特開 2023-166409 ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６および腫瘍関連抗原に結合するタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023166409

(43)【公開日】2023-11-21

(54)【発明の名称】ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６および腫瘍関連抗原に結合するタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20231114BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231114BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20231114BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C12N15/09 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023132099

(22)【出願日】2023-08-14

(62)【分割の表示】P 2020513796の分割

【原出願日】2018-09-07

(31)【優先権主張番号】62/555,110

(32)【優先日】2017-09-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/566,824

(32)【優先日】2017-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519288755

【氏名又は名称】ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100217663

【弁理士】

【氏名又は名称】末広 尚也

(72)【発明者】

【氏名】チャン， グレゴリー ピー．

(72)【発明者】

【氏名】チュン， アン エフ．

(72)【発明者】

【氏名】ヘイニー， ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】ランディ， ブラッドリー エム．

(72)【発明者】

【氏名】プリンツ， ビアンカ

(72)【発明者】

【氏名】グリンバーグ， アシャ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６、および腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにがんの処置に有用な医薬組成物および治療方法を提供する。
【解決手段】（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）に結合する第１の抗原結合部位と、（ｂ）ＥｐＣＡＭ、がん抗原１２５、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ、ネクチン細胞接着分子４、フコシル－ＧＭ１、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質８、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９、溶質キャリアファミリー４４メンバー４、およびシアリル化ルイスａ抗原からなる群から選択される抗原に結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）表面抗原分類１６（ＣＤ１６）に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを含むタンパク質を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）に結合する第１の抗原結
合部位と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭ、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ
（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル－ＧＭ１（モ
ノシアロテトラヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイ
ナーゼドメイン含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロ
テイナーゼドメイン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メン
バー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、およびシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９－９）からなる群
から選択される抗原に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）表面抗原分類１６（ＣＤ１６）に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくは
その一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【請求項2】

（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ
１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【請求項3】

（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２
ｂ）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル－ＧＭ１（モノシアロテト
ラヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイ
ン含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼド
メイン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬ
Ｃ４４Ａ４）、およびシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９－９）から選択される腫瘍関連
抗原に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ
１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【請求項4】

（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）から選択される腫
瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ
１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【請求項5】

（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原Ｎｅｃｔｉｎ４に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ
１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【請求項6】

（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）多発性骨髄腫関連抗原フコシル－ＧＭ１に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ
１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【請求項7】

（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＳＬＣ４４Ａ４から選択されるＴ細胞関連腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合部
位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ
１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【請求項8】

前記第１の抗原結合部位が、ヒト、非ヒト霊長類、およびげっ歯動物におけるＮＫＧ２
Ｄに結合する、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項9】

前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項
１から８のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項10】

前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する
、請求項９に記載のタンパク質。

【請求項11】

前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項
９または１０に記載のタンパク質。

【請求項12】

前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じ
ポリペプチド上に存在する、請求項１１に記載のタンパク質。

【請求項13】

前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、前記第２の抗原結合部位の前記軽
鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項１１または１２に
記載のタンパク質。

【請求項14】

（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と
、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ
１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【請求項15】

前記ｓｃＦｖが、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその一
部分またはＣＤ１６に結合する前記第３の抗原結合部位に、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ
－Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結しており、前記ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメイ
ンおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４に記載のタンパク質。

【請求項16】

前記ｓｃＦｖが、前記抗体Ｆｃドメインに連結している、請求項１５に記載のタンパク
質。

【請求項17】

前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスル
フィド架橋を形成する、請求項１４または１５に記載のタンパク質。

【請求項18】

前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ
１００との間で形成されている、請求項１７に記載のタンパク質。

【請求項19】

前記ｓｃＦｖが前記抗体Ｆｃドメインに連結しており、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ド
メインが前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置しており、かつ、前記ｓｃ
Ｆｖの前記重鎖可変ドメインに、可動性リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４
（（Ｇ４Ｓ）_４）を介して連結しており、前記Ｆａｂが前記抗体Ｆｃドメインに連結して
いる、請求項１８に記載のタンパク質。

