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特開2023-164339イネの葉の角度の調節におけるイネＯｓＣＫＸ３遺伝子の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023164339
(43)【公開日】2023-11-10
(54)【発明の名称】イネの葉の角度の調節におけるイネＯｓＣＫＸ３遺伝子の使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/29 20060101AFI20231102BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20231102BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20231102BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20231102BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20231102BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20231102BHJP
【ＦＩ】
C12N15/29
A01H1/00 A ZNA
C12N15/09 100
C12N15/90 100Z
C12N15/53
C12N9/02
【審査請求】有
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023070274
(22)【出願日】2023-04-21
(31)【優先権主張番号】202210492475.1
(32)【優先日】2022-04-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】520465253
【氏名又は名称】浙江師範大学
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６８８ Ｙｉｎｇｂｉｎ Ｒｏａｄ， Ｗｕｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｊｉｎｈｕａ， Ｚｅｊｉａｎｇ ３２１００４ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100205936
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 海龍
(74)【代理人】
【識別番号】100132805
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 貴之
(72)【発明者】
【氏名】張 可偉
(72)【発明者】
【氏名】黄 鵬
(72)【発明者】
【氏名】趙 江哲
(72)【発明者】
【氏名】洪 佳楽
(72)【発明者】
【氏名】朱 宝
(72)【発明者】
【氏名】夏 帥
(72)【発明者】
【氏名】朱 恩高
(72)【発明者】
【氏名】韓 平飛
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD07
2B030AD14
(57)【要約】 （修正有）
【課題】イネの葉の角度の調節におけるイネサイトカイニンオキシダーゼＯｓＣＫＸ３遺伝子の使用を提供する。
【解決手段】本発明は、イネ作物の改良におけるイネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３またはそれにコードされるタンパク質の応用を開示し、イネの葉枕の発達および葉の角度を調節することにより、イネの株型を改善し、イネの収量を増加させる。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、イネ作物の改良におけるイネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３またはそれにコードされるタンパク質の応用を開示し、イネの葉枕の発達および葉の角度を調節することにより、イネの株型を改善し、イネの収量を増加させる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イネの葉の角度を調節することを特徴とする、イネ作物の改良におけるイネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３またはそれがコードするタンパク質の使用。
【請求項2】
イネの葉枕の発達および葉の角度を調節し、イネの株型を改善し、イネの収量を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記イネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるものであり、また、それと相補的なヌクレオチド配列、それと同種のヌクレオチド配列、あるいは、数個のヌクレオチドを挿入または突然変異させることによって形成される、同じ機能を有するヌクレオチド配列も含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項4】
前記イネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３がコードするアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるものであることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項5】
前記イネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３をノックアウトすることにより、イネの葉の角度を小さくさせ、稲粒を大きくすることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項6】
前記イネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３を過剰発現させることにより、イネの葉の角度を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項7】
ＯｓＣＫＸ３変異体のヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５のいずれかに示されるものであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項8】
ｇＲＮＡ標的配列であって、前記ｇＲＮＡ標的配列は、イネＯｓＣＫＸ３遺伝子のＣＤＳセンス鎖の３３２～３５１番目の位置であり、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるものであることを特徴とする、植物の葉の角度の調節におけるイネＯｓＣＫＸ３遺伝子を編集するためのｇＲＮＡ標的配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、植物遺伝子工学の技術分野に属し、特に、イネの葉の角度の調整におけるイネＯｓＣＫＸ３遺伝子の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、中国の年間穀物の総生産量は６．６億トンを超え、そのうち米の生産量は約３２％を占めている。しかし、中国の人口増加と生活水準の向上に伴い、穀物生産に対する人々の需要はますます増加している。耕地面積が変わらない現状では、穀物生産、特に米生産を大幅に増加させるには、科学者が高収量で高品質の新品種を開発する必要がある。葉の角度とは、葉と茎との傾斜角のことで、イネの受光面積に大きく影響し、理想的な株型を形成する重要な要素であり、作物栽培において重要な役割を果たしている。直立した葉は密植に適しており、植物間の相互の陰影を減らし、光合成効率を高め、作物収量を増やすことができる（Ｔｏｎｇ ａｎｄ Ｃｈｕ， ２０１８）。葉の角度の大きさは主に葉枕によって制御され、葉枕の発達過程で細胞分裂と伸長により、葉の傾斜角度が変化する（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。
【0003】
