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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023163398
(43)【公開日】2023-11-10
(54)【発明の名称】脂質及び色素の共生産能を有する緑藻
(51)【国際特許分類】
C12N 1/12 20060101AFI20231102BHJP
C12P 7/6431 20220101ALI20231102BHJP
C12P 7/6427 20220101ALI20231102BHJP
A23L 33/12 20160101ALI20231102BHJP
A23L 33/115 20160101ALI20231102BHJP
A23L 5/46 20160101ALI20231102BHJP
A23L 5/44 20160101ALI20231102BHJP
C12P 5/00 20060101ALI20231102BHJP
C12P 17/18 20060101ALI20231102BHJP
C12P 7/6409 20220101ALI20231102BHJP
A61K 31/409 20060101ALI20231102BHJP
A61K 31/122 20060101ALI20231102BHJP
A61K 31/20 20060101ALI20231102BHJP
A61K 31/201 20060101ALI20231102BHJP
A61K 31/202 20060101ALI20231102BHJP
A61K 36/05 20060101ALI20231102BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20231102BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231102BHJP
A61K 8/9722 20170101ALI20231102BHJP
A61K 8/67 20060101ALI20231102BHJP
A61K 8/31 20060101ALI20231102BHJP
A61K 8/36 20060101ALI20231102BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20231102BHJP
A23K 10/30 20160101ALI20231102BHJP
A61K 31/015 20060101ALI20231102BHJP
【ＦＩ】
C12N1/12 C ZNA
C12N1/12 A
C12P7/6431
C12P7/6427
C12N1/12 Z
A23L33/12
A23L33/115
A23L5/46
A23L5/44
C12P5/00
C12P17/18 B
C12P7/6409
A61K31/409
A61K31/122
A61K31/20
A61K31/201
A61K31/202
A61K36/05
A61P39/06
A61P29/00
A61K8/9722
A61K8/67
A61K8/31
A61K8/36
A61Q19/00
A23K10/30
A61K31/015
【審査請求】未請求
【請求項の数】28
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022074294
(22)【出願日】2022-04-28
(71)【出願人】
【識別番号】504203572
【氏名又は名称】国立大学法人茨城大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】朝山 宗彦
【テーマコード（参考）】
2B150
4B018
4B064
4B065
4C083
4C086
4C088
4C206
【Ｆターム（参考）】
2B150AA01
2B150AB02
2B150DD47
4B018MA01
4B018MA04
4B018MD10
4B018MD13
4B018MD89
4B018ME02
4B018ME07
4B018ME14
4B064AB06
4B064AD87
4B064AD88
4B064AD89
4B064AE48
4B064AE54
4B064AE57
4B064CA08
4B064CC03
4B064CC04
4B064CC06
4B064CC12
4B064CC30
4B064CE02
4B064CE08
4B064CE10
4B064CE16
4B064DA01
4B064DA08
4B064DA10
4B064DA11
4B065AA83X
4B065AC09
4B065AC14
4B065AC16
4B065BA22
4B065BC03
4B065BC07
4B065BC08
4B065BC48
4B065BD01
4B065BD13
4B065BD16
4B065CA02
4B065CA03
4B065CA13
4B065CA18
4B065CA41
4B065CA43
4B065CA44
4B065CA50
4B065CA52
4C083AA021
4C083AA121
4C083AC011
4C083AC031
4C083AC241
4C083AC251
4C083AC851
4C083AD621
4C083CC03
4C086AA01
4C086CB04
4C086GA17
4C086HA28
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA63
4C086NA14
4C086ZA89
4C086ZB11
4C086ZC37
4C088AA15
4C088BA18
4C088MA52
4C088MA63
4C088NA14
4C088ZA89
4C088ZB11
4C088ZC37
4C206AA01
4C206BA02
4C206CA08
4C206CB25
4C206DA03
4C206DA04
4C206DA05
4C206KA18
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA72
4C206MA83
4C206NA14
4C206ZA89
4C206ZB11
4C206ZC37
(57)【要約】
【課題】脂質及び色素の生産に有用な微細藻類の提供。
【解決手段】コーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－２２４４３）又は脂質及び色素の共蓄積能を有するその派生株である緑藻細胞、並びに、その緑藻細胞を用いた脂質及び／又は色素の製造方法、その緑藻細胞由来の脂溶性成分抽出物とその用途。
【選択図】なし
【解決手段】コーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－２２４４３）又は脂質及び色素の共蓄積能を有するその派生株である緑藻細胞、並びに、その緑藻細胞を用いた脂質及び／又は色素の製造方法、その緑藻細胞由来の脂溶性成分抽出物とその用途。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－２２４４３を有するコーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株、又は脂質及び色素の共蓄積能を有するその派生株である、緑藻細胞。
【請求項2】
請求項１に記載の緑藻細胞を、２９℃以上で培地で培養することを含む、緑藻細胞の培養方法。
【請求項3】
請求項１に記載の緑藻細胞を、２９℃以上で培地で培養し、細胞内に蓄積された脂質及び／又は色素を回収することを含む、脂質及び／又は色素の製造方法。
【請求項4】
前記脂質がパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記色素が、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記色素が、クロロフィルａ及びクロロフィルｂからなる群から選択される少なくとも１つのクロロフィルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記培地が液体培地又は固形培地である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項8】
前記培地がＢＧ１１培地、若しくは希釈ＢＧ１１培地、又はそれらの栄養源欠乏培地である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項9】
希釈ＢＧ１１培地が、５倍希釈したＢＧ１１培地である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記緑藻細胞を３０～５０℃で培養する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項11】
前記培養を、白色光の照射下、又は白色光と赤色光の照射下で行う、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項12】
前記緑藻細胞を、希釈ＢＧ１１液体培地で、ＣＯ２ガス供給下、かつ、白色光、又は白色光と赤色光の照射下で、少なくとも５日間攪拌しながら培養し、前記緑藻細胞を緑色相から赤色相に移行させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項13】
前記緑藻細胞を、ＢＧ１１固形培地又は希釈ＢＧ１１固形培地で、白色光と赤色光の照射下で少なくとも２６日間培養し、前記緑藻細胞を緑色相から赤色相に移行させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項14】
請求項１に記載の緑藻細胞由来の、カロテノイド及び／又はクロロフィルを含む脂溶性成分抽出物。
【請求項15】
βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイドを含む、請求項１４に記載の脂溶性成分抽出物。
【請求項16】
脂溶性色素組成比率で少なくとも１０ｗ／ｗ％のエキネノン及び少なくとも３０ｗ／ｗ％のカンタキサンチンを含む、請求項１５に記載の脂溶性成分抽出物。
【請求項17】
パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む脂質を含む、請求項１４に記載の脂溶性成分抽出物。
【請求項18】
請求項１に記載の緑藻細胞、又は請求項１４～１７のいずれか１項に記載の脂溶性成分抽出物を含む、抗酸化剤又は抗炎症剤。
【請求項19】
請求項１に記載の緑藻細胞、又は請求項１４～１７のいずれか１項に記載の脂溶性成分抽出物を含む食品。
【請求項20】
請求項１に記載の緑藻細胞、又は請求項１４～１７のいずれか１項に記載の脂溶性成分抽出物を含む飼料。
【請求項21】
請求項１に記載の緑藻細胞、又は請求項１４～１７のいずれか１項に記載の脂溶性成分抽出物を含む化粧品。
【請求項22】
請求項１に記載の緑藻細胞、又は請求項１４～１７のいずれか１項に記載の脂溶性成分抽出物を含む医薬品。
【請求項23】
抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、請求項１９に記載の食品。
【請求項24】
抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、請求項２０に記載の飼料。
【請求項25】
抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、請求項２１に記載の化粧品。
【請求項26】
抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、請求項２２に記載の医薬品。
【請求項27】
請求項１に記載の緑藻細胞を、３００ｐｐｍ以上の濃度の次亜塩素酸又はその塩で処理することを含む、前記緑藻細胞を殺菌する方法。
【請求項28】
請求項２０に記載の飼料を非ヒト動物に給餌することを含む、非ヒト動物の飼養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脂質及び色素の共生産能を有する緑藻に関する。
【背景技術】
【0002】
微細藻類は、一般に、高い増殖力と光合成（炭酸ガス固定）能を有し、また安価な培地で培養可能であることから、モノづくり（バイオリファイナリー）に利用するのに適している。微細藻類の１種であり真核光合成微生物である緑藻を用いた有用物質生産として、これまでに、クロレラ、パラクロレラ、セデムスムス、イカダモ、又はクラミドモナス等を用いた主に中性脂肪（トリアシルグリセロール；ＴＡＧ）又は菌体外多糖（ＥＰＳ）の生産や、ヘマトコッカスを用いたカロテノイド（赤系色素）の１種であるアスタキサンチンの生産などが知られている（特許文献１～３）。一方で、例えば、本発明者らが見出した高い脂質生産能を有する緑藻パラクロレラ属ＢＸ１．５株（特許文献４）は、カロテノイドを高生産することはできない。
【0003】
赤系色素に属するβカロテノイド類は、βカロテン（朱色）→エキネノン（朱色）→カンタキサンチン（朱色）→アスタキサンチン（真紅）の合成経路で生産されることが知られている。βカロテノイド類は光合成微生物のみならず、パラコッカスやラビンチュラなど非光合成微生物でも生産されることから、非光合成微生物由来の赤色素合成遺伝子を植物、ラン藻、又は大腸菌へ導入した遺伝子組み換え体を作製してアスタキサンチン生産効率の向上を目指す試みもなされている（非特許文献１～３）。一方、緑藻コーラストレラ（Ｃｌｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ）も、脂質やカロテノイドを生産することが知られている（非特許文献４）が、その生産量は必ずしも十分ではなく、生産特性は株によって大きく異なる。またコーラストレラの培養温度は一般に１５～２５℃の低温であり、生産効率向上には適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１５－４２１８６号公報
【特許文献2】特開２０１６－１１１９８４号公報
【特許文献3】特開２０１７－１５８５８７号公報
【特許文献4】特開２０１９－１７３２８号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Park SY et al., Metabolic Engineering (2018) 49, p.105-115
【非特許文献2】Hasunuma T et al., The Plant Journal (2008) 55, p.857-868
【非特許文献3】Hasunuma T et al., ACS Synthetic Biology (2019) 8, p.2701-2709
【非特許文献4】Abe K et al., Food Chemistry (2007) 100, p.656-661
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、脂質及び色素の生産に有用な微細藻類を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、脂質及び色素を生産し細胞内に蓄積できるコーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株の取得に成功し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］ 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－２２４４３を有するコーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株、又は脂質及び色素の共蓄積能を有するその派生株である、緑藻細胞。
［２］ 上記［１］に記載の緑藻細胞を、２９℃以上で培地で培養することを含む、緑藻細胞の培養方法。
［３］ 上記［１］に記載の緑藻細胞を、２９℃以上で培地で培養し、細胞内に蓄積された脂質及び／又は色素を回収することを含む、脂質及び／又は色素の製造方法。
［４］ 前記脂質がパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む、上記［３］に記載の方法。
［５］ 前記色素が、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイドを含む、上記［３］又は［４］に記載の方法。
［６］ 前記色素が、クロロフィルａ及びクロロフィルｂからなる群から選択される少なくとも１つのクロロフィルを含む、上記［３］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ 前記培地が液体培地又は固形培地である、上記［２］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 前記培地がＢＧ１１培地、若しくは希釈ＢＧ１１培地、又はそれらの栄養源欠乏培地である、上記［２］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ 希釈ＢＧ１１培地が、５倍希釈したＢＧ１１培地である、上記［８］に記載の方法。
［１０］ 前記緑藻細胞を３０～５０℃で培養する、上記［２］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］ 前記培養を、白色光の照射下、又は白色光と赤色光の照射下で行う、上記［２］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ 前記緑藻細胞を、希釈ＢＧ１１液体培地で、ＣＯ２ガス供給下、かつ、白色光、又は白色光と赤色光の照射下で、少なくとも５日間攪拌しながら培養し、前記緑藻細胞を緑色相から赤色相に移行させる、［２］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］ 前記緑藻細胞を、ＢＧ１１固形培地又は希釈ＢＧ１１固形培地で、白色光と赤色光の照射下で少なくとも２６日間培養し、前記緑藻細胞を緑色相から赤色相に移行させる、上記［２］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１４］ 上記［１］に記載の緑藻細胞由来の、カロテノイド及び／又はクロロフィルを含む脂溶性成分抽出物。
［１５］ βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイドを含む、上記［１４］に記載の脂溶性成分抽出物。
［１６］ 脂溶性色素組成比率で少なくとも１０ｗ／ｗ％のエキネノン及び少なくとも３０ｗ／ｗ％のカンタキサンチンを含む、上記［１５］に記載の脂溶性成分抽出物。
［１７］ パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む脂質を含む、上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物。
［１８］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む、抗酸化剤又は抗炎症剤。
［１９］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む食品。
［２０］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む飼料。
［２１］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む化粧品。
［２２］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む医薬品。
［２３］ 抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、上記［１９］に記載の食品。
［２４］ 抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、上記［２０］に記載の飼料。
［２５］ 抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、上記［２１］に記載の化粧品。
［２６］ 抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、上記［２２］に記載の医薬品。
［２７］ 上記［１］に記載の緑藻細胞を、３００ｐｐｍ以上の濃度の次亜塩素酸又はその塩で処理することを含む、前記緑藻細胞を殺菌する方法。
［２８］ 上記［２０］又は［２４］に記載の飼料を非ヒト動物に給餌することを含む、非ヒト動物の飼養方法。
［１］ 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－２２４４３を有するコーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株、又は脂質及び色素の共蓄積能を有するその派生株である、緑藻細胞。
［２］ 上記［１］に記載の緑藻細胞を、２９℃以上で培地で培養することを含む、緑藻細胞の培養方法。
［３］ 上記［１］に記載の緑藻細胞を、２９℃以上で培地で培養し、細胞内に蓄積された脂質及び／又は色素を回収することを含む、脂質及び／又は色素の製造方法。
［４］ 前記脂質がパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む、上記［３］に記載の方法。
［５］ 前記色素が、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイドを含む、上記［３］又は［４］に記載の方法。
［６］ 前記色素が、クロロフィルａ及びクロロフィルｂからなる群から選択される少なくとも１つのクロロフィルを含む、上記［３］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ 前記培地が液体培地又は固形培地である、上記［２］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 前記培地がＢＧ１１培地、若しくは希釈ＢＧ１１培地、又はそれらの栄養源欠乏培地である、上記［２］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ 希釈ＢＧ１１培地が、５倍希釈したＢＧ１１培地である、上記［８］に記載の方法。
