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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023164109
(43)【公開日】2023-11-10
(54)【発明の名称】Ｌ型アミノ酸トランスポーター１を標的とした高分子
(51)【国際特許分類】
A61K 47/60 20170101AFI20231102BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231102BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231102BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20231102BHJP
C08G 69/10 20060101ALI20231102BHJP
【ＦＩ】
A61K47/60
A61K45/00
A61P35/00
A61K47/54
C08G69/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022075447
(22)【出願日】2022-04-28
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「医療研究開発推進事業費補助金 橋渡し研究戦略的推進プログラム補助事業」、「オープンイノベーションの推進により世界のつくばから医療の未来を加速開拓する事業」、「シーズＡ１９－３３がん関連アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１を標的とした光増感剤の開発」産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(71)【出願人】
【識別番号】307010166
【氏名又は名称】第一三共株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(72)【発明者】
【氏名】西山 伸宏
(72)【発明者】
【氏名】野本 貴大
(72)【発明者】
【氏名】カク コウシン
(72)【発明者】
【氏名】ヴン ヤン ミン
(72)【発明者】
【氏名】徐 文
(72)【発明者】
【氏名】金盛 開人
(72)【発明者】
【氏名】山田 直生
(72)【発明者】
【氏名】松井 誠
(72)【発明者】
【氏名】武元 宏泰
(72)【発明者】
【氏名】荻山 朋子
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4J001
【Ｆターム（参考）】
4C076AA94
4C076AA95
4C076CC27
4C076DD51
4C076EE23
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF32
4C084AA17
4C084NA12
4C084NA13
4C084ZB26
4J001DA01
4J001DA02
4J001DB02
4J001DB05
4J001DC05
4J001DC12
4J001DD07
4J001DD13
4J001DD20
4J001EA36
4J001ED64
4J001EE28C
4J001EE44C
4J001EE72C
4J001FA03
4J001FA06
4J001FA07
4J001FB01
4J001FC01
4J001GA01
4J001GA05
4J001GA13
4J001GD02
4J001GD08
4J001JA20
4J001JB01
4J001JB03
4J001JB50
4J001JC01
(57)【要約】
【課題】本願発明は、体内残存時間が長い、がん標的治療のためのコンジュゲート、並びに薬物送達システムを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）結合部位に薬物を結合させたコンジュゲートであって、ＬＡＴ１結合部位が、下記構造：
を有する化合物又は薬学的に許容される塩であり、特に、Ｒ１が、メチオニン様構造又はチロシン様構造であることによって特徴付けられる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）結合部位に薬物を結合させたコンジュゲートであって、ＬＡＴ１結合部位が、下記構造：
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）結合部位に薬物を結合させたコンジュゲートであって、
ＬＡＴ１結合部位が、下記構造：
〔式中、
Ｒ１は、メチオニン様構造又はチロシン様構造を表し、ここで、メチオニン様構造が、
であり、チロシン様構造が、
であり；
Ｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１－１０アルキル基、置換されていてもよいＣ１－１０アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、又は薬物であり；
Ｒ３及びＲ４は、独立して、水素原子又は－Ｌ３－薬物であり；
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、独立して、リンカーであるか又は存在せず；
ｘは、０～１０００の整数であり；
ｙは、２～１０００の整数であり；並びに
各繰り返し単位の結合順は任意である〕
を有する化合物又は薬学的に許容される塩である、上記コンジュゲート。
ＬＡＴ１結合部位が、下記構造：
【化1】
Ｒ１は、メチオニン様構造又はチロシン様構造を表し、ここで、メチオニン様構造が、
【化2】
【化3】
Ｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１－１０アルキル基、置換されていてもよいＣ１－１０アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、又は薬物であり；
Ｒ３及びＲ４は、独立して、水素原子又は－Ｌ３－薬物であり；
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、独立して、リンカーであるか又は存在せず；
ｘは、０～１０００の整数であり；
ｙは、２～１０００の整数であり；並びに
各繰り返し単位の結合順は任意である〕
を有する化合物又は薬学的に許容される塩である、上記コンジュゲート。
【請求項2】
Ｒ１がメチオニン様構造である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項3】
Ｒ１がチロシン様構造である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項4】
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３が、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキレン基であり、該Ｃ１－４０アルキレン基中のメチレン基は、１～１０個のオキソ基、ＮＨ、又は重合度が２～２，０００のポリオキシアルキレンで置換されていてもよい、請求項１～３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項5】
ｘが３０～１００の整数であり、ｙが１０～７０の整数である、請求項１～４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項6】
ｙ／（ｘ＋ｙ）の値が０．５以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項7】
薬物が、低分子化合物、中分子化合物、及び抗体からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項8】
薬物が、抗がん剤、光増感剤、核酸医薬、細胞毒性を有するタンパク質、及び体内診断薬からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項9】
薬物が抗がん剤又は光増感剤である、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項10】
脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肺がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ－イング腫及び軟部肉腫からなる群から選択されるがんの治療に用いられる、請求項８又は９に記載のコンジュゲート。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項12】
脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肺がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ－イング腫及び軟部肉腫からなる群から選択されるがんの治療に用いられる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がん標的治療のための、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）を標的としたメチオニン／チロシン修飾高分子及びコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0002】
がん細胞がグルコーストランスポーターを過剰発現することは周知であるが、最近の研究では、アミノ酸トランスポーターも過剰発現していることが明らかになっている（非特許文献1及び２）。特に、ＳＬＣ７Ａ５とも呼ばれるＬ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）が注目されている。ＬＡＴ１は、フェニルアラニンやメチオニンなどの嵩高い疎水的な側鎖を持つ中性アミノ酸を輸送するＮａ＋非依存性中性アミノ酸トランスポーターとして分類される（非特許文献３及び４）。
【0003】
先行研究によると、ＬＡＴ１の過剰発現は様々な種類のがん細胞で観察できることが示されたが（非特許文献５～７）、正常な臓器では血液脳関門、胎盤、神経血管など極めて限定的な部位でのみ発現している（非特許文献４）。したがって、ＬＡＴ１は、がんの診断と治療の有望な標的と見なされてきた。例えば、１１Ｃ－メチオニン－（３－１８Ｆ）－α－メチルチロシンは、ＬＡＴ１を介してがん細胞に取り込まれ、ＰＥＴを使用したがんのイメージングに利用されている（非特許文献８）。ホウ素中性子捕捉療法に使用されるｐ－ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）もＬＡＴ１を介して取り込まれる治療薬である（非特許文献９および１０）。
【0004】
上述のＬＡＴ１に対する薬剤は全て低分子であり、トランスポーターを通過できないような嵩高い薬剤や高分子薬剤への応用はいまだ限定的である。いくつかの研究では、フェニルアラニン誘導体で装飾された高分子とナノ粒子が報告されており、ＬＡＴ１認識による効率的な細胞取り込みが示されているが、ＬＡＴ１ターゲティングを介してインビボでのドラッグデリバリーを成功させた研究はごくわずかである非特許文献１１及び１２）。特に、ＬＡＴ１を標的とした高分子を用いて生体内で光線力学療法を成功させた報告例はない。これは、インビボという複雑な環境においてもなおＬＡＴ１への選択性を維持する薬物送達システムを開発することが困難だからであると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】E.L. Lieu, T. Nguyen, S. Rhyne, J. Kim, Amino acids in cancer, Exp. Mol. Med. 52 (2020) 15-30. https://doi.org/10.1038/s12276-020-0375-3
【非特許文献2】Y.D. Bhutia, E. Babu, S. Ramachandran, V. Ganapathy, Amino acid transporters in cancer and their relevance to "glutamine addiction": Novel targets for the design of a new class of anticancer drugs, Cancer Res. 75 (2015) 1782-1788. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-14-3745
【非特許文献3】E.M. del Amo, A. Urtti, M. Yliperttula, Pharmacokinetic role of l-type amino acid transporters lat1 and lat2, Eur. J. Pharm. Sci. 35 (2008) 161-174.
【非特許文献4】S.E. Jin, H.E. Jin, S.S. Hong, Targeting l-type amino acid transporter 1 for anticancer therapy: Clinical impact from diagnostics to therapeutics, Expert. Opin. Ther. Targets 19 (2015) 1319-1337.
【非特許文献5】H. Betsunoh, T. Fukuda, N. Anzai, D. Nishihara, T. Mizuno, H. Yuki, A. Masuda, Y. Yamaguchi, H. Abe, M. Yashi, Y. Fukabori, K. Yoshida, T. Kamai, Increased expression of system large amino acid transporter (lat)-1 mrna is associated with invasive potential and unfavorable prognosis of human clear cell renal cell carcinoma, BMC Cancer 13 (2013) 509. https://doi.org/10.1186/1471-2407-13-509
【非特許文献6】Z. Liang, H.T. Cho, L. Williams, A. Zhu, K. Liang, K. Huang, H. Wu, C. Jiang, S. Hong, R. Crowe, M.M. Goodman, H. Shim, Potential biomarker of l-type amino acid transporter 1 in breast cancer progression, Nucl. Med. Mol. Imaging 45 (2011) 93-102. https://doi.org/10.1007/s13139-010-0068-2
【非特許文献7】O. Yanagida, Y. Kanai, A. Chairoungdua, D.K. Kim, H. Segawa, T. Nii, S.H. Cha, H. Matsuo, J. Fukushima, Y. Fukasawa, Y. Tani, Y. Taketani, H. Uchino, J.Y. Kim, J. Inatomi, I. Okayasu, K. Miyamoto, E. Takeda, T. Goya, H. Endou, Human l-type amino acid transporter 1 (lat1): Characterization of function and expression in tumor cell lines, Biochim. Biophys. Acta 1514 (2001) 291-302. https://doi.org/10.1016/s0005-2736(01)00384-4
【非特許文献8】K. Kubota, T. Matsuzawa, M. Ito, K. Ito, T. Fujiwara, Y. Abe, S. Yoshioka, H. Fukuda, J. Hatazawa, R. Iwata, S. Watanuki, T. Ido, Lung-tumor imaging by positron emission tomography using c-11 l-methionine, J. Nucl. Med. 26 (1985) 37-42.
【非特許文献9】P. Wongthai, K. Hagiwara, Y. Miyoshi, P. Wiriyasermkul, L. Wei, R. Ohgaki, I. Kato, K. Hamase, S. Nagamori, Y. Kanai, Boronophenylalanine, a boron delivery agent for boron neutron capture therapy, is transported by atb0,+, lat1 and lat2, Cancer Sci. 106 (2015) 279-286. https://doi.org/10.1111/cas.12602
【非特許文献10】A. Wittig, W. Sauerwein, J. Coderre, J. Coderre, Mechanisms of transport of p-borono-phenylalanine through the cell membrane in vitro, Radiat. Res. 153 (2000) 173-180
【非特許文献11】E. Puris, M. Gynther, S. Auriola, K.M. Huttunen, L-type amino acid transporter 1 as a target for drug delivery, Pharm. Res. 37 (2020) 1-17. https://doi.org/Artn 8810.1007/S11095-020-02826-8
【非特許文献12】S. Takano, K. Sakurai, S. Fujii, Internalization into cancer cells of zwitterionic amino acid polymers via amino acid transporter recognition, Polym. Chem. 12 (2021) 6083-6087. https://doi.org/10.1039/d1py01010g
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、体内残存時間が長い、がん標的治療のためのコンジュゲート、並びに薬物送達システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ＬＡＴ１の基質となるメチオニン又はチロシン構造を側鎖に導入することにより、ＬＡＴ１を標的として薬物を腫瘍に選択的に集積させ、効率的な抗がん療法を提供することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0008】
メチオニンと類似した構造を有するシステインを側鎖に導入した高分子を使用した場合、メチオニンを導入した高分子と比較してＬＡＴ１に対する選択性が見られず、腫瘍集積性も比較的低いことが示された。このことから、側鎖構造を微調整することによりＬＡＴ１への選択性を高められることもまた見出された。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）結合部位に薬物を結合させたコンジュゲートであって、
ＬＡＴ１結合部位が、下記構造：
［１］Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）結合部位に薬物を結合させたコンジュゲートであって、
ＬＡＴ１結合部位が、下記構造：
【0010】
【化1】
【0011】
〔式中、
Ｒ１は、メチオニン様構造又はチロシン様構造を表し、ここで、メチオニン様構造が、
Ｒ１は、メチオニン様構造又はチロシン様構造を表し、ここで、メチオニン様構造が、
【0012】
【化2】
【0013】
であり、チロシン様構造が、
【0014】
【化3】
【0015】
であり；
Ｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１－１０アルキル基、置換されていてもよいＣ１－１０アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、又は薬物であり；
Ｒ３及びＲ４は、独立して、水素原子又は－Ｌ３－薬物であり；
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、独立して、リンカーであるか又は存在せず；
ｘは、０～１０００の整数であり；
ｙは、２～１０００の整数であり；並びに
各繰り返し単位の結合順は任意である〕
を有する化合物又は薬学的に許容される塩である、上記コンジュゲート。
［２］Ｒ１がメチオニン様構造である、［１］に記載のコンジュゲート。
［３］Ｒ１がチロシン様構造である、［１］に記載のコンジュゲート。
［４］Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３が、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキレン基であり、該Ｃ１－４０アルキレン基中のメチレン基は、１～１０個のオキソ基、ＮＨ、又は重合度が２～２，０００のポリオキシアルキレンで置換されていてもよい、［１］～［３］のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
［５］ｘが３０～１００の整数であり、ｙが１０～７０の整数である、［１］～［４］のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
［６］ｙ／（ｘ＋ｙ）の値が０．５以下である、［１］～［５］のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
［７］薬物が、低分子化合物、中分子化合物、及び抗体からなる群から選択される、［１］～［６］のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
［８］薬物が、抗がん剤、光増感剤、核酸医薬、細胞毒性を有するタンパク質、及び体内診断薬からなる群から選択される、［１］～［６］のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
［９］薬物が抗がん剤又は光増感剤である、［８］に記載のコンジュゲート。
［１０］脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肺がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ－イング腫及び軟部肉腫からなる群から選択されるがんの治療に用いられる、［８］又は［９］に記載のコンジュゲート。
［１１］［１］～［１０］のいずれか１項に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［１２］脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肺がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ－イング腫及び軟部肉腫からなる群から選択されるがんの治療に用いられる、［１１］に記載の医薬組成物。
Ｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１－１０アルキル基、置換されていてもよいＣ１－１０アルコキシ基、チオール基、シアノ基、アジド基、又は薬物であり；
Ｒ３及びＲ４は、独立して、水素原子又は－Ｌ３－薬物であり；
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、独立して、リンカーであるか又は存在せず；
ｘは、０～１０００の整数であり；
ｙは、２～１０００の整数であり；並びに
各繰り返し単位の結合順は任意である〕
を有する化合物又は薬学的に許容される塩である、上記コンジュゲート。
［２］Ｒ１がメチオニン様構造である、［１］に記載のコンジュゲート。
［３］Ｒ１がチロシン様構造である、［１］に記載のコンジュゲート。
［４］Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３が、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキレン基であり、該Ｃ１－４０アルキレン基中のメチレン基は、１～１０個のオキソ基、ＮＨ、又は重合度が２～２，０００のポリオキシアルキレンで置換されていてもよい、［１］～［３］のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
［５］ｘが３０～１００の整数であり、ｙが１０～７０の整数である、［１］～［４］のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
［６］ｙ／（ｘ＋ｙ）の値が０．５以下である、［１］～［５］のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
［７］薬物が、低分子化合物、中分子化合物、及び抗体からなる群から選択される、［１］～［６］のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
［８］薬物が、抗がん剤、光増感剤、核酸医薬、細胞毒性を有するタンパク質、及び体内診断薬からなる群から選択される、［１］～［６］のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
［９］薬物が抗がん剤又は光増感剤である、［８］に記載のコンジュゲート。
［１０］脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肺がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ－イング腫及び軟部肉腫からなる群から選択されるがんの治療に用いられる、［８］又は［９］に記載のコンジュゲート。
［１１］［１］～［１０］のいずれか１項に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［１２］脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肺がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ－イング腫及び軟部肉腫からなる群から選択されるがんの治療に用いられる、［１１］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【0016】
本発明のメチオニン／システイン修飾高分子及びコンジュゲートを用いることにより、がんに選択的に薬物を送達させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1A】ＰＥＧ－ＰＢＬＡ９７（２ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ－ｄ６中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図1B】ＰＥＧ－ＰＢＬＡ２７（２ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ－ｄ６中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図2A】ＰＢＬＡ１００（２ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ－ｄ６中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図2B】ＰＢＬＡ５７（２ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ－ｄ６中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図3A】ＰＡｓｐ１１０（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図3B】ＰＡｓｐ５７（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図4A】ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９７（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図4B】ＰＥＧ－ＰＡｓｐ２７（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図5A】ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６０／Ａｓｐ（Ａｌｌ）３７］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した。
【図5B】ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ１２／Ａｓｐ（Ａｌｌ）１５］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した。
【図6A】Ｐ［Ａｓｐ５９／Ａｓｐ（Ａｌｌ）５１］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した。
【図6B】Ｐ［Ａｓｐ１９／Ａｓｐ（Ａｌｌ）３８］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した。
【図7A】Ｐ［Ａｓｐ７０／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）４０］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図7B】Ｐ［Ａｓｐ３３／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）２４］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図8A】ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６０／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３７］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図8B】ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ１４／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）１３］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図9】Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３６］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図10】ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６０／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３７］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図11】ＦＣＭによるＣｙ５標識したＭｅｔ／Ｃｙｓ高分子の細胞取り込み評価を示す。（ａ）ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ、（ｂ）ＣＴ２６、（ｃ）ＢｘＰＣ３及びＮＩＨ３Ｔ３。結果を平均±ＳＤとして表す（ｎ＝５）。Ｔｕｋｅｙ法により一元配置分散分析を用いて統計分析を行った（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図12】ＦＣＭによるＣｙ５標識したＭｅｔ高分子の細胞取り込み評価を示す。（ａ）ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ、（ｂ）ＣＴ２６、（ｃ）ＢｘＰＣ３。結果を平均±ＳＤとして表す（ｎ＝５）。Ｔｕｋｅｙ法により一元配置分散分析を用いて統計分析を行った（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図13】Ｃｙ５標識した高分子の細胞内取り込みの定量的分析を示す図である。（ａ）ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ、（ｂ）ＣＴ２６、（ｃ）ＢｘＰＣ３。結果を平均±ＳＤとして表す（ｎ＝６）。多重比較法により二元配置分散分析を用いて統計分析を行った（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図14】高分子の細胞内分布を示す図である。（ａ）ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ及びＢｘＰＣ３細胞において２μＭのＣｙ５濃度とインキュベートした３０分、１時間、２時間及び３時間後のＭｅｔ官能化ポリマーの細胞内分布の蛍光画像。（ｂ）ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ及びＢｘＰＣ３細胞株において２μＭのＣｙ５濃度とインキュベートした３時間後のＣｙｓ官能化ポリマーの細胞内分布の蛍光画像。（ｃ）ＣＴ２６細胞株において２μＭのＣｙ５濃度とインキュベートした３時間後のＭｅｔ／Ｃｙｓ官能化ポリマーの細胞内分布の蛍光画像。スケールバーは１０μｍで示される。