植物ホルモンは、葉の角度の調節に重要な役割を果たしている。ブラシノステロイド（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ、ＢＲ）、ジベレリン酸（ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ、ＧＡ）、およびオーキシン（ＩＡＡ）はすべて、葉の角度の形成に関与していることがわかっている（Ｔｏｎｇ ａｎｄ Ｃｈｕ， ２０１８； Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。サイトカイニン（ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ、ＣＫ）は、作物の形態、生理機能、収量を調節する重要なホルモンの１種であり、幹細胞の分裂、穂の発達、株型、窒素肥料の使用、環境ストレスなどに密接に関連している（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２１）。しかし、葉の角度を調節するＣＫの分子メカニズムはまだ報告されていない。ＣＫレベルを調節する重要な酵素として、サイトカイニンオキシダーゼ／サイトカイニンデヒドロゲナーゼ（ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＣＫＸ）はＣＫの酸化分解を触媒してアデニンと側鎖を生成し、ＣＫを完全に不活性化する（Ａｓｈｉｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。ＣＫＸは、ＣＫ活性レベルの調節において重要な役割を果たしている。ＣＫＸ遺伝子発現量の低下は、ＣＫ含有量を大幅に増加させ、頂端分裂組織の形成を促進することができる。シロイヌナズナＣＫＸ３ＣＫＸ５二重変異体の花、さや、および種子の数は大幅に増加し、種子の数は５０％以上増加した（Ｂａｒｔｒｉｎａ ｅｔ ａｌ． ａｌ．， ２０１１）。イネＣＫＸ２およびＤＳＴ（ＯｓＣＫＸ２正の調節遺伝子）変異体では、ＣＫ含有量が大幅に増加し、一穂籾数が２０％以上増加した（Ａｓｈｉｋａｒｉ， ２００５； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。イネのＯｓＣＫＸ９は、Ｄ５３を介してストリゴラクトン（ｓｔｒｉｇｏｌａｃｔｏｎｅ， ＳＬ）シグナル伝達経路に関与し、イネの分げつ芽の発育を制御する（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。イネのＣＫＸ１１は、ＡＢＡ代謝経路に関与し、葉の老化を制御する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２１）。イネのＯｓＣＫＸ４は、Ｚｎの取り込みの制御にも関与している（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。ＣＫおよびＣＫＸ遺伝子は、イネの頂端分裂組織の発達、根の発達、葉の老化および分げつ芽の発達に関与することが確認されている。しかし、葉の角度の形成を調節するＣＫＸのメカニズムおよびその応用はまだ研究されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明が解決しようとする技術的課題は、イネの葉の角度の調節におけるイネサイトカイニンオキシダーゼＯｓＣＫＸ３遺伝子の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記の技術的課題を解決するために、本発明は、イネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３またはそれにコードされるタンパク質のイネ作物改良における使用、すなわちイネの葉の角度の調節を提供する。
【0006】
本発明の使用の改良としては、イネの葉枕の発達と葉の角度を調節し、イネの品種を改良し、イネの収量を増加させる。
【0007】
本発明の使用のさらなる改良としては、イネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるとおりである。また、それに相補的なヌクレオチド配列、同種のヌクレオチド配列、あるいは、配列中のいくつかのヌクレオチドを挿入または突然変異させることによって形成される、同じ機能を有するヌクレオチド配列も含まれる。
【0008】
本発明の使用のさらなる改良としては、遺伝子ＯｓＣＫＸ３によってコードされるアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるとおりである。
【0009】
本発明の使用のさらなる改良としては、ＯｓＣＫＸ３遺伝子をノックアウトすることにより、葉の角度が小さくなり、稲粒が大きくなる。
【0010】
本発明の使用のさらなる改良としては、ＯｓＣＫＸ３が過剰発現することにより、イネの葉の角度を増加させる。
【0011】
本発明の使用のさらなる改良としては、ＯｓＣＫＸ３変異体のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４～ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５のいずれかに示されるとおりである。
【0012】
本発明はまた、植物の葉の角度を調節する際にイネＯｓＣＫＸ３遺伝子を編集するためのｇＲＮＡ標的配列の使用を提供する。前記ｇＲＮＡの標的配列は、イネＯｓＣＫＸ３遺伝子のＣＤＳセンス鎖の３３２番目から３５１番目の位置にあり、そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるとおりである。
【0013】
本発明は、イネの葉の角度を調節する正の調節因子とその使用を提案するもので、リバースジェネティクスアプローチを用いて、イネの葉枕組織の細胞分裂と成長に関与することで、葉の角度の大きさを調節するＯｓＣＫＸ３遺伝子をスクリーニングした。本発明は、イネの葉の角度を調節する遺伝子の分子生物学的機能および使用を研究し、密に植えられた高収量の新しいイネ品種を育種するための潜在的な新しい遺伝子資源を提供する。
【0014】
本発明は、イネの葉の角度を調節する正の調節因子を取得し、その正の調節因子は遺伝子ＯｓＣＫＸ３であり、塩基配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるとおりであり、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるとおりである。植物の葉の角度の調節におけるイネＯｓＣＫＸ３遺伝子の使用は、具体的には次のとおりである。ＯｓＣＫＸ３遺伝子は、イネの葉の角度の形成を調節するために、葉枕の細胞の非対称成長を調節することにより、葉枕の発達を調節する。
【0015】
本発明の技術的な解決手段は、以下のように実現される。
本発明において、１１個のＯｓＣＫＸ遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、ＯｓＣＫＸ３変異体は葉の角度が著しく小さいことが見出され、異なる発育段階においてのイネの葉の角度が表れた形はすべて、ＯｓＣＫＸ３が葉の角度の大きさを調節することを証明した。
本発明において、１１個のＯｓＣＫＸ遺伝子変異体をスクリーニングすることにより、ＯｓＣＫＸ３変異体は葉の角度が著しく小さいことが見出され、異なる発育段階においてのイネの葉の角度が表れた形はすべて、ＯｓＣＫＸ３が葉の角度の大きさを調節することを証明した。
【0016】
使用の際、ＯｓＣＫＸ３のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクターを構築し、アグロバクテリウムを介した方法で日本晴に導入し、ＯｓＣＫＸ３遺伝子をノックアウトしたところ、得られたノックアウト変異体の葉の角度が著しく小さくなる。したがって、この方法は、葉枕組織のサイトカイニン含有量を増やし、葉枕細胞層の数を増やし、葉の角度を減らし、イネの株型と植え付け密度を改善し、収量を増やすことができる。
【発明の効果】
【0017】
従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を奏する。
１． ＯｓＣＫＸ３遺伝子は、他の収量特性を弱めることなく作物の葉の角度を変化させ、コンパクトな植物サイズと小さな葉の角度を持つイネ育種材料を作成できる。これは、イネ育種にとって重要な実用的意義を持っている。
１． ＯｓＣＫＸ３遺伝子は、他の収量特性を弱めることなく作物の葉の角度を変化させ、コンパクトな植物サイズと小さな葉の角度を持つイネ育種材料を作成できる。これは、イネ育種にとって重要な実用的意義を持っている。
【0018】
２． ＯｓＣＫＸ３遺伝子は、葉の角度の大きさを変えるのに有効な遺伝子で、葉枕の細胞層の数と維管束の数を変えることによって、イネの葉の角度を変えることができる。
【0019】
３． 現在、サイトカイニンによる葉の角度を調節する遺伝子についての報告はなく、本発明の遺伝子は、葉枕のサイトカイニンの含有量を制御することにより、葉の角度の調節に関与していることが明らかになった。
【0020】