［１０］ 前記緑藻細胞を３０～５０℃で培養する、上記［２］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］ 前記培養を、白色光の照射下、又は白色光と赤色光の照射下で行う、上記［２］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ 前記緑藻細胞を、希釈ＢＧ１１液体培地で、ＣＯ２ガス供給下、かつ、白色光、又は白色光と赤色光の照射下で、少なくとも５日間攪拌しながら培養し、前記緑藻細胞を緑色相から赤色相に移行させる、［２］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］ 前記緑藻細胞を、ＢＧ１１固形培地又は希釈ＢＧ１１固形培地で、白色光と赤色光の照射下で少なくとも２６日間培養し、前記緑藻細胞を緑色相から赤色相に移行させる、上記［２］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１４］ 上記［１］に記載の緑藻細胞由来の、カロテノイド及び／又はクロロフィルを含む脂溶性成分抽出物。
［１５］ βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイドを含む、上記［１４］に記載の脂溶性成分抽出物。
［１６］ 脂溶性色素組成比率で少なくとも１０ｗ／ｗ％のエキネノン及び少なくとも３０ｗ／ｗ％のカンタキサンチンを含む、上記［１５］に記載の脂溶性成分抽出物。
［１７］ パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む脂質を含む、上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物。
［１８］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む、抗酸化剤又は抗炎症剤。
［１９］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む食品。
［２０］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む飼料。
［２１］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む化粧品。
［２２］ 上記［１］に記載の緑藻細胞、又は上記［１４］～［１７］のいずれかに記載の脂溶性成分抽出物を含む医薬品。
［２３］ 抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、上記［１９］に記載の食品。
［２４］ 抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、上記［２０］に記載の飼料。
［２５］ 抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、上記［２１］に記載の化粧品。
［２６］ 抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための、上記［２２］に記載の医薬品。
［２７］ 上記［１］に記載の緑藻細胞を、３００ｐｐｍ以上の濃度の次亜塩素酸又はその塩で処理することを含む、前記緑藻細胞を殺菌する方法。
［２８］ 上記［２０］又は［２４］に記載の飼料を非ヒト動物に給餌することを含む、非ヒト動物の飼養方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、Ｄ３－１株を用いて脂質及び色素を効率良く生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】図１はＤ３－１株の系統解析の結果を示す図である。Ｄ３－１株の１８Ｓ ｒＤＮＡ領域を含む配列は図中のアクセッション番号ＬＣ７０２９１３の下でＧｅｎＢａｎｋに登録されているが、当該アクセッション番号及びその登録配列は未公開である。
【図2】図２はＤ３－１株を含む緑藻単離株由来のＦＡＭＥｓ分析結果を示すグラフである。図２Ａは、ＢＧ１１－Ｐ液体培地で培養した各株の緑藻細胞由来の脂質の脂肪酸組成を示す。縦軸は、各株（横軸）由来のＦＡＭＥｓ総量を１００％（１．０）としたときのＦＡＭＥｓ総量中の各ＦＡＭＥｓ量の割合（ｗ／ｗ％）を表す。図２Ａのグラフにおいて、ドット部はパルミチン酸メチルエステル、黒塗り部はステアリン酸メチルエステル、斜線網掛け部はオレイン酸メチルエステル、横線網掛け部はリノール酸メチルエステル、格子網掛け部はα－リノレン酸メチルエステルを表す。図２Ｂは、０．２ＢＧ１１液体培地で培養した各緑藻細胞株（横軸）由来のＦＡＭＥｓ量を、乾燥菌体重量（ＤＣＷ）に対するＦＡＭＥｓ総量の比率（ｗ／ｗ％）（縦軸）で表す。図２Ｃは、０．２ＢＧ１１液体培地で培養した各緑藻細胞株（横軸）由来のＦＡＭＥｓ量を、培養液１リットル当たりのＦＡＭＥｓ総量（ｍｇ／Ｌ）で表す。
【図3】図３は培養時間の経過に伴うＤ３－１株培養液の外観（特に、色）の変化を示す写真である。Ａ：本培養開始から３日後、６日後、９日後、１５日後、２１日後、及び２７日後のフラスコ内の培養液。Ｂ：本培養開始前（０日）、本培養開始から３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、及び２７日後に分取して９６穴プレートに移した培養液。
【図5】図５は、ＢＩＣ条件（振とう培養、２％ ＣＯ２）下、白色光（１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）連続照射（Ｗ１００）下で培養したＤ３－１株の、本培養開始から５日後と４８日後のフラスコ内の培養液の外観を示す写真である。Ａ：ＢＧ１１液体培地で４８日培養後の培養液（表３のＮｏ．９）、Ｂ：ＢＧ１１液体培地で５日培養後の培養液（表３のＮｏ．１０）、Ｃ：０．２ＢＧ１１液体培地で５日培養後の培養液（表３のＮｏ．１１）。
【図6】図６は、各培養条件にて寒天培地で培養したＤ３－１株の２６日培養後の呈色状態を示す写真である。Ａ：表３のＮｏ．１、Ｂ：表３のＮｏ．２、Ｃ：表３のＮｏ．３、Ｄ：表３のＮｏ．４、Ｅ：表３のＮｏ．５、Ｆ：表３のＮｏ．６、Ｇ：表３のＮｏ．７、Ｈ：表３のＮｏ．８。
【図7】図７はＤ３－１株由来の色素のＴＬＣ分析の結果を示す。Ａ：Ｄ３－１株の朱色細胞由来の色素抽出物のＴＬＣ分析結果、Ｂ：Ｄ３－１株の朱色細胞及び緑色細胞由来の色素抽出物のＴＬＣ分析結果の比較、並びに主な色素化合物の構造と一般的な代謝経路及び関連する生合成遺伝子（ｃｒｔＷ、ｃｒｔＺ）。
【図9】図９は４つの培養条件で培養したＤ３－１株を示す写真である。Ｒｄ１．０ＢＧｐ４ｍの寒天培地上の増殖画像（Ａ）と顕微鏡画像（Ｂ）、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍの寒天培地上の増殖画像（Ｃ）と顕微鏡画像（Ｄ）、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄの培養液の写真（Ｅ）と顕微鏡画像（Ｆ）、Ｇｒ１．０ＢＧｃ７ｄの培養液の写真（Ｇ）と顕微鏡画像（Ｈ）。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0012】
本発明は、３０℃以上でも生育可能なコーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株、並びにＤ３－１株の培養に基づく脂質及び色素の製造に関する。
【0013】
１）本発明の緑藻
本発明は、コーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株、又は脂質及び色素の共蓄積能を有するその派生株である、緑藻細胞に関する。コーラストレラ・エスピーＤ３－１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）（〒２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室）に２０２２年２月４日（受託日）付けで寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ－２２４４３である。本明細書において、コーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株は「Ｄ３－１株」と略記することがある。
本発明は、コーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株、又は脂質及び色素の共蓄積能を有するその派生株である、緑藻細胞に関する。コーラストレラ・エスピーＤ３－１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）（〒２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室）に２０２２年２月４日（受託日）付けで寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ－２２４４３である。本明細書において、コーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株は「Ｄ３－１株」と略記することがある。
【0014】
コーラストレラ・エスピーＤ３－１株の菌学的性質は次のとおりである。
（ａ）培養的性質
Ｄ３－１株は、静置培養又は培地を攪拌しながら行う液体培養により増殖（生育）・維持することができる。空気若しくはＣＯ２ガス（炭酸ガス）（好ましくは約０．０４～１５％）を液体培地に吹き込みながら（通気）培養するか、又は、大気中若しくはＣＯ２ガス（炭酸ガス）（好ましくは約０．０４～１５％）を充填した培養インキュベーター内で静置培養又は約３０～１００ｒｐｍの速度で振とう培養することが好ましい。Ｄ３－１株は、大気（空気）中で静置培養、又は攪拌しながら培養（振とう培養など）することで増殖（生育）・維持させることができるが、ＣＯ２ガス供給下ではその増殖（生育）を促進することができる。Ｄ３－１株は、液体培地でも固形培地（寒天培地など）でも培養することができる。Ｄ３－１株は、典型的には、ＢＧ１１培地（組成は後述）、希釈ＢＧ１１培地又はそれらの改変培地（例えば、栄養源欠乏培地）で培養することができる。培地のｐＨはｐＨ９～１１が好ましいが、中性付近（ｐＨ６～８）であってもよい。
（ａ）培養的性質
Ｄ３－１株は、静置培養又は培地を攪拌しながら行う液体培養により増殖（生育）・維持することができる。空気若しくはＣＯ２ガス（炭酸ガス）（好ましくは約０．０４～１５％）を液体培地に吹き込みながら（通気）培養するか、又は、大気中若しくはＣＯ２ガス（炭酸ガス）（好ましくは約０．０４～１５％）を充填した培養インキュベーター内で静置培養又は約３０～１００ｒｐｍの速度で振とう培養することが好ましい。Ｄ３－１株は、大気（空気）中で静置培養、又は攪拌しながら培養（振とう培養など）することで増殖（生育）・維持させることができるが、ＣＯ２ガス供給下ではその増殖（生育）を促進することができる。Ｄ３－１株は、液体培地でも固形培地（寒天培地など）でも培養することができる。Ｄ３－１株は、典型的には、ＢＧ１１培地（組成は後述）、希釈ＢＧ１１培地又はそれらの改変培地（例えば、栄養源欠乏培地）で培養することができる。培地のｐＨはｐＨ９～１１が好ましいが、中性付近（ｐＨ６～８）であってもよい。
【0015】
Ｄ３－１株の典型的な培養温度は３０℃であるが、より広い培養温度で生育・維持させることができる。
【0016】
Ｄ３－１株の培養には光を要しないが、蛍光白色光（白色蛍光灯の光）、ＬＥＤ白色光、ＬＥＤ赤色光などの光照射下で培養することにより、生育を促進し、また脂質・色素などの物質生産を促進することができる。培養時の明暗周期は不要である。
【0017】
（ｂ）形態的・生理学的性質
Ｄ３－１株は、ＢＧ１１液体培地で培養した場合には約３～１２μｍの直径を有する球形単細胞性の淡水性緑藻（真核光合成微生物）である。Ｄ３－１株細胞は、例えば大気（空気）中の静置培養では数ヶ月かけて、緑色（緑色相／グリーンステージ）から徐々に赤味を帯びて朱色（赤色相／レッドステージ）へと変化させることができる。Ｄ３－１株の細胞の緑色相から赤色相への変化は、Ｄ３－１株細胞が赤系色素（主としてカロテノイド）を生産し細胞内に蓄積することによって生じる。
Ｄ３－１株は、ＢＧ１１液体培地で培養した場合には約３～１２μｍの直径を有する球形単細胞性の淡水性緑藻（真核光合成微生物）である。Ｄ３－１株細胞は、例えば大気（空気）中の静置培養では数ヶ月かけて、緑色（緑色相／グリーンステージ）から徐々に赤味を帯びて朱色（赤色相／レッドステージ）へと変化させることができる。Ｄ３－１株の細胞の緑色相から赤色相への変化は、Ｄ３－１株細胞が赤系色素（主としてカロテノイド）を生産し細胞内に蓄積することによって生じる。
【0018】
Ｄ３－１株は、緑色細胞（緑色相）も朱色細胞（赤色相）も、培養液を直接－８０℃で保存することができる。
【0019】
（ｃ）分類学的性質
１８Ｓリボゾーム遺伝子（１８ＳリボゾームＲＮＡコード配列）の塩基配列に基づき、Ｄ３－１株はコーラストレラ・オアシスティフォルミス（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｏｏｃｙｓｔｉｆｏｒｍｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＭ０２００８８）及びコーラストレラ・コルコンティカ（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｃｏｒｃｏｎｔｉｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３７０８２）に対して９９．８％の配列相同性を示し、コーラストレラ属に分類される新種の株として同定された。
１８Ｓリボゾーム遺伝子（１８ＳリボゾームＲＮＡコード配列）の塩基配列に基づき、Ｄ３－１株はコーラストレラ・オアシスティフォルミス（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｏｏｃｙｓｔｉｆｏｒｍｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＭ０２００８８）及びコーラストレラ・コルコンティカ（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｃｏｒｃｏｎｔｉｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３７０８２）に対して９９．８％の配列相同性を示し、コーラストレラ属に分類される新種の株として同定された。
【0020】
（ｄ）その他の特徴
Ｄ３－１株は、脂質と色素を高生産することができる。本発明では、Ｄ３－１株を、２９℃以上、好ましくは３０℃以上の温度で培養した場合でも、脂質と色素を生産し細胞内にその両方を同時に蓄積することができる。
Ｄ３－１株は、脂質と色素を高生産することができる。本発明では、Ｄ３－１株を、２９℃以上、好ましくは３０℃以上の温度で培養した場合でも、脂質と色素を生産し細胞内にその両方を同時に蓄積することができる。
【0021】
本発明は、上記のコーラストレラ・エスピーＤ３－１株に由来し、Ｄ３－１株と同様に脂質及び色素の共蓄積能を有する派生株である緑藻（緑藻細胞）にも関する。本発明において細胞株の「脂質及び色素の共蓄積能」とは、その細胞株が脂質と色素を細胞内に同時に蓄積することができることを意味する。本発明における「脂質及び色素の共蓄積能」は、例えば、乾燥菌体重量（ＤＣＷ）１ｇ当たりの脂質量（ｇ）の比率が少なくとも２０ｗ／ｗ％、かつ色素量（ｇ）の比率が少なくとも２０ｗ／ｗ％となる量で脂質及び色素の両方を細胞内に蓄積できる能力であり得る。本発明におけるＤ３－１株又はその上記派生株は、２９℃以上、好ましくは３０℃以上の培養温度で脂質及び色素の共蓄積能を有し得る。Ｄ３－１株又はその上記派生株が蓄積する色素は、具体的には、カロテノイド及び／又はクロロフィルを含む。Ｄ３－１株又はその上記派生株は、特に、脂質とカロテノイドの共蓄積能を有することを特徴とする。本発明におけるＤ３－１株の上記派生株は、コーラストレラ・エスピーＤ３－１株について上述した性質を有することが好ましい。
【0022】
Ｄ３－１株の派生株は、例えば、Ｄ３－１株の変異株であってよい。変異株としては、以下に限定しないが、例えば、自然突然変異体、遺伝子組換え体、突然変異誘発処理体、プラスミド導入等による形質転換体、倍数化体などが含まれる。
【0023】
また本発明の緑藻細胞（Ｄ３－１株又はその脂質及び色素の共蓄積能を有する派生株）は、環境ストレスに対する耐性を有する。本発明の緑藻細胞は、好ましくは、乾燥、ＵＶ（紫外線）、酸化（過酸化水素などの酸化剤）、中性～アルカリ処理（ｐＨ７～１１）、凍結融解、４０℃～５０℃の加温などの環境ストレスに耐性を示し、生育することができる。
【0024】
２）本発明の緑藻細胞の培養と脂質及び色素生産
本発明では、本発明の緑藻細胞を、Ｄ３－１株に適した培養条件で、培養することができる。一実施形態では、本発明の緑藻細胞を、Ｄ３－１株の細胞増殖、脂質生産・蓄積、色素生産・蓄積、又は脂質と色素の両方の生産・蓄積に適した培養条件（例えば、後述の培養条件）で、培養することができる。したがって本発明は、本発明の緑藻細胞の培養方法にも関する。
本発明では、本発明の緑藻細胞を、Ｄ３－１株に適した培養条件で、培養することができる。一実施形態では、本発明の緑藻細胞を、Ｄ３－１株の細胞増殖、脂質生産・蓄積、色素生産・蓄積、又は脂質と色素の両方の生産・蓄積に適した培養条件（例えば、後述の培養条件）で、培養することができる。したがって本発明は、本発明の緑藻細胞の培養方法にも関する。
【0025】
本発明の緑藻細胞は、当該細胞に好適な培養温度で培養することができ、とりわけ、２９℃以上、例えば３０℃以上の培養温度でも好適に増殖（生育）・維持することができる。本発明は、例えば、本発明の緑藻細胞を、２９℃以上、好ましくは３０℃以上、例えば２９～５０℃、３０℃～５０℃、２９～４５℃、２９～４２℃、２９～４０℃、３０～４５℃、３０～４２℃、３０～４０℃、２９～３５℃、又は３０～３３℃で培養することを含む、緑藻細胞の培養方法も提供する。但し２９℃よりも低い温度で本発明の緑藻細胞を培養することも可能である。本発明の緑藻細胞の培養は、培地、好ましくは当該緑藻細胞の培養に適した培地を用いて行うことができる。
【0026】
本発明の緑藻細胞は、緑藻の一般的な培養温度よりも高い２９℃以上、好ましくは３０℃以上、例えば２９～５０℃、３０℃～５０℃、２９～４５℃、２９～４２℃、２９～４０℃、３０～４５℃、３０～４２℃、３０～４０℃、２９～３５℃、又は３０～３３℃、例えば３０℃の培養温度で培養した場合でも、脂質と色素を高生産し、細胞内に脂質と色素を共蓄積することができる。
【0027】
本発明の緑藻細胞の培養（前培養及び／又は本培養）には、ＢＧ１１培地（Ｂｌｕｅ Ｇｒｅｅｎ培地）、希釈ＢＧ１１培地、又はその改変培地（例えば、栄養源欠乏培地）を好適に使用することができる。但し本発明の緑藻細胞の培養に使用され得る培地はこれらに限定されるものではなく、例えばＣＢ培地（Ｃ培地とも呼ばれる；実施例において後述）などの、緑藻細胞の培養に使用可能な他の培地であってもよい。本発明の緑藻細胞の培養に使用される培地は、液体培地であってもよいし、寒天培地などの固形培地であってもよい。
ＢＧ１１液体培地の組成（配合量）を表１に示す。
ＢＧ１１液体培地の組成（配合量）を表１に示す。
【0028】
【表1】
【0029】
ＢＧ１１寒天培地は、ＢＧ１１液体培地１００ｍＬに寒天を適切な量（例えば、０．６ｗ／ｖ％、又は０．５～３ｗ／ｖ％）を添加して作製することができる。
【0030】
希釈ＢＧ１１培地は、上記組成のＢＧ１１培地を水などの水性媒体で希釈した希釈培地である。希釈ＢＧ１１培地は、ＢＧ１１培地を、任意の希釈倍率で、例えば１．５倍～３０倍、好ましくは２～１０倍、より好ましくは３～７倍、さらに好ましくは４～６倍、特に好ましくは５倍に希釈した培地であってよい。５倍に希釈（０．２倍濃度）したＢＧ１１培地を、本発明に関して０．２ＢＧ１１培地と称することがある。希釈ＢＧ１１培地は、液体培地（希釈ＢＧ１１液体培地）であってもよいし、寒天培地などの固形培地（希釈ＢＧ１１寒天培地などの、希釈ＢＧ１１固形培地）であってもよい。希釈ＢＧ１１培地を用いることにより、色素、特にカロテノイドをはじめとする脂溶性色素の蓄積をより早めることができる。
【0031】
ＢＧ１１培地又は希釈ＢＧ１１培地の改変培地は、例えば、リン源欠乏培地、窒素源欠乏培地などの栄養源欠乏培地であり得る。ＢＧ１１培地又は希釈ＢＧ１１培地の栄養源欠乏培地は、ＢＧ１１培地の組成に基づいて、当業者であれば容易に調製することができる。例えば、窒素源欠乏ＢＧ１１液体培地は、硝酸態窒素（ＮａＮＯ３）を除外するか又はその配合量を低減（好ましくは、重量比で５０％以下に低減）したＢＧ１１培地組成に基づいて培地を調製することにより作製することができる。例えば、リン源欠乏ＢＧ１１液体培地は、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）を除外するか又はその配合量を低減（好ましくは、重量比で５０％以下に低減）したＢＧ１１培地組成に基づいて培地を調製することにより作製することができる。
【0032】
培地のｐＨはｐＨ９～１１が好ましいが、中性付近（ｐＨ６～８）でもよい。
【0033】