【図15A】フローサイトメトリーによって分析された阻害研究を示す図である。ＳＫＯＶ３－ＬｕｃをＢＣＨ（システムＬ阻害剤）、ＢｚｌＳｅｒ（ＡＳＣＴ２阻害剤）又はＭｅＡＩＢ（システムＡ阻害剤）とインキュベートした。結果を平均±ＳＤとして表す（ｎ＝５）。スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図15B】フローサイトメトリーによって分析された阻害研究を示す図である。ＣＴ２６をＢＣＨ（システムＬ阻害剤）、ＢｚｌＳｅｒ（ＡＳＣＴ２阻害剤）又はＭｅＡＩＢ（システムＡ阻害剤）とインキュベートした。結果を平均±ＳＤとして表す（ｎ＝５）。スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図15C】フローサイトメトリーによって分析された阻害研究を示す図である。ＢｘＰＣ３をＢＣＨ（システムＬ阻害剤）、ＢｚｌＳｅｒ（ＡＳＣＴ２阻害剤）又はＭｅＡＩＢ（システムＡ阻害剤）とインキュベートした。結果を平均±ＳＤとして表す（ｎ＝５）。スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図16】Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］のインビトロでのＰＤＴを示す。（ａ）光毒性、（ｂ）暗毒性。細胞をＰｐａ－Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］とともに３時間インキュベートし、光毒性については、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、新鮮な培地で３．０ｍＷ／ｃｍ２で１時間ハロゲンランプ光照射を行った。暗毒性については、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、光照射なしで新鮮な培地でインキュベートした。結果を平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝６）。多重比較法により二元配置分散分析を用いて統計分析を行った（＊＊＊＊ｐ＜０．０５）。
【図17】ＬＡＴ１免疫組織化学検査を示す。腹腔内播種モデルは、がん細胞の腹腔内注射によって確立された。マウスから組織を採取し、５μｍで切片化する２時間前に４％ＰＦＡで固定した。ヘマトキシリン染色を受けた試料を２０倍で示した。スケールバーは５０μｍを示す。
【図18】腹膜播種モデルにおけるポリマーの生体内分布評価を示す。（ａ）ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ腹膜播種モデルにおける生体内分布。示されるポリマーを１時間の腹腔内注射後に組織を取り出した。組織の生物発光／蛍光（ｅｘ／ｅｍ＝６３０ｎｍ／６９０ｎｍ）画像とＣｙ５の分布をＩＶＩＳによって撮像した。（ｂ）ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ腫瘍モデルにおけるポリマー生体内分布の定量分析。ポリマーの放射効率測定は、画像処理に使用されるＬｉｖｅＩｍａｇｅソフトウェアによって自動的に割り当てられた。腫瘍の平均放射効率を生物発光領域の全蛍光として表した。結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。Ｔｕｋｅｙの多重比較法により二元配置分散分析を用いて統計分析を行った（＊＊ｐ＜０．０１）。（ｃ）ＢｘＰＣ３腫瘍モデルにおけるＩＶＩＳを使用した１時間のポリマー注入後の組織のポリマー蓄積の代表的な蛍光（ｅｘ／ｅｍ＝６１０ｎｍ／６９０ｎｍ）画像。（ｄ）蛍光強度（ｅｘ／ｅｍ＝６３０ｎｍ／６８０ｎｍ）によって定量化され、注入された用量／ｇ組織のパーセンテージとして表される、ＢｘＰＣ３腫瘍モデルにおけるポリマーの生体内分布。（ｅ）腫瘍／血液及び腫瘍肝の比率。結果を平均±ＳＤとして表す（ｎ＝３）。スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図19】ＣＴ２６腹膜播種モデルにおける生体内分布を示す。（ａ）組織の蛍光（ｅｘ／ｅｍ＝６３０ｎｍ／６９０ｎｍ）画像とＣｙ５の分布をＩＶＩＳによって撮像した。（ｂ）ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるポリマー生体内分布の定量分析。ポリマーの腹腔内注射の１時間後に組織を取り出した。腫瘍の画像とＣｙ５の分布をＩＶＩＳによって撮像した。（ｃ）ポリマーの１時間の腹腔内注射後の正常な臓器における生体内分布。
【図20】ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ腹膜播種モデルにおける抗腫瘍能力を示す。ＰＤＴ後のＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ腫瘍の生物発光画像。Ｐｐａ修飾ポリマーの投与量は０．１ｍｇ／マウスである。発光画像を光照射の０、５、１０、１５、２０日後に収集した。
【図21】平均腫瘍成長曲線を示す。腫瘍成長をマウス腹部の総生物発光として表した。結果を平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表す。Ｔｕｋｅｙの多重比較法により二元配置分散分析を用いて統計分析を行った（＊ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図22】ポリマー注入後の光照射なしのＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ腫瘍の生物発光画像を示す。Ｐｐａ修飾ポリマーの投与量は０．１ｍｇ／マウスである。発光画像を０、５、１０、１５、２０日目に収集した。
【図23】抗腫瘍研究（光刺激グループ）の終了時のＳＫＯＶ－Ｌｕｃ腹膜播種モデルにおける肝臓及び膵臓の腫瘍増殖のエクスビボ画像を示す。ルシフェリンを５分間、腹腔内注射した後、組織を取り出した。
【図24】ＰＤＴを用いた場合と用いない場合の相対的なマウスの体重曲線を示す図である。Ｍｅｔ修飾ポリマーは、光照射により腫瘍抑制能力を示したが、光照射の有無にかかわらず副作用を誘発しなかった。これらの結果は、Ｍｅｔ修飾ポリマーがＰＤＴに大きな可能性を秘めていることを示唆する。
【図25】Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡ９５の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図26】Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＡｓｐ９５の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図27】Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図28】Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図29】Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図30】Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図31】Ｃｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の阻害研究を示す。ＢｘＰＣ３細胞を１０ｍＭのＢＣＨ溶液で処理した後、それぞれの２．０μＭのＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］培地溶液を含む１０ｍＭのＢＣＨで３時間処理し、フローサイトメトリー分析を行った。結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。統計的有意性は、スチューデントｔ検定を使用して評価された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図32】Ｃｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の細胞取り込みを示す。ＢｘＰＣ３細胞を１０ｍＭのＢＣＨ溶液で処理した後、それぞれ２．０μＭのＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］培地溶液を含む１０ｍＭのＢＣＨで３時間処理し、フローサイトメトリー分析を行った。結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。統計的有意性は、スチューデントｔ検定を使用して評価された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図33】ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍モデル（ｎ＝３）においてＩＶＩＳ（ｅｘ／ｅｍ＝６４０／７００ｎｍ）によって正常な臓器（脾臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、腫瘍）で観察された蛍光を示す。
【図34】ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍モデル（ｎ＝３）におけるＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の腫瘍蓄積を示す。結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。Ｔｕｋｅｙの多重比較法により二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて統計分析を行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図35】ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍モデルの正常な臓器（脾臓、腎臓、肝臓、肺、心臓）におけるＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の生体内分布を示す。結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図36】ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍モデルにおけるＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の血液保持を示す。結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。
【図37】ＢｘＰＣ３細胞におけるＰｐａ結合ポリマーの光毒性を示す。結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝６）。
【図38】ＢｘＰＣ３細胞におけるＰＰａ結合ポリマーの暗毒性を示す。暗毒性について、暗毒性については、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、光照射なしに新鮮な培地中でインキュベートした。結果を平均±ＳＤとして示す（ｎ＝６）。
【図39】ＢｘＰＣ３細胞を皮下播種されたＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける、各種ポリマーの腹腔内投与後の経時的な腫瘍サイズの変化を観察した結果を示す。
【図40】ＢｘＰＣ３細胞を皮下播種されたＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける、各種ポリマーの腹腔内投与後の経時的な体重変化を観察した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明に係るＬ型アミノ酸トランスポーター１（以下、単に「ＬＡＴ１」と称することがある）結合部位及びコンジュゲートについて説明する。ＬＡＴ１は、様々ながん細胞で発現するアミノ酸トランスポーターであり、腫瘍標的における有望な標的分子と考えられている。
【0019】
本発明によれば、親水性高分子の側鎖に１又は複数のメチオニン／チロシン構造を結合させることにより、ＬＡＴ１を標的とする薬物送達システムを提供することができる。後述するように、メチオニン（Ｍｅｔ）修飾ＬＡＴ１結合部位又はチロシン（Ｔｙｒ）修飾ＬＡＴ１結合部位は、ＬＡＴ１介在型エンドサイトーシスによりがん細胞に効率的に取り込まれ、優れた腫瘍集積性を示す。さらに、抗がん剤（又は抗腫瘍剤）を結合させることにより、有意な抗腫瘍効果をもたらすことができる。
【0020】
１．アミノ酸トランスポーター
アミノ酸トランスポーターは、生体において、ごく限られた正常組織（例えば、脳血管内皮細、胎盤）に存在するが、がん細胞ではその発現が顕著であることが知られている。また、アミノ酸トランスポーターの中には、がん細胞特異的に発現するものもある。がん特異的であるＬＡＴ１は、がん診断マーカー及び治療の分子標的として着目されつつある。
アミノ酸トランスポーターは、生体において、ごく限られた正常組織（例えば、脳血管内皮細、胎盤）に存在するが、がん細胞ではその発現が顕著であることが知られている。また、アミノ酸トランスポーターの中には、がん細胞特異的に発現するものもある。がん特異的であるＬＡＴ１は、がん診断マーカー及び治療の分子標的として着目されつつある。
【0021】
天然のアミノ酸には、タンパク質を構成するアミノ酸として２１種類があり、これらのアミノ酸の側鎖の違いにより各アミノ酸の性質が大きく相違することは周知である。生体には、このような多様性のアミノ酸を適切な細胞等に輸送するために、性質の類似したアミノ酸群を基質とする各種のアミノ酸トランスポーターが存在する。アミノ酸トランスポーターは、細胞内小器官に存在する小胞膜型と、これとは異なる細胞膜型とに分類され、後者は、分子クローニング以前にはアミノ酸輸送システムとして機能上の特徴に基づいて、ｓｙｓｔｅｍ Ｌやｓｙｓｔｅｍ Ｂ０，＋などに分類されていた。
【0022】
がん細胞において発現が上昇しているアミノ酸トランスポーターに関して、その一部であるが、以下の表１に示されるような情報が得られている（永森ら、生化学、第８５巻、第３号、３３８～３４４頁（２０１４年）参照）。
【0023】
【表1】
【0024】
２．メチオニン／チロシン修飾したＬＡＴ１結合部位
本発明のメチオニン／チロシン修飾したＬＡＴ１結合部位は、下記の一般式（Ｉ）：
本発明のメチオニン／チロシン修飾したＬＡＴ１結合部位は、下記の一般式（Ｉ）：
【0025】
【化4】
【0026】
で表される構造を有するポリアスパラギン酸を含む重合体である。以下、本発明の上記重合体をより詳細に説明するために、本明細書では、上記式（Ｉ）中の「／（スラッシュ）」で区切られた右側部分を「Ａセグメント」と称し、左側部分を「Ｂセグメント」と称することがある。本発明の重合体をより良く理解するために、便宜上、上記式（Ｉ）では、Ｂセグメント－Ａセグメントの順に記載されているが、ｘ及びｙによって特定される繰り返し単位の構成及び順序は任意であってもよく、例えば、ブロックの形態であってもよく、又はランダムの形態であってもよい。後述するように、Ｂセグメントでは、ｘ＝０も取り得ることから、Ａセグメントを単独に繰り返したホモポリマーの形態であってもよい。
【0027】
（１）Ａセグメント
本発明のＬＡＴ１結合部位は、ＬＡＴ１介在型エンドサイトーシスにより細胞（特に、がん細胞）内に取り込まれる。Ａセグメント中のＲ１は、ＬＡＴ１に対する輸送基質を表し、メチオニン、チロシン、メチオニン誘導体、チロシン誘導体等を挙げることができる。輸送基質としては、特に、メチオニン、チロシンが好ましい。メチオニン、チロシン、メチオニン誘導体、及びチロシン誘導体の結合位置を明確にするために、メチオニン及びメチオニン誘導体については「メチオニン様構造」とし、チロシン及びチロシン誘導体については「チロシン様構造」とする用語を用いて、具体的に説明する。なお、これらのアミノ酸はＬ型であることが好ましい。
本発明のＬＡＴ１結合部位は、ＬＡＴ１介在型エンドサイトーシスにより細胞（特に、がん細胞）内に取り込まれる。Ａセグメント中のＲ１は、ＬＡＴ１に対する輸送基質を表し、メチオニン、チロシン、メチオニン誘導体、チロシン誘導体等を挙げることができる。輸送基質としては、特に、メチオニン、チロシンが好ましい。メチオニン、チロシン、メチオニン誘導体、及びチロシン誘導体の結合位置を明確にするために、メチオニン及びメチオニン誘導体については「メチオニン様構造」とし、チロシン及びチロシン誘導体については「チロシン様構造」とする用語を用いて、具体的に説明する。なお、これらのアミノ酸はＬ型であることが好ましい。
【0028】
「メチオニン様構造」は、
【0029】
【化5】
【0030】
を有するが、本発明によれば、天然型メチオニン（すなわち、Ｒ３が水素原子である）を構造に有するＡセグメントと同様の作用効果を得ることができれば、メチオニン誘導体を有するＡセグメントを使用してもよい。メチオニン誘導体には、立体異性体及び鏡像異性体が含まれ、異なる異性体型で存在可能であり得る。メチオニン誘導体としては、限定されないが、例えば、メチオニンのエステル、メチオニンアミド、メチオニンアミドのエステル、メチオニンのヒドロキシ類似体（即ち、２－ヒドロキシ－４－（メチルチオ）ブタン酸）、メチオニンのヒドロキシ類似体のエステル、及びそれらの塩等を挙げることができる。なお、エステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、ｎ－プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル（即ち、ｎ－ブチルエステル、ｓ－ブチルエステル、イソブチルエステル及びｔ－ブチルエステル）、ペンチルエステル（ｎ－ペンチルエステル、イソペンチルエステル）及びヘキシルエステル（特にｎ－ヘキシルエステル、イソヘキシルエステル）などが挙げられる。
【0031】
「システイン様構造」は、
【0032】
【化6】
【0033】
を有する。該システイン様構造は、上記メチオニン様構造と類似するが、メチオニン様構造を側鎖に有するＬＡＴ１結合部位の使用と比較してＬＡＴ１に対する選択性は見られないものの、腫瘍集積性が低い程度に有する。また、システイン様構造は、メチオニン様構造を有するＬＡＴ１結合部位に対するコントロールとしても使用可能であるシステイン誘導体には、立体異性体及び鏡像異性体が含まれ、異なる異性体型で存在可能であり得る。
【0034】
「チロシン様構造」は、
【0035】
【化7】
【0036】
を有するが、本発明によれば、天然型チロシン（すなわち、Ｒ４が水素原子である）を構造に有するＡセグメントと同様の作用効果を得ることができれば、チロシン誘導体を有するＡセグメントを使用してもよい。チロシン誘導体には、立体異性体及び鏡像異性体が含まれ、異なる異性体型で存在可能であり得る。チロシン誘導体としては、限定されないが、例えば、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（２－クロロ－４ヒドロキシフェニル）プロパノエート、Ｄ－チロシンエチルエステル塩酸塩、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（２，６－ジクロロ－３，４－ジメトキシフェニル）プロパノエートＨ－Ｄ－チロシン（ｔＢｕ）－アリルエステル塩酸塩、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（３－クロロ－４，５－ジメトキシフェニル）プロパノエート、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（２－クロロ－３－ヒドロキシ－４－メトキシフェニル）プロパノエート、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（４－［（２－クロロ－６－フルオロフェニル）メトキシ］フェニル）プロパノエート、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（２－クロロ－３，４－ジメトキシフェニル）プロパノエート、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（３－クロロ－５－フルオロ－４－ヒドロキシフェニル）プロパノエート、ジエチル２－（アセチルアミノ）－２－（４－［（２－クロロ－６－フルオロベンジル）オキシ］ベンジルマロネート、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（３－クロロ－４－メトキシフェニル）プロパノエート、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（３－クロロ－４－ヒドロキシ－５－メトキシフェニル）プロパノエート、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（２，６－ジクロロ－３－ヒドロキシ－４－メトキシフェニル）プロパノエート、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）プロパノエート、Ｈ－ＤＬ－チロシンメチルエステル塩酸塩、Ｈ－３，５－ジヨード－チロシン－メチルエステル塩酸塩、Ｈ－Ｄ－３，５－ジヨード－チロシン－メチルエステル塩酸塩、Ｈ－Ｄ－チロシン－メチルエステル塩酸塩、Ｄ－チロシンメチルエステル塩酸塩、Ｄ－チロシン－メチルエステル塩酸塩、メチルＤ－チロシネート塩酸塩、Ｈ－Ｄ－チロシンメチルエステル－塩酸塩、Ｄ－チロシンメチルエステル塩酸塩、Ｈ－Ｄ－チロシンメチルエステル－塩酸塩、（２Ｒ）－２－アミノ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、（２Ｒ）－２－アミノ－３－（４－ヒドロキシフェニル）メチルエステル塩酸塩、メチル（２Ｒ）－２－アミノ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパノエート塩酸塩、メチル（２Ｒ）－２－アザニル－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパノエート塩酸塩、３－クロロ－Ｌ－チロシン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、３－ニトロ－Ｌ－チロシンエチルエステル塩酸塩、ＤＬ－ｍ－チロシン、ＤＬ－ｏ－チロシン、Ｂｏｃ－チロシン（３，５－Ｉ２）－ＯＳｕ、Ｆｍｏｃ－チロシン（３－ＮＯ２）－ＯＨ、α－メチル－Ｌ－チロシン、α－メチル－Ｄ－チロシン、及びα－メチル－ＤＬ－チロシンのうちの１つ以上が挙げられる。
【0037】
一実施形態では、Ａセグメントの数を特定するための整数「ｙ」は、０～１０００であり、例えば、０～５０、０～１００、０～２００、０～５００などが挙げられる。
【0038】
一態様では、本発明のメチオニン様構造を有するＬＡＴ１結合部位に対して、Ａセグメントの含量は、３０～６０重量％である。好ましくは、５０重量％である。
【0039】
一実施形態では、Ａセグメントの平均分子量は、少なくとも５０００である。好ましくは、１０７００以上、１２０００以上であり、又は５０００～１１０００、５０００～１３０００の範囲である。
【0040】
別の態様では、本発明のチロシン様構造を有するＬＡＴ１結合部位に対して、Ａセグメントの含量は、２５～７０重量％である。好ましくは、６１重量％である。
【0041】
一実施形態では、Ａセグメントの平均分子量は、少なくとも５０００である。好ましくは、１００００以上、１１０００以上であり、又は５０００～１１０００、１００００～２３０００の範囲である。
【0042】
Ａセグメント中の「Ｌ１」は、リンカーであるか又は存在せず、メチオニン様構造又はチロシン様構造が該リンカーを介して又はリンカーを介さずに主骨格の（ポリ）アスパラギン酸に結合することができる。また、上記Ｒ３及びＲ４における「Ｌ３」は、水素原子又はリンカーを表すことができる。リンカーの種類、構造及び長さは、輸送基質（メチオニンなど）が、アミノ酸トランスポーターに認識され、また結合した薬物の作用が阻害されない限り、限定されない。
【0043】
Ｌ１及びＬ３がリンカーである場合、限定されないが、例えば、Ｃ１－４０アルキレン基である。ここで、Ｃ１－４０アルキレン基中のメチレン基は、１～１０個のオキソ基で置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１～１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、また、アルキレン基中のメチレン基のうち、１～２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ１－１０アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ６－１４アリーレン、５～１０員のヘテロアリーレン、又は重合度が２～２，０００のポリオキシアルキレンで置き換えられていてもよい。また、リンカーは、以下の構造：
【0044】
【化8】
であるか、又は
【0045】
【化9】
であってもよい。
【0046】
（２）Ｂセグメント
Ｂセグメントの末端部分は、場合により、例えば、Ｒ２－ＮＨ－構造を取り得て、一定の長さを有することにより、本発明のＬＡＴ１結合部位が、血中滞留性や腎臓・肝臓等への移行を制御するのに役立つ。また、一定の長さを持つことで、末端に嵩高い構造を導入しても、高分子とＬＡＴ１との相互作用を阻害しないことが期待される。より具体的には、Ｒ２は、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｒ５（ここで、Ｒ５は、水素、メチル、アジド、又はメトキシである）、－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｍ－Ｏ－Ｒ６（ここで、Ｒ６は、水素、メチル、アジド、又はメトキシであり；ｍは、０～１５００の整数であり、１０～１０００の整数であってよく、１００～５００の整数であってよい）、又は－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｒ５（ここで、Ｒ５は、水素、メチル、アジド、又はメトキシであり；ｎは、０～１５００の整数であり、１０～１０００の整数であってよく、１００～５００の整数であってよい）であり得る。
Ｂセグメントの末端部分は、場合により、例えば、Ｒ２－ＮＨ－構造を取り得て、一定の長さを有することにより、本発明のＬＡＴ１結合部位が、血中滞留性や腎臓・肝臓等への移行を制御するのに役立つ。また、一定の長さを持つことで、末端に嵩高い構造を導入しても、高分子とＬＡＴ１との相互作用を阻害しないことが期待される。より具体的には、Ｒ２は、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｒ５（ここで、Ｒ５は、水素、メチル、アジド、又はメトキシである）、－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｍ－Ｏ－Ｒ６（ここで、Ｒ６は、水素、メチル、アジド、又はメトキシであり；ｍは、０～１５００の整数であり、１０～１０００の整数であってよく、１００～５００の整数であってよい）、又は－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｒ５（ここで、Ｒ５は、水素、メチル、アジド、又はメトキシであり；ｎは、０～１５００の整数であり、１０～１０００の整数であってよく、１００～５００の整数であってよい）であり得る。
【0047】
一実施形態では、本発明のＬＡＴ１結合部位内のＢセグメントの含量は、３０～６０重量％である。好ましくは、３８重量％である。
【0048】
別の態様では、Ｂセグメントの平均分子量は、少なくとも１５００である。好ましくは７０００以上、８０００以上であり、又は１５００～７５００、１５００～８５００の範囲である。
【0049】
一実施形態ではＢセグメントの含量は、１５～４０重量％である。好ましくは１６重量％である。
【0050】
別の態様では、Ｂセグメントの平均分子量は、少なくとも５０００である。好ましくは、７０００以上、８０００以上であり、又は７０００～９０００、５０００～９０００の範囲である。
【0051】
Ｌ２は、リンカーであるか又は存在せず、上記Ｒ２基が該リンカーを介して又はリンカーを介さずに主骨格の（ポリ）アスパラギン酸に結合することができる。リンカーの種類、構造及び長さは、該リンカーを介して結合した輸送基質（メチオニンなど）が、アミノ酸トランスポーターに認識され、また結合した薬物の作用が阻害されない得る限り、限定されない。
【0052】
Ｌ２がリンカーである場合、限定されないが、例えば、Ｃ１－４０アルキレン基である。ここで、Ｃ１－４０アルキレン基中のメチレン基は、１～１０個のオキソ基で置換されていてもよく、隣接するメチレン基同士が１～１０個の不飽和結合で結ばれていてもよく、また、アルキレン基中のメチレン基のうち、１～２０個のメチレン基がＮＨ、Ｎ（Ｃ１－１０アルキル）、Ｏ、Ｓ、Ｃ６－１４アリーレン、５～１０員のヘテロアリーレン、又は重合度が２～２，０００のポリオキシアルキレンで置き換えられていてもよい。また、リンカーは、以下の構造：
【0053】
【化10】
であるか、又は
【0054】
【化11】
であってもよい。
【0055】
（３）ＬＡＴ１結合部位
本発明のＡセグメントとＢセグメントからなるＬＡＴ１結合部位は、市販の原料を用いて製造することができる。また、市販されていない場合は、当業者に周知の方法により、原料又は中間体を製造することができる。後述する実施例では、ＡセグメントとＢセグメントの重合比を様々なに変更したＬＡＴ１結合部位を合成し、常法に従って、目的製造物が得られたことを確認している。例えば、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィーを用いる方法が一般的である。
本発明のＡセグメントとＢセグメントからなるＬＡＴ１結合部位は、市販の原料を用いて製造することができる。また、市販されていない場合は、当業者に周知の方法により、原料又は中間体を製造することができる。後述する実施例では、ＡセグメントとＢセグメントの重合比を様々なに変更したＬＡＴ１結合部位を合成し、常法に従って、目的製造物が得られたことを確認している。例えば、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィーを用いる方法が一般的である。
【0056】
ＬＡＴ１結合部位を構成するＡセグメントとＢセグメントの割合を適宜変更した製造物を得ることができる。Ａセグメント又はＢセグメントの分率は、好ましくは、２０～５０モル％である。用語「モル％」は、本明細書中で使用するとき、多成分系における各成分のモル数の和で、ある成分のモル数を割ったものをいう。例えば、ＬＡＴ１結合部位の構成をＡセグメント及びＢセグメントのモノマーユニットの数として、それぞれ「ｙ」及び「ｘ」を用いて表記した場合、例えば、Ａセグメントの分率は、式：ｙ×１００／（ｘ＋ｙ）により求めることができる。
【0057】
また、本発明によれば、ＬＡＴ１結合部位の平均分子量（例えば、重量平均分子量（Ｍｗ）及び数平均分子量（Ｍｎ））は、当業者に周知な方法、例えば、クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法、粘度法、末端基定量法、浸透圧法、光散乱法、沈降速度法により測定することができる。本明細書中で使用するとき、用語「重量平均分子量（Ｍｗ）」は、多分散系高分子化合物の分子量を意味する。具体的には、分子量Ｍｉの分子がｎｉ個（ｉ＝１、２、・・・）ある多分散系における重量平均分子量は、下式：
【0058】
【数1】
【0059】
で表される。本発明のメチオニン様構造を有するＬＡＴ１結合部位の重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは、５００００である。より好ましくは、４００００である。一方、本発明のチロシン様構造を有するＬＡＴ１結合部位の重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは、５００００である。より好ましくは、７６０００である。
【0060】
一方、用語「数平均分子量（Ｍｎ）」は、２個以上の原子より分子が構成されているときの平均分子量でｉ番目の原子量をＭｉ、その数をＮｉ個とすると、下式：
【0061】
【数2】
【0062】
で表される。本発明のメチオニン様構造を有するＬＡＴ１結合部位の数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは、２５０００である。より好ましくは、２００００である。一方、本発明のチロシン様構造を有するＬＡＴ１結合部位の数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは、２５０００である。より好ましくは、３８０００である。
【0063】
後述する実施例において測定したように、ＬＡＴ１結合部位の分子量は、Ｍｗ＝４２０００、及びＭｎ＝２１０００であることから、非常に大きな分子量を有していると言える。
【0064】
本発明のＬＡＴ１結合部位の分子量分布は、Ｍｗ／Ｍｎ（分散比）によって表すことができる。分散比は、好ましくは１．１以上、より好ましくは１．１以上３以下である。
【0065】
本発明のＬＡＴ１結合部位は、分子量が大きいことから、生体に投与された場合、分解されるまでの時間が長いことを特徴とする。したがって、後述する該ＬＡＴ１結合部位と薬物を結合させたコンジュゲートは、生体内で速やかに代謝されることなく、長時間保持されることから、薬物の添加量を顕著に低く抑えることができる。例えば、がん治療といった臨床効果を目的とする場合、典型的には、本発明のＬＡＴ１結合部位は、下記に挙げるものが好ましい。
【0066】
２．コンジュゲート
