特開 2023-162344 コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＳＡＤＨＤ）を処置するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023162344

(43)【公開日】2023-11-08

(54)【発明の名称】コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＳＡＤＨＤ）を処置するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20231031BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 31/195 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 31/196 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 31/57 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231031BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20231031BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231031BHJP

   C07D 498/18 20060101ALN20231031BHJP

   C07J 7/00 20060101ALN20231031BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K45/00

A61K31/195

A61K31/196

A61K31/436

A61K31/57

A61K35/76

A61K35/761

A61P43/00 111

A61P43/00 121

C07D498/18

C07J7/00

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023139463

(22)【出願日】2023-08-30

(62)【分割の表示】P 2020544456の分割

【原出願日】2019-02-12

(31)【優先権主張番号】62/634,092

(32)【優先日】2018-02-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】510239406

【氏名又は名称】ワシントン ステイト ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】ヴォーゲル カーラ レイン

(72)【発明者】

【氏名】ギブソン ケネス マイケル

(72)【発明者】

【氏名】エインズリー ギャレット ロバート

(57)【要約】      （修正有）

【課題】コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＳＡＤＨＤ）を処置するための組成物および方法を提供する。
【解決手段】組成物は、ターゲティングベクターに作動可能に連結された、ＡＬＤＨ５Ａ１などの機能性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）酵素をコードする遺伝子を含むことができる。機能性ＳＳＡＤＨ酵素は、循環γ‐ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）とγ‐アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のレベルを低下させると想定されている。いくつかの実施形態において、標的化ベクターに作動可能に連結された機能性ＳＳＡＤＨ酵素をコードする遺伝子を含む組成物；１つ以上のｍＴＯＲ阻害剤；およびＧＡＢＡ-Ｔ阻害剤の組み合わせの治療有効量を対象に投与することを含む、組合せ療法が想定される。適切なｍＴＯＲ阻害剤にはラパマイシンが含まれ、一方、適切なＧＡＢＡ-Ｔ阻害剤にはビガバトリンが含まれる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的化ベクターに作動可能に連結された機能性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）酵素をコードする遺伝子を含む、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＳＡＤＨＤ）を処置するための組成物。

【請求項2】

遺伝子がＡＬＤＨ５Ａ１である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

標的化ベクターがウイルスベクターである、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

標的化ベクターが肝臓を標的化する、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。

【請求項7】

前記機能性ＳＳＡＤＨ酵素が、循環γ-ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）およびγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のレベルを低下させる、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。

【請求項8】

組成物が血液脳関門を通過しない、請求項１～７のいずれかに記載の組成物。

【請求項9】

治療有効量の請求項１～８のいずれかの組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＳＳＡＤＨＤを処置する方法。

【請求項10】

治療有効量が、１日当たり体重１ｋｇ当たり１～１０．０００μｇの範囲の機能性ＳＳＡＤＨ酵素を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

組成物が、週１回、週２回、または月１回投与される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

組成物が静脈内に投与される、請求項９～１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

標的化ベクターに作動可能に連結された機能性ＳＳＡＤＨ酵素をコードする遺伝子を含む組成物；１つ以上のｍＴＯＲ阻害剤；ＧＡＢＡ-Ｔ阻害剤；またはそれらの組み合わせの治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＳＳＡＤＨＤを処置する方法。

【請求項14】

前記１つ以上のｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシン、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびリダフォロリムス、トリン１、およびトリン２のうちの１つ以上を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

ＧＡＢＡ－Ｔ阻害剤がビガバトリンである、請求項１３記載の方法。

【請求項17】

治療有効量の、トリン２、ビガバトリン、および標的化ベクターに作動可能に連結された機能性ＳＳＡＤＨ酵素をコードする遺伝子を含む組成物、を投与することを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項18】

トリン２および／またはビガバトリンの治療有効量が、１日当たり体重１ｋｇ当たり１～２５μｇを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

トリン２および／またはビガバトリンが、１日に２回または３回投与される、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

前記対象が、増加したレベルの循環代謝産物を有する、請求項１３～１９のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

前記循環代謝産物が、ＧＨＢ、ＧＡＢＡ、またはその両方である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

治療有効量のＮＫＣＣ１阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてＳＳＡＤＨＤを処置する方法。

【請求項23】

ＮＫＣＣ１阻害剤が、ブメタニド、アロプレグナノロン、プレグナノロン、プロゲステロン、ガボクサドール、エチフォキシン、ＸＢＤ－１７３、ＦＧ－７１４２、ガバジン、イソニアジド、エンセニクリン、およびＡＶＬ－３２８８からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ＮＫＣＣ１阻害剤がブメタニドである、請求項２３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の参照】

【0001】

本出願は、２０１８年２月２２日に出願された米国仮出願第６２／６３４，０９２号の利益を主張する。上記出願の全内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
連邦支援研究に関する表明

【0002】

本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与されたグラント番号ＮＳ０８２２８６、ＮＳ０９８８５６、ＮＳ０８５３６９、およびＥＹ０２７４７６に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。

【技術分野】

【0003】

本明細書に開示される主題は一般に、神経障害を処置するための組成物および方法を対象とする。

【背景技術】

【0004】

コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＳＡＤＨＤ）の病態生理学および臨床的特徴の理解の進歩は、１９８０年代におけるその記載から継続している。(Jakobsら、Clin Chim Acta 111:169-178(1981); Gibsonら、Clin Chim Acta 133:33-42(1983)). マウスノックアウトモデル、いわゆるアルデヒドデヒドロゲナーゼ５ａｌ（ａｌｄｈ５ａ１-／-）マウス(Hogema et al. 2000)の開発により、１９９９年に大きな進歩もたらされた。この動物モデルの表現型は重度であり、生後約３週間で早期に致死性を示すが、ＧＡＢＡ作働性、グルタミン酸作働性、ＧＨＢ作動性、代謝性、酸化ストレス、その他のパラメータについては他には利用できない洞察が得られている(Gupta et al. J Pharmacol Exp Ther 302:180-187(2002); Cortez et al.、Pharmacol Biochem Behav 79:547-553(2004); Buzziら、Brain Res 1090:15-22(2006); Wu et al.、Ann Neurol 59:42-52(2006); Jansen et al.、BMC Dev Biol 8:112(2008); Pearl et al.、J Inherit Metab Dis 32:343-352(2009); Vogel et al.、Ann Clin Transl Neurol 2:699-706(2015); Vogel et al.、J Inherit Metab Dis 39:877-886(2016); Vogel et al.、Clin Pharmacol Ther 101:458-461(2017); Vogel et al.、Toxicol In Vitro 40:196-202(2017); Vogel et al.、Pediatr Neurol 66:44-52.e1. (2017); Vogel et al. Biochim Biophys Acta 1863:33-42(2017); Vogel et al.、Toxicol In Vitro 46:203-212(2017); Vogel et al.、PLoS One 12(10):e0186919(2017))。これまでのところ、このモデルを早期致死から救う治療薬には、ＧＡＢＡＢおよびＧＨＢ受容体拮抗薬、非生理的アミノ酸タウリン、抗てんかん薬ビガバトリン、ケトン生成食、および後者のｍＴＯＲ阻害剤であるＴｏｒｉｎ ２などのラパログ薬がある。ＳＧＳ７４２， ＧＡＢＡＢＲアンタゴニストは、進行中の臨床試験の対象である(www.clinicaltrials.gov; NCT02019667)。

【0005】

主要な中枢抑制性神経伝達物質であるＧＡＢＡ(Schousboe and Waagepetersen Prog Brain Res 160:9-19(2007))及びその関連構造類似体であるγヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）は、ＳＳＡＤＨＤにおいて超生理的レベルに蓄積する(Malaspina et al. Neurochem Int 99:72-84(2016))(図１)。各々が病態生理学に寄与する程度は未知のままである。しかしながら、ＧＡＢＡの新たな役割は、腸脳軸に沿った神経内分泌作用、オートファジー、概日リズムなど、抑制性神経伝達物質の役割を超えて存在する(Kilb Neuroscientist 18:613-630(2012); Lakhani et al. EMBO Mol Med 6:551-566(2014); Chellappa et al.)。Sci Rep 6:33661(2016); Mittalら、J Cell Physiol 232:2359-2372(2017))。これらの役割は、ＳＳＡＤＨＤにおける病理メカニズムを探索する新しい機会を提供する。ＳＳＡＤＨＤ治療のための研究と前臨床薬開発のための新しい方向性が必要である。

【発明の概要】

【0006】

１つの態様において、本明細書中に提供されるのは、標的化ベクターに作動可能に連結された機能性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）酵素をコードする遺伝子を含む、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＳＡＤＨＤ）を処置するための組成物である。いくつかの実施形態では、遺伝子はＡＬＤＨ５Ａ１であってもよい。

【0007】

いくつかの実施形態では、標的化ベクターはウイルスベクターである。適切なウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。

【0008】

いくつかの実施形態では、標的化ベクターは肝臓を標的化する。

【0009】

いくつかの実施形態では、機能性ＳＳＡＤＨ酵素は、循環γ-ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）およびγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、組成物は血液脳関門を通過しない。

【0010】

別の態様において、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の組成物のいずれかを投与することを含む、それを必要とする対象におけるＳＳＡＤＨＤを処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療有効量が１日当たり体重１ｋｇ当たり１～１０，０００μｇの範囲の機能性ＳＳＡＤＨ酵素を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物が週１回、週２回、または月１回投与される。いくつかの実施形態では、組成物は静脈内に投与される。

【0011】

さらに別の局面において、本発明は、標的化ベクターに作動可能に連結された機能性ＳＳＡＤＨ酵素をコードする遺伝子を含む組成物；１つ以上のｍＴＯＲ阻害剤；ＧＡＢＡ-Ｔ阻害剤；またはそれらの組み合わせの治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＳＳＡＤＨＤを処置する方法を提供する。

【0012】

適切なｍＴＯＲ阻害剤としてはラパマイシン、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびリダフォロリムス、トリン１、およびトリン２が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシンである。特定の実施形態では、ＧＡＢＡ－Ｔ阻害剤はビガバトリンである。

【0013】

いくつかの実施形態では、トリン２、ビガバトリン、および標的化ベクターに作動可能に連結された機能性ＳＳＡＤＨ酵素をコードする遺伝子を含む組成物の治療有効量を投与することを含む、併用療法が想定される。

【0014】

特定の実施形態において、トリン２および／またはビガバトリンの治療有効量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり１～２５μｇを含む。いくつかの実施形態において、トリン２および／またはビガバトリンは、１日２回または３回投与される。

【0015】

いくつかの実施形態では、対象は、循環代謝産物のレベルが増加していてもよい。このような循環代謝産物はＧＨＢ、ＧＡＢＡ、またはその両方を含み得るが、必ずしもこれらに限定されない。

【0016】

さらに別の側面では、本発明は、治療有効量のＮＫＣＣ１阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてＳＳＡＤＨＤを処置する方法を提供する。ＮＫＣＣ１阻害剤は、ブメタニド、アロプレグナノロン、プレグナノロン、プロゲステロン、ガボキサドール、エチフォキシン、ＸＢＤ－１７３、ＦＧ－７１４２、ガバジン、イソニアジド、エンセニクリン、およびＡＶＬ－３２８８を含み得るが、必ずしもこれらに限定されない。特定の実施形態では、ＮＫＣＣ１阻害剤はブメタニドである

【0017】

例示的な実施形態のこれらおよび他の態様、目的、特徴、および利点は、以下の例示的な実施形態の詳細な説明を考慮すると、当業者には明らかになるのであろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

本発明の特徴および利点の理解は、本発明の原理を利用することができる例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。