本発明の緑藻細胞は、光照射下で培養することが好ましい。光の強度及び／又は波長などの光条件を調整することにより、物質生産能を調整することができる。光照射は、人工光源若しくは太陽光、又はそれらの組み合わせによるものであってよい。人工光源としては、限定するものではないが、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、蛍光灯、白熱電球、有機ＥＬ、半導体レーザー、高圧ナトリウムランプ、低圧ナトリウムランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、水銀ランプなどが挙げられる。光強度（光量子束密度）は、１～１，０００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、好ましくは１０～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より好ましくは１０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、さらに好ましくは３０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より強光条件では７０～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、好ましい強光条件では１００～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、例えば３０～１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、７０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、７０～１５０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、１００～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、又は１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓであってよい。細胞培養液に２種類以上の光（例えば、白色光と赤色光）を照射、例えば、同時に照射（混合照射）する場合、光強度は、それらの照射光の合計で、１～１，０００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、好ましくは１０～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より好ましくは１０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、さらに好ましくは３０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より強光条件では７０～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、好ましい強光条件では１００～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、例えば３０～１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、７０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、７０～１５０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、１００～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、又は１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓであってよい。本発明では、光強度を強めることにより、色素産生を促進することができる。本発明の緑藻細胞は、光の連続照射（２４時間照射）下で培養することが好ましい。
【0034】
本発明の緑藻細胞の培養は、白色光の照射下、又は白色光と赤色光の照射下で（すなわち、白色光、又は白色光と赤色光を照射しながら）行うことが好ましい。一実施形態では、白色光は、蛍光白色光、又はＬＥＤ白色光であり得る。一実施形態では、白色光は、例えば、１～１，０００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、好ましくは１０～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より好ましくは１０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、さらに好ましくは３０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より強光条件では７０～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、好ましい強光条件では１００～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、特に好ましくは７０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、例えば３０～１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、７０～１５０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、１００～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、又は１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓであってよい。白色光と赤色光の照射（例えば、混合照射）を行う場合、赤色光は、波長域６００～７８０ｎｍ（例えば、蛍光赤色光、又はＬＥＤ赤色光）、好ましくは波長域６４５～６８０ｎｍ、例えば６６０ｎｍ付近にピーク波長を有する光であってよい。白色光と赤色光の照射は、白色光と赤色光を、同程度の光強度（光量子束密度）で、例えば、それぞれ、１０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、好ましくは３０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より好ましくは３０～１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、特に好ましくは４０～７０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓで、例えば５０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓで、好ましくは同時に、緑藻細胞に照射するものであってよい。白色光と赤色光の照射について、同程度の光強度（光量子束密度）とは、白色光の光強度：赤色光の光強度＝１：１．２～１．２：１、好ましくは１：１．１～１．１：１、特に好ましくは１：１であることを意味する。合計で同じ光強度であっても、白色光のみの照射よりも、白色光と赤色光の照射（好ましくは、同時照射）の方が色素産生を促進することができる。
【0035】
本発明の緑藻細胞の培養は、静置培養によって又は攪拌しながら培養することによって行うことが好ましい。本発明に関して培養の際に行う「攪拌」は、物理的操作により、細胞を含む培地（通常は、液体培地）をかき混ぜることを意味する。攪拌しながらの培養の例としては、例えば、振とう培養、撹拌子を用いた撹拌培養、高圧空気を利用した曝気攪拌を伴う培養などが挙げられるが、これらに限定されない。振とう培養は、レシプロ式振とう培養、又は揺動式振とう培養であってよいが、それに限定されない。
【0036】
本発明の緑藻細胞の培養は、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で行ってもよいが、ＣＯ２ガス供給下で行ってもよい。本発明の緑藻細胞は、空気（０．０４％ ＣＯ２）若しくはＣＯ２ガス（０．０４％超のＣＯ２濃度、例えば１％以上又は１．５％以上、好ましくは２％以上、かつ、好ましくは２０％以下、より好ましくは２～１０％、例えば、０．０４％超～２０％、０．０４％超～１５％、１.５～１５％、１.５～１０％、１.５～６％、２～６％、１.５～４％、又は２～４％、典型的には２％のＣＯ２ガス）を液体培地に吹き込むなどして供給しながら培養してもよいし、又は、大気中若しくはＣＯ２ガス（０．０４％超のＣＯ２濃度、例えば１％以上又は１．５％以上、好ましくは２％以上、かつ、好ましくは２０％以下、より好ましくは２～１０％、例えば、０．０４％超～２０％、０．０４％超～１５％、１.５～１５％、１.５～１０％、１.５～６％、２～６％、１.５～４％、又は２～４％、典型的には２％のＣＯ２ガス）充填下で静置培養又は攪拌しながら培養（振とう培養など；好ましくは３０～１００ｒｐｍ、例えば３０～５０ｒｐｍ、好ましくは４０ｒｐｍの速度で行うことができる）してもよい。なおＣＯ２（二酸化炭素）ガスの濃度％は、本発明について、ｖ／ｖ％（すなわち、体積／体積％）を意味する。培養時にＣＯ２ガスを供給するなどして高濃度ＣＯ２下に菌体培地を置く（曝露する）ことにより、本発明の緑藻細胞の増殖（生育）を促進することができる。
【0037】
本発明の緑藻細胞の培養では脂質が生産され細胞内に蓄積される。本明細書で用いる場合、用語「脂質」は、遊離脂肪酸、及び脂肪酸とアルコールのエステルを包含する。脂肪酸とアルコールのエステルとしては、例えば、アシルグリセロール及びワックスエステルが挙げられる。アシルグリセロールは、脂肪酸とグリセロールがエステル結合した化合物を指し、１分子のグリセロールに３分子の脂肪酸がエステル結合した「トリアシルグリセロール」（ＴＡＧ；中性脂肪）、１分子のグリセロールに２分子の脂肪酸がエステル結合した「ジアシルグリセロール」、及び１分子のグリセロールに１分子の脂肪酸がエステル結合した「モノアシルグリセロール」が挙げられる。本明細書において「ワックスエステル」とは、脂肪酸と脂肪アルコールがエステル結合した化合物を指す。本発明において、用語「脂肪酸」は、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸を包含する。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、中性脂肪（ＴＡＧ）、ワックスエステル（ＷＥ）、ジアシルグリセロール（ＤＧ）、及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てを含み得る。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、脂質組成比率において、中性脂肪を最も高い組成比率で含むことが好ましい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、脂質組成比率において、中性脂肪を最も高い組成比率で含み、ワックスエステルを中性脂肪よりも低い組成比率で含むことが好ましい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、脂質組成比率において、中性脂肪を最も高い組成比率で含み、ワックスエステルを中性脂肪よりも低い組成比率で含み、さらに、ジアシルグリセロールをワックスエステルよりも低い組成比率で含むことが好ましい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、脂質組成比率において、中性脂肪を最も高い組成比率で含み、ワックスエステルを中性脂肪よりも低い組成比率で含み、ジアシルグリセロールをワックスエステルよりも低い組成比率で含み、さらに、遊離脂肪酸をジアシルグリセロールよりも低い組成比率で含むことが好ましい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、脂質組成比率で、少なくとも４０ｗ／ｗ％、好ましくは、少なくとも５０ｗ／ｗ％、より好ましくは、少なくとも７０ｗ／ｗ％の中性脂肪を含み得るが、中性脂肪のその脂質組成比率は、好ましくは９０ｗ／ｗ％以下、より好ましくは８０ｗ／ｗ％以下、例えば７０ｗ／ｗ％以下であってよく、例えば４０～９０ｗ／ｗ％、４０～７０ｗ／ｗ％、５０～９０ｗ／ｗ％、５０～８０ｗ／ｗ％、５０～７０ｗ／ｗ％、７０～９０ｗ／ｗ％、又は７０～８０ｗ／ｗ％であってもよい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、脂質組成比率で、少なくとも５０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも７０ｗ／ｗ％、例えば５０～８０ｗ／ｗ％又は７０～８０ｗ／ｗ％）の中性脂肪、少なくとも１２ｗ／ｗ％（好ましくは１８ｗ／ｗ％以下、例えば１２～３０ｗ／ｗ％又は１２～１８ｗ／ｗ％）のワックスエステル、少なくとも７ｗ／ｗ％（好ましくは９ｗ／ｗ％以下、例えば７～１１ｗ／ｗ％又は７～９ｗ／ｗ％）のジアシルグリセロール、及び少なくとも１ｗ／ｗ％（好ましくは３ｗ／ｗ％以下、例えば１～６ｗ／ｗ％）の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を含み得る。本発明において「脂質」は、脂質組成物であってよい。
【0038】
本発明において、「脂質組成比率」とは、脂質総量中の各脂質化合物の比率（％）を意味する。脂質組成比率は、脂質総量の重量と各脂質化合物の重量に基づいてｗ／ｗ％で表すことができる。あるいは、脂質組成比率（％）は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で観察された脂質に相当するバンドの濃さをイメージングアナライザーにより画像解析した結果に基づいて数値化することもでき、それによって、重量測定値から算出されるｗ／ｗ％値に近似した脂質組成比率（％）を得ることができる。
【0039】
本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、炭素数１６の脂肪酸（飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸）と炭素数１８の脂肪酸（飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸）からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含み、好ましくは、炭素数１６の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸と炭素数１８の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸とを含む。本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、炭素数１４、２０、２２又は２４以上の脂肪酸（飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸）の少なくとも１つをさらに含んでもよい。本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、好ましくは、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、及びリノレン酸（Ｃ１８：３）からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む。本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、特に、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、及びリノレン酸（Ｃ１８：３）からなる群から選択される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は５つ全ての脂肪酸を含むことが好ましい。そのような脂質は、別の脂肪酸、例えば、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、Ｃ１６：２脂肪酸、Ｃ１６：３脂肪酸、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、及び／又はアラキドン酸（Ｃ２０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）などを、さらに含んでもよい。本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、上記の脂肪酸を、脂質化合物の構成要素、及び／又は遊離脂肪酸として含み得る。なお本明細書において、脂肪酸及び脂肪酸メチルエステル（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒｓ、ＦＡＭＥｓ）の表記において「Ｃｘ：ｙ」とは、炭素原子数がｘ個で、二重結合数がｙ個であることを表す。
【0040】
好ましい実施形態では、本発明の緑藻細胞、例えばその朱色細胞又は緑色細胞により、生産され細胞内に蓄積される脂質は、炭素数１６の脂肪酸及び炭素数１８の脂肪酸、特に、パルミチン酸及びオレイン酸を高い脂肪酸組成比率で含む。本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、脂肪酸組成比率で少なくとも２０ｗ／ｗ％（好ましくは少なくとも２５ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも２８ｗ／ｗ％、例えば２５～３５ｗ／ｗ％）のパルミチン酸及び少なくとも２８ｗ／ｗ％（好ましくは少なくとも３３ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも３５ｗ／ｗ％、例えば３３～４３ｗ／ｗ％）のオレイン酸を含むことが好ましい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、脂肪酸組成比率で少なくとも２５ｗ／ｗ％のパルミチン酸及び少なくとも３３ｗ／ｗ％のオレイン酸を含むことが好ましい。本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質は、脂肪酸組成比率でパルミチン酸とオレイン酸の合計で少なくとも４８ｗ／ｗ％、好ましくは少なくとも５８ｗ／ｗ％、例えば少なくとも６３ｗ／ｗ％となる量のパルミチン酸及びオレイン酸を含むことが好ましい。本発明において、脂質の脂肪酸組成比率は、脂質に含まれる脂肪酸総量中の各脂肪酸の比率（％）を意味する。脂肪酸組成比率は、脂質中の全脂肪酸をメチルエステル化して得た脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥｓ）の組成比率で表すこともできる。脂肪酸組成比率は、脂肪酸総量（又はＦＡＭＥｓ総量）の重量と各脂肪酸（又は各脂肪酸メチルエステル）の重量に基づいてｗ／ｗ％で表すことができる。あるいは、脂肪酸組成比率（％）は、イメージングアナライザーを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）画像のバンドの濃さの測定のような画像解析の結果に基づいて算出することもでき、それによって、重量測定値から算出されるｗ／ｗ％値に近似した脂肪酸組成比率（％）を得ることができる。本発明の緑藻細胞由来の脂質、例えば、脂質抽出物は、パルミチン酸及びオレイン酸を、従来のコーラストレラ由来ものと比較して顕著に多い量で含み、特に食品や飼料での使用に適している。
【0041】
本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質の上記組成及び組成比率は、本発明の緑藻細胞由来の脂溶性成分抽出物においても同様である。
【0042】
本発明の緑藻細胞の培養では色素が生産され細胞内に蓄積される。植物や微生物が生産され細胞内に蓄積される色素は、脂溶性色素と水溶性色素に大別される。本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される色素は、主として脂溶性色素である。脂溶性色素は、クロロフィルとカロテノイドに大別される。カロテノイドはカロテノイド生合成経路により生成される黄色～赤色を呈する各種の赤系色素であり、Ｃ４０Ｈ５６を基本骨格として有する。カロテノイドとしては、βカロテノイドと称される、βカロテン、エキネノン、及びカンタキサンチン、並びに、キサントフィル群の一つであるアスタキサンチンが挙げられるが、それらに限定されない。一方、クロロフィルの例としては、例えばクロロフィルａ、及びクロロフィルｂが挙げられるが、それらに限定されない。クロロフィルは、いずれもテトラピロール環を基本骨格としている。
【0043】
本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される色素は、クロロフィルを含む緑系色素及び／又はカロテノイドを含む赤系色素を含む。本発明の緑藻細胞（例えば、朱色細胞（赤色相）又は緑色細胞（緑色相））により生産され細胞内に蓄積される色素は、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのカロテノイドを含むものであってよい。本発明の緑藻細胞（例えば、朱色細胞（赤色相）又は緑色細胞（緑色相））により生産され細胞内に蓄積される色素は、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てのカロテノイドを含むものであってよく、さらに、そのカロテノイドはエキネノン及び／又はカンタキサンチンを少なくとも含むことが好ましい。本発明の緑藻細胞（例えば、朱色細胞（赤色相）又は緑色細胞（緑色相））により生産され細胞内に蓄積される色素は、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てのカロテノイド、例えば、エキネノン、カンタキサンチン及びアスタキサンチンを含み、それに加えて、クロロフィルａ及び／又はクロロフィルｂを含むものであってもよい。本発明において「色素」は、色素組成物であってよい。
【0044】