本明細書に開示されるＬＡＴ１結合部位は、上記の通り、ＬＡＴ１を標的としたエンドサイトーシスにより取り込まれるため、このような作用機序を利用することにより、ＬＡＴ１結合部位にコンジュゲートさせた治療薬をがん細胞に特異的に送達させることができる。本発明において使用可能な治療薬の例としては、限定されないが、アドリアマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、マイトマイシン－Ｃ、ダウノマイシン、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、塩酸ゲムシタビン、エムタンシン、カリキアマイシン、毒素（例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素などの細胞毒素）、含ホウ素医薬（例えばボルテゾミブ、或いは、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に使用され得るｐ－ボロノフェニルアラニンなどの薬剤）、核酸医薬（例えば、デコイ核酸、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマー）、光線力学的療法（ＰＤＴ）に使用され得る光増感剤（例えばポルフィリン誘導体）などが挙げられる。
本明細書に開示されるＬＡＴ１結合部位は、上記の通り、ＬＡＴ１を標的としたエンドサイトーシスにより取り込まれるため、このような作用機序を利用することにより、ＬＡＴ１結合部位にコンジュゲートさせた治療薬をがん細胞に特異的に送達させることができる。本発明において使用可能な治療薬の例としては、限定されないが、アドリアマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、マイトマイシン－Ｃ、ダウノマイシン、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、塩酸ゲムシタビン、エムタンシン、カリキアマイシン、毒素（例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素などの細胞毒素）、含ホウ素医薬（例えばボルテゾミブ、或いは、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に使用され得るｐ－ボロノフェニルアラニンなどの薬剤）、核酸医薬（例えば、デコイ核酸、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマー）、光線力学的療法（ＰＤＴ）に使用され得る光増感剤（例えばポルフィリン誘導体）などが挙げられる。
【0067】
本明細書で使用される場合、「抗がん剤」又は「抗腫瘍剤」は、がん細胞（又は腫瘍細胞）に対して標的化された細胞傷害性効果を生じる薬物を指す。抗癌剤の例としては、限定されないが、ボルテゾミブ、イマチニブ、セリシクリブ、アファチニブ、アレクチニブ、アキシチニブ、ベリノスタット、ボルテゾミブ、ボスチニブ、カボザンチニブ、カルフィルゾミブ、セリチニブ、コビメチニブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、イキサゾミブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ニロチニブ、オラパリブ、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パノビノスタット、パゾパニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、シプリューセル－Ｔ、ソニデジブ、ソラフェニブ、テムシロリムス、トファシチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、及びボリノスタットが挙げられる。
【0068】
本発明のＬＡＴ１結合部位にコンジュゲートさせることができる物質としては、治療薬の他、各種の化合物を挙げることができ、毒素、造影剤、光増感剤、核酸医薬、含ホウ素医薬などが含まれる。本発明のＬＡＴ１結合部位にこのような物質をコンジュゲートさせる方法は、例えば、ＡセグメントのＲ１に該当するメチオニン様構造又はチロシン様構造のカルボキシ基又はアミノ基に、直接又はリンカーを介して、又は、ＢセグメントのＲ２に該当する構造に直接又はリンカーを介して、上記物質の官能基を共有結合させることによって達成され、当業者に周知の方法によって行うことができる。
【0069】
本明細書で使用される場合、「光増感剤」とは、光を吸収すると励起状態へと促進され得る化合物であり、「感光性分子」と称されることもある。光照射によって活性化（光励起）された光増感剤は、毒性になり得るか、または毒性分子を生じ得るため、光照射されたがん細胞に対して細胞傷害性となる。このような光増感剤の例としては、限定されないが、蛍光色素、赤外吸収色素、近赤外吸収色素、ポルフィリン分子及びクロロフィル分子などが挙げられる。
【0070】
本発明の治療薬をコンジュゲートさせる場合、治療薬の結合量を適宜調節して、治療を目的とする適用疾患に対して、適切な治療有効量でコンジュゲートを投与することが好ましい。本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」とは、本発明のコンジュゲートが、対象の細胞、組織又は臓器に投与したときに、疾患の病態若しくは疾患の進行を予防または改善する効果がある治療薬の量を指す。
【0071】
３．医薬組成物
本発明によれば、本明細書の開示される高分子、又はその塩、誘導体、若しくは水和物、及び薬学的に許容される他の成分（担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含む、がんを治療するための医薬組成物が提供される。
本発明によれば、本明細書の開示される高分子、又はその塩、誘導体、若しくは水和物、及び薬学的に許容される他の成分（担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含む、がんを治療するための医薬組成物が提供される。
【0072】
４．がん治療
本発明のコンジュゲートは、がんに特異的に集積し、結合された薬物により、がんを治療することができる。治療対象とするがんは、特に限定されないが、固形がんであることが好ましい。固形がんは、結腸がん、胃がん、乳がん、大腸がん、胆嚢がん、肺がん（具体的には腺がん）、転移性ＣＲＣ等の結腸直腸がん（ＣＲＣ）、頭頸部がん、肝がん、膵臓がん、及び骨肉腫等を含む、各種形態のがんから選択される。医師等の当業者であれば、がんを治療するための有効成分としての本発明のＬＡＴ１結合部位の投与量、濃度、回数、及び頻度を、がんの種類や悪性度等、及び対象（被験者）の性別、年齢、体重、患部の状態等を考慮して、適切に選択することができる。
本発明のコンジュゲートは、がんに特異的に集積し、結合された薬物により、がんを治療することができる。治療対象とするがんは、特に限定されないが、固形がんであることが好ましい。固形がんは、結腸がん、胃がん、乳がん、大腸がん、胆嚢がん、肺がん（具体的には腺がん）、転移性ＣＲＣ等の結腸直腸がん（ＣＲＣ）、頭頸部がん、肝がん、膵臓がん、及び骨肉腫等を含む、各種形態のがんから選択される。医師等の当業者であれば、がんを治療するための有効成分としての本発明のＬＡＴ１結合部位の投与量、濃度、回数、及び頻度を、がんの種類や悪性度等、及び対象（被験者）の性別、年齢、体重、患部の状態等を考慮して、適切に選択することができる。
【0073】
本発明によれば、本発明のＬＡＴ１結合部位、コンジュゲート及び医薬組成物は、シリンジ等を用いて、対象の静脈内又は局所に投与され得る。投与されるべき治療対象は、哺乳動物であることが好ましく、哺乳動物としては、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。
【0074】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例0075】
本実施例中で使用される代表的な試薬及び測定機器を下記に列挙した。また、全ての動物実験は、東京工業大学の施設内動物管理使用委員会からの承認を得て実施した。
【0076】
（１）試薬
・α－メトキシ－ω－アミノ－ポリ（エチレングリコール）（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨＯＡ）：株式会社ノフ（東京、日本）
・プロピルアミン：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・β－ベンジルＬ－アスパラギン酸Ｎ－カルボキシ無水物（ＢＬＡ－ＮＣＡ）：中央化成
・Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・ジクロロメタン（ＤＣＭ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）：関東化学株式会社（東京）
・ジエチルエーテル：関東化学株式会社（東京）
・ヘキサン：関東化学株式会社（東京）
・塩酸（ＨＣｌ）：ナカライテスク（京都、日本）
・水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）：ナカライテスク（京都、日本）
・Ｎ－メチル－２－ピロリドン：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・アリルアミン：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・トリエチルアミン（ＴＥＡ）：ナカライテスク（京都、日本）
・ＤＬ－ホモシステイン：東京化学工業株式会社（東京、日本）
・エルシステイン：東京化学工業（東京、日本）
・２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）：東京化学工業株式会社（東京、日本）
・アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・Ｃｙ５ ＮＨＳエステル：ルミプローブ（メリーランド州、米国）
・フェオホルビドａ（Ｐｐａ）：船越株式会社（東京、日本）
・アジド－ポリ（エチレングリコール）－アミン（Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２）［Ｍｗ：９Ｋ］
・ベンゼン：ナカライテスク（京都、日本）
・β－ベンジルＬ－アスパラギン酸Ｎ－カルボキシ無水物（ＢＬＡ－ＮＣＡ）：中央化成株式会社
・Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）：和光純薬工業（株）
・ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：ナカライテスク（京都、日本）
・ＮＨ２－Ｔｙｒ（実験室で合成）
・ＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒ（第一三共提供）
・１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）：ＴＣＩ化学物質
・Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：和光純薬工業株式会社
・トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：ＴＣＩ化学物質
・α－メトキシ－ω－アミノ－ポリ（エチレングリコール）（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨＯＡ）：株式会社ノフ（東京、日本）
・プロピルアミン：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・β－ベンジルＬ－アスパラギン酸Ｎ－カルボキシ無水物（ＢＬＡ－ＮＣＡ）：中央化成
・Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・ジクロロメタン（ＤＣＭ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）：関東化学株式会社（東京）
・ジエチルエーテル：関東化学株式会社（東京）
・ヘキサン：関東化学株式会社（東京）
・塩酸（ＨＣｌ）：ナカライテスク（京都、日本）
・水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）：ナカライテスク（京都、日本）
・Ｎ－メチル－２－ピロリドン：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・アリルアミン：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・トリエチルアミン（ＴＥＡ）：ナカライテスク（京都、日本）
・ＤＬ－ホモシステイン：東京化学工業株式会社（東京、日本）
・エルシステイン：東京化学工業（東京、日本）
・２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）：東京化学工業株式会社（東京、日本）
・アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）：富士フイルム和光純薬工業株式会社（大阪府）
・Ｃｙ５ ＮＨＳエステル：ルミプローブ（メリーランド州、米国）
・フェオホルビドａ（Ｐｐａ）：船越株式会社（東京、日本）
・アジド－ポリ（エチレングリコール）－アミン（Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２）［Ｍｗ：９Ｋ］
・ベンゼン：ナカライテスク（京都、日本）
・β－ベンジルＬ－アスパラギン酸Ｎ－カルボキシ無水物（ＢＬＡ－ＮＣＡ）：中央化成株式会社
・Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）：和光純薬工業（株）
・ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：ナカライテスク（京都、日本）
・ＮＨ２－Ｔｙｒ（実験室で合成）
・ＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒ（第一三共提供）
・１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）：ＴＣＩ化学物質
・Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：和光純薬工業株式会社
・トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：ＴＣＩ化学物質
【0077】
（２）測定機器
・ＮＭＲ（核磁気共鳴）：ＢＲＵＫＥＲ ＡＶＡＮＣＥＩＩＩ ４００（４００ＭＨｚ、ＢＲＵＫＥＲ ＢｉｏＳｐｉｎ）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＵＳＡ
・ＧＰＣ（ゲル透過クロマトグラフィー）：Ｊａｓｃｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（東京、日本）
・カラム：
ＴＳＫ－ｇｅｌ ｓｕｐｅｒＡＷ３０００、ｓｕｐｅｒＡＷ４０００カラム：東ソー株式会社（東京都）
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケア（東京都））
ＧＬ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＷＰ３００ Ｃ１８ ５μｍ ４．６×２５０ｍｍ（東京都、日本）
・検出器：
屈折率－２０３１（ＲＩ－２０３１）：Ｊａｓｃｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（東京、日本）
紫外可視分光法－２０７０（ＵＶ－２０７０）：Ｊａｓｃｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（東京、日本）
・ディスポーザブルＰＤ－１０脱塩カラム：ＧＥヘルスケア（東京都）
・ナノドロップマイクロボリューム分光光度計及び蛍光光度計：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）
・マイクロプレートリーダー：Ｓｐａｒｋ，Ｔｅｃａｎ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（川崎市、日本）
・ＮＭＲ（核磁気共鳴）：ＢＲＵＫＥＲ ＡＶＡＮＣＥＩＩＩ ４００（４００ＭＨｚ、ＢＲＵＫＥＲ ＢｉｏＳｐｉｎ）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＵＳＡ
・ＧＰＣ（ゲル透過クロマトグラフィー）：Ｊａｓｃｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（東京、日本）
・カラム：
ＴＳＫ－ｇｅｌ ｓｕｐｅｒＡＷ３０００、ｓｕｐｅｒＡＷ４０００カラム：東ソー株式会社（東京都）
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケア（東京都））
ＧＬ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＷＰ３００ Ｃ１８ ５μｍ ４．６×２５０ｍｍ（東京都、日本）
・検出器：
屈折率－２０３１（ＲＩ－２０３１）：Ｊａｓｃｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（東京、日本）
紫外可視分光法－２０７０（ＵＶ－２０７０）：Ｊａｓｃｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（東京、日本）
・ディスポーザブルＰＤ－１０脱塩カラム：ＧＥヘルスケア（東京都）
・ナノドロップマイクロボリューム分光光度計及び蛍光光度計：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）
・マイクロプレートリーダー：Ｓｐａｒｋ，Ｔｅｃａｎ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（川崎市、日本）
【0078】
なお、本明細書で使用される化合物の略称については、対応する以下の正式名称を参照されたい：
・ＰＥＧ：ポリ（エチレングリコール）
・ＰＡｓｐ：ポリ（アスパラギン酸）
・ＰＥＧ－ＰＡｓｐ：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ（アスパラギン酸）
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］（注：ｍ及びｎはそれぞれの平均ユニット数を示す。以下同じ。）
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（２－アミノ－２－カルボキシエチル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（２－アミノ－２－カルボキシエチル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］；及びポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（２－アミノ－２－カルボキシエチル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］；及びポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（２－アミノ－２－カルボキシエチル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］：ポリ（アスパラギン酸－ｒａｎ－アリルアスパルトアミド）
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－アリルアスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（４－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）フェノキシ）プロピル）アスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（１６－（４－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）フェノキシ）－３，６，９，１２－テトラオキサヘキサデカニル）アスパルトアミド］
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（４－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）フェノキシ）プロピル）アスパラギン酸］
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（１６－（４－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）フェノキシ）－３，６，９，１２－テトラオキサヘキサデカニル）アスパルトアミド］
・ＰＥＧ：ポリ（エチレングリコール）
・ＰＡｓｐ：ポリ（アスパラギン酸）
・ＰＥＧ－ＰＡｓｐ：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ（アスパラギン酸）
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］（注：ｍ及びｎはそれぞれの平均ユニット数を示す。以下同じ。）
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（２－アミノ－２－カルボキシエチル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（２－アミノ－２－カルボキシエチル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］；及びポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（２－アミノ－２－カルボキシエチル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］；及びポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（（２－アミノ－２－カルボキシエチル）チオ）プロピル）アスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］：ポリ（アスパラギン酸－ｒａｎ－アリルアスパルトアミド）
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－アリルアスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（４－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）フェノキシ）プロピル）アスパルトアミド］
・Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）ｎ］：ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（１６－（４－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）フェノキシ）－３，６，９，１２－テトラオキサヘキサデカニル）アスパルトアミド］
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（３－（４－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）フェノキシ）プロピル）アスパラギン酸］
・ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）ｎ］：ポリ（エチレングリコール）－ｂｌｏｃｋ－ポリ［アスパラギン酸－ｒａｎ－（１６－（４－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）フェノキシ）－３，６，９，１２－テトラオキサヘキサデカニル）アスパルトアミド］
【0079】
実施例１：メチオニン又はシステイン修飾高分子の合成
（１）概要
水溶性高分子のポリ（アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（メチオニン）ｎ）（以下、Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］）、ポリエチレングリコール－ポリ（アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（メチオニン）ｎ）（以下、ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｎ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｍ］）、並びにポリ（アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（システイン）ｎ）（以下、Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］）、ポリエチレングリコール－ポリ（アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（システイン）ｎ）（以下、ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］）を合成した過程を記す。開始剤をプロピルアミン、モノマーをＢＬＡ－ＮＣＡとするＮ－カルボキシ無水物（ＮＣＡ）重合により、ＰＢＬＡｎ（ｎは重合度を示す）を合成した。開始剤をα－メトキシ－２－アミノ－ポリ（エチレングリコール）、モノマーをＢＬＡ－ＮＣＡとするＮＣＡ重合によりＰＥＧ－ＰＢＬＡｎを合成した。塩基性条件下で側鎖のカルボキシ基を脱保護し、ＰＡｓｐｎとＰＥＧ－ＰＡｓｐｎを得た（ｎは重合度を示す）。その後、アリルアミンのアミノ基をＰＡｓｐｎとＰＥＧ－ＰＡｓｐｎのカルボキシ基に結合し、ポリ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（アリルアミン）ｎ］（以下、（Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］）を得た。Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］とＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］は、光化学ラジカルチオール－エンクリック反応により、ＤＬ－ホモシステインとＬ－システインをＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］側鎖炭素二重結合に導入することにより合成した。
（１）概要
水溶性高分子のポリ（アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（メチオニン）ｎ）（以下、Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］）、ポリエチレングリコール－ポリ（アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（メチオニン）ｎ）（以下、ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｎ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｍ］）、並びにポリ（アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（システイン）ｎ）（以下、Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］）、ポリエチレングリコール－ポリ（アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（システイン）ｎ）（以下、ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］）を合成した過程を記す。開始剤をプロピルアミン、モノマーをＢＬＡ－ＮＣＡとするＮ－カルボキシ無水物（ＮＣＡ）重合により、ＰＢＬＡｎ（ｎは重合度を示す）を合成した。開始剤をα－メトキシ－２－アミノ－ポリ（エチレングリコール）、モノマーをＢＬＡ－ＮＣＡとするＮＣＡ重合によりＰＥＧ－ＰＢＬＡｎを合成した。塩基性条件下で側鎖のカルボキシ基を脱保護し、ＰＡｓｐｎとＰＥＧ－ＰＡｓｐｎを得た（ｎは重合度を示す）。その後、アリルアミンのアミノ基をＰＡｓｐｎとＰＥＧ－ＰＡｓｐｎのカルボキシ基に結合し、ポリ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（アリルアミン）ｎ］（以下、（Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］）を得た。Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］とＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］は、光化学ラジカルチオール－エンクリック反応により、ＤＬ－ホモシステインとＬ－システインをＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］側鎖炭素二重結合に導入することにより合成した。
【0080】
（２）合成手法及び解析
（２－１）ＰＥＧ－ＰＡｓｐｎ（ｎ＝２７及び９７）及びＰＡｓｐｎ（ｎ＝５７及び１１０）の合成
ポリ（アスパラギン酸）（ＰＡｓｐ）及びポリエチレングリコール－ポリ（アスパラギン酸）（ＰＥＧ－ＰＡｓｐ）の合成スキームを下記に示す。
（２－１）ＰＥＧ－ＰＡｓｐｎ（ｎ＝２７及び９７）及びＰＡｓｐｎ（ｎ＝５７及び１１０）の合成
ポリ（アスパラギン酸）（ＰＡｓｐ）及びポリエチレングリコール－ポリ（アスパラギン酸）（ＰＥＧ－ＰＡｓｐ）の合成スキームを下記に示す。
【0081】
【化12】
【0082】
ＰＥＧ－ＰＡｓｐｎとＰＡｓｐｎ（ｎはＰＡｓｐの重合度を示す）は、ＢＬＡ－ＮＣＡの開環重合とその後の脱保護（加水分解）により合成した。ＰＥＧ－ｂ－ポリ（β－ベンジル－Ｌ－アスパラギン酸塩）（ＰＥＧ－ＰＢＬＡ９７）の合成では、ＭｅＯ－ＰＥＧ１０ｋ－ＮＨ２（５００ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をベンゼン凍結乾燥した。ＢＬＡ－ＮＣＡ（１．１９５ｇ、４．８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１６．２ｍｌ）とＤＭＦ（１．８ｍｌ）の混合溶媒に溶解し、ＤＣＭ（６．３ｍｌ）とＤＭＦ（０．７ｍｌ）混合溶媒に溶解したＭｅＯ－ＰＥＧ１０ｋ－ＮＨ２と室温で混合することで重合を開始した。２日間、アルゴン雰囲気下で撹拌した後、ヘキサン及び酢酸エチル混合溶媒（ｖ／ｖ＝３／２）に滴下して再沈殿を行った。沈殿物を減圧濾過及び減圧乾燥により回収し、１．２３ｇを得た。
【0083】
ポリ（β－ベンジル－Ｌ－アスパラギン酸塩）（ＰＢＬＡ９７）の合成では、ＢＬＡ－ＮＣＡ（３．０５ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）とＤＭＦ（２ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、プロピルアミン（９μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）と混合して、室温で２日間、アルゴン雰囲気下で撹拌することにより重合した。その後、１５０ｍＬのジエチルエーテルに滴下し、沈殿を得た。沈殿を減圧濾過及び減圧乾燥により回収し、２．４ｇを得た。その他のＰＥＧ－ＰＢＬＡとＰＢＬＡについても同様の方法で重合した。
【0084】
ＰＥＧ－ＰＢＬＡ
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＧ由来のピーク［３．２０－３．６３ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］とＰＢＬＡ由来のピーク［２．５３－２．９３ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ－）、４．８６－５．１８（－Ｏ－ＣＨ２－Ｐｈ）、７．１３－７．４３ｐｐｍ（Ｐｈ）］の積分値の比からＰＢＬＡの重合度ＤＰ＝２７（ｎ＝２７）及びＤＰ＝９７（ｎ＝９７）、数平均分子量Ｍｎ＝１５，６００（ｎ＝２７）及びＭｎ＝２９，９００（ｎ＝９７）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子の分子量分散度はＰＤＩ＝１．１３（ｎ＝２７）及びＰＤＩ＝１．１３（ｎ＝９７）と求まり、狭い分子量分布を有することを確認した（データ示さず）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＧ由来のピーク［３．２０－３．６３ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］とＰＢＬＡ由来のピーク［２．５３－２．９３ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ－）、４．８６－５．１８（－Ｏ－ＣＨ２－Ｐｈ）、７．１３－７．４３ｐｐｍ（Ｐｈ）］の積分値の比からＰＢＬＡの重合度ＤＰ＝２７（ｎ＝２７）及びＤＰ＝９７（ｎ＝９７）、数平均分子量Ｍｎ＝１５，６００（ｎ＝２７）及びＭｎ＝２９，９００（ｎ＝９７）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子の分子量分散度はＰＤＩ＝１．１３（ｎ＝２７）及びＰＤＩ＝１．１３（ｎ＝９７）と求まり、狭い分子量分布を有することを確認した（データ示さず）。
【0085】
ＰＥＧ－ＰＢＬＡ
