特開 2023-165564 ベシクル及びその薬物送達のための使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023165564

(43)【公開日】2023-11-16

(54)【発明の名称】ベシクル及びその薬物送達のための使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/10 20060101AFI20231109BHJP

   A61K 38/28 20060101ALI20231109BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231109BHJP

   A61K 33/30 20060101ALI20231109BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20231109BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20231109BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231109BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231109BHJP

【ＦＩ】

A61K9/10

A61K38/28

A61P43/00 111

A61K33/30

A61K9/51

A61K9/16

A61P25/00

A61P1/16

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022076777

(22)【出願日】2022-05-06

(71)【出願人】

【識別番号】305027401

【氏名又は名称】東京都公立大学法人

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】朝山 章一郎

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 捷太

(72)【発明者】

【氏名】清水 莉乃

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA16

4C076AA29

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC01

4C076CC16

4C076DD70H

4C076FF16

4C076FF67

4C076GG42

4C084AA02

4C084BA44

4C084DB34

4C084MA21

4C084MA38

4C084MA41

4C084NA05

4C084NA06

4C084NA13

4C084ZA01

4C084ZA75

4C086AA01

4C086AA02

4C086HA03

4C086MA02

4C086MA05

4C086MA21

4C086MA38

4C086MA41

4C086NA05

4C086NA06

4C086NA13

4C086ZA01

4C086ZA75

(57)【要約】

【課題】コレステロールに親水性基を結合してなる両親媒性化合物を含むベシクルの提供。
【解決手段】以下の式（１）で表される化合物を含有する外殻を有する中空形状である、ベシクル。

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式（１）で表される化合物を含有する外殻を有し、かつ中空形状であるベシクル。

【化1】

（式中、Ｘは

【化2】

（式中、ｍは２～４３の整数であり、ｎは１～３である。）
または

【化3】

（式中、ｎは１～３である。）
である。）

【請求項2】

請求項１に記載のベシクルを含む薬物担体。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のベシクルと、前記ベシクル内に内包された物質とを含む、物質内包システム。

【請求項4】

前記物質が薬物である請求項３に記載の物質内包システム。

【請求項5】

式（１）で表される化合物は、下記式（４）で表される化合物であり、前記物質がインスリンである、アミロイドβの凝集の抑制のための請求項３に記載の物質内包システム。

【化4】

（式中、ｍは２～４３の整数である。）

【請求項6】

式（１）で表される化合物は、下記式（５）で表される化合物であり、前記物質が亜鉛である、肝細胞を標的とする請求項３に記載の物質内包システム。

【化5】

【請求項7】

以下の式（５）で表される化合物。

【化6】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、修飾コレステロールを含むベシクルとその薬物送達のための使用に関する。

【背景技術】

【0002】

発明者らは以前に、エチレングリコールを初めとする親水性基と、疎水性基と、それらの間に位置する１～５個の含窒素基とを具備することを特徴とする界面活性剤様化合物を開発した（特許文献１）。これらの界面活性剤様化合物は、生体への毒性が低く、小粒径で標的部位に移送されやすく、標的部位での発現効率が高い核酸複合体を形成することができる。特許文献１の界面活性剤様化合物は、ＤＮＡとの複合体を形成した場合の、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の遺伝子導入効率が、ＤＮＡのみを投与した場合に比べて上昇することが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許第６３５８６６１号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

両親媒性分子を自己組織化させることにより、球殻状に閉じた膜構造を有する小胞であるベシクルを形成し得ることが知られている。ベシクルは多様な分子設計が可能であり、物質の徐放、毒性物質の捕捉、臭気及び味分子のマスキングなど、新たな機能を呈する可能性があることから、薬物送達システム（Drug Delivery System, DDS） の担体や、バイオマテリアル、機能性材料等としての利用が検討されている。特に、生体に由来したリン脂質からなる、脂質二分子膜を有するベシクルはリポソームと呼ばれ、生体への安全性の面から様々な検討がなされている。

【0005】

しかしながら、特許文献１には、界面活性剤様化合物とベシクル形成との関係については開示されていない。

【0006】

本発明が解決すべき課題は、コレステロールに由来する疎水性部分と親水性ポリマー鎖の部分とを有する化合物から形成されたベシクルを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、コレステロールのステロール骨格の３位に、エーテル結合を有する親水性ポリマー鎖が結合されてなる化合物から、これを外殻として有する中空のベシクルを形成することができることを見出し、本発明を完成した。