葉の角度を調節するための本発明におけるＯｓＣＫＸ３の発見およびその使用は、葉の角度を調節するＣＫに関する技術の空白を埋め、イネの密植を改善し、イネの収量を増加させるための潜在的な応用価値を有する遺伝子を提供する。
【0021】
サイトカイニン含有量の増加を促進することと、イネの葉の角度を調節することとの間には必ずしも関係がないことに注意する必要がある。例えば、現在知られているＯｓＣＫＸ２遺伝子やＯｓＣＫＸ１１遺伝子はいずれもサイトカイニン量の増加を促進する機能を持っているが、イネの葉の角度との相関についての報告がなされていない。
【0022】
以上の説明を要約すると、本発明は、植物遺伝子工学の分野に関し、特に、植物の葉の角度の調節におけるイネサイトカイニンオキシダーゼＯｓＣＫＸ３遺伝子の使用に関する。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術を使用して日本晴イネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３をノックアウトし、トランスジェニック技術を使用して、ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料を得る。野生型と比較して、突然変異体の葉の角度は大幅に減少し、株型はより直立になるが、一方、過剰発現材料の葉の角度は大幅に増加する。ホルモン分析により、突然変異体のサイトカイニン含有量が著しく増加したことが示された。また、葉枕の細胞学的な構造観察により、突然変異体の葉枕の向軸端と背軸端の細胞層と維管束の数が著しく増加したことが観察された。そのサイトカイニンは細胞数を増やし、葉の角度の形成を変化させることを示した。農業形質の分析は、突然変異体の米粒サイズが有意に増加し、過剰発現材料の粒サイズが著しく小さいことを示した。そのため、遺伝子組換え技術によりＯｓＣＫＸ３遺伝子をノックアウトすることで、イネの葉の形成角度や稲粒の大きさを変化させ、植物の形状や植栽密度を改善し、収量を増やすことができる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本発明の実施形態に係るＯｓＣＫＸ３変異体の作成図および過剰発現材料におけるＯｓＣＫＸ３遺伝子の発現量を示す図であり、図ＡはＯｓＣＫＸ３遺伝子構造とＣＲＩＳＰＲ標的を示し、図ＢはＯｓＣＫＸ３遺伝子の変異部位を示し、図ＣはＯｓＣＫＸ３過剰発現材料におけるＯｓＣＫＸ３遺伝子の発現量を示している。
【図2】本発明に係る野生型（ＷＴ）、ＯｓＣＫＸ３変異体およびＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の成長１０日後（Ａ）および９０日後（Ｂ）の表現型を示す図であり、図Ｃおよび図Ｄはそれぞれ図Ａおよび図Ｂの葉の角度の統計データを示している。
【図3】本発明の実施形態に係る野生型（ＷＴ）、ＯｓＣＫＸ３変異体およびＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の葉枕の向軸端と背軸端の表現型を示す図であり、図Ａ～ＣはＷＴ （Ａ）、ＯｓＣＫＸ３変異体（Ｂ）およびＯｓＣＫＸ３過剰発現材料（Ｃ）の葉枕の切片構造を示し、図Ｄ～ＦはＷＴ （Ｄ）、ＯｓＣＫＸ３変異体（Ｅ）およびＯｓＣＫＸ３過剰発現物質（Ｆ）の葉枕の向軸端構造を示し、図Ｇ～ＩはＷＴ （Ｇ）、ＯｓＣＫＸ３変異体（Ｈ）およびＯｓＣＫＸ３過剰発現材料（Ｉ）の葉枕の背軸端構造を示し、図Ｊは野生型（ＷＴ、左）、ＯｓＣＫＸ３変異体（中央）およびＯｓＣＫＸ３過剰発現材料（右）の葉枕のＤ１およびＤ２の長さを示し、図Ｋは野生型（ＷＴ、左）、ＯｓＣＫＸ３変異体（中央）およびＯｓＣＫＸ３過剰発現材料（右）の葉枕のＤ１およびＤ２の薄壁細胞層数を示し、図Ｌは野生型（ＷＴ、左）、ＯｓＣＫＸ３変異体（中央）およびＯｓＣＫＸ３過剰発現材料（右）の葉枕の維管束の数を示している。
【図4】ＯｓＣＫＸ３遺伝子の発現パターンと細胞内局在を示す図であり、図Ａは根、茎、葉枕および葉におけるＯｓＣＫＸ３遺伝子の発現量を示し、図Ｂ～ＥはＯｓＣＫＸ３プロモーターによって駆動されるＧＵＳレポーター遺伝子ベクターの遺伝子組み換えイネの７日齢の実生（Ｂ）、葉枕切片（Ｃ）、葉（Ｄ）および節（Ｅ）のＧＵＳ染色画像を示し、図ＦはＯｓＣＫＸ３のホルモン誘導性発現パターンを示し、図ＧはＯｓＣＫＸ３の細胞内局在を示しており、図において、ＩＡＡは３－Ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、インドール酢酸、ＢＬはｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ、ブラシノライド、ｃＺはｃｉｓ－ｚｅａｔｉｎ、シス－ゼアチン、ｔＺはｔｒａｎｓ－ｚｅａｔｉｎ、トランス－ゼアチン、ｉＰはｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｅ、イソペンテニルアデニンであり、Ｍｏｃｋは０．１％エタノールで処理した１０日齢の苗を指し、ＩＡＡ、ＢＬ、ｃＺ、ｔＺ、ｉＰはそれぞれ１μＭで処理した１０日齢のイネ苗を指す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、図面を参照しながら、本発明に係る実施形態について、さらに具体的に説明する。
本発明の目的、技術的解決手段および利点をより明確にするために、本発明は、実施形態を介して以下でさらに詳細に説明される。ここに記載された特定の実施形態は、本発明を限定するものではなく、本発明を説明するためにのみ使用されることを理解されたい。
本発明の目的、技術的解決手段および利点をより明確にするために、本発明は、実施形態を介して以下でさらに詳細に説明される。ここに記載された特定の実施形態は、本発明を限定するものではなく、本発明を説明するためにのみ使用されることを理解されたい。
【0025】
本発明の実施形態に係るイネの葉の角度を調節する遺伝子は、イネＯｓＣＫＸ３変異体を同定することによって得られる。
【0026】
本発明の実施形態において、ＯｓＣＫＸ３のＣＤＳ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １に示されるとおり、または、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １に示されるＣＤＳ配列と少なくとも７０％の相同性を有するＤＮＡ配列であり、または、それらのいくつか置換、挿入、または欠失によって得られる機能的類似体である。
【0027】
本発明の実施形態において、ＯｓＣＫＸ３によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２である。
【0028】
本発明に係る野生型イネは日本晴である。
【0029】
本発明に係る従来の大腸菌ＤＨ５α株、アグロバクテリウムＧＶ３１０１株、ＥＨＡ１０５株はいずれも市場から購入することができる。
本発明は、特定の実施形態に関連して以下でさらに説明される。
本発明は、特定の実施形態に関連して以下でさらに説明される。
【0030】
（実施形態１）
イネサイトカイニンオキシダーゼＯｓＣＫＸ３変異体を得る。
１． ＯｓＣＫＸ３遺伝子ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター導入遺伝子
イネゲノムアノテーションプロジェクトにおけるイネＯｓＣＫＸ３の遺伝子番号はＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ３４２３０であり、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １はＯｓＣＫＸ３の完全な読み取り枠配列であり、そのアミノ酸配列は配列表のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２である。
イネサイトカイニンオキシダーゼＯｓＣＫＸ３変異体を得る。
１． ＯｓＣＫＸ３遺伝子ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター導入遺伝子
イネゲノムアノテーションプロジェクトにおけるイネＯｓＣＫＸ３の遺伝子番号はＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ３４２３０であり、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １はＯｓＣＫＸ３の完全な読み取り枠配列であり、そのアミノ酸配列は配列表のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２である。