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ８．２７－８．０６（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、７．４３－７．１３（ｂｒ、＝ＣＨ－ＣＨ＝）、５．１８－４．８６（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－）、４．７１－４．４８（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．７１－３．６５（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）、３．６３－３．２０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．２８－３．２１（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９３－２．５３（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．２５－１．２２（ｂｒ、ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ８．２７－８．０６（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、７．４３－７．１３（ｂｒ、＝ＣＨ－ＣＨ＝）、５．１８－４．８６（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－）、４．７１－４．４８（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．７１－３．６５（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）、３．６３－３．２０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．２８－３．２１（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９３－２．５３（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．２５－１．２２（ｂｒ、ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）
【0086】
ＰＥＧ－ＰＢＬＡ９７及びＰＥＧ－ＰＢＬＡ２７（ともに２ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ－ｄ６中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１Ａ及び１Ｂに示した。
【0087】
ＰＢＬＡ
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．７１－０．７８ｐｐｍ（－ＣＨ３－ＣＨ２－）］とＰＢＬＡ由来のピーク［２．５４－２．９４ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ－）、４．９０－５．１４（－Ｏ－ＣＨ２－Ｐｈ）、７．１３－７．４３ｐｐｍ（Ｐｈ）］の積分値の比からＰＢＬＡの重合度ＤＰ＝５７（ｎ＝５７）及びＤＰ＝１１０（ｎ＝１１０）、数平均分子量Ｍｎ＝１１，７００（ｎ＝５７）及びＭｎ＝２２，６００（ｎ＝１１０）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子の分子量分散度はＰＤＩ＝１．０７（ｎ＝５７及びＰＤＩ＝１．０８（ｎ＝１１０）と求まり、狭い分子量分布を持つことを確認した（データ示さず）。ＰＢＬＡ１１０及びＰＢＬＡ５７（ともに２ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ－ｄ６中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２Ａ及び２Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ８．２９－８．０３（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、７．４３－７．１３（ｂｒ、＝ＣＨ－ＣＨ＝）、５．１４－４．９０（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－）、４．７１－４．８８（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．７０－３．５５（ｂｒ、－ＣＨ２－ＮＨ）、２．９４－２．５４（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．８３－１．７０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－）、１．３７－１．２９（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）、０．７８－０．７１（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．７１－０．７８ｐｐｍ（－ＣＨ３－ＣＨ２－）］とＰＢＬＡ由来のピーク［２．５４－２．９４ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ－）、４．９０－５．１４（－Ｏ－ＣＨ２－Ｐｈ）、７．１３－７．４３ｐｐｍ（Ｐｈ）］の積分値の比からＰＢＬＡの重合度ＤＰ＝５７（ｎ＝５７）及びＤＰ＝１１０（ｎ＝１１０）、数平均分子量Ｍｎ＝１１，７００（ｎ＝５７）及びＭｎ＝２２，６００（ｎ＝１１０）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子の分子量分散度はＰＤＩ＝１．０７（ｎ＝５７及びＰＤＩ＝１．０８（ｎ＝１１０）と求まり、狭い分子量分布を持つことを確認した（データ示さず）。ＰＢＬＡ１１０及びＰＢＬＡ５７（ともに２ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ－ｄ６中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２Ａ及び２Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ８．２９－８．０３（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、７．４３－７．１３（ｂｒ、＝ＣＨ－ＣＨ＝）、５．１４－４．９０（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－）、４．７１－４．８８（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．７０－３．５５（ｂｒ、－ＣＨ２－ＮＨ）、２．９４－２．５４（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．８３－１．７０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－）、１．３７－１．２９（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）、０．７８－０．７１（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
【0088】
脱保護では、１．０ｇのＰＥＧ－ＰＢＬＡ又はＰＢＬＡを２０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ水溶液に入れ、１２時間室温で撹拌することにより行った。溶液を透析膜（ＭＷＣＯ、３，５００Ｄａ）を用いて、０．０１Ｍ ＨＣｌ水溶液と純水中で室温で透析し、凍結乾燥して回収した。（収率：ＰＥＧ－ＰＡｓｐ：９５％、ＰＡｓｐ：９４％）。１Ｈ ＮＭＲとサイズ排除クロマトグラフィーで高分子の物性を確認した。
【0089】
ＰＥＧ－ＰＡｓｐ
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＧ由来のピーク［３．４８－３．９０ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］とアスパラギン酸のα水素のピーク（２．６８－３．０２ｐｐｍ）の積分値の比からＡｓｐの重合度ＤＰ＝９７（ｎ＝９７）及びＤＰ＝２７（ｎ＝２７）、数平均分子量Ｍｎ＝２１，２００（ｎ＝１１０）及びＭｎ＝１３，２００（ｎ＝２７）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＧ由来のピーク［３．４８－３．９０ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］とアスパラギン酸のα水素のピーク（２．６８－３．０２ｐｐｍ）の積分値の比からＡｓｐの重合度ＤＰ＝９７（ｎ＝９７）及びＤＰ＝２７（ｎ＝２７）、数平均分子量Ｍｎ＝２１，２００（ｎ＝１１０）及びＭｎ＝１３，２００（ｎ＝２７）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
【0090】
ＰＡｓｐ
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．７９－０．９７ｐｐｍ（ＣＨ３－ＣＨ２－）］とアスパラギン酸のα水素のピーク（２．８７－３．０５ｐｐｍ）の積分値の比からＡｓｐの重合度ＤＰ＝１１０（ｎ＝１１０）及びＤＰ＝５７（ｎ＝５７）、数平均分子量Ｍｎ＝１２，７００（ｎ＝１１０）及びＭｎ＝６，６００（ｎ＝５７）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。ＰＡｓｐ１１０及びＰＡｓｐ５７（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３Ａ及び３Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７６－４．６７（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．１５－３．０７（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）、３．０５－２．８７（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）１．５２－１．４０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－）、０．９１－０．７９（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．７９－０．９７ｐｐｍ（ＣＨ３－ＣＨ２－）］とアスパラギン酸のα水素のピーク（２．８７－３．０５ｐｐｍ）の積分値の比からＡｓｐの重合度ＤＰ＝１１０（ｎ＝１１０）及びＤＰ＝５７（ｎ＝５７）、数平均分子量Ｍｎ＝１２，７００（ｎ＝１１０）及びＭｎ＝６，６００（ｎ＝５７）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。ＰＡｓｐ１１０及びＰＡｓｐ５７（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図３Ａ及び３Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７６－４．６７（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．１５－３．０７（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）、３．０５－２．８７（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）１．５２－１．４０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－）、０．９１－０．７９（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
【0091】
ＰＥＧ－ＰＡｓｐ
ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９７及びＰＥＧ－ＰＡｓｐ２７（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４Ａ及び４Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７７－４．６６（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９０－３．４８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．２１－３．２８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．０２－２．６８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．８３－１．７２（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）。
ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９７及びＰＥＧ－ＰＡｓｐ２７（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４Ａ及び４Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７７－４．６６（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９０－３．４８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．２１－３．２８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．０２－２．６８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．８３－１．７２（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）。
【0092】
（２－２）ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］及びＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］の合成
アリルアミン修飾ＰＡｓｐ及びＰＥＧ－ＰＡｓｐの合成スキームを下記に示す。
アリルアミン修飾ＰＡｓｐ及びＰＥＧ－ＰＡｓｐの合成スキームを下記に示す。
【0093】
【化13】
【0094】
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］及びＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］ は、高分子とアリルアミンの縮合反応により合成した。ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６０／Ａｓｐ（Ａｌｌ）３７］の合成では、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９７（２００ｍｇ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解し、ＤＭＴ－ＭＭ（Ａｓｐ単位に対して０．５当量、５８ｍｇ）、ＴＥＡ（３滴）、アリルアミン（Ａｓｐ単位に対して０．５当量、１２ｍｇ）をその溶液に加えた。室温で一晩反応させた。反応後ＮａＨＣＯ３ １０ｍＭ）水溶液及び脱イオン水中で透析し（ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ）、凍結乾燥して回収した（収率＝９３．５％）。
【0095】
Ｐ［Ａｓｐ５９／Ａｓｐ（Ａｌｌ）５１］の合成では、ＰＡｓｐ（１００ｍｇ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、ＤＭＴ－ＭＭ（Ａｓｐ単位に対して０．８当量、３８２．３５ｍｇ）、ＴＥＡ（３滴）、アリルアミン（Ａｓｐ単位に対して２当量、４４２．３４ｍｇ）を加えて、４０℃で一晩撹拌し反応させた。その後、上記と同じ方法で透析及び凍結乾燥し、回収した（収率＝９４．７％）。全ての高分子について１Ｈ ＮＭＲ分光法（溶媒：Ｄ２Ｏ）及びＧＰＣで物性を評価した。
【0096】
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ａｌｌ）
ｎ
］
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．７９－０．９７ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］及びアリルアミンのピーク［（３．７８－３．８１ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－）、５．０５－５．２６ｐｐｍ（－ＣＨ＝ＣＨ２）、５．７３－５．９４ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ＝）］の積分値の比からアリルアミンが導入されたユニット数は３７（ｍ＝６０、ｎ＝３７）及び１５（ｍ＝１２、ｎ＝１５）、数平均分子量Ｍｎ＝２２，７００（ｍ＝６０、ｎ = ３７）及びＭｎ＝１３，８００（ｍ＝１２、ｎ＝１５）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．７９－０．９７ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］及びアリルアミンのピーク［（３．７８－３．８１ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－）、５．０５－５．２６ｐｐｍ（－ＣＨ＝ＣＨ２）、５．７３－５．９４ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ＝）］の積分値の比からアリルアミンが導入されたユニット数は３７（ｍ＝６０、ｎ＝３７）及び１５（ｍ＝１２、ｎ＝１５）、数平均分子量Ｍｎ＝２２，７００（ｍ＝６０、ｎ = ３７）及びＭｎ＝１３，８００（ｍ＝１２、ｎ＝１５）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
【0097】
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ
ｎ
／Ａｓｐ（Ａｌｌ）
ｍ
］
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６０／Ａｓｐ（Ａｌｌ）３７］及びＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ１２／Ａｓｐ（Ａｌｌ）１５］（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図５Ａ及び５Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ５．９４－５．７３（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ＝）、５．２６－５．０５（ｂｒ、－ＣＨ＝ＣＨ２）、４．７５－４．３６（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９１－３．７８（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－）、３．７９－３．６２（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．３１－３．１７（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９６－２．４５（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．３５－１．２５（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）。
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６０／Ａｓｐ（Ａｌｌ）３７］及びＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ１２／Ａｓｐ（Ａｌｌ）１５］（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図５Ａ及び５Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ５．９４－５．７３（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ＝）、５．２６－５．０５（ｂｒ、－ＣＨ＝ＣＨ２）、４．７５－４．３６（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９１－３．７８（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－）、３．７９－３．６２（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．３１－３．１７（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９６－２．４５（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．３５－１．２５（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）。
【0098】
Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ａｌｌ）
ｎ
］
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．８１－０．９４ｐｐｍ（ＣＨ３－ＣＨ２－）］及びアリルアミンのピーク［（３．６９－３．９０ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－）、５．０７－５．２９ｐｐｍ（－ＣＨ＝ＣＨ２）、５．７４－５．９５ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ＝）］の積分値の比からアリルアミンが導入されたユニット数は５１（ｍ＝５９、ｎ＝５１）及び３８（ｍ＝１９，ｎ＝３８）、数平均分子量Ｍｎ＝１４，７００（ｍ＝５９、ｎ＝５１）及びＭｎ＝８，１００（ｍ＝１９，ｎ＝３８）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。Ｐ［Ａｓｐ５９／Ａｓｐ（Ａｌｌ）５１］及びＰ［Ａｓｐ１９／Ａｓｐ（Ａｌｌ）３８］（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図６Ａ及び６Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ５．９５－５．７４（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ＝）、５．２９－５．０７（ｂｒ、＝ＣＨ２）、４．７３－４．５９（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、４．６０－４．３９（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ）、３．９０－３．６９（ｂｒ、－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－）、３．１７－３．１０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．０２－２．４４（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．５５－１．４４（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）、０．９４－０．８１（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．８１－０．９４ｐｐｍ（ＣＨ３－ＣＨ２－）］及びアリルアミンのピーク［（３．６９－３．９０ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－）、５．０７－５．２９ｐｐｍ（－ＣＨ＝ＣＨ２）、５．７４－５．９５ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ＝）］の積分値の比からアリルアミンが導入されたユニット数は５１（ｍ＝５９、ｎ＝５１）及び３８（ｍ＝１９，ｎ＝３８）、数平均分子量Ｍｎ＝１４，７００（ｍ＝５９、ｎ＝５１）及びＭｎ＝８，１００（ｍ＝１９，ｎ＝３８）と求められた。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。Ｐ［Ａｓｐ５９／Ａｓｐ（Ａｌｌ）５１］及びＰ［Ａｓｐ１９／Ａｓｐ（Ａｌｌ）３８］（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図６Ａ及び６Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ５．９５－５．７４（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ＝）、５．２９－５．０７（ｂｒ、＝ＣＨ２）、４．７３－４．５９（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、４．６０－４．３９（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ）、３．９０－３．６９（ｂｒ、－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－）、３．１７－３．１０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．０２－２．４４（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＯ－）、１．５５－１．４４（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）、０．９４－０．８１（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
【0099】
（２－３）ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／（Ａｓｐ―Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）ｎ］及びＰ［Ａｓｐｍ／（Ａｓｐ―Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）ｎ］の合成
メチオニン（Ｍｅｔ）／システイン（Ｃｙｓ）官能化ＰＡｓｐ及びＰＥＧ－ＰＡｓｐの合成スキームを下記に示す。
メチオニン（Ｍｅｔ）／システイン（Ｃｙｓ）官能化ＰＡｓｐ及びＰＥＧ－ＰＡｓｐの合成スキームを下記に示す。
【0100】
【化14】
【0101】
ＭｅｔとＣｙｓのＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］及びＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］への導入は、光化学ラジカルチオール－エンクリック反応により行った。ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］及びＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］の合成では、ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］又はＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ａｌｌ）ｎ］を３０ｍｇ秤量し、ＤＬ－ホモシステインをＡｓｐ（Ａｌｌ）単位に対して１５０－４５０当量を水（７ｍＬ）に溶解し、ＤＭＰＡ（Ａｓｐ（Ａｌｌ））単位に対して３０－１００当量のアセトニトリル溶液（３ｍＬ）を加えた。３０分撹拌した後、ハンディＵＶランプ（３６５ｎｍ）で光照射しながら室温で１．５～２ｈ撹拌して反応させた。アセトンと水中で透析した後（ＭＷＣＯ：３，５００）、凍結乾燥し、ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］又はＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］を得た（収率＞９０％）。
【0102】
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］及びＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）ｎ］の合成では、ＤＬ－ホモシステインの代わりにＬ－システインを用いることで合成した。得られた全ての高分子について１Ｈ ＮＭＲ（溶媒：Ｄ２Ｏ）及びＧＰＣ［カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ）；溶出液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）；流速：０．６ｍｌ／分；温度：室温］で物性評価した。
【0103】
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）
ｎ
］
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＧ由来のピーク［３．６１－３．８１ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］及びメチオニンのピーク［（１．７０－１．８９ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、２．３０－２．０２ｐｐｍ（－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．５１－２．７１ｐｐｍ（－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．７２－２．９９ｐｐｍ（－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、３．２０－３．４１ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．８１－３．９６ｐｐｍ（－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）］の積分値の比からメチオニンが導入されたユニット数は３７（ｍ＝６０、ｎ＝３７）及び１３（ｍ＝１４、ｎ＝１３）、数平均分子量Ｍｎ＝２８，３００（ｍ＝６０、ｎ＝３７）及びＭｎ＝１６，０００（ｍ＝１４、ｎ＝１３）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を有することを確認した（データを示さず）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＧ由来のピーク［３．６１－３．８１ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］及びメチオニンのピーク［（１．７０－１．８９ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、２．３０－２．０２ｐｐｍ（－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．５１－２．７１ｐｐｍ（－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．７２－２．９９ｐｐｍ（－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、３．２０－３．４１ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．８１－３．９６ｐｐｍ（－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）］の積分値の比からメチオニンが導入されたユニット数は３７（ｍ＝６０、ｎ＝３７）及び１３（ｍ＝１４、ｎ＝１３）、数平均分子量Ｍｎ＝２８，３００（ｍ＝６０、ｎ＝３７）及びＭｎ＝１６，０００（ｍ＝１４、ｎ＝１３）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を有することを確認した（データを示さず）。
【0104】
Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）
ｎ
］