【0019】

【図1】ＧＡＢＡ代謝および細胞内相互作用を示す概略図である。ＳＳＡＤＨＤ患者の欠損部位は「Ｘ」で示す。略語：ＧＡＢＡ、γアミノ酪酸；ＧＡＢＡＡＲ、イオンチャネル型ＧＡＢＡＡ受容体；ＧＡＢＡＢＲ、代謝型ＧＡＢＡＢ受容体；ＧＡＢＡ－Ｔ，ＧＡＢＡ－トランスアミナーゼ；ＳＳＡ，コハク酸セミアルデヒド；ＡＫＲ７ａ２，ａｌｄｏ－ｋｅｔｏレダクターゼ７ａ２；ＧＨＢ，γ－ヒドロキシ酪酸；ｃＡＭＰ，サイクリックＡＭＰ；ＮＫＣＣ１，ナトリウムカリウム塩化物コトランスポーターｌ；ＫＣＣ２，神経細胞の塩化カリウムコトランスポーター２。ＳＳＡＤＨＤでは、ＧＡＢＡ、ＳＳＡ、ＧＨＢが蓄積する（↑）。ＧＡＢＡおよびＧＨＢの増加は、ＧＡＢＡＡおよびＧＡＢＡＢ受容体と推定上のＧＨＢ受容体を活性化する（分子同定は不明）。しかし、ＧＡＢＡとＧＨＢ受容体の代償的ダウンレギュレーション（↓）がＳＳＡＤＨＤで報告されており、過多ＧＡＢＡは、生体内での抑制性神経伝達の増加につながらないことを示唆している。ＮＫＣＣ１とＫＣＣ２は膜貫通型塩化物勾配を制御し、ＧＡＢＡＡ受容体の方向性膜貫通型塩化物フラックスを決定する。実験的なＳＳＡＤＨＤでは、ＮＫＣＣ１とＫＣＣ２（ＮＫＣＣ１／ ＫＣＣ２）の発現比が上昇し（Vogeletal。PediatrNeurol66:44-52.e1。(2017c)）、ＧＡＢＡＡ受容体の活性化が、脳細胞からの塩化物流出、膜貫通脱分極、神経伝達の活性化を引き起こすことを示唆している（詳細は図３を参照）。ブメタニドのようなＮＫＣＣ１阻害剤は、細胞内塩化物濃度を低下させる。ＳＳＡＤＨＤにおいて、ブメタニドはこのようにＧＡＢＡ抑制性神経伝達活性を回復させ、発作を効率的に抑制する可能性がある。最後に、ＳＳＡＤＨＤならびにビガバトリン投与動物において、ＧＡＢＡの増加は、二次的に増加したミトコンドリア数、酸化ストレス、オートファジーおよびマイトファジーを伴うｍＴＯＲ経路を活性化する。トリン１（ｔｏｒｉｎ １）およびトリン２（ｔｏｒｉｎ ２）のようなｍＴＯＲ阻害剤は、ＧＡＢＡ誘導、ｍＴＯＲ経路媒介細胞内欠損を改善し、ａｌｄｈ５ａ１欠損マウスの寿命を有意に延長させた。

【0020】

【図2】ＮＣＳ－３８２投与（７日間、毎日、３００ｍｇ／ｋｇ）後のａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおける溶質担体（Ｓｌｃ）の皮質遺伝子発現プロファイルを示すグラフ。相対レベルを表示し、ビヒクルを与えた対照ａｌｄｈ５ａ１-／マウスに対して正規化する。担体の機能的役割：＊ｌ７ａ６、＊ｌ７ａ７、＊ｌ７ａ８、小胞性グルタミン酸（ｇｌｕ）トランスポーター、ｇｌｕコトランスポーター、ｇｌｕトランスポーター３；それぞれ１ａ１、＊１ａ２、１ａ３、１ａ４、興奮性アミノ酸トランスポーター３、２、ｌ、および４；＊３２ａｌ、ＧＡＢＡ小胞性トランスポーター；３８ａ１、Ｎａ＋共役アミノ酸トランスポーター１（グルタミン輸送）；＊６ａｌ、細胞膜ＧＡＢＡトランスポーター；＊６ａ１１、６ａ１２、６ａ１３、Ｎａ＋依存性ＧＡＢＡシナプス前終末再取り込み、Ｎａ＋／Ｃｌ－依存性ベタイン、およびＮａ＋／Ｃｌ－依存性ＧＡＢＡ ２トランスポーター；それぞれ７ａ１１、グルタミン酸システインアンチポーター。星印を付けた遺伝子は、ＮＣＳ－３８２の慢性投与後に発現の補正を示した。値は、生物学的三連（ｎ＝各３匹の動物、ＮＣＳ-３８２およびビヒクル）のプールされたデータを表す。

【0021】

【図3A-3B】実験的ＳＳＡＤＨＤにおける酵素補充療法（ＥＲＴ）。（図３Ａ）酵素置換介入に応じたＡｌｄｈ５ａ１-／マウス生存日数（ＤＯＬ ３０）。精製ヒトＡＬＤＨ５ＡｌをＤＯＬ１０から皮下注射により毎日（１ｍｇ／ｋｇ／日）投与した。（図３Ｂ）ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおけるＥＲＴ後のＧＡＢＡ関連遺伝子の発現（ａｌｄｈ５ａ１＋／＋マウスに対する倍率変化；２１日齢マウスの矢状切片）。略語：Ｇａｂｒａ５，ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットα５；Ｇａｂｒａ６，α－６；Ｇａｂｒ１，β－１；Ｇａｂｒ３，β－３；Ｇａｂｒｄ，δ；Ｇａｂｒｅ，ε；Ｇａｂｒｇｌ，γ－１；Ｇａｂｒｇ２，γ－２；Ｇａｂｒｇ３，γ－３；Ｇａｂｒｑ，θ．星印の値はＥＲＴに応じた発現の方向補正を表す。

【0022】

【図4A-4B】ＥＲＴを投与した動物における代謝測定。処理スキームは、図３の凡例に記載する。（図４Ａ）遺伝子型（ＷＴ＝野生型、ａｌｄｈ５ａ１＋／＋マウス；ＭＴ＝突然変異体、ａｌｄｈ５ａ１-／マウス；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＳＳＡＤＨ、組換えＳＳＡＤＨ）に応じた脳ＧＨＢ内容。（図４Ｂ）血清中のＧＡＢＡ。データは平均値±標準偏差で示した。統計解析は、一元配置分散分析と事後解析（ｔ検定）を採用した。

【0023】

【図5A-5C】ＳＳＡＤＨＤにおける細胞内塩化物ホメオスタシス、ＧＡＢＡ作動性神経伝達およびブメタニド（略号については図１参照）。（図５Ａ）ブメタニドの膜イオン輸送および作用メカニズムの模式図。(図５Ｂ) 生後２０日に収集されたａｌｄｈ５ａ１＋／＋（ｎ＝５）およびａｌｄｈ５ａ１－／－（ｎ＝５）マウスの視床下部におけるＮＫＣＣ１およびＫＣＣ２遺伝子発現。発現データは、Ｂｉｏ－Ｒａｄからのｑ－ＲＴ－ＰＣＲ、検証済み経路プレートを用いて得た。（図５Ｃ）１００ｍｇ／ｋｇブメタニドの急性投与後の鎮静までの時間。動物は発作イベントについて日常生活（ＤＯＬ）２０および２４で評価し、不動化までの時間（鎮静）は、Ｎｏｌｄｕｓ技術を用いた視覚記録により決定した（本文参照）。ブメタニドを、最初の観察記録の２０分後に対象マウスに腹腔内投与し、続いてさらに２０分間記録した。発作の総数を、全４０分間の記録期間の５分間のブロックで定量化した。ブメタニドはＥｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）から入手し、ＤＭＳＯビヒクルに無菌的に溶解した。溶媒投与例では鎮静は認められなかった。Ａｌｄｈ５ａ１－／－マウス（突然変異体； ＭＴ）はアルドｈ５ａ１＋／＋（野生型；ＷＴ）マウスと比較して、ブメタニドの鎮静作用に対して有意に抵抗性であり、後者はほぼ瞬間的な不動化を示した。固定化前のａｌｄｈ５ａ１－／－マウスの活動期（～３～８分）の間、発作活性は認められなかった。加えて、この耐性はａｌｄｈ５ａ１－／－マウスで年齢と共に有意に増加した（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。使用した略語：ｎ、研究した動物の数；ＤＯＬ、生存日； ｓｅｃ、秒； ｍｉｎ、分。

【0024】

【図6】オートファジーの調節におけるＡＭＰＫおよびｍＴＯＲＣ１の役割の簡略化された概略図である。ＡＭＰＫ （アデノシン一リン酸活性化タンパク質キナーゼ）とｍＴＯＲ（ラパマイシンの機構的標的）はともに、細胞内エネルギー、増殖、生存の調節において重要な役割を果たしている。ＰｒｋａｇｌとＰｒｋａｇ２（プロテインキナーゼｃＡＭＰ活性化γサブユニット１と２）は、活性型ＡＭＰＫ三量体構造の構成要素である。逆に、ＲａｇＢとＤ（ｒａｓ関連ＧＴＰ結合蛋白質ＢとＤ）は、ｍＴＯＲＣ１機能の調節に関与している。Ｔｓｃ１／２（結節性硬化症蛋白１および２）はｍＴＯＲＣ１の負の調節因子である。略語：ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ酵素、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ酵素；ＡＣＣ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ；ＡＴＰ、アデノシン三リン酸；ＡＭＰ、アデノシン一リン酸。

【0025】

【図7】ａｌｄｈ５ａ１-／－マウスにおける発作型の代表的な電気記録図記録。これらのデータは、表２のデータを生成するために使用されたトレースを表す。

【0026】

本明細書の図面は例示の目的のためだけのものであり、必ずしも一定の縮尺で描かれていない。
（実施形態の詳細な説明）
一般的な定義

【0027】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語および技術の定義は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989)(Sambrook、Fritsch、およびManiatis); Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第4版(2012)(Green and Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology(1987); Current Protocols in Enzymology(Academic Press, Inc.);PCR 2: A Practical Approach(1995)(M.J. MacPherson, B.D. Hames、およびG.Greenfield ed.; Animal Cell Culture(1987); Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008(ISBN 076375223); Kendrew et al.(eds.), The Encyclopedia of. Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994(ISBN 0632021829); Robert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995(ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons(New York, N.Y. 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons(New York, N.Y. 1992); and Marten H. Hofker and Jan van Deursen, Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2nd edition(2011)に記載されている。

【0028】

本明細書で使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」は文脈が明らかに沿わないことを指示しない限り、単数および複数の両方の指示対象を含む。

【0029】

「任意選択(optional)」または「任意選択的(optionally)」という語は、後に記載される事象、状況または代替物が起こっても起こらなくてもよく、その記載が事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを手段する。

【0030】

終点による数値範囲の列挙は列挙された終点と同様に、それぞれの範囲内に包含されるすべての数および分数を含む。

【0031】

パラメータ、量、持続時間などの測定可能な値に言及するときに本明細書で使用される「約」または「ほぼ」という用語は開示された発明において実行するのに適切である限り、＋／－１０％以下、＋／－５％以下、＋／－１％以下、および＋／－０．１％以下の変化などの、指定された値からの変化を包含することを意味し、修飾語「約」または「ほぼ」が言及する値自体もまた、具体的に、好ましくは開示されていることを理解されたい。

【0032】

本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、全細胞および/または生きた細胞および/または細胞残屑を含み得る。生物学的サンプルは「体液」を含み得る(またはそれに由来し得る)。本発明は、体液が羊水、房水、房水、我々の体液、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢(耳ろう)、乳び、乳糜、乳糜、内リンパ、外リンパ、滲出液、糞便、雌射精液、胃酸、胃液、リンパ、粘液(鼻腔ドレナージおよび痰を含む)、心膜液、腹膜液、胸水、膿、リウマチ、唾液、皮脂(皮膚油)、精液、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、嘔吐物およびこれらの1つ以上の混合物から選択される実施形態を包含する。生物学的サンプルには、細胞培養物、体液、体液由来の細胞培養物が含まれる。体液は例えば、穿刺、または他の収集もしくはサンプリング手順によって、哺乳動物生物から得ることができる。

【0033】

用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書において、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味するために互換的に使用される。哺乳動物にはマウス、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されない。インビボで得られるかまたはインビトロで培養される生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫もまた包含される。

【0034】

以下、様々な実施形態について説明する。特定の実施形態は、網羅的な説明として、または本明細書で論じるより広い態様に対する限定として意図されていないことに留意されたい。特定の実施形態に関連して説明される1つの態様は、必ずしもその実施形態に限定されず、任意の他の実施形態(単数または複数)で実施することができる。なお、本明細書において、「一実施形態」、「実施形態」、「実施形態例」とは実施形態に関連して説明した特定の特性、構造又は特性が本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを手段するものであり、本明細書の各箇所における「一実施形態において」、「実施形態において」又は「実施形態例」という語句の出現は必ずしも全てが同一の実施形態を指すものではなく、そのような出現であってもよい。さらに、特定の特徴、構造、または特性は1つまたは複数の実施形態において、本開示から当業者には明らかであるように、任意の適切な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は他の実施形態に含まれる他の特徴ではなく、いくつかの実施形態を含むが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲では、特許請求の範囲に記載された実施形態のいずれも、任意の組合せで使用することができる。

