特開 2023-16081 腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の情報を提供する方法、当該情報を用いたＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法およびサイトカインストーム重症化予測方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023016081

(43)【公開日】2023-02-02

(54)【発明の名称】腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の情報を提供する方法、当該情報を用いたＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法およびサイトカインストーム重症化予測方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20230126BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20230126BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALN20230126BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20230126BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/04

C12Q1/06

C12Q1/68

C12N15/11

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021120143

(22)【出願日】2021-07-21

(71)【出願人】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構

(71)【出願人】

【識別番号】520358379

【氏名又は名称】株式会社Ｒｈｅｌｉｘａ

(74)【代理人】

【識別番号】100167689

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 征二

(72)【発明者】

【氏名】大野 欽司

(72)【発明者】

【氏名】平山 正昭

(72)【発明者】

【氏名】西脇 寛

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ06

4B063QQ54

4B063QR08

4B063QR42

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS24

4B063QX01

(57)【要約】      （修正有）

【課題】治療方針等の判断材料とするために、腸内細菌叢に含まれる細菌の中で特定種類の細菌に関する情報を提供する方法、当該情報を用いたＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法およびサイトカインストーム重症化予測方法を提供する。
【解決手段】腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の情報を提供する方法であって、糞便サンプルに含まれる細菌の種類及び量を解析する解析工程と、腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の割合情報を提供する情報提供工程と、を含み、提供された情報に基づき、被検者のＣＯＶＩＤ－１９の重症化を予測する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の情報を提供する方法であって、
当該方法は、
糞便サンプルに含まれる細菌の種類および量を解析する解析工程と、
腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の割合情報を提供する情報提供工程と、
を含む、方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法により提供された情報に基づき、被検者のＣＯＶＩＤ－１９の重症化を予測する、ＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法。

【請求項3】

腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の割合が少ないほどＣＯＶＩＤ－１９が重症化すると予測する、請求項２に記載のＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法。

【請求項4】

請求項１に記載の方法により提供された情報に基づき、被検者のサイトカインストームの重症化を予測する、サイトカインストーム重症化予測方法。

【請求項5】

腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の割合が少ないほどサイトカインストームが重症化すると予測する、請求項４に記載のサイトカインストーム重症化予測方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願における開示は、腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の情報を提供する方法、当該情報を用いたＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法およびサイトカインストーム重症化予測方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人間の腸内には多種多様な細菌が生息している。多種多様な細菌が住んでいる様子が「お花畑（［英］ｆｌｏｒａ）」に見えることから、腸内に生息する細菌叢は「腸内フローラ」と呼ばれている。腸内フローラの種類は１０００種類以上、その数は約１００兆個とも言われている。細菌には、エネルギー産生；短鎖脂肪酸・ビタミン類・セロトニンなどの物質代謝；免疫調整；肥満予防；等の様々な働きがあるといわれている。

【0003】

腸内細菌叢は、例えば、１６ＳｒＲＮＡの遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）の配列の違いから検出した腸内細菌叢をデータベース化し、作成した複数のデータベースを対比することで、優位な菌の種類を特定する方法が知られている（特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第６８６３６３３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、特許文献１に記載の方法は、腸内細菌叢のデータベースから健康状態と関係のある菌群を抽出するための方法を提供する発明である。臨床等の現場では、腸内細菌叢に含まれる１０００種類以上で約１００兆個あるといわれる細菌の中で、特定種類の細菌に関する情報を提供することで、治療方針等の判断材料とできることが好ましい。

【0006】

本出願における開示は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、腸内細菌叢に含まれる細菌の中でコリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）属の割合情報は、被検者の疾患治療の際に有用な情報であることを新たに見出した。

【0007】

すなわち、本出願における開示の目的は、腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の情報を提供する方法、当該情報を用いたＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法およびサイトカインストーム重症化予測方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本出願における開示は、以下に示す、腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の情報を提供する方法、当該情報を用いたＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法およびサイトカインストーム重症化予測方法に関する。

