＢ酵素発現、ＣａｔＡ酵素発現、ＡｒｏＹ酵素、ＫｐｄＢ酵素発現およびＰｏｂＡ酵素発現から選択される１種または２種以上の酵素発現が強化されたシュードモナス属細菌は、ＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌において、ＶａｎＡ酵素発現、ＶａｎＢ酵素発現、ＣａｔＡ酵素発現、ＡｒｏＹ酵素発現、ＫｐｄＢ酵素発現およびＰｏｂＡ酵素発現から選択される１種または２種以上の酵素発現が強化されたシュードモナス属細菌であることを特徴とする。標的酵素の発現が強化されていることは、野生型のシュードモナス属細菌と比較して、標的酵素の活性が増加していることにより確認することができる。標的酵素の発現を強化する方法としては、標的酵素遺伝子と、標的酵素遺伝子の上流に機能的に連結された遺伝子発現を促進するプロモータ領域とを含む発現カセットまたは該発現カセットを含むベクターをシュードモナス属細菌に導入し、標的酵素遺伝子のコピー数を増やす方法が挙げられる。プロモータは恒常的なプロモータ、誘導的なプロモータのいずれであってもよく、シュードモナス属細菌で必要な酵素量を発現できるものであればよい。発現カセットまたは該発現カセットを含むベクターをシュードモナス属細菌に導入する際、相同組換え法、エレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、酢酸リチウム法等を用いることができる。ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖および複製可能なベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。発現カセットは、ターミネーター等の発現調節領域を含んでいてもよい。発現カセットは、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子など）などの選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターに含まれていてもよい。発現カセットまたは該発現カセットを含むベクターが導入された形質転換細胞は、選択マーカー遺伝子に対応する薬剤（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコールなど）で細胞を選抜することにより取得することができる。取得された形質転換細胞において、標的酵素遺伝子の導入が生じていることは、標的酵素遺伝子を増幅可能なプライマーを用いたＰＣＲにより確認することができる。
【0098】
工程（１）で得られた抽出液中でＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を培養することにより、工程（１）で得られた抽出液にＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させることができる。培養温度は、例えば１５～４０℃、好ましくは２０～３０℃であり、培養期間は、例えば１時間～１０日、好ましくは４～４８時間である。培養は、例えば、好気培養であり、好気培養は、例えば、培養液を振とうしたり、培養液に空気または酸素ガスを吹き込むことにより行うことができる。
【0099】
工程（１）で得られた抽出液にＣａｔＢ酵素およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を作用させると、該シュードモナス属細菌は、抽出液中の酢酸を生育炭素源として代謝しながら増殖するとともに、抽出液中のクマル酸およびフェルラ酸をムコン酸に変換する。また、本来であればシュードモナス属細菌はＣａｔＢ酵素を保有するため、変換されたムコン酸がさらに分解または変換されるが、ＣａｔＢ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌はムコン酸をさらに分解または変換しないため、ムコン酸は培養液中に蓄積される。また、本来であればシュードモナス属細菌はＰｃａＨＧ酵素を保有するため、変換されたプロトカテク酸がさらに分解され生育炭素源として消費されるが、ＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌はプロトカテク酸が、ムコン酸の前駆体であるカテコールに変換されるため、ムコン酸は培養液中に蓄積される（図１）。
【0100】
工程（１）で得られた抽出液がギ酸、乳酸、アミノ酸などの炭素源や窒素源を含む場合、ＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌はこれらを消費分解しながら増殖する。すなわち、本発明では、フェルラ酸およびクマル酸以外の炭素源および窒素源が、ＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌により消費されることにより、培養液中のムコン酸以外の不純物成分が除去されるため、培養液からのムコン酸精製を簡素化することができる。
【0101】
シュードモナス属細菌を作用させた抽出液から、ムコン酸をさらに精製することができる。精製のためには、ＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌を分離し、分離したろ液を、吸着カラムに通液し、吸着画分を回収することにより、さらにムコン酸精製純度を高めることができる。吸着カラムとしては、疎水吸着カラム、イオン交換などがあるが、疎水吸着カラムが好ましい。
【0102】
本発明におけるムコン酸とは、ムコン酸のフリー体、ムコン酸の塩やエステル等の総称であり、本発明で得られるムコン酸は、これらのいずれかの形態またはこれらの混合物であってもよい。また、ムコン酸にはｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ－ムコン酸、ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ－ムコン酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸の３種類の異性体が存在し、本発明におけるムコン酸としてはこれらの１種または２種以上であってもよいが、好ましくはｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸である。