【0035】

本明細書に引用される全ての刊行物、公開された特許文書、および特許出願は、各個々の刊行物、公開された特許文書、または特許出願が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個々に示された場合と同様に、それと同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
組成物

【0036】

特定の局面において、本発明は、ＳＳＡＤＨＤを処置するための１つ以上の組成物を含む。いくつかの実施形態では、ＳＳＡＤＨＤが正常レベルよりも高いレベルの循環レベルの代謝産物を通して現れ得る。そのような代謝産物にはγ-ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）およびγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。

【0037】

この文脈で使用さる場合、「処置する」とは、少なくとも１つの症状または疾患、病的状態、または障害の重症度を治癒、改善、安定化、予防、または軽減することを意味する。この用語は、能動的処置、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の向上に特異的に向けられた処置を含み、また、因果的処置、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の原因の除去に向けられた処置も含む。さらに、この用語は緩和処置、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の治癒よりもむしろ症状の緩和のためにデザインされた処置;予防処置、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の発症を最小限または部分的または完全に阻害するように向けられた処置;および支持処置、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の向上に向けられた別の特異的治療を補足するために用いられる処置を含む。処置は疾患、病理学的状態、または障害を硬化、改善、安定化、または予防することを意図しているが、実際には治癒、改善、安定化または予防をもたらす必要はないことが理解される。処置の効果は本明細書中に記載されるように、および関与する疾患、病理学的状態、または障害に適切であるような当該分野で公知のように、測定または評価され得る。このような測定および評価は、定性的および/または定量的に行うことができる。従って、例えば、疾患、病理学的状態、または疾患、病理学的状態、または障害の特性または特性、および/または症状は、任意の効果または任意の量に減少され得る。

【0038】

本明細書で使用される「処置を必要とする」という用語は対象が処置を必要とする、または処置から利益を得ることになる、介護者（例えば、医師、看護師、看護師、またはヒトの場合は個人；動物の場合は動物（非ヒト動物を含む））によってなされる判断を指す。この判断は介護者の例の領域にあるが、本明細書に記載される組成物および治療剤によって治療可能な状態の結果として、対象が病気であるか、または病気になるのであろうという知識を含む、様々な因子に基づいて行われる。

【0039】

本明細書中で使用される場合、用語「機能性」または「機能性ＳＳＡＤＨ酵素」は酵素を非存在、欠損、欠陥または非機能性にする突然変異を有する遺伝子に由来する酵素とは対照的に、正常に機能する酵素をいう。いくつかの実施形態では、機能性ＳＳＡＤＨ酵素は、ＳＳＡＤＨをコードする野生型遺伝子を保有する健康な個体に見出される酵素など、完全に機能性な酵素である。

【0040】

コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）は、コハク酸セミアルデヒドをクレブス回路の必須成分であるコハク酸塩に変換するＧＡＢＡ分解経路における酵素である。ＳＳＡＤＨ欠損症の場合、ＧＡＢＡ分解経路の最終中間体であるコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）が蓄積し、コハク酸に酸化することができない。その結果、ＳＳＡはγ‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼによりＧＨＢに還元される。これは、ＧＡＢＡとＧＨＢの両方の循環レベルの上昇を導く。

【0041】

本明細書において、「ベクター」とは、ある環境から別の環境へのエンティティ(entity)の移入を可能にする、または容易にするツールである。プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンに、挿入されたセグメントの複製を引き起こすように、別のＤＮＡセグメントを挿入することができる。一般に、ベクターはそれが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子；１つ以上の遊離末端を含み、遊離末端を含まない核酸分子（例えば、環状）；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および当技術分野で公知の他の多様なポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、環状二本鎖ＤＮＡループを意味し、標準的な分子クローニング技術などによって、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルスにパッケージングするためのベクター中に存在する（例えば、レトロウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠陥アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドを含む。ある種のベクターはそれらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる 組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。

【0042】

組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターは、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択することができ、発現される核酸配列に作動可能に連結される１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。組換えおよびクローニング方法に関しては、米国特許出願第１０／８１５，７３０号、２００４年９月２日に米国特許出願第２００４－０１７１１５６ Ａ１号が記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0043】

いくつかの実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターを含み得るが、必ずしもこれに限定されない。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、有糸分裂細胞と有糸分裂後細胞の両方でその遺伝子を感染させ発現させる能力を有する。最も一般的に知られているレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖蛋白質を用いて広範囲の細胞型を標的とする。

【0044】

レンチウイルスは、当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。１つの例示的な方法は、レンチウイルス移入プラスミド骨格を含むプラスミド中に目的の遺伝子をクローニングすることを含み得る。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含み、抗生物質を含まないＤＭＥＭ中に、トランスフェクションの前日に、５０％コンフルエンスまでＴ-７５フラスコ中に低継代（ｐ＝５）で播種することができる。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行ってもよい。細胞は、１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミドおよび以下のパッケージングプラスミドでトランスフェクトされ得る：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ-Ｇ偽型）、および７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）。トランスフェクションは、カチオン性脂質送達剤（５０μＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００および１００μｌ Ｐｌｕｓ試薬）を用いて４ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭ中で行うことができる。６時間後、培地を、１０％ウシ胎児血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭに交換することができる。これらの方法は細胞培養中に血清を使用するが、無血清方法が好ましい。

【0045】

レンチウイルスは、以下のように精製することができる。ウイルス上清を４８時間後に回収することができる。上清からデブリを最初に除去し、０．４５ｕｍ低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターを通して濾過することができる。次に、それらを超遠心機中で２４，０００ｒｐｍで２時間回転させる。ウイルスペレットを、４℃で一晩、５０μｌのＤＭＥＭに再懸濁する。次いで、それらをアリコートし、そして直ちに-８０℃で凍結する。

【0046】

別の実施形態においては、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づく最小非霊長類レンチウイルスベクターもまた、特に眼遺伝子治療のために意図される（例えば、Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275-285を参照のこと）。別の実施形態では、加齢黄斑変性のウェブ形態の治療のために網膜下注射を介して送達されるアンギオスタチンおよびアンギオスタチンを発現するウマ感染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子治療ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）もまた企図され（例えば、Binleyら、HUMAN GENE THERAPY 23:980-991(2012年9月）を参照のこと）、このベクターは本発明に適切であるように必要に応じて改変することができる。

【0047】

別の実施形態では、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通エキソンを標的とするｓｉＲＮＡ、核小体局在ＴＡＲデコイ、および抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムを有する自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、DiGiustoら(2010)Sci Transl Med 2:36ra43を参照のこと）を使用することができ、及び／または。それは本発明のシステムに適合することができる。患者の体重１ｋｇ当たり最低２．５×１０⁶個のＣＤ３４＋細胞を収集し、２μｍｏｌ／Ｌ-グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ-３リガンド（Ｆｌｔ-３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ-ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で、２×１０⁶細胞／ｍｌの密度で１６～２０時間、前刺激することができる。予め刺激した細胞を、フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ²）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）でコーティングした７５ｃｍ²組織培養フラスコ中で、５の感染多重度で１６～２４時間レンチウイルスで形質導入することができる。

【0048】

レンチウイルスベクターはパーキンソン疾患の処置におけるように開示されている（例えば、米国特許公開第２０１２０２９５９６０号および米国特許番号７３０３９１０および７３５１５８５を参照のこと）。レンチウイルスベクターはまた、眼疾患の処置のために開示されている（例えば、米国特許公開番号２００６０２８１１８０，２００９０００７２８４、ＵＳ２０１１０１１７１８９、ＵＳ２００９００１７５４３、ＵＳ２００７００５４９６１、ＵＳ２０１００３１７１０９を参照のこと）。レンチウイルスベクターもまた、脳への送達について開示されている（例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１１０２９３５７１、ＵＳ２０１１０２９３５７１、ＵＳ２００４００１３６４８、ＵＳ２００７００２５９７０、ＵＳ２００９０１１１１０６、およびＵＳ特許番号ＵＳ７２５９０１５を参照のこと）。

【0049】

特定の実施形態において、標的化ベクターはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを含むが、必ずしもこれらに限定されないウイルスベクターである。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。

【0050】

例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）については投与経路、製剤および用量は、米国特許第８，４５４，９７２号およびアデノ随伴ウイルスベクターを含む臨床試験と同様であり得る。アデノウイルスについては投与経路、製剤および用量は米国特許第８，４０４，６５８号およびアデノウイルスを含む臨床試験におけるようなものであり得る。プラスミド送達については投与経路、製剤および用量は米国特許第５，８４６，９４６号およびプラスミドを含む臨床研究におけるようなものであり得る。用量は平均７０ｋｇの個体（例えば、成人男性）に基づいて、または外挿することができ、患者、被験者、異なる体重および種の哺乳動物に対して調整することができる。投与回数は年齢、性別、全身健康状態、患者または被験者の他の状態および対処される特定の状態または症状を含む通常の因子に依存して、医師または獣医師（例えば、医師、獣医師）の範囲内にある。ウイルスベクターは、目的の組織に注射され得る。細胞型特異的発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。例えば、肝臓特異的発現はアルブミンプロモーターを使用し、ニューロン特異的発現（例えば、ＣＮＳ障害を標的とするため）はシナプシンＩプロモーターを使用する。

【0051】

インビボ送達に関して、ＡＡＶはいくつかの理由のために、他のウイルスベクターよりも有利である。それは毒性が低く（これは、免疫応答を活性化することができる細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法によるものであり得る）、宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす蓋然性が低い。ＡＡＶに関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはそれらの任意の組み合わせであり得る。標的化される細胞に関してＡＡＶのＡＡＶを選択することができ；例えば、脳またはニューロン細胞を標的化するためにＡＡＶ血清型１、２、５またはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはそれらの任意の組み合わせを選択することができ；心臓組織を標的化するためにＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は肝臓への送達に有用である。

【0052】

いくつかの態様または実施形態では、送達粒子製剤を含む組成物を使用することができる。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質ベースの粒子、任意選択で脂質ナノ粒子、またはカチオン性脂質、および任意選択で生分解性ポリマーを含む。ある実施形態において、カチオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーがエチレングリコールまたはポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子がリポタンパク質、好ましくはコレステロールをさらに含む。いくつかの実施形態では、送達粒子が直径５００ｎｍ未満、任意選択で直径２５０ｎｍ未満、任意選択で直径１００ｎｍ未満、任意選択で直径約３５ｎｍ～約６０ｎｍである。

【0053】

いくつかのタイプの粒子送達系および／または製剤は、生物医学的用途の多様なスペクトルにおいて有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送および特性に関してユニット全体として振る舞う小さな物体として定義される。粒子は、直径に従ってさらに分類される。粗い粒子は、２，５００～１０，０００ナノメートルの範囲をカバーする。微粒子は、１００～２，５００ナノメートルのサイズである。超微粒子またはナノ粒子は一般に、１～１００ナノメートルのサイズである。１００ｎｍ限界の基礎は、バルク材料から粒子を区別する新規な特性が典型的には１００ｎｍ未満の臨界長さスケールで発達するという事実である。

【0054】

本明細書中で使用される場合、粒子送達系／製剤は、本発明による粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明による粒子は１００ミクロン（μｍ）未満の最大寸法（例えば、直径）を有する任意の実体（entity）である。いくつかの実施形態では、本発明の粒子が１０μｍ未満の最大寸法を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子が２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子が１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。ある態様において、本発明の粒子は、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、または１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。典型的には、本発明の粒子が５００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子が２５０ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子が２００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子が１５０ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子が１００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。例えば５０ｎｍ未満の最大寸法を有する、より小さな粒子が、本発明のある態様において使用される。ある態様において、本発明の粒子は、２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。

【0055】

一般的に、「ナノ粒子」は、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子のことを言う。特定の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は５００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子が２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子が１００ｎｍ以下の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子が３５ｎｍ～６０ｎｍの範囲の最大寸法を有する。本明細書で粒子またはナノ粒子に言及することは、適切な場合には交換可能であり得ることが理解されるのであろう。

