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特開2023-165666アルカリ耐性が増加された免疫グロブリン結合蛋白質変異体およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023165666
(43)【公開日】2023-11-16
(54)【発明の名称】アルカリ耐性が増加された免疫グロブリン結合蛋白質変異体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20231109BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20231109BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20231109BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231109BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231109BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231109BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231109BHJP
C12N 11/12 20060101ALI20231109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C07K1/22
C07K14/195
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N11/12
【審査請求】有
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023076167
(22)【出願日】2023-05-02
(31)【優先権主張番号】10-2022-0054786
(32)【優先日】2022-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】517167247
【氏名又は名称】アミコージェン・インコーポレイテッド
【住所又は居所原語表記】１４－１０ ＷＯＲＡＳＡＮ－ＲＯ ９５０ ＢＥＯＮ－ＧＩＬ， ＭＵＮＳＡＮ－ＥＵＰ， ＪＩＮＪＵ－ＳＩ， ＧＹＥＯＮＧＳＡＮＧＮＡＭ－ＤＯ， ５２８４０， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】崔 守林
(72)【発明者】
【氏名】朴 昭英
(72)【発明者】
【氏名】朴 ▲ソ▼▲ラ▼
(72)【発明者】
【氏名】沈 餘援
【テーマコード（参考）】
4B033
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B033NA42
4B033NB03
4B033NB45
4B033NC03
4B033ND03
4B033NF02
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA30
4H045AA40
4H045BA61
4H045CA11
4H045EA65
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】アルカリ耐性が増加された免疫グロブリン結合蛋白質変異体およびその用途が提供。
【解決手段】本出願は、アルカリ耐性が増加された免疫グロブリン結合蛋白質変異体に関し、より詳しくは、免疫グロブリン結合蛋白質のＢ３ドメインの特定位置のアミノ酸が突然変異されて野生型に比べてアルカリ耐性が増進された免疫グロブリン結合蛋白質変異体およびその用途に関する。
【選択図】図５
【解決手段】本出願は、アルカリ耐性が増加された免疫グロブリン結合蛋白質変異体に関し、より詳しくは、免疫グロブリン結合蛋白質のＢ３ドメインの特定位置のアミノ酸が突然変異されて野生型に比べてアルカリ耐性が増進された免疫グロブリン結合蛋白質変異体およびその用途に関する。
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号４のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）から起算して、
２８番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、４３番目のアミノ酸であるリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、１３番目のアミノ酸であるチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、５１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、および６０番目のアミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）からなる群より選択された一つ以上が元来とは異なるアミノ酸で置換された、ポリペプチド。
２８番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、４３番目のアミノ酸であるリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、１３番目のアミノ酸であるチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、５１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、および６０番目のアミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）からなる群より選択された一つ以上が元来とは異なるアミノ酸で置換された、ポリペプチド。
【請求項2】
配列番号４のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）から起算して、下記の中から選択された一つ以上の置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド：
２８番目のアミノ酸（Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、またはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）で置換；
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換。
２８番目のアミノ酸（Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、またはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）で置換；
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換。
【請求項3】
配列番号４のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）から起算して、２８番目のアミノ酸（Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、またはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）で置換された、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項4】
下記の中から選択された一つ以上の置換を追加的に含む、請求項３に記載のポリペプチド：
配列番号４のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）から起算して、
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換。
配列番号４のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）から起算して、
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換。
【請求項5】
配列番号４のアミノ酸配列で、以下のアミノ酸変異を含む、請求項１に記載のポリペプチド：
Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｇ、Ｅ２８Ｌ、Ｅ２８Ｐ、Ｅ２８Ｗ、Ｅ２８Ｇ＋Ｙ１３Ｆ、Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｐ、Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｖ、Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｅ、Ｅ２８Ｌ、Ｅ２８Ｐ、Ｅ２８Ｗ、Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｅ、Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｔ、Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｆ、またはＹ１３Ｆ＋Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｐ。
Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｇ、Ｅ２８Ｌ、Ｅ２８Ｐ、Ｅ２８Ｗ、Ｅ２８Ｇ＋Ｙ１３Ｆ、Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｐ、Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｖ、Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｅ、Ｅ２８Ｌ、Ｅ２８Ｐ、Ｅ２８Ｗ、Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｅ、Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｔ、Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｆ、またはＹ１３Ｆ＋Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｐ。
【請求項6】
配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または４７のアミノ酸配列で表示される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項7】
蛋白質ＬのＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４、Ｃ、Ｗ、およびＭドメインからなる群より選択された一つ以上を追加的に含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項8】
配列番号４のポリペプチドと比較してアルカリ耐性が増加された、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項9】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含む、ポリペプチド多量体。
【請求項10】
配列番号４９のアミノ酸配列で表示される、請求項９に記載のポリペプチド多量体。
【請求項11】
蛋白質ＬのＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４、Ｃ、Ｗ、およびＭドメインからなる群より選択された一つ以上を追加的に含む、請求項９に記載のポリペプチド多量体。
【請求項12】
Ｂ３ドメインとして、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体を含む、蛋白質Ｌ変異体。
【請求項13】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチド、前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、または前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体をコーディングする、核酸分子。
【請求項14】
請求項１３に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載の核酸分子またはこれを含む組換えベクターを含む組換え細胞。
【請求項16】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチド、前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、または前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体が固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス。
【請求項17】
（１）請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチド、
（２）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（３）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、
（４）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体または蛋白質Ｌ変異体をコーディングする核酸分子、
（５）前記核酸分子を含む組換えベクター、
（６）前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞、および
（７）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体が固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
からなる群より選択された１種以上を含む、免疫グロブリン結合用組成物。
（２）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（３）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、
（４）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体または蛋白質Ｌ変異体をコーディングする核酸分子、
（５）前記核酸分子を含む組換えベクター、
（６）前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞、および
（７）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体が固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
からなる群より選択された１種以上を含む、免疫グロブリン結合用組成物。
【請求項18】
（ａ）請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチド、
（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、または
（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
を含む、免疫グロブリンの分離または精製用組成物。
（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、または
（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
を含む、免疫グロブリンの分離または精製用組成物。
【請求項19】
免疫グロブリンを含む試料に、（ａ）請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチド、（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、または（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックスを接触させて、前記免疫グロブリンを吸着させる段階を含む、免疫グロブリンの分離または精製方法。
【請求項20】
標的化合物を含む液状試料に、（ａ）請求項１乃至６のいずれか一項に記載のポリペプチド、（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、または（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックスを接触させて、前記標的化合物を吸着させる段階を含む、液体から一つ以上の標的化合物を分離または精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
アルカリ耐性が増加された免疫グロブリン結合蛋白質変異体に関し、より詳しくは、免疫グロブリン結合蛋白質のＢ３ドメインの特定位置のアミノ酸が突然変異されて野生型に比べてアルカリ耐性が増進された免疫グロブリン結合蛋白質変異体およびその用途が提供される。
【背景技術】
【0002】
モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、遺伝子操作された動物細胞の培養時、培地中に分泌され、細胞自体から分泌される多くの蛋白質と培地内の蛋白質とが混ざって非常に低濃度に存在するようになる。したがって、目的のモノクローナル抗体以外の不純物除去が抗体生産で重要な段階である。モノクローナル抗体分離精製工程は、培地からモノクローナル抗体だけを選択的に回収できる抗体親和性リガンド（ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｎｄ）を利用した親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）が主に使用されており、前記抗体親和性リガンドとして蛋白質Ａ、蛋白質Ｇ、蛋白質Ｌなどが使用されている。