【0008】

項１．式（１）で表される化合物を含有する外殻を有し、かつ中空形状である、ベシクル。

【化1】

（式中、Ｘは

【化2】

（式中、ｍは２～４３の整数であり、ｎは１～３である。）
または

【化3】

（式中、ｎは１～３である。）
である。）

【0009】

項２．項１に記載のベシクルを含む薬物担体。

【0010】

項３．項１又は２に記載のベシクルと、前記ベシクル内に内包された物質とを含む、物質内包システム。

【0011】

項４．前記物質が薬物である項３に記載の物質内包システム。

【0012】

項５．式（１）で表される化合物は、下記式（４）で表される化合物であり、前記物質がインスリンである、アミロイドβの凝集の抑制のための項３に記載の物質内包システム。

【化4】

（式中、ｍは２～４３の整数である。）

【0013】

項６．式（１）で表される化合物は、下記式（５）で表される化合物であり、前記物質が亜鉛である、肝細胞を標的とする項３に記載の物質内包システム。

【化5】

【0014】

項７．以下の式（５）で表される化合物。

【化6】

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、安全性が高く、また疎水性部分がアルキル鎖であるリポソームと比較して構造安定性が高いベシクル、およびかかるベシクルを含む薬物担体ならびに薬物送達システムが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀のＣＭＣ測定のグラフ。

【図2】Ｉ₁／Ｉ₃対ＬｏｇＣのグラフ。

【図3】（Ａ）Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀およびＣｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀の動的光散乱による平均粒径の測定。（Ｂ）Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀の模式図。（Ｃ）Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀の模式図。

【図4】（Ａ）Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀の透過型電子顕微鏡画像。（Ｂ）Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀の透過型電子顕微鏡画像。

【図5】（Ａ）Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀とインスリンを混合したサンプルのゲル電気泳動後のゲルの写真。（Ｂ）Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀とインスリンを混合したサンプルのゲル電気泳動後のゲルの写真。

【図6】（Ａ）インスリン単体の透過型電子顕微鏡画像。（Ｂ）インスリンにＣｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を添加したサンプルの透過型電子顕微鏡画像。

【図7】（Ａ）Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を添加していないサンプルの顕微鏡画像。（Ｂ）Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を１００等量添加した際の顕微鏡画像。

【図8】凝集したアミロイドβにＣｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を各種量で添加したサンプルの蛍光強度を示すグラフ。

【図9】（Ａ）Ｃｈｏｌ－ＬａｃのＣＭＣ測定のグラフ。（Ｂ）Ｉ₁／Ｉ₃対ＬｏｇＣのグラフ。

【図10】Ｃｈｏｌ－Ｌａｃの（溶媒は水）の粒径。

【図11】Ｃｈｏｌ－ＬａｃベシクルのＴＥＭ観察画像。

【図12】（Ａ）Ａｃｉｄ Ｒｅｄ５２の内包を内包したＣｈｏｌ－Ｌａｃベシクルの共焦点顕微鏡画像、（Ｂ）位相コントラストの画像。

【図13】健常者（Normal model）とII型糖尿病患者(Type II Diabetes)におけるすい臓からの亜鉛イオンの分泌と、肝臓における亜鉛、インスリン放出の関係を示す模式図。

【図14】（Ａ）Ｃｈｏｌ－Ｌａｃ ５．０×１０^-2ｍｇ／ｍＬ(酢酸ウラニウムで染色)。（Ｂ）Ｚｎ²⁺／Ｃｈｏｌ－Ｌａｃ ２．５×１０^-2ｍｇ／ｍＬ(酢酸ウラニウムで染色)。（Ｃ）ＺｎＣｌ₂(酢酸ウラニウムで染色せず)

【図15】（Ａ）水中（４℃）でのＺｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃの粒径、 （Ｂ）胎児ウシ血清アルブミン添加後のＺｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃの濁度のグラフ。

【図16】ＨｅｐＧ２細胞に各種サンプルを添加した後の細胞生存率を示すグラフ。

【図17】蛍光プローブ法による細胞に取り込まれた亜鉛イオンの評価。（Ａ），（Ｃ）細胞のみ、（Ｂ），（Ｄ）細胞に亜鉛イオン内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃを添加。（Ｃ）及び（Ｄ）は位相コントラスト。

【図18】（Ａ）Ｈｅｐ２細胞及びＣ２Ｃ１２細胞の各々への亜鉛イオンの取り込みを示すグラフ。（Ｂ）各種濃度で阻害剤を加えたときのＨｅｐ２細胞における亜鉛イオンの取り込みを示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下に、本発明の実施形態を説明する。