【0031】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックアウトベクターｐＧＥＢ３１－ＯｓＣＫＸ３の構築と転換を行う。具体的には、遺伝子ＯｓＣＫＸ３のＣＤＳ配列の３３２～３５１ｂｐ配列を標的部位（ＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣＡ）として選択し、それをノックアウトベクターｐＲＧＥＢ３１に接続し、ｐＲＧＥＢ３１－ ＯｓＣＫＸ３ベクターを構築する。そのあと、通常の方法（武漢伯遠生物科技有限公司に委託）に従って形質転換を行い、ＯｓＣＫＸ３遺伝子のノックアウト株系を取得する。
【0032】
２． イネゲノムＤＮＡの抽出
ＯｓＣＫＸ３変異体（ステップ１で得られたＯｓＣＫＸ３遺伝子ノックアウト株系）のイネ葉約０．０５ｇを２ｍＬ遠沈管に入れ、スチールビーズと５００μＬ ＣＴＡＢ溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．０）（１Ｍ母液を予め配合する）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．４Ｍ ＮａＣｌ、２％ ＣＴＡＢ）を加え、組織粉砕機で４０Ｈｚ、６０秒間粉砕し、６５℃の水浴に２０分間入れ、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。４００μＬの上清を取り、新しい１．５ｍＬの遠沈管に加え、同じ体積のクロロホルムを加え、よく混ぜて、室温で５分間放置する。その後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清３００μＬを注意深く吸引し、そして、２倍積の無水エタノールを加えて、上下反転して均一に混合し、－２０℃で３０分間放置する。それを１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、残液を吸引除去し、室温で５～１０分間静置すると、小さな白い斑点が透明になり、すぐに３０～５０μＬの水またはＴＥを加えて溶解し、やさしく混ぜて均一に混合し、遠心分離して、将来の使用のために－２０℃で保存する。
ＯｓＣＫＸ３変異体（ステップ１で得られたＯｓＣＫＸ３遺伝子ノックアウト株系）のイネ葉約０．０５ｇを２ｍＬ遠沈管に入れ、スチールビーズと５００μＬ ＣＴＡＢ溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．０）（１Ｍ母液を予め配合する）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．４Ｍ ＮａＣｌ、２％ ＣＴＡＢ）を加え、組織粉砕機で４０Ｈｚ、６０秒間粉砕し、６５℃の水浴に２０分間入れ、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。４００μＬの上清を取り、新しい１．５ｍＬの遠沈管に加え、同じ体積のクロロホルムを加え、よく混ぜて、室温で５分間放置する。その後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清３００μＬを注意深く吸引し、そして、２倍積の無水エタノールを加えて、上下反転して均一に混合し、－２０℃で３０分間放置する。それを１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、残液を吸引除去し、室温で５～１０分間静置すると、小さな白い斑点が透明になり、すぐに３０～５０μＬの水またはＴＥを加えて溶解し、やさしく混ぜて均一に混合し、遠心分離して、将来の使用のために－２０℃で保存する。
【0033】
３． ノックアウト材料の標的配列遺伝子型の検出
上記ステップ２で得られたイネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３ノックアウトＴ０世代材料のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーペアＯｓＣＫＸ３ ｃｒｉｓｐｒ－Ｆ（５’－ＣＣＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴ －３’）およびＯｓＣＫＸ３ ｃｒｉｓｐｒ－Ｒ（５’－ＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＡＧＡＣＣＴＴＡＴ－３）’）を用いて、ＰＣＲ増幅を行う。
上記ステップ２で得られたイネ遺伝子ＯｓＣＫＸ３ノックアウトＴ０世代材料のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーペアＯｓＣＫＸ３ ｃｒｉｓｐｒ－Ｆ（５’－ＣＣＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴ －３’）およびＯｓＣＫＸ３ ｃｒｉｓｐｒ－Ｒ（５’－ＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＡＧＡＣＣＴＴＡＴ－３）’）を用いて、ＰＣＲ増幅を行う。
【0034】
ＰＣＲ増幅システムの総量は５０μＬであり、テンプレートは１μＬのゲノムＤＮＡ（約 ５０ｎｇ）、２５μＬの２×ＫＯＤ酵素反応バッファー、１０μＬの２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬの１０Ｍプライマー（各プライマー２μＬ）、ＫＯＤ酵素１μＬ、ｄｄＨ２Ｏ（滅菌脱イオン水）を５０μＬに加える。
【0035】
ＰＣＲプログラムは、９５℃で５分間の予備変性し、続いてＰＣＲサイクルに入り、パラメーターは、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長でＰＣＲサイクルを実施し、合計３５サイクルを行う。スクリーニングにより、Ｔ０世代の陽性トランスジェニック植物を得る（陽性植物のＰＣＲ増幅産物のサイズは５９７ｂｐであった）。結果を図１に示し、２つの独立したＯｓＣＫＸ３変異体が取得され、それぞれ１塩基Ｃが挿入された変異株と２５ｂｐが削除された変異株であって、その表現型の観察を行う。
【0036】
ＯｓＣＫＸ３－１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されている。
ＯｓＣＫＸ３－３の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示されている。
ＯｓＣＫＸ３－３の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示されている。
【0037】
（実施形態２）
ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の取得
１． 融合タンパク質ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰベクターの構築
（１） イネの総ＲＮＡの抽出
野生型イネ日本晴の葉をとり、素早く粉末状にすりつぶし、その粉末（約０．１ｇ）をＲＮａｓｅフリーの１．５ｍＬ遠沈管に素早く移す（予めＴｒｉｚｏｌ １ｍＬを入れておく）。１０秒間ボルテックスし、室温で５分間静置した後、４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を新しい１．５ｍＬ遠沈管に移す。遠沈管に２００μＬのクロロホルムを加え、上下反転させてよく混ぜ、室温で５分間放置し、４℃、１２，０００ｇで１５分間遠心分離する。上層の水相３００μＬを新しい１．５ｍＬ遠沈管に移し、イソプロパノール３００μＬを加えてよく混ぜ、室温で１０分間放置し、４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を保持し、１ｍＬの７０％（ＤＥＰＣで調製）アルコールを加えて沈殿物を洗浄し、沈殿物を吸引して再懸濁し、４℃、７５００ｇで、５分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を残し、軽く遠心し、ピペットチップで余分なアルコールを吸い取り、室温で５分間放置し、ＲＮＡを乾燥させる。５０μＬのＤＥＰＣ水を加えて沈殿物を溶解し、溶解後氷上に置き、ｃＤＮＡ合成用ＲＮＡの濃度を測定し、－８０℃の冷蔵庫に保存する。
ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の取得
１． 融合タンパク質ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰベクターの構築
（１） イネの総ＲＮＡの抽出