【0103】
本発明で得られるムコン酸は、他原料で得られたものと同様に化学合成の前駆体などとして使用することができ、例えば、ポリマー原料となるアジピン酸やテレフタル酸の原料として使用することが知られている。
【実施例0104】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0105】
（参考例１）糖濃度の測定
バガスアルカリ抽出液に含まれるグルコースおよびキシロース濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。
バガスアルカリ抽出液に含まれるグルコースおよびキシロース濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。
【0106】
（参考例２）芳香族化合物の分析
バガスアルカリ抽出液に含まれる芳香族化合物は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。なお、各分析サンプルは、３５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その上清成分を下記分析に供した。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ＨｉｄｒｏＲＰ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）
移動相：アセトニトリル－０．１％ Ｈ３ＰＯ４（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。
バガスアルカリ抽出液に含まれる芳香族化合物は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。なお、各分析サンプルは、３５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その上清成分を下記分析に供した。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ＨｉｄｒｏＲＰ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）
移動相：アセトニトリル－０．１％ Ｈ３ＰＯ４（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。
【0107】
バガスアルカリ抽出液に含まれる酢酸およびギ酸は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。なお、各分析サンプルは、３５００Ｇで１０分間遠心分離を行い、その上清成分を下記分析に供した。
カラム：Ｓｈｉｍ－ＰａｃｋとＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ ＳＣＲ１０１Ｈ（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ ｐ－トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ－トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
カラム：Ｓｈｉｍ－ＰａｃｋとＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ ＳＣＲ１０１Ｈ（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ ｐ－トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ－トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【0108】
（実施例１）リグニン含有バイオマスのアルカリ処理
リグニン含有バイオマスとして、バガスを用意した。バガス１２８ｇ（含水率２２％、乾燥バガス１００ｇ相当）に１４％ ＮａＯＨ溶液８５ｇ、ＲＯ水１７８７ｇを投入し混合した。すなわち、１２ｇのＮａＯＨを１００ｇの乾燥バガスに添加したことになり、乾燥バガス１ｇあたりに添加されたＮａＯＨの量は１２０ｍｇとなる。また、バガス固形分の最終濃度は５ｗｔ％とした。その後、オートクレーブにて、９０℃で２時間のアルカリ処理を行った。アルカリ処理後のバガスは、１ｍｍスクリーンろ過に供し、その後、ろ液を２１２μｍスクリーンろ過に供し、合計約１５００ｇのアルカリ処理液を回収した。このときのｐＨは、１２．７であった。前記アルカリ処理液１０１６ｇをｐＨ調整に使用した。ｐＨセンサーにて、ｐＨ変化をモニターしながら、６ＭのＨＣｌを１９ｇ添加し、ｐＨ５．２に調整した。その後、ｐＨ調整液を８５００Ｇで６分間、遠心、上清をバガスアルカリ抽出液とした。
リグニン含有バイオマスとして、バガスを用意した。バガス１２８ｇ（含水率２２％、乾燥バガス１００ｇ相当）に１４％ ＮａＯＨ溶液８５ｇ、ＲＯ水１７８７ｇを投入し混合した。すなわち、１２ｇのＮａＯＨを１００ｇの乾燥バガスに添加したことになり、乾燥バガス１ｇあたりに添加されたＮａＯＨの量は１２０ｍｇとなる。また、バガス固形分の最終濃度は５ｗｔ％とした。その後、オートクレーブにて、９０℃で２時間のアルカリ処理を行った。アルカリ処理後のバガスは、１ｍｍスクリーンろ過に供し、その後、ろ液を２１２μｍスクリーンろ過に供し、合計約１５００ｇのアルカリ処理液を回収した。このときのｐＨは、１２．７であった。前記アルカリ処理液１０１６ｇをｐＨ調整に使用した。ｐＨセンサーにて、ｐＨ変化をモニターしながら、６ＭのＨＣｌを１９ｇ添加し、ｐＨ５．２に調整した。その後、ｐＨ調整液を８５００Ｇで６分間、遠心、上清をバガスアルカリ抽出液とした。
【0109】
バガスアルカリ抽出液の成分組成を表１に示す。
【0110】
【表1】
【0111】