【0003】
蛋白質Ａ、蛋白質Ｇ、蛋白質Ａ／Ｇ、蛋白質Ｌなどのような免疫グロブリン結合バクテリア蛋白質は、免疫蛋白質（抗体、抗体断片など）を精製、検出することに幅広く使用されている。これら免疫グロブリン結合蛋白質は、抗体上の認知部位、結合する抗体種類などにおいて互いに異なる抗体結合様相を有する。
【0004】
このうち、蛋白質Ｌは、バクテリアの一種であるペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ（フィネゴルディア・マグナ （Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）））から最初分離された蛋白質であり、軽鎖相互作用（Ｌ ｃｈａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を通じて免疫グロブリンに結合することが確認されて、蛋白質Ｌと命名された。免疫グロブリン（抗体）のＦｃ部位に結合する蛋白質Ａおよび蛋白質Ｇとは異なり、蛋白質Ｌは軽鎖（例えば、カッパ（ｋａｐｐａ））相互作用を通じて抗体に結合する。蛋白質Ｌは、抗体結合時に重鎖部分に影響を受けないため、蛋白質Ａおよび蛋白質Ｇと比較して、より広範囲な抗体種類に結合することができ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｆａｂ断片などのような抗体断片にも結合可能であるという利点を有する。
【0005】
一方、一般に、抗体精製後にレジンに残っている核酸、脂質、蛋白質、微生物のような多様な汚染物質を除去するための洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ－ｉｎ－ｐｌａｃｅ、ＣＩＰ）を実施する。この時、レジンの洗浄剤のうち最も広範囲に使用される物質がＮａＯＨである。しかし、蛋白質基盤の精製用レジンは、アルカリに弱いため、抗体精製により効果的に適用するために、アルカリ条件でも安定した免疫グロブリン結合蛋白質の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】大韓民国登録特許第１０－１８５７９５３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本出願では、アルカリ耐性が増加された免疫グロブリン結合蛋白質変異体およびその用途が提供される。前記免疫グロブリン結合蛋白質変異体は、蛋白質Ｌまたはその機能的一部（例、Ｂ３ドメイン）の変異体であり得、野生型蛋白質または機能的一部に比べて、アルカリ耐性（アルカリ条件での免疫グロブリン結合能、安定性など）が改善（増加）されたことを特徴とする。
【0008】
より具体的に、本出願の一例は、蛋白質ＬのＢ３ドメインで（例えば、配列番号４のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）から起算する）、
【0009】
２８番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、４３番目のアミノ酸であるリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、１３番目のアミノ酸であるチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、５１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、および６０番目のアミノ酸であるアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）からなる群より選択された一つ以上が元来とは異なるアミノ酸で置換された、ポリペプチドを提供する。
【0010】
一例において、前記ポリペプチドは、蛋白質ＬのＢ３ドメインで（例えば、配列番号４のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）から起算する）、下記の中から選択された一つ以上の置換を含む、ポリペプチドであり得る。
【0011】
２８番目のアミノ酸（Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、またはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）で置換；
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および、
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および、
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換
【0012】
他の例は、前記ポリペプチドからなる繰り返し単位（単量体）を２個以上含むポリペプチド多量体を提供する。
【0013】
前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体は、蛋白質ＬのＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４、Ｃ、Ｗ、およびＭドメインからなる群より選択された一つ以上を追加的に含むことができる。
【0014】
他の例は、Ｂ３ドメインとして、前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを２個以上繰り返して含むポリペプチド多量体を含む、蛋白質Ｌ変異体を提供する。
【0015】
前述したポリペプチド、ポリペプチド多量体、および／または蛋白質Ｌ変異体は、野生型蛋白質ＬのＢ３ドメイン（例えば、配列番号４）またはこれを含む多量体または野生型蛋白質Ｌと比較して、アルカリ耐性（例えば、アルカリ条件での免疫グロブリン結合能、安定性など）に優れたものであり得る。
【0016】
他の例は、前述したポリペプチド、ポリペプチド多量体、および／または蛋白質Ｌ変異体をコーディングする核酸分子を提供する。
【0017】
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する、前記組換えベクターは、適切な宿主細胞で前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、および／または蛋白質Ｌ変異体を発現させるための発現ベクターとして使用することができる。
【0018】
他の例は、前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。前記組換え細胞は、宿主細胞が前記核酸分子または組換えベクターで形質転換されたものであり得、前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、および／または蛋白質Ｌ変異体の発現が可能な細胞であり得る。
【0019】
他の例は、前記ポリペプチド、前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、または前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、マトリックス（レジン）を提供する。前記マトリックスは、吸着により蛋白質を分離および／または精製する技術、例えば、クロマトグラフィーに使用するためのものであり得る。
【0020】
他の例は、
（１）前記ポリペプチド、
（２）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（３）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、
（４）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体または蛋白質Ｌ変異体をコーディングする核酸分子、
（５）前記核酸分子を含む組換えベクター、
（６）前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞、および
（７）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、マトリックス、
からなる群より選択された１種以上を含む、免疫グロブリン結合用組成物および／または免疫グロブリン分離および／または精製用組成物を提供する。
（１）前記ポリペプチド、
（２）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（３）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、
（４）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体または蛋白質Ｌ変異体をコーディングする核酸分子、
（５）前記核酸分子を含む組換えベクター、
（６）前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞、および
（７）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、マトリックス、
からなる群より選択された１種以上を含む、免疫グロブリン結合用組成物および／または免疫グロブリン分離および／または精製用組成物を提供する。
【0021】
他の例は、
（１）前記ポリペプチド、
（２）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（３）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、
（４）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体または蛋白質Ｌ変異体をコーディングする核酸分子、
（５）前記核酸分子を含む組換えベクター、
（６）前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞、および
（７）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、マトリックス、
からなる群より選択された１種以上の、免疫グロブリン結合、および／または免疫グロブリン分離および／または精製のための用途を提供する。
（１）前記ポリペプチド、
（２）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（３）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、
（４）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体または蛋白質Ｌ変異体をコーディングする核酸分子、
（５）前記核酸分子を含む組換えベクター、
（６）前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞、および
（７）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、マトリックス、
からなる群より選択された１種以上の、免疫グロブリン結合、および／または免疫グロブリン分離および／または精製のための用途を提供する。
【0022】
他の例は、
（ａ）前記ポリペプチド、
（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、および
（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
からなる群より選択された１種以上を含む、免疫グロブリンの分離および／または精製用組成物を提供する。
（ａ）前記ポリペプチド、
（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、および
（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
からなる群より選択された１種以上を含む、免疫グロブリンの分離および／または精製用組成物を提供する。
【0023】
他の例は、
（ａ）前記ポリペプチド、
（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、および
（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
からなる群より選択された１種以上の、免疫グロブリンの分離および／または精製のための用途を提供する。
（ａ）前記ポリペプチド、
（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、および
（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
からなる群より選択された１種以上の、免疫グロブリンの分離および／または精製のための用途を提供する。
【0024】
他の例は、免疫グロブリンを含む試料（例えば、液状試料）に、
（ａ）前記ポリペプチド、
（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、および
（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
からなる群より選択された１種以上を接触させて、前記免疫グロブリンを吸着させる段階を含む、免疫グロブリンの分離および／または精製方法を提供する。
（ａ）前記ポリペプチド、
（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、
（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、および
（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされた、クロマトグラフィー用マトリックス、
からなる群より選択された１種以上を接触させて、前記免疫グロブリンを吸着させる段階を含む、免疫グロブリンの分離および／または精製方法を提供する。
【0025】
他の例は、標的化合物を含む試料（例えば、液状試料）に、（ａ）前記ポリペプチド、（ｂ）前記ポリペプチドからなる繰り返し単位を２個以上含むポリペプチド多量体、（ｃ）前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をＢ３ドメインとして含む蛋白質Ｌ変異体、および（ｄ）前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、または蛋白質Ｌ変異体を含む複数のリガンドが固体支持体にカップリングされたクロマトグラフィー用マトリックスからなる群より選択された１種以上を接触させて、前記標的化合物を吸着させる段階を含む、液体から一つ以上の標的化合物を分離または精製する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0026】
本出願では、アルカリ耐性が増進された蛋白質Ｌ Ｂ３ドメイン変異体およびその用途が提供される。
【0027】
用語の定義
本明細書において、ポリヌクレオチド（「遺伝子または核酸分子」と混用され得る）またはポリペプチド（「蛋白質」と混用され得る）が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列から（必須で）なる」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列で表示される」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で含むことを意味し得、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能（免疫グロブリンの軽鎖と結合）および／または目的とする機能（例えば、野生型蛋白質Ｌ Ｂ３ドメインに比べて増加されたアルカリ耐性）を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、変形、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または前記変異を排除しないもの）と解釈され得る。
本明細書において、ポリヌクレオチド（「遺伝子または核酸分子」と混用され得る）またはポリペプチド（「蛋白質」と混用され得る）が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列から（必須で）なる」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列で表示される」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で含むことを意味し得、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能（免疫グロブリンの軽鎖と結合）および／または目的とする機能（例えば、野生型蛋白質Ｌ Ｂ３ドメインに比べて増加されたアルカリ耐性）を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、変形、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または前記変異を排除しないもの）と解釈され得る。
【0028】
一例において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」または「特定の核酸配列またはアミノ酸配列から（必須で）なるまたは表示される」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、
（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で含むまたはなるか、または