野生型イネ日本晴の葉をとり、素早く粉末状にすりつぶし、その粉末（約０．１ｇ）をＲＮａｓｅフリーの１．５ｍＬ遠沈管に素早く移す（予めＴｒｉｚｏｌ １ｍＬを入れておく）。１０秒間ボルテックスし、室温で５分間静置した後、４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を新しい１．５ｍＬ遠沈管に移す。遠沈管に２００μＬのクロロホルムを加え、上下反転させてよく混ぜ、室温で５分間放置し、４℃、１２，０００ｇで１５分間遠心分離する。上層の水相３００μＬを新しい１．５ｍＬ遠沈管に移し、イソプロパノール３００μＬを加えてよく混ぜ、室温で１０分間放置し、４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を保持し、１ｍＬの７０％（ＤＥＰＣで調製）アルコールを加えて沈殿物を洗浄し、沈殿物を吸引して再懸濁し、４℃、７５００ｇで、５分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を残し、軽く遠心し、ピペットチップで余分なアルコールを吸い取り、室温で５分間放置し、ＲＮＡを乾燥させる。５０μＬのＤＥＰＣ水を加えて沈殿物を溶解し、溶解後氷上に置き、ｃＤＮＡ合成用ＲＮＡの濃度を測定し、－８０℃の冷蔵庫に保存する。
【0038】
（２） 第一鎖ｃＤＮＡの逆転写
抽出した全ＲＮＡは、ＴＡＫＡＲＡのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔの説明書に従って逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡ産物を得て、－２０℃で保存する。
抽出した全ＲＮＡは、ＴＡＫＡＲＡのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔの説明書に従って逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡ産物を得て、－２０℃で保存する。
【0039】
（３） プラスミドＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰの構築
ＯｓＣＫＸ３遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）によって、下記のプライマー対を設計する。
ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰ－Ｆ （５’－ ＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＴＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧ －３’） および ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰ－Ｒ（５’－ ＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡ －３’）。
ＯｓＣＫＸ３遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）によって、下記のプライマー対を設計する。
ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰ－Ｆ （５’－ ＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＴＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧ －３’） および ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰ－Ｒ（５’－ ＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡ －３’）。
【0040】
日本晴のｃＤＮＡを鋳型として、ハイフィデリティ酵素を用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅系は５０ μＬであって、テンプレートｃＤＮＡ １μＬ（約５０ｎｇ）、２×ＫＯＤ酵素反応バッファー２５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰ １０μＬ、１０ｕＭ プライマー ４μＬ（各プライマーは ２μＬ）、ＫＯＤ酵素 １μＬ、ｄｄＨ２Ｏ（滅菌脱イオン水）を５０μＬに加える。
【0041】
ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で５分間、３０サイクル（９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で２分間、３０秒間）、６８℃で１０分間であって、ＯｓＣＫＸ３ ＣＤＳフラグメントを得る（増幅産物のサイズは１５８４ｂｐ、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）。増幅産物をアガロースゲル回収キットで回収し、ワンステップクローニング法でＰＣＲ８ベクターに連結し、構築したベクターをＬＲ反応によりｐＭＤＣ４３ベクターに構築し、ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰベクターを得る。
【0042】
２． ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の取得
（１） ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の構築
ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰベクターを取得した後、武漢伯遠生物科学技術有限公司によって、日本晴材料の形質転換を行い、ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料を得る。
（１） ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の構築
ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰベクターを取得した後、武漢伯遠生物科学技術有限公司によって、日本晴材料の形質転換を行い、ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料を得る。
【0043】
（２） ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料におけるＯｓＣＫＸ３発現量の解析
ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料のＲＮＡを抽出し、リバースし、以下のプライマーを用いてＯｓＣＫＸ３の発現量を検出したところ、図１Ｃの結果となり、過剰発現材料にＯｓＣＫＸ３が高発現していることを示している。
ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料のＲＮＡを抽出し、リバースし、以下のプライマーを用いてＯｓＣＫＸ３の発現量を検出したところ、図１Ｃの結果となり、過剰発現材料にＯｓＣＫＸ３が高発現していることを示している。
【0044】
以下のプライマーを使用して、ＯｓＣＫＸ３遺伝子の発現を分析する。
プライマーＦ： ５’－ＡＧＧＣＣＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＧ－３’
プライマーＲ： ５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＡ－３’
プライマーＦ： ５’－ＡＧＧＣＣＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＧ－３’
プライマーＲ： ５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＡ－３’
【0045】
また、使用した内部参照遺伝子Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ５のプライマーは次のとおりである。
プライマーＦ： ５’－ＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡ－３’
プライマーＲ： ５’－ＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＡＣＧ－３’。
プライマーＦ： ５’－ＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡ－３’
プライマーＲ： ５’－ＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＡＣＧ－３’。
【0046】
図１Ｃでは、ＮＩＰは日本晴野生型を表し、ＯＥ１～ＯＥ２はＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の２つの系統を表す。