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．８０－０．９２ｐｐｍ（ＣＨ３－ＣＨ２－）］及びメチオニンのピーク［（１．７０－１．８６ｐｐｍ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、２．３０－２．０１ｐｐｍ（－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．４９－２．７１ｐｐｍ（－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．７４－２．９９ｐｐｍ（－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、３．１９－３．４３ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．７８－３．９６ｐｐｍ（－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）］の積分値の比からメチオニンが導入されたユニット数は４０（ｍ＝７０、ｎ＝４０）及び２４（ｍ＝３３、ｎ＝２４）、数平均分子量Ｍｎ＝２１，１００（ｍ＝７０、ｎ＝４０）及びＭｎ＝１９，７００（ｍ＝３３、ｎ＝２４）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．８０－０．９２ｐｐｍ（ＣＨ３－ＣＨ２－）］及びメチオニンのピーク［（１．７０－１．８６ｐｐｍ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、２．３０－２．０１ｐｐｍ（－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．４９－２．７１ｐｐｍ（－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．７４－２．９９ｐｐｍ（－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、３．１９－３．４３ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．７８－３．９６ｐｐｍ（－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）］の積分値の比からメチオニンが導入されたユニット数は４０（ｍ＝７０、ｎ＝４０）及び２４（ｍ＝３３、ｎ＝２４）、数平均分子量Ｍｎ＝２１，１００（ｍ＝７０、ｎ＝４０）及びＭｎ＝１９，７００（ｍ＝３３、ｎ＝２４）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
【0105】
Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）
ｎ
］
Ｐ［Ａｓｐ７０／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）４０］及びＰ［Ａｓｐ３３／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）２４］（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図７Ａ及び７Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７０－４．５０（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９６－３．７８（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、３．４３－３．１９（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．１７－３．０７（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９９－２．７４（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、２．７１－２．４９（ｂｒ、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．３０－２．０１（ｂｒ、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、１．８６－１．７０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、１．２９－１．１８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ）、０．９２－０．８０（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
Ｐ［Ａｓｐ７０／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）４０］及びＰ［Ａｓｐ３３／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）２４］（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図７Ａ及び７Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７０－４．５０（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９６－３．７８（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、３．４３－３．１９（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．１７－３．０７（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９９－２．７４（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、２．７１－２．４９（ｂｒ、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．３０－２．０１（ｂｒ、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、１．８６－１．７０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、１．２９－１．１８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ）、０．９２－０．８０（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
【0106】
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）
ｎ
］
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６０／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３７］及びＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ１４／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）１３］（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図８Ａ及び８Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７３－４．５１（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９６－３．８１（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、３．８１－３．６１（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．５４－３．５０（ｂｒ、ＣＨ３－Ｏ－ＣＨ２－）、３．４１－３．２０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９９－２．７２（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、２．７１－２．５１（ｂｒ、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．３０－２．０２（ｂｒ、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ）、１．８９－１．７０（ｂｒ、ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、１．２７－１．２０（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）。
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６０／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３７］及びＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ１４／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）１３］（ともに１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図８Ａ及び８Ｂに示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７３－４．５１（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９６－３．８１（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、３．８１－３．６１（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．５４－３．５０（ｂｒ、ＣＨ３－Ｏ－ＣＨ２－）、３．４１－３．２０（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９９－２．７２（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、２．７１－２．５１（ｂｒ、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．３０－２．０２（ｂｒ、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ）、１．８９－１．７０（ｂｒ、ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、１．２７－１．２０（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）。
【0107】
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）
ｎ
］
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＧ由来のピーク［３．５８－３．７８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］及びシステインのピーク［（１．６８－１．９１ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．５１－２．６７ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、２．９６－３．１８ｐｐｍ（－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ－）、３．２１－３．４２ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．９１－３．９９ｐｐｍ（－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）］の積分値の比からシステインが導入されたユニット数は４０（ｍ＝５７、ｎ＝４０）、数平均分子量Ｍｎ＝２７、２００（ｍ＝５７、ｎ＝４０）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＧ由来のピーク［３．５８－３．７８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］及びシステインのピーク［（１．６８－１．９１ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．５１－２．６７ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、２．９６－３．１８ｐｐｍ（－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ－）、３．２１－３．４２ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．９１－３．９９ｐｐｍ（－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）］の積分値の比からシステインが導入されたユニット数は４０（ｍ＝５７、ｎ＝４０）、数平均分子量Ｍｎ＝２７、２００（ｍ＝５７、ｎ＝４０）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
【0108】
Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）
ｎ
］
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．８２－０．９１ｐｐｍ（ＣＨ３－ＣＨ２－）］及びシステインのピーク［（１．６９－１．８９ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．５２－２．６７ｐｐｍ（－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．９７－３．２０ｐｐｍ（－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ－）、３．２１－３．４１ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－）、３．８７－４．０２ｐｐｍ（－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）］の積分値の比からシステインが導入されたユニット数は３６（ｍ＝７４、ｎ＝３６）数平均分子量Ｍｎ＝１９，７００（ｍ＝７４、ｎ＝３６）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤由来のピーク［０．８２－０．９１ｐｐｍ（ＣＨ３－ＣＨ２－）］及びシステインのピーク［（１．６９－１．８９ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．５２－２．６７ｐｐｍ（－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、２．９７－３．２０ｐｐｍ（－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ－）、３．２１－３．４１ｐｐｍ（－ＮＨ－ＣＨ２－）、３．８７－４．０２ｐｐｍ（－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）］の積分値の比からシステインが導入されたユニット数は３６（ｍ＝７４、ｎ＝３６）数平均分子量Ｍｎ＝１９，７００（ｍ＝７４、ｎ＝３６）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した。
【0109】
Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）
ｎ
］
Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３６］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図９に示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７２－４．４９（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、４．０２－３．８７（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、３．４１－３．２１（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－）、３．２０－２．９７（ｂｒ、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９８－２．６７（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、２．６７－２．５２（ｂｒ、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、１．８９－１．６９（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）、０．９１－０．８２（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３６］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図９に示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７２－４．４９（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、４．０２－３．８７（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、３．４１－３．２１（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－）、３．２０－２．９７（ｂｒ、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９８－２．６７（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、２．６７－２．５２（ｂｒ、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）、１．８９－１．６９（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）、０．９１－０．８２（ｂｒ、ＣＨ３－ＣＨ２－）。
【0110】
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ
ｍ
／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）
ｎ
］
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５７／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）４０］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１０に示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７５－４．５０（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９９－３．９１（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、３．９０－３．８０（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）３．７８－３．５８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．５５－３．５０（ｂｒ、ＣＨ３－Ｏ－ＣＨ２－）、３．４２－３．２１（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．１８－２．９６（ｂｒ、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９７－２．６７（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、２．６７－２．５１（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、１．９１－１．６８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）。
ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５７／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）４０］（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｄ２Ｏ中、室温）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１０に示した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ４．７５－４．５０（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－）、３．９９－３．９１（ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ２）、３．９０－３．８０（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）３．７８－３．５８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）、３．５５－３．５０（ｂｒ、ＣＨ３－Ｏ－ＣＨ２－）、３．４２－３．２１（ｂｒ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－）、３．１８－２．９６（ｂｒ、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）、２．９７－２．６７（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＯ－）、２．６７－２．５１（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－）、１．９１－１．６８（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－）。
【0111】
（２－４）高分子の蛍光標識
Ｍｅｔ／Ｃｙｓで修飾した高分子（１０ｍｇ）を水に溶解し、Ｃｙ５－ＮＨＳ（高分子に対して１．０当量）のＤＭＳＯ溶液を加えて反応させた。一晩撹拌した後、溶液を脱イオン水中で透析し（ＭＷＣＯ：３，５００）、さらにＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通して未反応の色素を取り除いた後、凍結乾燥して回収した（収率：Ｃｙ５―ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］＝７０％、Ｃｙ５―Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］＝８８％）。生成物についてはＧＰＣ［カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ）；溶出液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）；流速：０．６ｍＬ／分；温度：室温］で分析し未反応のＣｙ５を取り除いたことを確認した。ＰＥＧ２０ｋ－ＮＨ２についても同様にＣｙ５を導入した。
Ｍｅｔ／Ｃｙｓで修飾した高分子（１０ｍｇ）を水に溶解し、Ｃｙ５－ＮＨＳ（高分子に対して１．０当量）のＤＭＳＯ溶液を加えて反応させた。一晩撹拌した後、溶液を脱イオン水中で透析し（ＭＷＣＯ：３，５００）、さらにＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通して未反応の色素を取り除いた後、凍結乾燥して回収した（収率：Ｃｙ５―ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］＝７０％、Ｃｙ５―Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］＝８８％）。生成物についてはＧＰＣ［カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ）；溶出液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）；流速：０．６ｍＬ／分；温度：室温］で分析し未反応のＣｙ５を取り除いたことを確認した。ＰＥＧ２０ｋ－ＮＨ２についても同様にＣｙ５を導入した。
【0112】
Ｃｙ５修飾高分子のＰＢＳ中における蛍光は、マイクロプレートリーダー（Ｓｐａｒｋ、Ｔｅｃａｎ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊａｐａｎ）により測定した。
【0113】
Ｍｅｔ／Ｃｙｓ官能化高分子とＣｙ５のコンジュゲーション（蛍光標識）について、下記に合成スキームを示す。
【0114】
【化15】
【0115】
（２－５）ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）ｎ］及びＰ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）ｎ］への光増感剤（フェオホルバイドａ：Ｐｐａ）の結合
Ｍｅｔ官能化ＰＡｓｐとＰｐａのコンジュゲーションについて、下記に合成スキームを示す。
Ｍｅｔ官能化ＰＡｓｐとＰｐａのコンジュゲーションについて、下記に合成スキームを示す。
【0116】
【化16】
【0117】
光増感剤の結合では、Ｐｐａ、ＤＣＣ、及びＮＨＳ（１：１．２：１．４、３０ｍｇ：１２ｍｇ：８．２２ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、２ｈ遮光して撹拌した。その後、シリカゲルカラムで精製（溶媒：ジクロロメタン／メタノール、１０／１体積比）し、エバポレートして溶媒を取り除き、Ｐｐａ ＮＨＳエステルを回収した（収率＝７５％）。精製したＰｐａ ＮＨＳエステルとＭｅｔで修飾した高分子高分子を２：１（０．４２ｍｇ：１０ｍｇ）の混合比で炭酸バッファー中に、触媒量のＴＥＡとともに溶解し（ｐＨ＝７～８）、一晩、遮光して室温で反応させた。脱イオン水中で透析し（ＭＷＣＯ：３，５００）、ＰＤ－１０脱塩カラムに通してフリーのＰｐａを取り除き、凍結乾燥してＰｐａ結合高分子を回収した（収率：Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）ｎ］＝３０％）。生成物についてはＧＰＣ［カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ）；溶出液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有）；流速：０．６ｍＬ／分；温度：室温］で分析し、未反応のＰｐａが取り除かれたことを確認した（データを示さず）。
【0118】
実施例２：培養細胞に対する評価
（１）概要
蛍光色素（Ｃｙ５）で標識したメチオニン／システイン（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）修飾高分子の細胞取り込み量を比較した。その後、Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子の細胞内分布を共焦点顕微鏡により観察した。続いて、アミノ酸トランスポーター阻害剤を用いて、ＬＡＴ１への特異性を調べた。最後に、光増感剤（Ｐｐａ）で標識したＭｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子のがん細胞光毒性をＣＣＫ－８アッセイにより評価した。
（１）概要
蛍光色素（Ｃｙ５）で標識したメチオニン／システイン（Ｍｅｔ／Ｃｙｓ）修飾高分子の細胞取り込み量を比較した。その後、Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子の細胞内分布を共焦点顕微鏡により観察した。続いて、アミノ酸トランスポーター阻害剤を用いて、ＬＡＴ１への特異性を調べた。最後に、光増感剤（Ｐｐａ）で標識したＭｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子のがん細胞光毒性をＣＣＫ－８アッセイにより評価した。
【0119】
（２）Ｍｅｔ／Ｃｙｓ官能化高分子の細胞取り込み量の評価
（２－１）フローサイトメーター（ＦＣＭ）による細胞取り込みの測定
２４ウェルプレートに細胞を１．０×１０５細胞／ウェルとなるよう播種し、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞ではＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、ＢｘＰＣ３及びＣＴ２６細胞ではＲＰＭＩ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞ではＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。培地交換後、以下のサンプル溶液５００μＬを加え、３時間インキュベートした。
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）
・ＰＥＧ２０ｋ－Ｃｙ５（Ｃｙ５：２μＭ）
（２－１）フローサイトメーター（ＦＣＭ）による細胞取り込みの測定
２４ウェルプレートに細胞を１．０×１０５細胞／ウェルとなるよう播種し、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞ではＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、ＢｘＰＣ３及びＣＴ２６細胞ではＲＰＭＩ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞ではＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。培地交換後、以下のサンプル溶液５００μＬを加え、３時間インキュベートした。
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）
・ＰＥＧ２０ｋ－Ｃｙ５（Ｃｙ５：２μＭ）
【0120】
Ｄ－ＰＢＳ ０．５ｍＬで２回洗浄後、１５０μＬトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞及びＣＴ２６細胞では３分間、ＢｘＰＣ３細胞では１０分間、ＮＩＨ３Ｔ３細胞では５分間インキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞ではＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、ＢｘＰＣ３及び ＣＴ２６細胞ではＲＰＭＩ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞ではＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）を３５０μＬ加え、懸濁した後に、ＦＣＭにより細胞取り込みを測定した。得られた結果を図１１及び図１２に示す。
【0121】
（２－２）ライセートの蛍光定量による細胞取り込みの測定
９６ウェルプレートに細胞を１．０×１０４細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。以下のサンプル溶液１００μＬを加え、３時間インキュベートした。
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）
・ＰＥＧ２０ｋ－Ｃｙ５（Ｃｙ５：２μＭ）
９６ウェルプレートに細胞を１．０×１０４細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。以下のサンプル溶液１００μＬを加え、３時間インキュベートした。
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）
・ＰＥＧ２０ｋ－Ｃｙ５（Ｃｙ５：２μＭ）
【0122】
Ｄ－ＰＢＳ（＋）０．１ｍＬで２回洗浄後、０．１ｍＬ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ溶液を加え、３０分間インキュベートした。５０μＬ溶液をブラックプレートに移動した後に、マイクロプレートリーダーにより蛍光強度を測定した（ｅｘ／ｅｍ＝６３５／６９０ｎｍ）。検量線により計算した取り込み量を図１３に示す。
【0123】
ＬＡＴ１過剰発現がん細胞において、Ｍｅｔ修飾高分子は、Ｃｙｓ修飾高分子とＰＥＧ２０ｋよりも高い細胞取り込み量を示した（図１１）。一方、正常細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞に対しては、Ｍｅｔ修飾高分子は極めて少ない取り込み量を示した。同様の結果はｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅの蛍光定量においても得られた（図１２）。さらに、細胞取り込み量は重合度依存的であり、Ｐ［Ａｓｐ７０／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）４０］は、Ｐ［Ａｓｐ３３／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）２４］よりも高い取り込み量を示した（図１３）。
【0124】
実施例３：共焦点顕微鏡による細胞内分布の観察
（１）共焦点顕微鏡による観察
