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特開2023-165504３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸の単一重合体、及び３－ヒドロキシブタン酸単位と３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023165504
(43)【公開日】2023-11-16
(54)【発明の名称】３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸の単一重合体、及び３－ヒドロキシブタン酸単位と３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体
(51)【国際特許分類】
C08G 75/26 20060101AFI20231109BHJP
【ＦＩ】
C08G75/26
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022076592
(22)【出願日】2022-05-06
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）２０２０年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、「ムーンショット型研究開発事業／地球環境再生に向けた持続可能な資源循環を実現／生分解開始スイッチ機能を有する海洋分解性プラスチックの研究開発」 委託研究、 産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】柘植 丈治
(72)【発明者】
【氏名】マルグプ ミリザティ
(72)【発明者】
【氏名】ルカス ヴィニシウス サンチニ セネヴィヴァ
【テーマコード（参考）】
4J030
【Ｆターム（参考）】
4J030BA03
4J030BA19
4J030BB06
4J030BC11
4J030BD22
4J030BG30
(57)【要約】
【課題】より優れた機械的特性を有する新規なポリチオエステルを提供すること。
【解決手段】３－ヒドロキシブタン酸単位と３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体、３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸の単一重合体、及び当該重合体を含む組成物。
【選択図】図６
【解決手段】３－ヒドロキシブタン酸単位と３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体、３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸の単一重合体、及び当該重合体を含む組成物。
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
３－ヒドロキシブタン酸単位と３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
【請求項2】
３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位のモル分率が、６モル％以上である、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
【請求項3】
３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位のモル分率が、１０モル％以上である、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
【請求項4】
３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位のモル分率が、実質的に１００モル％である、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
【請求項5】
３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸の単一重合体。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体及び／又は請求項５に記載の単一重合体を含む組成物。
【請求項7】
請求項６に記載の組成物からなるフィルム又はシート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、３－ヒドロキシブタン酸単位と３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体、及び３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸をモノマー単位とする単一重合体、並びに当該重合体を含む組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
３－ヒドロキシアルカン酸のホモポリマー又は共重合体であるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は微生物が細胞内に蓄積するバイオポリエステルである。近年では、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。
【0003】
ポリエステルの加工工程において、ポリエステルの結晶化速度の高さは加工時間の短縮につながるため、非常に重要である。
最も一般的なＰＨＡである、（Ｒ）－３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）を構成単位とするホモポリマー（以下、「Ｐ（３ＨＢ）」）は、高結晶性であるために硬くて脆く、実用性に乏しい。また、溶融温度（１８０℃）と熱分解温度（約２００℃）とが近いために、溶融時にポリマーが低分子量化してしまうなど成型加工時の劣化が問題となり、工業生産には向いていない。この物性を改善する手段の一つとして、３ＨＢと他のモノマーとの共重合体化が種々検討されてきた。
最も一般的なＰＨＡである、（Ｒ）－３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）を構成単位とするホモポリマー（以下、「Ｐ（３ＨＢ）」）は、高結晶性であるために硬くて脆く、実用性に乏しい。また、溶融温度（１８０℃）と熱分解温度（約２００℃）とが近いために、溶融時にポリマーが低分子量化してしまうなど成型加工時の劣化が問題となり、工業生産には向いていない。この物性を改善する手段の一つとして、３ＨＢと他のモノマーとの共重合体化が種々検討されてきた。
【0004】
最近、本発明者らは、３ＨＢ単位と、α位に側鎖を持つ３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸（３Ｈ２ＭＢ）単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＢ））を報告している（特許文献１）。当該Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｈ２ＭＢ）は、第２成分である３Ｈ２ＭＢを低分率で含むものであるが、高い結晶化速度を有しながら低い温度で溶融するため、優れた溶融加工性を有する。
【0005】
一方、ポリチオエステル（ＰＴＥ）は、約７０年前に化学合成されたものの、高い製造コスト、低収率及び毒性物質の使用の点で、工業的スケールでは製造されたことがなかった。しかし、ＰＴＥは、ＰＨＡよりも低い結晶秩序を有するという性質があり、加工の点からもＰＴＥの有用性は高いと期待されている。
【0006】
近年、生合成によるポリチオエステルとして、例えば、３ＨＢと３－メルカプトプロピオン酸（３ＭＰ）とのコポリマーがＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを用いて製造できることが報告されている（非特許文献１、２）。また、３ＨＢと３－メルカプトブタン酸（３ＭＢ）とのコポリマーがＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａで生合成できることも報告されている（非特許文献３）。
【0007】
さらに、３ＭＰのホモポリマー、３ＭＢのホモポリマー、３－メルカプト吉草酸（３ＭＶ）のホモポリマー等のＰＴＥのホモポリマーが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの組換え株から得られたことも報告されている（非特許文献４、５）。具体的には、非特許文献１には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの組換え株を用いて、ブチレートキナーゼを含む非天然経路によって各種のＰＴＥのホモポリマーが得られている（非特許文献４のＦｉｇ．１ｂ）。ＰＴＥのホモポリマーは、対応するポリオキシエステルよりも低いガラス転移温度（Ｔｇ）及び／又は高い融解温度（Ｔｍ）を有し、さらには高い破断伸びを有し得る。これは、例えば３ＨＢと３－メルカプトプロピオン酸（３ＭＰ）とのコポリマーが対応するポリオキシエステルコポリマーと比べて高い弾性を有するためと考えられる。
【0008】
しかし、上記のＰＴＥの機械的特性は知られておらず、より優れた機械的特性を有するＰＴＥの開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】特開２０１６－１５５９３６号公報
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｌuｔｋｅ－Ｅｖｅｒｓｌｏｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００１，１４７，１１－１９
【非特許文献2】Ｌuｔｋｅ－Ｅｖｅｒｓｌｏｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｕｌｅｓ ２００１，２，１０６１－１０６５
【非特許文献3】Ｌuｔｋｅ－Ｅｖｅｒｓｌｏｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ ２００２，１，２３６－４０
【非特許文献4】Ｙｕ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ ２００７，７，８１０－８１９
【非特許文献5】Ｊ．Ｋａｗａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００３，４，１６９８－１７０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