【0047】
（実施形態３）
イネ変異体および過剰発現材料の表現型同定
野生型日本晴、ＯｓＣＫＸ３ノックアウト変異体、ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の葉の角度をそれぞれ観察する。播種後１０日間正常に成長し、葉３枚、茎１本の段階まで成長した後、第１葉の葉枕部を撮影し、ソフトウェアｉｍａｇｅ Ｊを使用して不完全葉に対して、葉の角度を測定する。葉枕を交点とし、葉面を一辺の線、葉鞘をもう一辺の線とする。その発生表現型を図２に示す。ＯｓＣＫＸ３変異体は、野生型と比較して葉の角度の表現型が大幅に減少し、過剰発現材料は葉の角度の表現型が大幅に増加していることが分かる。これは、ＯｓＣＫＸ３がイネの葉の角度を変化させることができることを示している。
イネ変異体および過剰発現材料の表現型同定
野生型日本晴、ＯｓＣＫＸ３ノックアウト変異体、ＯｓＣＫＸ３過剰発現材料の葉の角度をそれぞれ観察する。播種後１０日間正常に成長し、葉３枚、茎１本の段階まで成長した後、第１葉の葉枕部を撮影し、ソフトウェアｉｍａｇｅ Ｊを使用して不完全葉に対して、葉の角度を測定する。葉枕を交点とし、葉面を一辺の線、葉鞘をもう一辺の線とする。その発生表現型を図２に示す。ＯｓＣＫＸ３変異体は、野生型と比較して葉の角度の表現型が大幅に減少し、過剰発現材料は葉の角度の表現型が大幅に増加していることが分かる。これは、ＯｓＣＫＸ３がイネの葉の角度を変化させることができることを示している。
【0048】
葉枕組織切片の観察（図３Ａ～Ｉ）により、変異体の葉枕部の向軸端から維管束までの距離（ｄ１）がわずかに短く、葉枕部の背軸端から維管束までの距離（ｄ２）が著しく長くなる。一方、過剰発現材料のｄ１とｄ２は両方とも短くなる（図２Ｄ～Ｊ）。変異体は、背軸端の細胞層数と維管束の数が顕著に増加した（図２Ｋ～Ｌ）。結果として、ＯｓＣＫＸ３が葉枕の長さと背軸端の長さを調節することによって葉の角度を調節することを示している。
【0049】
１２０日の正常な成長から成熟までの日本晴、ＯｓＣＫＸ３変異体、およびＯｓＣＫＸ３過剰発現材料を観察し、農業形質の統計結果を図６に示す。ＯｓＣＫＸ３変異体は、より大きな稲粒になるが、他の形質に有意差はない。ＯｓＣＫＸ３変異体には、葉の角度を小さくして稲粒を大きくする有益な形質があるが、他の形質には影響しないことを示している。これは、葉の角度を小さくすることが可能な他の多くの変異体と異なり、それらの変異体は、収量特性にも影響を与える。ＯｓＣＫＸ３は、イネ収量を改善するための潜在的な新しい遺伝子資源として使用できることを示している。
【0050】
（実施形態４）
ＯｓＣＫＸ３遺伝子発現解析
１． ＰｒｏＯｓＣＫＸ３：：ＧＵＳベクターの構築
日本晴のイネゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーペア：
ＯｓＣＫＸ３ ｐｒｏ－Ｆ（５’－ＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＣＡＴＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＡＴ－３’）、およびＯｓＣＫＸ３ ｐｒｏ－Ｒ （５’－ＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＧＡＴＴＣＴ－３’）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅システムの総量は５０μＬで、テンプレートは１μＬのゲノムＤＮＡ（約５０ｎｇ）、２５μＬの２×ＫＯＤ酵素反応バッファー、１０μＬの２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬの１０ｕＭ プライマー（各プライマー２μＬ）、１μＬのＫＯＤ酵素、およびｄｄＨ２Ｏ（滅菌脱イオン水）を５０μＬに添加する。
ＯｓＣＫＸ３遺伝子発現解析
１． ＰｒｏＯｓＣＫＸ３：：ＧＵＳベクターの構築
日本晴のイネゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーペア：
ＯｓＣＫＸ３ ｐｒｏ－Ｆ（５’－ＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＣＡＴＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＡＴ－３’）、およびＯｓＣＫＸ３ ｐｒｏ－Ｒ （５’－ＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＧＡＴＴＣＴ－３’）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅システムの総量は５０μＬで、テンプレートは１μＬのゲノムＤＮＡ（約５０ｎｇ）、２５μＬの２×ＫＯＤ酵素反応バッファー、１０μＬの２ｍＭ ｄＮＴＰ、４μＬの１０ｕＭ プライマー（各プライマー２μＬ）、１μＬのＫＯＤ酵素、およびｄｄＨ２Ｏ（滅菌脱イオン水）を５０μＬに添加する。
【0051】
ＰＣＲプログラムは、９５℃で５分間の予備変性し、続いてＰＣＴのサイクルに入り、パラメーターとして９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長でＰＣＲサイクルを実施し、合計３５サイクルを行う。ＯｓＣＫＸ３プロモーター配列（配列は配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）を取得する。増幅産物をアガロースゲル回収キットで回収し、ワンステップクローニング法でＰＣＲ８ベクターに結合し、構築したベクターをＬＲ反応に使用ｐＭＤＣ１６３ベクターに構築し、ＰｒｏＯｓＣＫＸ３：：ＧＵＳベクターを取得する。その後、常法（武漢伯遠生物科学技術有限公司に委託）に従って形質転換を行い、ＰｒｏＯｓＣＫＸ３：：ＧＵＳ形質転換植物を得る。
【0052】
ＰｒｏＯｓＣＫＸ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示されている。
【0053】
２． ＯｓＣＫＸ３遺伝子発現解析
ステップ１で得られたＰｒｏＯｓＣＫＸ３：：ＧＵＳ形質転換植物の実生、成葉、節、葉枕を採取し、ＧＵＳ染色法により目的遺伝子の発現状況を解析する。トランスジェニック植物のサンプルを９０％アセトンで満たされた予冷ガラス瓶に入れ、室温で３０分間放置する。氷水で２回洗浄した後、サンプルをＧＵＳ染色液に移し、３７℃で４～２０時間染色する。染色したサンプルをエタノール：酢酸＝３：１の脱色液に２～１２時間入れ脱色する。脱色が完了したら、デジタルカメラまたは顕微鏡を使用して写真を撮り、染色結果を記録する。葉枕部切片観察用サンプルはＦＡＡ固定液で固定する必要があり、具体的に固定液の成分は１ｍＬ ３８％ホルムアルデヒド（最終濃度２％）、１ｍＬ 氷酢酸、１８ｍＬ ５０％アルコールであり、さらに樹脂に埋め込む。半薄切りスライサーを使用して厚さ７μｍの切片を得て、葉枕部組織の観察に用いる。ＯｓＣＫＸ３の発現解析は、ＴａＫａＲａ社のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの操作説明書に従って行い、異なる組織をテンプレートとして使用し、ＯｓＣＫＸ３の定量的プライマーと内部参照遺伝子Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ５を使用して標的遺伝子を増幅し、ＯｓＣＫＸ３の発現を検出する。図４Ａ～Ｅの結果は、ＯｓＣＫＸ３が葉枕部で高度に発現していることを示している。図４Ｆの結果は、ＯｓＣＫＸ３遺伝子がＢＬ、ｔＺおよびｉＰホルモンによって誘導されることを示している。
ステップ１で得られたＰｒｏＯｓＣＫＸ３：：ＧＵＳ形質転換植物の実生、成葉、節、葉枕を採取し、ＧＵＳ染色法により目的遺伝子の発現状況を解析する。トランスジェニック植物のサンプルを９０％アセトンで満たされた予冷ガラス瓶に入れ、室温で３０分間放置する。氷水で２回洗浄した後、サンプルをＧＵＳ染色液に移し、３７℃で４～２０時間染色する。染色したサンプルをエタノール：酢酸＝３：１の脱色液に２～１２時間入れ脱色する。脱色が完了したら、デジタルカメラまたは顕微鏡を使用して写真を撮り、染色結果を記録する。葉枕部切片観察用サンプルはＦＡＡ固定液で固定する必要があり、具体的に固定液の成分は１ｍＬ ３８％ホルムアルデヒド（最終濃度２％）、１ｍＬ 氷酢酸、１８ｍＬ ５０％アルコールであり、さらに樹脂に埋め込む。半薄切りスライサーを使用して厚さ７μｍの切片を得て、葉枕部組織の観察に用いる。ＯｓＣＫＸ３の発現解析は、ＴａＫａＲａ社のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの操作説明書に従って行い、異なる組織をテンプレートとして使用し、ＯｓＣＫＸ３の定量的プライマーと内部参照遺伝子Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ５を使用して標的遺伝子を増幅し、ＯｓＣＫＸ３の発現を検出する。図４Ａ～Ｅの結果は、ＯｓＣＫＸ３が葉枕部で高度に発現していることを示している。図４Ｆの結果は、ＯｓＣＫＸ３遺伝子がＢＬ、ｔＺおよびｉＰホルモンによって誘導されることを示している。