【0056】

粒子の大きさは、それがローディング前またはローディング後に測定されるかどうかによって異なることが理解されるであろう。したがって、特定の実施形態において、「ナノ粒子」という用語は、ローディング前の粒子にのみ適用され得る。

【0057】

本発明に包含されるナノ粒子は例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁液、またはそれらの組み合わせとして、異なる形態で提供されてもよい。金属、誘電体、および半導体ナノ粒子はハイブリッド構造（例えば、コアシェルナノ粒子）と同様に調製されてもよい。半導体材料からなるナノ粒子は、電子エネルギーレベルの量子化が生じるほど十分に小さい（典型的には１０ｎｍ未満）場合には量子ドットと標識されてもよい。このようなナノスケール粒子は、薬物担体または造影剤として生物医学的適用において使用され、そして本発明における同様の目的に適合され得る。

【0058】

半固体および軟質ナノ粒子が製造されており、これらは本発明の範囲内である。半固体の性質のプロトタイプのナノ粒子は、リポソームである。種々のタイプのリポソームナノ粒子が、現在、抗癌剤およびワクチンのための送達系として臨床的に使用されている。一方の半分が親水性であり、他方の半分が疎水性であるナノ粒子は、Ｊａｎｕｓ粒子と呼ばれ、エマルジョンを安定化するのに特に有効である。それらは、水／油界面で自己集合し、固体界面活性剤として作用することができる。

【0059】

粒子のキャラクタリゼーション（例えば、形態、寸法などのキャラクタリゼーションを含む）は、種々異なる技術を使用して行われる。一般的な技術は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）、紫外可視分光法、二重偏光干渉法および核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。キャラクタリゼーション（寸法測定）は、本発明の任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ投与のための送達に最適なサイズの粒子を提供するために、天然粒子（すなわち、プレローディング）に関して、または貨物（cargo）（本明細書中の貨物（cargo）とは、例えば、機能性ＳＳＡＤＨ酵素、薬物、またはそれらの任意の組み合わせをコードする遺伝子をいい、そして追加のキャリアおよび／または賦形剤を含み得る）のローディング後に行うことができる。特定の好ましい実施形態では粒子寸法（例えば、直径）のキャラクタリゼーションは。動的レーザ散乱（ＤＬＳ）を使用する測定に基づく。粒子、それらの製造方法および使用方法、ならびにそれらの測定に関しては、米国特許第８，７０９，８４３号；米国特許第６，００７，８４５号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，９８５，３０９号、特許第５，５４３，１５８号、およびJames E. DahlmanおよびCarmen Barnesらによる刊行物（Nature Nanotechnology (2014)、２０１４年５月１１日にオンラインで公開、doi:10.1038/nnano.2014.84）が挙げられる。

【0060】

本発明の範囲内の粒子送達系は、固体、半固体、エマルジョン、またはコロイド粒子を含むがこれらに限定されない任意の形態で提供され得る。そのようなものとして、例えば、脂質ベースの系、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム、または遺伝子銃を含むがこれらに限定されない、本明細書中に記載される送達系のいずれかが、本発明の範囲内の粒子送達系として提供することができる。

【0061】

別の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が企図される。抗トランスサイレチン低分子干渉ＲＮＡは、脂質ナノ粒子中にカプセル化され、ヒトに送達されており（例えば、Coelhoら、N Engl J Med 2013;369:819-29を参照のこと）、そしてこのようなシステムは、本発明のシステムに適合することができ、適用することができる。静脈内投与される約０．０１～約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量が考えられる。デキサメタゾン、アセトアンピノフェン、ジフェンヒドラミンまたはセチリジン、およびラニチジンなどの、注入関連反応のリスクを低減するための薬物が企図される。５回の用量について４週間毎に約０．３ｍｇ／ｋｇの複数回用量も考えられる。

【0062】

Ｚｈｕら（ＵＳ２０１４０３４８９００）は、マルチポートマニホルドを使用してリポソーム、脂質ディスク、および他の脂質ナノ粒子を調製するための方法を提供し、ここでは、有機溶媒を含む脂質溶液流は水溶液（例えば、緩衝液）の２つ以上の流と混合される。いくつかの態様において、脂質および水溶液の流れの少なくともいくつかは、互いに直接対向するものではない。したがって、この方法は、追加の工程として有機溶媒の希釈を必要としない。いくつかの実施形態では、溶液の１つはまた、活性医薬成分（ＡＰＩ）を含有する可能性がある。本発明は、異なる脂質製剤および異なるペイロードを用いたリポソーム製造の堅牢な方法を提供する。粒子サイズ、形態、および製造スケールは、ポートサイズおよびマニホールドポートの数を変更することによって、ならびに脂質および水溶液の流速または流速を選択することによって制御することができる。

【0063】

参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７０９，８４３号は、組織、細胞、および細胞内区画への治療薬含有粒子の標的化送達のための薬物送達システムを提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマーまたは脂質に結合したポリマーを含む標的粒子を提供する。

【0064】

上記の脂質または脂質様化合物は、適用可能であれば、化合物自体、ならびにそれらの塩および溶媒和物を含む。例えば、塩を、脂質様化合物上のアニオンと正に荷電した族（例えば、アミノ）との間で形成してもよい。適切なアニオンには、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、トシル酸塩、酒石酸塩、フム酸塩、グルタミン酸塩、グルクロン酸塩、乳酸塩、グルタル酸塩、およびマレイン酸塩が含まれる。同様に、塩はまた、脂質様化合物上のカチオンと負に荷電した族（例えば、カルボキシレート）との間で形成することができる。適切なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオンなどのアンモニウムカチオンが挙げられる。脂質様化合物には、第四級窒素原子を含有する塩も含まれる。溶媒和物とは、脂質様化合物と薬学的に許容される溶媒との間に形成される複合体をいう。薬学的に許容される溶媒の実施例としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸、およびエタノールアミンが挙げられる。

【0065】

本発明による送達または投与は、リポソームを用いて行うことができる。リポソームは、内燃水性区画を取り囲む単層または多層脂質二重層と、比較的不透過性の外側親油性リン脂質二重層とから構成される球状小胞構造である。リポソームは生体適合性であり、非毒性であり、親水性および親油性薬物分子の両方を送達し、血漿酵素による分解からそれらの荷物を保護し、そして生物学的膜および血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ってそれらの荷重を輸送し得るので、薬物送達キャリアとしてかなり注目されている（例えば、SpuchおよびNavarro、Journal of Drug Delivery、2011巻、第ID 469679、12頁、2011年、doi:10.1155/2011/469679を参照のこと）。

【0066】

リポソームはいくつかの異なるタイプの脂質から作製することができるが、リン脂質は薬物担体としてリポソームを作製するために最も一般的に使用される。リポソーム形成は、脂質フィルムが水溶液と混合される場合には自発的であるが、ホモジナイザー、ソニケーター、または押出装置を使用することによって、振盪の形態で力を適用することによって促進することができる(例えば、総説のために、SpuchおよびNavarro、Journal of Drug Delivery、2011巻、第ID 469679、12頁、2011年、doi:10.1155/2011/469679を参照のこと)。

【0067】

いくつかの他の添加剤を、リポソームの構造および特性を改変するために、リポソームに添加することができる。例えば、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかをリポソーム混合物に添加して、リポソーム構造の安定化を助け、リポソーム内部積荷の漏出を防ぐことができる。さらに、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリンまたは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、およびリン酸ジセチルから調製され、それらの手段小胞サイズは約５０および１００ｎｍに調整された（例えば、SpuchおよびNavarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679を参照のこと）。

【0068】

リポソーム製剤は、１，２-ジステアリル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリンおよびモノシアロガングリオシドなどの天然リン脂質および脂質から主に構成されてもよい。この製剤はリン脂質のみから構成されるので、リポソーム製剤は多くの課題に遭遇し、その一つは血漿中の不安定性である。これらの課題を克服するために、特に脂質膜の操作において、いくつかの試みがなされてきた。これらの試みの１つは、コレステロールの操作に焦点を当てた。従来の製剤へのコレステロールの添加はカプセル化された生物活性化合物の血漿または１，２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）への迅速な放出を減少させ、安定性を増加させる（例えば、総説については、SpuchおよびNavarro, Journal of Drug Delivery, vol.2011, Article ID 469679,12頁、2011. doi:10.1155/2011/469679を参照のこと)。

【0069】

特異的細胞上の抗原を標的とする特異的標的化ベクターを開発することができる。局所的または全身的な導入の際に、これらのベクターは、循環することができ、そして特定の細胞にホーミングすることができる。特定の細胞および組織を標的とすることは、遺伝子治療用途の安全性を大いに高めるであろう。無関係な細胞または組織の不注意な感染による不適切な発現は、遺伝子治療応用における懸念の１つの原因である。従って、特定の細胞を標的とすることは、有害な副作用の可能性を減少させるであろう。いくつかの実施形態において、そのような標的細胞は、必ずしも限定されないが、肝細胞、リンパ球、血液、血漿、脳脊髄液、膵臓、ネフロン、グリア細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、ニューロン、星状膠細胞、肝細胞、白血球、単球、白血球、白血球、脾臓、血小板、性腺、卵巣、眼、網膜色素上皮、アマクリン細胞、双極細胞、硝子体液、房水、網膜、水晶体を含むことができる。特定の実施形態では、標的細胞は肝細胞である。

【0070】

組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列または遺伝子が、ヌクレオチド配列または遺伝子の発現を可能にするように（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入された場合に宿主細胞内において）、調節エレメントまたは標的化ベクターに連結または複合体化されることを意味することを意図する。

【0071】

いくつかの実施形態では、本発明は、標的化ベクターに作動可能に連結された機能性ＳＳＡＤＨ酵素をコードする遺伝子を含む、ＳＳＡＤＨＤを処置するための組成物を含む。特定の実施形態では、遺伝子は、ＡＬＤＨ５Ａ１であってもよい。ＡＬＤＨ５Ａ１遺伝子は。蛋白質のアルデヒドデヒドロゲナーゼファミリーに属する。この遺伝子は、ミトコンドリアＮＡＤＯＢ依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）をコードする。本明細書の別の箇所に記載されているように、この酵素の欠損は、神経伝達物質ＧＡＢＡの代謝における稀な先天性のエラーである。この欠損に応答して、患者からの生理学的流体は、多数の神経調節特性を有する化合物であるＧＨＢを蓄積する。

【0072】

いくつかの実施形態において、ＡＬＤＨ５Ａ１は実施例に記載されるように、細菌細胞株において産生することができる。いくつかの実施形態において、ＡＬＤＨ５Ａ１は、ＨＥＫ、酵母、およびＣＨＯ細胞を含むが必ずしもこれらに限定されない、多数の細菌および哺乳動物細胞において産生することができる。

【0073】

機能性ＳＳＡＤＨ酵素の存在は、より低いレベルの循環代謝産物をもたらし得る。このような循環代謝産物はＧＨＢおよびＧＡＢＡを含み得るが、必ずしもこれらに限定されない。特定の実施形態において、機能性ＳＳＡＤＨ酵素は、循環ＧＨＢおよびＧＡＢＡのレベルを低下させる。

【0074】

いくつかの実施形態では、組成物は血液脳関門を通過しない。血液脳関門は高度に選択的な半透過性の境界であり、循環血液と脳および中枢神経系の細胞外液を隔てている。血液脳関門は、毛細血管壁の内皮細胞によって形成され、星状細胞の端足は毛細血管を癒合し、周皮細胞は毛細血管基底膜に埋め込まれている。これは、受動拡散による水、いくつかの気体、および脂溶性分子の通過、ならびにニューロン機能に重要なグルコースおよびアミノ酸などの分子の選択的輸送を可能にする。血液脳関門は、血液中の溶質（例えば、細菌）および大分子または親水性分子の脳脊髄液中への拡散を制限し、一方、疎水性分子（酸素、二酸化炭素、ホルモン）および小極性分子の拡散を可能にする。障壁の細胞は、特定の輸送タンパク質を使用して、障壁を横切ってグルコースなどの代謝産物を能動的に輸送する。
処置方法