（実施例２）ＣａｔＢ酵素発現およびＰｃａＨＧ酵素発現が欠損したシュードモナス属細菌（ＮＧＣ７株ΔcａｔＢΔpｃａＨＧ株）の作製
配列番号１９および配列番号２０からなるプライマーセットを用いたＰＣＲによりシュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株のゲノムＤＮＡから増幅した、ｐｃａＨ遺伝子およびｐｃａＧ遺伝子の部分配列を含む１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じくＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（国立遺伝学研究所より入手）と連結し、ｐＫ１９ｐｃａＨＧを構築した。ｐＫ１９ｐｃａＨＧをＡｐａＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、ｐｃａＨ遺伝子およびｐｃａＧ遺伝子の内部に存在する配列の一部を欠失させたｐＫ１９ΔｐｃａＨＧを作製した。シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株をＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。培養液の一部を新しいＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、ＯＤ６００が０．３～０．５に達するまで、３０℃で振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（６，０００×ｇ，５ｍｉｎ，４℃）により細胞を回収し、得られた細胞を冷却した０．５Ｍ シュークロース溶液で洗浄した。洗浄操作は２回繰り返した。洗浄後の細胞を遠心分離により回収し、０．１ｍＬの冷却した０．５Ｍ シュークロース溶液に懸濁した。細胞懸濁液と１μｇのｐＫ１９ΔｐｃａＨＧとを混合し、エレクトロポレーションに供した（１０．０ＫＶ）。１ｍＬのＳＯＣ培地と混合し、３０℃で１時間振盪培養した。遠心分離により細胞を回収し、０．１ｍＬのＳＯＣ培地に懸濁した。懸濁液を２５ｍｇ／Ｌ カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹し、３０℃で一晩静置培養した。形成されたカナマイシン耐性コロニーを、１０％シュークロースを含むＬＢ液体培地５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液の一部を、１０％シュークロースを含むＬＢ液体培地５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養する操作をさらに２回繰り返した。得られた培養液の一部をＬＢ寒天培地に塗抹し、３０℃で１晩静置培養した。形成されたコロニーのゲノムＤＮＡを常法で抽出し、それを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ｐｃａＨ遺伝子およびｐｃａＧ遺伝子の欠失を確認した。この細菌を、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧ株とした。
配列番号１９および配列番号２０からなるプライマーセットを用いたＰＣＲによりシュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株のゲノムＤＮＡから増幅した、ｐｃａＨ遺伝子およびｐｃａＧ遺伝子の部分配列を含む１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じくＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（国立遺伝学研究所より入手）と連結し、ｐＫ１９ｐｃａＨＧを構築した。ｐＫ１９ｐｃａＨＧをＡｐａＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、ｐｃａＨ遺伝子およびｐｃａＧ遺伝子の内部に存在する配列の一部を欠失させたｐＫ１９ΔｐｃａＨＧを作製した。シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株をＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。培養液の一部を新しいＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、ＯＤ６００が０．３～０．５に達するまで、３０℃で振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（６，０００×ｇ，５ｍｉｎ，４℃）により細胞を回収し、得られた細胞を冷却した０．５Ｍ シュークロース溶液で洗浄した。洗浄操作は２回繰り返した。洗浄後の細胞を遠心分離により回収し、０．１ｍＬの冷却した０．５Ｍ シュークロース溶液に懸濁した。細胞懸濁液と１μｇのｐＫ１９ΔｐｃａＨＧとを混合し、エレクトロポレーションに供した（１０．０ＫＶ）。１ｍＬのＳＯＣ培地と混合し、３０℃で１時間振盪培養した。遠心分離により細胞を回収し、０．１ｍＬのＳＯＣ培地に懸濁した。懸濁液を２５ｍｇ／Ｌ カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹し、３０℃で一晩静置培養した。形成されたカナマイシン耐性コロニーを、１０％シュークロースを含むＬＢ液体培地５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液の一部を、１０％シュークロースを含むＬＢ液体培地５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養する操作をさらに２回繰り返した。得られた培養液の一部をＬＢ寒天培地に塗抹し、３０℃で１晩静置培養した。形成されたコロニーのゲノムＤＮＡを常法で抽出し、それを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ｐｃａＨ遺伝子およびｐｃａＧ遺伝子の欠失を確認した。この細菌を、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧ株とした。