従って、本発明は、より優れた機械的特性を有する新規なＰＴＥを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、炭素源と、２位にメチル基を有する３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸（３Ｍ２ＭＰ）の存在下に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が特定の微生物のβ酸化欠損株に導入された形質転換体を用いることにより、３Ｍ２ＭＰ単位を高分率で含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体、また、実質的に３Ｍ２ＭＰ単位のみから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体（すなわち、３Ｍ２ＭＰの単一重合体）が効率よく得られることを見出し、本発明を完成するに至った。また、これらの共重合体が従来のＰＨＡ、ＰＴＥと比較して高い弾性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0013】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）３－ヒドロキシブタン酸単位と３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
（２）３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位のモル分率が、６モル％ 以上である、（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
（３）３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位のモル分率が、１０モル％以上である、（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
（４）３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位のモル分率が、実質的に１００モル％である、（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
（５）３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸の単一重合体。
（６）（１）～（４）のいずれか１つに記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体及び／又は（５）に記載の単一重合体を含む組成物。
（７）（６）に記載の組成物からなるフィルム又はシート。
（１）３－ヒドロキシブタン酸単位と３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
（２）３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位のモル分率が、６モル％ 以上である、（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
（３）３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位のモル分率が、１０モル％以上である、（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
（４）３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸単位のモル分率が、実質的に１００モル％である、（１）に記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体。
（５）３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸の単一重合体。
（６）（１）～（４）のいずれか１つに記載のポリヒドロキシアルカン酸共重合体及び／又は（５）に記載の単一重合体を含む組成物。
（７）（６）に記載の組成物からなるフィルム又はシート。
【発明の効果】
【0014】
本発明の３Ｍ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とを含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体、及び３Ｍ２ＭＰの単一重合体は、異常に大きな破断伸びを有し、フィルム等のプラスチック材料として有効に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図2】図２の（ａ）は、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）（表１のサンプル番号７）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。構造式Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）中の記号Ａ～Ｄはプロトンを表し、それぞれ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて対応するシグナルとして観察される。図２の（ｂ）は、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）（表１のサンプル番号７）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。構造式Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）中の記号Ｅ～Ｈはカーボンを表し、それぞれ、１３Ｃ ＮＭＲスペクトルにおいて対応するシグナルとして観察される。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の新規なポリヒドロキシアルカン酸共重合体は、式（Ｉ）で表される、３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）単位と３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸（３Ｍ２ＭＰ）単位とから成るポリヒドロキシアルカン酸共重合体（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）と言うことがある）である。また、本発明の新規なポリヒドロキシアルカン酸共重合体は、式（ＩＩ）で表される、３Ｍ２ＭＰの単一重合体（Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）と言うことがある）である。本明細書では、これらをまとめて、ＰＨＡ又はポリチオエステル（ＰＴＥ）と言うことがある。
【0017】
【化1】
【0018】
【化2】
【0019】
本発明の式（Ｉ）の共重合体（Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）中の３Ｍ２ＭＰ単位の割合は、ポリマーの弾性の点から、少なくとも６モル％であり、好ましくは少なくとも１０モル％、より好ましくは少なくとも２０モル％、より好ましくは少なくとも３０モル％、より好ましくは少なくとも４０モル％、より好ましくは少なくとも５０モル％、より好ましくは少なくとも６０モル％、より好ましくは少なくとも７０モル％、より好ましくは少なくとも８０モル％、より好ましくは少なくとも９０モル％、より好ましくは少なくとも９５モル％、より好ましくは少なくとも９８モル％、更に好ましくは少なくとも９９モル％である。
【0020】
本発明のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）及びＰ（３Ｍ２ＭＰ）、特にＰ（３Ｍ２ＭＰ）は、異常に大きな破断伸びを示し、天然もしくは合成ゴム（典型的には、１００～８００％の範囲の伸び）等のほとんどの市販のエラストマーポリマー、又は共重合体及び／又は単一重合体の伸びが約１０００％であるポリ（４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ（４ＨＢ））等の周知のＰＨＡよりも高い弾性を有する。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＭＰ）にも有意な弾性特性があることから（非特許文献４）、ＰＴＥの弾性が優れているのはポリマー骨格中の硫黄原子によるものと考えられる。
【0021】
ＰＴＥにおけるイオウのポーリングの電気陰性度（２．５８）は、ポリオキシエステルであるＰＨＡの、酸素のポーリングの電気陰性度（３．４４）より著しく低く、炭素原子の電気陰性度（２．５５）に近いため（非特許文献３）、ＰＴＥは、ＰＨＡよりも低い結晶秩序を有し、伸縮時にポリマー構造をより容易に動員できる可能性がある（非特許文献４）。
【0022】
また、３Ｍ２ＭＰ単位のα炭素メチル基は、ポリマー構造のパッキングを妨げることによってその機械的特性にも影響を及ぼす可能性がある。
【0023】
本発明のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）は、特定の微生物のβ酸化欠損株を宿主に用いて製造される。
具体的には、炭素源と、３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸（３Ｍ２ＭＰ）の存在下に、宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターに、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子、及び３Ｍ２ＭＰから３Ｍ２ＭＰ－ＣｏＡへの変換反応を促進することによって３Ｍ２ＭＰ－ＣｏＡトランスフェラーゼの供給を増加させるための、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ｐｃｔ）遺伝子、並びに公知のモノマー供給遺伝子を挿入してプラスミドを得、当該プラスミドを宿主細胞に導入することによって得られる。