【0075】

また、それを必要とする対象においてＳＳＡＤＨＤを処置する方法も、本発明の範囲内で想定される。このような方法は、本明細書中に記載される組成物のいずれかの治療有効量を投与することを含み得る。本明細書の他の箇所に記載されるように、「処置する」とは、少なくとも１つの症状または疾患、病理学的状態または障害の重症度を治癒、改善、安定化、予防または軽減することを意味する。

【0076】

特定の実施形態では、対象はＳＳＡＤＨＤを有する。特定の実施形態では、対象が代謝産物の循環レベルを増加させている。用語「高い」、「高い」、「増加」、「上昇」、または「上昇」は例えば、対照と比較して、基礎レベルより上の増加をいい、用語「低」、「低」、「減少」、または「減少」は例えば、対照と比較して、基礎レベルより下の減少をいう。

【0077】

用語「対照」は、試験試料中の発現産物との比較を提供するのに適した任意の標準品のことを言う。一実施形態では、対照は、発現産物レベルが検出され、試験試料からの発現産物レベルと比較される「対照試料」を得ることを含む。そのような対照試料は、既知の結果を有する対照患者からの試料（保存試料または以前の試料測定値であり得る）；正常患者または関心のある条件を有する患者などの対象から単離された正常組織、体液、または細胞を含むが、これらに限定されない、任意の適切な試料を含み得る。

【0078】

「変化量」または「変化量」という用語は、対照試料中の代謝産物またはバイオマーカー核酸の発現レベルまたはコピー数と比較して、代謝産物またはバイオマーカー核酸のコピー数（例えば、生殖細胞系列および／または体細胞）の増加または減少を指し、バイオマーカーの「変化量」という用語は、正常な対照試料中の対応するタンパク質レベルと比較して、試料中のバイオマーカータンパク質のタンパク質レベルの増加または減少も含む。さらに、変化した量のバイオマーカータンパク質は、バイオマーカータンパク質の発現または活性に影響を及ぼし得る、マーカーのメチル化状態などの翻訳後修飾を検出することによって決定することができる。

【0079】

対象における代謝産物またはバイオマーカーの量は、バイオマーカーの量が量を評価するために使用されるアッセイの標準誤差よりも大きい量又は小さい量、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはその量よりも大きいかまたは小さい場合、代謝産物またはバイオマーカーの通常量よりも「有意に」高いかまたは低いものとする。あるいは、対象におけるバイオマーカーの量が、バイオマーカーの正常および／または対照の量よりも少なくとも約２、好ましくは少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上、又は、５％～１００％など任意の範囲において高いか、または低い場合には、正常および／または対照の量より有意に高いか、又は低いとみなすことができる。このような有意な調節値は、本明細書に記載される任意の測定基準（例えば、変化した発現レベル、変化した活性、癌細胞過剰増殖成長の変化、癌細胞死の変化、バイオマーカー阻害の変化、試験薬剤結合の変化など）に適用することができる。

【0080】

マーカーの「変化した発現レベル」という用語は、試験試料（例えば、癌に罹患している被験体に由来するサンプル）におけるマーカーの発現レベルまたはコピー数を指し、これは発現またはコピー数を評価するために使用されるアッセイの標準誤差よりも大きくまたは小さく、そして好ましくは対照試料（例えば、関連する疾患を有さない健常被験体由来のサンプル）におけるマーカーまたは染色体領域の発現レベルまたはコピー数の少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍または１０倍以上であり、そして好ましくはいくつかの対照試料におけるマーカーまたは染色体領域の平均発現レベルまたはコピー数である。変化した発現レベルは発現またはコピー数を評価するために使用されるアッセイの標準誤差よりも大きくまたは小さく、そして好ましくはコントロールサンプル（例えば、関連する疾患を有さない健常対象由来のサンプル）におけるマーカーの発現レベルまたはコピー数の少なくとも２倍、そしてより好ましくは３倍、４倍、５倍または１０倍以上であり、そして好ましくはいくつかのコントロールサンプルにおけるマーカーの平均発現レベルまたはコピー数である。

【0081】

マーカーの「改変された活性」という用語は、正常な対照サンプルにおけるマーカーの活性と比較して、疾患状態（例えば、癌サンプルにおける）において増加または減少するマーカーの活性をいう。マーカーの改変された活性は例えば、マーカーの改変された発現、マーカーの改変されたタンパク質レベル、マーカーの改変された構造、または例えば、マーカーと同じもしくは異なる経路に関与する他のタンパク質との改変された相互作用、または転写活性化もしくは阻害剤との改変された相互作用の結果であり得る。

【0082】

マーカーの量が、量を評価するために使用されるアッセイの標準誤差よりも多い量だけ正常レベルよりもそれぞれ多いか、または少ない場合、そして好ましくはその量の少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍以上、またはそれ以上である場合には、対象における代謝産物またはマーカー、例えば、代謝産物またはマーカーの発現またはコピー数、またはマーカーのタンパク質レベルの「量」は、マーカーの正常量よりも「有意に」高いか、または低い。あるいは、量がマーカーの正常量よりもそれぞれ少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、４倍、または５倍多いか、または少ない場合には、対象におけるマーカーの量は正常量よりも「有意に」多いか、または少ないとみなすことができる。

【0083】

特定の実施形態では、対象は、循環代謝産物のレベルが増加している。このような代謝産物は、アルコール、アミノ酸、ヌクレオチド、抗酸化剤、有機酸、ポリオール、およびビタミンを含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される代謝産物は、ＧＨＢ、ＧＡＢＡ、またはその両方を含むが、必ずしもこれらに限定されない。特定の実施形態において、ＳＳＡＤＨＤ条件を有する対象は、ＧＨＢ、ＧＡＢＡ、またはその両方について正常な循環レベルよりも増加した、または高いレベルを示す。

【0084】

いくつかの実施形態では、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターは例えば、静脈内、皮内、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内、直腸内、動脈内、リンパ管内、髄腔内、気管内、鼻腔内、経口、粘膜、または他の送達方法によって、目的の組織に送達される。送達の方法は、局所的または全身的な処置が所望されるかどうか、および処置されるべき領域に依存し得る。非経口投与は、もし使用される場合には、注射剤は、液体の溶液又は懸濁液としての通常の形態、注射前の液体の溶液または懸濁液に適した固体形態、又はエマルジョンとして、調製することができる。

【0085】

このような送達は、単一用量または複数回用量のいずれかによるものであり得る。当業者は、本明細書中で送達される実際の投薬量が種々の因子（例えば、ベクターの選択、標的細胞、生物、または組織、処置される対象の一般的な条件、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／改変の型など）に依存して大きく変化し得ることを理解する。

【0086】

このような用量は例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容される賦形剤、および／または当技術分野で公知の他の化合物をさらに含有する可能性がある。用量は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩などのような、１つ以上の薬学的に許容される塩をさらに含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲルまたはゲル化材料、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤などの補助物質もまた、ここに存在し得る。さらに、特に剤形が再構成可能な形態である場合には、防腐剤、保湿剤、懸濁化剤、界面活性剤、酸化防止剤、防御剤、充填剤、キレート剤、コーティング剤、化学的安定剤などの１つ以上の他の従来の医薬成分も存在し得る。適切な例示的成分としては、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容される賦形剤の完全な考察は、参照により本明細書に組み込まれるレミントンの薬学的科学（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ．１９９１）に入手可能である。

【0087】

本明細書中の実施形態において、送達はアデノウイルスを介するものであり、これは、少なくとも１×１０⁵粒子（粒子単位、ｐｕとも呼ばれる）のアデノウイルスベクターを含む単一の追加免疫用量であり得る。本明細書の一実施形態では、用量がアデノウイルスベクターの少なくとも約１×１０⁶粒子（例えば、約１×１０⁶～１×１０¹²粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０⁷粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０⁸粒子（例えば、約１×１０⁸～１×１０¹¹粒子または約１×１０⁸～１×１０¹²粒子）、最も好ましくは少なくとも約１×１００粒子（例えば、約１×１０⁹～１×１０¹⁰粒子または約１×１０⁹～１×１０¹²粒子）、さらには少なくとも約１×１０¹⁰粒子（例えば、約１×１０¹⁰～１×１０¹²粒子）であることが好ましい。あるいは、用量が約１×１０¹⁴個以下の粒子、好ましくは約１×１０¹³個以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０¹²個以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０¹¹個以下の粒子、最も好ましくは約１×１０¹⁰個以下の粒子（例えば、約１×１０⁹個以下の粒子）を含む。したがって、用量は例えば、約１×１０⁶粒子単位（ｐｕ）、約２×１０⁶ｐｕ、約４×１０⁶ｐｕ、約１×１０⁷ｐｕ、約２×１０⁷ｐｕ、約４×１０⁷ｐｕ、約１×１０⁸ｐｕ、約２×１０⁸ｐｕ、約４×１０⁸ｐｕ、約１×１０⁹ｐｕ、約２×１０⁹ｐｕ、約４×１０⁹ｐｕ、約１×１０¹⁰ｐｕ、約２×１０¹⁰ｐｕ、約４×１０¹⁰ｐｕ、約１×１０¹¹ｐｕ、約２×１０¹¹ｐｕ、約４×１０¹¹ｐｕ、約１×１０¹²ｐｕ、約２×１０¹²ｐｕ、または約４×１０¹² ｐｕのアデノウイルスベクターを含む単回用量のアデノウイルスベクターを含み得る。例えば、米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号（Ｎａｂｅｌら、２０１３年６月４日付；本明細書中に参考として援用される）中のアデノウイルスベクター、およびその２９欄３６～５８行目の投薬量を参照のこと。本明細書中の実施形態において、アデノウイルスは、複数回用量を介して送達される。

【0088】

本明細書の一実施形態では、送達はＡＡＶを介する。ＡＡＶのヒトへのインビボ送達のための治療的に有効な用量は、約１×１０¹⁰～約１×１０¹⁰機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する約２０～約５０ｍｌの生理食塩水溶液の範囲であると考えられる。投薬量は、任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるように調節され得る。本明細書の一実施形態では、ＡＡＶ用量が一般に、約１×１０⁵～１×１０⁵⁰ゲノムＡＡＶ、約１×１０⁸～１×１０²⁰ゲノムＡＡＶ、約１×１０¹⁰～約１×１０¹⁶ゲノム、または約１×１０¹¹～約１×１０¹⁶ゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒトの用量は、約１×１０¹³ゲノムのＡＡＶであり得る。このような濃度は、約０．００１ｍｌ～約１００ｍｌ、約０．０５ｍｌ～約５０ｍｌ、または約１０ｍｌ～約２５ｍｌのキャリア溶液で送達され得る。他の有効な投薬量は、用量応答曲線を確立する日常的な試験を通して、当業者によって容易に確立することができる。例えば、米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号（Ｈａｊｊａｒら、２０１３年３月２６日付、第２７欄、４５～６０行）を参照のこと。

【0089】

本明細書の一実施形態では、送達はプラスミドを介する。このようなプラスミド組成物において、投薬量は、応答を誘発するために十分な量のプラスミドであるべきである。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの適切な量は、約０．１～約２ｍｇ、または個体７０ｋｇあたり約１μｇ～約１０μｇであり得る。

【0090】

本明細書中の用量は、平均７０ｋｇの個体に基づく。投与回数は医師または獣医師（例えば、医師、獣医師）、または当業者の範囲内である。実験に使用されるマウスは典型的には約２０ｇであり、マウス実験から７０ｋｇまでの個体をスケールアップすることができることにも留意されたい。

【0091】

本明細書中に提供される組成物に使用される投薬量は、反復投与または反復投薬のための投薬量を含む。特定の実施形態では、投与が数週間、数ヶ月、または数年の期間内に繰り返される。最適な投薬計画を得るために、適切なアッセイを行うことができる。反復投与はより低い投薬量の使用を可能にし得、これはオフターゲット改良に積極的に影響しうる。

【0092】

本明細書で提供される化合物、組成物、または薬物の「有効量」または「治療有効量」という用語は非毒性であるが、所望の結果を提供するのに十分な量の組成物を意味する。必要とされる正確な量は対象の種、年齢、および一般状態、処置される疾患の重症度、使用される特定の組成物、その投与様式などに応じて、対象ごとに異なる。したがって、「有効量」を特定し、正確に「有効量」を特定することは不可能である しかし、適切な有効量は、日常的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。