【0054】
以下のプライマーを使用して、ＯｓＣＫＸ３遺伝子の発現を分析する。
プライマー Ｆ： ５’－ＡＧＧＣＣＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＧ－３’
プライマー Ｒ： ５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＡ－３’
プライマー Ｆ： ５’－ＡＧＧＣＣＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＧ－３’
プライマー Ｒ： ５’－ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＡ－３’
【0055】
使用した内部参照遺伝子Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ５プライマーは次のとおりである。
プライマー Ｆ： ５’－ＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡ－３’
プライマー Ｒ： ５’－ＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＡＣＧ－３’。
プライマー Ｆ： ５’－ＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡ－３’
プライマー Ｒ： ５’－ＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＡＣＧ－３’。
【0056】
（実施形態５）
ＯｓＣＫＸ３の細胞内局在
実施例２で得られたＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換し、ＬＢ固形培地に画線し、１～２日間培養した後、実験用のシングルコロニーを選択する。５ｍＬの対応する抗生物質を含むＬＢ液体培養液の中から単一のクローンを選び、２８℃、２００～２２０ｒｐｍで１日間振盪しながら培養する。アグロバクテリウムを、ＯＤ６００が約０．３になるようにカナ抗生物質を含むＬＢ液体培地２０ｍＬに移し（培地２０ｍＬに対して１．５ｍＬ）、２８℃で振とうしながら培養する。菌液のＯＤ６００値を検査し、１．５程度の値になれば十分である。事前に再懸濁液を準備し（滅菌 ｄｄＨ２Ｏ、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍ ＭＥＳおよび１００μＭ ＡＳ）、６０００ｒｐｍで５分間細菌を収集する。最初に２ｍＬの再懸濁液を使用し、次に６～８ｍＬの再懸濁液を加え、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を捨て、再懸濁溶液に２ｍＬの再懸濁溶液を加え、最後に１５ｍＬの再懸濁溶液を加える。２８℃で２～３時間の暗培養後にタバコを注入する。異なる菌液を含む侵入液を５ｍＬの遠沈管で１：１：１の割合で混合し、よく振った後、１ｍＬの注射器に充填し、親指で注射器を押しながら、葉の下表皮からタバコ葉（子葉は使用せず）に注入する。注入後、タバコの葉は湿潤現象が発生するため、注入穴の数をなるべく少なくする。タバコは培養３日後に観察し、結果を図４Ｇに示す。ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰ（左から１番目）と小胞体メーカー蛍光（左から２番目）が融合し（左から４番目）、明視野は左から３番目であり、ＯｓＣＫＸ３が小胞体に局在することを示している。
ＯｓＣＫＸ３の細胞内局在
実施例２で得られたＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換し、ＬＢ固形培地に画線し、１～２日間培養した後、実験用のシングルコロニーを選択する。５ｍＬの対応する抗生物質を含むＬＢ液体培養液の中から単一のクローンを選び、２８℃、２００～２２０ｒｐｍで１日間振盪しながら培養する。アグロバクテリウムを、ＯＤ６００が約０．３になるようにカナ抗生物質を含むＬＢ液体培地２０ｍＬに移し（培地２０ｍＬに対して１．５ｍＬ）、２８℃で振とうしながら培養する。菌液のＯＤ６００値を検査し、１．５程度の値になれば十分である。事前に再懸濁液を準備し（滅菌 ｄｄＨ２Ｏ、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍ ＭＥＳおよび１００μＭ ＡＳ）、６０００ｒｐｍで５分間細菌を収集する。最初に２ｍＬの再懸濁液を使用し、次に６～８ｍＬの再懸濁液を加え、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を捨て、再懸濁溶液に２ｍＬの再懸濁溶液を加え、最後に１５ｍＬの再懸濁溶液を加える。２８℃で２～３時間の暗培養後にタバコを注入する。異なる菌液を含む侵入液を５ｍＬの遠沈管で１：１：１の割合で混合し、よく振った後、１ｍＬの注射器に充填し、親指で注射器を押しながら、葉の下表皮からタバコ葉（子葉は使用せず）に注入する。注入後、タバコの葉は湿潤現象が発生するため、注入穴の数をなるべく少なくする。タバコは培養３日後に観察し、結果を図４Ｇに示す。ＯｓＣＫＸ３－ＧＦＰ（左から１番目）と小胞体メーカー蛍光（左から２番目）が融合し（左から４番目）、明視野は左から３番目であり、ＯｓＣＫＸ３が小胞体に局在することを示している。
【0057】
（実施形態６）
ＯｓＣＫＸ３の生化学的活性の検出
１． ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯｓＣＫＸ３活性検出
（１） ＯｓＣＫＸ３－ＭＢＰベクター構築
次のプライマーを使用してＯｓＣＫＸ３を増幅し、ｐＭＡＬベクターに接続し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えて発現を誘導し、Ａｍｙｌｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）を使用して目的のタンパク質を精製し、ＭＢＰ－ＯｓＣＫＸ３融合タンパク質を取得する。
ＯｓＣＫＸ３の生化学的活性の検出
１． ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯｓＣＫＸ３活性検出
（１） ＯｓＣＫＸ３－ＭＢＰベクター構築
次のプライマーを使用してＯｓＣＫＸ３を増幅し、ｐＭＡＬベクターに接続し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えて発現を誘導し、Ａｍｙｌｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）を使用して目的のタンパク質を精製し、ＭＢＰ－ＯｓＣＫＸ３融合タンパク質を取得する。
【0058】
ｐＭＡＬ－ｃ２ＸベクターのＯｓＣＫＸ３増幅プライマーを構築する。
ＯｓＣＫＸ３－ｐＭＡＬ Ｆ： ＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＴＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧ
ＯｓＣＫＸ３－ｐＭＡＬ Ｒ： ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧ
ＯｓＣＫＸ３－ｐＭＡＬ Ｆ： ＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＴＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧ
ＯｓＣＫＸ３－ｐＭＡＬ Ｒ： ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧ
【0059】
（２） 活性の検出
各反応液（１００μＬ）に１４μｇ ＭＢＰ－ＯｓＣＫＸ３融合タンパク質、０．１ｍＭサイトカイニン基質（ｉＰとｔＺ）、０．５ｍＭ ２，６－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＣＩＰ）、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ ８．５）を加え、３７℃の水浴で３０分間反応させる。その後、直ちにトリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる。４°Ｃ、１２，０００ｇで１０分間遠心分離する。上清をろ過し、ＨＰＬＣを使用して基質の減少量を定量的に検出する。図５Ａと５Ｂの結果は、ＯｓＣＫＸ３がｔＺとｉＰを触媒できることを示している。