【請求項20】

前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインに、可
動性リンカーを介して連結している、請求項１５から１９のいずれか一項に記載のタンパ
ク質。

【請求項21】

前記可動性リンカーが、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４（（Ｇ４Ｓ）_４）を含
む、請求項２０に記載のタンパク質。

【請求項22】

前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインのＮ末
端またはＣ末端に位置している、請求項１５から２１のいずれか一項に記載のタンパク質
。

【請求項23】

前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末
端に位置している、請求項２２に記載のタンパク質。

【請求項24】

前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその
一部分またはＣＤ１６に結合する前記第３の抗原結合部位に連結している、請求項１４か
ら２３のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項25】

前記Ｆａｂ断片の重鎖部分が、重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、前記重
鎖可変ドメインが、前記ＣＨ１ドメインに連結している、請求項２４に記載のタンパク質
。

【請求項26】

前記Ｆａｂ断片が、前記抗体Ｆｃドメインに連結している、請求項２４または２５に記
載のタンパク質。

【請求項27】

配列番号２０８および配列番号２０９から選択される配列を含む、請求項１４から２６
のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項28】

抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖを含み、前記抗体Ｆｃドメインに連結した前記ｓ
ｃＦｖが、配列番号２１０および配列番号２１１から選択される配列によって表される、
請求項１５から２７のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項29】

配列番号２１２および配列番号２１３から選択される配列を含む、請求項１５から２７
のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項30】

配列番号２１０および配列番号２１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％
同一の配列を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項31】

配列番号２１０および配列番号２１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％
同一の配列を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項32】

配列番号２１０および配列番号２１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％
同一の配列を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項33】

配列番号２１２および配列番号２１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％
同一の配列を含む、請求項１５から３２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項34】

配列番号２１２および配列番号２１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％
同一の配列を含む、請求項１５から３２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項35】

配列番号２１２および配列番号２１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％
同一の配列を含む、請求項１５から３２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項36】

（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第１の抗原結合部位と
、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ
１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【請求項37】

ＥｐＣＡＭに結合するさらなる抗原結合部位をさらに含む、請求項３６に記載のタンパ
ク質。

【請求項38】

ＥｐＣＡＭに結合する前記第２の抗原結合部位が、Ｆａｂ断片である、請求項３６また
は３７に記載のタンパク質。

【請求項39】

ＥｐＣＡＭに結合する前記第２の抗原結合部位および前記さらなる抗原結合部位が、Ｆ
ａｂ断片である、請求項３７または３８に記載のタンパク質。

【請求項40】

ＥｐＣＡＭに結合する前記第２の抗原結合部位および前記さらなる抗原結合部位が、ｓ
ｃＦｖである、請求項３６または３７に記載のタンパク質。

【請求項41】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽
鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置している、請求項３６から４０のいずれか一
項に記載のタンパク質。

【請求項42】

前記軽鎖可変ドメインが、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメイン
のＮ末端に位置している、請求項４１に記載のタンパク質。

【請求項43】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃド
メインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に連結している
、請求項３６から４２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項44】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃド
メインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に、Ａｌａ－Ｓ
ｅｒまたはＧｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結している、請求項４３に記
載のタンパク質。

【請求項45】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃド
メインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位のＣ末端に、Ｓ
ＧＳＧＧＧＧＳを含む可動性リンカー（配列番号２０７）を介して連結している、請求項
４３に記載のタンパク質。

【請求項46】

前記抗体ＦｃドメインのＣ末端が、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変
ドメインのＮ末端に連結している、請求項４５に記載のタンパク質。

【請求項47】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインと前記
ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとの間でジスルフィド架橋が形成されている、請求項３
６から４６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項48】

前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ
１００との間で形成されている、請求項４７に記載のタンパク質。

【請求項49】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが、前記軽鎖可変ドメ
インに、可動性リンカーを介して連結している、請求項３６から４８のいずれか一項に記
載のタンパク質。