【0093】

いくつかの実施形態において、治療有効量は、１日当たり１ｋｇ体重当たり１～１０，０００μｇの範囲の機能性ＳＳＡＤＨ酵素を含む。いくつかの実施形態では、組成物は週１回、週２回、または月１回投与されてもよい。

【0094】

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の標的化ベクターに機能性に連結された機能性ＳＳＡＤＨ酵素をコードする遺伝子、および１つ以上のｍＴＯＲ阻害剤、ＧＡＢＡ－Ｔ阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＳＳＡＤＨＤを処置する方法を含む。

【0095】

ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物の標的）は、プロテインキナーゼのホスファチジルイノシトール３－キナーゼ関連キナーゼファミリーのメンバーであるキナーゼである。ｍＴＯＲは他のタンパク質と結合し、２つの異なるタンパク質複合体、ｍＴＯＲ複合体１とｍＴＯＲ複合体２のコア成分として働き、これらは異なる細胞過程を調節する。特に、両複合体のコア成分として、ｍＴＯＲは細胞増殖、細胞増殖、細胞運動、細胞生存、蛋白質合成、オートファジー、転写を調節するセリン／トレオニン蛋白質キナーゼとして機能する。ｍＴＯＲ阻害薬は、ｍＴＯＲキナーゼを阻害する薬物の一種である。

【0096】

用語「阻害する」または「ダウンレギュレートする」は、例えば、特定の作用、機能、または相互作用の減少、制限、または遮断を含む。タンパク質の機能のような生物学的機能は、野生型状態のような制御のような基準状態と比較して減少すれば阻害される。このような阻害または欠損は例えば、特定の時間および／または場所での薬剤の適用によって誘導され得るか、または、例えば、遺伝性突然変異によって構成的であり得る。このような阻害または欠損はまた、部分的または完全であり得る（例えば、野生型状態のようなコントロールのような参照状態と比較して、本質的に測定可能な活性がない）。本質的に完全な阻害または欠乏は、ブロックされたと呼ばれる。用語「促進する」または「アップレギュレートする」は、反対の意味を有する。

【0097】

例示的なｍＴＯＲ阻害剤には、ラパログとして知られる薬物のクラスが含まれるが、必ずしもこれに限定されない。ラパログには、ラパマイシン、ならびにシロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびリダフォロリムスなどのその類似体が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。特定の実施形態では、好ましいラパログはラパマイシンである。

【0098】

他の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤がトリン１およびトリン２を含み得る。

【0099】

ＧＡＢＡ－Ｔ（ＧＡＢＡトランスアミナーゼ）は、ＧＡＢＡを代謝・分解する酵素である。ＧＡＢＡ－Ｔ阻害薬はＧＡＢＡ－Ｔに作用し、その機能を阻害する酵素阻害薬である。ＧＡＢＡ－Ｔ抑制剤の実施例としては必ずしも限定されないが、バルプロ酸、ビガバトリン、フェニレンチリデンヒドラジン、エタノールアミン－Ｏ－スルファート（ＥＯＳ）、およびＬ－シクロセリンが挙げられる。特定の実施形態では、好ましいＧＡＢＡ-Ｔ阻害剤はビガバトリンである。

【0100】

特定の実施形態において、併用療法は、標的化ベクターに作動可能に連結された機能性ＳＳＡＤＨ酵素をコードする遺伝子、トリン２、およびビガバトリンを含む組成物の治療有効量の投与を含み得る。

【0101】

いくつかの実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤および／またはＧＡＢＡ-Ｔ阻害剤は、１日あたり体重１ｋｇあたり１～２５μｇの範囲の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤および／またはＧＡＢＡ-Ｔ阻害剤は、１日２回投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤および／またはＧＡＢＡ-Ｔ阻害剤は、１日３回投与されてもよい。

【0102】

他の実施形態では、本発明は、治療有効量のＮａ－Ｋ－Ｃｌ共輸送体１（ＮＫＣＣ１）阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてＳＳＡＤＨＤを処置する方法を含む。

【0103】

ＮＫＣＣタンパク質は、ナトリウム、カリウム、塩化物イオンを細胞膜を越えて輸送する膜輸送タンパク質である。各溶質を同じ方向に移動させるため、ＮＫＣＣタンパク質は共輸送体（symporters）と見なされる。それらは、２つの正に帯電した溶質（ナトリウムおよびカリウム）を、負に帯電した溶質（塩化物）の２つの部分と一緒に移動させることによって、電気中性を維持する。ＮＫＣＣ１は、人体全体、特に外分泌腺と呼ばれる体液を分泌する臓器に広く分布している。

【0104】

ＮＫＣＣ１は、発達初期には脳の多くの領域でも発現しているが、成人期には発現しない。ＮＫＣＣ１の存在のこの変化は、神経伝達物質ＧＡＢＡおよびグリシンに対する反応を興奮性から抑制性に変化させる原因であると思われ、これは初期の神経の発生のために重要であることが示唆される。ＮＫＣＣ１トランスポーターが主に活性である限り、ニューロンの内部塩化物濃度は、成熟した塩化物濃度と比較して上昇する。これは、それぞれのリガンドゲートアニオンチャネルが塩化物にとって透過性であるため、ＧＡＢＡおよびグリシン応答にとって重要である。より高い内部塩化物濃度では、このイオンのための外向きの駆動力が増加し、したがって、チャネルの開放は細胞を離れる塩化物につながり、それによって、それを脱分極させる。発生の後半では、ＮＫＣＣ１の発現が減少し、ＫＣＣ２ Ｋ－Ｃｌ共輸送体の発現が増加するため、ニューロンの内部塩化物濃度が成人の値まで低下する。

【0105】

実施例３に記載のように、ＳＳＡＤＨＤ患者に現れる出生後発作は、ＮＫＣＣ１の過剰発現によって引き起こされる可能性がある。したがって、ＮＫＣＣ１の阻害は、ＳＳＡＤＨＤにおいて正の治療効果を有する可能性がある。いくつかの実施形態において、ＳＳＡＤＨＤは、治療有効量のＮＫＣＣ１阻害剤をそれを必要とする対象に投与することによって処置され得る。

【0106】

適切なＮＫＣＣ１阻害剤としては、ブメタニド、アロプレグナノロン、プレグナノロン、プロゲステロン、ガボクサドール、エチフォキシン、ＸＢＤ－１７３、ＦＧ－７１４２、ガバジン、イソニアジド、エンセニクリン、およびＡＶＬ－３２８８が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＮＫＣＣ１阻害剤はブメタニドである。

【0107】

本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載される。
実施例
実施例１－ＮＣＳ-３８２、ＳＳＡＤＨＤのための潜在的な新規治療剤
薬理学的及び構造的考察

【0108】

ＮＣＳ-３８２は、ＧＨＢのそれよりも１４倍低いＫｉを有する推定ＧＨＢ受容体（ＧＨＢＲ）アンタゴニストであり（図１）（Maitre Prog Neurobiol 51:337-361(1997); Vogensenら、J Med Chem 56:8201-8205(2013)）、そしてその分子構造が未定義のままであるＧＨＢＲの唯一の公知のアンタゴニストである（Bayら、Biochem Pharmacol 87:220-228(2014)）。ＮＣＳ-３８２は、早期致死からのａｌｄｈ５ａ１-／－マウスの救済、およびＧＨＢプロドラッグ、γ-ブチロラクトン（ＧＢＬ）によって誘導される運動欠損の遮断に有効であった（Ainslieら、Pharmacol Res Perspect 4:e00265(2016); Guptaら、J Pharmacol Exp Ther 302:180-187(2002)）。ＮＣＳ－３８２は、ラセミ混合物として存在する（ヒドロキシル炭素；図１）。Ｒ-異性体はラセミ混合物の２倍強力であり、Ｓ-エナンチオマーより１３倍強力である（Castelliら、CNS Drug Rev 10:243-260(2004)）。後述する出願人による最初の試験に先立ち、ＮＣＳ－３８２の非臨床薬物動態／毒性学的解析（臨床介入に先立つ必須の検討事項）は報告されていなかった。
ＮＣＳ－３８２の薬物動態と毒性学、および有効性

【0109】

ＮＣＳ-３８２の薬力学的特性に関する限定された以前の研究は、ヒヒおよびハトにおいて実施され、そしてＧＨＢの中心的効果を調べるためにＧＨＢＲに対するアンタゴニスト特異性を利用するように設計された（Quangら、Life Sci 71:771-778(2002); Castelliら、J Neurochem 87:722-732(2003); Castelliら、CNS Drug Rev 10:243-260(2004)）。出願人らはＣ５７／Ｂ６マウスにおけるＮＣＳ-３８２（１００～５００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与後に詳細な薬物動態測定を得た（Ainslieら、Pharmacol Res Perspect 4:e00265(2016)）。ＮＣＳ－３８２の血漿中消失ｔ１／２は用量依存的に０．２５～０．６８時間の範囲であった。ＮＣＳ－３８２の脳内滞留時間は長く、ｔ１／２は０．７６～０．９７時間であり、投与量の増加に伴い減少した。濃度‐時間曲線下面積（ＡＵＣ）に基づく脳対血漿比は０．７２～１．８の範囲であった。投与量の増加に伴い脳内ｔ１／２が減少する傾向は中枢のＧＨＢ結合部位の飽和を反映しており、全身循環に戻るためにより多くの非結合型ＮＣＳ－３８２を残している可能性がある。尿中に回収された全ＮＣＳ－３８２投与量の割合は低く（＜４％）、糞中には検出されず（＜１５０ｎｇ／ｍｇ糞）、ヒドロキシル部分でのグルクロン酸化（主生成物）および脱水素（副生成物）を特徴とする主要な消失経路として代謝が示唆された（図１）。ＮＡＤＰＨ存在下でのＮＣＳ‐３８２（Ｃｌｉｎｔ）の固有クリアランスは、マウスおよびヒト肝ミクロソーム（ＭＬＭ，ＨＬＭ）において、それぞれ０．５８７および０．５１３ｍＬ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質であった。計算されたマウスおよびヒトの肝クリアランスは、それぞれ５．２および１．２Ｌ／ｈ／ｋｇ体重であった。脱水素のためのＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数（Ｋｍ）は、マウスおよびヒトでそれぞれ２９．５±１０および１２．７±４．９μＭであった。グルクロニド形成は、両方の種において１００μＭまで線状であった。ＵＧＴ２Ｂ７（ｕｒｉｄｉｎｅ ５’－ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ； ＵＤＰ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２Ｂ７）はＵＧＴ２Ｂ７阻害剤であるｄｉｃｌｏｆｅｎａｃとの競合研究（Ainslie et al. Pharmacol Res Perspect 4:e00265(2016)）に基づき、ＮＣＳ－３８２代謝を担うグルクロン酸抱合酵素の主要アイソフォームとして推定された。ジクロフェナク（２５ｍｇ／ｋｇ）の同時投与は、ＧＢＬで処置した動物における鎮静および運動効果を遮断するために、ＮＣＳ‐３８２（３００ｍｇ／ｋｇ）の効力を改善した。ＮＣＳ－３８２およびジクロフェナクのグルクロニドの血漿中濃度は、いずれかの薬剤を単独投与したマウスと比較して、併用投与で低下した。

【0110】

また、ＮＣＳ－３８２の生体変換において活性のある薬物代謝酵素の同定も報告されておらず、また、薬物の代謝に関与する典型的な酵素、すなわちチトクロムＰ４５０ｓ（ＣＹＰ）を阻害するＮＣＳ－３８２の能力もない。したがって、出願人は７つのＣＹＰアイソフォーム（ＣＹＰ Ｉ Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６および３Ａ４）によって触媒される反応において、ＨＬＭおよびＦＤＡ推奨プローブ基質を使用した（Vogelら、Toxicol In Vitro 40:196-202(2017)）。ＮＣＳ-３８２は、最高試験用量（３０μＭ）では試験酵素のいずれも阻害しなかった。さらに、ＮＣＳ‐３８２は、超生理的用量（５００μＭまで）で、薬物の生体内変換および輸送に関与する核内受容体（アリール炭化水素、構成的アンドロスタン、およびプレグナンＸ受容体）を誘導する最小能力を発現した。まとめると、これらの知見は、ＣＹＰ Ｐ４５０媒介薬物‐薬物相互作用が低リスクであることを示す。