本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される色素は、脂溶性色素組成比率において、カロテノイドの中で、カンタキサンチンを最も高い組成比率で含むことが好ましい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される色素は、脂溶性色素組成比率において、カロテノイドの中で、カンタキサンチンを最も高い組成比率で含み、エキネノンをカンタキサンチンよりも低い組成比率で含むことが好ましい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される色素は、脂溶性色素組成比率において、カロテノイドの中で、カンタキサンチンを最も高い組成比率で含み、エキネノンをカンタキサンチンよりも低い組成比率で含み、さらに、アスタキサンチンをエキネノンよりも低い組成比率で含むことが好ましい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される色素は、脂溶性色素組成比率において、カロテノイドの中で、カンタキサンチンを最も高い組成比率で含み、エキネノンをカンタキサンチンよりも低い組成比率で含み、アスタキサンチンをエキネノンよりも低い組成比率で含み、さらに、βカロテンをアスタキサンチンよりも低い組成比率で含むことが好ましい。本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される色素は、脂溶性色素組成比率において、クロロフィルａをクロロフィルｂよりも高い組成比率で含むことが好ましい。
【0045】
本発明の緑藻細胞の、特に朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素は、カロテノイドを含み、好ましくは、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのカロテノイドを含み、特に好ましくは、エキネノン、又はエキネノンとカンタキサンチンとを含み、場合により、さらにβカロテンを含んでもよい。本発明の緑藻細胞の、特に朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素は、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てのカロテノイドを含んでもよい。本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、カンタキサンチンとエキネノンを主成分とすることが好ましい。本発明において「カンタキサンチンとエキネノンを主成分とする」とは、本発明の緑藻細胞内に蓄積した色素（特に、脂溶性色素）の中でカンタキサンチンとエキネノンがそれぞれ占める割合（組成比率）が構成色素の中で第１位又は第２位に位置づけられることを意味する。なおカンタキサンチンの組成比率が第１位でエキネノンの組成比率が第２位であってもよいし、その逆であってもよいし、両者が同比率で第１位であってもよいが、カンタキサンチンの組成比率が第１位であることが特に好ましい。
【0046】
一実施形態では、本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも１０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも１２ｗ／ｗ％又は少なくとも３０ｗ／ｗ％、例えば１０～４３ｗ／ｗ％）のエキネノン、及び少なくとも３０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも４０ｗ／ｗ％又は少なくとも４５ｗ／ｗ％、例えば３０～５７ｗ／ｗ％）のカンタキサンチンを含み得る。一実施形態では、本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも３０ｗ／ｗ％（好ましくは、例えば３０～４３ｗ／ｗ％）のエキネノン、及び少なくとも４５ｗ／ｗ％（好ましくは、例えば４５～５７ｗ／ｗ％）のカンタキサンチンを含み得る。一実施形態では、本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも３５ｗ／ｗ％のエキネノン、及び少なくとも５０ｗ／ｗ％のカンタキサンチンを含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、脂溶性色素組成比率でエキネノンとカンタキサンチンの合計で少なくとも４０ｗ／ｗ％、好ましくは少なくとも５０ｗ／ｗ％又は少なくとも５２ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも７０ｗ／ｗ％又は少なくとも７５ｗ／ｗ％、さらに好ましくは少なくとも８０ｗ／ｗ％又は少なくとも８５ｗ／ｗ％、例えば少なくとも９０ｗ／ｗ％となる量のエキネノンとカンタキサンチンを含むことができる。
【0047】
本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、上記の脂溶性色素組成比率のエキネノン及びカンタキサンチン、例えば、脂溶性色素組成比率で、少なくとも１０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも１２ｗ／ｗ％又は少なくとも３０ｗ／ｗ％）のエキネノン、及び少なくとも３０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも４０ｗ／ｗ％又は少なくとも４５ｗ／ｗ％）のカンタキサンチンを含んでもよく、場合により、それに加えて脂溶性色素組成比率で少なくとも３ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも１０ｗ／ｗ％又は少なくとも５ｗ／ｗ％）のアスタキサンチンを含んでもよい。
【0048】
一実施形態では、本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも５５ｗ／ｗ％、好ましくは少なくとも６５ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも７０ｗ／ｗ％又は少なくとも７５ｗ／ｗ％、さらに好ましくは少なくとも８０ｗ／ｗ％又は少なくとも９０ｗ／ｗ％のカロテノイド（カロテノイド総量）を含んでもよい。
【0049】
本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、カロテノイドに加えて、クロロフィル、例えばクロロフィルａ及び／又はクロロフィルｂを含んでもよい。その場合、本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、脂溶性色素組成比率で、３０ｗ／ｗ％未満、好ましくは１０ｗ／ｗ％未満、より好ましくは５ｗ／ｗ％未満、さらに好ましくは３ｗ／ｗ％未満、特に好ましくは１ｗ／ｗ％未満又は０．５ｗ／ｗ％未満のクロロフィル（クロロフィル総量）を含み得る。一実施形態では、そのようなクロロフィル量は、脂溶性色素組成比率で、例えば０．０１ｗ／ｗ％以上であってよく、０．０１ｗ／ｗ％以上であり３０ｗ／ｗ％未満であってよい。
【0050】
本発明の緑藻細胞、特にその朱色細胞（赤色相）によるカロテノイド蓄積量（カロテノイド生産量）は、乾燥菌体重量（ＤＣＷ）に対し、少なくとも２０ｗ/ｗ％、好ましくは少なくとも３０ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも３５ｗ／ｗ％のカロテノイド（カロテノイド総量）であることが好ましい。
【0051】
本発明の緑藻細胞の朱色細胞（赤色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、カロテノイドとクロロフィル以外の赤系色素及び／又は緑系色素などの色素をさらに含んでもよい。
【0052】
一方、本発明の緑藻細胞の緑色細胞（緑色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、クロロフィルを含み、好ましくは、クロロフィルａ及び／又はクロロフィルｂ、例えば、クロロフィルａ、又は、クロロフィルａ及びクロロフィルｂを含む。本発明の緑藻細胞の緑色細胞（緑色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、クロロフィルに加えて、カロテノイド（例えば、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てのカロテノイドを含む）を含んでもよい。本発明の緑藻細胞の緑色細胞（緑色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、クロロフィルａ及び／又はクロロフィルｂを含むクロロフィルを主成分とする。本発明において「クロロフィルを主成分とする」とは、本発明の緑藻細胞内に蓄積した色素（特に、脂溶性色素）の中でクロロフィルが占める割合（クロロフィルａ及びクロロフィルｂの少なくとも一方のクロロフィルの組成比率）が、カロテノイドが占める割合（βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンなどのそれぞれの組成比率）や他の色素（もし存在する場合）が占める割合（他の色素の組成比率）と比較して高いことを意味する。一実施形態では、本発明の緑藻細胞、特にその緑色細胞（緑色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも４０ｗ／ｗ％、好ましくは少なくとも５０ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも５２ｗ／ｗ％のクロロフィル（クロロフィル総量）を含んでもよい。一実施形態では、本発明の緑藻細胞、特にその緑色細胞（緑色相）により生産され細胞内に蓄積される色素（特に、脂溶性色素）は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも４０ｗ／ｗ％（好ましくは少なくとも５０ｗ／ｗ％）のクロロフィル（クロロフィル総量）、及び３０ｗ／ｗ％未満（好ましくは２０ｗ／ｗ％未満）のカロテノイド（カロテノイド総量）を含んでもよい。
【0053】
本発明において、「脂溶性色素組成比率」とは、脂溶性色素総量中の各脂溶性色素の比率（％）を意味する。脂溶性色素組成比率は、脂溶性色素総量の重量と各脂溶性色素の重量に基づいてｗ／ｗ％で表すことができる。あるいは、脂溶性色素組成比率（％）は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上の脂溶性色素に相当するバンドの濃さをイメージングアナライザーを用いて画像解析した結果に基づいて数値化することもでき、それによって、重量測定値から算出されるｗ／ｗ％値に近似した脂溶性色素組成比率（％）を得ることができる。
【0054】
本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される色素の上記組成及び組成比率は、本発明の緑藻細胞由来の脂溶性成分抽出物においても同様である。
【0055】
なお本発明に関して、ｗ／ｗ％は重量／重量％を意味し、ｗ／ｖ％は重量／体積％を意味する。
【0056】
一実施形態では、本発明の緑藻細胞を、ＢＩＣ条件（Ｂａｓａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；基本誘導条件）下、又はＳＣＣ条件（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；標準培養条件）下で培養することができる。ＢＩＣ条件下では、本発明の緑藻細胞を、液体培地で、光照射しながら、高濃度ＣＯ２下（例えば、１．５～２０％ ＣＯ２下、好ましくは１．５～６％ ＣＯ２下、より好ましくは２～４％ ＣＯ２下、典型的には２％ ＣＯ２下）で攪拌しながら培養することにより、本培養を実施する。ＳＣＣ条件下では、本発明の緑藻細胞を、固形培地又は液体培地で、光照射しながら、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）又は高濃度ＣＯ２下（例えば、１．５～２０％ ＣＯ２下、より好ましくは２～４％ ＣＯ２下、典型的には２％ ＣＯ２下）で静置培養することにより、本培養を実施する。
【0057】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明の緑藻細胞を、希釈ＢＧ１１液体培地で、ＣＯ２ガス供給下（例えば、１．５～２０％ ＣＯ２下、典型的には２％ ＣＯ２下）、白色光を照射、又は白色光と赤色光を照射（好ましくは、同時照射）しながら少なくとも５日間、攪拌しながら培養することにより、緑藻細胞をより短期間で、緑色相から赤色相に移行させることができる。ここで、希釈ＢＧ１１液体培地は、好ましくは２～１０倍、より好ましくは３～７倍、さらに好ましくは４～６倍、特に好ましくは５倍に希釈したＢＧ１１液体培地（０．２ＢＧ１１液体培地）であってよい。ＣＯ２ガスは、１.５％以上、好ましくは２％以上、かつ、好ましくは２０％以下、より好ましくは２～１０％、例えば１.５～１０％、１.５～６％、２～６％、１.５～４％、又は２～４％、典型的には２％のＣＯ２濃度で供給すればよい。培養は、振とう培養などの、攪拌しながらの培養で行うことが好ましく、好ましくは３０～１００ｒｐｍ、好ましくは３０～５０ｒｐｍ、例えば４０ｒｐｍの速度で振とう培養することができる。培養は２９℃以上の培養温度で特に好適に行うことができ、好ましくは３０℃以上、例えば２９～５０℃、より好ましくは３０～５０℃、さらに好ましくは３０～４５℃、特に好ましくは３０～４２℃、典型的には３０℃で行うことができる。白色光は、より強光条件下、好ましくは７０～３００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より好ましくは７０～２００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、さらに好ましくは７０～１５０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、例えば１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓで照射することができるが、それに限定されない。白色光と赤色光の照射には、ＬＥＤ白色光とＬＥＤ赤色光を用いることが好ましい。白色光と赤色光をそれぞれ、好ましくは３０～１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より好ましくは４０～７０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、例えば５０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓで照射（好ましくは混合照射）することができるが、それに限定されない。培養期間は、少なくとも５日間、例えば、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、又は１１日間以上（例えば、５日間～１年間又はそれ以上、５日間～２００日間、５日間～１２０日間、５日間～９０日間、５日間～５０日間、又は５日間～３０日間）であってよく、５日間～１０日間、又は６日間～１５日間であってもよい。本発明の緑藻細胞を高濃度ＣＯ２下（好ましくは、１．５％以上又は２％以上のＣＯ２ガス供給下）、希釈ＢＧ１１液体培地（栄養源低減下）で白色光、又は白色光と赤色光を照射しつつ、攪拌しながら培養することにより、当該細胞の緑色相から赤色相への移行時期を顕著に早めることができ、本発明の緑藻細胞を培養開始から短期間（例えば、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、又は１０日間）のうちに朱色細胞に変化させ、カロテノイドと脂質を高生産させて細胞内にそれらを蓄積させることができる。このような培養方法により本発明の緑藻細胞内に蓄積する色素は、好ましくは、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンを含み、より好ましくは、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンを含み、場合により、さらにクロロフィル（クロロフィルａ及び／又はクロロフィルｂ、例えば、クロロフィルａ）を含む。好ましい一実施形態では、このような培養方法により本発明の緑藻細胞内に蓄積する色素は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも１０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも１２ｗ／ｗ％）のエキネノン、及び少なくとも３０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも４０ｗ／ｗ％）のカンタキサンチンを含み得るが、場合により、さらに少なくとも３ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも１０ｗ／ｗ％）のアスタキサンチンを含み得る。
【0058】
本発明の別の好ましい一実施形態では、本発明の緑藻細胞を、固形培地、好ましくはＢＧ１１固形培地又は希釈ＢＧ１１固形培地で、白色光と赤色光を照射（好ましくは同時照射）しながら少なくとも２６日間培養することにより、緑藻細胞を固形培地での培養としてはかなり短期間で、緑色相から赤色相に移行させることができる。ここで、固形培地は、寒天培地であってよいが、それに限定されない。希釈ＢＧ１１固形培地は、好ましくは２～１０倍、より好ましくは３～７倍、さらに好ましくは４～６倍、特に好ましくは５倍に希釈したＢＧ１１液体培地（０．２ＢＧ１１液体培地）を固形化した培地（例えば寒天培地）であってよい。希釈ＢＧ１１固形培地よりもＢＧ１１固形培地を使用する方が、細胞量（バイオマス量）の増加には有利である。白色光と赤色光の照射には、ＬＥＤ白色光とＬＥＤ赤色光を用いることが好ましい。白色光と赤色光はそれぞれ、好ましくは３０～１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、より好ましくは４０～７０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ、例えば５０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓで照射（好ましくは混合照射）することができるが、それに限定されない。培養は、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で行ってもよいが、ＣＯ２ガス供給下（例えば、１．５～２０％ ＣＯ２下、典型的には２％ ＣＯ２下）で行ってもよい。ＣＯ２ガスは、以下に限定されないが、０．０４％超、例えば１％以上又は１．５％以上、好ましくは２％以上、かつ、好ましくは２０％以下、より好ましくは２～１０％、例えば、０．０４％超～２０％、０．０４％超～１５％、１.５～１５％、１.５～１０％、１.５～６％、２～６％、１.５～４％、又は２～４％、典型的には２％のＣＯ２濃度で供給すればよい。培養は好ましくは静置培養である。培養は２９℃以上の培養温度で特に好適に行うことができ、好ましくは３０℃以上、例えば２９～５０℃、より好ましくは３０～５０℃、さらに好ましくは３０～４５℃、特に好ましくは３０～４２℃、典型的には３０℃で行うことができる。培養期間は、少なくとも２６日間、例えば、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、又は３１日間以上（例えば、２６日間～５０日間、２６日間～９０日間、２６日間～１２０日間、２６日間～２００日間、２６日間～１年間又はそれ以上）であってよく、好ましい例として２６日間～５０日間であってもよい。本発明の緑藻細胞を、ＢＧ１１固形培地又は希釈ＢＧ１１固形培地などの固形培地で、白色光と赤色光を照射しながら培養することにより、一般に物質生産に時間を要する固形培地においても、当該細胞の緑色相から赤色相への移行時期を顕著に早めることができ、本発明の緑藻細胞を培養開始から短期間で朱色細胞に変化させ、カロテノイドと脂質を高生産させて細胞内にそれらを蓄積させることができる。このような培養方法により本発明の緑藻細胞内に蓄積する色素は、好ましくは、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンを含み、より好ましくは、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンを含み、場合により、さらにクロロフィル（クロロフィルａ及び／又はクロロフィルｂ、例えば、クロロフィルａ）を含む。好ましい一実施形態では、このような培養方法により本発明の緑藻細胞内に蓄積する色素は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも３０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも３５ｗ／ｗ％）のエキネノン、及び少なくとも４０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも４５ｗ／ｗ％）のカンタキサンチンを含み得るが、場合により、さらに少なくとも３ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも５ｗ／ｗ％）のアスタキサンチンを含み得る。
【0059】
本発明では、本発明の緑藻細胞の上記のような培養方法を用いて、脂質や色素を製造することができる。本発明は、本発明の緑藻細胞を培養し、好ましくは、２９℃以上で培養し、細胞内に蓄積された脂質及び／又は色素を回収することを含む、脂質及び／又は色素の製造方法にも関する。本発明は、本発明の緑藻細胞を培養し、細胞内に蓄積された脂質を回収することを含む、脂質の製造方法にも関する。本発明は、本発明の緑藻細胞を培養し、細胞内に蓄積された色素を回収することを含む、色素の製造方法にも関する。さらに本発明は、本発明の緑藻細胞を培養し、細胞内に蓄積された脂質及び色素の両方を回収することを含む、脂質及び色素の製造方法にも関する。本発明の緑藻細胞の培養条件や培養方法は上述のとおりである。
【0060】