具体的には、炭素源と、３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸（３Ｍ２ＭＰ）の存在下に、宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターに、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子、及び３Ｍ２ＭＰから３Ｍ２ＭＰ－ＣｏＡへの変換反応を促進することによって３Ｍ２ＭＰ－ＣｏＡトランスフェラーゼの供給を増加させるための、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ｐｃｔ）遺伝子、並びに公知のモノマー供給遺伝子を挿入してプラスミドを得、当該プラスミドを宿主細胞に導入することによって得られる。
【0024】
図１に、本発明のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）の代表的な生合成経路の例を示す（左パネル）。炭素源の一例であるグルコースは、ピルビン酸、次いでアセチル－ＣｏＡに変換された後、このアセチル－ＣｏＡはβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）により２量化（ＰｈａＡ）され、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）によって還元されて、３ＨＢ－ＣｏＡに変換される。一方、３Ｍ２ＭＰは、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼにより、３Ｍ２ＭＰ－ＣｏＡに変換される。各々の経路で供給されたモノマーはポリヒドロキシアルカン酸重合酵素（ＰｈａＣ）の基質として利用され、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）が合成される。
【0025】
また、図１に、本発明のＰ（３Ｍ２ＭＰ）の代表的な生合成経路の例を示す（右パネル）。３Ｍ２ＭＰは、ｐｈａＡ及びｐｈａＢを発現しない宿主中で、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼにより、３Ｍ２ＭＰ－ＣｏＡに変換される。３Ｍ２ＭＰ－ＣｏＡはポリヒドロキシアルカン酸重合酵素（ＰｈａＣ）の基質として利用され、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）が合成される。
【0026】
更に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子の上流には、フェイシン（ｐｈａｓｉｎ）と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子が導入される（例えば、特開２０１３－４２６９７号参照）。フェイシンは、細菌の細胞内でＰＨＡ顆粒に共局在することが知られており、ＰＨＡ顆粒の形成、安定化などに関わると考えられている。
【0027】
宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターとしては、プロモーター、リボゾーム結合部位、遺伝子クローニング部位、ターミネーター等を有する公知のベクターを用いることができる。
【0028】
ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子としては、例えば、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１－３株、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・エスピーＡ３３、アロクロマティウム・ビノサム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バシルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＩＮＴ００５、ランプロシスティス・ロゼオペルシシナ（Ｌａｍｐｒｏｃｙｓｔｉｓ ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）、ノカルディア・コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ロドバクター・シャエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ ｓｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＮＣＩＭＢ ４０１２６、チオカプサ・フェニギー（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、及びアエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）から選ばれる微生物に由来するものが挙げられる。
【0029】
また、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子としては、上記のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素の変異体をコードする遺伝子でもよい。このような変異体は、野生型のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸重合活性を有するタンパク質である。かかる変異体を用いることにより、ポリヒドロキシアルカン酸重合体の生産量が増加する。例えば、本発明に用いられるＰＨＡ重合酵素変異体としては、微生物由来のＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣ）のＮ末端から１４９番目のアスパラギンからセリンへの置換、及び／又はＰｈａＣの１７１番目のアスパラギン酸からグリシンへの置換を含む変異体が挙げられる。
フェイシン（ＰｈａＰ）としては、Ｎ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列を有する変異体も好ましく用いられる。例えば、フェイシンのＮ末端から４番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換してなる変異体が挙げられる（例えば、特開２０１３－４２６９７号参照）。フェイシンの変異体は、同様にポリヒドロキシアルカン酸重合体の生産性を向上させる。
上記のＰｈａＣの１４９番目のアミノ酸の置換、同酵素の１７１番目のアミノ酸の置換、及びフェイシンの４番目のアミノ酸の置換、のすべてを含む変異体も好ましい。
ＰＨＡ重合酵素及びフェイシンが由来する微生物は、例えばアエロモナス属微生物であり、具体的にはアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）が挙げられる。
以下、ＰｈａＰの４番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されてなる変異体を「ＰｈａＰＡｃＤ４Ｎ」、ＰｈａＣの１４９番目のアスパラギンがセリンに、及びＰｈａＣの１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されてなる二重変異体を「ＰｈａＣＡｃＮＳＤＧ」と表記することがある。
ＰｈａＰＡｃＤ４Ｎの製造法は、例えば、特開２０１３－４２６９７号に開示され、ＰｈａＣＡｃＮＳＤＧの製造法は、例えば、Ｔｓｕｇｅ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｌｅｔｔ ２７７（２００７）２１７－２２２に詳述されている。
フェイシン（ＰｈａＰ）としては、Ｎ末端から２０番目までのアミノ酸領域において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列を有する変異体も好ましく用いられる。例えば、フェイシンのＮ末端から４番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換してなる変異体が挙げられる（例えば、特開２０１３－４２６９７号参照）。フェイシンの変異体は、同様にポリヒドロキシアルカン酸重合体の生産性を向上させる。
上記のＰｈａＣの１４９番目のアミノ酸の置換、同酵素の１７１番目のアミノ酸の置換、及びフェイシンの４番目のアミノ酸の置換、のすべてを含む変異体も好ましい。
ＰＨＡ重合酵素及びフェイシンが由来する微生物は、例えばアエロモナス属微生物であり、具体的にはアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）が挙げられる。
以下、ＰｈａＰの４番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されてなる変異体を「ＰｈａＰＡｃＤ４Ｎ」、ＰｈａＣの１４９番目のアスパラギンがセリンに、及びＰｈａＣの１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されてなる二重変異体を「ＰｈａＣＡｃＮＳＤＧ」と表記することがある。
ＰｈａＰＡｃＤ４Ｎの製造法は、例えば、特開２０１３－４２６９７号に開示され、ＰｈａＣＡｃＮＳＤＧの製造法は、例えば、Ｔｓｕｇｅ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｌｅｔｔ ２７７（２００７）２１７－２２２に詳述されている。
【0030】
公知のモノマー供給遺伝子としては、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂＡ、ｐｈｂＢ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９３－１５２９７（１９８９））、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のｐｈａＪ（Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．ａｎｄ Ｄｏｉ，Ｙ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１－４８３０（１９９７））等が挙げられる。
【0031】
本発明で使用される宿主微生物は、糖類や油脂類を炭素源として使用した場合の増殖性が良好で、菌株の安定性が高く、菌体と培養液との分離が比較的容易なものであれば特に制限されないが、例えば、エシュリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、カプリアヴィドゥス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、又はビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属の微生物が好ましい。より好ましくは、エシュリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属である。