【0112】
配列番号２３および配列番号２４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲによりシュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７株のゲノムＤＮＡから増幅した、ｃａｔＢ遺伝子、ｃａｔＣ遺伝子およびｃａｔＡ遺伝子を含む２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じくＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（国立遺伝学研究所より入手）と連結し、ｐＫ１９ｃａｔＢＣＡを構築した。ｐＫ１９ｃａｔＢＣＡをＥｃｏＲＶおよびＳｃａＩで消化し、ｃａｔＢ遺伝子の内部に存在する配列の一部を欠失させたｐＫ１９ΔｃａｔＢを作製した。前述と同様の方法で、ｐＫ１９ΔｃａｔＢを用いてＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧ株を形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを得た。形成されたカナマイシン耐性コロニーを、１０％シュークロースを含むＬＢ液体培地５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液の一部を、１０％シュークロースを含むＬＢ液体培地５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養する操作をさらに２回繰り返した。得られた培養液の一部をＬＢ寒天培地に塗抹し、３０℃で１晩静置培養した。形成されたコロニーのゲノムＤＮＡを常法で抽出し、それを鋳型とし、配列番号２５および配列番号２６からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ｃａｔＢ遺伝子の欠失を確認した。この細菌を、ＮＧＣ７株ΔｃａｔＢΔｐｃａＨＧ株とした。
【0113】
（実施例３）ＡｒｏＹ酵素、ＫｐｄＢ酵素、ＣａｔＡ酵素、ＶａｎＡ酵素およびＶａｎＢ酵素の発現を強化したＮＧＣ７株ΔｃａｔＢΔｐｃａＨＧ株の作製
クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ａ１７０－４０株のゲノムＤＮＡの部分断片を鋳型として、配列番号２７および配列番号２８からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｒｏＹ遺伝子）を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩで消化し、予めＫｐｎＩで消化したｐＭＣＬ２００プラスミドＤＮＡにクローニングすることにより、ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡを得た。
クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ａ１７０－４０株のゲノムＤＮＡの部分断片を鋳型として、配列番号２７および配列番号２８からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｒｏＹ遺伝子）を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩで消化し、予めＫｐｎＩで消化したｐＭＣＬ２００プラスミドＤＮＡにクローニングすることにより、ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡを得た。
【0114】
クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ ＮＢＲＣ１４１９０株のＤＮＡを鋳型として、配列番号２９および配列番号３０のプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、４－ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢ遺伝子（ｋｐｄＢ遺伝子）を含む約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片の両末端を平滑化処理し、予めＸｂａＩで消化しさらに平滑化処理したｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡに連結することにより、ｐＴＳ０５２プラスミドＤＮＡを得た。ｐＴＳ０５２プラスミドＤＮＡとしては、ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡに含まれるａｒｏＹ遺伝子と順方向にｋｐｄＢ遺伝子が連結されたクローンを選択して得た。
【0115】
ｐＴＳ０５２プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号３１および配列番号３２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ａｒｏＹ遺伝子およびｋｐｄＢ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、予めＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＪＢ８６６プラスミドＤＮＡにＩｎｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０７４プラスミドＤＮＡを得た。
【0116】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３３および配列番号３４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、カテコール・１，２－ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｃａｔＡ遺伝子）を含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、予めＳａｃＩで消化したｐＴＳ０７４プラスミドＤＮＡにＩｎｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０７９プラスミドＤＮＡを得た。