【0018】

本明細書において、「ベシクル」とは、両親媒性分子が自己集合して形成された外殻を備え、かつ外殻の内部に空間を有し、中空形状である物質を指す。

【0019】

本発明の実施形態のベシクルは、式（１）で表される化合物を含有する外殻を有する、中空形状のベシクルである。

【0020】

【化7】

【0021】

式中、Ｘは

【0022】

【化8】

【0023】

（式中、ｍは２～４３の整数であり、ｎは１～３である。）
または

【0024】

【化9】

【0025】

（式中、ｎは１～３である。）
である。

【0026】

式（１）で表される化合物は、コレステロールと、エーテル結合を有する親水性ポリマーを、アミド結合を介して結合させた化合物である。式（１）で表される化合物は、親水性の部分と疎水性の部分を備えているため、両親媒性である。かかる両親媒性分子が自己集合すると、親水性ポリマー鎖に由来する親水性の部分を外殻の外側に向けた状態で、コレステロールに由来する疎水性の部分が球状の脂質膜を形成し、球状の脂質膜の内部には空隙が形成される。

【0027】

式（２）で表される親水性基は、ポリオキシエチレンの繰り返し単位を有する。ｎの値が小さすぎると、式（１）で表される化合物は両親媒性の性質を有することができず、ベシクルを形成することができない。また、ｍの値が多すぎても、式（１）で表される化合物が脂質二重膜を形成することができず、小胞を形成する代わりにミセルを形成する。このため、ｍは２～４３である。好ましくは、ｍは１１～１３である。ｎは１～３であり、好ましくはｎは２である。式（２）で表される親水性基におけるｎが２の場合、以下の式（２ａ）となる。

【0028】

【化10】

【0029】

（式中、ｍは２～４３の整数である。）
（２）で表される親水性基の分子量は好ましくは１００～１８００であり、より好ましくは２００～１５００である。式（１）で表される化合物のＸが式（２）で表される親水性基である場合、式（１）で表される化合物の分子量は好ましくは４８０～２２００であり、より好ましくは４８０～１９００である。

【0030】

式（３）で表される親水性基は、ラクトースの構成単位のグルコースの１位にアミノ基を介してアルキレンが結合している。ｎは１～３であり、好ましくはｎは２である。式（３）で表される親水性基におけるｎが２の場合、以下の式（３ａ）となる。

【0031】

【化11】

【0032】

ベシクル中の両親媒性分子における式（１）で表される化合物の割合が特に限定されないが、ベシクル形成の容易さの点から、質量で５０質量％以上であることが好ましく、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、９０質量％以上、または１００質量％であってよい。また、モル分率で５０ｍｏｌ％以上であることが好ましく、６０ｍｏｌ％以上、７０ｍｏｌ％以上、８０ｍｏｌ％以上、９０ｍｏｌ％以上、または１００ｍｏｌ％であってよい。

【0033】

ベシクル中の両親媒性分子における式（１）で表される化合物は、１種類であってもよいし、２種類以上の式（１）で表される化合物の組み合わせであってもよい。

【0034】

ベシクルは、構造が壊れない限り、形成助剤、安定化剤、バインダー等の他の成分を含んでもよい。

【0035】

形成助剤としては、特に限定されず、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ステロール類、ポリオキシアルキレンステロール類、ステロール類の脂肪酸エステル、脂肪酸、ポリオキシアルキリレン硬化ひまし油、ポリオキシアルキレンひまし油などが挙げられる。

【0036】

安定化剤としては、アクリル系高分子、ビニル系高分子、ポリオキシアルキレン等の合成高分子、セルロース誘導体、加工澱粉、リグニン誘導体等の半合成高分子、天然高分子等が挙げられる。安定化剤は主に水に添加され、粘性等を高めることで、分散媒体中のベシクル及びマイクロカプセルの保存安定性を向上させる効果がある。

【0037】

本発明の実施形態のベシクルの粒径は特に限定されないが、例えば１００ｎｍ以上である。上限値は特に限定されないが、例えば１０００ｎｍ以下である。

【0038】

ベシクルの粒径は、透過型電子顕微鏡観察より、個々のベシクルの粒径を測定できる。また、市販のレーザー回折・動的光散乱式粒度分布測定装置を用いて、レーザー回折・動的光散乱法による粒度分布の測定値から、平均粒径としてベシクルの粒径を求めることもできる。

【0039】

本発明の実施形態の式（１）で表される化合物を含有する外殻を有する中空形状であるベシクルの製造方法について説明する。

【0040】

一つの実施形態では、式（１）で表される化合物は、公知の方法により製造することができる。例えば、Ｘが式（２）で表される親水性基である式（１）で表される化合物は、S. Asayama et al., Bioconjugate Chem. 2018, 29, 67に記載されているように、ＰＥＧ－ＮＨ₂及びクロロギ酸コレステリルをクロロホルム中で溶解させ、これにトリエチルアミンを加えて加熱して反応させ、精製することにより得られる。