【0009】

（１）腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の情報を提供する方法であって、
当該方法は、
糞便サンプルに含まれる細菌の種類および量を解析する解析工程と、
腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の割合情報を提供する情報提供工程と、
を含む、方法。
（２）上記（１）に記載の方法により提供された情報に基づき、被検者のＣＯＶＩＤ－１９の重症化を予測する、ＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法。
（３）腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の割合が少ないほどＣＯＶＩＤ－１９が重症化すると予測する、上記（２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法。
（４）上記（１）に記載の方法により提供された情報に基づき、被検者のサイトカインストームの重症化を予測する、サイトカインストーム重症化予測方法。
（５）腸内細菌叢に占めるコリンセラ属の割合が少ないほどサイトカインストームが重症化すると予測する、上記（４）に記載のサイトカインストーム重症化予測方法。

【発明の効果】

【0010】

被検者の糞便サンプルを解析することで得られるコリンセラ属の割合情報は、被検者の疾患治療の際に有用である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下に、腸内細菌叢に占めるコリンセラ属（以下、単に「コリンセラ」と記載することがある。）の情報を提供する方法、当該情報を用いたＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法およびサイトカインストーム重症化予測方法について詳しく説明する。

【0012】

（腸内細菌叢に占めるコリンセラの情報を提供する方法の実施形態）
腸内細菌叢に占めるコリンセラの情報を提供する方法（以下、単に「情報提供方法」と記載することがある。）の実施形態について説明する。情報提供方法は、糞便サンプルに含まれる細菌の種類および量を解析する解析工程と、腸内細菌叢に占めるコリンセラの割合情報を提供する情報提供工程と、を含む。

【0013】

糞便サンプルは、被検者から公知の方法で採取すればよい。また、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類および量は、１６ＳｒＲＮＡの遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）解析等の公知の方法により解析すればよい。解析工程で得られた解析結果から腸内細菌叢に占めるコリンセラの割合情報は、以下に記載する用途に用いることができる。

【0014】

（ＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法およびサイトカインストーム重症化予測方法）
情報提供方法により提供される情報は、後述する実施例に記載のとおり、ＣＯＶＩＤ－１９重症化と相関関係がある。したがって、腸内細菌叢に占めるコリンセラの割合情報は、被検者がＣＯＶＩＤ－１９に感染した際に重症化するか否かを予測する用途に使用できる。換言すると、情報提供方法により提供される情報は、被検者のＣＯＶＩＤ－１９の重症化を予測する、ＣＯＶＩＤ－１９重症化予測方法に用いることができる。なお、ＣＯＶＩＤ－１９重症化を予測する際には、腸内細菌叢に占めるコリンセラの割合が低いほどＣＯＶＩＤ－１９が重症化すると予測すればよい。統計データに基づき、腸内細菌叢に占めるコリンセラの割合の閾値を決定し、閾値より低い場合はＣＯＶＩＤ－１９が重症化すると予測し、閾値より高い場合はＣＯＶＩＤ－１９が重症化しないと予測すればよい。被検者がＣＯＶＩＤ－１９に感染した際に、或いは、既に感染した被検者が重症化するか否かを予測することで、医師の治療方針、病床確保等の計画ができる。

【0015】

腸内細菌叢に占めるコリンセラの割合が少ないほどＣＯＶＩＤ－１９が重症化する作用機序は明らかではないが、次の推測ができる。

【0016】

コリンセラは、回腸末端部から肝臓に戻されずに大腸に到達した１次胆汁酸を、以下に示すスキームにより２次胆汁酸に変換する。この２次胆汁酸への変換により、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）を生成する。

【0017】

ヒルガオ抽出物の抗ＣＯＶＩＤ－１９成分解析により、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｒｅｇｉｏｎおよびａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２（ＡＣＥ２）の結合を阻害することがｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎにより示されている（Ｐｏｏｃｈｉ ＳＰ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｉｐｏｍｏｅａ ｏｂｓｃｕｒａ（Ｌ．） ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍａｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ＡＣＥ２ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｆｏｏｄ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ．２０２０；１：１６８－１７９．）