【0117】
ｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号３５および配列番号３６からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ラクトースプロモーター領域（Ｐｌａｃ）を含む約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ｐＴＳ０７９プラスミドＤＮＡのＮｏｔＩサイトにＩｎｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ｐＴＳ０８２プラスミドＤＮＡを得た。
【0118】
シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３７および配列番号３８からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、バニレート・デメチラーゼ・オキシゲナーゼコンポーネント遺伝子（ｖａｎＡ遺伝子）およびバニレート・デメチラーゼ・オキシドレダクターゼコンポーネント遺伝子（ｖａｎＢ）を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ＳａｃＩおよびＳｍａＩで消化し、予めＳａｃＩおよびＳｍａＩで消化したｐＱＥ３０プラスミドＤＮＡと連結することにより、ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを得た。
【0119】
ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号３９および配列番号４０からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ｖａｎＡ遺伝子およびｖａｎＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ０８２プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０８４プラスミドＤＮＡを得た。得られたｐＴＳ０８４プラスミドＤＮＡを用いて、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を形質転換することにより、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を作製した。
【0120】
（実施例４）ＡｒｏＹ酵素、ＫｐｄＢ酵素、ＣａｔＡ酵素、ＶａｎＡ酵素およびＶａｎＢ酵素の発現強化に加え、ＰｏｂＡ酵素の発現を強化したＮＧＣ７株ΔｃａｔＢΔｐｃａＨＧ株の作製
ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号４１および配列番号４２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ｖａｎＡ遺伝子およびｖａｎＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ０８２プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０９２プラスミドＤＮＡを得た。
ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号４１および配列番号４２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ｖａｎＡ遺伝子およびｖａｎＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ０８２プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０９２プラスミドＤＮＡを得た。
【0121】
シュードモナス・プチダ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４３および配列番号４４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ｐｏｂＡ遺伝子を含む約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ０９２プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０９４プラスミドＤＮＡを得た。
【0122】
ｐＴＳ０９４プラスミドＤＮＡを用いて、シュードモナス・スピーシーズ ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を形質転換することにより、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０９４株を作製した。
【0123】
（実施例５）シュードモナス属細菌（ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０９４株）の前培養
各株をＬＢ寒天培地３０℃で一晩静置培養した。寒天培地上に形成されたコロニーをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃で１６ｈ振盪培養した。得られた培養液からＯＤ６００が５．０の細胞懸濁液（生理食塩水に懸濁）１ｍＬを調製し、接種源とした。
各株をＬＢ寒天培地３０℃で一晩静置培養した。寒天培地上に形成されたコロニーをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３０℃で１６ｈ振盪培養した。得られた培養液からＯＤ６００が５．０の細胞懸濁液（生理食塩水に懸濁）１ｍＬを調製し、接種源とした。
【0124】