（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列からなるかこれを必須で含み、元来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味し得る。本明細書において、前記元来の機能は、野生型蛋白質Ｌ Ｂ３ドメインの免疫グロブリン（特に、軽鎖部位）結合能（アミノ酸配列の場合）または前記のような免疫グロブリン結合能を有する蛋白質をコードする機能（核酸配列の場合）であり得、前記目的とする機能は、野生型蛋白質Ｌ Ｂ３ドメインに比べて増加されたアルカリ耐性（アミノ酸配列の場合）または前記のような増加されたアルカリ耐性を有する蛋白質をコードする機能（核酸配列の場合）であり得る。
（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で含むまたはなるか、または
（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列からなるかこれを必須で含み、元来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味し得る。本明細書において、前記元来の機能は、野生型蛋白質Ｌ Ｂ３ドメインの免疫グロブリン（特に、軽鎖部位）結合能（アミノ酸配列の場合）または前記のような免疫グロブリン結合能を有する蛋白質をコードする機能（核酸配列の場合）であり得、前記目的とする機能は、野生型蛋白質Ｌ Ｂ３ドメインに比べて増加されたアルカリ耐性（アミノ酸配列の場合）または前記のような増加されたアルカリ耐性を有する蛋白質をコードする機能（核酸配列の場合）であり得る。
【0029】
本明細書で提供されるポリペプチドは、特定の配列番号として定義されたアミノ酸配列を含むか、またはその機能的変異体であり得る。前記「機能的変異体」は、増加されたｐＨ値の環境で前記ポリペプチドの向上した化学的安定性および／または免疫グロブリンに対する親和性（結合能）には影響を与えないアミノ酸位置で一つ以上の追加変異を含む全ての類似する配列を含む。
【0030】
本明細書において、用語「配列相同性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、与えられた核酸配列またはアミノ酸配列と一致する程度を意味し、百分率（％）で表示され得る。核酸配列に対する相同性の場合、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（参照：ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３， １９９３）またはＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３， １９９０）などを使用して決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
【0031】
本明細書において、「ポリペプチドのアミノ酸配列内の特定位置のアミノ酸残基」は、前記アミノ酸配列内の特定位置のアミノ酸残基または前記蛋白質と同一の活性を有する同種由来のアイソタイプ蛋白質および／または異種由来蛋白質で前記特定位置と対応する位置のアミノ酸残基を包括する意味に解釈され得る。
【0032】
本明細書で提供されるポリペプチドのアミノ酸配列のうち、Ｎ－末端の１番目の残基がメチオニン（Ｍ）である場合、前記メチオニンは、自然的状態で含まれているものであるか、または組換え過程で生成されたものであり得る。本明細書で提供されるポリペプチドが組換えで生産される場合、Ｎ－末端の１番目の残基であるメチオニン（Ｍ）および／またはＮ－末端に位置するシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を除いたアミノ酸配列を含むポリペプチドも本明細書の範囲に含まれる。また、蛋白質のアミノ酸配列のうち、Ｎ－末端の１番目の残基がメチオニンでない場合、前記蛋白質が組換え的に生産される場合に前記１番目の残基のＮ－末端にメチオニンが追加され得る。
【0033】
本明細書で使用されたアミノ酸位置は、特別な言及がない限り、Ｎ－末端の１番目のアミノ酸残基としてメチオニン（Ｍ）を含む組換え蛋白質の場合、前記メチオニンの次の２番目のアミノ酸から起算する。例えば、Ｎ－末端の１番目のアミノ酸としてメチオニン（Ｍ）を含む配列番号４のポリペプチドで、「２８番目のアミノ酸」とは、前記１番目のアミノ酸であるメチオニンの次の２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐ）を１番アミノ酸にして２８番目に位置するアミノ酸残基（つまり、配列番号４から２９番目のアミノ酸に該当する）を意味する。
【0034】
本明細書に使用されたアミノ酸の１文字（３文字）は、生化学分野での標準略語規定により、以下のアミノ酸を意味する：
Ａ（Ａｌａ）：アラニン；Ｃ（Ｃｙｓ）：システイン；Ｄ（Ａｓｐ）：アスパラギン酸；Ｅ（Ｇｌｕ）：グルタミン酸；Ｆ（Ｐｈｅ）：フェニルアラニン；Ｇ（Ｇｌｙ）：グリシン；Ｈ（Ｈｉｓ）：ヒスチジン；Ｉ（ＩＩｅ）：イソロイシン；Ｋ（Ｌｙｓ）：リシン；Ｌ（Ｌｅｕ）：ロイシン；Ｍ（Ｍｅｔ）：メチオニン；Ｎ（Ａｓｎ）：アスパラギン；Ｏ（Ｐｌｙ）ピロリシン；Ｐ（Ｐｒｏ）：プロリン；Ｑ（Ｇｌｎ）：グルタミン；Ｒ（Ａｒｇ）：アルギニン；Ｓ（Ｓｅｒ）：セリン；Ｔ（Ｔｈｒ）：トレオニン；Ｕ（Ｓｅｃ）：セレノシステイン、Ｖ（Ｖａｌ）：バリン；Ｗ（Ｔｒｐ）：トリプトファン；Ｙ（Ｔｙｒ）：チロシン。
Ａ（Ａｌａ）：アラニン；Ｃ（Ｃｙｓ）：システイン；Ｄ（Ａｓｐ）：アスパラギン酸；Ｅ（Ｇｌｕ）：グルタミン酸；Ｆ（Ｐｈｅ）：フェニルアラニン；Ｇ（Ｇｌｙ）：グリシン；Ｈ（Ｈｉｓ）：ヒスチジン；Ｉ（ＩＩｅ）：イソロイシン；Ｋ（Ｌｙｓ）：リシン；Ｌ（Ｌｅｕ）：ロイシン；Ｍ（Ｍｅｔ）：メチオニン；Ｎ（Ａｓｎ）：アスパラギン；Ｏ（Ｐｌｙ）ピロリシン；Ｐ（Ｐｒｏ）：プロリン；Ｑ（Ｇｌｎ）：グルタミン；Ｒ（Ａｒｇ）：アルギニン；Ｓ（Ｓｅｒ）：セリン；Ｔ（Ｔｈｒ）：トレオニン；Ｕ（Ｓｅｃ）：セレノシステイン、Ｖ（Ｖａｌ）：バリン；Ｗ（Ｔｒｐ）：トリプトファン；Ｙ（Ｔｙｒ）：チロシン。
【0035】
本明細書に表記される「（アミノ酸１文字）（アミノ酸位置）（アミノ酸１文字）」は、天然型ポリペプチドの当該アミノ酸位置で先に表記されたアミノ酸が後に表記されたアミノ酸で置換されることを意味する。例えば、Ｅ２８Ｇは、天然型ポリペプチドの２８番残基に該当するグルタミン酸（Ｅ）がグリシン（Ｇ）で置換されることを意味する。また後に表記されたアミノ酸で「斜線（／）」表示は「または」を意味し得る。例えば、Ｅ２８Ｇ／Ａは、天然型ポリペプチドの２８番残基に該当するグルタミン酸（Ｅ）がグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）で置換されることを意味し得る。
【0036】
本明細書において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、後に出る数値と同等または類似の範囲の数値を全て含むための表現であり、後に出る数値を基準に、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、±０．０５、または±０．０１範囲を含むものと解釈され得るが、これに制限されるのではない。
【0037】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【0038】
免疫グロブリン結合蛋白質変異体：蛋白質Ｌ Ｂ３ドメイン変異体、およびこれを含む多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、および蛋白質Ｌ変異体
本出願は、アルカリ耐性が増進された免疫グロブリン結合蛋白質変異体およびその用途が提供される。前記免疫グロブリン結合蛋白質変異体は、蛋白質Ｌまたはその機能的一部（例、Ｂ３ドメイン）の変異体であり得、野生型蛋白質または機能的一部に比べて、アルカリ耐性（アルカリ条件での免疫グロブリン結合能、安定性など）が改善（増加）されたことを特徴とする。
本出願は、アルカリ耐性が増進された免疫グロブリン結合蛋白質変異体およびその用途が提供される。前記免疫グロブリン結合蛋白質変異体は、蛋白質Ｌまたはその機能的一部（例、Ｂ３ドメイン）の変異体であり得、野生型蛋白質または機能的一部に比べて、アルカリ耐性（アルカリ条件での免疫グロブリン結合能、安定性など）が改善（増加）されたことを特徴とする。
【0039】
本出願の免疫グロブリン結合蛋白質は、バクテリアの一種であるペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ（フィネゴルディア・マグナ （Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）））から最初分離された蛋白質であり、軽鎖相互作用（Ｌ ｃｈａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を通じて免疫グロブリンに結合することが確認されて、蛋白質Ｌ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ）と命名された。ペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）由来の蛋白質Ｌ（例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＡ２５６１２．１）は、７１９個のアミノ酸残基からなり、分子量は９５ｋＤ（還元剤（２－メルカプトエタノール（２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ））存在下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定時）または７６ｋＤ（６Ｍ グアニジン塩酸塩（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ）存在下のゲルクロマトグラフィーで測定時）であり、酸性蛋白質である（ｐＩ４．０）。免疫グロブリン（抗体）のＦｃ部位に結合する蛋白質Ａおよび蛋白質Ｇとは異なり、蛋白質Ｌは軽鎖（例えば、ｋａｐｐａ）相互作用を通じて抗体に結合する。蛋白質Ｌは、抗体結合時に重鎖部分に影響を受けないため、蛋白質Ａおよび蛋白質Ｇと比較して、より広範囲な抗体種類に結合することができ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどを含む全てのサブタイプの抗体に結合することができ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｆａｂ断片などのような抗体断片にも結合可能である。
【0040】
このような免疫グロブリン軽鎖（ｋａｐｐａ）結合活性により、蛋白質Ｌは、カッパタイプ（ｋａｐｐａ ｔｙｐｅ）軽鎖（全部または一部）を含む抗体（全長または断片）の精製に有用に使用することができる。
【0041】
そこで、本出願の免疫グロブリン結合蛋白質変異体は、蛋白質Ｌ、特に蛋白質ＬのＢ３ドメインを基盤に改良されたものであり得る。前記蛋白質Ｌは、ペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）由来のものであり得、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＡ２５６１２．１（配列番号５０）のアミノ酸配列で表現されたり、前記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列を有して免疫グロブリン（特に、軽鎖部位）結合能を維持する蛋白質であり得るが、これに制限されるのではない。
【0042】
前記蛋白質ＬのＢ３ドメインは、ペプトストレプトコッカス・マグナス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）由来の蛋白質Ｌ（例えば、配列番号５０）のＢ３ドメインであり得、例えば、配列番号４のアミノ酸配列で表現されたり、前記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列を有して免疫グロブリン（特に、軽鎖部位）結合能を維持する蛋白質であり得るが、これに制限されるのではない。前記蛋白質ＬのＢ３ドメインは、配列番号３の核酸配列によりコーディングされるものであり得るが、これに制限されるのではない。
【0043】
前記Ｂ３ドメインの所定の位置にアミノ酸置換による変異を導入することによって、Ｂ３ドメイン、これを含む多量体および／または蛋白質Ｌの免疫グロブリン（特に、軽鎖部位）との結合能は維持しながらアルカリ耐性を増加させることができる。
【0044】
一例は、蛋白質ＬのＢ３ドメインにおいて（蛋白質ＬのＢ３ドメインを基準に）、２８番目のアミノ酸残基に該当するグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、４３番目のアミノ酸残基に該当するリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、１３番目のアミノ酸残基に該当するチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、５１番目のアミノ酸残基に該当するアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、および６０番目のアミノ酸残基に該当するアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）からなる群より選択された一つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個）が元来とは異なるアミノ酸で置換された、ポリペプチド（蛋白質ＬのＢ３ドメイン変異体）を提供する。
【0045】
前記他のアミノ酸は、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）、リシン（Ｋ、Ｌｙｓ）、およびグリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）からなる群より選択され、野生型蛋白質Ｌ Ｂ３ドメインの当該位置のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸であり得る。
【0046】
一具体例において、前記ポリペプチドは、蛋白質ＬのＢ３ドメインにおいて、下記の中から選択された一つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個）の置換を含むものであり得る：
２８番目のアミノ酸（Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、またはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）で置換；
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換。
２８番目のアミノ酸（Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、またはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）で置換；
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換。
【0047】
他の具体例において、前記ポリペプチドは、蛋白質ＬのＢ３ドメインにおいて、２８番目のアミノ酸（Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、またはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、例えば、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）で置換されたものであり得る。
【0048】
他の具体例において、前記ポリペプチドは、蛋白質ＬのＢ３ドメインにおいて、
２８番目のアミノ酸（Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、またはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、例えば、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）で置換され、
下記の中から選択された一つ以上の置換を追加的に含むものであり得る。
２８番目のアミノ酸（Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、またはトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、例えば、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）で置換され、
下記の中から選択された一つ以上の置換を追加的に含むものであり得る。
【0049】
配列番号４のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）から起算して、
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換。
４３番目のアミノ酸（Ｋ）がプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）で置換；
１３番目のアミノ酸（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換；
５１番目のアミノ酸（Ｄ）がバリン（Ｖａｌ、Ｖ）またはトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）で置換；および
６０番目のアミノ酸（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）で置換。
【0050】
例えば、前記ポリペプチドは、前記蛋白質ＬのＢ３ドメインにおいて、以下のアミノ酸変異を含むものであり得る。
【0051】