本発明の方法において本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積された脂質は、当技術分野で公知の任意の脂質回収方法によって回収することができる。例えば、本発明の緑藻細胞又はその細胞破砕物に有機溶媒を加え、脂質を抽出し、さらにＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）等を行い、脂質抽出物を分離することにより、脂質を回収することができる。抽出には、例えば、ジエチルエーテル、エタノール、メタノール、クロロホルム、ギ酸、酢酸エチル、ヘキサン、ブタノール、又はそれらのいずれかの混合物等の有機溶媒を使用することができる。回収した脂質は、常法によりさらに精製してもよい。
【0061】
本発明の方法において細胞内に生産され蓄積された色素は、当技術分野で公知の任意の色素化合物の回収方法によって回収することができる。好ましい実施形態では、本発明の緑藻細胞内に生産され蓄積された脂溶性色素は、当技術分野で公知の任意の脂溶性色素の回収方法によって回収することができる。例えば、本発明の緑藻細胞又はその細胞破砕物に有機溶媒を加え、脂溶性色素を抽出し、さらに遠心分離（例えば、８，０００ｇで１０分）やＨＰＬＣ等を行い、脂溶性色素抽出物を分離することにより、色素（脂溶性色素）を回収することができる。抽出には、例えば、ジエチルエーテル、エタノール、メタノール、クロロホルム、ギ酸、酢酸エチル、ヘキサン、ブタノール、又はそれらのいずれかの混合物等の有機溶媒を使用することができる。回収した色素は、常法によりさらに精製してもよい。
【0062】
本発明の脂質及び／又は色素の製造方法によれば、本発明の緑藻細胞（例えばその朱色細胞又は緑色細胞）により生産され細胞内に蓄積される脂質として上述された脂質、及び／又は、本発明の緑藻細胞（例えばその朱色細胞又は緑色細胞）により生産され細胞内に蓄積される色素として上述された色素を取得することができる。
【0063】
本発明の方法では、好ましくは、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、及びリノレン酸（Ｃ１８：３）からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を（脂質化合物の構成要素及び／又は遊離脂肪酸として）含む脂質（例えば、脂質抽出物）を取得することができる。一実施形態では、本発明の方法により、脂肪酸組成比率で少なくとも２５ｗ／ｗ％のパルミチン酸及び少なくとも３３ｗ／ｗ％のオレイン酸を含む脂質（例えば、脂質抽出物）を取得することができる。本発明の方法で得られる脂質、例えば、脂質抽出物は、食品原料、例えば代替肉の原料として有用である。本発明の方法で得られる脂質の組成や特性などは、本段落の記載のみに限定されず、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質について上述したとおりである。
【0064】
本発明の方法では、カロテノイド、好ましくは、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのカロテノイド（例えば、エキネノン及び／又はカンタキサンチン）を含む色素を取得することができる。一実施形態では、本発明の方法により、βカロテン、エキネノン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てのカロテノイド（例えば、エキネノン及び／又はカンタキサンチンを少なくとも含むことが好ましい）を含む色素を取得することができる。一実施形態では、本発明の方法により、脂溶性色素組成比率で少なくとも１０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも１２ｗ／ｗ％又は少なくとも３０ｗ／ｗ％）のエキネノン、少なくとも３０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも４０ｗ／ｗ％又は少なくとも４５ｗ／ｗ％）のカンタキサンチン、及び少なくとも３ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも１０ｗ／ｗ％又は少なくとも５ｗ／ｗ％）のアスタキサンチンを含む色素を取得することができる。本発明の方法では、さらにクロロフィル（例えば、クロロフィルａ及び／又はクロロフィルｂ）を含む色素を取得することができる。本発明の方法で得られる色素（例えば、脂溶性色素）の組成や特性などは、本段落の記載のみに限定されず、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される色素について上述したとおりである。
【0065】
また、本発明の方法において細胞内に生産され蓄積された脂質及び色素は、当技術分野で公知の任意の脂溶性成分抽出方法によって、脂溶性成分抽出物として取得することができる。例えば、本発明の緑藻細胞又はその細胞破砕物に有機溶媒を加え、脂溶性成分を抽出し、脂溶性画分を分離することにより、脂質及び色素を含む脂溶性成分抽出物を取得することができる。抽出には、例えば、ジエチルエーテル、エタノール、メタノール、クロロホルム、ギ酸、酢酸エチル、ヘキサン、ブタノール、又はそれらのいずれかの混合物等の有機溶媒を使用することができる。取得した脂溶性成分抽出物は、常法によりさらに精製してもよい。本発明の緑藻細胞から得られるそのような脂溶性成分抽出物（本発明の緑藻細胞由来の脂溶性成分抽出物）は、色素としてカロテノイド及び／又はクロロフィルを含む。本発明の方法で得られる脂溶性成分抽出物に含まれる脂質及び色素（例えば、脂溶性色素）の組成や特性などは、本発明の緑藻細胞により生産され細胞内に蓄積される脂質又は色素について上述したとおりである。
【0066】
３）脂溶性成分抽出物とその用途
本発明は、上記のようにして取得可能な、本発明の緑藻細胞（例えばその朱色細胞及び／又は緑色細胞）由来の脂溶性成分抽出物にも関する。本発明の脂溶性成分抽出物は、脂質及び色素（脂溶性色素）を含む。本発明の脂溶性成分抽出物はカロテノイド及び／又はクロロフィルを含む色素を含むことが好ましい。また、本発明の脂溶性成分抽出物は、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む脂質を含むことが好ましい。
本発明は、上記のようにして取得可能な、本発明の緑藻細胞（例えばその朱色細胞及び／又は緑色細胞）由来の脂溶性成分抽出物にも関する。本発明の脂溶性成分抽出物は、脂質及び色素（脂溶性色素）を含む。本発明の脂溶性成分抽出物はカロテノイド及び／又はクロロフィルを含む色素を含むことが好ましい。また、本発明の脂溶性成分抽出物は、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む脂質を含むことが好ましい。
【0067】
一実施形態では、本発明の脂溶性成分抽出物は、脂溶性色素として、エキネノンとカンタキサンチンを主成分とするものであり得る。そのような脂溶性成分抽出物は、好ましくは、本発明の緑藻細胞の朱色細胞（赤色相）に由来するものであり得る。別の実施形態では、本発明の脂溶性成分抽出物は、脂溶性色素として、クロロフィルを主成分とするものであり得る。そのような脂溶性成分抽出物は、好ましくは、本発明の緑藻細胞の緑色細胞（緑色相）に由来するものであり得る。
【0068】
一実施形態では、本発明の脂溶性成分抽出物（特に、朱色細胞由来）は、脂溶性色素組成比率で、エキネノンとカンタキサンチンの合計で少なくとも４０ｗ／ｗ％、好ましくは少なくとも５０ｗ／ｗ％又は５２ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも７０ｗ／ｗ％又は少なくとも７５ｗ／ｗ％、さらに好ましくは少なくとも８０ｗ／ｗ％又は少なくとも８５ｗ／ｗ％、例えば少なくとも９０ｗ／ｗ％となる量のエキネノンとカンタキサンチンを含むものであり得る。一実施形態では、本発明の脂溶性成分抽出物は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも１０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも１２ｗ／ｗ％又は少なくとも３０ｗ／ｗ％）のエキネノン、及び少なくとも３０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも４０ｗ／ｗ％又は少なくとも４５ｗ／ｗ％）のカンタキサンチンを含み、場合により、それに加えて脂溶性色素組成比率で少なくとも３ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも１０ｗ／ｗ％又は少なくとも５ｗ／ｗ％）のアスタキサンチンを含み得る。特に好ましい一実施形態では、本発明の脂溶性成分抽出物は、少なくとも３０ｗ／ｗ％のエキネノン、少なくとも４５ｗ／ｗ％のカンタキサンチン、及び少なくとも３ｗ／ｗ％のアスタキサンチンを含むものであり得る。また、本発明の脂溶性成分抽出物は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも５５ｗ／ｗ％、好ましくは少なくとも６５ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも７０ｗ／ｗ％又は少なくとも７５ｗ／ｗ％、さらに好ましくは少なくとも８０ｗ／ｗ％又は少なくとも９０ｗ／ｗ％のカロテノイド（カロテノイド総量）を含むものであり得る。
【0069】
別の実施形態では、本発明の脂溶性成分抽出物（特に、緑色細胞由来）は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも４０ｗ／ｗ％、好ましくは少なくとも５０ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも５２ｗ／ｗ％のクロロフィル（クロロフィル総量）を含むものであり得る。一実施形態では、本発明の脂溶性成分抽出物は、脂溶性色素組成比率で、少なくとも４０ｗ／ｗ％（好ましくは少なくとも５０ｗ／ｗ％）のクロロフィル（クロロフィル総量）、及び３０ｗ／ｗ％未満（好ましくは２０ｗ／ｗ％未満）のカロテノイド（カロテノイド総量）を含んでもよい。
【0070】
一実施形態では、本発明の脂溶性成分抽出物は、脂肪酸組成比率で少なくとも２０ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも２５ｗ／ｗ％）のパルミチン酸及び少なくとも２８ｗ／ｗ％（好ましくは、少なくとも３３ｗ／ｗ％）のオレイン酸を含む脂質を含むものであり得る。一実施形態では、本発明の脂溶性成分抽出物は、脂肪酸組成比率でパルミチン酸とオレイン酸の合計で少なくとも４８ｗ／ｗ％（好ましくは少なくとも５８ｗ／ｗ％）となる量のパルミチン酸及びオレイン酸を含むものであり得る。
【0071】
本発明の脂溶性成分抽出物は、本発明の緑藻細胞の朱色細胞又は緑色細胞のいずれに由来するものであっても高い抗酸化能と高い抗炎症能を有する。したがって本発明は、本発明の脂溶性成分抽出物、又はその脂溶性成分抽出物が由来する本発明の緑藻細胞を（有効成分として）含む、抗酸化剤又は抗炎症剤も提供する。本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤は組成物であり得る。一実施形態では、本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤は、抗酸化効果又は抗炎症効果を試料、細胞又は組織などにもたらすための試薬であってもよい。別の実施形態では、本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤は、抗酸化作用又は抗炎症作用を組成物に付与するために用いる添加剤であってもよく、その添加剤は食品、飼料、化粧品、又は医薬品などに添加（配合）することができる。
【0072】
本発明はまた、本発明の緑藻細胞、又は本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）を含む、食品、飼料、化粧品、及び医薬品も提供する。ここで用いる本発明の緑藻細胞は、朱色細胞又は緑色細胞のいずれであってもよいが、脂質及び色素を細胞内に蓄積しており、特に、色素としてカロテノイド及び／又はクロロフィルを細胞内に蓄積しているものである。本発明の緑藻細胞、又は本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）を含む、食品、飼料、化粧品、及び医薬品は、抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすための（抗酸化用又は抗炎症用の）食品、飼料、化粧品、及び医薬品であってもよい。さらに本発明は、本発明の緑藻細胞、又は本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）を用いて、食品、飼料、化粧品、及び医薬品を製造することを含む、食品、飼料、化粧品、及び医薬品の製造方法も提供する。
【0073】
本発明の緑藻細胞、又は本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）の、食品、飼料、化粧品、及び医薬品などの組成物への添加（配合）量は、カロテノイドなどの脂溶性色素の一般的な添加量に従えばよい。そのような添加量は、本発明の緑藻細胞、又は本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）に含まれる脂質の量をさらに考慮して決定してもよい。本発明の食品、飼料、化粧品、及び医薬品に本発明の緑藻細胞、又は本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）を配合することにより、抗酸化作用及び抗炎症作用を食品、飼料、化粧品、及び医薬品に付与することができる。
【0074】
本発明の食品の例として、例えば、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、シャーべット、及び氷菓等の冷菓類、牛乳、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、菜汁飲料、茶飲料、スポーツ飲料、ビタミン補給飲料、栄養補給バランス飲料、ゼリー飲料及び粉末飲料等の飲料類、プリン、及び果汁入りプリン等のプリン類、ゼリー、ババロア、及びヨーグルト等のデザート類、チューインガム等のガム類、マーブルチョコレート等のチョコレート類、キャラメル、ヌガー、グミキャンディー、マシュマロ等を含むソフトキャンディーやタフィ等のキャラメル類、ソフトビスケット、ハードビスケット、ソフトクッキー等の焼き菓子類、乳化タイプドレッシング、セパレートドレッシング、及びノンオイルドレッシング等のドレッシング類、ケチャップ、たれ、及びソース等のソース類、ストロべリージャム、ブルーべリージャム、マーマレード、リンゴジャム、及びプレザーブ等のジャム類、シロップ漬のチェリー、アンズ、リンゴ、及びイチゴ等の加工用果実、ハム、及びソーセージ等の畜肉加工品、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚肉すり身、蒲鉾、竹輪、はんぺん、及び薩摩揚げ等の水産練り製品、うどん、冷麦、そうめん、そば、中華そば、スパゲッティ、マカロニ、ビーフン、及び春雨等の麺類、食パン、菓子パン、及び惣菜パン等のパン類、コーヒークリーム、生クリーム、カスタードクリーム、ホイップクリーム、及びサワークリーム等のクリーム類、コンソメスープ、ポタージュスープ、クリームスープ、中華スープ、味噌汁、シチュー、及びカレー等のスープ類などの加工食品を挙げることができる。
【0075】
食品はまた、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品、サプリメントなどを含む機能性食品であってもよい。機能性食品はまた、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ ｃｌａｉｍ）が適用される健康食品などの健康食品全般を包含する。機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、又はジェル剤やペースト剤などであってもよいし、通常の食品の形状（例えば、飲料、菓子など）であってもよい。食品は、食品組成物であってもよい。
【0076】
飼料は、固形、半固形、液状などの任意の形状であってよい。飼料は任意の非ヒト動物への給餌のためのものであってよい。飼料は、飼料組成物であってもよい。
【0077】
化粧品は、乳液、化粧水、美容パック、化粧下地、日焼け止めなどの基礎化粧品、ファンデーション、チーク、マスカラ、口紅などのメイクアップ化粧品などであってよいが、これらに限定されない。化粧品は、抗酸化作用又は抗炎症作用に基づき、例えば、アンチエイジング用、抗しわ・たるみ用、抗シミ・そばかす用、抗炎症用（日焼けケア用など）、又は敏感肌用等の化粧品であってもよい。化粧品は、化粧品組成物（化粧料）であってもよい。
【0078】
医薬品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、ジェル剤、又は液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤等の任意の剤形のものであってよい。医薬品は経口用であっても非経口用であってもよい。医薬品は、医薬組成物であってもよい。
【0079】
本発明の食品、飼料、化粧品、及び医薬品は、さらに、食品、飼料、化粧品、及び医薬品においてそれぞれ許容される添加剤を含んでもよい。本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤もまた、許容される添加剤を含んでもよい。添加剤としては、例えば担体、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の食品、飼料、化粧品、及び医薬品は、他の成分や材料をさらに含んでもよい。
【0080】
本発明の食品、飼料、化粧品、及び医薬品などに、本発明の緑藻細胞、又は本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）を配合することにより、高い抗酸化効果及び／又は抗炎症効果、並びに抗酸化効果又は抗炎症効果から誘導される他の効果（例えば、アンチエイジング効果、保存性向上効果等）などが得られる。
【0081】
本発明の緑藻細胞若しくは本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）、又はそれを含む食品、飼料、化粧品、若しくは医薬品は、対象において抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすために使用することもできる。本発明は、本発明の緑藻細胞若しくは本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤）、又はそれを含む食品、飼料、化粧品、若しくは医薬品を、対象に投与することを含む、酸化ストレスを低減又は予防する方法を提供する。本発明はまた、本発明の緑藻細胞若しくは本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗炎症剤）、又はそれを含む食品、飼料、化粧品、若しくは医薬品を、対象に投与することを含む、炎症を抑制又は予防する方法を提供する。本発明において「投与」とは、食品又は飼料に対して用いられる「摂取」、化粧品に対して用いられる「適用」、及び医薬に対して用いられる「投与」をいずれも包含する。
【0082】
本発明の緑藻細胞若しくは本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）、又はそれを含む食品、飼料、化粧品、若しくは医薬品の投与量は、投与する対象の年齢及び体重、投与経路、投与回数等に基づいて適宜設定することができる。
【0083】
本発明の緑藻細胞若しくは本発明の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤）、又はそれを含む食品、飼料、化粧品、若しくは医薬品を投与する対象は、任意の動物であってよく、特に、ヒト又は非ヒト動物であってよく、例えば、ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ウマ、ウシ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ヤギ等の家畜動物やペットを始めとする哺乳動物、ニワトリ、ウズラ、カモ、アヒル、ハト、インコ、オウム、ジュウシマツ、フラミンゴなどの鳥類、コイ、キンギョ、メダカ、アロワナ、グッピー、サケ、マス、マグロ、ハタ、サバ、ブリ、ハマチ、タイ等の魚類、エビ、カニなどの甲殻類などであってよい。上記対象は、酸化ストレスを生じる疾患又は酸化ストレスによって引き起こされる疾患に罹患しているか、罹患している疑いがあるか、又は罹患しやすい遺伝的又は環境的素因を有する対象であることが好ましい。あるいは、上記対象は、強い炎症反応を生じる疾患又は強い炎症反応によって引き起こされる疾患に罹患しているか、罹患している疑いがあるか、又は罹患しやすい遺伝的又は環境的素因を有する対象であることが好ましい。上記対象は、それらの両方の対象に該当する対象であってもよい。あるいは、上記対象は、酸化ストレス及び／又は炎症の発生を予防することが望まれる対象であってよい。上記対象は、抗酸化効果及び／又は抗炎症効果による身体状態（健康状態）の改善が望まれる対象であってもよい。しかしながら対象はこれらに限定されるものではない。
【0084】