【0032】
本発明では、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）の合成のために、例えば、ポリヒドロキシアルカン酸重合体の生合成における反復単位のより高い制御を可能にする、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳ５２１８のｆａｄＢ遺伝子及びｆａｄＪ遺伝子ノックアウト変異株であるＥ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ株（β酸化欠損株）（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ ２０１２，１１３，４８０－４８６）を宿主として、２つのプラスミド：ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴとｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＪＣＡｃ（ＮＳＤＧ）ＡＢＲｅを導入することができる。
ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴは、３Ｍ２ＭＰ－ＣｏＡの供給のためのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ由来のプロピオニル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰＣＴ）遺伝子を含む。ｐＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＪＣＡｃ（ＮＳＤＧ）ＡＢＲｅは、ｐｈａＰＣＪオペロンの増強された発現を通してより高いＰＨＡ蓄積を可能にする点変異Ｄ４Ｎを有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のフェイシン遺伝子（ｐｈａＰＡｃ）［Ｊ．Ｇｅｎ Ａｐｐｌ ＮＩｃｒｏｂｉａｌ ２０１５，６１，６３－６６］、３ＨＢベース共重合体の第２の単量体ユニットの取り込みを増強するＮ１４９Ｓ及びＤ１７１Ｇ点変異を有するＡ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡシンターゼ遺伝子（ｐｈａＣＡｃ）［ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｌｅｔ ２００７，２７７，２１７－２２２］、（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）、並びにＰｈａＣＡｃ重合のための３ＨＢ前駆物質の供給のためのＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６由来の酵素である３－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡＲｅ）及びアセトアセチル－ＣｏＡ還元酵素（ＰｈａＢＲｅ）の遺伝子を含む。
また、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）の生合成のために、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ株（β酸化欠損株）を宿主として、２つのプラスミド：ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴとｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ（ＮＳＤＧ）を導入することができる。ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ（ＮＳＤＧ）は、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＪＣＡｃ（ＮＳＤＧ）ＡＢＲｅから、ｐｈａＡＢＲｅ遺伝子及びｐｈａＪＡｃ遺伝子を削除したプラスミドである。
ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴは、３Ｍ２ＭＰ－ＣｏＡの供給のためのＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ由来のプロピオニル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰＣＴ）遺伝子を含む。ｐＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＪＣＡｃ（ＮＳＤＧ）ＡＢＲｅは、ｐｈａＰＣＪオペロンの増強された発現を通してより高いＰＨＡ蓄積を可能にする点変異Ｄ４Ｎを有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のフェイシン遺伝子（ｐｈａＰＡｃ）［Ｊ．Ｇｅｎ Ａｐｐｌ ＮＩｃｒｏｂｉａｌ ２０１５，６１，６３－６６］、３ＨＢベース共重合体の第２の単量体ユニットの取り込みを増強するＮ１４９Ｓ及びＤ１７１Ｇ点変異を有するＡ．ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡシンターゼ遺伝子（ｐｈａＣＡｃ）［ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｌｅｔ ２００７，２７７，２１７－２２２］、（Ｒ）特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）、並びにＰｈａＣＡｃ重合のための３ＨＢ前駆物質の供給のためのＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６由来の酵素である３－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡＲｅ）及びアセトアセチル－ＣｏＡ還元酵素（ＰｈａＢＲｅ）の遺伝子を含む。
また、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）の生合成のために、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ株（β酸化欠損株）を宿主として、２つのプラスミド：ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴとｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ（ＮＳＤＧ）を導入することができる。ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ（ＮＳＤＧ）は、ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＪＣＡｃ（ＮＳＤＧ）ＡＢＲｅから、ｐｈａＡＢＲｅ遺伝子及びｐｈａＪＡｃ遺伝子を削除したプラスミドである。
【0033】
上記の、ＰｈａＪＡｃ遺伝子の点変異Ｄ４Ｎ及びＰｈａＣＡｃの二重点変異ＮＳＤＧの存在は、高い重合体の蓄積、及び３ＨＢ単位への第２モノマー（３Ｍ２ＭＰ）単位の高い取込みをもたらす。実際に、本発明では、点変異Ｄ４Ｎ及びＰｈａＣＡｃの二重点変異ＮＳＤＧの存在によって、これまで報告されているＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３－メルカプトアルカノエート）の生産量を有意に超える重合体が得られる（非特許文献１；Ｌuｔｋｅ－Ｅｖｅｒｓｌｏｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００１，２，１０６１－１０６５；Ｌuｔｋｅ－Ｅｖｅｒｓｌｏｈ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００３，２２１，１９１－１９６を参照）。
【0034】
炭素源としては、例えば、糖類、カルボン酸、油脂類等を用いることができる。糖類としては、グルコース、フルクトース、ガクトース、キシロース、アラビノース、サッカロース、マルトース、でんぷん、でんぷん加水分解物等が挙げられる。カルボン酸としては、酢酸、乳酸等が挙げられる。油脂類としては、植物油が好ましく、例えば大豆油、コーン油、綿実油、落花生油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、又はこられの分別油、例えばパームＷオレイン油（パーム油を２回無溶媒分別した低沸点画分）、パーム核油オレイン（パーム核油を１回無溶媒分別した低沸点画分）、又はこれらの油脂やその画分を化学的もしくは生化学的に処理した合成油、あるいはこれらの混合油が挙げられる。
【0035】
培養温度は、菌の生育可能な温度、好ましくは１５～４０℃、特に好ましくは２０～４０℃、更に好ましくは２８～３４℃である。培養時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では１～７日間が好ましく、また連続培養も可能である。培養培地は、本発明の宿主が利用できるものである限り特に限定されない。炭素源に加えて、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源等を含有する培地を使用することができる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣ等のビタミン類などが挙げられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣ等のビタミン類などが挙げられる。
【0036】
本発明のＰＨＡの菌体からの回収は、例えば、次の方法によって行うことができる。培養終了後、遠心分離器等で培養液から菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄した後、乾燥させた後、この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶媒を用いて共重合体を抽出する。次いで、この共重合体を含む有機溶媒溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノール、へキサン等の貧溶媒を加えて共重合体を沈殿させる。沈殿した共重合体から、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させ、共重合体を回収することができる。得られた共重合体の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法、核磁気共鳴法等により行うことができる。