Ｅ２８Ｇ（２８番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がグリシン（Ｇ）で置換、本明細書での単一のアミノ酸置換は同一の方式で表示および解釈される）、Ｅ２８Ａ、Ｅ２８Ｌ、Ｅ２８Ｐ、Ｅ２８Ｗ、Ｅ２８Ｇ＋Ｙ１３Ｆ、Ｅ２８ Ｇ＋Ｋ４３Ｐ（２８番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がグリシン（Ｇ）で置換および４３番目のアミノ酸であるリシン（Ｋ）がプロリン（Ｐ）で置換、本明細書での多重のアミノ酸置換は同一の方式で表示および解釈される）、Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｖ、Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｅ、Ｅ２８Ｌ、Ｅ２８Ｐ、Ｅ２８Ｗ、Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｅ、Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｔ、Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｆ、またはＹ１３Ｆ＋Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｐ。
【0052】
前記蛋白質ＬのＢ３ドメイン（野生型）は、配列番号４のアミノ酸配列を含むものであり得る。
【0053】
本明細書に記載された蛋白質ＬのＢ３ドメインのアミノ酸位置は、配列番号４のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）から起算する。つまり、本明細書に記載された２８番目のアミノ酸（Ｅ）（Ｅ２８）は配列番号４の２９番目のアミノ酸に該当し、４３番目のアミノ酸（Ｋ）（Ｋ４３）は配列番号４の４４番目のアミノ酸に該当し、１３番目のアミノ酸（Ｙ）（Ｙ１３）は配列番号４の１４番目のアミノ酸に該当し、５１番目のアミノ酸（Ｄ）（Ｄ５１）は配列番号４の５２番目のアミノ酸に該当し、６０番目のアミノ酸（Ｎ）（Ｎ６０）は配列番号４の６１番目のアミノ酸に該当する。
【0054】
一具体例において、前記ポリペプチド（蛋白質Ｌ Ｂ３ドメイン変異体）は、配列番号４のアミノ酸配列を基準に、
Ｅ２８Ａ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号７）；
Ｅ２８Ｇ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号８）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｙ１３Ｆ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号９）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｐ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号１０）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｖ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号１１）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｅ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号１２）
Ｅ２８Ｌ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２３）；
Ｅ２８Ｐ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２４）；
Ｅ２８Ｗ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２５）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｅ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２６）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｔ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２７）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｆ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２８）；または
Ｙ１３Ｆ＋Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｐ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号４７）、
を含むものであり得る。
Ｅ２８Ａ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号７）；
Ｅ２８Ｇ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号８）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｙ１３Ｆ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号９）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｐ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号１０）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｖ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号１１）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｅ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号１２）
Ｅ２８Ｌ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２３）；
Ｅ２８Ｐ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２４）；
Ｅ２８Ｗ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２５）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｅ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２６）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｄ５１Ｔ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２７）；
Ｅ２８Ｇ＋Ｎ６０Ｆ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号２８）；または
Ｙ１３Ｆ＋Ｅ２８Ｇ＋Ｋ４３Ｐ変異が導入されて変形されたアミノ酸配列（配列番号４７）、
を含むものであり得る。
【0055】
前記ポリペプチド（蛋白質Ｌ Ｂ３ドメイン変異体）のアミノ酸配列を下記の表１に整理した。
【0056】
【表1】
【0057】
他の例は、前記ポリペプチドを繰り返し単位（単量体）で２個以上含むポリペプチド多量体を提供する。一具体例において、前記ポリペプチド多量体は、前述したポリペプチドを含む（またはなる）繰り返し単位を２個以上、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個含むものであり得る。例えば、前記ポリペプチド多量体は、配列番号４９（配列番号４７を連続して４個含む）で表現されるものであり得るが、これに制限されるのではない。
【0058】
他の例は、前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体を含む免疫グロブリン結合蛋白質を提供する。
【0059】
一例において、前記免疫グロブリン結合蛋白質は、前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体に加えて、蛋白質ＬのＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４、Ｃ、Ｗ、およびＭドメインからなる群より選択された一つ以上を追加的に含むものであり得る。
【0060】
他の例は、前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体を含む、蛋白質Ｌ変異体を提供する。
【0061】
本出願で提供されるポリペプチド（蛋白質Ｌ Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、および／または蛋白質Ｌ変異体は、野生型Ｂ３ドメイン（配列番号４）またはこれを含むポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、および／または蛋白質Ｌと比較して、アルカリ耐性が増加したものであり得る。例えば、本出願で提供されるポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、および／または蛋白質Ｌ変異体は、塩基条件（例えば、ｐＨ９以上、ｐＨ９．５以上、ｐＨ１０以上、ｐＨ１０．５以上、ｐＨ１１以上、ｐＨ１１．５以上、ｐＨ１２以上、ｐＨ１２．５以上、またはｐＨ１３以上；上限値はｐＨ１４であり得る）での免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ、３、またはＩｇＧ４））またはその軽鎖部位を含む断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）との結合能が、野生型Ｂ３ドメイン（配列番号４）またはこれを含むポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、および／または蛋白質Ｌと比較して、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、または約３０％以上増加したものであり得るが、これに制限されるのではない。特に、前記ポリペプチド多量体は、塩基条件での免疫グロブリンまたはその断片との結合能が、野生型Ｂ３ドメインに比べて、約１．５倍以上、約１．７倍以上、約２倍以上、約２．３倍以上、約２．５倍以上、または約２．７倍以上増加したものであり得るが、これに制限されるのではない。
【0062】
本明細書において、免疫グロブリンは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などに由来するものであり得、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどの多様なサブタイプから選択されたものであり得る。本出願で提供されるポリペプチド（蛋白質Ｌ Ｂ３ドメイン変異体）および／またはこれを含むポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、および／または蛋白質Ｌ変異体は、免疫グロブリンの軽鎖部位に結合するものであり得る。したがって、本出願で提供されるポリペプチド（蛋白質Ｌ Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、および／または蛋白質Ｌ変異体が結合可能な免疫グロブリンは、完全な形態または軽鎖を含む断片形態、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２などであり得るが、これに制限されるのではない。
【0063】
一例において、本出願で提供されるポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、および／または蛋白質Ｌ変異体は、非自然に発生（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）するものであり得、例えば、組換え的方法または化学的合成により生産されるものであり得るが、これに制限されるのではない。
【0064】
核酸分子、組換え発現ベクター、組換え細胞
他の例は、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体をコードする核酸分子を提供する。
他の例は、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体をコードする核酸分子を提供する。
【0065】
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは、適切な宿主細胞で前記核酸分子を蛋白質で発現させることができる発現ベクターであり得る。前記組換えベクターは、適切な宿主細胞で前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、および／または蛋白質Ｌ変異体を発現させるための発現ベクターとして使用され得る。
【0066】
他の例は、前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。前記組換え細胞は、適切な宿主細胞が前記核酸分子または組換えベクターが導入（形質転換）されたものであり得る。
【0067】
また、前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体は、遊離状態でなく固定化させた状態で使用され得る。前記固定化は、当業界に公知の通常の方法により製造が可能であり、固定化させるための担体として、繊維素、デンプン、デキストラン、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）などの天然ポリマー；ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ポリアクリレート（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）、ユーバージットＣ（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ）などの合成ポリマー；またはシリカ（ｓｉｌｉｃａ）、ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、金属のようなミネラルなどを使用することができる。また、これら担体に共有結合、イオン結合、疎水性結合、物理的吸着、マイクロカプセル化（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）などにより前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体を結合させることが可能である。また、これら担体－酵素結合体がグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、シアノゲンブロミド（ｃｙａｎｏｇｅｎ ｂｒｏｍｉｄｅ）などの作用により共有結合を形成することによって前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体を固定化させることも可能である。また、前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体を別に精製する必要なしに前記ポリペプチド、これを含むポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体を含有する微生物細胞をそのまま固定化して使用することも可能である。このような全細胞固定化（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）時に微生物に含有されている前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体の反応性を高めるために細胞エントラップメントまたは表面ディスプレイ（ｃｅｌｌ ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｏｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ）などの技術を適用することもできる。
【0068】
本明細書に記載された核酸配列は、コドンの縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体を発現させようとする微生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現する蛋白質のアミノ酸配列および／または機能を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われ得る。
【0069】
前記核酸分子またはベクターの導入は、公知の形質転換方法を当業者が適切に選択して行うことができる。本明細書において、用語「形質転換」は、標的蛋白質（外来蛋白質）をコードする核酸分子を含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記核酸分子がコードする蛋白質が発現することができるようにすることを意味する。形質転換された核酸分子は、宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入される、および／または染色体外に位置することができる。また、前記核酸分子は、標的蛋白質（前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体）をコーディングするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。前記核酸分子は、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、その導入される形態には制限がない。例えば、前記核酸分子は、独自的に発現するのに必要な全てのエレメントを含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入され得る。前記発現カセットは、通常前記核酸分子に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位および／または翻訳終結信号などの発現調節エレメントを含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であり得る。また、前記核酸分子は、それ自体の形態で宿主細胞の誘電体に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであり得る。前記で用語「作動可能に連結」されたものとは、発現調節エレメントが目的蛋白質（外来蛋白質）をコードする核酸分子の転写調節（例、転写開始）を行うことができるように発現調節エレメント（例、プロモーター）と核酸分子が機能的に連結されていることを意味し得る。作動可能な連結は、当業界における公知の遺伝子組換え技術を利用して行うことができ、例えば、通常の部位特異的ＤＮＡ切断および連結により行われ得るが、これに制限されない。