各反応液（１００μＬ）に１４μｇ ＭＢＰ－ＯｓＣＫＸ３融合タンパク質、０．１ｍＭサイトカイニン基質（ｉＰとｔＺ）、０．５ｍＭ ２，６－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＣＩＰ）、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ ８．５）を加え、３７℃の水浴で３０分間反応させる。その後、直ちにトリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる。４°Ｃ、１２，０００ｇで１０分間遠心分離する。上清をろ過し、ＨＰＬＣを使用して基質の減少量を定量的に検出する。図５Ａと５Ｂの結果は、ＯｓＣＫＸ３がｔＺとｉＰを触媒できることを示している。
【0060】
２． ｉｎ ｖｉｖｏ活性の検出
（１）ＣＫの抽出
サンプル５０ｍｇを２ｍＬ遠沈管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れ、スチールボールを加え、すばやく液体窒素に入れ、ミル（Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ－４８、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉｎｇｘｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）を使用してサンプルを粉砕する。粉末にした後、１．６ｍＬの８０％メタノールと対応する内部標準として、５０ｐｇの［２Ｈ５］ｔＺ，［２Ｈ５］ｔＺＲ，［２Ｈ６］ｉＰ，［２Ｈ６］ｉＰＲを添加する。混合物の入った遠沈管を回転機で４℃、２時間回転混合し、４℃、１５，０００ｇで１０分間遠心分離する。上清を新しい遠沈管に注意深く吸引し、窒素下でブロードライする。残りの沈殿物に８０％メタノール溶液０．６ｍＬを加えて再度混合し、上記の操作を繰り返す。最後に、上清を２ｍＬの遠沈管に加え、窒素下で乾燥させ、３００μＬの３０％メタノールに再溶解させる。この溶液を０．２２μｍの水性フィルター膜を用いてろ過して使用に備える。
（１）ＣＫの抽出
サンプル５０ｍｇを２ｍＬ遠沈管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れ、スチールボールを加え、すばやく液体窒素に入れ、ミル（Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ－４８、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉｎｇｘｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）を使用してサンプルを粉砕する。粉末にした後、１．６ｍＬの８０％メタノールと対応する内部標準として、５０ｐｇの［２Ｈ５］ｔＺ，［２Ｈ５］ｔＺＲ，［２Ｈ６］ｉＰ，［２Ｈ６］ｉＰＲを添加する。混合物の入った遠沈管を回転機で４℃、２時間回転混合し、４℃、１５，０００ｇで１０分間遠心分離する。上清を新しい遠沈管に注意深く吸引し、窒素下でブロードライする。残りの沈殿物に８０％メタノール溶液０．６ｍＬを加えて再度混合し、上記の操作を繰り返す。最後に、上清を２ｍＬの遠沈管に加え、窒素下で乾燥させ、３００μＬの３０％メタノールに再溶解させる。この溶液を０．２２μｍの水性フィルター膜を用いてろ過して使用に備える。
【0061】
（２） ＧＣ－ＭＳシステムを用いたＣＫ含有量の測定
ＣＫ抽出物は、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８型分離カラムアセンブリを備えたＥｘｉｏｎＬＣ（ＡＢ ＳＣＩＥＸ）液体クロマトグラフィーシステムを使用して分離する。カラムは、まず４０℃で平衡化させ、その後３０μＬのサンプルを加えて分析を行う。ＣＫの分析において、移動相成分Ａは水、Ｂはメタノールであり、多段階の直線勾配溶出法によって溶出される。具体的なステップは、０～２．５ｍｉｎ：５％Ａ；２．５～３ｍｉｎ：５～２０％Ｂ；３～１２．５ｍｉｎ：２０～５０％Ｂ；１２．５～１３ｍｉｎ：５０～１００％Ｂ；１３～１５ｍｉｎ：１００％Ｂ；１５～１５．２ｍｉｎ：１００～５％Ｂ；１５．２～１８ｍｉｎ：５％Ｂである。流量は０．３ｍＬ／ｍｉｎに設定する。
ＣＫ抽出物は、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８型分離カラムアセンブリを備えたＥｘｉｏｎＬＣ（ＡＢ ＳＣＩＥＸ）液体クロマトグラフィーシステムを使用して分離する。カラムは、まず４０℃で平衡化させ、その後３０μＬのサンプルを加えて分析を行う。ＣＫの分析において、移動相成分Ａは水、Ｂはメタノールであり、多段階の直線勾配溶出法によって溶出される。具体的なステップは、０～２．５ｍｉｎ：５％Ａ；２．５～３ｍｉｎ：５～２０％Ｂ；３～１２．５ｍｉｎ：２０～５０％Ｂ；１２．５～１３ｍｉｎ：５０～１００％Ｂ；１３～１５ｍｉｎ：１００％Ｂ；１５～１５．２ｍｉｎ：１００～５％Ｂ；１５．２～１８ｍｉｎ：５％Ｂである。流量は０．３ｍＬ／ｍｉｎに設定する。
【0062】
ＣＫの分析は、ＱＴＲＡＰ ５５００型三重四重極型質量分析計システム（ＡＢ ＳＣＩＥＸ）のマルチプル反応検出スキャンモード（ＭＲＭ ｍｏｄｅ）で行われる。関連情報の参照に基づき、ホルモン含有量の定量分析に適したイオンを選択する。ＭＲＭの最適条件は次のとおりである。エアカーテンガス圧：４０ｐｓｉ、イオンスプレー電圧：陽イオンモード ５０００Ｖ、陰イオンモード －４５００Ｖ、ターボヒーター温度：６００℃、霧化ガス圧（Ｇａｓ １）：６０ｐｓｉ；加熱ガス圧（Ｇａｓ ２）：６０ｐｓｉ。Ａｎａｌｙｓｔ（バージョン １．６．３ ＡＢ ＳＣＯＥＸ）ソフトウェアを使用して、関連機器を制御し、結果のデータを取得する。得られた生データは、さらなる分析と処理のためにＭｕｌｔｉＱｕａｎｔソフトウェア（バージョン３．０．２ ＡＢ ＳＣＩＥＸ）にインポートし、ＣＫの結果は内部標準参照によって正確に定量化される。図５Ｃは、ＯｓＣＫＸ３がｉｎ ｖｉｖｏでｔＺとｉＰを触媒できることを示している。変異後にイネのｔＺとｉＰの含有量が増加し、イネの葉の角度が小さくなり、一方、過剰発現後にイネのｔＺとｉＰの含有量が減少し、イネの葉の角度が大きくなることを示している。
【0063】
（実施形態７）
農業形質の分析
日本晴野生型、ＯｓＣＫＸ３遺伝子変異体、過剰発現材料種を圃場に植え、生育１２０日後の農業的形質を写真撮影し、統計分析を行う。草丈、一穂籾数、分げつ数、千粒重、粒長、粒幅を含むすべての農業的形質を、ＳＰＳＳソフトウェアを用いて単一植物データに基づき統計的な分析を行う。得られた結果を図６に示す。
農業形質の分析
日本晴野生型、ＯｓＣＫＸ３遺伝子変異体、過剰発現材料種を圃場に植え、生育１２０日後の農業的形質を写真撮影し、統計分析を行う。草丈、一穂籾数、分げつ数、千粒重、粒長、粒幅を含むすべての農業的形質を、ＳＰＳＳソフトウェアを用いて単一植物データに基づき統計的な分析を行う。得られた結果を図６に示す。
【0064】
図６によれば、以下の要約した結論が得られる。
ＯｓＣＫＸ３遺伝子変異後、イネの葉の角度が小さくなり、千粒重が増加し、結実率がわずかに低下するが、他の農業形質に有意差はない。ＯｓＣＫＸ３遺伝子の過剰発現後、葉の角度が大きくなり、千粒重が減少し、結実率がわずかに減少し、また、草丈が低くなり、一穂籾数が減少するが、その他の農業形質に有意差はない。それは、ＯｓＣＫＸ３遺伝子が育種改良可能な遺伝子資源として使用できることを示す。
ＯｓＣＫＸ３遺伝子変異後、イネの葉の角度が小さくなり、千粒重が増加し、結実率がわずかに低下するが、他の農業形質に有意差はない。ＯｓＣＫＸ３遺伝子の過剰発現後、葉の角度が大きくなり、千粒重が減少し、結実率がわずかに減少し、また、草丈が低くなり、一穂籾数が減少するが、その他の農業形質に有意差はない。それは、ＯｓＣＫＸ３遺伝子が育種改良可能な遺伝子資源として使用できることを示す。
【0065】
最後に、上記の例は、本発明のいくつかの特定の実施形態に過ぎないことに留意されたい。もちろん、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、多くの変形が可能である。当業者が本発明に開示された内容から直接導出または関連付けることができるすべての変形は、本発明の保護範囲と見なされるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】