３５ｍｍ２のガラス製ディッシュに細胞を５．０×１０４細胞／ディッシュとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。各ディッシュに２．０μＭ Ｃｙ５－Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子溶液を１ｍＬ加え、３時間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳ（－） １ｍＬで洗浄後、１００ｎＭ ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ｒｅｄ ＤＮＤ－９９／（Ｄ－ＰＢＳ：ＲＰＭＩ＝１：９）溶液１ｍＬを加え、３０分間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳ １ｍＬで洗浄後、５．０μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ／Ｄ－ＰＢＳ溶液１ｍＬを加え、Ｄ－ＰＢＳ １ｍＬで２回洗浄後、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞ではＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、ＢｘＰＣ３及びＣＴ２６細胞ではＲＰＭＩ ２ｍＬを加え、ＣＬＳＭで観察した。得られた結果を図１４に示す。
（１）共焦点顕微鏡による観察
３５ｍｍ２のガラス製ディッシュに細胞を５．０×１０４細胞／ディッシュとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。各ディッシュに２．０μＭ Ｃｙ５－Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子溶液を１ｍＬ加え、３時間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳ（－） １ｍＬで洗浄後、１００ｎＭ ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ｒｅｄ ＤＮＤ－９９／（Ｄ－ＰＢＳ：ＲＰＭＩ＝１：９）溶液１ｍＬを加え、３０分間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳ １ｍＬで洗浄後、５．０μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ／Ｄ－ＰＢＳ溶液１ｍＬを加え、Ｄ－ＰＢＳ １ｍＬで２回洗浄後、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞ではＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、ＢｘＰＣ３及びＣＴ２６細胞ではＲＰＭＩ ２ｍＬを加え、ＣＬＳＭで観察した。得られた結果を図１４に示す。
【0125】
Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子は、エンドソーム／リソソームに局在したことから、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれることが示唆された。
【0126】
（２）特異性評価
２４ウェルプレートに細胞を１．０×１０５細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。以下のサンプル溶液５００μＬを加え、３０分間インキュベートした。
・ＢＣＨ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｌ阻害剤）：１０ｍＭ
・ＢｚｌＳｅｒ（ＡＳＣＴ２阻害剤）：１０ｍＭ
・ＭｅＡＩＢ（Ｓｙｓｔｅｍ Ａ阻害剤）：１０ｍＭ
２４ウェルプレートに細胞を１．０×１０５細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。以下のサンプル溶液５００μＬを加え、３０分間インキュベートした。
・ＢＣＨ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｌ阻害剤）：１０ｍＭ
・ＢｚｌＳｅｒ（ＡＳＣＴ２阻害剤）：１０ｍＭ
・ＭｅＡＩＢ（Ｓｙｓｔｅｍ Ａ阻害剤）：１０ｍＭ
【0127】
その後、以下のサンプル溶液５００μＬを加え、３時間インキュベートした。
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＢＣＨ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＢｚｌＳｅｒ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＭｅＡＩＢ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＢＣＨ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＢｚｌＳｅｒ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＭｅＡＩＢ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＢＣＨ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＢｚｌＳｅｒ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＭｅＡＩＢ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＢＣＨ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＢｚｌＳｅｒ １０ｍＭ
・Ｃｙ５－Ｃｙｓ修飾高分子（Ｃｙ５：２μＭ）、ＭｅＡＩＢ １０ｍＭ
【0128】
Ｄ－ＰＢＳ ０．５ｍＬで２回洗浄後、１５０μＬトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞、ＣＴ２６細胞では３分間、ＢｘＰＣ３細胞では１０分間インキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞ではＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、ＢｘＰＣ３及びＣＴ２６細胞では ＲＰＭＩ ２ｍＬを３５０μＬ加え、懸濁した後に、ＦＣＭにより細胞取り込みを測定した。Ｃｙｓ修飾高分子の特異性評価は上記と同じように行った。得られた結果を図１５に示す。
【0129】
ＬＡＴ１阻害剤はＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ、ＣＴ２６及びＢｘＰＣ３におけるＭｅｔ修飾ＰＡｓｐの細胞取り込みを有意に阻害することができたが、ＡＳＣＴ２及びシステムＡ阻害剤は細胞取り込みを阻害せず、Ｍｅｔ修飾ＰＡｓｐの細胞取り込みはＬＡＴ１によって媒介されるエンドサイトーシスであることが示唆された。一方、Ｍｅｔ修飾ＰＥＧ－ＰＡｓｐ Ｃｙｓ修飾高分子の細胞取り込みは、阻害の処理下では低下しなかった。これは、側鎖の化学構造がＬＡＴ１標的に寄与することを示唆した。
【0130】
実施例４：細胞光毒性評価
Ｐｐａ－Ｍｅｔ修飾高分子のがん細胞増殖抑制作用をＣＣＫ－８アッセイにより評価した。
（１）細胞毒性測定
９６ウェルプレートに細胞を１．０×１０４細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。以下のサンプル溶液１００μＬを加え、３時間インキュベートした。
・Ｐｐａ－Ｍｅｔ修飾高分子（Ｐｐａ：２μＭ）
Ｐｐａ－Ｍｅｔ修飾高分子のがん細胞増殖抑制作用をＣＣＫ－８アッセイにより評価した。
（１）細胞毒性測定
９６ウェルプレートに細胞を１．０×１０４細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。以下のサンプル溶液１００μＬを加え、３時間インキュベートした。
・Ｐｐａ－Ｍｅｔ修飾高分子（Ｐｐａ：２μＭ）
【0131】
Ｄ－ＰＢＳ（－）０．１ｍＬで２回洗浄後、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞ではＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、ＢｘＰＣ３細胞ではＲＰＭＩ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞ではＤＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）を１００μＬ加え、１時間６８０ｎｍのハロゲンランプを用いて光照射した。４８時間インキュベートした後、１０％ＣＣＫ－８溶液を各ウェルに１００μＬ加え、１．５時間インキュベートした後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果を図１６に示す。
【0132】
Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］－Ｐｐａはがん細胞に対して極めて高い光毒性を示したが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する光毒性は低かった（図１６（ａ））。この結果は細胞取り込み量と整合性のとれる結果であった（図１６（ｂ））。一方、光照射を行わなければ、Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］－Ｐｐａ細胞毒性は誘起されなかった。すなわち、高分子－光増感剤そのものに顕著な毒性はないということが示唆された。
【0133】
実施例５：腹膜播種腫瘍マウスモデルに対する効果（腫瘍におけるＬＡＴ１発現量、腫瘍集積性及び抗腫瘍効果）
（１）概要
腹膜播種腫瘍マウスモデル（ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ、ＢｘＰＣ３、及びＣＴ２６）に対して蛍光色素（Ｃｙ５）で標識したＭｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子を腹腔内注射し、体内動態を評価した。さらに、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ（ヒト卵巣がん細胞株）腹膜播種腫瘍マウスモデルに対して光増感剤（Ｐｐａ）で標識したＭｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子を腹腔内注射し、抗腫瘍効果を評価した。
（１）概要
腹膜播種腫瘍マウスモデル（ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ、ＢｘＰＣ３、及びＣＴ２６）に対して蛍光色素（Ｃｙ５）で標識したＭｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子を腹腔内注射し、体内動態を評価した。さらに、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ（ヒト卵巣がん細胞株）腹膜播種腫瘍マウスモデルに対して光増感剤（Ｐｐａ）で標識したＭｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子を腹腔内注射し、抗腫瘍効果を評価した。
【0134】
（２）免疫組織化学による腫瘍ＬＡＴ１発現量の評価
（２－１）腹膜播種腫瘍マウスモデルの作製
ＣＴ２６：細胞懸濁液（３．０×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃマウスに対して２００μｌ腹内に注射した。
ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ・ＢｘＰＣ３：細胞懸濁液（５．０×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに対して２００μｌ腹内に注射した。
（２－１）腹膜播種腫瘍マウスモデルの作製
ＣＴ２６：細胞懸濁液（３．０×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃマウスに対して２００μｌ腹内に注射した。
ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ・ＢｘＰＣ３：細胞懸濁液（５．０×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに対して２００μｌ腹内に注射した。
【0135】
（２－２）免疫組織化学
パラフィン包埋された５μｍ厚の組織切片を脱パラフィン及び脱水した後、抗原賦活のためクエン酸バッファー中でｍｉｃｒｏｗａｖｅ処理を１０分間行った。内因性ペルオキセダーゼ活性をブロックするために３％Ｈ２Ｏ２により２０分間処理を行った。３％ＢＳＡ ＰＢＳＴ溶液で３０分間ブロックした後、ウサギポリクローナル抗ＬＡＴ１抗体（５μｇ／ｍｌ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を組織切片上に乗せ、室温で２時間反応させ、ＰＢＳＴで３回の洗浄をした後、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ ＳｔａｉｎＴＭ Ｒａｂｂｉｔ ＭＡＸ ＰＯ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を組織切片上に乗せ、室温で１５分反応させた。最後に、３－３’ジアミノベンジン（ＤＡＢ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ，Ｌｔｄ．）を反応色素に用い、ヘマトキシリンで核染色を行った後、光学顕微鏡で観察した。得られた結果を図１７に示す。
パラフィン包埋された５μｍ厚の組織切片を脱パラフィン及び脱水した後、抗原賦活のためクエン酸バッファー中でｍｉｃｒｏｗａｖｅ処理を１０分間行った。内因性ペルオキセダーゼ活性をブロックするために３％Ｈ２Ｏ２により２０分間処理を行った。３％ＢＳＡ ＰＢＳＴ溶液で３０分間ブロックした後、ウサギポリクローナル抗ＬＡＴ１抗体（５μｇ／ｍｌ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を組織切片上に乗せ、室温で２時間反応させ、ＰＢＳＴで３回の洗浄をした後、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｅ ＳｔａｉｎＴＭ Ｒａｂｂｉｔ ＭＡＸ ＰＯ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を組織切片上に乗せ、室温で１５分反応させた。最後に、３－３’ジアミノベンジン（ＤＡＢ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ，Ｌｔｄ．）を反応色素に用い、ヘマトキシリンで核染色を行った後、光学顕微鏡で観察した。得られた結果を図１７に示す。
【0136】
ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ、ＢｘＰＣ３、ＣＴ２６腹膜播種腫瘍マウスモデルいずれもＬＡＴ１の強い発現を認めた。
【0137】
実施例６：メチオニン・システイン官能化高分子の体内動態
（１）腹膜播種腫瘍マウスモデルの作製
ＣＴ２６：細胞懸濁液（３．０×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃマウスに対して２００μｌ腹内に注射した。
ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ・ＢｘＰＣ３：細胞懸濁液（５．０×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに対して２００μｌ腹内に注射した。
（１）腹膜播種腫瘍マウスモデルの作製
ＣＴ２６：細胞懸濁液（３．０×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃマウスに対して２００μｌ腹内に注射した。
ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ・ＢｘＰＣ３：細胞懸濁液（５．０×１０６細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに対して２００μｌ腹内に注射した。
【0138】
（２）体内動態の評価
がん細胞の腹腔播種から２週間後、以下のサンプルＤ－ＰＢＳ（－）溶液２５０μＬを腹腔内投与した（Ｃｙ５ １０μＭ、２５０μＬ／マウス）。
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ修飾高分子
・Ｃｙ５－Ｃｙｓ修飾高分子
・ＰＥＧ２０ｋ－Ｃｙ５
がん細胞の腹腔播種から２週間後、以下のサンプルＤ－ＰＢＳ（－）溶液２５０μＬを腹腔内投与した（Ｃｙ５ １０μＭ、２５０μＬ／マウス）。
・Ｃｙ５－Ｍｅｔ修飾高分子
・Ｃｙ５－Ｃｙｓ修飾高分子
・ＰＥＧ２０ｋ－Ｃｙ５
【0139】
サンプル注射から１時間後にマウスを安楽死させた。ＳＫＯＶ３腫瘍モデルについては、安楽死５分前に２００μＬのルシフェリン（３０ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内投与した。腫瘍と臓器を摘出した後、ＰＢＳで丁寧に洗浄し、余分な水分をティッシュペーパーで拭き取った後、Ｃｙ５の蛍光をインビボイメージングシステム（ｅｘ／ｅｍ＝６３０／６９０ｎｍ；ＩＶＩＳ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により撮像した。ＳＫＯＶ３モデルについてはルシフェリンの発光も測定した。
【0140】
定量については、膵臓付近の腫瘍を摘出しＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加えてホモジェナイズした。各種臓器についても同様にホモジェナイズした。ホモジェナイズはマルチビーズショッカーにより行った。ホモジェナイズ溶液をブラック９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．ＵＳＡ）に移し、マイクロプレートリーダー（ＳＰＡＲＫ ＴＫＳ０１，ＴＥＡＣＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（ｅｘ／ｅｍ＝６３０ｎｍ／６８０ｎｍ）により蛍光を測定した。また検量線を臓器ホモジェナイズ溶液を用いて作成し、各サンプル内に含まれるＣｙ５量を算出することにより、投薬量％／ｇ組織に換算した。結果を図１８及び図１９に示す。
【0141】
Ｍｅｔ／Ｃｙｓ修飾高分子は腫瘍に迅速に集積した。一方、正常組織に対してはあまり集積しなかった。
【0142】
実施例７：抗腫瘍効果
ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの腹腔播種から２週間後、以下のサンプルＤ－ＰＢＳ（－）溶液２５０μＬを腹腔内投与した（Ｐｐａ １０μＭ、２５０μＬ／マウスｅ）。
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ８９／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３８］
・Ｐｐａ－ＰＥＧ２０ｋ
ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの腹腔播種から２週間後、以下のサンプルＤ－ＰＢＳ（－）溶液２５０μＬを腹腔内投与した（Ｐｐａ １０μＭ、２５０μＬ／マウスｅ）。
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ８９／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３８］
・Ｐｐａ－ＰＥＧ２０ｋ
【0143】
光照射群に関しては、試料投与から１時間後にマウスの腹部に２００ｍＷ／ｃｍ２ ６８０ｎｍのレーザーを６００秒照射した。照射日を１日目とし、５日おきに腫瘍の成長をＩＶＩＳにて、体重を電子天秤にて全２０日間測定した。
【0144】
評価した検体をまとめると下記のようになる（ｎ＝５）。
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］（Ｌｉｇｈｔ）
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ８９／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３８］（Ｌｉｇｈｔ）
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］（Ｄａｒｋ）
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ８９／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３８］（Ｄａｒｋ）
・Ｐｐａ－ＰＥＧ２０ｋ（Ｌｉｇｈｔ）
・処置なし
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］（Ｌｉｇｈｔ）
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ８９／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３８］（Ｌｉｇｈｔ）
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ９２／Ａｓｐ（Ｍｅｔ）３５］（Ｄａｒｋ）
・Ｐｐａ－Ｐ［Ａｓｐ８９／Ａｓｐ（Ｃｙｓ）３８］（Ｄａｒｋ）
・Ｐｐａ－ＰＥＧ２０ｋ（Ｌｉｇｈｔ）
・処置なし
【0145】
【0146】
実施例８：チロシン修飾高分子の合成
（１）Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ポリ［アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（チロシン）ｎ］及びＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ポリ［アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（トリエチレングリコール－チロシン）ｎ］の合成
本チロシンリガンド修飾高分子Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ポリ［アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（チロシン）ｎ］及びＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ポリ［アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（トリエチレングリコール－チロシン）ｎ］（以下、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）ｎ］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）ｎ］（ｍ＝Ａｓｐのユニット数、ｎ＝Ａｓｐ（Ｔｙｒ）又はＡｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）のユニット数）の合成法を記す。
（１）Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ポリ［アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（チロシン）ｎ］及びＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ポリ［アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（トリエチレングリコール－チロシン）ｎ］の合成
本チロシンリガンド修飾高分子Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ポリ［アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（チロシン）ｎ］及びＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ポリ［アスパラギン酸ｍ／アスパラギン酸（トリエチレングリコール－チロシン）ｎ］（以下、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）ｎ］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）ｎ］（ｍ＝Ａｓｐのユニット数、ｎ＝Ａｓｐ（Ｔｙｒ）又はＡｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）のユニット数）の合成法を記す。
【0147】
Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）ｎ］の合成スキームを下記に示す。
【0148】
【化17】
【0149】
Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）ｎ］の合成スキームを下記に示す。
【0150】
【化18】
【0151】
開始剤をＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２、モノマーをＢＬＡ－ＮＣＡとするＮ－カルボキシ無水物（ＮＣＡ）重合によりＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡｎを合成した。塩基性条件下で側鎖のカルボキシ基を脱保護し、Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＡｓｐｎを得た。その後、プロピルスペーサー及びトリエチレングリコールスペーサーを有するチロシン構造リガンドＮＨ２－Ｔｙｒ及びＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒのアミノ基をそれぞれＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＡｓｐｎのカルボキシ基に結合し、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を得た。
【0152】
（２）合成手法
（２－１）Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡ９５の合成
３００ｍＬ二口ナスフラスコにＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２ ０．４０ｇ（０．０４４ｍｍｏｌ）を量り取り、ベンゼン８．０ｍＬに溶解させた後、凍結乾燥した。アルゴン雰囲気下で１００ｍＬ二口ナスフラスコにＢＬＡ－ＮＣＡを１．２６ｇ（５．０７ｍｍｏｌ）（ｎ＝９５）を量り取った。Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２に蒸留精製したＤＭＦを１．３６ｍＬ、ＤＣＭを１３．６ｍＬ加えた。またＢＬＡ－ＮＣＡにそれぞれＤＭＦを３．５５ｍＬ及びＤＣＭを３５．５ ｍＬ加えて、溶解させた。ＢＬＡ－ＮＣＡ溶液をＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２溶液に加え、アルゴン雰囲気下のもと室温で４８時間攪拌した。反応溶液をそれぞれヘキサン、酢酸エチル混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）８００ｍＬに滴下し、再沈殿により精製した。その後、減圧乾燥させ、白色固体Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡ９５を収量１．２０ｇ、収率９６％で得た。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２５に示す。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ８．４１－８．０２（ｂｒ，－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－），７．４８－７．０６（ｂｒ，＝ＣＨ－ＣＨ＝），５．３０－４．８３（ｂｒ，－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ－），４．８２－４．３２（ｂｒ，－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－），３．７３－３．６４（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－），３．５７－３．４３（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），２．９４－２．７２，２．７０－２．５５（ｂｒ，－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－），２．３６－２．２９（ｂｒ，－Ｎ３－ＣＨ２－ＣＨ２－）。
（２－１）Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡ９５の合成
３００ｍＬ二口ナスフラスコにＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２ ０．４０ｇ（０．０４４ｍｍｏｌ）を量り取り、ベンゼン８．０ｍＬに溶解させた後、凍結乾燥した。アルゴン雰囲気下で１００ｍＬ二口ナスフラスコにＢＬＡ－ＮＣＡを１．２６ｇ（５．０７ｍｍｏｌ）（ｎ＝９５）を量り取った。Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２に蒸留精製したＤＭＦを１．３６ｍＬ、ＤＣＭを１３．６ｍＬ加えた。またＢＬＡ－ＮＣＡにそれぞれＤＭＦを３．５５ｍＬ及びＤＣＭを３５．５ ｍＬ加えて、溶解させた。ＢＬＡ－ＮＣＡ溶液をＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２溶液に加え、アルゴン雰囲気下のもと室温で４８時間攪拌した。反応溶液をそれぞれヘキサン、酢酸エチル混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）８００ｍＬに滴下し、再沈殿により精製した。その後、減圧乾燥させ、白色固体Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡ９５を収量１．２０ｇ、収率９６％で得た。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２５に示す。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ８．４１－８．０２（ｂｒ，－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－），７．４８－７．０６（ｂｒ，＝ＣＨ－ＣＨ＝），５．３０－４．８３（ｂｒ，－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ－），４．８２－４．３２（ｂｒ，－ＣＯ－ＣＨ－ＮＨ－），３．７３－３．６４（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－），３．５７－３．４３（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），２．９４－２．７２，２．７０－２．５５（ｂｒ，－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－），２．３６－２．２９（ｂｒ，－Ｎ３－ＣＨ２－ＣＨ２－）。
【0153】
（２－２）Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡｎ（ｎ＝９５）の脱保護
５０ｍＬナスフラスコにＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡ９５ １．０５ｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）を量り取り、０．１Ｍ ＮａＯＨａｑ １５ｍＬ及びＮＭＰ １５ｍＬを加えて室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）に入れ、２Ｌの純水で３回透析した。溶液を凍結乾燥させ、白色固体Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＡｓｐ９５を収量７８７ｍｇ、収率９３％で得た。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２６に示す。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．３４－７．１２，７．１１－６．８３（ｂｒ，－ＣＨ＝ＣＨ－），４．７５－４．３５（ｂｒ，－Ｃ＝Ｏ－ＣＨ－ＮＨ），４．１７－３．９９（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），３．９８－３．８５（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ－Ｃ＝Ｏ－），３．８６－３．６０（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），３．４７－３．２７（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－），３．２６－３．１３，３．１２－２．９３（ｂｒ，－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ－），２．９４－２．５１（ｂｒ，－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－），２．０８－１．７８（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）。
５０ｍＬナスフラスコにＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡ９５ １．０５ｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）を量り取り、０．１Ｍ ＮａＯＨａｑ １５ｍＬ及びＮＭＰ １５ｍＬを加えて室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）に入れ、２Ｌの純水で３回透析した。溶液を凍結乾燥させ、白色固体Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＡｓｐ９５を収量７８７ｍｇ、収率９３％で得た。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２６に示す。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．３４－７．１２，７．１１－６．８３（ｂｒ，－ＣＨ＝ＣＨ－），４．７５－４．３５（ｂｒ，－Ｃ＝Ｏ－ＣＨ－ＮＨ），４．１７－３．９９（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），３．９８－３．８５（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ－Ｃ＝Ｏ－），３．８６－３．６０（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），３．４７－３．２７（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－），３．２６－３．１３，３．１２－２．９３（ｂｒ，－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ－），２．９４－２．５１（ｂｒ，－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－），２．０８－１．７８（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）。
【0154】
（２－３）Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の合成
２０ｍＬスクリュー管瓶にＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＡｓｐ９５ １５０ｍｇ（７．５μｍｏｌ）を量り取り、Ｈ２ＯとＤＭＦの混合溶媒（Ｈ２Ｏ：ＤＭＦ＝２：８）１０ｍＬに溶解させた。そこに、ＮＨ２－Ｔｙｒ ８４ｍｇ（２１４ μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）及び２１１ｍｇ（５３４μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、ＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒ １２５ｍｇ（２１４μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び３１３ｍｇ（５３４μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、ＴＥＡ ２９８μＬ（２．１３８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ ５５ｍｇ（２８５μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、１３７ｍｇ（７１３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、５５ｍｇ（２８５μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び１３７ｍｇ（７１３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、ＮＨＳ ３３ｍｇ（２８５μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、８２ｍｇ（７１３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、３３ｍｇ（２８５μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び８２ｍｇ（７１３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）をそれぞれ加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）に入れ、それぞれ２Ｌの０．０１Ｍ ＮａＯＨで透析を２回行った後、２Ｌの純水でそれぞれ４回ずつ透析した。得られた溶液を凍結乾燥し、白色固体Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を収量１７７ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、２１９ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、２１３ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び３０２ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、収率８６％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、９３％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、８９％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び９２％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）で得た。
２０ｍＬスクリュー管瓶にＮ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＡｓｐ９５ １５０ｍｇ（７．５μｍｏｌ）を量り取り、Ｈ２ＯとＤＭＦの混合溶媒（Ｈ２Ｏ：ＤＭＦ＝２：８）１０ｍＬに溶解させた。そこに、ＮＨ２－Ｔｙｒ ８４ｍｇ（２１４ μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）及び２１１ｍｇ（５３４μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、ＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒ １２５ｍｇ（２１４μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び３１３ｍｇ（５３４μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、ＴＥＡ ２９８μＬ（２．１３８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ ５５ｍｇ（２８５μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、１３７ｍｇ（７１３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、５５ｍｇ（２８５μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び１３７ｍｇ（７１３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、ＮＨＳ ３３ｍｇ（２８５μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、８２ｍｇ（７１３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、３３ｍｇ（２８５μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び８２ｍｇ（７１３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）をそれぞれ加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）に入れ、それぞれ２Ｌの０．０１Ｍ ＮａＯＨで透析を２回行った後、２Ｌの純水でそれぞれ４回ずつ透析した。得られた溶液を凍結乾燥し、白色固体Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を収量１７７ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、２１９ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、２１３ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び３０２ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、収率８６％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、９３％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、８９％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び９２％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）で得た。
【0155】
（２－４）Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の脱保護
２０ｍＬスクリュー管瓶にそれぞれ１５０ｍｇ Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］（５．５μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］（４．８μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］（４．７μｍｏｌ）及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］（３．４μｍｏｌ）を量り取り、９５％ＴＦＡ ５ｍＬに溶かして室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜 （ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）に入れ、それぞれ２Ｌの０．０１Ｍ ＮａＯＨで透析を２回行った後、２Ｌの純水で４回透析した。溶液を凍結乾燥させ、白色固体Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を収量９５ｍｇ（３．９μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、９１ｍｇ（３．４μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、１０７ｍｇ（３．７μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び１２４ｍｇ（３．３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、収率７１％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、７１％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、７９％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１）及び９７％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）で得た。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２７（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、図２８（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、図２９（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び図３０（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）に示す。
２０ｍＬスクリュー管瓶にそれぞれ１５０ｍｇ Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］（５．５μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］（４．８μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］（４．７μｍｏｌ）及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］（３．４μｍｏｌ）を量り取り、９５％ＴＦＡ ５ｍＬに溶かして室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜 （ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）に入れ、それぞれ２Ｌの０．０１Ｍ ＮａＯＨで透析を２回行った後、２Ｌの純水で４回透析した。溶液を凍結乾燥させ、白色固体Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を収量９５ｍｇ（３．９μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、９１ｍｇ（３．４μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、１０７ｍｇ（３．７μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び１２４ｍｇ（３．３μｍｏｌ）（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、収率７１％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、７１％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、７９％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１）及び９７％（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）で得た。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２７（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、図２８（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、図２９（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び図３０（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）に示す。
【0156】
Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）ｎ］（ｎ＝２０及び３０）：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．３４－７．１２，７．１１－６．８３（ｂｒ，－ＣＨ＝ＣＨ－），４．７５－４．３５（ｂｒ，－Ｃ＝Ｏ－ＣＨ－ＮＨ），４．１７－３．９９（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），３．９８－３．８５（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ－Ｃ＝Ｏ－），３．８６－３．６０（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），３．４７－３．２７（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－），３．２６－３．１３，３．１２－２．９３（ｂｒ，－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ－），２．９４－２．５１（ｂｒ，－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－），２．０８－１．７８（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）。
【0157】
Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐｍ／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）ｎ］（ｎ＝２１及び４３）：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．３５－７．１６，７．１０－６．９１（ｂｒ，－ＣＨ＝ＣＨ－），４．７４－４．３８（ｂｒ，－Ｃ＝Ｏ－ＣＨ－ＮＨ），４．１９－４．０３（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），４．０２－３．８５（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），３．８２－３．６３（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），３．４７－３．３２（ｂｒ，－Ｃ－ＣＨ２－ＣＨ－），３．３１－３．１６（ｂｒ，－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－），３．１７－２．９７（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），２．９６－２．５０（ｂｒ，－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－），２．４８－２．２９（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ－Ｃ＝Ｏ－），１．９６－１．８０（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－），１．７９－１．６４（ｂｒ，－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）。
【0158】
（２－５）ｔｅｒｔ－ブチルＯ－（１６－アミノ－５，８，１１，１４－テトラオキサヘキサデカン－１－イル）－Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－チロシネート（「ＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒ」（中間体）の合成
ＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒを下記の合成スキームに従って合成した。
ＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒを下記の合成スキームに従って合成した。
【0159】
【化19】
【0160】
スキーム１．４の合成。試薬及び条件：（ａ）トランス－１，４－ジブロモ－２－ブテン、テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム水素硫酸塩、ＮａＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、Ｈ２Ｏ、５８％。（ｂ）ベンジル（２－｛２－［２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチル）カルバメート、テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム水素硫酸塩、ＮａＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、Ｈ２Ｏ、３０％；（ｃ）Ｈ２（１ａｔｍ）、Ｐｄ／Ｃ、ＡｃＯＥｔ、ＭｅＯＨ、５１％。
【0161】
（２－５－１）ｔｅｒｔ－ブチル Ｏ－［（２Ｅ）－４－ブロモブタ－２－エン－１－イル］－Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－チロシネート（２）
【0162】
【化20】
【0163】
ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）Ｌ－チロシネート（０．２０ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）、及び、ｔｒａｎｓ－１，４－ジブロモ－２－ブテン（０．２５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１．８ｍＬ）に、テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム硫酸水素塩（０．２０ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）、及び、水酸化ナトリウム（０．０４７ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の水溶液（０．９５ｍＬ）を加え、室温にて４５分間攪拌した。反応液にジクロロメタン、及び、水を加え分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、標記化合物（０．１６ｇ、収率：５８％）を無色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．０８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．１１-５．９５（２Ｈ、ｍ）、４．９７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、４．５３（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝４．８、１．２Ｈｚ）、４．４０（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、３．９９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、２．９９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、１．４２（９Ｈ、ｓ）、１．４１（９Ｈ、ｓ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：４７０．１５５５（Ｍ＋Ｈ）＋（計算値：Ｃ２２Ｈ３３ＢｒＮＯ５：４７０．１５３７）。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．０８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．１１-５．９５（２Ｈ、ｍ）、４．９７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、４．５３（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝４．８、１．２Ｈｚ）、４．４０（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、３．９９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、２．９９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ）、１．４２（９Ｈ、ｓ）、１．４１（９Ｈ、ｓ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：４７０．１５５５（Ｍ＋Ｈ）＋（計算値：Ｃ２２Ｈ３３ＢｒＮＯ５：４７０．１５３７）。
【0164】
（２－５－２）ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｏ－［（１８Ｅ）－３－オキソ－１－フェニル－２，７，１０，１３，１６－ペンタオキサ－４－アザイコス－１８－エン－２０－イル］－Ｌ－チロシネート（３）
【0165】
【化21】
【0166】
ｔｅｒｔ－ブチル Ｏ－［（２Ｅ）－４－ブロモブタ－２－エン－１－イル］－Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－チロシネート（１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）、及び、ベンジル（２－｛２－［２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチル）カルバメート（０．８４ｇ、２．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１．８ｍＬ）に、テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム硫酸水素塩（０．７２ｇ、２．１ｍｍｏｌ）、及び、水酸化ナトリウム（０．１７ｇ、４．３ｍｍｏｌ）の水溶液（０．９５ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液にジクロロメタン、及び、水を加え分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製し、標記化合物（０．４５ｇ、収率：３０％）を無色の液体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．３５（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、７．３２－７．３０（１Ｈ、ｍ）、７．０７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、５．９２（２Ｈ、ｓ）、５．４９（１Ｈ、ｓ）、５．１０（２Ｈ、ｂｒｓ）、４．９８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、４．４９（２Ｈ、ｂｒｓ）、４．４０（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、４．０３（２Ｈ、ｓ）、３．６４－３．５５（１４Ｈ、ｍ）、３．３９（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、２．９９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、１．４２（９Ｈ、ｓ）、１．４１（９Ｈ、ｓ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：７１７．４００９（Ｍ＋Ｈ）＋（計算値：Ｃ３８Ｈ５７Ｎ２Ｏ１１：７１７．３９５７）。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．３５（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、７．３２－７．３０（１Ｈ、ｍ）、７．０７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、５．９２（２Ｈ、ｓ）、５．４９（１Ｈ、ｓ）、５．１０（２Ｈ、ｂｒｓ）、４．９８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、４．４９（２Ｈ、ｂｒｓ）、４．４０（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、４．０３（２Ｈ、ｓ）、３．６４－３．５５（１４Ｈ、ｍ）、３．３９（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝５．２Ｈｚ）、２．９９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、１．４２（９Ｈ、ｓ）、１．４１（９Ｈ、ｓ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：７１７．４００９（Ｍ＋Ｈ）＋（計算値：Ｃ３８Ｈ５７Ｎ２Ｏ１１：７１７．３９５７）。
【0167】
（２－５－３）ｔｅｒｔ－ブチル Ｏ－（１６－アミノ－５，８，１１，１４－テトラオキサヘキサデカン－１－イル）－Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－チロシネート（４）
【0168】
【化22】
【0169】
ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｏ－［（１８Ｅ）－３－オキソ－１－フェニル－２，７，１０，１３，１６－ペンタオキサ－４－アザイコス－１８－エン－２０－イル］－Ｌ－チロシネート（０．４６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（３ｍＬ）及び、メタノール（３ｍＬ）溶液に、１０％パラジウム－活性炭素（８７ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で４時間撹拌した。セライトろ過後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）で精製し、粗生成物（０．１９ｇ、収率：５１％）を無色の液体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．０６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ）、６．８０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、４．９８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、４．４０（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、３．９５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、３．６８－３．５９（１２Ｈ、ｍ）、３．５４－３．４９（４Ｈ、ｍ）、２．９９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、２．８６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、１．８８－１．７２（４Ｈ、ｍ）、１．４２（９Ｈ、ｓ）、１．４１（９Ｈ、ｓ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：５８５．３７６１（Ｍ＋Ｈ）＋（計算値：Ｃ３０Ｈ５３Ｎ２Ｏ９：５８５．３７４６）。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．０６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ）、６．８０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、４．９８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、４．４０（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、３．９５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、３．６８－３．５９（１２Ｈ、ｍ）、３．５４－３．４９（４Ｈ、ｍ）、２．９９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、２．８６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、１．８８－１．７２（４Ｈ、ｍ）、１．４２（９Ｈ、ｓ）、１．４１（９Ｈ、ｓ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：５８５．３７６１（Ｍ＋Ｈ）＋（計算値：Ｃ３０Ｈ５３Ｎ２Ｏ９：５８５．３７４６）。
【0170】
実施例９：解析
（１）Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡ９５
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２由来のピーク［３．５７－３．４３（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］とＢＬＡ－ＮＣＡ由来のピーク［８．４１－８．０２（ｂｒ、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－）、５．３０－４．８３（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ－）、２．９４－２．７２、２．７０－２．５５（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－）］の積分値の比からＰＢＬＡの重合度ＤＰ＝９５、数平均分子量Ｍｎ＝２８，５００と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子の分子量分散度はＰＤＩ＝１．１１と求まり、狭い分子量分布を持つことを確認した。
（１）Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＢＬＡ９５