【0070】
前記核酸分子を宿主細胞に形質転換する方法は、核酸を細胞（微生物）内に導入する如何なる方法でも遂行可能であり、宿主細胞により当該分野で公知の形質転換技術を適切に選択して行うことができる。前記公知の形質転換方法として電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱法、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポゾーム法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法、熱ショク（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法、粒子銃衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、シリコン炭化物ウィスカー（Ｓｉｌｉｃｏｎ ｃａｒｂｉｄｅ ｗｈｉｓｋｅｒｓ）、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）などが例示され得るが、これに制限されるのではない。
【0071】
前記核酸分子の宿主細胞誘電体（染色体）内導入（挿入）は、公知の方法を当業者が適切に選択して行うことができ、例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼシステム（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍまたはＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ；例えば、（ａ）ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９蛋白質など）、そのコード遺伝子、または前記遺伝子を含むベクター；および（ｂ）ガイドＲＮＡ（例、ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）など）、そのコードＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含むベクターを含む混合物（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ蛋白質とガイドＲＮＡの混合物など）、複合体（例えば、リボ核酸融合蛋白質（ＲＮＰ））、組換えベクター（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼコード遺伝子およびガイドＲＮＡコードＤＮＡを共に含むベクターなど）などからなる群より選択された一つ以上）を使用して行うことができるが、これに制限されるのではない。
【0072】
本明細書において、用語「ベクター」は、適した宿主内で目的蛋白質を発現させることができるように適した調節配列に作動可能に連結された前記目的蛋白質をコードする核酸分子の塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主微生物内に形質転換された後、宿主微生物の遺伝体と関係なく発現したり、宿主微生物の遺伝体内に統合され得る。
【0073】
本明細書で使用可能なベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、通常使用される全てのベクターの中で選択され得る。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージなどが挙げられる。例えば、前記ベクターとして、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＣ系（例、ｐＢＣ－ＫＳ（＋））、ｐＢＲ系（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５）、ｐＵＣ系（例、ｐＵＣ１１８およびｐＵＣ１１９）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系（例、ｐＥＴ－２２ｂ（＋））、バチルスサブチリス由来プラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、レトロウイルス、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスのような動物ウイルス由来プラスミド、バキュロウイルスのような昆虫ウイルス由来プラスミドなどを使用することができるが、これに制限されない。
【0074】
前記宿主細胞は、通常使用される全ての種類の単細胞有機体、例えば各種バクテリア（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ属など）などの原核細胞微生物および酵母などの真核細胞微生物からなる群より選択されたものであり得、例えば、クローストリディア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）属微生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）など）などからなる群より択されたものであり得るが、これに制限されるのではない。
【0075】
本明細書で使用可能なベクターは、公知の発現ベクターおよび／または核酸分子の宿主細胞染色体内挿入用ベクターであり得る。前記核酸分子の宿主細胞染色体内挿入は、当業界に知られた任意の方法、例えば、相同組換えまたはＣＲＩＳＰＲシステムにより行われ得るが、これに限定されない。前記ベクターは、前記染色体内挿入の有無を確認するための選別マーカ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むことができる。前記選別マーカは、ベクターで形質転換された細胞を選別、つまり、前記ポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面蛋白質の発現のような選択可能表現型を付与する遺伝子の中で選択して使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では選別マーカを発現する細胞だけが生存したり他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【0076】
他の例は、前記核酸分子を適切な宿主細胞で発現させる段階を含む、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体の製造方法を提供する。前記製造方法は、前述した組換え細胞を培養する段階を含むことができ、任意に前記培養物から前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体を分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
【0077】
Ｂ３ドメイン変異体を含むマトリックス（レジン）
他の例は、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体が固体支持体にカップリングされたマトリックス（レジン）を提供する。前記マトリックスは、吸着により蛋白質を分離および／または精製する技術、例えば、（親和性）クロマトグラフィーに使用するためのクロマトグラフィー用マトリックスであり得るが、これに制限されるのではない。
他の例は、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体が固体支持体にカップリングされたマトリックス（レジン）を提供する。前記マトリックスは、吸着により蛋白質を分離および／または精製する技術、例えば、（親和性）クロマトグラフィーに使用するためのクロマトグラフィー用マトリックスであり得るが、これに制限されるのではない。
【0078】
前記マトリックスで、前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体は、固体支持体に結合（カップリング）されるリガンドとして使用し、２個以上の複数個で使用することができる。一具体例において、前記クロマトグラフィー用マトリックスは、複数個のポリペプチド多量体が固体支持体にカップリングされたものであり得るが、これに制限されるのではない。
【0079】
前記固体支持体は、ポリペプチドをカップリングさせることができる全ての適した公知の種類のもの、例えば、通常の親和性分離マトリックスに使用される固体支持体から適切に選択され得る。例えば、前記固体支持体は、有機または無機物質であり得る。
【0080】
一例において、前記固体支持体は、有機物質であり得、水性媒質に親水性表面を露出させる、および／または内部表面上にヒドロキシ（－ＯＨ）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、カルボキシアミド（－ＣＯＮＨ２、おそらくＮ－置換された形態で）、アミノ（－ＮＨ２、おそらく置換された形態で）、オリゴ－またはポリエチレンオキシ基を露出させるポリマーを基剤とするものであり得る。前記ポリマーは、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロースなどの多糖類、例えば、ビスエポキシド、エピハロヒドリン、または１，２，３－トリハロ置換された低級炭化水素と共に架橋結合された多糖類を基剤として、適した多孔性および強度を提供するものであり得る。一具体例において、前記固体支持体は、多孔性アガロースビーズであり得るが、これに制限されるのではない。本明細書で使用された固体支持体は、逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）懸濁液ゼラチン化など標準的方法により製造されたり（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ： Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９ （２）， ３９３－３９８ （１９６４））、市販される製品、例えばセファロース（商標）ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ所在）などを使用することができるが、これに制限されるのではない。
【0081】
他の例で、前記固体支持体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどの合成ポリマーを基剤とすることができる。ジビニルおよびモノビニル－置換されたベンゼンを基剤としたマトリックスのような疎水性ポリマーの場合には、マトリックス表面が時々親水性化されて、囲んだ水性液体で前記のような親水性基を露出させることがある。前記ポリマーは、標準的方法により製造したり（「Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」， Ｒ． Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅＬ´Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０ （９）， ７０－７５ （１９８８））、市販される製品、例えばソース（Ｓｏｕｒｃｅ、商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ所在）などを使用することができるが、これに制限されるのではない。
【0082】
また他の例で、前記固体支持体は、シリカ、酸化ジルコニウムなどの無機性質の支持体を含むことができ、または固体支持体が表面、チップ、毛細管またはフィルターなどの他の形態であり得る。
【0083】
一例において、前記マトリックスは、多孔性モノリス（ｍｏｎｏｌｉｔｈ）の形態であるか、多孔性または非多孔性のビーズまたは粒子形態であり得る。ビーズまたは粒子型マトリックスが充填されたベッドとしてまたは懸濁された形態で使用され得る。懸濁された形態は、拡張されたベッドおよび純粋な懸濁液と知られたものなどを含み、そのうち、粒子またはビーズは自由に動くことができる。モノリス、充填されたベッドおよび拡張されたベッドの場合、分離過程は濃度勾配を通じた通常のクロマトグラフィー以降にすることが一般的である。
【0084】
前記リガンド（前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、または蛋白質Ｌ変異体）は、例えばリガンドに存在するアミノ基および（または）カルボキシ基を使用する通常のカップリング技術を通じて支持体に付着され得る。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などはよく知られたカップリング剤である。支持体とリガンドとの間に、スペーサとして知られた分子を導入することができ、これはリガンドの活用度を向上させ、リガンドの支持体としての化学的カップリングを容易にする。これとは異なり、リガンドは、物理的吸着または生物特異な吸着などの非共有結合により支持体に付着され得る。
【0085】
本明細書で提供されるマトリックスは、親和性クロマトグラフィーに使用される既存の蛋白質Ｌを含むマトリックスと比較して、塩基条件（例えば、ｐＨ９以上、ｐＨ９．５以上、ｐＨ１０以上、ｐＨ１０．５以上、ｐＨ１１以上、ｐＨ１１．５以上、ｐＨ１２以上、ｐＨ１２．５以上、またはｐＨ１３以上）；より具体的に、アルカリ溶液（例えば、０．３Ｍ ＮａＯＨ溶液、約ｐＨ１３．４８）を使用した洗浄を１乃至２０回（例えば、１５回遂行時）での免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ、３、またはＩｇＧ４））またはその軽鎖部位を含む断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）との結合能が約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、または約３０％以上増加したものであり得るが、これに制限されるのではない。
【0086】
免疫グロブリン結合、分離、精製用途
本明細書で提供されるポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、蛋白質Ｌ変異体、および／またはクロマトグラフィー用マトリックスに一つ以上の標的化合物（例えば、免疫グロブリンのような蛋白質など）が吸着されることによって液体から分離および／または精製され得る。
本明細書で提供されるポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、蛋白質Ｌ変異体、および／またはクロマトグラフィー用マトリックスに一つ以上の標的化合物（例えば、免疫グロブリンのような蛋白質など）が吸着されることによって液体から分離および／または精製され得る。
【0087】
そこで、他の例は、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、蛋白質Ｌ変異体、および／またはクロマトグラフィー用マトリックスの免疫グロブリン結合、および／または免疫グロブリン分離および／または精製用途を提供する。
【0088】
より具体的に、一例は、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、蛋白質Ｌ変異体、これらをコーディングする核酸分子、組換えベクターおよび組換え細胞、およびクロマトグラフィー用マトリックスからなる群より選択された１種以上を含む免疫グロブリン結合用組成物を提供する。
【0089】
他の例は、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、蛋白質Ｌ変異体、およびクロマトグラフィー用マトリックスからなる群より選択された１種以上を含む免疫グロブリンの分離および／または精製用組成物を提供する。
【0090】
他の例は、免疫グロブリンを含む試料に、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、蛋白質Ｌ変異体、およびクロマトグラフィー用マトリックスからなる群より選択された１種以上を接触させて、前記免疫グロブリンを吸着させる段階を含む、免疫グロブリンの分離および／または精製方法を提供する。
【0091】
他の例は、標的化合物を含む液状試料に、前述したポリペプチド（Ｂ３ドメイン変異体）、ポリペプチド多量体、免疫グロブリン結合蛋白質、蛋白質Ｌ変異体、およびクロマトグラフィー用マトリックスからなる群より選択された１種以上を接触させて、前記標的化合物を吸着させる段階を含む、液体から一つ以上の標的化合物を分離および／または精製する方法を提供する。
【0092】
本明細書において、免疫グロブリンは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などに由来するものであり得、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどの多様なサブタイプから選択されたものであり得る。前記精製および／または分離対象免疫グロブリンは、完全な形態または軽鎖を含む断片形態、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２などであり得るが、これに制限されるのではない。
【0093】