本発明はまた、本発明の緑藻細胞、又は本発明の上記飼料を非ヒト動物に給餌することを含む、非ヒト動物の飼養方法も提供する。非ヒト動物への給餌は、常法に従って行うことができる。本発明の非ヒト動物の飼養方法は、非ヒト動物において抗酸化効果又は抗炎症効果をもたらすことができ、非ヒト動物の健康状態の改善に寄与することから、アニマルウェルフェア、疾患の予防、あるいは動物個体、卵、食肉等の生産効率向上などの面で有効である。さらに、本発明の非ヒト動物の飼養方法は、本発明の緑藻細胞により生産・蓄積された色素（カロテノイド及び／又はクロロフィル）及び／又は脂質を動物個体、卵、食肉等に蓄積させる目的で実施してもよい。例えば、本発明の緑藻細胞の朱色細胞（赤色相）、又はその細胞由来の脂溶性成分抽出物（あるいは本発明の抗酸化剤又は抗炎症剤）を含む飼料は、赤系色素であるカロテノイドを高含量で含むことから、動物個体、卵、食肉等に赤味を付与する目的（例えば、魚類の色揚げ用）で非ヒト動物に給餌され得る。このような本発明の飼養方法は、上述したような任意の非ヒト動物を飼養対象とするものであってよいが、例えば食肉用では、ウシ、ブタ、イノシシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ等の哺乳動物、ニワトリ、ウズラ、カモ、アヒル、ハト等の鳥類、サケ、マス、マグロ、ハタ、サバ、ブリ、ハマチ、タイ等の魚類、エビ（ロブスター、イセエビ、クルマエビなど）、カニ（タラバガニ、ズワイガニ等）等の甲殻類などが飼養対象として特に好ましく、また鑑賞用では、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等の哺乳動物、インコ、オウム、ジュウシマツ、フラミンゴ等の鳥類、コイ、キンギョ、メダカ、アロワナ、グッピー等の魚類などが飼養対象として特に好ましい。
【0085】
４）本発明の緑藻細胞の殺菌方法
本発明の緑藻細胞は、後述の実施例に記載のとおり、３００ｐｐｍ以上の濃度の次亜塩素酸に感受性を示し、生育できなかった。したがって３００ｐｐｍ以上の濃度の次亜塩素酸で本発明の緑藻細胞を処理すれば、本発明の緑藻細胞を殺菌することができる。
本発明の緑藻細胞は、後述の実施例に記載のとおり、３００ｐｐｍ以上の濃度の次亜塩素酸に感受性を示し、生育できなかった。したがって３００ｐｐｍ以上の濃度の次亜塩素酸で本発明の緑藻細胞を処理すれば、本発明の緑藻細胞を殺菌することができる。
【0086】
本発明は、本発明の緑藻細胞を、３００ｐｐｍ以上、例えば３００～３０００ｐｐｍの濃度の次亜塩素酸又はその塩で処理することを含む、本発明の緑藻細胞を殺菌する方法も提供する。次亜塩素酸の塩としては、例えば、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウムなどの、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例0087】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0088】
［実施例１］
（微細藻類の単離）
日本国神奈川県の鎌倉・湘南地方の水域から採集した試料液を培養し、そこから混釈重層法（ｐｏｕｒ－ｐｌａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）によりＢＧ１１寒天培地上で緑藻（微細藻類）１９株を単離した。得られた１９株をＤ３－１～Ｄ３－７株、Ｅ３－１～Ｅ３－５株、及びＦ３－１～Ｆ３－７株と命名した。そのうちの１つであるＤ３－１株は、増殖期に相当する緑色相（グリーンステージ）では直径約３～７μｍ程度の緑色の球形単細胞として観察された。
（微細藻類の単離）
日本国神奈川県の鎌倉・湘南地方の水域から採集した試料液を培養し、そこから混釈重層法（ｐｏｕｒ－ｐｌａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）によりＢＧ１１寒天培地上で緑藻（微細藻類）１９株を単離した。得られた１９株をＤ３－１～Ｄ３－７株、Ｅ３－１～Ｅ３－５株、及びＦ３－１～Ｆ３－７株と命名した。そのうちの１つであるＤ３－１株は、増殖期に相当する緑色相（グリーンステージ）では直径約３～７μｍ程度の緑色の球形単細胞として観察された。
【0089】
（Ｄ３－１株の種同定）
Ｄ３－１株から抽出した全ＤＮＡを鋳型とし、１８Ｓ特異的共通プライマー（９３Ｆプライマー： ５’－ｃｔｇｃｇａａｔｇｇｃｔｃａｔｔａａａｗｃａｇ－３’（ｗはａ又はｔを示す）（配列番号１）及びＩＴＳ２－ｒプライマー： ５’－ｔｃｃｔｃｃｇｃｔｔａｔｔｇａｔａｔｇｃ－３’（配列番号２））を使用して、ゲノムＤＮＡ上の１８Ｓリボゾーム遺伝子とその下流周辺領域（ＩＴＳ１（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ １； 内部転写スペーサー１）、５．８Ｓリボゾーム遺伝子及びＩＴＳ２（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ ２； 内部転写スペーサー２））を含む１８Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ１－５．８Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ２領域を核酸増幅し、得られた増幅断片をクローニングベクターｐＧＥＭ－Ｔにクローニングして組換えプラスミドｐＧＥＭ１８Ｓを作製した。常法により増幅断片の３，２５８ｂｐの塩基配列を決定した（配列番号３）。得られた塩基配列を用いて１８Ｓ ｒＤＮＡ領域についてＢＬＡＳＴ（Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）及びＣｌｕｓｔａｌＷ解析を行った。１８Ｓ ｒＤＮＡ領域においてＤ３－１株と高い配列相同性を示したコーラストレラ属４株を含む緑藻８株で構築された系統樹を図１に示す。コーラストレラ・オオシスティフォルミス（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｏｏｃｙｓｔｉｆｏｒｍｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＭ０２００８８）及びコーラストレラ・コルコンティカ（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｃｏｒｃｏｎｔｉｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３７０８２）はＤ３－１株に対し１８Ｓ ｒＤＮＡ領域（２，５２４ｂｐ）において９９．８％の配列相同性を示した。コーラストレラ・テヌイテカ（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｔｅｎｕｉｔｈｅｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＨ１７６１０８）及びコーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）ＹＡＣＣＹＢ２０８株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＨ６３６６６３）はＤ３－１株に対して１８Ｓ ｒＤＮＡ領域において高い配列相同性を示したが、Ｄ３－１株の１８Ｓ ｒＤＮＡ領域が約２．５ｋｂであるのに対して約１．７ｋｂという大幅に短い長さの１８Ｓ ｒＤＮＡ領域を有しており、Ｄ３－１株と比較して１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子における基本的な構造の違いが認められた。この系統解析の結果から、Ｄ３－１株は、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ ｐｈｙｌｕｍ）クロレラ綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）ヨコワミドロ目（Ｓｐｈａｅｒｏｐｌｅａｌｅｓ）イカダモ科（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍａｃｅａｅ）コーラストレラ属（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ）に分類される新種の株であることが明らかとなり、コーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株と称された。
Ｄ３－１株から抽出した全ＤＮＡを鋳型とし、１８Ｓ特異的共通プライマー（９３Ｆプライマー： ５’－ｃｔｇｃｇａａｔｇｇｃｔｃａｔｔａａａｗｃａｇ－３’（ｗはａ又はｔを示す）（配列番号１）及びＩＴＳ２－ｒプライマー： ５’－ｔｃｃｔｃｃｇｃｔｔａｔｔｇａｔａｔｇｃ－３’（配列番号２））を使用して、ゲノムＤＮＡ上の１８Ｓリボゾーム遺伝子とその下流周辺領域（ＩＴＳ１（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ １； 内部転写スペーサー１）、５．８Ｓリボゾーム遺伝子及びＩＴＳ２（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ ２； 内部転写スペーサー２））を含む１８Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ１－５．８Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ２領域を核酸増幅し、得られた増幅断片をクローニングベクターｐＧＥＭ－Ｔにクローニングして組換えプラスミドｐＧＥＭ１８Ｓを作製した。常法により増幅断片の３，２５８ｂｐの塩基配列を決定した（配列番号３）。得られた塩基配列を用いて１８Ｓ ｒＤＮＡ領域についてＢＬＡＳＴ（Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）及びＣｌｕｓｔａｌＷ解析を行った。１８Ｓ ｒＤＮＡ領域においてＤ３－１株と高い配列相同性を示したコーラストレラ属４株を含む緑藻８株で構築された系統樹を図１に示す。コーラストレラ・オオシスティフォルミス（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｏｏｃｙｓｔｉｆｏｒｍｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＭ０２００８８）及びコーラストレラ・コルコンティカ（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｃｏｒｃｏｎｔｉｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３７０８２）はＤ３－１株に対し１８Ｓ ｒＤＮＡ領域（２，５２４ｂｐ）において９９．８％の配列相同性を示した。コーラストレラ・テヌイテカ（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｔｅｎｕｉｔｈｅｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＨ１７６１０８）及びコーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）ＹＡＣＣＹＢ２０８株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＨ６３６６６３）はＤ３－１株に対して１８Ｓ ｒＤＮＡ領域において高い配列相同性を示したが、Ｄ３－１株の１８Ｓ ｒＤＮＡ領域が約２．５ｋｂであるのに対して約１．７ｋｂという大幅に短い長さの１８Ｓ ｒＤＮＡ領域を有しており、Ｄ３－１株と比較して１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子における基本的な構造の違いが認められた。この系統解析の結果から、Ｄ３－１株は、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ ｐｈｙｌｕｍ）クロレラ綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）ヨコワミドロ目（Ｓｐｈａｅｒｏｐｌｅａｌｅｓ）イカダモ科（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍａｃｅａｅ）コーラストレラ属（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ）に分類される新種の株であることが明らかとなり、コーラストレラ・エスピー（Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ ｓｐ．）Ｄ３－１株と称された。
【0090】
コーラストレラ・エスピーＤ３－１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）（〒２９２－０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室）に２０２２年２月４日（受託日）付けで寄託された（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－２２４４３）。
【0091】
［実施例２］
（脂肪酸組成及び脂質生産能の分析）
実施例１で得られた緑藻１９株の前培養液５ｍＬを、５０ｍＬのリン源欠乏ＢＧ１１液体培地（Ｋ２ＨＰＯ４を含まないＢＧ１１培地；ＢＧ１１－Ｐ液体培地）に添加後、白色光（３０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ［３０μＥ／ｍ２／ｓ］）を連続照射しながら静置条件で３０℃、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で１４日間培養した（ＳＣＣ条件での培養； 細胞培養液濁度ＯＤ７３０＝およそ０.５程度となった）。培養した細胞を回収し、乾燥し、細胞から全脂質を抽出した。抽出した脂質を常法によりメチルエステル化して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）とし、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）での水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）分析に供した。ＦＩＤ分析では、脂肪酸メチルエステルを炭素数及び不飽和度（二重結合の数）に従って分離・定量し、さらに、脂質抽出物の脂肪酸組成をＦＡＭＥｓ総量中の各ＦＡＭＥ量の比率（ｗ／ｗ％）で表すことができる。
（脂肪酸組成及び脂質生産能の分析）
実施例１で得られた緑藻１９株の前培養液５ｍＬを、５０ｍＬのリン源欠乏ＢＧ１１液体培地（Ｋ２ＨＰＯ４を含まないＢＧ１１培地；ＢＧ１１－Ｐ液体培地）に添加後、白色光（３０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ［３０μＥ／ｍ２／ｓ］）を連続照射しながら静置条件で３０℃、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で１４日間培養した（ＳＣＣ条件での培養； 細胞培養液濁度ＯＤ７３０＝およそ０.５程度となった）。培養した細胞を回収し、乾燥し、細胞から全脂質を抽出した。抽出した脂質を常法によりメチルエステル化して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）とし、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）での水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）分析に供した。ＦＩＤ分析では、脂肪酸メチルエステルを炭素数及び不飽和度（二重結合の数）に従って分離・定量し、さらに、脂質抽出物の脂肪酸組成をＦＡＭＥｓ総量中の各ＦＡＭＥ量の比率（ｗ／ｗ％）で表すことができる。
【0092】
結果を図２Ａに示す。リン源欠乏ＢＧ１１液体培地を用いた培養条件で、細胞内の脂肪酸の組成について、パルミチン酸（Ｃ１６：０）とオレイン酸（Ｃ１８：１）が合計量で６０ｗ／ｗ％以上の比率（ＦＡＭＥｓ量ベース）を占めることが明らかとなった。また細胞内の脂肪酸の組成について、炭素数１８の不飽和脂肪酸（Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３）の比率（ＦＡＭＥｓ量ベース）が６０～７０％程度と高いことも示された。炭素数１８の不飽和脂肪酸の組成比率が高いことは、当該脂質が、燃料よりも食用油として適していることを示す。
【0093】
次いで、パルミチン酸（Ｃ１６：０）とオレイン酸（Ｃ１８：１）のＦＡＭＥｓの合計量が特に高い６株を、ＢＧ１１培地中で前培養した後、５０ｍＬの０．２ＢＧ１１液体培地（水で５倍に希釈したＢＧ１１培地）に添加し、白色光（ＬＥＤ；１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら、４０ｒｐｍのレシプロ（往復）式振とう条件で３０℃、３％ ＣＯ２ガス供給下で６日間培養した（ＢＩＣ条件での培養）。培養した細胞を回収し、乾燥し、細胞から全脂質を抽出した。抽出した脂質を常法によりメチルエステル化して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥｓ）とし、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）での水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）分析（ＧＣ／ＦＩＤ分析）に供した。
【0094】
結果を図２Ｂ及びＣに示す。全ＦＡＭＥｓ量の比較により、６株の中でもＤ３－１株が特に高い脂質生産能を有することが示された。図２Ｂは、０．２ＢＧ１１液体培地で培養した各緑藻細胞株由来のＦＡＭＥｓ量を、培養液の乾燥菌体重量（ＤＣＷ）に対する全ＦＡＭＥｓ量の比率（ｗ／ｗ％）で表す。図２Ｃは、０．２ＢＧ１１液体培地で培養した各緑藻細胞株由来のＦＡＭＥｓ量を、培養液１リットル当たりの全ＦＡＭＥｓ量（ｍｇ／Ｌ）で表す。この培養条件（６日間培養）で得られたＤ３－１株のＦＡＭＥｓ生産量は、４４．４ｗ／ｗ％［ＦＡＭＥｓ／ＤＣＷ］（図２Ｂ）、８２１ｍｇ・ＦＡＭＥｓ／Ｌ（図２Ｃ）であった。
【0095】
さらに、ＢＧ１１培地中で前培養したＤ３－１株（５ｍＬ）を、５０ｍＬの０．２ＢＧ１１液体培地に添加し、白色光（ＬＥＤ；１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら、４０ｒｐｍのレシプロ式振とう条件で３０℃、２％ ＣＯ２ガス供給下で５日間培養した。培養した細胞を回収し、乾燥し、細胞から全脂質を抽出し、メチルエステル化して、得られたＦＡＭＥｓのＧＣ／ＦＩＤ分析を行った。その結果を表２に示す。
【0096】
【表2】
【0097】
リン源欠乏ではない０．２ＢＧ１１液体培地を用いた場合でも、パルミチン酸（Ｃ１６：０）とオレイン酸（Ｃ１８：１）のＦＡＭＥｓ組成比率は高かった。０．２ＢＧ１１液体培地を用いたこの培養条件（５日間培養）では、培養液の乾燥菌体重量（ＤＣＷ）に対する全ＦＡＭＥｓ量の比率が約２０ｗ／ｗ％、培養液１リットル当たりの全ＦＡＭＥｓ量が約３５０ｍｇと算出された。
【0098】
このように、異なる培養条件でも、Ｄ３－１株による、脂質、特にパルミチン酸（Ｃ１６：０）及びオレイン酸（Ｃ１８：１）、そして炭素数１８の不飽和脂肪酸（Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３）の高い生産量が示された。
【0099】
［実施例３］
（色素生産のための培養条件の検討）
実施例２において、Ｄ３－１株を０．２ＢＧ１１液体培地でわずか５日間培養しただけで、培養液が緑色から赤色（より具体的には、朱色）に変化し、赤色相（レッドステージ）に移行することが観察された。これは、Ｄ３－１株が赤系色素を生産し、細胞内に蓄積することによるものと考えられた。そこで色素生産に適したＤ３－１株の培養条件の検討を行った。
（色素生産のための培養条件の検討）
実施例２において、Ｄ３－１株を０．２ＢＧ１１液体培地でわずか５日間培養しただけで、培養液が緑色から赤色（より具体的には、朱色）に変化し、赤色相（レッドステージ）に移行することが観察された。これは、Ｄ３－１株が赤系色素を生産し、細胞内に蓄積することによるものと考えられた。そこで色素生産に適したＤ３－１株の培養条件の検討を行った。
【0100】
Ｄ３－１株を、ＢＩＣ条件（Ｂａｓａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；基本誘導条件）又はＳＣＣ条件（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；標準培養条件）下で、０．２ＢＧ１１液体培地又はＢＧ１１液体培地を用いて培養した。
【0101】
具体的には、ＢＩＣ条件下では、１００ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内に５０ｍＬのＢＧ１１液体培地を入れ、そこに１／１００容のＤ３－１株培養液を添加し、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）でＤ３－１株を２５日間静置培養して前培養液（ＯＤ７７０＝およそ１．２）を取得し、その前培養液の５ｍＬを３００ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内に新しく用意した４５ｍＬの０．２ＢＧ１１液体培地又はＢＧ１１液体培地に添加した後、インキュベーター（ＣＦ－４１５；トミー精工製）中、白色光（ＬＥＤ；１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら２％ ＣＯ２ガス供給下（２％ ＣＯ２／Ｗ１００）、３０℃で２７日間、４０ｒｐｍのレシプロ式振とう条件で培養（本培養）した。
【0102】
ＳＣＣ条件下では、ＢＩＣ条件下と同様にして調製したＤ３－１株の前培養液の５ｍＬを、１００ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内に新しく用意した４５ｍＬの０．２ＢＧ１１液体培地又はＢＧ１１液体培地に添加した後、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で白色と赤色の混合ＬＥＤを使用して白色光及び赤色光（６６０ｎｍ）をそれぞれ５０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓで連続照射しながら（０．０４％ ＣＯ２／Ｗ５０Ｒ５０）、又は大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で白色光（ＬＥＤ；１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら（０．０４％ ＣＯ２／Ｗ１００）、３０℃で２７日間にわたり静置培養（本培養）した。