【0041】

得られた式（１）で表される化合物の水溶液を室温で調製するのみで、簡便にベシクルを形成させることができる。この時、ベシクルの中空部（内水相）への物質の包摂には、超音波処理を施す。

【0042】

別の実施形態では、Ｘが式（３）で表される親水性基である式（１）で表される化合物は、ラクトースのＤＭＦ溶液と、クロロギ酸コレステリルとアルキレンジアミン（例えばエチレンジアミン）を反応させた化合物（ＥｔｄＮＨ₂－Ｃｈｏｌ）のＤＭＦ溶液を混合し、１日間室温でインキュベートし、次にこの混合液にＮａＢＨ₃ＣＮのＤＭＦ溶液を加えて、５日間室温でインキュベート後、透析する製造方法により得られる。

【0043】

次に、式（１）で表される化合物を用いて、上記透析後の透析膜内の溶液を超音波処理することで、ベシクルを水溶液中で調製する。超音波処理は、出力５０～２００Ｗ、周波数１０～１００ＫＨｚ、温度４～５０℃、時間１分～３時間で行い、上述の化合物を使用し、５．４×１０^-3 ｍｇ／ｍＬ～１．８×１０^-1 ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で行うことができる。

【0044】

本発明の実施形態のベシクルは、物質を内包するための担体として使用することができる。なお、本明細書において、物質の「内包」は、物質のベシクルの内水相中への物質の組み込み、物質の式（１）で表される化合物により形成された外殻への組み込み、および物質の外殻への結合を包含する。

【0045】

本発明の実施形態のベシクルは、疎水性部分がコレステロールに由来するため、疎水性部分がアルキル鎖であるリポソームと比較して、構造安定性が高い。また、本発明の実施形態のベシクルは、式（１）で表される化合物を単純に水中で混合して、超音波処理するのみで、化合物の二分子膜で形成された１枚膜と考えられるベシクルが形成される点で、調製が簡易で好ましい。

【0046】

本発明の実施形態のベシクルは、特に中空部（内水相）に多量の物質（例えば薬物など）を内包できるため、薬物送達（ドラッグデリバリー）、化粧品、医薬品、香料、農薬、インク等、広い分野に応用することができる。物質としては、薬物、蛍光分子、ペプチド、金属（金属単体及び金属化合物のイオンを含む）タンパク質などが挙げられる。また、中空部を区画形成する外殻の疎水部に疎水性の物質を、外殻の親水部には親水性の物質を取り込み又は結合させることもできる。

【0047】

本発明の実施形態の物質内包システムは、上述のベシクルと、該ベシクルに内包された物質とを含む。物質としては薬物、蛍光分子、ペプチド、金属（金属単体及び金属化合物のイオンを含む）タンパク質などが挙げられる。

【0048】

本発明の実施形態の物質内包システムは、上述のベシクルと、該ベシクルに内包された薬物とを含む薬物送達システムであってよい。

【0049】

上記薬物送達システムにおいて、（１）で表される化合物は、下記式（４）で表される化合物であり、薬物がインスリンであってもよい。このような薬物送達システムは、アミロイドβの凝集の抑制のための又は凝集したアミロイドβのリフォールディングを促進するための薬物送達システムとして使用することができる。

【0050】

【化12】

【0051】

（式中、ｍは２～４３の整数である。）
上記薬物送達システムにおいて、式（１）で表される化合物は、下記式（５）で表される化合物であり、薬物が亜鉛であってもよい。このような薬物送達システムは、肝細胞を標的とする薬物送達システムとして使用することができ、DDSキャリアのプラットフォームになり得ると期待される。

【0052】

【化13】

【0053】

本発明の実施形態は、以下の式（５）で表される化合物を包含する。

【0054】

【化14】

【0055】

上述したように、式（５）で表される化合物は、本発明の実施形態のベシクルの製造に使用することができる。かかる式（５）で表される化合物を使用して製造されたベシクルは、疎水性部分がアルキル鎖であるリポソームと比較して、構造安定性が高い。

【0056】

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【実施例0057】

実施例１ Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ ₅₀₀ の合成
S. Asayama et al., Bioconjugate Chem. 2018, 29, 67に記載されているように、ＰＥＧ－ＮＨ２（ＰＥＧの分子量：５００）６６．８１ｍｇ（０．０１４９９ｍｏｌ）をクロロフォルム１０ｍＬに溶解させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ） ４μＬ、及びクロロぎ酸コレステリル １２９．４９ｍｇ（０．２８８８４ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら４０℃で２４時間反応させた。反応後の生成物に蒸留水を加えてＴＥＡを分離し、蒸留及びろ過により精製し、コレステリル末端修飾ＰＥＧ（分子量９１３、以後Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀で示す）（収率約５０％）を得た。合成が完了したことは¹Ｈ－ＮＭＲ測定により確認した。