【0037】
本発明のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）及びＰ（３Ｍ２ＭＰ）、特にＰ（３Ｍ２ＭＰ）は異常に大きな破断伸びを有し、変形後ほとんど瞬間的に形状を回復する。このような特徴は、プラスチック材料としての加工時における大きな利点である。したがって、これらの共重合体を含む組成物はフィルム、シート、容器、ボトル、包装材料等の用途に使用することができる。
【0038】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例0039】
［材料及び調製方法］
（１）微生物
大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ株（β酸化欠損株）を宿主に用いた。ＬＳＢＪ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳ５２１８株（Ｓｐｒａｔｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８１，１４６，１１６６）のβ酸化の一部を担うｆａｄＢ遺伝子及びｆａｄＪ遺伝子が欠損した変異株である（Ｔａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２，１１３，４８０）。
（１）微生物
大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ株（β酸化欠損株）を宿主に用いた。ＬＳＢＪ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳ５２１８株（Ｓｐｒａｔｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８１，１４６，１１６６）のβ酸化の一部を担うｆａｄＢ遺伝子及びｆａｄＪ遺伝子が欠損した変異株である（Ｔａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２，１１３，４８０）。
【0040】
（２）培地
（ａ）Ｌｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地
Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎ １０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。また、寒天培地は、上記成分に寒天１．５～２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）となるよう加え、オートクレーブ処理して調製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度５０μｇ／ｍＬ、カルベニシリン：終濃度５０μｇ／ｍＬ）は、液体培地、寒天培地ともにオートクレーブ処理後に添加した。
（b）Ｍ９改良培地
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ、ＮＨ４Ｃｌ ０．５ｇ、ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２．５ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、１Ｍ ＣａＣｌ２ ０．１ｍＬを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。カナマイシン ５０ｍｇ及びカルベニシリン ５０ｍｇはオートクレーブ後に添加した。
（ａ）Ｌｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地
Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎ １０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。また、寒天培地は、上記成分に寒天１．５～２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）となるよう加え、オートクレーブ処理して調製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度５０μｇ／ｍＬ、カルベニシリン：終濃度５０μｇ／ｍＬ）は、液体培地、寒天培地ともにオートクレーブ処理後に添加した。
（b）Ｍ９改良培地
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ、ＮＨ４Ｃｌ ０．５ｇ、ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２．５ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍＬ、１Ｍ ＣａＣｌ２ ０．１ｍＬを脱イオン水１Ｌに溶かして、１２１℃で２０分間オートクレーブして調製した。カナマイシン ５０ｍｇ及びカルベニシリン ５０ｍｇはオートクレーブ後に添加した。
【0041】
（３）プラスミド
（ａ）ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣJＡｃＡＢＲｃ ＮＳＤＧ
ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｃ ＮＳＤＧは、文献（Ｓａｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１４，１１７，６７０）にしたがって作製した。ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｃ ＮＳＤＧは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅのＰＨＡオペロンを有しており、ｐｈａＰでは４位のアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に、ｐｈａＣでは１４９位のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に、かつ１７１位のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に変異している（Ｕｓｈｉｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５，６１，６３）。
（ｂ）ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ ＮＳＤＧ
ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｃ ＮＳＤＧ（Ｓａｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１４，１１７，６７０）のｐｈａＪ及びｐｈａＡＢを含まない領域をＰＣＲ法により増幅し、７ｋｂの増幅断片を平滑末端化及びリン酸化し、自己環状化させることでｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ ＮＳＤＧを作製した。
（ｃ）ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴ
ｐｃｔ遺伝子を含むＮｈｅ Ｉ－Ｍｕｎ Ｉ断片を、ＰＣＲ法によってｐＴＶｐｃｔＣ１ＳＴＱＫＡＢＲｅから増幅し、次いで、当該断片をｐＴＴＱ１９のＸｂａ Ｉ－ＥｃｏＲ Ｉ部位に挿入することによって、ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを作製した（Ｆｕｒｕｔａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｒｅｓ．２０１７，２４：２２１）。当該ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴは、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ由来のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）を有している（同文献）。
（ａ）ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣJＡｃＡＢＲｃ ＮＳＤＧ
ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｃ ＮＳＤＧは、文献（Ｓａｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１４，１１７，６７０）にしたがって作製した。ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｃ ＮＳＤＧは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅのＰＨＡオペロンを有しており、ｐｈａＰでは４位のアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に、ｐｈａＣでは１４９位のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に、かつ１７１位のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に変異している（Ｕｓｈｉｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５，６１，６３）。
（ｂ）ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ ＮＳＤＧ
ｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃＡＢＲｃ ＮＳＤＧ（Ｓａｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１４，１１７，６７０）のｐｈａＪ及びｐｈａＡＢを含まない領域をＰＣＲ法により増幅し、７ｋｂの増幅断片を平滑末端化及びリン酸化し、自己環状化させることでｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ ＮＳＤＧを作製した。
（ｃ）ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴ
ｐｃｔ遺伝子を含むＮｈｅ Ｉ－Ｍｕｎ Ｉ断片を、ＰＣＲ法によってｐＴＶｐｃｔＣ１ＳＴＱＫＡＢＲｅから増幅し、次いで、当該断片をｐＴＴＱ１９のＸｂａ Ｉ－ＥｃｏＲ Ｉ部位に挿入することによって、ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを作製した（Ｆｕｒｕｔａｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｒｅｓ．２０１７，２４：２２１）。当該ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴは、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ由来のプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）を有している（同文献）。
【0042】
実施例１ 重合体の製造
１．Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）の生合成
上記大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ（β酸化欠損株）株に、プラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃ ＮＳＤＧを加え、ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを導入した。
ＬＢ寒天培地上に形成された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪの単一コロニーを、５０ｍＬ振とうフラスコ中の２０ｍＬのＬｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地に植菌し、３７℃、１６０ストローク／分で、一晩培養した。この培養液５ｍＬを、５００ｍＬ振とうフラスコ中の９５ｍＬのＭ９改良培地（１７．１ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍＬの１Ｍ ＣａＣｌ２、２．５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌグルコース、０．２５～２．５ｇ／Ｌ （ＲＳ）－３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸（３Ｍ２ＭＰ）、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、１ｍＭ 誘導剤ＩＰＴＧ）を植菌し、３０℃、１３０ストローク／分で、７２時間培養した。培養後、１０分の遠心分離（５９６０×ｇ）を行って菌体を回収し、水で洗浄後、凍結乾燥させた。
１．Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）の生合成
上記大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ（β酸化欠損株）株に、プラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＪＡｃ ＮＳＤＧを加え、ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを導入した。
ＬＢ寒天培地上に形成された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪの単一コロニーを、５０ｍＬ振とうフラスコ中の２０ｍＬのＬｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地に植菌し、３７℃、１６０ストローク／分で、一晩培養した。この培養液５ｍＬを、５００ｍＬ振とうフラスコ中の９５ｍＬのＭ９改良培地（１７．１ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍＬの１Ｍ ＣａＣｌ２、２．５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌグルコース、０．２５～２．５ｇ／Ｌ （ＲＳ）－３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸（３Ｍ２ＭＰ）、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、１ｍＭ 誘導剤ＩＰＴＧ）を植菌し、３０℃、１３０ストローク／分で、７２時間培養した。培養後、１０分の遠心分離（５９６０×ｇ）を行って菌体を回収し、水で洗浄後、凍結乾燥させた。
【0043】
２．Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）の生合成
Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）を製造するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ（β酸化欠損株）株に、プラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ ＮＳＤＧを加え、ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを導入した。最初に、組換え大腸菌ＬＳＢＪを５ｍＬ試験管に入った１．７ｍＬのＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌ カナマイシンと５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリンを含む）に接種し、３７℃で４時間、１６０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液（０．２ｍＬ）を、５０ｍｌフラスコに入った２０ｍＬ ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン及び５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリンを含む）に植菌し、３０℃で１８時間、１６０ｒｐｍで振とう培養し、前培養液とした。次に、前培養液５ｍＬを５００ｍＬ振とうフラスコに入った１００ｍＬのＭ９改良培地（２ｍＬ／Ｌの１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍＬの１Ｍ ＣａＣｌ２、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含む）に植菌し、３０℃で４時間、１３０ｒｐｍで振とう培養を行った。その後、３．７５ｇ／Ｌグルコース、１．２ｇ／Ｌの３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸（ｐＨ中和済）、及び１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、培養を７６時間継続した。培養後、１０分の遠心分離（５９６０×ｇ）を行って菌体を回収し、水で洗浄後、凍結乾燥させた。
Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）を製造するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＳＢＪ（β酸化欠損株）株に、プラスミドｐＢＢＲ１ｐｈａＰ（Ｄ４Ｎ）ＣＡｃ ＮＳＤＧを加え、ｐＴＴＱ１９－ＰＣＴを導入した。最初に、組換え大腸菌ＬＳＢＪを５ｍＬ試験管に入った１．７ｍＬのＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌ カナマイシンと５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリンを含む）に接種し、３７℃で４時間、１６０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液（０．２ｍＬ）を、５０ｍｌフラスコに入った２０ｍＬ ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン及び５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリンを含む）に植菌し、３０℃で１８時間、１６０ｒｐｍで振とう培養し、前培養液とした。次に、前培養液５ｍＬを５００ｍＬ振とうフラスコに入った１００ｍＬのＭ９改良培地（２ｍＬ／Ｌの１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍＬの１Ｍ ＣａＣｌ２、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含む）に植菌し、３０℃で４時間、１３０ｒｐｍで振とう培養を行った。その後、３．７５ｇ／Ｌグルコース、１．２ｇ／Ｌの３－メルカプト－２－メチルプロピオン酸（ｐＨ中和済）、及び１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、培養を７６時間継続した。培養後、１０分の遠心分離（５９６０×ｇ）を行って菌体を回収し、水で洗浄後、凍結乾燥させた。
【0044】
３．Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）の回収
培養後、遠心分離により菌体を回収し、蒸留水で２回洗浄し、あらかじめ秤量したチューブで７２時間凍結乾燥し、乾燥菌体重量を算出した。ポリマー含有量は、文献（Ａｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ ２０１７，１２４，２５０－２５４）に記載されている方法を修正した超音波抽出によって決定した。すなわち、約１００ｍｇの凍結乾燥菌体を前もって秤量した５０ｍＬ容のプラスチックチューブに加え、２０ｍＬの蒸留水に再懸濁した。続いて、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の１０％溶液１３ｍＬを、最終濃度が約４％のＳＤＳになるように添加した。次に、その溶液を出力１０で４分間連続的に超音波処理し、３回のすすぎステップ（２０ｍＬ蒸留水、次いで５ｍＬメタノール、次いで２０ｍＬ蒸留水、遠心分離で回収）を行い、２４時間凍結乾燥してポリマー量を測定した。