（実施例６）シュードモナス属細菌をアルカリ抽出液に作用させてムコン酸に変換する工程１（ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株）
表１の組成の抽出液をｐＨ７に調整した後、９ｍＬをムコン酸変換に使用し、さらに１０×ＭＭ（３４２．０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，６０．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，２０．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ）を１ｍＬ、１００×Ｍｅｔａｌ（４９．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）を０．１ｍＬ添加し、合計１０．１ｍＬの抽出液を調製した。ここに、実施例５で得た接種源を０．１ｍＬ添加し、３０℃で振とう培養を行った。培養開始時のＯＤ６００は０、培養開始４６時間後のＯＤ６００は１．９であった。培養開始時および培養開４６時間後の成分比較を表２に示す。
表１の組成の抽出液をｐＨ７に調整した後、９ｍＬをムコン酸変換に使用し、さらに１０×ＭＭ（３４２．０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，６０．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，２０．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ）を１ｍＬ、１００×Ｍｅｔａｌ（４９．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）を０．１ｍＬ添加し、合計１０．１ｍＬの抽出液を調製した。ここに、実施例５で得た接種源を０．１ｍＬ添加し、３０℃で振とう培養を行った。培養開始時のＯＤ６００は０、培養開始４６時間後のＯＤ６００は１．９であった。培養開始時および培養開４６時間後の成分比較を表２に示す。
【0125】
【表2】
【0126】
培養開始時および培養開始４６時間後の成分比較から、クマル酸およびフェルラ酸が消費され、ムコン酸が蓄積されたことを確認した。一方で、バニリン酸などの他の芳香族化合物、酢酸、ギ酸、乳酸などの有機酸も減少しており、これらはシュードモナス属細菌の生育炭素源として利用されたことが確認できた。
【0127】
（実施例７）シュードモナス属細菌をアルカリ抽出液に作用させてムコン酸に変換する工程２（ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０９４株）
表１の組成の抽出液をｐＨ７に調整した後、９ｍＬをムコン酸変換に使用し、さらに１０×ＭＭ（３４２．０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，６０．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，２０．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ）を１ｍＬ、１００×Ｍｅｔａｌ（４９．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）を０．１ｍＬ添加し、合計１０．１ｍＬの抽出液を調製した。ここに、実施例５で得た接種源を０．１ｍＬ（ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０９４株）添加し、３０℃で振とう培養を行った。培養開始時のＯＤ６００は０、培養開始４６時間後のＯＤ６００は１．９あった。培養開始時および培養開４６時間後の成分比較を表３に示す。
表１の組成の抽出液をｐＨ７に調整した後、９ｍＬをムコン酸変換に使用し、さらに１０×ＭＭ（３４２．０ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，６０．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，２０．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ）を１ｍＬ、１００×Ｍｅｔａｌ（４９．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）を０．１ｍＬ添加し、合計１０．１ｍＬの抽出液を調製した。ここに、実施例５で得た接種源を０．１ｍＬ（ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０９４株）添加し、３０℃で振とう培養を行った。培養開始時のＯＤ６００は０、培養開始４６時間後のＯＤ６００は１．９あった。培養開始時および培養開４６時間後の成分比較を表３に示す。
【0128】
【表3】
【0129】
培養開始時および培養開始４６時間後の成分比較から、クマル酸およびフェルラ酸が消費され、ムコン酸が蓄積されたことを確認した。一方で、バニリン酸などの他の芳香族化合物、酢酸、ギ酸、乳酸などの有機酸も減少しており、これらはシュードモナス属細菌の生育炭素源として利用されたことが確認できた。さらに、実施例６に比べるとＰｏｂＡ酵素を強化したＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０９４株の方が、プロトカテク酸の蓄積が減少し、ムコン酸の蓄積濃度がさらに高まることが確認できた。
【0130】
（比較例１）シュードモナス属細菌をモデル抽出液に作用させてムコン酸に変換する工程
モデル抽出液として、各芳香族化合物の試薬を混合し、表４に示す組成のモデル抽出液を調製した。抽出液を表４のモデル抽出液に変更した点を除き実施例６および実施例７と同様にして、培養試験を行った。
モデル抽出液として、各芳香族化合物の試薬を混合し、表４に示す組成のモデル抽出液を調製した。抽出液を表４のモデル抽出液に変更した点を除き実施例６および実施例７と同様にして、培養試験を行った。
【0131】
表５に示すとおり、いずれの株でも増殖を確認できなかった。
【0132】
【表4】
【0133】
【表5】
【図1】
【配列表】