【0058】

同様に、ＰＥＧ－ＮＨ２（ＰＥＧの分子量：５００）の代わりにＰＥＧ－ＮＨ２（ＰＥＧの分子量：２０００）を用いて、上記の製造方法により、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀を得た。

【0059】

【化15】

【0060】

実施例２ Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ ₅₀₀ の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の測定
E.D. Goddard, et al, Langmuir. 1985, 1,3,352-355に記載された方法に従って、ピレンによる蛍光プローブ法にてＣｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀のＣＭＣ測定を行った。図１のスペクトルの第一ピークおよび第三ピークをＩ₁およびＩ₃と表記し、プロットした濃度ごとのＩ₁／Ｉ₃の値からＣＭＣは０．１１～１１ｍＭと非常に低濃度であることが示された（図２）。

【0061】

実施例３ 粒径の測定
動的光散乱によりＣｈｏｌ－ＰＥＧ_500、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀のそれぞれのＣＭＣ以上の濃度での粒径を測定した。Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀は平均粒径が約５００ｎｍと非常に大きな値を示し（図３（Ａ）、左グラフ）、ベシクルを形成していることが示唆された（図３（Ｂ）。一方、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀は平均粒径は約１０－２０ｎｍを示し（図３（Ａ）、右グラフ）、ミセルを形成していることが示唆された（図３（Ｃ））。

【0062】

実施例４ 透過型電子顕微鏡観察
ベシクル形成を確認するために透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を行った。Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ_500、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀を２．９０ｍＭで調整し、直前に１／１００希釈した．そのサンプルをグリット上に２μＬ添加し、２晩自然乾燥させた。その後、染色剤（２％酢酸ウラニル）を２μＬ添加してろ紙で吸い取った。加速電圧は１２０ｋＶにて観察を行った。通常のプロトコルではグリッド上にサンプルをのせた直後に２％酢酸ウラニルを添加するが、今回はベシクル形成が予想されることから、染色時の操作で構造が壊れないように自然乾燥する系を用いた。Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀はＤＬＳ測定結果（図３（Ａ））と一致するような粒径が観察され、ベシクルが形成していることが示された（図４（Ａ））。一方、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀はＣＭＣ以下であったため、粒子は観察されなかった（図４（Ｂ））。

【0063】

実施例５ ベシクルによるインスリンの内包
インスリン５０μｇ (１０ｍｇ／ｍＬ インスリン in ２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ, ｐＨ８．２)とＣｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀ ７．９６μｇ (１当量)、１５．９２μｇ (２当量)、３９．８０μｇ (５当量)、７９．６０μｇ (１０当量)、１５９．２μｇ(２０当量)、２３８．８０μｇ (３０当量)、３１８．４０μｇ (４０当量)、３９８．００μｇ (５０当量)をｐＨ７．４ ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で全量１２５μＬにし、超音波処理(１１０Ｗ、４０ｋＨｚ)を５分間行った。ゲル濃度８％のゲルを作成し、２０ｍＡで４５分間電気泳動を行った。電気泳動後、固定液で振盪した後、ＣＢＢ染色液で３０分間染色した後にバンドの変化を確認した。

【0064】

Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を添加したサンプルではすべて、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を添加していないNaked insulinのサンプル（四角枠で囲んだ）に比べて、バンドが高分子量側へシフトしていることが確認された（図５（Ａ））。また、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀をインスリン１に対してモル比で３０当量添加したサンプル（右から３つ目のレーン）では大きく高分子量側へのバンドのシフトが確認された。このことから、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧベシクルへインスリンが内包されたと推察された。一方、同一条件で行ったＣｈｏｌ－ＰＥＧ₂₀₀₀とインスリンのゲル電気泳動結果は、いずれにおいてもバンドのシフトが確認されなかった（図５（Ｂ））。

【0065】

実施例６ インスリン内包ベシクルの透過型電子顕微鏡観察
Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀ベシクルにインスリンが内包されていることを確認するために、実施例５のゲル電気泳動で用いたサンプルと同一条件のものを、１／１００に希釈し、グリット上に２μＬ添加し、２晩自然乾燥させた。その後、染色剤（２％酢酸ウラニル）を2 μL添加してろ紙で吸い取った。加速電圧は１２０ｋＶにて、透過型電子顕微鏡観察にて観察した。図６（Ａ）に示されるように、インスリン単体では均一な粒径など示しておらず、フレキシブルな構造をとっていることが分かる。一方、図６（Ｂ）に示されるように、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を３０当量添加したサンプルでは、フレキシブルなnaked insulinは観察されず、直径数百ｎｍの粒子が観察された。このことから、すべてのインスリンがベシクルに内包されたことが確認された。