【0018】

また、上記シミュレーションに加え、組み替えタンパク質を用いた無細胞系の実験により、ＵＤＣＡが濃度依存的にｓｐｉｋｅ ｒｅｇｉｏｎとＡＣＥ２の結合を阻害することが知られている（Ａｄｒｉａｎａ Ｃａｒｉｎｏ１ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｊａｃｋｉｎｇ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＡＣＥ２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｓｅｍｉ－ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｃｋｅｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ”，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０２０，Ｖｏｌｕｍｅ ８，Ａｒｔｉｃｌｅ ５７２８８５）。

【0019】

更に、ラット脊髄損傷モデルにおいて、ＵＤＣＡはＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの産生を抑制することが知られている（Ｗａｎ－Ｋｙｕ Ｋｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ａｆｔｅｒ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｒａｔｓ”，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，２０１９，５６：２６７－２７７）。

【0020】

ＵＤＣＡは強力なラジカルスカベンジャーとして抗酸化効果を発揮し、抗アポトーシス効果も有する。そのため、ＵＤＣＡはＣＯＶＩＤ－１９において多臓器不全を惹起するサイトカインストームを抑制すると推測できる。したがって、腸内細菌叢に占めるコリンセラの割合が少ないほどＵＤＣＡの生成量が少なくなり、その結果、ＣＯＶＩＤ－１９が重症化すると推測できる。

【0021】

また、ＵＤＣＡはＡＬＸ／ｃＡＭＰ／ＰＩ３Ｋパスウェイを介して急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）における肺胞液クリアランスを上昇させる。ＵＤＣＡは肝硬変を含む各種肝疾患に対して米国ＦＤＡにおいても本邦においても認可されており、重篤な副作用がない安全な薬剤として広く使われている。ＵＤＣＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染防御効果とＣＯＶＩＤ－１９重症化抑制効果への臨床応用が期待される。

【0022】

なお、上記のとおり、ＵＤＣＡは、サイトカインストームを抑制すると推測できる。ところで、ＣＯＶＩＤ－１９に限らず、ウイルス感染・細菌感染・血球貪食性リンパ組織球症・移植片対宿主病・医源性（ＣＡＲ－Ｔ療法、Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）によってもサイトカインストームが発生する（Ｆａｊｇｅｎｂａｕｍ Ｄ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．，“Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｔｏｒｍ”， Ｎ． Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０２０， ３８３：２２５５－２２７３）。そしてサイトカインストームが起きると、発熱や倦怠感、凝固異常が過剰に起こることになり、全身状態の悪化や血栓形成に繋がる。したがって、本出願で開示する情報提供方法はＣＯＶＩＤ－１９の重症化予測の用途に限定されず、サイトカインストームの重症化予測等の用途にも使用できる。ＣＯＶＩＤ－１９の重症化予測と同様に、腸内細菌叢に占めるコリンセラの割合が少ないほどサイトカインストームが重症化すると予測すればよい。