【0103】
各培養条件において培養液を継続的に観察した。図３Ａは、本培養開始から３日後、６日後、９日後、１５日後、２１日後、及び２７日後のフラスコ内の培養液の外観を示す。本培養開始から３日後の時点ではいずれの培養条件でも緑色であった培養液は、時間が経つにつれて赤色（より具体的には、朱色）に変化した。例えばＢＩＣ条件下では、０．２ＢＧ１１培地で６日後、ＢＧ１１培地で１５日後には明確に朱色を呈していた。またＳＣＣ条件下、かつＷ５０Ｒ５０の光照射下では、０．２ＢＧ１１培地で１５日後、ＢＧ１１培地で２１日後には濃い朱色を呈していた。ＳＣＣ条件下、かつＷ１００の光照射下でも、０．２ＢＧ１１培地で１５日後～２１日後、ＢＧ１１培地で２１日後～２７日後には明確に朱色を呈していた。
【0104】
さらに、本培養開始から３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、及び２７日後（３日に１回）に各培養液から試料を分取し、－３０℃で保管した。培養終了後、取得した各試料を２００μＬずつ９６穴プレートの各ウェルへ移し、波長７３０ｎｍでの光学密度（ＯＤ７３０）及び波長４６５ｎｍでの光学密度（ＯＤ４６５）を分光光度計で測定した。図３Ｂは、本培養開始当日（０日）、本培養開始から３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、及び２７日後の培養液から分取して９６穴プレートの各ウェルへ移した試料の外観を示す。いずれの培養液においても時間の経過とともに赤味が増し、緑色からより鮮やかな朱色へと色が大きく変化した。培地以外の培養条件が同一である培養液間で比較すると、ＢＧ１１培地よりも０．２ＢＧ１１培地を用いた場合の方が早期に赤味が増加したことが示された。０．２ＢＧ１１培地を使用することによる栄養源の減少ストレスが、Ｄ３－１株における早期の赤系色素の蓄積を促進したと考えられる。
【0105】
図４Ａのグラフは細胞量（本発明では細胞増殖量又はバイオマス生産量とも称される）の指標となるＯＤ７３０の継時的変化を、図４Ｂのグラフは赤系色素であるカロテノイドの量（カロテノイド生産量）の指標となるＯＤ４６５の継時的変化を示す。図３、及び図４Ｂに示されるように、培養時間の経過に伴って培養液が緑色から朱色に変化するとともに、カロテノイド量が増加したことから、Ｄ３－１株が産生・蓄積した赤系色素がカロテノイドであることが確認された。
【0106】
本実施例の結果から、細胞増殖量やカロテノイド生産量をより増加させる上では、０．０４％ ＣＯ２下の培養よりも２％ ＣＯ２下の培養の方がより効果的であることが示された。
【0107】
また、０．２ＢＧ１１培地よりもＢＧ１１培地を用いた場合の方が全体的な細胞増殖量やカロテノイド生産量は増加した。一方で、例えば、本培養開始から９日後の液体培養液の色（図３）を各培養条件で比較すると、ＢＧ１１培地よりも０．２ＢＧ１１培地を使用した場合の方が赤味が濃く、ＢＩＣ条件下及びＳＣＣ条件下の両方でＢＧ１１培地では緑色に近かったのに対し、０．２ＢＧ１１培地ではかなり赤味を帯びていたことから、カロテノイドの蓄積比率の増加は、ＢＧ１１培地よりも０．２ＢＧ１１培地を用いた場合の方がより早期に起こることが示された。
【0108】
このように、特に、０．２ＢＧ１１液体培地を用いた２％ ＣＯ２下の培養条件では、コスト面と生産量のバランスが取れた効率の良いカロテノイド生産が可能であった。
【0109】
［実施例４］
（異なる培養条件での色素生産）
Ｄ３－１株を、０．２ＢＧ１１液体培地又はＢＧ１１液体培地において、実施例３に記載のＢＩＣ条件に従い、白色光（ＬＥＤ；１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら２％ ＣＯ２ガス供給下、３０℃で４８日間、４０ｒｐｍのレシプロ式振とう条件で培養した。
（異なる培養条件での色素生産）
Ｄ３－１株を、０．２ＢＧ１１液体培地又はＢＧ１１液体培地において、実施例３に記載のＢＩＣ条件に従い、白色光（ＬＥＤ；１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら２％ ＣＯ２ガス供給下、３０℃で４８日間、４０ｒｐｍのレシプロ式振とう条件で培養した。
【0110】
その結果、細胞は朱色に変化し、その後４８日後まで継続して、培養液中で赤系色素の十分な蓄積が観察された。図５は、本培養開始から５日後と４８日後のフラスコ内の培養液の外観を示す。０．２ＢＧ１１液体培地を用いた培養では、本培養開始時に緑色であった培養液は、本培養開始から４日後には色に変化が生じ、５日後にはすでに朱色に変化していた。ＢＧ１１液体培地を用いた培養では、本培養開始時に緑色であった培養液は、５日後にはほぼ緑色であったが、１２日後には朱色に変化し、４８日後には濃い朱色を呈していた。
【0111】
わずか５日間の培養で培養液の色が変化するレベルまでカロテノイド色素を蓄積できる微細藻類はこれまで報告されていない。Ｄ３－１株は培養初期から長期間にわたって高いカロテノイド生産能を発揮できることが示された。
【0112】
一方、ＢＧ１１液体培地で培養したＤ３－１株を、寒天培地上で、実施例３に記載のＳＣＣ条件に従って培養した。より具体的には、ＢＧ１１液体培地で得た緑色培養液又は朱色培養液から採取したＤ３－１株を、ＢＧ１１寒天培地又は０．２ＢＧ１１寒天培地のプレート左半分に塗り広げ、それを大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で、白色光及び赤色光（混合ＬＥＤ；それぞれ５０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら（０．０４％ ＣＯ２／Ｗ５０Ｒ５０）、又は白色光（ＬＥＤ；１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら（０．０４％ ＣＯ２／Ｗ１００）、３０℃で静置培養した。
【0113】
その結果を表３に示す。表３には上記の液体培地での培養結果も併せて示した。図６には、各培養条件にて寒天培地で培養したＤ３－１株の培養開始から２６日後の呈色状態を示す。
【0114】
【表3】
【0115】
緑色培養液又は朱色培養液のいずれのＤ３－１株（すなわち、緑色細胞又は朱色細胞）を寒天培地に播種した場合でも、白色光と赤色光を混合照射した場合は、培養開始から２５日後までに細胞は赤味を帯び始め、２６日後～９０日後の細胞は継続的に朱色を呈した。白色蛍光灯（３０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を用いた光照射を行った場合には、寒天培地上での培養においてＤ３－１株が緑色から濃い朱色にまで変化するのに通常は９０日程度を要するが、上記培養条件ではより早期に朱色に変化し、特に白色光と赤色光の照射を行った場合には、驚くべきことに、寒天培地でも培養開始から２６日後にはＤ３－１株は朱色に変化した。寒天培地のような固体培養において、白色光と赤色光の混合照射は、赤系色素の生産促進に特に効果的であることが示された。一方、白色光のみ（Ｗ１００）を照射した場合は、緑色培養液又は朱色培養液のいずれのＤ３－１株を寒天培地に播種した場合でも、培養開始から２６日後の細胞は緑色を呈した。
【0116】
なお、白色光と赤色光を混合照射する培養条件（Ｗ５０Ｒ５０）では、寒天培地に播種したＤ３－１株の朱色細胞は、いったん緑色に変化したものの、２６日間という短期間のうちに、再度、朱色に変化した。白色光を照射する培養条件（Ｗ１００）では、寒天培地に播種したＤ３－１株の朱色細胞は、２６日後には緑色に変化していたが、その後、培養開始から３０日後には細胞は再度、赤色を帯び始め、徐々に朱色に変化した。液体培養したＤ３－１株の朱色細胞を寒天培地で培養しても朱色細胞を生育させることができることが示された。
【0117】
表３に示すように、Ｄ３－１株を寒天培地で培養して得られる朱色細胞の量（細胞増殖量又はバイオマス生産量）は、０．２ＢＧ１１培地よりもＢＧ１１培地を用いた場合の方が多かった。
【0118】
［実施例５］
（Ｄ３－１株由来の色素のＴＬＣ分析）
ＢＧ１１寒天培地上で、白色蛍光灯を用いて蛍光白色光（３０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら大気中（０．０４％ ＣＯ２下）、ＳＣＣ条件で３ヶ月間（９０日間）培養して朱色に変化したＤ３－１株細胞を回収し、それに溶媒（ジエチルエーテル：クロロホルム：メタノール＝１：２：１液）４００μＬとガラスビーズ（小サイズ直径φ０．１ｍｍ、大サイズ直径φ１ｍｍの２種類のビーズを混合）を加えてボルテックスミキサーを用いて細胞破砕を実施した。得られた細胞破砕液を遠心分離（８，０００ｇで１０分）にかけて上清（脂溶性画分）を回収し、この抽出工程を４回繰り返して１．６ｍＬの抽出液を得た。この抽出液（色素を含む脂溶性成分抽出物；以下の実施例では「色素抽出物」とも称する）をロータリーエバポレーターを用いて乾固させた後、ジエチルエーテルに溶解し、それを被験試料として薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用シリカゲルの起点（Ｏｒｉ）に４μＬずつスポットした。標準物質として、カロテノイドに属するβカロテン（βＣａｒ；ＣＡＳ ＲＮ ７２３５－４０－７；株式会社和光（日本））、エキネノン（Ｅｃ；ＣＡＳ ＲＮ ４３２－６８－８；ＤＨＩ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／株式会社和光）、カンタキサンチン（Ｃｘ；ＣＡＳ ＲＮ ５１４－７８－３；ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ／株式会社和光）、及びアスタキサンチン（Ａｘ；ＣＡＳ ＲＮ ４７２－６１－７；ＤＨＩ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／株式会社和光）も起点（Ｏｒｉ）にスポットした。シリカゲル上の試料を石油エーテル：アセトン＝４：１の展開溶媒を用いて分画し、ＴＬＣ分析を行った。分画後のＴＬＣゲル上のバンドのシグナル強度はイメージングアナライザー（ＢＩＯ－１Ｄシステム；Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ．（フランス））を用いて解析し、脂溶性色素総量中の各色素量の比率（脂溶性色素組成比率％）を算出した。
（Ｄ３－１株由来の色素のＴＬＣ分析）
ＢＧ１１寒天培地上で、白色蛍光灯を用いて蛍光白色光（３０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら大気中（０．０４％ ＣＯ２下）、ＳＣＣ条件で３ヶ月間（９０日間）培養して朱色に変化したＤ３－１株細胞を回収し、それに溶媒（ジエチルエーテル：クロロホルム：メタノール＝１：２：１液）４００μＬとガラスビーズ（小サイズ直径φ０．１ｍｍ、大サイズ直径φ１ｍｍの２種類のビーズを混合）を加えてボルテックスミキサーを用いて細胞破砕を実施した。得られた細胞破砕液を遠心分離（８，０００ｇで１０分）にかけて上清（脂溶性画分）を回収し、この抽出工程を４回繰り返して１．６ｍＬの抽出液を得た。この抽出液（色素を含む脂溶性成分抽出物；以下の実施例では「色素抽出物」とも称する）をロータリーエバポレーターを用いて乾固させた後、ジエチルエーテルに溶解し、それを被験試料として薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用シリカゲルの起点（Ｏｒｉ）に４μＬずつスポットした。標準物質として、カロテノイドに属するβカロテン（βＣａｒ；ＣＡＳ ＲＮ ７２３５－４０－７；株式会社和光（日本））、エキネノン（Ｅｃ；ＣＡＳ ＲＮ ４３２－６８－８；ＤＨＩ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／株式会社和光）、カンタキサンチン（Ｃｘ；ＣＡＳ ＲＮ ５１４－７８－３；ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ／株式会社和光）、及びアスタキサンチン（Ａｘ；ＣＡＳ ＲＮ ４７２－６１－７；ＤＨＩ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／株式会社和光）も起点（Ｏｒｉ）にスポットした。シリカゲル上の試料を石油エーテル：アセトン＝４：１の展開溶媒を用いて分画し、ＴＬＣ分析を行った。分画後のＴＬＣゲル上のバンドのシグナル強度はイメージングアナライザー（ＢＩＯ－１Ｄシステム；Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ．（フランス））を用いて解析し、脂溶性色素総量中の各色素量の比率（脂溶性色素組成比率％）を算出した。
【0119】
得られたＴＬＣ画像を図７Ａに示す。図７中、展開溶媒の先端位置を「Ｔｏｐ」として示した。ＴＬＣ画像の左側に、Ｒｆ値（＝［Ｏｒｉからバンド（色素）までの距離］／［ＯｒｉからＴｏｐまでの距離］）を示した。ＴＬＣ画像の各レーンの上には標準物質の略名、又は被験試料が由来する株名（Ｄ３－１株）を示した。
【0120】
ＴＬＣゲル（図７Ａ）上のバンドのシグナル強度に基づく解析の結果、Ｄ３－１株の朱色細胞由来の脂溶性成分抽出物（色素抽出物）は、脂溶性色素として、βカロテン（０．１％）、エキネノン（３８．１％）、カンタキサンチン（５２．５％）、アスタキサンチン（６．０％）、クロロフィルａ（Ｃｈｌａ；０．１％）及びその他の色素（クロロフィルｂなど；３．２％）を含んでいた。Ｄ３－１株が産生する赤系色素の主成分はエキネノンとカンタキサンチン（脂溶性色素総量中、合計で約９０％）であった。
【0121】
次いで、Ｄ３－１株の朱色細胞と緑色細胞のそれぞれに由来する色素抽出物を分析・比較した。実施例３のＢＩＣ条件下の培養と同様にして調製したＤ３－１株の前培養液の５ｍＬを、４５ｍＬのＢＧ１１液体培地に添加した後、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で、白色蛍光灯を用いて蛍光白色光（３０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら、３０℃で３０日間又は９０日間にわたって静置培養し（ＳＣＣ条件）、３０日間の培養で緑色細胞を、９０日間の培養で朱色細胞を得た。
【0122】
得られた細胞を回収し、上記と同じ方法によって抽出を行い、抽出液（色素抽出物）を得た。この抽出液（色素抽出物）をロータリーエバポレーターを用いて乾固させた後、ジエチルエーテルに溶解し、それを被験試料として薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用シリカゲルの起点（Ｏｒｉ）に２０μＬずつスポットした。標準物質として、βカロテンも起点（Ｏｒｉ）にスポットした。シリカゲル上の試料を、石油エーテル：アセトン＝４：１の展開溶媒を用いて分画し、ＴＬＣ分析を行った。分画後のＴＬＣゲル上のバンドのシグナル強度はイメージングアナライザー（ＢＩＯ－１Ｄシステム；Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ．（フランス））を用いて解析し、脂溶性色素総量中の各色素量の比率（脂溶性色素組成比率％）を算出した。
【0123】
得られたＴＬＣ画像を図７Ｂに示す。ＴＬＣゲル（図７Ｂ）上のバンドのシグナル強度に基づく解析の結果、Ｄ３－１株の朱色細胞由来の色素抽出物は、脂溶性色素として、βカロテン（２．４８％）、エキネノン（３９．２％）、カンタキサンチン（５０．０％）、アスタキサンチン（８．２４％）、及びクロロフィルａ（０．１％未満）を含んでいた。ＴＬＣ分析で得られた、朱色細胞由来の色素抽出物におけるこの脂溶性色素組成比率は、図７Ａに示した結果と同程度であった。また、Ｄ３－１株の朱色細胞における乾燥菌体重量（ＤＣＷ）中のカロテノイド量の比率は３７．８ｗ／ｗ％であった。このカロテノイド生産量は、従来知られている緑藻細胞のカロテノイド生産量と比較してもトップクラスの高いレベルである。
【0124】
一方、Ｄ３－１株の緑色細胞由来の色素抽出物は、脂溶性色素として、βカロテン（２．３０％）、エキネノン（４．８１％）、カンタキサンチン（７.５１％）、アスタキサンチン（３．８７％）、クロロフィルａ（３３.２％）、クロロフィルｂ（Ｃｈｌｂ；２０．４％）、及びその他の緑系色素（２７.９１％）を含み、カロテノイドに属する化合物の比率の合計が１８．４９％であったのに対し、クロロフィルａとクロロフィルｂの比率の合計は５３．６％でありカロテノイドを大きく上回った。Ｄ３－１株の緑色細胞由来の色素抽出物は、Ｄ３－１株の朱色細胞由来の色素抽出物とは色素組成が大きく異なっていた。
【0125】
さらに、実施例３のＢＩＣ条件下の培養と同様にして調製したＤ３－１株の前培養液の５ｍＬを、４５ｍＬのＢＧ１１液体培地に添加した後、白色光（ＬＥＤ；１００μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら、２％ ＣＯ２ガス供給下、３０℃で６日間、４０ｒｐｍのレシプロ式振とう条件（ＢＩＣ条件）で培養し、朱色細胞を得た。得られた細胞を回収し、上記と同じ方法によって抽出を行い、抽出液（色素抽出物）を得た。この抽出液（色素抽出物）を上記と同じ方法によって解析し、脂溶性色素総量中の各色素量の比率（脂溶性色素組成比率％）を算出した。ＢＩＣ条件下で６日間培養したＤ３－１株由来の色素抽出物は、脂溶性色素として、βカロテン（９．１７％）、エキネノン（１４．５％）、カンタキサンチン（４０．３％）、アスタキサンチン（１４．２％）、クロロフィルａ（１３％）、及びクロロフィルｂ（８．８３％）を含んでいた。脂溶性色素総量中のカロテノイド量の比率は約７８．２％であった。Ｄ３－１株のこの朱色細胞における乾燥菌体重量（ＤＣＷ）中のカロテノイド量の比率は３８．５ｗ／ｗ％であった。
【0126】
Ｄ３－１株の朱色細胞におけるエキネノン及びカンタキサンチンの上記のような高比率な生産は特筆に値し、それがＤ３－１株のカロテノイド生産の大きな特徴であることが示された。
【0127】
図７ＢのＴＬＣ画像の右には、βカロテンから、ｃｒｔＷ遺伝子産物やｃｒｔＺ遺伝子産物の作用を経てアスタキサンチンが生成される一般的な代謝経路を示した。
【0128】
緑色細胞と朱色細胞における乾燥菌体重量（ＤＣＷ）当たりのカロテノイド量に基づいて算出すると、乾燥菌体重量（ＤＣＷ）中のカロテノイド量の比率が１２～１５ｗ/ｗ％程度になるまでカロテノイドが蓄積したときが、概ね、目視で細胞が赤く色づき始める（赤味を帯びる）時期に相当すると考えられた。
【0129】
［実施例６］
（Ｄ３－１株由来の脂質のＴＬＣ分析）
実施例５で得た、ＳＣＣ条件下で液体培養したＤ３－１株の朱色細胞と緑色細胞のそれぞれに由来する色素抽出物を、実施例５と同様に、乾固させた後でジエチルエーテルに溶解し、それを被験試料として薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用シリカゲルの起点（Ｏｒｉ）に１０μＬずつスポットした。シリカゲル上の試料を、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１の展開溶媒を用いて分画し、５％リンモリブデン酸溶液（エタノール中）で染色し、ＴＬＣ分析を行った。分画後のＴＬＣゲル上のバンドのシグナル強度はイメージングアナライザー（ＢＩＯ－１Ｄシステム； Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ．（フランス））を用いて解析し、脂質総量中の各脂質量の比率（脂質組成比率％）を算出した。
（Ｄ３－１株由来の脂質のＴＬＣ分析）
実施例５で得た、ＳＣＣ条件下で液体培養したＤ３－１株の朱色細胞と緑色細胞のそれぞれに由来する色素抽出物を、実施例５と同様に、乾固させた後でジエチルエーテルに溶解し、それを被験試料として薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用シリカゲルの起点（Ｏｒｉ）に１０μＬずつスポットした。シリカゲル上の試料を、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：１の展開溶媒を用いて分画し、５％リンモリブデン酸溶液（エタノール中）で染色し、ＴＬＣ分析を行った。分画後のＴＬＣゲル上のバンドのシグナル強度はイメージングアナライザー（ＢＩＯ－１Ｄシステム； Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ．（フランス））を用いて解析し、脂質総量中の各脂質量の比率（脂質組成比率％）を算出した。
【0130】
得られたＴＬＣ画像を図８に示す。図８中、展開溶媒の先端位置を「Ｔｏｐ」として示した。ＴＬＣ画像の左側に、Ｒｆ値（＝［Ｏｒｉからバンドまでの距離］／［ＯｒｉからＴｏｐまでの距離］）を示した。ＴＬＣ画像の右側に、検出された主な脂質の構造式を示した。
【0131】
図８に示されるように、Ｄ３－１株の朱色細胞由来の脂質の主要成分は、中性脂肪（ＴＡＧ；トリアシルグリセロール）であることが示された。さらに、Ｄ３－１株は、中性脂肪に加えて、量が多い順に、ワックスエステル（ＷＥ）、ジアシルグリセロール（ＤＧ）、及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）も生産していることが明らかになった。ここで朱色細胞由来の色素抽出物についてシグナル強度に基づいて算出された脂質組成比率％は、ＴＡＧが５９．２％、ＷＥが２４．７％、ＤＧが１０．２％、ＦＦＡが５．９％であった。
【0132】
同様に、実施例５で得た、ＢＩＣ条件下で６日間培養して得られたＤ３－１株の朱色細胞由来の色素抽出物を、上記と同様にして脂質のＴＬＣ分析にかけた。この色素抽出物も、中性脂肪（ＴＡＧ）、ワックスエステル（ＷＥ）、ジアシルグリセロール（ＤＧ）、及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を含んでおり、脂質の主要成分は中性脂肪であった。その色素抽出物についてシグナル強度に基づいて算出された脂質組成比率％は、ＴＡＧが７５．６％、ＷＥが１４．４％、ＤＧが７．９６％、ＦＦＡが２．０４％であった。