【0111】

続いて、ＨｅｐＧ２細胞を用いて、１ｍＭまでのＮＣＳ-３８２の細胞毒性を試験した。細胞の完全性、生存、およびオルガネラ機能を評価する複数のバイオマーカーはＮＣＳ-３８２細胞毒性についてほとんど証拠を示さなかった（Vogelら、Toxicol In Vitro 40:196-202(2017)）。ＨｅｐＧ２細胞におけるＮＣＳ－３８２を用いた遺伝子発現研究では、調節不全を示す少数の遺伝子（試験した３７０個のうち）のみが明らかになった（表１）。さらに、高用量ＮＣＳ－３８２は、ａｌｄｈ５ａ１－／－マウス（例えば、ａｌｄｈ５ａＪ－／ＮＳＣ）由来の神経幹細胞（ＮＳＣ、または神経前駆細胞）において最小限の薬理毒性しか示さなかった（Vogelら、Toxicol In Vitro 46:203-212(2017)）。これらの細胞はＳＳＡＤＨＤのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして開発され、培地中のＧＨＢ含量の増加、酸化ストレスのバイオマーカーの増強、およびミトコンドリア数の増加を示し、ＳＳＡＤＨＤの治療を評価するための有用な前臨床スクリーニングツールとしてのＮＳＣの有用性を強調した（Vogelら、PLoS One 12(10):e0186919(2017)）。以上をまとめると、多くの追加試験が必要であるが、パイロット薬物動態／安全性／毒性学的評価は、ＳＳＡＤＨＤにおけるＮＣＳ－３８２の臨床応用の可能性を支持している。

【表1】

ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおけるＮＣＳ－３８２の前臨床効果

【0112】

出願人は、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＣＳ-３８２の輸送に注目した。ここでの目的は、ＮＣＳ－３８２がＧＨＢの取り込みを遮断する可能性を調べることであった。本出願人らはＮＣＳ－３８２が能動的に輸送され、ＧＨＢ輸送を阻害することができることをＭａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を用いて初めて実証した（Vogelら、Toxicol In Vitro 46:203-212(2017)）。ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験によるこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に続いて、出願人は、脳／肝臓ＧＨＢの比が逆説的に見えるＮＣＳ－３８２の慢性投与（３００ｍｇ／ｋｇ；７日連続）によって影響されないことを見出した。この知見は、ＮＣＳ－３８２の将来の適用の可能性が脳のＧＨＢレベルが慢性治療で修飾されないように見えるため、わずかに有益であるに過ぎない可能性を示唆している。出願人は、ＮＣＳ投与マウスの皮質領域を調べ、神経伝達物質輸送に関与する多くの溶質担体の発現を評価した。図２に示すように、出願人らは、処置の非存在下で、ａｌｄｈ５ａ１-／皮質において、これらの輸送体の本質的に全てがダウンレギュレートされることを見出した。ＮＣＳ‐３８２は、グルタミン酸とＧＡＢＡトランスポーターの両方を含むこれらのキャリアの７つの異常発現を正常化し、６つには影響を及ぼさず、実際にグルタミン酸‐シスチン対向輸送体の有意なダウンレギュレーションを誘導した。この所見は、この動物モデルにおけるグルタチオンの有意な枯渇、グルタチオンがグルタミン酸、システイン及びグリシンから構成されるという観察、並びにグルタミン酸／グルタミン濃度がａｌｄｈ５ａ１－／－脳で異常であるという初期の所見（Gupta, J Pharmacol Exp Ther 302:180-187(2004); Chowdhury, (2007)）を考慮すると興味深い。これらの結果は、ＳＳＡＤＨＤにおけるＮＣＳ－３８２の使用に対するわずかな前臨床的支持を提供する。ＮＣＳ－３８２を用いて、寿命、体重および神経行動学的転帰を評価し、慢性および急性投与パラダイムの両方を使用して、ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおけるさらなるｉｎ ｖｉｖｏ研究が進行中である。
実施例２－ＳＳＡＤＨＤに対する酵素補充療法

【0113】

治療アプローチとして、有機性皮膚症では実現可能であるはずであるが、リソソーム貯留障害において、エンザイム置換療法（ＥＲＴ）が注目を集めている(Darvish-Damavandi et al. Mol Genet Metab Rep 8:51-60(2016))。出願人は、大腸菌においてアンピシリン耐性を伴うＧＳＴ－ｈＳＳＡＤＨ融合タンパク質を過剰発現するＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）標識ヒトＡＬＤＨ５Ａ１遺伝子構築物を用いて、ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおけるＥＲＴの実現可能性を検討した（DNASU Plasmid Repository; Ramachandranら(2004)）。トランスフェクトし、アンピシリンを補充した標準ＬＢブロス中で３７℃で一晩増殖させたＥ．ｃｏｌｉの粗抽出物を回収し、ペレット化し、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（プロテアーゼインヒビター； Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ ＵＳＡ）およびリゾチームで溶解した。大腸菌の粗溶解物中に存在するＧＳＴ-ｈＳＳＡＤＨを、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＧＳＴスピン精製キットを使用して精製し、続いて透析し、続いてポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）カラムを使用して濃縮した。得られたタンパク質含量を、標準的なＢＣＡタンパク質アッセイを用いて定量した。ＧＳＴ標識酵素活性をトロンビンで切断し、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ対に基づく分光蛍光光度法を用いてＡＬＤＨ５Ａ１の活性を決定した（Gibsonら、Clin Chim Acta 196:219-221(1991)）。

【0114】

細菌産生ＡＬＤＨ５Ａ１を用いたＥＲＴの実現可能性を、その後、ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスで評価した。エンドポイントとして、出願人は早期致死（生後日（ＤＯＬ）２１～２３；エンドポイント、ＤＯＬ ３０（これは非常に有意な生存））からのこのモデルのレスキューを使用し、後者のエンドポイントは治療タンパク質の限られた利用可能性の観点から選択された。精製ＡＬＤＨ５Ａｌを生後１０日目から投与した（ｉ．ｐ、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇ，ｑ．ｄ．）。ビヒクル治療したａｌｄｈ５ａ１－／－マウスの生存期間中央値は、２２日（８０％の生存率（５匹中４匹）に匹敵する）から、ＥＲＴ治療ありでは３０日であった（Ｌｏｇｒａｎｋ； ｐ０．０４；図３（ｉｎｓｅｔ））。脳、肝臓および血清を、ＤＯＬ３０で採取した生存ＥＲＴ処置対象から収集した。ＧＡＢＡ受容体遺伝子の発現は、ＥＲＴ（ＤＯＬ ３０）と未処理（ＤＯＬ ２１）ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスの間で対比され、ＤＯＬ ２１ ａｌｄｈ５ａ１＋／＋マウスへのデータ正常化であった。いくつかのＧＡＢＡＡ受容体サブユニット（主にγ、イプシロンおよびθ）の発現は、酵素介入によりａｌｄｈ５ａ１－／－マウスで有意に補正された（図３）。出願人らは非経口的に投与されたＳＳＡＤＨが血液および他の組織中の代謝産物（ＧＨＢ、ＧＡＢＡ）を低下させると仮定したので、これらの中間体はＬＣ／ＭＳ-ＭＳを使用して、偽および酵素処置された被験体において定量した（図４）（Gibsonら、Biomed Environ Mass Spectrom 19:89-93(1990); Kokら、J Inherit Metab Dis 16:508-512(1993)）。その数は少なかったが、出願人は酵素投与動物の脳におけるＧＨＢの有意な補正、および血液中のＧＡＢＡレベルの改善傾向を見出した。この有望な試験は、生化学的測定の検出力が十分ではなく、より大きなｎ値を用いたより広範な評価が必要である。特に、出願人は血液および器官におけるＳＳＡＤＨ活性のレベルを評価し、そしてＰＥＧ化は、タンパク質ｔ１／２を増加させ、そして免疫原性を減少させるために利用してもよい（Bellら、PLOS ONE 12:e0173269(2017)）。
実施例３-過ＧＡＢＡ作動性障害であるＳＳＡＤＨＤにおける発作の逆説

【0115】

哺乳類の脳のＧＡＢＡＡ受容体を通る塩化物の方向性フラックスは、膜貫通塩化物勾配によって調節される。これは、主に２つのトランスポーター、塩化ナトリウム－カリウム共輸送体（ＮＫＣＣ１）と塩化カリウム共輸送体（ＫＣＣ２）によって制御される（図５Ａ）（Kilb Neuroscientist 18:613-630(2012)）。ＮＫＣＣ１の活性が増加し、細胞内塩化物濃度が上昇すると、ＧＡＢＡＡ受容体が活性化され、塩化物流出、原形質膜脱分極、逆説的な神経伝達活性化が起こる。このような状況は胎児の脳で観察されるが、ＧＡＢＡＡ受容体の活性化が一貫して塩素の細胞への取り込みの増加、過分極および神経伝達の阻害につながると、出生後には逆転する。出願人は、ＳＳＡＤＨＤでは、出生後の発作は、ＮＫＣＣ１の過剰発現と、出生後のＧＡＢＡＡ受容体の継続的な興奮性能力によって引き起こされると仮定した。もしこれが確認されれば、この機構は過剰ＧＡＢＡ作動性状態における発作のパラドックスを説明するのでろう（Vogelら、Pediatr Neurol 66:44-52.e1(2017)）。さらに、ＮＫＣＣ１の阻害がＳＳＡＤＨＤに正の治療効果をもたらす可能性があることも示唆される。これらの仮説を支持して、出願人は、ＮＫＣＣ１がａｌｄｈ５ａ１－／－脳で高度に過剰発現していることを発見した（図５Ｂ）。塩化物イオンを細胞外に輸送するＫＣＣ２の発現も増加したが、ＮＫＣＣ１よりも有意に低かった（図５Ｂ）。従って、ＮＫＣＣ１とＫＣＣ２の比率が大幅に増加し、細胞内塩化物濃度がａｌｄｈ５ａ１－／－の脳で増加する可能性があることが示唆され、ＧＡＢＡＡ受容体の主な役割としての脱分極および興奮性活性を支持している。これは、パッチクランプ法によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経生理学的評価、または多分、塩化物イオンプローブによる２光子測定を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの評価を用いて定量的に評価されるべきものである。

【0116】

次に、ＳＳＡＤＨＤにおけるＮＫＣＣ１阻害の潜在的な治療的役割を検討した。この文脈において、出願人は、ＮＫＣＣ１の発現が増加しているため、ＳＳＡＤＨＤにおけるＮＫＣＣ１阻害剤の鎮静活性に対する耐性があると仮定した。出願人はａｌｄｈ５ａ１＋／＋及びａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにブメタニド（２５及び１００ｍｇ／ｋｇ体重）の急性ｉ．ｐ．用量を、発作活性のビデオ記録並びに固定化までの時間の評価と共に、急性ｉ．ｐ．投与した。ブメタニドは、元々浮腫に対して承認されたＮＫＣＣ１と２の両方の既知の阻害剤であるが、脳への浸透が不十分であるにもかかわらず、いくつかの神経／てんかん障害において抗てんかん効果が実証されている(Levy et al .Curr Emerg Hosp Med Rep 1(2) doi:10.1007/s40138-013-0012-8. (2013); Oliveros et al. Pediatr Crit Care Med 12:210-214(2011); Rahmanzadehら。Schizophr Res 184:145-146(2016); Clearyら、PLOS ONE 8:e57148(2013)。出願人は、発作活動(http://www.noldus.com/animal-behavior-research)を評価するために、ノルダス(Noldus)技術によって開発されたルブリック(rublic)と共に、動物行動を記録するためのピンナクル（Pinnacle）技術(https://www.pinnaclet.com)技術を使用した。出願人の設計は、連続して４０分間について５分間のエポックで全身性強直間代発作を定量化することであった。２０分の時点で、ブメタニド（２５または１００ｍｇ／ｋｇ）の単一腹腔内投与を行い、動物をオープンフィールド設定に戻した。２５ｍｇ／ｋｇのブメタニドの用量は、ａｌｄｈ５ａ１＋／＋またはａｌｄｈ５ａ１－／－マウスのいずれに対しても、４０分間の記録期間中に不動化を誘発しなかった。逆に、１００ｍｇ／ｋｇは、不動化の迅速な誘導をもたらした（図５Ｃ）。しかし、興味深いことに、ａｌｄｈ５ａ１－／－はＤＯＬ ２０および２４の両方において、ブメタニドの効果に対して有意に耐性が高く、この抵抗はより古いａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおいて約３倍大きいことが観察された。また、突然変異マウスでは、ブメタニド注射から不動化開始までの時間において、発作活性は認められず、おおよそ３～８分の時間であった。同様に、低い用量のブメタニド（２５ｍｇ／ｋｇ）も鎮静なしでａｌｄｈ５ａ１－／－マウスの発作活性を低下させた（データは示していない）。これらの予備データは、ブメタニドの鎮静効果に対するａｌｄｈ５ａ１－／－マウスの耐性が、ＮＫＣＣ１活性の増加と塩化物勾配の破壊に続発することを示唆しており、ＮＫＣＣ１の操作と細胞内塩化物恒常性の回復がＳＳＡＤＨＤの潜在的に魅力的な治療標的であることを示唆している。
実施例４－ＧＡＢＡとｍＴＯＲ：ＳＳＡＤＨＤにおける処置戦略と病態生理学的洞察
ＳＳＡＤＨＤの治療標的であるｍＴＯＲの阻害