【0023】

以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

【実施例0024】

＜実施例１＞
以下の手順により、腸内細菌叢を解析することで、ＣＯＶＩＤ－１９重症化を予測するための指標となる細菌の特定を行った。

【0025】

〔サンプル〕
以下の表１に示す１０か国、合計９５３人の健常人の１６ＳｒＲＮＡＶ３－Ｖ５シーケンスデータを用いた。データは、公開されている情報から入手した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）。なお、１０か国は、地政学的要因の影響を減らすために、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）の国々から選択した。また、表１には、１００万人当たりのＣＯＶＩＤ－１９死亡率、平均年齢、男女比も示す。なお、１００万人当たりのＣＯＶＩＤ－１９死亡率は、これら１０か国においてワクチンが広く行き渡る前の２０２１年２月９日のＯｕｒ Ｗｏｒｌｄ ｉｎ Ｄａｔａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｏｕｒｗｏｒｌｄｉｎｄａｔａ．ｏｒｇ／）の値である。また、平均的な腸内細菌叢は各国で２０歳から７０歳まで類似しているため、データセットは年齢と性別でフィルタリングはしなかった。なお、日本の１３７人の健常人のデータは、発明者らが独自にサンプルを入手し解析を行ったデータである（Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．，“Ｓｈｏｒｔ－Ｃｈａｉｎ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ Ｉｓ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｂｕｔ Ｎｏｔ ｉｎ Ｒａｐｉｄ－Ｅｙｅ－Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｓｌｅｅｐ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ”，ｍＳｙｓｔｅｍｓ ２０２０， ５：ｅ００７９７－２０）。

【0026】

【表1】

【0027】

〔データ解析〕
１０カ国の９５３人の健常人の生の１６ＳｒＲＮＡシーケンスデータセットは、各国毎にＣＯＶＩＤ－１９の死亡率でラベル付けされ、単一のデータセットにプールした。データセットは、疫学における観察研究のメタアナリシス（ＭＯＯＳＥ）ガイドラインに従って分析した。

【0028】

〔一般化線形モデル（ＧＬＭ）分析〕
先ず、１０か国の９５３人の健常人の１６ＳｒＲＮＡＶ３－Ｖ５シーケンスデータを使用して、属レベルで各腸内細菌の相対的な存在量を分析した。次に、ＧＬＭを使用して、１０か国でのＣＯＶＩＤ－１９死亡率と属レベルの細菌の相関関係を調べた。ＧＬＭ分析では、ガウス分布、ガンマ分布、および逆ガウス分布を比較し、ガンマ分布が最低の赤池情報量基準（Ａｋａｉｋｅ’ｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ：ＡＩＣ）（ガウス、１４５９９、ガンマ、１４５７３、および逆ガウス、１５３１８）を生じさせることを発見した。ガンマ分布を使用したＧＬＭ分析の結果を表２示す。コリンセラは、腸内細菌叢に占める割合が少なくなるほどＣＯＶＩＤ－１９死亡率が高くなることを確認した。また、コリンセラに関するｐ値は１．５８Ｅ－１５であり、著しく低い値であった。なお、表２における“Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ”に関し、“－”は少ないほどＣＯＶＩＤ－１９死亡率が高くなり、“＋”は多くなるほどＣＯＶＩＤ－１９死亡率が高くなることを意味する。

【0029】

【表2】

【0030】

ＣＯＶＩＤ－１９重症化の要因として高齢・肥満・喫煙歴・呼吸器感染症歴・糖尿病などが知られている。これらの有病率は各国で大きく違わないにも関わらずＣＯＶＩＤ－１９死亡率は各国で大きく異なる。そのため、死亡率の違いを決めるＦａｃｔｏｒ Ｘの存在が提案されているがその実態は明らかではない。表２に示すとおり、コリンセラ属細菌の健常人の腸内細菌叢に占める割合は１０か国平均では１％未満であるが、多くの国で腸内細菌叢のトップテンに入る菌である。コリンセラ属が顕著に低いｐ値を示していることから、コリンセラ属がＦａｃｔｏｒ Ｘの可能性がある。

【0031】

以上の結果より、被検者の腸内細菌叢に占めるコリンセラの割合情報は、ＣＯＶＩＤ－１９重症化を予測する上で非常に有用な情報となることを確認した。ＣＯＶＩＤ－１９の感染者が将来重症化するか否かを予測できると、適切な医療リソースの分配ができるととともに、予期せぬ重症化により自宅療養中に不幸な転機を辿る症例を減らすことが期待される。

【産業上の利用可能性】

【0032】

本出願における開示により、ＣＯＶＩＤ－１９重症化およびサイトカインストーム重症化を予測するための情報を提供できる。したがって、医療機関や大学医学部などの研究機関等におけるＣＯＶＩＤ－１９患者等の検査及び研究に有用である。