【0133】
以上の実施例におけるＤ３－１株の脂質及び色素生産に関する実験の概略と生産結果の例を表４に示した。
【0134】
【表4】
【0135】
［実施例７］
（Ｄ３－１株の環境ストレス耐性）
本実施例ではＤ３－１株の環境ストレス耐性能について試験した。
４つの培養条件で培養したＤ３－１株細胞を用意し、それぞれ、Ｒｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、Ｇｒ１．０ＢＧｃ７ｄと名付けた（図９）。
（Ｄ３－１株の環境ストレス耐性）
本実施例ではＤ３－１株の環境ストレス耐性能について試験した。
４つの培養条件で培養したＤ３－１株細胞を用意し、それぞれ、Ｒｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、Ｇｒ１．０ＢＧｃ７ｄと名付けた（図９）。
【0136】
Ｒｄ１．０ＢＧｐ４ｍ（図９Ａ、Ｂ）は、Ｄ３－１株をＢＧ１１寒天培地上で、白色蛍光灯を用いて蛍光白色光（３０ｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で、３０℃で４ヶ月間静置培養して得た朱色細胞である。
【0137】
Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ（図９Ｃ、Ｄ）は、Ｄ３－１株をＢＧ１１寒天培地上で白色蛍光灯を用いて蛍光白色光（３０ｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で、３０℃で２ヶ月間静置培養して得た緑色細胞である。
【0138】
Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ（図９Ｅ、Ｆ）は、Ｄ３－１株を０．２ＢＧ１１液体培地で、１００ｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓの白色ＬＥＤ光の連続照射及び２％ ＣＯ２ガス供給下、４０ｒｐｍのレシプロ式振とう条件で攪拌しながら、３０℃で７日間培養して得た朱色細胞である。
【0139】
Ｇｒ１．０ＢＧｃ７ｄ（図９Ｇ、Ｈ）は、Ｄ３－１株をＢＧ１１液体培地で、１００ｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓの白色ＬＥＤ光の連続照射及び２％ ＣＯ２ガス供給下、４０ｒｐｍのレシプロ式振とう条件で攪拌しながら、３０℃で７日間培養して得た緑色細胞である。
【0140】
図９に示す写真では、Ｄ３－１株の朱色細胞内に赤系色素の蓄積が認められた。
【0141】
得られたＲｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、Ｇｒ１．０ＢＧｃ７ｄを、以下の環境ストレスに曝露した。
【0142】
１：（熱乾燥）４２℃で３時間にわたり熱乾燥
２：（ＵＶ）５分間の紫外線（ＵＶ）照射
３：（酸化）１０ｐｐｍの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で添加して１０分間処理
４：（アルカリ処理）０．５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加してｐＨ１１とし、１０分間
５：（ＮａＣｌＯ）３００ｐｐｍ～３０００ｐｐｍの次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ；漂白剤）で４分間処理した後、ＢＧ１１液体培地で細胞を洗浄
６：（凍結融解）－８０℃で３時間にわたり凍結し、次いで氷上で融解
７：（４０℃）４０℃のインキュベーターで５分間
８：（５０℃）５０℃のインキュベーターで５分間
２：（ＵＶ）５分間の紫外線（ＵＶ）照射
３：（酸化）１０ｐｐｍの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で添加して１０分間処理
４：（アルカリ処理）０．５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加してｐＨ１１とし、１０分間
５：（ＮａＣｌＯ）３００ｐｐｍ～３０００ｐｐｍの次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ；漂白剤）で４分間処理した後、ＢＧ１１液体培地で細胞を洗浄
６：（凍結融解）－８０℃で３時間にわたり凍結し、次いで氷上で融解
７：（４０℃）４０℃のインキュベーターで５分間
８：（５０℃）５０℃のインキュベーターで５分間
【0143】
上記のように環境ストレス処理した細胞は、回収し、１００μＬのＢＧ１１液体培地に加えて分散させた後、５μＬを新しいＢＧ１１寒天培地上にスポットした。なお凍結融解処理した細胞は、そのまま、ＢＧ１１寒天培地に播いた。寒天培地上の細胞を、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）で、蛍光白色光（３０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら、３０℃で１５日間にわたって静置培養し、継時的に細胞の生育を観察した。
【0144】
その結果、熱乾燥処理では、Ｒｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、及びＧｒ１．０ＢＧｃ７ｄのいずれの細胞も十分な生育を示したが、液体培地よりも寒天培地の方がより良い生育が見られた。ＵＶ処理ではＲｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、及びＧｒ１．０ＢＧｃ７ｄのいずれの細胞も良く生育した。酸化剤Ｈ２Ｏ２による酸化処理でも、Ｒｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、及びＧｒ１．０ＢＧｃ７ｄのいずれの細胞も良く生育した。さらに、アルカリ処理でも、Ｒｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、及びＧｒ１．０ＢＧｃ７ｄのいずれの細胞も良く生育した。
【0145】
一方、ＮａＣｌＯ処理ではＲｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、及びＧｒ１．０ＢＧｃ７ｄのいずれの細胞もうまく生育しなかった。Ｄ３－１株はＮａＣｌＯに対して感受性を有することが示された。この結果は、例えば屋外培養完了後の培養槽を消毒する際などに、Ｄ３－１株の殺菌用にＮａＣｌＯが有効であることを示している。
【0146】
凍結融解処理後、Ｒｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、及びＧｒ１．０ＢＧｃ７ｄのいずれの細胞も生育できた。Ｄ３－１株の朱色細胞及び緑色細胞を－８０℃で凍結保存できることが示された。
【0147】
４０℃での処理、５０℃での処理では、Ｒｄ１．０ＢＧｐ４ｍ、Ｇｒ１．０ＢＧｐ２ｍ、Ｒｄ０．２ＢＧｃ７ｄ、及びＧｒ１．０ＢＧｃ７ｄのいずれの細胞も良く生育した。Ｄ３－１株の朱色細胞及び緑色細胞は４０℃や５０℃という比較的高い温度でも死滅することなく生育できるこの株の特徴が示された。
【0148】
［実施例８］
（Ｄ３－１株及びＮＩＥＳ－１４４株の細胞増殖と色素蓄積）
ＢＧ１１培地及びＣＢ培地における、Ｄ３－１株の細胞増殖及び色素蓄積を、抗酸化作用が知られているアスタキサンチンを産生することが知られているヘマトコッカス・エスピー（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＮＩＥＳ－１４４株と比較して試験した。ヘマトコッカス・エスピー ＮＩＥＳ－１４４株は、国立環境研究所微生物系統保存施設（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ（ＮＩＥＳコレクション）、茨城県つくば市、日本）から株番号ＮＩＥＳ－１４４に基づいて入手することができる。
（Ｄ３－１株及びＮＩＥＳ－１４４株の細胞増殖と色素蓄積）
ＢＧ１１培地及びＣＢ培地における、Ｄ３－１株の細胞増殖及び色素蓄積を、抗酸化作用が知られているアスタキサンチンを産生することが知られているヘマトコッカス・エスピー（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＮＩＥＳ－１４４株と比較して試験した。ヘマトコッカス・エスピー ＮＩＥＳ－１４４株は、国立環境研究所微生物系統保存施設（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ（ＮＩＥＳコレクション）、茨城県つくば市、日本）から株番号ＮＩＥＳ－１４４に基づいて入手することができる。
【0149】
Ｄ３－１株及びＮＩＥＳ－１４４株のそれぞれの前培養液２ｍＬを、ＢＧ１１液体培地又はＣＢ液体培地５０ｍＬに接種し、これを５０ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内で、大気中（０．０４％ ＣＯ２下）、白色蛍光灯を用いて蛍光白色光（３０μｍｏｌ光量子／ｍ２／ｓ）を連続照射しながら、３０℃で１２６日間（４ヶ月間）にわたり静置培養（本培養）した（ＳＣＣ条件）。各培養液の濁度ＯＤ７３０（バイオマス量に相当）値を継時的に測定した。
【0150】
ＢＧ１１液体培地の組成は前述のとおりである。ＣＢ液体培地の組成を表５に示す。
【0151】
【表5】
【0152】
図１０に、各培養液のＯＤ７３０値の継時的変化を示す。図１０Ａ中の写真はＢＧ１１培地で培養し細胞内に赤系色素を蓄積したＤ３－１株の顕微鏡写真、図１０Ｂ中の写真はＣＢ培地で培養し細胞内に赤系色素を蓄積したＮＩＥＳ－１４４株の顕微鏡写真である。
【0153】
Ｄ３－１株はいずれの培地でも十分な増殖を示したが、上記の培養期間全体にわたってＢＧ１１培地の方がＣＢ培地よりも高いＯＤ７３０値（菌体培養液濁度）を示した（図１０Ａ）。Ｄ３－１株は、ＢＧ１１培地では培養開始から３３日後、ＣＢ培地では培養開始から５０日後には、やや赤味を帯び、緑色から朱色へと変化し始めたことが目視で観察された。ＢＧ１１培地で培養したＤ３－１株では９６日後～１２６日後には良好な色づきが認められ、細胞は鮮やかな朱色を呈した。
【0154】
一方、ＮＩＥＳ－１４４株は、培養開始から２２日後までは、ＢＧ１１培地よりもＣＢ培地を使用した場合の方が、高いＯＤ７３０値（菌体培養液濁度）を示した（図１０Ｂ）。２２日後以降は、ＮＩＥＳ－１４４株のＯＤ７３０値（菌体培養液濁度）は、逆にＣＢ培地よりもＢＧ１１培地を使用した場合の方が高くなり、その後はその傾向が１２６日後まで続いた（図１０Ｂ）。ＢＧ１１培地で培養したＮＩＥＳ－１４４は、培養開始から５０日後にはやや赤味を帯び、緑色から色が変化し始めた。ＣＢ培地で培養したＮＩＥＳ－１４４株は、培養開始から２２日後を過ぎた頃から細胞が徐々に赤味を帯びた緑色となって色づき始め、培養開始から３３日後までには明瞭な色変化を生じ、５０日後以降は赤色を呈したが、その赤色はＤ３－１株が呈した朱色とは異なり真紅に近い色（真紅細胞）であった。
【0155】
以上の結果に基づき、次の実験ではＢＧ１１培地で培養したＤ３－１株と、ＣＢ培地で培養したＮＩＥＳ－１４４株を使用することとした。
【0156】
［実施例９］
（Ｄ３－１株由来の色素抽出物の抗酸化能）
実施例８におけるＤ３－１株とＮＩＥＳ－１４４株の比較試験で用いたのと同じＳＣＣ培養条件で、Ｄ３－１株をＢＧ１１液体培地で３０日間又は９０日間、ＮＩＥＳ－１４４株をＣＢ液体培地で９０日間培養することにより、それぞれ、Ｄ３－１株の緑色細胞及び朱色細胞、並びにＮＩＥＳ－１４４株の真紅細胞の培養液を取得した。
（Ｄ３－１株由来の色素抽出物の抗酸化能）
実施例８におけるＤ３－１株とＮＩＥＳ－１４４株の比較試験で用いたのと同じＳＣＣ培養条件で、Ｄ３－１株をＢＧ１１液体培地で３０日間又は９０日間、ＮＩＥＳ－１４４株をＣＢ液体培地で９０日間培養することにより、それぞれ、Ｄ３－１株の緑色細胞及び朱色細胞、並びにＮＩＥＳ－１４４株の真紅細胞の培養液を取得した。
【0157】
Ｄ３－１株の緑色細胞及び朱色細胞、並びにＮＩＥＳ－１４４株の真紅細胞の培養液から、実施例５と同様のガラスビーズ破砕法により、ジエチルエーテル：クロロホルム：メタノール＝１：２：１液を溶媒として用いて細胞を破砕し、脂溶性画分を抽出し、得られた抽出液を色素抽出物とした。
【0158】
この抽出液（色素抽出物）をロータリーエバポレーターを用いて乾固させた後、エタノール（９９．５％）に溶解して原液エキス試料とし、「Ｄ３－１＿緑色エキス」（Ｄ３－１株の緑色細胞由来；３０日間培養後）、「Ｄ３－１＿朱色エキス」（Ｄ３－１株の朱色細胞由来；９０日間培養後）、及び「ＮＩＥＳ－１４４＿真紅エキス」（ＮＩＥＳ－１４４株の真紅細胞由来；９０日間培養後）と名付けた。
【0159】
Ｄ３－１＿緑色エキス（２１μｇ／μＬ）、Ｄ３－１＿朱色エキス（５３μｇ／μＬ）、及びＮＩＥＳ－１４４＿真紅エキス（１８μｇ／μＬ）、並びに抗酸化作用が知られているフコキサンチン（Ｆｘ；１０μｇ／μＬ； 市販品）及びβカロテン（βＣａｒ；１μｇ／μＬ；市販品）を原液とし、これらにエタノールを添加してそれぞれ５倍、２５倍に希釈した後、調製当日（０日）、及び遮光して－３０℃で７日間保管した後（７日）に、ＡＢＴＳ法で抗酸化能を測定した。
【0160】
ＡＢＴＳ法とは、ＡＢＴＳ（２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）二アンモニウム）と過硫酸カリウムを混合することで発生するＡＢＴＳラジカルが４１５ｎｍと７３４ｎｍに最大吸収波長を持つことを利用した抗酸化能（抗酸化活性）の測定法である。ＡＢＴＳ法では、抗酸化能を持つ物質の添加により、ＡＢＴＳラジカルに電子が与えられ、それによるＡＢＴＳラジカルの減少を吸光度の減少としてとらえ、間接的に抗酸化能を求める。この方法は、脂溶性・水溶性のいずれの物質の抗酸化能も測定することができるため、近年、食品の抗酸化能の測定にも多く用いられている。ＡＢＴＳ法による抗酸化能の測定は、具体的には、以下のとおり行った。まず、３．６ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳ水溶液と０．６６ｍｇ／ｍＬ 過硫酸カリウム水溶液を２０ｍＬずつ混合し、１０℃の暗闇条件で１８時間静置後、９９．５％ エタノールでＯＤ７３４＝０．７５±０．０５になるように希釈し、これをＡＢＴＳワーキング液とした。上記の３種類のエキス試料並びに陽性対照であるＦｘ及びβＣａｒ試料について、９９．５％ エタノールで、それぞれ試料濃度が、×１、×１／５（×０．２）、×１／２５（×０．０４）となるよう三段階希釈を行った。これらの試料を１００μＬずつ、１．５ｍＬ容エッペンチューブに分注し、さらに９００μＬのＡＢＴＳワーキング液を加え、全容１，０００μＬを室温・暗闇条件で５分間静置して反応させた。その後、エッペンチューブから２００μＬ取り、９６穴プレートに打ち込み、ＯＤ７３４で吸光度を測定した。算出された吸光度を以下の式に代入し、Ｓ％値を算出した。
【0161】
Ｓ％＝（［Ａｃｏｎｔｒｏｌ － Ａｔｅｓｔ］ ／ Ａｃｏｎｔｒｏｌ）×１００
【0162】
この式において、「Ａｃｏｎｔｒｏｌ」は陰性対照であるＡＢＴＳワーキング液２００μＬの吸光度、「Ａｔｅｓｔ」は試料１００μＬとＡＢＴＳワーキング液９００μＬの混合液から採取した２００μＬの吸光度の測定値である。測定は３連で行い、平均値を求めた。Ｓ％値は、酸化されずに残っているＡＢＴＳ量を、酸化されていない初期ＡＢＴＳの量（抗酸化能の最大値）［Ｓ＝１００％］に対する相対値で表したものであり、各試料の抗酸化能を示す。
【0163】
結果を図１１に示す。図１１では、グラフ縦軸の値が大きいほど抗酸化能が高いことを示す。試料濃度に依存したＳ％値が得られたことは、各試料が濃度に依存した抗酸化能を示したことを意味し、そのＳ％値が各試料の抗酸化能の指標として有効であることを示す。
【0164】
図１１に示されるように、Ｄ３－１＿朱色エキスは、フコキサンチン（Ｆｘ）、βカロテン（βＣａｒ）、及びＮＩＥＳ－１４４＿真紅エキスと比較して、より高い抗酸化能を示した。Ｄ３－１＿緑色エキスは、Ｄ３－１＿朱色エキスと比較してもさらに高い抗酸化能を示した。またＤ３－１株由来の色素抽出物は、いずれも、－３０℃で７日間保存した場合でも高い抗酸化能を維持していた。Ｄ３－１株由来の色素抽出物は、緑色細胞と朱色細胞のいずれに由来するものであっても高い抗酸化能を有することが示された。
【0165】
［実施例１０］
（Ｄ３－１株由来の色素抽出物の抗炎症能）
実施例９で取得した色素抽出物（色素エキス）の抗炎症能をグリース法によって測定した。
（Ｄ３－１株由来の色素抽出物の抗炎症能）
実施例９で取得した色素抽出物（色素エキス）の抗炎症能をグリース法によって測定した。
【0166】
マクロファージは、刺激が与えられて活性化すると、代表的な炎症メディエーターの１つである一酸化窒素（ＮＯ）を発生する。グリース法では、マクロファージにより産生されたＮＯが酸化され、水と反応して亜硝酸や硝酸になり、この発生した亜硝酸とグリース試薬に含まれるスルファニルアミドが反応してジアゾニウム塩となり、Ｎ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ＮＥＤ）とのカップリングが起きることで、５４０～５５０ｎｍに最大吸収波長をもつアゾ色素が発生する。このアゾ色素の量を５４０～５５０ｎｍでの吸光度を測定することにより算出し、それをマクロファージのＮＯ産生量の指標値とし、そのＮＯ産生量に基づいて間接的に抗炎症能を評価できる。ＮＯの発生が過剰であると、炎症の悪化や発がんなどの原因となり、人体に悪影響をもたらすとされ、そのため、特に産生量の多いマクロファージのＮＯ産生量の制御が炎症の制御に有効であると考えられている。
【0167】
具体的には、まず、実施例９で取得した色素抽出物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、その後、添加後のＤＭＳＯ濃度が０．１％以下になるよう、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈を行った。この希釈後のＤ３－１＿朱色エキス（１７．５μｇ／μＬ）及びＤ３－１＿緑色エキス（６．５０μｇ／μＬ）を原液（ｘ１.０）とし、さらに濃度が１／５（ｘ０．２）、１／２５（ｘ０．０４）となるようＰＢＳで三段階希釈した。この希釈液１０μＬを、９６穴プレートに予め分注しておいたリポポリサッカライド（ＬＰＳ，最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を含むマウスマクロファージ由来細胞株ＲＡＷ２６４培養液１００μＬ（１．０×１０５細胞／ウェル；理化学研究所バイオリソース研究センター細胞バンク（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ））へ添加した。得られた反応液を３７℃のインキュベーター内（５％ ＣＯ２ガス供給下）で１２時間静置した。その後、反応液５０μＬに５０μＬのスルファニルアミドを添加してから８分間静置し、続いてＮ－１－ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ＮＥＤ）液を５０μＬ追加し、さらに８分間静置して反応させた。この反応液について５４０ｎｍでの吸光度を測定することによりアゾ色素の量を決定し、それをＮＯ生産量の指標値とした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、３回の独立した試験によって算出した。
【0168】
その結果を図１２に示す。図１２では、各処理区のＮＯ生成量を、色素抽出物を添加せずにＬＰＳとＤＭＳＯを添加した陽性対照（ＬＰＳによる炎症誘導区）におけるＮＯ生成量を１００％とした場合の相対値で表している。ＲＡＷ２６４株をはじめとするマクロファージ系細胞は、ＬＰＳ（リポ多糖）等の刺激により活性化されると一酸化窒素（ＮＯ）などの炎症性メディエーターを産生し、それにより炎症反応が誘発される。被験物質存在下での、ＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４株からのＮＯ生成量の低減（ＮＯ生成の抑制）は、その被験物質が抗炎症能を有することを示す。なお図１２では、グラフ縦軸の値が小さいほど抗炎症能が高いことを示す。
【0169】
図１２に示されるように、Ｄ３－１＿朱色エキス及びＤ３－１＿緑色エキス添加区ではいずれも陽性対照と比較してＮＯ生成が顕著に抑制され、さらに、そのＮＯ生成抑制レベルは色素抽出物の添加濃度に依存していたことから、Ｄ３－１＿朱色エキス及びＤ３－１＿緑色エキスはいずれも高い抗炎症能を有することが示された。添加濃度を考慮すると、Ｄ３－１＿緑色エキスが示した抗炎症能は、Ｄ３－１＿朱色エキスと比較しても約７倍高かった。
【産業上の利用可能性】
【0170】
本発明のＤ３－１株及びその培養方法は、脂肪酸として例えばパルミチン酸（Ｃ１６：０）やオレイン酸（Ｃ１８：１）を高比率で含む脂質（油脂）、及びエキネノンやカンタキサンチンなどのカロテノイド色素を短期間で効率良く生産するために有利に利用することができる。本発明のＤ３－１株は屋内又は屋外大規模培養にも好適である。本発明のＤ３－１株由来の機能性藻素材は機能性の食品、飼料、化粧品、医薬品等の製造に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【0171】
配列番号１：９３Ｆプライマー
配列番号２：ＩＴＳ２－ｒプライマー
配列番号３：１８Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ１－５．８Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ２領域
配列番号２：ＩＴＳ２－ｒプライマー
配列番号３：１８Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ１－５．８Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ２領域
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】