前記免疫グロブリンまたは標的化合物の分離および／または精製方法は、クロマトグラフィー、例えば、親和性クロマトグラフィーであり得る。
【0094】
前記親和性クロマトグラフィーを簡単に説明すれば、第１段階で標的化合物、例えば、前述のような免疫グロブリンまたはその断片を含む溶液（例えば、同じ免疫グロブリンまたはその断片発現細胞培養液など）を前記標的化合物が分離マトリックス上に存在するリガンドに吸着され得る条件下で分離マトリックスを通過させる。このような条件は例えばｐＨおよび（または）塩濃度、つまり、溶液中のイオン強さにより調節される。マトリックスの容量を超えないように注意するべきであるが、つまり、満足な吸着が可能なように十分に流れを緩くしなければならない。この段階で、その溶液の他の成分は原則的に塞がれず通過する。必須的なことではないが、保有された物質および（または）緩く結合された物質を除去するために、その後、マトリックスは、水溶液を使用するなどにより洗浄する。本出願で提供されるマトリックスは、前述のように、アルカリ製剤を使用する洗浄段階を行っても標的化合物（例えば、免疫グロブリンまたはその断片）に対する結合能を維持することができるという利点を有する。次の段階で、溶出剤と称する第２溶液を標的化合物の脱着、つまり、放出を可能にする条件下でマトリックス上に通過させる。このような条件はｐＨ、塩濃度、つまり、イオン強さ、疎水性などの変化により通常提供される。勾配溶出および段階式溶出などの多様な溶出方法が知られている。溶出は、マトリックス上で所望の抗体を代替する競争物質を含む第２溶液によっても可能になり得る。
【発明の効果】
【0095】
アルカリ耐性が向上してアルカリ条件での安定性が向上した免疫グロブリン結合蛋白質を提供することによって、クロマトグラフィーのようなアルカリ製剤を利用した洗浄工程を必須で伴う免疫グロブリン精製技術で免疫グロブリン－結合リガンドとして有利に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0096】
【図1】一実施例によるＢ３ドメイン変異体ＥＰ１（Ｅ２８Ａ）とＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）のアルカリ処理後のｓｃＦｖ結合能（吸光度で測定される）を野生型（ｗＢ３）と比較した結果を示すグラフである（１次 ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ結果）。
【図2】一実施例による４種のＢ３ドメイン変異体ＢＥＰ１（Ｅ２８Ｇ／Ｙ１３Ｆ）、ＢＥＰ２（Ｅ２８Ｇ／Ｋ４３Ｐ）、ＢＥＰ３（Ｅ２８Ｇ／Ｄ５１Ｖ）、およびＢＥＰ４（Ｅ２８Ｇ／Ｎ６０Ｅ）のアルカリ処理後のｓｃＦｖ結合能（吸光度で測定される）を変異体ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）（１００％）と比較した結果を示すグラフである（２次 ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ結果）。
【図3】一実施例による６種のＢ３ドメイン変異体ＥＰＳ１（Ｅ２８Ｌ）、ＥＰＳ２（Ｅ２８Ｐ）、ＥＰＳ３（Ｅ２８Ｗ）、ＥＰＳ４（Ｅ２８Ｇ／Ｋ４３Ｅ）、ＥＰＳ５（Ｅ２８Ｇ／Ｄ５１Ｔ）、およびＥＰＳ６（Ｅ２８Ｇ／Ｎ６０Ｆ）のアルカリ処理後のｓｃＦｖ結合能（吸光度で測定される）を変異体ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）と比較した結果を示すグラフである（３次 ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ結果）。
【図4】アルカリ耐性が増加された変異体の選抜のための位置指定突然変異ライブラリーの作製過程を例として示す模式図である。
【図5】一実施例によるＢ３ドメイン変異体ｍＢＦ４（Ｙ１３Ｆ／Ｅ２８Ｇ／Ｋ４３Ｐ）のアルカリ処理後の時間によるｓｃＦｖ結合能（吸光度で測定される）変化を野生型Ｂ３ドメインと比較して示すグラフである。
【図6】一実施例によるＢ３ドメイン変異体ｍＢＦ４（Ｙ１３Ｆ／Ｅ２８Ｇ／Ｋ４３Ｐ）を４個含む四量体４ｍＢＦのアルカリ処理（洗浄）回収（サイクル：ｃｙｃｌｅ）によるｓｃＦｖ結合能（吸光度で測定される）変化を市販製品（Ｃｙｔｉｖａ １７－５４７８－０１、Ｃａｐｔｏ Ｌ）と比較して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0097】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。下記に記載された実施例は、発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形可能であることは当業者に自明である。
【0098】
＜実施例１＞改良のための組換え免疫グロブリンＧの断片（ＩｇＧ（ｆ））蛋白質の製造
【0099】
＜１－１＞免疫グロブリンＧのＩｇＧ（ｆ）遺伝子合成
ヒトのＩｇＧ１基盤のｓｃＦｖ ｒｅｇｉｏｎのポリペプチド（ＩｇＧ（ｆ）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ；配列番号２）をコードする核酸配列（ＩｇＧ（ｆ）遺伝子；配列番号１）は、ＮＣＢＩサイトのＢｌａｓｔを通じて探して（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＷＷ４３７２６）、コスモジンテク社（大田、韓国）に依頼して合成した。
ヒトのＩｇＧ１基盤のｓｃＦｖ ｒｅｇｉｏｎのポリペプチド（ＩｇＧ（ｆ）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ；配列番号２）をコードする核酸配列（ＩｇＧ（ｆ）遺伝子；配列番号１）は、ＮＣＢＩサイトのＢｌａｓｔを通じて探して（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＷＷ４３７２６）、コスモジンテク社（大田、韓国）に依頼して合成した。
【0100】
＜１－２＞ｐＥＴ－ＩｇＧ（ｆ）プラスミドの製造
前記実施例＜１－１＞で得たＩｇＧ（ｆ）遺伝子をｐＥＴ２９ａ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）のＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素認識部位に挿入してｐＥＴ－ＩｇＧ（ｆ）プラスミドを準備した。詳細は下記のとおりである。
前記実施例＜１－１＞で得たＩｇＧ（ｆ）遺伝子をｐＥＴ２９ａ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）のＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素認識部位に挿入してｐＥＴ－ＩｇＧ（ｆ）プラスミドを準備した。詳細は下記のとおりである。
【0101】
前記実施例＜１－１＞で合成を通じて得られたＩｇＧ（ｆ）遺伝子ＤＮＡ産物（配列番号１）を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断した後、精製キット（ＱＩＡＥＸ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）で精製して、これを挿入ＤＮＡとして使用した。また、ｐＥＴ２９ａ（＋）ベクターＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断してアンタークティックホスファターゼ（ａｎｔａｒｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（エンジノミックス社、韓国）で脱リン酸化させたＤＮＡ断片をベクターＤＮＡとして使用した。前記の挿入ＤＮＡとベクターＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼ（エンジノミックス社、韓国）を利用して１６℃で１６時間ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた後、前記ライゲーション液を利用して電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株（エンジノミックス社）に形質転換を行った。前記菌株を５０μｇ／ｍＬ濃度のカナマイシン抗生剤を含有するＬＢ寒天培地に塗抹して３７℃で１６～１８時間静置培養することによって形質転換体を選別した。この形質転換体からプラスミドを分離して挿入ＤＮＡの塩基配列を決定することによって、配列番号１の核酸配列を有するＩｇＧ（ｆ）遺伝子を含むｐＥＴ－ＩｇＧ（ｆ）プラスミドを製造した。前記ｐＥＴ－ＩｇＧ（ｆ）プラスミドは配列番号２で表示される野生型ＩｇＧ（ｆ）蛋白質（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ）を発現する。
【0102】
＜１－３＞ニッケル親和性レジンを利用したＩｇＧ（ｆ）蛋白質の精製
ＩｇＧ（ｆ）遺伝子を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を種菌培養するために、カナマイシン抗生剤が含有されたＬＢ液体培地（ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ））５ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブに分注し、選別された形質転換体を接種した後、３７℃、２００ｒｐｍ条件で１６時間振盪培養した。ＬＢ液体培地２００ｍＬが分注された５００ｍＬ三角フラスコに前記種菌培養液１％（ｖ／ｖ）を接種した後、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。約ＯＤ６００＝０．６まで振盪培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオ－ガラクトピラノシド：ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の最終濃度が１ｍＭになるように添加して３７℃、２００ｒｐｍ、１８時間にかけて追加振盪培養した。このフラスコ培養液を遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、２０分）して菌体を回収した後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）（イントロンバイオテクノロジー社、韓国）１０ｍＬの溶液に懸濁した。この懸濁液を４℃で超音波紛砕機で１５分間破砕して遠心分離（４℃、２０，０００ｒｐｍ、２０分）して上澄液だけを取った。ニッケル親和性レジンであるＷｏｒｋＢｅａｄｓ（商標）４０ Ｎｉ－ＮＴＡ（ｂｉｏｗｏｒｋｓ社、スウェーデン）１ｍＬをカラムに充填して５ｍＬの結合バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ） ｐＨ８．０）を流した後、前記の上澄液２．５ｍＬと結合バッファー２．５ｍＬを混合してカラムに流した。洗浄バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）５ｍＬを流した後、溶出バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）２．５ｍＬを流して通過液は１５ｍＬのコニカルチューブに回収した。このように回収された精製された蛋白質はＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（ｃｙｔｉｖａ社、スウェーデン）を利用して脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を進行した。
ＩｇＧ（ｆ）遺伝子を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を種菌培養するために、カナマイシン抗生剤が含有されたＬＢ液体培地（ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ））５ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブに分注し、選別された形質転換体を接種した後、３７℃、２００ｒｐｍ条件で１６時間振盪培養した。ＬＢ液体培地２００ｍＬが分注された５００ｍＬ三角フラスコに前記種菌培養液１％（ｖ／ｖ）を接種した後、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。約ＯＤ６００＝０．６まで振盪培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオ－ガラクトピラノシド：ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の最終濃度が１ｍＭになるように添加して３７℃、２００ｒｐｍ、１８時間にかけて追加振盪培養した。このフラスコ培養液を遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、２０分）して菌体を回収した後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）（イントロンバイオテクノロジー社、韓国）１０ｍＬの溶液に懸濁した。この懸濁液を４℃で超音波紛砕機で１５分間破砕して遠心分離（４℃、２０，０００ｒｐｍ、２０分）して上澄液だけを取った。ニッケル親和性レジンであるＷｏｒｋＢｅａｄｓ（商標）４０ Ｎｉ－ＮＴＡ（ｂｉｏｗｏｒｋｓ社、スウェーデン）１ｍＬをカラムに充填して５ｍＬの結合バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ） ｐＨ８．０）を流した後、前記の上澄液２．５ｍＬと結合バッファー２．５ｍＬを混合してカラムに流した。洗浄バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）５ｍＬを流した後、溶出バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）２．５ｍＬを流して通過液は１５ｍＬのコニカルチューブに回収した。このように回収された精製された蛋白質はＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（ｃｙｔｉｖａ社、スウェーデン）を利用して脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を進行した。
【0103】
＜実施例２＞鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）の作製
【0104】
＜２－１＞Ｂ３ドメイン遺伝子の合成
ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）由来蛋白質ＬのＢ３ドメイン遺伝子（配列番号３）に後ほどの蛋白質精製を考慮して６ｘＨｉｓ ｔａｇを含めた遺伝子をコスモジンテク社（大田、韓国）に依頼して合成した。
ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）由来蛋白質ＬのＢ３ドメイン遺伝子（配列番号３）に後ほどの蛋白質精製を考慮して６ｘＨｉｓ ｔａｇを含めた遺伝子をコスモジンテク社（大田、韓国）に依頼して合成した。
【0105】
＜２－２＞ｐＢＣ－ｗＢ３プラスミドの製造
前記実施例＜２－１＞で得た蛋白質Ｌの野生型Ｂ３ドメイン（ｗＢ３）遺伝子（配列番号３）をｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）のＮｄｅＩとＮｏｔＩ制限酵素認識部位に挿入してｐＢＣ－ｗＢ３プラスミドを製造した。詳しく下記のとおり進行した。
前記実施例＜２－１＞で得た蛋白質Ｌの野生型Ｂ３ドメイン（ｗＢ３）遺伝子（配列番号３）をｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）のＮｄｅＩとＮｏｔＩ制限酵素認識部位に挿入してｐＢＣ－ｗＢ３プラスミドを製造した。詳しく下記のとおり進行した。
【0106】
前記実施例＜２－１＞で合成を通じて得られたｗＢ３遺伝子ＤＮＡ産物（配列番号３）を制限酵素ＮｄｅＩとＮｏｔＩで切断した後、精製キット（ＱＩＡＥＸ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）で精製してこれを挿入ＤＮＡとして使用した。また、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩとＮｏｔＩで切断してアンタークティックホスファターゼ（ａｎｔａｒｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（エンジノミックス社、韓国）で脱リン酸化させたＤＮＡ断片をベクターＤＮＡとして使用した。前記の挿入ＤＮＡとベクターＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼ（エンジノミックス社、韓国）を利用して１６℃で１６時間ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた後、前記ライゲーション液を利用して電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で大腸菌ＤＨ５α菌株（エンジノミックス社）に形質転換を行った。前記菌株を２０μｇ／ｍＬ濃度のクロラムフェニコール抗生剤を含有するＬＢ寒天培地（ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ））に塗抹して３７℃で１６～１８時間静置培養をすることによって形質転換体を選別した。選別された形質転換体からプラスミドを分離して挿入ＤＮＡの塩基配列を決定して、配列番号３の核酸配列を有する野生型Ｂ３ドメイン遺伝子を含むｐＢＣ－ｗＢ３プラスミドを製造した。前記ｐＢＣ－ｗＢ３プラスミドは配列番号４で表示される野生型蛋白質Ｌ Ｂ３ドメイン蛋白質を発現する。
【0107】
＜実施例３＞エラー誘発性重合酵素連鎖反応（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）方法を利用したｗＢ３改良
【0108】