【0066】

実施例７ Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ ₅₀₀ ベシクルによるアミロイドβ凝集阻害
まず、アミロイドβタンパク質の製造元(ペプチド研究所)のプロトコルを参考に、マイクロプレート中でアミロイドβのリン酸カリウム緩衝液溶液を３７℃で４８時間インキュベートすることでアミロイドβの凝集操作を行った。その後、凝集したアミロイドβに対してモル比で１００等量のＣｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を添加し、３７℃で２４時間インキュベートした後、蛍光色素チオフラビン（ＴｈＴ）を加え、蛍光顕微鏡での観察を行った（Ｅｘ：４４２ｎｍ、Ｅｍ：４８５ｎｍ）。ＴｈＴは凝集したアミロイドβのβシートに特異的に結合し、蛍光強度が増大することが知られている。Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を添加していないサンプルの顕微鏡画像では緑色の点が観察され、凝集したアミロイドβの存在が確認された（図７（Ａ））。一方、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を１００当量添加した際の顕微鏡画像では緑色の蛍光はほとんど観察されなかった（図７（Ｂ））。

【0067】

これを定量化するためにマイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度（Ｅｘ：４４２ｎｍ、Ｅｍ：４８５ｎｍ）の測定を行ったところ、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀を１００当量添加したサンプルではアミロイドβ単体に比べて優位に蛍光強度が低下しており（図８）、凝集がリフォールドされたことが確認されました。

【0068】

Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ₅₀₀は、インスリンを内包するという薬物担体の効果のみならず、凝集したアミロイドβとの相互作用により凝集アミロイドβのリフォールディング効果も有し、２重の機能を有することが、成功裏に実証された。

【0069】

実施例８ Ｃｈｏｌ－Ｌａｃの合成
ラクトース（０．２５３ｍｍｏｌ）の２ｍＬ ＤＭＦ溶液と、ＥｔｄＮＨ₂－Ｃｈｏｌ（０．０７７ｍｍｏｌ）の２ｍＬ ＤＭＦ溶液とを混合し、１日間室温でインキュベートした。次にこの混合液にＮａＢＨ₃ＣＮ（０．０７４ｍｍｏｌ）の１ｍＬ ＤＭＦ溶液を加え、５日間室温でインキュベートし、その後透析し、Ｃｈｏｌ－Ｌａｃを得た。透析後、透析膜内の溶液を超音波処理することで、ベシクルを形成した。

【0070】

【化16】

【0071】

実施例９ Ｃｈｏｌ－Ｌａｃのベシクル形成の確認
実施例２と同様に、ピレンを用いて蛍光測定を行った。Ｃｈｏｌ－Ｌａｃ溶液の濃度を変えてピレンの蛍光強度を測定すると図９（Ａ）のスペクトルが得られた。このスペクトルの第一ピークおよび第三ピークをＩ₁およびＩ₃と表記し、Ｉ₁／Ｉ₃の強度比を縦軸、Ｌｏｇ（濃度）を横軸にとると図９（Ｂ）の図が得られた。濃度が５．４×１０^－3ｍｇ／ｍＬ以上の時に強度比が低下した。強度比の低下は一般的にピレンが疎水場に取り込まれた状態を表していると言われる。よって、この実験から一定の濃度以上でＣｈｏｌ－Ｌａｃが疎水場を有する集合体を形成していることが示唆された。

【0072】

次に、ＤＬＳ測定を行った。ピレンの実験結果から疎水場を有する集合体の形成濃度ではＣｈｏｌ－Ｌａｃベシクルの粒径が１５０ｎｍ以下であった（図１０）。この値は、ＤＤＳのキャリアとして適切な大きさだと言える。今後、評価する実験におけるＣｈｏｌ－Ｌａｃベシクルの濃度を５．４×１０^－2ｍｇ／ｍＬとした。

【0073】

さらに、ＴＥＭ測定を行った。グリッドの調製を行い、２日間乾燥させた後、酢酸ウラニウムで染色した。観察画像は図１１に示す通りである。この図からＣｈｏｌ－Ｌａｃが球状であることが示され、ここまでの実験でＣｈｏｌ－Ｌａｃが球状のベシクルかミセルを形成していることが示唆された。

【0074】

最後に、ベシクルかミセルかを決定するために、１．５時間超音波処理することでＣｈｏｌ－Ｌａｃへの親水性の蛍光試薬であるＡｃｉｄ Ｒｅｄ５２の内包を試み、調製した溶液を４日間透析後、共焦点顕微鏡で観察した。その結果、内部に蛍光が見られた（図１２（Ａ），（Ｂ））。よって、親水性の試薬を内部に保持したことからＣｈｏｌ－Ｌａｃが内水層を持ち、ベシクル構造を形成することが裏付けられた。