培養後、遠心分離により菌体を回収し、蒸留水で２回洗浄し、あらかじめ秤量したチューブで７２時間凍結乾燥し、乾燥菌体重量を算出した。ポリマー含有量は、文献（Ａｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ ２０１７，１２４，２５０－２５４）に記載されている方法を修正した超音波抽出によって決定した。すなわち、約１００ｍｇの凍結乾燥菌体を前もって秤量した５０ｍＬ容のプラスチックチューブに加え、２０ｍＬの蒸留水に再懸濁した。続いて、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の１０％溶液１３ｍＬを、最終濃度が約４％のＳＤＳになるように添加した。次に、その溶液を出力１０で４分間連続的に超音波処理し、３回のすすぎステップ（２０ｍＬ蒸留水、次いで５ｍＬメタノール、次いで２０ｍＬ蒸留水、遠心分離で回収）を行い、２４時間凍結乾燥してポリマー量を測定した。
【0045】
４．Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）ＰＨＡの精製
ポリマーを大量に精製する場合は、ＰＨＡを蓄積させた乾燥菌体を１００ｍＬの蓋付ガラス瓶に移し、１００ｍＬのクロロホルムを加え、スターラーで７２時間攪拌した。撹拌後の溶液をＮｏ．１濾紙（アドバンテック社製）でろ過し、ナス型フラスコに移し変えた。その後、ロータリーエバポレーターで完全に濾液を揮発させ、ポリマーを析出させた。次いで、析出したポリマーを少量のメタノールで洗い取り、約２０ｍＬのクロロホルムに完全に溶解させた後、４００ｍＬのメタノールに少量ずつ滴下しながら撹拌を行い、精製した。精製した共重合体をＮｏ．１濾紙で回収し、４８時間、ドラフト中で乾燥させた。結果を表１に示す。
ポリマーを大量に精製する場合は、ＰＨＡを蓄積させた乾燥菌体を１００ｍＬの蓋付ガラス瓶に移し、１００ｍＬのクロロホルムを加え、スターラーで７２時間攪拌した。撹拌後の溶液をＮｏ．１濾紙（アドバンテック社製）でろ過し、ナス型フラスコに移し変えた。その後、ロータリーエバポレーターで完全に濾液を揮発させ、ポリマーを析出させた。次いで、析出したポリマーを少量のメタノールで洗い取り、約２０ｍＬのクロロホルムに完全に溶解させた後、４００ｍＬのメタノールに少量ずつ滴下しながら撹拌を行い、精製した。精製した共重合体をＮｏ．１濾紙で回収し、４８時間、ドラフト中で乾燥させた。結果を表１に示す。
【0046】
【表1】
【0047】
実施例２ Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）の構造及び物性の分析
（１）１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲ
核磁気共鳴分光装置（Ｂｉｏｓｐｉｎ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００Ａ，Ｂｒｕｋｅｒ、又はＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ，Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して測定を行った。１次元（１Ｄ）１Ｈ－ＮＭＲ、２次元（２Ｄ）１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ（相関分光法）、及び１Ｈ－１３Ｃ ＨＳＱＣ（異核種単一量子コヒーレンス）ＮＭＲについては、精製及びろ過したポリマーの１０～２０ｍｇを１ｍｌのＣＤＣｌ３に溶解し、０．４５μｍポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルター膜でろ過し、１３Ｃ－ＮＭＲについては、４０ｍｇを１ｍｌのＣＤＣｌ３に溶解し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター膜でろ過し、測定サンプルとした。サンプル番号７のＰ（３Ｍ２ＭＰ）の１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図２に示す。図３には、サンプル番号１～６のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）、及びサンプル番号７のＰ（３Ｍ２ＭＰ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの比較を示す。
（１）１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲ
核磁気共鳴分光装置（Ｂｉｏｓｐｉｎ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００Ａ，Ｂｒｕｋｅｒ、又はＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ，Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して測定を行った。１次元（１Ｄ）１Ｈ－ＮＭＲ、２次元（２Ｄ）１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ（相関分光法）、及び１Ｈ－１３Ｃ ＨＳＱＣ（異核種単一量子コヒーレンス）ＮＭＲについては、精製及びろ過したポリマーの１０～２０ｍｇを１ｍｌのＣＤＣｌ３に溶解し、０．４５μｍポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルター膜でろ過し、１３Ｃ－ＮＭＲについては、４０ｍｇを１ｍｌのＣＤＣｌ３に溶解し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター膜でろ過し、測定サンプルとした。サンプル番号７のＰ（３Ｍ２ＭＰ）の１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図２に示す。図３には、サンプル番号１～６のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）、及びサンプル番号７のＰ（３Ｍ２ＭＰ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの比較を示す。
【0048】
Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから、４つのピークＡ（３．１４ｐｐｍ）、Ｂ（３．０１ｐｐｍ）、Ｃ（２．８６ｐｐｍ）及びＤ（１．２５ｐｐｍ）を特定した。ピーク積分値は、ピークＡ～Ｃについては０．９９～１、ピークＤについては３．１６であった。１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルから、ピークＥ、Ｆ、Ｇ、及びＨはそれぞれ２０１．３、４８．４、３１．６、及び１７．６ｐｐｍであった。
Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）の３Ｍ２ＭＰ単位の含有量を、１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおけるメチン（＞ＣＨ－）ピークの積分により決定した。３ＨＢのメチン（３ＨＢ-ＣＨ）は５．２５ｐｐｍに表れ、その他、３ＨＢのメチレン（３ＨＢ-ＣＨ２）は２．５ｐｐｍ付近、３ＨＢのメチル（３ＨＢ-ＣＨ３）は１．２７ｐｐｍに表れた。
また、２つのモノマー単位を有する共重合体として、４つの可能な共重合体の組合せ（３ＨＢ－３Ｍ２ＭＰ、３ＨＢ－３ＨＢ、３Ｍ２ＭＰ－３Ｍ２ＭＰ、及び３Ｍ２ＭＰ－３ＨＢ）が考えられるが、この共重合体の配列分布を、パラメーターＤ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９８９，２２，１６７６－１６８２）を計算することにより予測した。
Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）の３Ｍ２ＭＰ単位の含有量を、１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおけるメチン（＞ＣＨ－）ピークの積分により決定した。３ＨＢのメチン（３ＨＢ-ＣＨ）は５．２５ｐｐｍに表れ、その他、３ＨＢのメチレン（３ＨＢ-ＣＨ２）は２．５ｐｐｍ付近、３ＨＢのメチル（３ＨＢ-ＣＨ３）は１．２７ｐｐｍに表れた。
また、２つのモノマー単位を有する共重合体として、４つの可能な共重合体の組合せ（３ＨＢ－３Ｍ２ＭＰ、３ＨＢ－３ＨＢ、３Ｍ２ＭＰ－３Ｍ２ＭＰ、及び３Ｍ２ＭＰ－３ＨＢ）が考えられるが、この共重合体の配列分布を、パラメーターＤ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９８９，２２，１６７６－１６８２）を計算することにより予測した。
【0049】
【数1】
【0050】
（式中、３ＨＢはＯ、３Ｍ２ＭＰはＳであり、例えばＦｏｓは１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルにおける３ＨＢ－３Ｍ２ＭＰ配列のカルボニル基のモル分率である）
例えばＤが１の場合、共重合体は有意にランダムであるが、Ｄが１より著しく大きい場合、共重合体はブロック状である。Ｄが１より著しく小さい場合、共重合体は交互共重合体である。４つの可能な共重合体の組合せに対するピークの帰属は、１Ｈ－１３Ｃ－ＨＭＢＣ（異核多結合相関）ＮＭＲにより行った。結果を表２に示す。
例えばＤが１の場合、共重合体は有意にランダムであるが、Ｄが１より著しく大きい場合、共重合体はブロック状である。Ｄが１より著しく小さい場合、共重合体は交互共重合体である。４つの可能な共重合体の組合せに対するピークの帰属は、１Ｈ－１３Ｃ－ＨＭＢＣ（異核多結合相関）ＮＭＲにより行った。結果を表２に示す。
【0051】
【表2】
【0052】
表２は、すべてのサンプルのＤ値が１よりも大幅に大きいことを示す。この結果は、すべてのサンプルがブロック状配列度分布を持ち得ることを示す。３Ｍ２ＭＰ単位のモル分率が低いと、ブロック配列の程度は高い傾向にあった。
【0053】
最後に、減衰全反射（ＡＴＲ）、モデルＡＴＲ ＰＲＯ４００－Ｓ（Ｊａｓｃｏ，Ｊａｐａｎ）を有するＦＴ／ＩＲ－４６００分析計（Ｊａｓｃｏ，Ｊａｐａｎ）によるフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法を用いて、ポリマー分子中のチオエステル化学基の発生を確認した（図示せず）。
【0054】
（２）ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）
菌体から精製したポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）（Ｍｗ：重量平均分子量）をＧＰＣ測定によって求めた。標準物質としてポリスチレンを使用しているため、本発明で求めた分子量はポリスチレン換算相対分子量である。用いた５種類のポリスチレンの分子量は、３，７９０、３０，３００、２１９，０００、７５６，０００及び４，２３０，０００である。