【0117】

ミトコンドリア数の増加（オルガネラの大きさと総数の両方を含む）は、錐体海馬ニューロンのａｌｄｈ５ａ１－／－マウスで最初に立証された（Nylenら、2009）。その後、Ｌａｋｈａｎｉら（EMBO Mol Med 6:551-566(2014)）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＧＡＢＡレベルの上昇がｍＴＯＲ（ラパマイシンの分子標的）の活性化をもたらし、ミトコンドリア数の上昇および酸化ストレスの増強として現れることを明らかにした。この同じ研究者グループはさらに、ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスに由来する脳および肝臓のミトコンドリア数が増加し、酸化ストレスの増強と関連しており、その全てがｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンによって正常化され得ることを立証した。

【0118】

これらの研究は、ｍＴＯＲ阻害薬（ラパマイシン、テムシロリムス）、ｄｕａｌ ｍＴＯＲＣ１／２およびＰＩ３Ｋ阻害薬、ならびにｍＴＯＲ非依存性オートファジー誘導薬（Vogelら、J Inherit Metab Dis 39:877-886(2016); Fig. 6）を用いたａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおけるさらなる前臨床介入研究の起源であった。ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスの寿命延長（早期致死からのレスキュー）が、多数のｍＴＯＲ特異的および二重阻害剤にわたって観察され、二重阻害剤ＸＬ７６５およびＴｏｒｉｎ２による所見は著しかった。ＸＬ７６５は、ａｌｄｈ５ａ１-／－マウスにおいて、ＤＯＬ ５０で屠殺するまで３５日間にわたり軽度の体重改善を誘導した（Vogelら、J Inherit Metab Dis 39:877-886(2016)）。逆に、オートファジーのｍＴＯＲ非依存性誘導因子は、早期致死の軽減に有益ではなかった。これらのデータはｍＴＯＲ非依存性機構を介したオートファジーの誘導が救済には不十分であることを示唆し、ｍＴＯＲに関連する他の機能がａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおけるｍＴＯＲ遮断の臨床的有効性に関与している可能性を示唆している。

【0119】

漸増用量パラダイムでＤＯＬ１０から開始したａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおけるトリン２投与による研究を、３チャンネル記録心電図法（ピナクル技術；https://www.pinnaclet.com/eeg-emg-systerns.html）および電極移植ａｌｄｈ５ａ１＋／＋およびａｌｄｈ５ａ１－／－マウス）を用いて発作について評価した。ＥＥＧは、発作頻度（発作の全数）、および全発作時間（発作に費やされた累積時間）について、半自動検出（Neuroscore, Data Sciences International,St.Paul,MN）を用いてオフラインでスコア化した；ここでは発作イベントがＥＥＧ上の持続時間≧３秒の連続スパイクのランと定義した。自動的に検出された事象を目視検査によって検証した（Dhamneら、Mol Autism 8:26(2017)）。本発明者らの予測は、Ｔｏｒｉｎ２投与が両方のパラメーターの向上をもたらすことであった。出願人らは、トリン２がａｌｄｈ５ａ１-／-マウスにおける発作頻度を減少させるのに効果がないことを見出し（表２）、予想外にも、それが全発作時間を有意に延長することを見出した（表２）。トリン２が多数のＧＡＢＡ（Ａ）作動性受容体サブユニットを補正（アップレギュレート）することは興味深い（Vogel et al. J Inherit Metab Dis 39:877-886(2016)）。これらの受容体が未成熟なままであれば、ブメタニドに関する我々の仮説（前述参照）と一致して、それらのその後のアップレギュレーションは申請者が観察したように、脱分極を悪化させ、したがって、累積てんかんアウトバースト期間を増強する可能性が考えられる（表２）。他方、ｍＴＯＲ阻害剤がてんかんにおいて起こり、反復興奮性回路の形成につながり得るシナプス再編成の形態であるモッシー線維の発芽を妨げるという証拠が提供された（Dudekら、2017）。どの機構がトリン２による発作活性の増強を説明するかについては研究中である。

【表2】

データは、平均±ＳＥＭとして示した。発作事象にはスパイク列、おそらくミオクローヌス、欠神発作および強直間代発作が含まれていた。
実施例４－将来の方向性
ビガバトリン処置およびａｌｄｈ５ａ１１－／－マウスを用いてｍＴＯＲ役割を解剖する。

【0120】

ビガバトリン（ＶＧＢ）処理マウスは、ＶＧＢが、ＧＡＢＡ代謝のこの最初の酵素を不可逆的に阻害するため、薬物誘発型ＧＡＢＡトランスアミナーゼ欠損症である（図１）。ＶＧＢを使用すると、ＣＮＳにおける有意に上昇したＧＡＢＡは、比較的低い１日用量（～１０ｍｇ／ｋｇ）で、または較正された浸透圧ミニポンプを用いた慢性皮下送達によって、達成することができる（Vogelら、J Inherit Metab Dis 39:877-886(2016); Vogelら)。Toxicol In Vitro 40:196-202(2017)）。これらの「モデル」間の主な相違点は、ＶＧＢ処理マウスにおいてＧＨＢが上昇していないことにある。このことはＧＡＢＡの役割とｍＴＯＲに対するその効果をより明確に単離することを可能にする。出願人らは、これらの異なるモデルにおける遺伝子発現を使用して、この局面を探求し始めた。

【0121】

ｍＴＯＲは、増殖と異化（すなわち、翻訳、オートファジー）を制御するのに役立つ多数の細胞内生体エネルギー的手がかりを調整する（図６）。多数の遺伝子発現変化が、２つの動物モデル間で相関した。Ｐｒｋａｇ１は両方のモデルの脳においてダウンレギュレートされた（Vogelら、Toxicol In Vitro 40:196-202(2017);Vogelら、Pediater Neurol 66:44-52.e1. (2017)）。Ｐｒｋａｇ１は、ヘテロ三量体アンペア活性化プロテインキナーゼ（アンペアＫ）のγ調節サブユニットであり、α触媒サブユニットと非触媒βサブユニットも含む（図６）。ＡＭＰＫは、細胞エネルギー状態をモニターする重要なエネルギー感知酵素である。細胞の代謝ストレスに応答して、ＡＭＰＫは活性化され、従って、脂肪酸およびコレステロールのｄｅ ｎｏｖｏ生合成の調節に関与する鍵酵素であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）および３‐ヒドロキシ３‐メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）をリン酸化し、不活性化する。ＡＭＰＫは、代謝酵素の直接的リン酸化を介して作用し、転写調節因子のリン酸化を介して長期的に作用する。低エネルギー条件の間、ＡＭＰＫは、ｍＴＯＲ活性化の重要な陰性エフェクターである。

【0122】

また、Ｐｒｋａｇ２はａｌｄｈ５ａ１－／－の脳でダウンレギュレートされた（そしてＶＧＢ処理マウス眼でダウンレギュレートされた）。Ｐｒｋａｇ１および２の発現低下はｍＴＯＲ阻害剤Ｔｏｒｉｎ １により正常化し、ＡＭＰＫ活性化物質（ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスでダウンレギュレート）、Ｓｔｋ１１の補正はＴｏｒｉｎ２により正常化した。同様に、ＡＭＰＫの下流のシグナル伝達系であるＴｓｃ１および２も、ａｌｄｈ５ａ１－／－のマウス脳において、より低い発現を示し、これはＴｏｒｉｎ１およびＴｏｒｉｎ２によって正常化された。Ｒａｇ ＧＴＰａｓｅは、そのアミノ酸感知経路を介してｍＴＯＲを活性化し、ＲａｇＢ／ＲａｇＤ発現は、ａｌｄｈ５ａ１－／－の脳でアップレギュレートされた（ＲａｇＢはＶＧＢ処理眼組織でアップレギュレートされたが、ＲａｇＤはＶＧＢ処理脳組織でアップレギュレートされた）。まとめると、これらの知見は、ＡＭＰＫの補正が、ａｌｄｈ５ａ１－／－マウスにおけるＴｏｒｉｎ薬物の生存促進効果に関与することを強く示唆する。ＧＡＢＡ代謝の障害を治療するためのｍＴＯＲ阻害剤の潜在的な臨床的有用性を理解することは、著者らの研究室における中心的テーマであり続けるのであろう。

【0123】

ＳＳＡＤＨＤにおける多系統機能障害を考慮すると、表現型の漸増的向上を活用するためには、組み合わせ治療が必要となる可能性が高い。眼毒性の問題を克服できれば、論理的な出発点はＶＧＢであろう。実際、これに関して、ｍＴＯＲのインヒビターは、ＶＧＢに関連するＧＡＢＡの付加的な増加の効果を軽減するために追加することができる。この障害における酸化ストレスの証拠が与えられれば、抗酸化剤も価値があるであろう（Gupta et al. J Pharmacol Exp Ther 302:180-187(2002)）。今回の報告で示されているように、ＥＲＴは治療的有益性を有する可能性があり、ＣＲ１ＳＰＲＣａｓ９アプローチなど、将来的には遺伝子操作と組み合わせることが可能である。それにもかかわらず、出願人の短期目標は、ＳＳＡＤＨＤの標的療法の開発である。

【0124】

本発明の記載された方法、医薬組成物、およびキットの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、本発明はさらなる修正が可能であり、特許請求の範囲に記載された本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解される。実際に、当業者に明らかである本発明を実施するための記載されたモードの種々の改変は、本発明の範囲内であることが意図される。本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、または適応を包含することが意図され、本発明が関係する当技術分野内の公知の慣例内に入り、本明細書で前述した本質的な特徴に適用されてもよい。

【図1】

【図2】

【図3A-3B】

【図4A-4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【手続補正書】

【提出日】2023-09-25

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＡＤＨ）酵素をコードするＲＮＡを含む、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＳＡＤＨＤ）を処置するための組成物。

【請求項2】

コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素が、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ５ファミリーメンバーＡ１（ＡＬＤＨ５Ａ１）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

酵素が、１日当たり体重１ｋｇ当たり１～１０．０００μｇの範囲の機能性ＳＳＡＤＨ酵素で投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

組成物が、週１回、週２回、または月１回投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

組成物が静脈内に投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

組成物がくも膜下腔内に投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

ｍＴＯＲ阻害剤、ＧＡＢＡ－Ｔ阻害剤、またはそれらの組み合わせの１つ以上が、前記組成物と組み合わせて、投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシン、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、トリン１、およびトリン２のうちの１つ以上を含む、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、請求項７に記載の組成物。

【請求項10】

ＧＡＢＡ－Ｔ阻害剤がビガバトリンである、請求項７に記載の組成物。

【請求項11】

トリン２またはビガバトリンの少なくとも一つの治療有効量が投与される、請求項７に記載の組成物。

【請求項12】

トリン２またはビガバトリンの少なくとも一つの治療有効量が、１日当たり体重１ｋｇ当たり１～２５μｇを含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

トリン２またはビガバトリンの少なくとも一つが、１日に２回または３回投与される、請求項１１に記載の組成物。

【請求項14】

組成物が、増加したレベルの循環代謝産物を有する対象に投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項15】

前記循環代謝産物が、ＧＨＢ、ＧＡＢＡ、またはその両方である、請求項１４に記載の組成物。

【外国語明細書】