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２由来のピーク［３．５７－３．４３（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］とＢＬＡ－ＮＣＡ由来のピーク［８．４１－８．０２（ｂｒ、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－）、５．３０－４．８３（ｂｒ、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ－）、２．９４－２．７２、２．７０－２．５５（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－）］の積分値の比からＰＢＬＡの重合度ＤＰ＝９５、数平均分子量Ｍｎ＝２８，５００と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子の分子量分散度はＰＤＩ＝１．１１と求まり、狭い分子量分布を持つことを確認した。
【0171】
（２）Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＰＡｓｐ９５
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２由来のピーク［３．５７－３．４３（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］とアスパラギン酸のα水素のピーク（３．０１－２．４０（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－）の積分値の比からＡｓｐの重合度ＤＰ＝９５（ｎ＝９５）、数平均分子量Ｍｎ＝２０，０００と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルの開始剤Ｎ３－ＰＥＧ９ｋ－ＮＨ２由来のピーク［３．５７－３．４３（ｂｒ、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）］とアスパラギン酸のα水素のピーク（３．０１－２．４０（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－）の積分値の比からＡｓｐの重合度ＤＰ＝９５（ｎ＝９５）、数平均分子量Ｍｎ＝２０，０００と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
【0172】
（３）Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのアスパラギン酸のα水素のピーク（３．０１－２．４０（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－）及びＮＨ２－Ｔｙｒのベンゼン環上の水素のピーク［７．３４－７．１２、７．１１－６．８３（ｂｒ、－ＣＨ＝ＣＨ－）］の積分値の比からＮＨ２－Ｔｙｒの導入数は２０（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）及び３０（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、数平均分子量はＭｎ＝２４，３００（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）及びＭｎ＝２６，５００（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）と求まった。同様に、１Ｈ ＮＭＲスペクトルのアスパラギン酸のα水素のピーク（３．０１－２．４０（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－）及びＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒのベンゼン環上の水素のピーク［７．３４－７．１２、７．１１－６．８３（ｂｒ、－ＣＨ＝ＣＨ－）］の積分値の比からＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒの導入数は２１（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び４３（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、数平均分子量はＭｎ＝２８，５００（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及びＭｎ＝３７，２００（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルのアスパラギン酸のα水素のピーク（３．０１－２．４０（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－）及びＮＨ２－Ｔｙｒのベンゼン環上の水素のピーク［７．３４－７．１２、７．１１－６．８３（ｂｒ、－ＣＨ＝ＣＨ－）］の積分値の比からＮＨ２－Ｔｙｒの導入数は２０（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）及び３０（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、数平均分子量はＭｎ＝２４，３００（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）及びＭｎ＝２６，５００（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）と求まった。同様に、１Ｈ ＮＭＲスペクトルのアスパラギン酸のα水素のピーク（３．０１－２．４０（ｂｒ、－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ＝Ｏ－）及びＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒのベンゼン環上の水素のピーク［７．３４－７．１２、７．１１－６．８３（ｂｒ、－ＣＨ＝ＣＨ－）］の積分値の比からＮＨ２－ＴＥＧ－Ｔｙｒの導入数は２１（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び４３（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）、数平均分子量はＭｎ＝２８，５００（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及びＭｎ＝３７，２００（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）と求まった。また、ＧＰＣカーブから、得られた高分子は単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した（データを示さず）。
【0173】
実施例１０：培養細胞に対する評価
（１）概要
蛍光色素（Ｃｙ５）で標識したＮ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐｎ（Ｃｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐｎ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］（Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］（Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］（Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］（Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）の細胞内の取り込み量を比較した。次に、ＢＣＨ（ＬＡＴ１阻害剤）との共培養における取り込み量を測定し、ＬＡＴ１特異性を比較した。
（１）概要
蛍光色素（Ｃｙ５）で標識したＮ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐｎ（Ｃｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐｎ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］（Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］（Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］（Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］（Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）の細胞内の取り込み量を比較した。次に、ＢＣＨ（ＬＡＴ１阻害剤）との共培養における取り込み量を測定し、ＬＡＴ１特異性を比較した。
【0174】
（２）Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の細胞取り込み量の評価
蛍光色素（Ｃｙ５）をＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］に導入し、細胞に添加したのちに細胞内のＣｙ５蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。
蛍光色素（Ｃｙ５）をＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］に導入し、細胞に添加したのちに細胞内のＣｙ５蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。
【0175】
（３）Ｃｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の合成
クリックケミストリーにより、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の末端のアジド基にＣｙ５－ＤＢＣＯを結合した。Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５を５０．０ｍｇ（２．５０μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］を７０．０ｍｇ（２．８８μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］を７０．０ｍｇ（２．６４μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］を８０．０ｍｇ（２．８１μｍｏｌ）及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を８０．０ｍｇ（２．１５μｍｏｌ）を１０ｍＬバイアルに量り取り、５．００ｍＬの純水に溶解させた。次に、高分子溶液に対してそれぞれ１等量のＣｙ５－ＤＢＣＯ（１２．５ｍｇ／ｍｌ Ｃｙ５－ＤＢＣＯ／ＤＭＳＯ溶液）それぞれ２０２μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５）、２３３μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、２１３μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、２２７μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び１７４μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）を高分子溶液に加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）に入れ、それぞれ２Ｌの純水で４回透析した。その後、ＰＤ－１０カラムを用いてさらに精製し、高分子溶液を凍結乾燥させ、青色固体４４．３ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５）、６４．８ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、６１．２ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、６２．２ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び５８．９ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）を得た。
クリックケミストリーにより、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の末端のアジド基にＣｙ５－ＤＢＣＯを結合した。Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５を５０．０ｍｇ（２．５０μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］を７０．０ｍｇ（２．８８μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］を７０．０ｍｇ（２．６４μｍｏｌ）、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］を８０．０ｍｇ（２．８１μｍｏｌ）及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を８０．０ｍｇ（２．１５μｍｏｌ）を１０ｍＬバイアルに量り取り、５．００ｍＬの純水に溶解させた。次に、高分子溶液に対してそれぞれ１等量のＣｙ５－ＤＢＣＯ（１２．５ｍｇ／ｍｌ Ｃｙ５－ＤＢＣＯ／ＤＭＳＯ溶液）それぞれ２０２μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５）、２３３μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、２１３μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、２２７μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び１７４μＬ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）を高分子溶液に加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）に入れ、それぞれ２Ｌの純水で４回透析した。その後、ＰＤ－１０カラムを用いてさらに精製し、高分子溶液を凍結乾燥させ、青色固体４４．３ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５）、６４．８ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］）、６１．２ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］）、６２．２ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］）及び５８．９ｍｇ（Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］）を得た。
【0176】
（４）細胞内Ｃｙ５蛍光強度の測定
２４ウェルプレートにＢｘＰＣ３細胞を１．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。上記の高分子溶液をそれぞれ２．０μＭとなるように培地で調製し、ウェルに５００μＬずつ加えて３時間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳ ５００μＬで２回洗浄後、１５０μＬトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、７分間インキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、ＲＰＭＩ培地を３５０μＬ加え、懸濁してフローサイトメトリー（Ｅｘ／Ｅｍ＝６５０／６７０ｎｍ）により細胞への取り込み量を測定した。得られた結果を図３１に示す。
２４ウェルプレートにＢｘＰＣ３細胞を１．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。上記の高分子溶液をそれぞれ２．０μＭとなるように培地で調製し、ウェルに５００μＬずつ加えて３時間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳ ５００μＬで２回洗浄後、１５０μＬトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、７分間インキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、ＲＰＭＩ培地を３５０μＬ加え、懸濁してフローサイトメトリー（Ｅｘ／Ｅｍ＝６５０／６７０ｎｍ）により細胞への取り込み量を測定した。得られた結果を図３１に示す。
【0177】
チロシン修飾高分子はいずれもチロシン修飾していないコントロールであるＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５に比べて有意な取り込み量の増大を示した。Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］は、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］に比べて取り込み量が高く、また両方ともチロシンリガンドの数の増加につれて取り込み量が増加した。
【0178】
（５）Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］のＢＣＨによる阻害効果の評価
蛍光色素（Ｃｙ５）を導入したＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を用いて、ＬＡＴ１阻害剤であるＢＣＨと細胞に共培養したのちに細胞内のＣｙ５蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。
蛍光色素（Ｃｙ５）を導入したＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を用いて、ＬＡＴ１阻害剤であるＢＣＨと細胞に共培養したのちに細胞内のＣｙ５蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。
【0179】
２４ウェルプレートにＢｘＰＣ３細胞を１．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。ＢＣＨを１０．０ｍＭとなるように培地で調製し、ウェルに５００μＬずつ加えて３０分間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳ ５００μＬで２回洗浄後、上記の高分子溶液をそれぞれ２．０μＭ、ＢＣＨを１０．０ｍＭとなるように培地で調製し、ウェルに５００μＬずつ加えて３時間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳ ５００μＬで２回洗浄後、１５０μＬトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を加え、７分間インキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、ＲＰＭＩ培地を３５０μＬ加え、懸濁してフローサイトメトリー（Ｅｘ／Ｅｍ＝６５０／６７０ｎｍ）により細胞への取り込み量を測定した。得られた結果を図３２に示す。
【0180】
ＢＣＨ（ＬＡＴ１阻害剤）との共培養下において、Ｃｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５とＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］は細胞内取り込み量に変化が見られなかった。一方、チロシン修飾高分子であるＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の取り込み量に大きな差は確認された。以上の結果から、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］は、ＬＡＴ１特異的に介してエンドサイトーシスにより効率的に細胞内に取りこまれたことが示唆された。
【0181】
実施例１１：皮下腫瘍マウスモデルに対する効果（血中滞留性及び腫瘍集積性）
（１）概要
ＢｘＰＣ３（ヒト膵臓腺がん細胞）皮下腫瘍マウスモデルに対してＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を静脈注射し、体内動態を評価した。
（１）概要
ＢｘＰＣ３（ヒト膵臓腺がん細胞）皮下腫瘍マウスモデルに対してＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を静脈注射し、体内動態を評価した。
【0182】
（２）Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の体内動態
ＢｘＰＣ３皮下腫瘍マウスモデルに対してＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を静脈注射し、血中滞留性及び腫瘍集積性を評価した。
ＢｘＰＣ３皮下腫瘍マウスモデルに対してＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］を静脈注射し、血中滞留性及び腫瘍集積性を評価した。
【0183】
（３）ＢｘＰＣ３皮下腫瘍マウスモデルの作製
ＢｘＰＣ３細胞懸濁液（５．０×１０７細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃマウスに対して１００ μｌ皮下注射した。
ＢｘＰＣ３細胞懸濁液（５．０×１０７細胞／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃマウスに対して１００ μｌ皮下注射した。
【0184】
（４）体内動態の評価
腫瘍サイズがおよそ２００ｍｍ３に達したモデルマウスに対して、上記の５０．０μＭ高分子調製溶液１００μＬを尾静脈投与した。投与量はマウス一匹当たりそれぞれ０．１０ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、０．１２ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、０．１３ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、０．１４ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及び０．１９ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］となる。試料投与から１、３、６、２４時間後に解剖し、血液及び各種臓器をマルチビーズショッカー粉砕チューブに回収した。その後、各種臓器をＰＢＳで洗浄して、ＩＶＩＳを用いて（Ｅｘ／Ｅｍ＝６４０／７００ｎｍ）で蛍光強度を観察し、その結果を図３３に示す。回収された臓器１００ｍｇに対してＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを８００μＬ加え、マルチビーズショッカーでホモジナイズした後、９６ウェルプレートに移してＴＥＣＡＮより蛍光強度を定量的に測定した（Ｅｘ／Ｅｍ＝６４０ｎｍ／７００ｎｍ）。その結果を図３４～３６に示す。
腫瘍サイズがおよそ２００ｍｍ３に達したモデルマウスに対して、上記の５０．０μＭ高分子調製溶液１００μＬを尾静脈投与した。投与量はマウス一匹当たりそれぞれ０．１０ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、０．１２ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、０．１３ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、０．１４ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及び０．１９ｍｇ Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］となる。試料投与から１、３、６、２４時間後に解剖し、血液及び各種臓器をマルチビーズショッカー粉砕チューブに回収した。その後、各種臓器をＰＢＳで洗浄して、ＩＶＩＳを用いて（Ｅｘ／Ｅｍ＝６４０／７００ｎｍ）で蛍光強度を観察し、その結果を図３３に示す。回収された臓器１００ｍｇに対してＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを８００μＬ加え、マルチビーズショッカーでホモジナイズした後、９６ウェルプレートに移してＴＥＣＡＮより蛍光強度を定量的に測定した（Ｅｘ／Ｅｍ＝６４０ｎｍ／７００ｎｍ）。その結果を図３４～３６に示す。
【0185】
投与されたＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５は肝臓における集積を示した一方で、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］は２４時間後も腎臓に集積を示した。また、Ｃｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５に比べて、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］に投与された腫瘍組織は比較的に高い蛍光を示した（図３３）。
【0186】
投与されたＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５の腫瘍集積性は２４時間を経て約１．０％投薬量／ｇ組織に維持した。それに対して、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］とＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］は投与後６時間に腫瘍集積性が少し上昇したものの、有意な差が見られなかった。一方で、図３４の結果に一致して、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］はＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５に比べて有意な腫瘍集積性の増加を示し、投与後６時間でそれぞれ約１．５％投薬量／ｇ組織及び２．０％投薬量／ｇ組織を示した。本チロシン修飾高分子はチロシン修飾より腫瘍集積性の付与を達成することが示された。
【0187】
投与から６時間後におけるＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］の血中濃度は５．０％投薬量／ｍｌ以下となり、投与から２４時間後血中濃度は１．０％投薬量／ｍｌ以下と血中からの速やかな消失を示した（図３５）。
【0188】
投与されたＣｙ５－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５は肝臓における集積を示した一方で、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］、Ｃｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］及びＣｙ５－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］は腎臓に集積を示した。また図３６よりチロシン修飾高分子は投与された後に腎臓を通して速やかに体内から排泄されたとここで示唆された。
【0189】
実施例１２：細胞光毒性評価
Ｐｐａ－Ｔｙｒ修飾高分子のがん細胞増殖抑制作用をＣＣＫ－８アッセイにより評価した。
（１）細胞毒性測定
９６ウェルプレートに細胞を１．０×１０４細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。以下のサンプル溶液１００μＬを加え、３時間インキュベートした。
・Ｐｐａ－Ｔｙｒ修飾高分子（Ｐｐａ：１μＭ）
Ｐｐａ－Ｔｙｒ修飾高分子のがん細胞増殖抑制作用をＣＣＫ－８アッセイにより評価した。
（１）細胞毒性測定
９６ウェルプレートに細胞を１．０×１０４細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間前培養した。以下のサンプル溶液１００μＬを加え、３時間インキュベートした。
・Ｐｐａ－Ｔｙｒ修飾高分子（Ｐｐａ：１μＭ）
【0190】
Ｄ－ＰＢＳ（－）０．１ｍＬで２回洗浄後、ＢｘＰＣ３細胞ではＲＰＭＩ（１０％ウシ胎児血清／ペニシリン含有）を１００μＬ加え、１時間６８０ｎｍのハロゲンランプを用いて光照射した。４８時間インキュベートした後、１０％ＣＣＫ－８溶液を各ウェルに１００μＬ加え、１．５時間インキュベートした後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果を図３７と図３８に示す。
【0191】
Ｐｐａ－Ｔｙｒ修飾高分子はいずれも光照射を行わなければ、がん細胞に対して光毒性を示さなかった（図３８）。一方、光照射を行う場合では、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］－Ｐｐａはがん細胞に対して、Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５－Ｐｐａ、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）２０］－Ｐｐａ、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］－Ｐｐａ及びＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ７４／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）２１］－Ｐｐａより高い光毒性を示した。（図３７）。すなわち、本チロシン修飾高分子はチロシン修飾より光毒性の増加付与を達成することが示された。
【0192】
本発明によれば、アミノ酸トランスポーター（ＬＡＴ１）を標的としたメチオニン又はチロシン修飾したＬＡＴ１結合部位に抗がん剤を結合させたコンジュゲートの使用により、がんを治療することが可能になる。
【0193】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【0194】
実施例１３：抗腫瘍効果
ＢｘＰＣ３細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下播種から２週間後、以下のサンプルＤ－ＰＢＳ（－）溶液１００μＬを腹腔内投与した（Ｐｐａ ５０μＭ、１００μＬ／マウスｅ）。
・Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］－Ｐｐａ
・Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］－Ｐｐａ
・Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５－Ｐｐａ
ＢｘＰＣ３細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下播種から２週間後、以下のサンプルＤ－ＰＢＳ（－）溶液１００μＬを腹腔内投与した（Ｐｐａ ５０μＭ、１００μＬ／マウスｅ）。
・Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］－Ｐｐａ
・Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］－Ｐｐａ
・Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５－Ｐｐａ
【0195】
試料投与から６時間後にマウスの皮下に２００ｍＷ／ｃｍ２ ６８０ｎｍのレーザーを６００秒照射した。照射日を１日目とし、３日おきに腫瘍の成長をバーニャ目盛にて、体重を電子天秤にて全２８日間測定した。結果を図３９及び図４０に示す。
【0196】
光照射を行う場合では、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］－ＰｐａとＮ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ６５／Ａｓｐ（Ｔｙｒ）３０］－Ｐｐａは、Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ９５－Ｐｐａより高い抗腫瘍効果を示した。また、Ｐｐａ－Ｔｙｒ修飾高分子が投与されていないコントロールグループに比べて、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｐ［Ａｓｐ５２／Ａｓｐ（ＴＥＧ－Ｔｙｒ）４３］－Ｐｐａはより高い抗腫瘍効果という有意差を示した（図３９）。いずれのＰｐａ－Ｔｙｒ修飾高分子を光照射した後も、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの体重は著しく変化することが見られなかった（図４０）。すなわち、本チロシン修飾高分子はチロシン修飾よりＢｘＰＣ３の皮下腫瘍モデルに対して抗腫瘍効果の増加付与を達成することが示された。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】