ＧＰＣサンプルは、精製したポリマーを約１ｍｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに溶解し、孔径０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ－ＦＨ ＰＶＤＦフィルター（ミリポア社製）を取り付けたシリンジでろ過して調製した。
ＧＰＣ測定には島津製作所社製のＮｅｘｅｒａ ４０ １８２ ＧＰＣ ｓｙｓｔｅｍ（ディテクター：Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ－５０４ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用し、カラムにはＳｈｏｄｅｘ社製のＫ－８０６Ｍ及びＫ－８０２を用いた。移動層にはクロロホルムを用い、総液流量は０．３ｍＬ／分、カラム温度は４０℃に設定した。ポリスチレンスタンダードから検量線を引き、これとサンプルデータとを照合することによりポリスチレン換算分子量及び分子量分布を算出した。
菌体から精製したポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）（Ｍｗ：重量平均分子量）をＧＰＣ測定によって求めた。標準物質としてポリスチレンを使用しているため、本発明で求めた分子量はポリスチレン換算相対分子量である。用いた５種類のポリスチレンの分子量は、３，７９０、３０，３００、２１９，０００、７５６，０００及び４，２３０，０００である。
ＧＰＣサンプルは、精製したポリマーを約１ｍｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに溶解し、孔径０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ－ＦＨ ＰＶＤＦフィルター（ミリポア社製）を取り付けたシリンジでろ過して調製した。
ＧＰＣ測定には島津製作所社製のＮｅｘｅｒａ ４０ １８２ ＧＰＣ ｓｙｓｔｅｍ（ディテクター：Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ－５０４ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用し、カラムにはＳｈｏｄｅｘ社製のＫ－８０６Ｍ及びＫ－８０２を用いた。移動層にはクロロホルムを用い、総液流量は０．３ｍＬ／分、カラム温度は４０℃に設定した。ポリスチレンスタンダードから検量線を引き、これとサンプルデータとを照合することによりポリスチレン換算分子量及び分子量分布を算出した。
【0055】
（３）示差走査熱量（ＤＳＣ）
ＤＳＣサンプルは、精製したポリマーを約１０ｍｇ秤り取り、５ｍＬ容のサンプルバイアルに入れ、約１～２ｍＬのクロロホルムに完全に溶解した。これをドラフト中で約３週間乾燥させることによりキャストフィルムを作製した。このキャストフィルムから約３ｍｇを秤量し、専用アルミニウムパンに入れたものをＤＳＣ測定サンプルとした。
測定には、パーキンエルマー社製のＤＳＣ ８５００を使用した。測定は２０ｍＬ／分の窒素雰囲気下で行った。対照には試料の入っていないアルミニウムパンを用いた。測定の条件として、初めに－５０℃～２００℃まで２０℃／分の昇温速度で加熱し、２００℃で１分間保持した後、－５００℃／分で－５０℃まで急冷した。次に、－５０℃で１分間保持した後、２０℃／分の昇温速度で２００℃に加熱した。
なお、キャストフィルムは３週間以上室温下に置き、結晶形成を進行させたものを使用した。測定した試料の融点Ｔｍは最初に昇温した時のサーモグラムより決定した。ガラス転移温度Ｔｇは２回目に昇温した際の熱容量変化の中点とした。
結果を表３、図４に示す。
Ｔｃｃ：冷結晶化点。冷結晶化点（Ｃｏｌｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）は、昇温時にガラス転移温度以上の過冷却液体状態から結晶が生成する現象である。
ＤＳＣサンプルは、精製したポリマーを約１０ｍｇ秤り取り、５ｍＬ容のサンプルバイアルに入れ、約１～２ｍＬのクロロホルムに完全に溶解した。これをドラフト中で約３週間乾燥させることによりキャストフィルムを作製した。このキャストフィルムから約３ｍｇを秤量し、専用アルミニウムパンに入れたものをＤＳＣ測定サンプルとした。
測定には、パーキンエルマー社製のＤＳＣ ８５００を使用した。測定は２０ｍＬ／分の窒素雰囲気下で行った。対照には試料の入っていないアルミニウムパンを用いた。測定の条件として、初めに－５０℃～２００℃まで２０℃／分の昇温速度で加熱し、２００℃で１分間保持した後、－５００℃／分で－５０℃まで急冷した。次に、－５０℃で１分間保持した後、２０℃／分の昇温速度で２００℃に加熱した。
なお、キャストフィルムは３週間以上室温下に置き、結晶形成を進行させたものを使用した。測定した試料の融点Ｔｍは最初に昇温した時のサーモグラムより決定した。ガラス転移温度Ｔｇは２回目に昇温した際の熱容量変化の中点とした。
結果を表３、図４に示す。
Ｔｃｃ：冷結晶化点。冷結晶化点（Ｃｏｌｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）は、昇温時にガラス転移温度以上の過冷却液体状態から結晶が生成する現象である。
【0056】
【表3】
【0057】
表３から、サンプル７は、明瞭な非晶質挙動を示し、負のＴｇを示し、融点及び低温結晶化ピークは検出されなかった。また、サンプル１～３では、３Ｍ２ＭＰ単位のモル分率が増えるにつれてＴｇ及びΔＨｍは減少し、サンプル４では不定形性をもたらした。
【0058】
実施例３ Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３Ｍ２ＭＰ）、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）の機械的特性
実施例１で製造したサンプル番号１～６の共重合体のキャストフィルム、及びサンプル番号７の重合体のキャストフィルムを作製し、降伏強度、引張強度、破断伸び、及びヤング率を決定した。
＜装置＞
引張試験機：ＡＧＳ－Ｈ／ＥＺＴｅｓｔ（島津製作所）
分析ソフト：ＴＲＡＰＥＺＩＵＭ ２（島津製作所）
＜サンプル調製＞
（ａ）キャストフィルムの作製
精製したポリマーを適量のクロロホルムの溶解し、フラットシャーレに展開した。ここで用いたポリマー重量は、シャーレの面積を考慮して、厚さが１５０μｍになるように計算した。展開後、穴をあけたアルミホイルでシャーレにふたをして、クロロホルムが完全に気化するまで、平滑な場所に室温で静置した。乾燥後、シャーレからフィルムを丁寧に剥がし、１週間、室温で静置した。シャーレから剥がれにくいポリマーは、シャーレとポリマーとの間に超純水を滴下することにより、剥離した。
（ｂ）引張試験片の作製
作製したキャストフィルムを縦２０ｍｍ、横３ｍｍに切断したものをサンプルとした。切断には剃刀を使用し、ポリマーの真上から押さえつけるように切断した。
＜測定条件＞
つかみ間距離１０ｍｍ、引張速度１０ｍｍ／分とし、室温で測定した。
＜データ解析＞
引張試験において、ポリマーの塑性が開始する応力を降伏強度、ポリマーが破断した時の応力を引張強度、伸び率を破断伸びとした。ヤング率は、応力－歪み曲線における開始点の傾きとした。
結果を表４、図５～図７に示す。図５は各キャストフィルムの写真を、図６は応力－歪み曲線を、図７は、マニュアルによるサンプル７の伸び（ｂ）、及び変形後の瞬間回復（ｃ）を示す。
実施例１で製造したサンプル番号１～６の共重合体のキャストフィルム、及びサンプル番号７の重合体のキャストフィルムを作製し、降伏強度、引張強度、破断伸び、及びヤング率を決定した。
＜装置＞
引張試験機：ＡＧＳ－Ｈ／ＥＺＴｅｓｔ（島津製作所）
分析ソフト：ＴＲＡＰＥＺＩＵＭ ２（島津製作所）
＜サンプル調製＞
（ａ）キャストフィルムの作製
精製したポリマーを適量のクロロホルムの溶解し、フラットシャーレに展開した。ここで用いたポリマー重量は、シャーレの面積を考慮して、厚さが１５０μｍになるように計算した。展開後、穴をあけたアルミホイルでシャーレにふたをして、クロロホルムが完全に気化するまで、平滑な場所に室温で静置した。乾燥後、シャーレからフィルムを丁寧に剥がし、１週間、室温で静置した。シャーレから剥がれにくいポリマーは、シャーレとポリマーとの間に超純水を滴下することにより、剥離した。
（ｂ）引張試験片の作製
作製したキャストフィルムを縦２０ｍｍ、横３ｍｍに切断したものをサンプルとした。切断には剃刀を使用し、ポリマーの真上から押さえつけるように切断した。
＜測定条件＞
つかみ間距離１０ｍｍ、引張速度１０ｍｍ／分とし、室温で測定した。
＜データ解析＞
引張試験において、ポリマーの塑性が開始する応力を降伏強度、ポリマーが破断した時の応力を引張強度、伸び率を破断伸びとした。ヤング率は、応力－歪み曲線における開始点の傾きとした。
結果を表４、図５～図７に示す。図５は各キャストフィルムの写真を、図６は応力－歪み曲線を、図７は、マニュアルによるサンプル７の伸び（ｂ）、及び変形後の瞬間回復（ｃ）を示す。
【0059】
【表4】
【0060】
図５より、３Ｍ２ＭＰ単位のモル分率が増えると、キャストフィルムは透明度が高くなり、より柔軟になることが分かる。また、表４より、３Ｍ２ＭＰ単位のモル分率が増えるにしたがい、降伏強度、引張強度及びヤング率は減少し、一方、破断伸びは増加した。特に、サンプル４では１５００％以上の破断伸びを示した。サンプル４とほぼ同じモル分率の３Ｍ２ＭＰ単位からなるサンプル５は、サンプル４よりも低い破断伸びを示したが、これは、サンプル４と比べて低い分子量及び微細構造の相違に因るものと考えられる。
サンプル７については、２６０５％という異常な破断伸び示し、また、変形したフィルムはほとんどが瞬間的に形状を回復した。これは、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）が格別な弾性を有することを意味しており、このことは加工上特に有利である。
サンプル７については、２６０５％という異常な破断伸び示し、また、変形したフィルムはほとんどが瞬間的に形状を回復した。これは、Ｐ（３Ｍ２ＭＰ）が格別な弾性を有することを意味しており、このことは加工上特に有利である。
【産業上の利用可能性】
【0061】
本発明の３Ｍ２ＭＰ単位と３ＨＢ単位とを含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体、及び３Ｍ２ＭＰの単一重合体は、フィルム等のプラスチック材料として有効に活用できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