【0075】

【化17】

【0076】

実施例１０ Ｚｎ ²⁺ デリバリーシステムのためのＺｎ ²⁺ 内包細胞ターゲティングベシクルの調製
亜鉛は生理活性必須微量元素の1つであり、体内において多くの機能を有し、その一つに、肝臓におけるインスリン分解抑制機能がある。糖尿病患者では健常者と比べ、すい臓から亜鉛イオンの分泌がうまく行われず肝臓において亜鉛不足となり、インスリンが必要以上に分解される（図１３）。そこで、直接、肝臓に亜鉛イオンをデリバリーすることが出来れば、新たな糖尿病治療となると考えられる。

【0077】

そこで、実施例９で合成したＣｈｏｌ－Ｌａｃを用いて、亜鉛イオン（Ｚｎ²⁺）を肝臓にデリバリーするためのキャリアの開発を試みた。Ｃｈｏｌ－Ｌａｃ分子のラクトース末端のβガラクトースと、肝臓のアシアロ糖タンパク質レセプターとが特異的に作用し、肝臓に効率的に亜鉛イオンをデリバリーすることを目指した。

【0078】

Ｃｈｏｌ－ＬａｃへのＺｎイオン内包は、Ｃｈｏｌ－Ｌａｃ溶液（濃度５．４×１０^－2ｍｇ／ｍＬ）と塩化亜鉛水溶液を１．５時間超音波処理後、内包されていない亜鉛イオンを透析（分画分子量＝１０００）により除去した。透析後、透析膜内の溶液を原子吸光測定を行った結果を表１に示す。Ｃｈｏｌ－Ｌａｃを混合した系では、亜鉛のみを溶解したコントロールを上回る吸光度が得られた。

【0079】

【表1】

【0080】

実施例１１ Ｚｎ ²⁺ 内包ベシクルのＴＥＭ観察
ＴＥＭ画像により、実施例１０で得られたＣｈｏｌ－Ｌａｃによる亜鉛イオン（Ｚｎ²⁺）の内包を可視的に確認した。親水化処理したグリッドに３．０μＬのサンプルを添加し、２日間自然乾燥させ、２日後に酢酸ウラニル２．０μＬ添加させ、３秒後ろ紙で酢酸ウラニルを取り除き、ＴＥＭ観察した。亜鉛イオンを内包したＣｈｏｌ－Ｌａｃ（図１４（Ｂ））では亜鉛イオンを内包していないＣｈｏｌ－Ｌａｃ（図１４（Ａ））に比べて内部が染色されていた。また、塩化亜鉛溶液のみのコントロール（図１４（Ｃ））よりも大きな粒径であることから、Ｃｈｏｌ－Ｌａｃに亜鉛イオンが内包していることが示唆された。

【0081】

Ｚｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃは、水中、４℃で１か月粒径の変化がないことから経時安定性があることが分かった（図１５（Ａ））。またＺｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃは、血清タンパク質中で濁度を示さないことから、血清安定性も有することがわかった（図１５（Ｂ））。

【0082】

実施例１２ 細胞実験
本研究では、肝臓をターゲットとしているため、人の肝臓モデル細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いて細胞実験を行った。まず、細胞毒性をアラマーブルーアッセイという方法で評価した。詳細には、ＨｅｐＧ２細胞を１ウェルに１．０×１０⁴ 個の濃度でマイクロプレートに播いて３７℃、２４時間インキュベートした（５％ＣＯ₂インキュベーター内）。次に、１ウェル当たり５０μLのサンプル（生理食塩水、Ｃｈｏｌ－ＬａｃベシクルまたはＺｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃベシクル:溶媒は生理食塩水）を加えて、引き続き、２４時間インキューべートし、生理食塩水で洗浄後、１００μＬのアラマーブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）を加えて２時間インキュベートした。その後、８０μＬ分をブラックプレートに移し、マイクロプレートリーダーにより、蛍光を測定した(Ｅｘ. ５５０ｎｍ，Ｅｍ．５９５ｎｍ)。

【0083】

結果を図１６に示す。生理食塩水のみを加えたコントロール（細胞生存率１００％）に比べて、Ｃｈｏｌ－ＬａｃベシクルおよびＺｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃベシクルは共に細胞生存率が８５％以上を示し、細胞毒性が低いことが示された。