＜３－１＞エラー誘発性重合酵素連鎖反応（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）によるｗＢ３変異体ライブラリーの作製
実施例２で合成したｗＢ３遺伝子（配列番号３）の核酸配列に人為的に無作為突然変異を誘発するために、エラー誘発性重合酵素連鎖反応（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）を行って突然変異ライブラリーを構築した。
実施例２で合成したｗＢ３遺伝子（配列番号３）の核酸配列に人為的に無作為突然変異を誘発するために、エラー誘発性重合酵素連鎖反応（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）を行って突然変異ライブラリーを構築した。
【0109】
具体的な突然変異ライブラリーの製造過程は次のとおりである。エラー誘発性重合酵素連鎖反応は、Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（登録商標） ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（クロンテック、米国）を使用して１０００ｂｐ当たり１～２個の突然変異が起こるように誘導した。ＰＣＲ反応混合液の組成は、鋳型ＤＮＡとしてｐＢＣ－ｗＢ３プラスミド（実施例２－２）１ｎｇ、ＥＰ－Ｆプライマー（配列番号５）とＴ７プライマー（配列番号６）のそれぞれ１０ｐｍｏｌ、４０μＭ ｄＧＴＰ、Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｄＮＴＰ ｍｉｘとＴＩＴＡＮＩＵＭ（商標） Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）で最終体積は１００μＬに調整した。ＰＣＲは、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社、米国）を使用して次の条件で行った。前記反応混合液を９４℃で３０秒間初期変性（ｐｒｅ－ｄｅｎａｕｒａｔｉｏｎ）させ、変性を９４℃で３０秒、アニーリングを５５℃で３０秒および重合を６８℃で３分間行う反応を１６回繰り返した後、６８℃で１分間後重合させた。
【0110】
前記条件で行ったエラー誘発性重合酵素連鎖反応を通じて得られたそれぞれのｗＢ３変異遺伝子ＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｄｅＩとＮｏｔＩで切断した後、ＱＩＡＥＸ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）で精製して、挿入ＤＮＡとして使用した。また、ｐＢＣ－ＫＳ（＋）プラスミドを制限酵素ＮｄｅＩとＮｏｔＩで切断し、アンタークティックホスファターゼ（ａｎｔａｒｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（エンジノミックス社、韓国）で脱リン酸化させた３．４ｋｂの大きさのＤＮＡ断片をベクターＤＮＡとして使用した。前記の挿入ＤＮＡとベクターＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼ（エンジノミックス社、韓国）を利用して１６℃で１６時間ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた後、前記ライゲーション液を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で大腸菌ＤＨ５α菌株に形質転換を行った。前記菌株を２０μｇ／ｍＬ濃度のクロラムフェニコール抗生剤を含むＬＢ寒天培地に塗抹して３７℃で１６～１８時間静置培養をすることによって無作為突然変異ライブラリーを製造した。
【0111】
＜３－２＞アルカリ耐性が増加された変異体の選抜
前記方法を通じて誘発されたｗＢ３変異遺伝子を含んでいる大腸菌ＤＨ５α形質転換体を培養するために、クロラムフェニコール抗生剤が含有されたＬＢ液体培地５００μＬを９６－ディープウェルプレート（バイオニア社、韓国）に分注し、形質転換体を接種した後、３７℃、２８０ｒｐｍ条件で１８時間振盪培養した。
前記方法を通じて誘発されたｗＢ３変異遺伝子を含んでいる大腸菌ＤＨ５α形質転換体を培養するために、クロラムフェニコール抗生剤が含有されたＬＢ液体培地５００μＬを９６－ディープウェルプレート（バイオニア社、韓国）に分注し、形質転換体を接種した後、３７℃、２８０ｒｐｍ条件で１８時間振盪培養した。
【0112】
具体的な蛋白質精製過程は次のとおりである。蛋白質精製は、Ｐｒｏｍｅｇａ ＨｉｓＬｉｎｋ（商標） ９６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）を使用して進行した。１０× ＦａｓｔＢｒｅａｋ（商標） Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ＲｅａｇｅｎｔとＤＮａｓｅ Ｉ ｓｏｌｕｔｉｏｎを比率に合うように混合してＦａｓｔＢｒｅａｋ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔ／ＤＮａｓｅ Ｉ ｓｏｌｕｔｉｏｎを準備した。各ウェルに６００μＬの培養液と６０μＬのＦａｓｔＢｒｅａｋ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔ／ＤＮａｓｅ Ｉ ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れた後、６５μＬのＨｉｓＬｉｎｋ（商標） Ｒｅｓｉｎを入れた。これをシェーカー（ｓｈａｋｅｒ）で１００ｒｐｍで３０分間混合して培養液とレジンが反応できるようにした。反応液とレジンを濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）プレートに移し、Ｖａｃ－Ｍａｎ（登録商標）９６ Ｖａｃｕｕｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）を利用して１０秒間真空を加えてフィルタリングした。次に、２５０μＬのｂｉｎｄｉｎｇ／ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．５）を各ウェルに添加した後、１０秒間真空を加えて洗浄し、同じ方法で３回繰り返した。プレートに２００μＬの溶出バッファー（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．５）を添加して１０分間反応させた後、１分間真空を与えて新たな９６－ウェルプレートに精製された蛋白質を回収した。精製したｗＢ３変異体を９６－ウェルプレートでＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ社、スウェーデン）にカップリングさせた後、濾過（ｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）プレートに移した。実施例＜１－３＞で精製したＩｇＧ（ｆ）蛋白質１５０μＬ（７１．５μｇ／ｍＬ）を前記濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）プレートに入れた後、シェーカー（ｓｈａｋｅｒ）を利用して常温で１００ｒｐｍで１時間反応させた。非結合したＩｇＧ（ｆ）蛋白質は真空を与えて除去した後、１５０μＬのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を各ウェルに添加して真空を加えて洗浄し、同じ方法で３回洗浄した。１５０μＬの溶出バッファー（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ、ｐＨ２．５）を入れて常温で３０秒間反応させた後、１分間真空を与えて新たな９６－ウェルプレートに蛋白質を回収した。溶出バッファーを処理した濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）プレートは１５０μＬのＰＢＳバッファーを各ウェルに分注して真空を加えて洗浄し、同じ方法で３回洗浄した。
【0113】
回収した蛋白質を移した新たな９６－ウェルプレートは、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ社、米国）を使用してＯＤ２８０でＩｇＧ（ｆ）蛋白質量を測定した。初期結合分析が終わった後、ｗＢ３変異体のアルカリ耐性を確認するために濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）プレートに入っているｗＢ３変異体レジンに０．３Ｍ ＮａＯＨを２００μＬを添加した後（ｐＨ１３．４８）、常温で１００ｒｐｍで１時間反応させた。その後、２００μＬのＰＢＳバッファーで３回洗浄し、初期結合分析と同様な方法でＩｇＧ（ｆ）蛋白質結合させた後、回収して抗体の量を測定した。前記のような方法を繰り返して残っているＩｇＧ（ｆ）蛋白質量を比較する方法でｗＢ３変異体の残存するＩｇＧ（ｆ）結合活性を分析した。
【0114】
前記ｗＢ３変異体の０．３Ｍ ＮａＯＨ処理する前と後の吸光度を比較してｗＢ３よりアルカリ耐性が増加されたｗＢ３変異体（２個）を選抜した。前記選抜された２個の変異体は、遺伝子の核酸配列決定を通じて、野生型ｗＢ３（配列番号４）がＥ２８Ａ（組換え的合成時、開始コドンによりコーディングされたメチオニン（Ｍ）の次のアミノ酸残基（つまり、配列番号４の２番目のアミノ酸残基であるＰ）から起算して２８番目（つまり、配列番号４の２９番目）アミノ酸残基であるＥがＡで置換された変異を意味する、本明細書でアミノ酸変異表示は同一の方式で解釈される）変異を有する変異体ＥＰ１（配列番号７）およびＥ２８Ｇ変異を有する変異体ＥＰ２（配列番号８）に突然変異されたことを確認した。前記選抜された２個の変異体ＥＰ１（Ｅ２８Ａ）とＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）の吸光度を野生型（ｗＢ３）の吸光度と比較した結果を図１に示した（ｗＢ３の吸光度（１００％）に対する相対値で示す）。
【0115】
＜３－３＞エラー誘発性重合酵素連鎖反応（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）によるＥＰ２変異体ライブラリーの作製
実施例＜３－２＞で選別されたｗＢ３変異体のうち、アルカリ耐性がより高い変異体ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）（配列番号８）のコーディング遺伝子に対して追加改良を進行した。ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターに挿入されているＥＰ２を新たな鋳型にしてエラー誘発性重合酵素連鎖反応（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）をもう一度進行した。
実施例＜３－２＞で選別されたｗＢ３変異体のうち、アルカリ耐性がより高い変異体ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）（配列番号８）のコーディング遺伝子に対して追加改良を進行した。ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターに挿入されているＥＰ２を新たな鋳型にしてエラー誘発性重合酵素連鎖反応（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）をもう一度進行した。
【0116】
実施例＜３－１＞および＜３－２＞と同様な方法でエラー誘発性重合酵素連鎖反応を進行した後、ＥＰ２よりアルカリ耐性が増加された蛋白質を選抜した。その結果、４個の変異体が追加的に選抜され、これらの遺伝子の核酸配列決定を通じて、変異体ＥＰ２がＥ２８Ｇ／Ｙ１３Ｆ変異を有する変異体ＢＥＰ１（配列番号９）、Ｅ２８Ｇ／Ｋ４３Ｐ変異を有する変異体ＢＥＰ２（配列番号１０）、Ｅ２８Ｇ／Ｄ５１Ｖ変異を有する変異体ＢＥＰ３（配列番号１１）、Ｅ２８Ｇ／Ｎ６０Ｅ変異を有する変異体ＢＥＰ４（配列番号１２）に突然変異されたことを確認した。前記確認された４個の変異体ＢＥＰ１（Ｅ２８Ｇ／Ｙ１３Ｆ）、ＢＥＰ２（Ｅ２８Ｇ／Ｋ４３Ｐ）、ＢＥＰ３（Ｅ２８Ｇ／Ｄ５１Ｖ）、ＢＥＰ４（Ｅ２８Ｇ／Ｎ６０Ｅ）の吸光度を変異体ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）の吸光度と比較した結果を図２に示した（ＥＰ２の吸光度（１００％）に対する相対値で示す）。
【0117】
＜実施例４＞部位飽和突然変異（ｓｉｔｅ－ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を利用したｗＢ３改良
【0118】
＜４－１＞部位飽和突然変異によるｗＢ３変異体ライブラリーの作製
ｗＢ３遺伝子で改良されたＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）遺伝子に追加的にアルカリ耐性を付与するために＜実施例３＞で選定された変異体で変異が起こった５個のアミノ酸残基（Ｙ１３、Ｅ２８、Ｋ４３、Ｄ５１、Ｎ６０）に対して部位飽和突然変異（ｓｉｔｅ－ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）ライブラリーを製造した。具体的な方法は次のとおりである。
ｗＢ３遺伝子で改良されたＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）遺伝子に追加的にアルカリ耐性を付与するために＜実施例３＞で選定された変異体で変異が起こった５個のアミノ酸残基（Ｙ１３、Ｅ２８、Ｋ４３、Ｄ５１、Ｎ６０）に対して部位飽和突然変異（ｓｉｔｅ－ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）ライブラリーを製造した。具体的な方法は次のとおりである。
【0119】
２８番目のアミノ酸（Ｎ－末端に開始コドンによるメチオニン（Ｍ）を含む配列番号４の２９番目のアミノ酸に該当、本明細書でアミノ酸位置表示は同一の方式で解釈される）が変異されたライブラリーを製造するために、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターに挿入されているｗＢ３遺伝子（配列番号３）を鋳型にし、２８－Ｆプライマー（配列番号１３）、２８－Ｒプライマー（配列番号１４）、Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０× Ｐｆｕ－Ｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、１０ｍＭ ｄＮＴＰで最終体積を５０μＬに調整した反応混合液を準備して行った。前記反応混合液を次の反応条件で反応させた。９５℃で２分間初期変性させ、変性を９５℃で２０秒、アニーリングを５６℃で４０秒および重合を７２℃で１分間行う反応を２５回繰り返した後、７２℃で５分間後重合させた。前記条件で得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで１８時間処理し、精製キット（ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；コスモジンテク社、韓国）で精製して、これを直ちに電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒａｔｉｏｎ）で大腸菌ＤＨ５α菌株に形質転換させた。前記形質転換された菌株を２０μｇ／ｍＬ濃度のクロラムフェニコール抗生剤を含有するＬＢ寒天培地に塗抹して３７℃で１６～１８時間静置培養することによって部位飽和突然変異ライブラリーを製造した。
【0120】
その後、前記叙述した方法と同様な方法で、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターに挿入されているＢＥＰ１（配列番号９）コーディング遺伝子、ＢＥＰ２（配列番号１０）コーディング遺伝子、ＢＥＰ３（配列番号１１）コーディング遺伝子、またはＢＥＰ４（配列番号１２）コーディング遺伝子を鋳型にして、それぞれ１３－Ｆプライマー（配列番号１５）と１３－Ｒプライマー（配列番号１６）、４３－Ｆプライマー（配列番号１７）と４３－Ｒプライマー（配列番号１８）、５１－Ｆプライマー（配列番号１９）と５１－Ｒプライマー（配列番号２０）、６０－Ｆプライマー（配列番号２１）と６０－Ｒプライマー（配列番号２２）を使用してライブラリーを作製した。
【0121】
＜４－２＞アルカリ耐性が増加された変異体の選抜
前記実施例＜３－２＞と同様な方法を利用して前記実施例＜４－１＞で作製されたライブラリーを探索した結果、変異体ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）に比べてアルカリ耐性が同等または増加した変異体としてＥＰＳ１（Ｅ２８Ｌ）（配列番号２３）、ＥＰＳ２（Ｅ２８Ｐ）（配列番号２４）、ＥＰＳ３（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２５）、ＥＰＳ４（Ｅ２８Ｇ／Ｋ４３Ｅ）（配列番号２６）、ＥＰＳ５（Ｅ２８Ｇ／Ｄ５１Ｔ）（配列番号２７）、およびＥＰＳ６（Ｅ２８Ｇ／Ｎ６０Ｆ）（配列番号２８）の６個の変異体が追加的に選抜された。前記追加的に選抜された６個の変異体の吸光度を変異体ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）の吸光度と比較した結果を図３に示した（（ＥＰ２の吸光度１００％）に対する相対値で示す）。
前記実施例＜３－２＞と同様な方法を利用して前記実施例＜４－１＞で作製されたライブラリーを探索した結果、変異体ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）に比べてアルカリ耐性が同等または増加した変異体としてＥＰＳ１（Ｅ２８Ｌ）（配列番号２３）、ＥＰＳ２（Ｅ２８Ｐ）（配列番号２４）、ＥＰＳ３（Ｅ２８Ｗ）（配列番号２５）、ＥＰＳ４（Ｅ２８Ｇ／Ｋ４３Ｅ）（配列番号２６）、ＥＰＳ５（Ｅ２８Ｇ／Ｄ５１Ｔ）（配列番号２７）、およびＥＰＳ６（Ｅ２８Ｇ／Ｎ６０Ｆ）（配列番号２８）の６個の変異体が追加的に選抜された。前記追加的に選抜された６個の変異体の吸光度を変異体ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）の吸光度と比較した結果を図３に示した（（ＥＰ２の吸光度１００％）に対する相対値で示す）。