【0084】

実施例１３ Ｚｎ ²⁺ 内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃによる細胞内への亜鉛イオンの取り込みの増強
次に細胞内に取り込まれたＺｎ²⁺イオンを蛍光プローブ法を用いて評価した。蛍光試薬としてＺｎＡＦ－２ＤＡを用いた。この試薬は、亜鉛イオンと反応することで緑色の蛍光を示す。詳細には、８ウェルスライドガラスに、HepG2細胞を１．５×１０⁵個播種し、３７℃、２４時間インキュベートした（５％ＣＯ₂インキュベーター内）。各ウェルに培地７５μL、サンプル（Ｚｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃベシクル）７５μLずつ添加し、３７℃、２４時間インキュベートした（５％ＣＯ₂インキュベーター内）。培地を取り除き、生理食塩水で２回洗浄後、各ウェルに、５μＭ ＺｎＡＦ－２ＤＡを１５０μＬ加えて、３７℃、２時間インキュベートした（５％ＣＯ₂インキュベーター内）。ＺｎＡＦ－２ＤＡを取り除き、生理食塩水で２回洗浄後、各ウェルにＤＡＰＩ（１／１００００）１００μＬ加え、遮光した状態で３０分インキュベートした。ＤＡＰＩを取り除き、生理食塩水で、２回洗浄した。スライドガラスの仕切りを外し、各ウェルに５０％グリセロール２００μＬのピペッターで１滴加え、カバーガラスを付けた。その後、共焦点レーザー走査型顕微鏡によって細胞を観察した。

【0085】

その結果、図１７（Ｂ），（Ｄ）に示すように、亜鉛イオン内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃを添加した細胞では、図１７（Ａ），（Ｃ）の細胞のみのコントロールに比べ、より強い緑色の蛍光が見られた。よって、Ｃｈｏｌ－Ｌａｃベシクルから亜鉛イオンがリリースされ細胞内に取り込まれていることが確認された。

【0086】

【化18】

【0087】

実施例１４ 細胞内へのＺｎイオンの取り込みへのアシアロ糖レセプターの関与
ＨｅｐＧ２細胞またはＣ２Ｃ１２細胞を１ウェルに５．０×１０⁵個の濃度でマイクロプレートに播いて３７℃、２４時間インキュベートした（５％ＣＯ₂インキュベーター内）。培地を取り除き、１ウェル当たり新たに培地２５０μＬと２２０μLのサンプル（Ｚｎ²⁺またはＺｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃベシクル）を加えて、３７℃、２４時間インキュベートした（５％ＣＯ₂インキュベーター内）。培地を取り除き、生理食塩水で２回洗浄し、各ウェルに２％TritonX-100溶液４５０μＬを添加した。一晩インキュベートした後、この溶液をマイクロチューブに移し、精製水９００μＬと１Ｍ ＨＣＬ １５０μＬを加え、１．５ｍＬの細胞溶解液を調製し、細胞内に取り込まれた亜鉛イオンを原子吸光分析で定量評価した。

【0088】

結果を図１８（Ａ）に示す。Ｚｎ²⁺単体を加えたものに比べてＺｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃを用いた系では、ＨｅｐＧ２細胞およびＣ２Ｃ１２細胞のいずれの細胞でも高いＺｎ取り込み量が得られた。また、肝臓のアシアロ糖タンパク異質を有しないＣ２Ｃ１２細胞に比べてＨｅｐＧ２細胞ではＺｎ²⁺取り込み量が増大したことから、肝臓のレセプターを介して効率的に亜鉛をデリバリーできることが示唆された。

【0089】

さらに、レセプターを介した取り込みであることを評価するためアシアロフェツイン（Asialofetuin）試薬を用いて阻害実験を行った。上記の試験で、１ウェル当たり２２０μＬのサンプル（Ｚｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃベシクル）を加えて、３７℃、２４時間インキュベート（５％ＣＯ₂インキュベーター内）する代わりに、２６０μＬのサンプルの中に、各種濃度のアシアロフェツインを加え、４℃で４時間インキュベートした。

【0090】

添加したアシアロフェツインは、細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに結合するため、レセプターを介した細胞へのＺｎ²⁺の取り込みを阻害する。アシアロフェツインを加えた系ではＺｎ²⁺の取り込み量が、アシアロフェツインの濃度依存的に、低下した（図１８（Ｂ））。よって、Ｚｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃはアシアロ糖レセプターを介して効率的に取り込まれていることが示唆された。

【0091】

以上より、本実施例で合成したＣｈｏｌ－Ｌａｃがベシクル構造を形成し、ベシクル内に亜鉛を内包可能であり、Ｚｎ²⁺内包Ｃｈｏｌ－Ｌａｃベシクルが肝臓におけるアシアロ糖タンパク質レセプターを介して取り込まれることが示唆された。よって、Ｃｈｏｌ－Ｌａｃベシクルは、肝臓を標的する亜鉛イオンデリバリーキャリアとして糖尿病治療に期待できると考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】