【0122】
＜実施例５＞位置指定突然変異（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）方法を利用したｗＢ３改良
位置指定突然変異（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を通じて実施例３および４で確認されたアルカリ耐性が増加した変異体に追加的にアルカリ耐性を付与しようとした。このために、選定された５個のアミノ酸変異（Ｙ１３Ｆ、Ｅ２８Ｇ／Ｗ、Ｋ４３Ｅ／Ｐ、Ｄ５１Ｔ／Ｖ、Ｎ６０Ｅ／Ｆ）に対して位置指定突然変異ライブラリーを作製し、具体的な製造過程は次のとおりである（図４参照）。
位置指定突然変異（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を通じて実施例３および４で確認されたアルカリ耐性が増加した変異体に追加的にアルカリ耐性を付与しようとした。このために、選定された５個のアミノ酸変異（Ｙ１３Ｆ、Ｅ２８Ｇ／Ｗ、Ｋ４３Ｅ／Ｐ、Ｄ５１Ｔ／Ｖ、Ｎ６０Ｅ／Ｆ）に対して位置指定突然変異ライブラリーを作製し、具体的な製造過程は次のとおりである（図４参照）。
【0123】
まず、１３番目のアミノ酸が変異されたライブラリーを製造するためにＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）（配列番号８）コーディング遺伝子を鋳型にして、ＥＰ－Ｆプライマー（配列番号５）とＳＨ１３－Ｒ１プライマー（配列番号３１）、ＳＨ１３－Ｒ２プライマー（配列番号３２）を使用するＰＣＲを行って約０．１ｋｂの大きさのＰＣＲ産物を回収した。２８番目のアミノ酸が変異されたライブラリーを製造するために、ｗＢ３（配列番号４）コーディング遺伝子、ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）（配列番号８）コーディング遺伝子、ＥＰＳ３（配列番号２５）コーディング遺伝子を鋳型にして、ＳＨ１３－Ｆ１プライマー（配列番号２９）、ＳＨ１３－Ｆ２プライマー（配列番号３０）とＳＨ４３－Ｒ１プライマー（配列番号３５）、ＳＨ４３－Ｒ２プライマー（配列番号３６）を使用するＰＣＲを行って約０．１４ｋｂの大きさのＰＣＲ産物を回収した。４３番目のアミノ酸が変異されたライブラリーを製造するために、ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）（配列番号８）コーディング遺伝子を鋳型にして、ＳＨ４３－Ｆ１プライマー（配列番号３３）、ＳＨ４３－Ｆ２プライマー（配列番号３４）とＳＨ５１－Ｒ１プライマー（配列番号３９）、ＳＨ５１－Ｒ２プライマー（配列番号４０）を使用するＰＣＲを行って約０．０７ｋｂの大きさのＰＣＲ産物を回収した。５１番目のアミノ酸が変異されたライブラリーを製造するために、ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）（配列番号８）コーディング遺伝子を鋳型にして、ＳＨ５１－Ｆ１プライマー（配列番号３７）、ＳＨ５１－Ｆ２プライマー（配列番号３８）とＳＨ６０－Ｒ１プライマー（配列番号４４）、ＳＨ６０－Ｒ２プライマー（配列番号４５）、ＳＨ６０－Ｒ３プライマー（配列番号４６）を使用するＰＣＲを行って約０．０８ｋｂの大きさのＰＣＲ産物を回収した。６０番目のアミノ酸が変異されたライブラリーを製造するために、ＥＰ２（Ｅ２８Ｇ）（配列番号８）コーディング遺伝子を鋳型にして、ＳＨ６０－Ｆ１プライマー（配列番号４１）、ＳＨ６０－Ｆ２プライマー（配列番号４２）、ＳＨ６０－Ｆ３プライマー（配列番号４３）とＴ７プライマー（配列番号６）を使用してＰＣＲを行って約０．３２ｋｂの大きさのＰＣＲ産物を回収した。ＰＣＲ反応液の組成は、それぞれの鋳型ＤＮＡ、プライマー、Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０× Ｐｆｕ－Ｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー、１０ｍＭ ｄＮＴＰで最終体積を１００μＬに調整して準備した。前記反応混合液を次の条件で反応させた。９５℃で２分間初期変性させて変性を９５℃で５０秒、アニーリングを５８℃で４０秒および重合を７２℃で１分間行う反応を２５回繰り返した後、７２℃で５分間後重合させた。
【0124】
前記条件から得られた１０２ｂｐのＰＣＲ産物と１４１ｂｐのＰＣＲ産物、６７ｂｐのＰＣＲ産物、７８ｂｐのＰＣＲ産物、および３２０ｂｐのＰＣＲ産物を混合してプライマーを添加せずにＰＣＲを行って５個のＰＣＲ産物が１個に連結された約０．７ｋｂの大きさのＰＣＲ産物を回収した。前記約０．７ｋｂのＰＣＲ産物を鋳型にしてＥＰ－Ｆプライマー（配列番号５）とＴ７プライマー（配列番号６）を使用したＰＣＲを行って約０．７ｋｂの大きさの多重変異体ＤＮＡ断片を増幅した。このように得られた約０．７ｋｂのＰＣＲ産物を実施例＜２－２＞の方法と同様にｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡに挿入してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α菌株の形質転換を行って位置指定突然変異体ライブラリーを製造した。
【0125】
＜実施例６＞アルカリ耐性が増加されたｍＢＦ変異体開発：変異蛋白質ｍＢＦ単量体のアルカリ耐性比較
前記実施例５で製造したライブラリーを実施例＜１－３＞のような方法で精製した後、＜実施例３＞と同様な方法で時間による吸光度を測定してアルカリ耐性を比較した。図５に前記で得られた時間による吸光度を開始時（０ｈ）の吸光度（１００％）に対する相対値で示した。
前記実施例５で製造したライブラリーを実施例＜１－３＞のような方法で精製した後、＜実施例３＞と同様な方法で時間による吸光度を測定してアルカリ耐性を比較した。図５に前記で得られた時間による吸光度を開始時（０ｈ）の吸光度（１００％）に対する相対値で示した。
【0126】
図５に示されているように、実施例＜３－２＞と同様な方法を利用して実施例５のライブラリーを探索した結果、変異体ＥＰ２に比べてアルカリ耐性が増加した変異体としてｍＢＦ４（Ｙ１３Ｆ／Ｅ２８Ｇ／Ｋ４３Ｐ）（配列番号４７）が選別された。図５に示すように、ｍＢＦ４蛋白質は０．３Ｍ ＮａＯＨに５時間処理後に活性を比較した時、野生型アミノ酸配列を有するｗＢ３蛋白質に比べて約２．７倍以上アルカリ耐性が増加したことを確認した。
【0127】
前記実施例１乃至６で選別された蛋白質Ｌ Ｂ３ドメイン変異体のアミノ酸配列を下記の表２に整理した。
【0128】
【表2】
【0129】
＜実施例７＞ｍＢＦ四量体のアルカリ耐性の調査
【0130】
＜７－１＞４ｍＢＦ遺伝子合成
実施例＜６－１＞で確認したｍＢＦ４蛋白質のアルカリ耐性を追加的に確認するために、ｍＢＦ４変異体コーディング遺伝子を四量体で合成し、これを４ｍＢＦと命名した。前記遺伝子配列はコドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）過程を経た後（配列番号４８）、コスモジンテク社（大田、韓国）会社に依頼して合成した。
実施例＜６－１＞で確認したｍＢＦ４蛋白質のアルカリ耐性を追加的に確認するために、ｍＢＦ４変異体コーディング遺伝子を四量体で合成し、これを４ｍＢＦと命名した。前記遺伝子配列はコドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）過程を経た後（配列番号４８）、コスモジンテク社（大田、韓国）会社に依頼して合成した。
【0131】
＜７－２＞ｐＥＴ－４ｍＢＦプラスミドの製造
前記実施例＜７－１＞で得た４ｍＢＦ遺伝子（配列番号４８）を前記実施例＜１－２＞の方法と同様にｐＥＴ２９ａ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）にクローニングしてｐＥＴ－４ｍＢＦプラスミドを製造した。前記ｐＥＴ－４ｍＢＦプラスミドは配列番号４９で表示される変異蛋白質４ｍＢＦを発現する。
前記実施例＜７－１＞で得た４ｍＢＦ遺伝子（配列番号４８）を前記実施例＜１－２＞の方法と同様にｐＥＴ２９ａ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）にクローニングしてｐＥＴ－４ｍＢＦプラスミドを製造した。前記ｐＥＴ－４ｍＢＦプラスミドは配列番号４９で表示される変異蛋白質４ｍＢＦを発現する。
【0132】
＜７－３＞ニッケル親和性レジンを利用した変異蛋白質ｍＢＦ四量体の精製
ｐＥＴ－４ｍＢＦプラスミドで形質転換されて４ｍＢＦ遺伝子を含む大腸菌ＤＨ５α形質転換体を種菌培養するためにカナマイシン抗生剤が含有されたＬＢ液体培地５ｍＬを５０ｍＬコニカルチューブに分注し、選別した形質転換体を接種した後、３７℃、２００ｒｐｍ条件で１６時間振盪培養した。カナマイシン抗生剤が含有されたＴＢ液体培地５００ｍＬを２０００ｍＬ三角フラスコに分注し、前記培養液を種菌培養液の１％（ｖ／ｖ）で接種した後、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。約ＯＤ６００＝０．６まで振盪培養した後、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の最終濃度が１ｍＭになるように添加して３７℃、２００ｒｐｍ、１８時間にかけて追加振盪培養した。このフラスコ培養液を遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、２０分）して菌体を回収した後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）（イントロンバイオテクノロジー社、韓国）３０ｍＬの溶液に懸濁した。この懸濁液を４℃で超音波紛砕機で３０分間破砕し、遠心分離（４℃、２０，０００ｒｐｍ、２０分）して上澄液だけを取った。ＷｏｒｋＢｅａｄｓ（商標） ４０ Ｎｉ－ＮＴＡ（ｂｉｏｗｏｒｋｓ社、スウェーデン）７ｍＬをカラムに充填した後、結合バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）３５ｍｌを流して前記の上澄液３０ｍＬと結合バッファー３０ｍＬを混合した後にカラムに流した。洗浄バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）３５ｍＬを流した後、溶出バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）４０ｍＬを流して通過液は５０ｍＬのコニカルチューブに回収した。精製された蛋白質はＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（ｃｙｔｉｖａ社、米国）を利用して脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を進行した。
ｐＥＴ－４ｍＢＦプラスミドで形質転換されて４ｍＢＦ遺伝子を含む大腸菌ＤＨ５α形質転換体を種菌培養するためにカナマイシン抗生剤が含有されたＬＢ液体培地５ｍＬを５０ｍＬコニカルチューブに分注し、選別した形質転換体を接種した後、３７℃、２００ｒｐｍ条件で１６時間振盪培養した。カナマイシン抗生剤が含有されたＴＢ液体培地５００ｍＬを２０００ｍＬ三角フラスコに分注し、前記培養液を種菌培養液の１％（ｖ／ｖ）で接種した後、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。約ＯＤ６００＝０．６まで振盪培養した後、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の最終濃度が１ｍＭになるように添加して３７℃、２００ｒｐｍ、１８時間にかけて追加振盪培養した。このフラスコ培養液を遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、２０分）して菌体を回収した後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）（イントロンバイオテクノロジー社、韓国）３０ｍＬの溶液に懸濁した。この懸濁液を４℃で超音波紛砕機で３０分間破砕し、遠心分離（４℃、２０，０００ｒｐｍ、２０分）して上澄液だけを取った。ＷｏｒｋＢｅａｄｓ（商標） ４０ Ｎｉ－ＮＴＡ（ｂｉｏｗｏｒｋｓ社、スウェーデン）７ｍＬをカラムに充填した後、結合バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）３５ｍｌを流して前記の上澄液３０ｍＬと結合バッファー３０ｍＬを混合した後にカラムに流した。洗浄バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）３５ｍＬを流した後、溶出バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ８．０）４０ｍＬを流して通過液は５０ｍＬのコニカルチューブに回収した。精製された蛋白質はＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（ｃｙｔｉｖａ社、米国）を利用して脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を進行した。
【0133】
＜７－４＞変異蛋白質ｍＢＦ四量体のアルカリ耐性比較
実施例＜７－３＞で精製した４ｍＢＦをＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ社、スウェーデン）にカップリングした。作製された４ｍＢＦレジン（４ｍＢＦ－アガロースビーズ）は、アルカリ耐性が高いと知られている商業的に入手可能な蛋白質Ｌ基盤のレジンであるＣｙｔｉｖａ社製品（Ｃｙｔｉｖａ １７－５４７８－０１、Ｃａｐｔｏ Ｌ）とアルカリ耐性を比較した。Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／５０ カラム（ｃｙｔｉｖａ社、米国）に各レジンを１ｍｌずつ充填した後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）（イントロンバイオテクノロジー社、韓国）５ｍｌを１ｍｌ／分で流した。約１ｍｇ／ｍｌの精製抗体（ＫＢＩＯ社、韓国）２５ｍｌをＰＢＳバッファー２５ｍｌと希釈して１ｍｌ／分で流した。ＰＢＳバッファー５ｍｌを１ｍｌ／分で流して非結合した抗体蛋白質を除去した後、溶出バッファー（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ、ｐＨ２．５）５ｍｌを０．５ｍｌ／分で流して通過液を回収して結合された抗体を分離した。この時、分離した抗体は、中性化バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）０．５ｍｌが入っているチューブに回収して中性化されるようにし、回収された抗体の量を測定した。初期結合分析が終わった後、アルカリ処理のためにＰＢＳバッファー５ｍｌを１ｍｌ／分で流した後、０．３Ｍ ＮａＯＨ ７．５ｍｌを０．５ｍｌ／分で流してＮａＯＨが１５分間レジンに接触することができるようにした。その後、ＰＢＳバッファー５ｍｌを１ｍｌ／分で流して残っているＮａＯＨを除去する過程までをアルカリ処理１回に設定し、同様な方法でアルカリ処理を繰り返した（１～１５サイクル：ｃｙｃｌｅ）。アルカリ処理後に初期結合分析と同様な方法で精製抗体を結合させ、回収して抗体の量を測定した。前記のような方法を繰り返して回収される抗体の量を比較する方法で各レジンが有しているアルカリ耐性を分析した。
実施例＜７－３＞で精製した４ｍＢＦをＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ社、スウェーデン）にカップリングした。作製された４ｍＢＦレジン（４ｍＢＦ－アガロースビーズ）は、アルカリ耐性が高いと知られている商業的に入手可能な蛋白質Ｌ基盤のレジンであるＣｙｔｉｖａ社製品（Ｃｙｔｉｖａ １７－５４７８－０１、Ｃａｐｔｏ Ｌ）とアルカリ耐性を比較した。Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／５０ カラム（ｃｙｔｉｖａ社、米国）に各レジンを１ｍｌずつ充填した後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）（イントロンバイオテクノロジー社、韓国）５ｍｌを１ｍｌ／分で流した。約１ｍｇ／ｍｌの精製抗体（ＫＢＩＯ社、韓国）２５ｍｌをＰＢＳバッファー２５ｍｌと希釈して１ｍｌ／分で流した。ＰＢＳバッファー５ｍｌを１ｍｌ／分で流して非結合した抗体蛋白質を除去した後、溶出バッファー（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ、ｐＨ２．５）５ｍｌを０．５ｍｌ／分で流して通過液を回収して結合された抗体を分離した。この時、分離した抗体は、中性化バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）０．５ｍｌが入っているチューブに回収して中性化されるようにし、回収された抗体の量を測定した。初期結合分析が終わった後、アルカリ処理のためにＰＢＳバッファー５ｍｌを１ｍｌ／分で流した後、０．３Ｍ ＮａＯＨ ７．５ｍｌを０．５ｍｌ／分で流してＮａＯＨが１５分間レジンに接触することができるようにした。その後、ＰＢＳバッファー５ｍｌを１ｍｌ／分で流して残っているＮａＯＨを除去する過程までをアルカリ処理１回に設定し、同様な方法でアルカリ処理を繰り返した（１～１５サイクル：ｃｙｃｌｅ）。アルカリ処理後に初期結合分析と同様な方法で精製抗体を結合させ、回収して抗体の量を測定した。前記のような方法を繰り返して回収される抗体の量を比較する方法で各レジンが有しているアルカリ耐性を分析した。
【0134】
前記得られた結果を図６に示した。図６に示すように、４ｍＢＦレジンは、既に産業用で幅広く使用されているＣｙｔｉｖａ社製品に比べて、アルカリ耐性に優れたことを確認した。特に、アルカリ処理を１５回まで進行した時、４ｍＢＦレジンの残存活性は４３．４６％にＣｙｔｉｖａ社製品に比べて約１．４倍高いことが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】