【請求項50】

前記可動性リンカーが、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４（Ｇ４Ｓ）_４）を含む
、請求項４９に記載のタンパク質。

【請求項51】

前記第２の抗原結合部位ｓｃＦｖおよび前記さらなる抗原結合部位ｓｃＦｖが、ＣＤ１
６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合
する前記第３の抗原結合部位に、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結している、請
求項４０から５０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項52】

前記第２の抗原結合部位ｓｃＦｖおよび前記さらなる抗原結合部位ｓｃＦｖが、前記抗
体Ｆｃドメインに、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結している、請求項４０から
５１のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項53】

前記第２の抗原結合部位および／または前記さらなる抗原結合部位の前記重鎖可変ドメ
インと前記軽鎖可変ドメインとの間でジスルフィド架橋が形成されている、請求項５１ま
たは５２に記載のタンパク質。

【請求項54】

前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ
１００との間で形成されている、請求項５３に記載のタンパク質。

【請求項55】

ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメインのＮ末端に位置している軽鎖
可変ドメインを含み、前記軽鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインに
、可動性リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４（Ｇ４Ｓ）_４）を介して連結し
ており、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、前記抗体Ｆｃドメインに、Ａｌａ－Ｓｅ
ｒまたはＧｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結している、請求項３６から５
４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項56】

配列番号２０３のアミノ酸配列を含むタンパク質。

【請求項57】

配列番号２０３および配列番号２０４のアミノ酸配列を含むタンパク質。

【請求項58】

配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むタンパク
質。

【請求項59】

配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むタンパク
質。

【請求項60】

配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むタンパク
質。

【請求項61】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７
、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、および配
列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含
む、先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項62】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号４１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン
と、配列番号４２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６
０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項63】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号４９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン
と、配列番号５０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６
０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項64】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号５７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン
と、配列番号５８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６
０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項65】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号５９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン
と、配列番号６０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６
０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項66】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号６１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン
と、配列番号６２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６
０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項67】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号６９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン
と、配列番号７０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６
０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項68】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号７７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン
と、配列番号７８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６
０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項69】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号８５と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン
と、配列番号８６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６
０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項70】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号９３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン
と、配列番号９４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６
０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項71】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイ
ンと、配列番号１０２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１か
ら６０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項72】

前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイ
ンと、配列番号１０４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１か
ら６０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項73】

前記第１の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項１から１０のいずれか一
項に記載のタンパク質。

【請求項74】

前記単一ドメイン抗体が、Ｖ_ＨＨ断片またはＶ_ＮＡＲ断片である、請求項７３に記載の
タンパク質。

【請求項75】

前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項
１から１０または７３から７４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項76】

前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じ
ポリペプチド上に存在する、請求項７５に記載のタンパク質。

【請求項77】

前記第２の抗原結合部位がＥｐＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可
変ドメインが配列番号１１５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の
抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１１９と少なくとも９０％同一のアミノ
酸配列を含む、請求項１、２、または６１から７２のいずれかに記載のタンパク質。

【請求項78】

前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号１１６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１１７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１１８のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載のタンパク質。

【請求項79】

前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
前記配列番号１２０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
前記配列番号１２１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
前記配列番号１２２のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載のタンパク質。

【請求項80】

前記第２の抗原結合部位がＥｐＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可
変ドメインが配列番号１２３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の
抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１２７と少なくとも９０％同一のアミノ
酸配列を含む、請求項１、２、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項81】

前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号１２４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１２５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１２６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載のタンパク質。

【請求項82】

前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
配列番号１２８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１２９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１３０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８１に記載のタンパク質。

【請求項83】

前記第２の抗原結合部位がＥｐＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可
変ドメインが配列番号１３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の
抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１３５と少なくとも９０％同一のアミノ
酸配列を含む、請求項１、２、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項84】

前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号１３２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１３３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１３４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８３に記載のタンパク質。

【請求項85】

前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
配列番号１３６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１３７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１３８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載のタンパク質。

【請求項86】

前記第２の抗原結合部位がＥｐＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可
変ドメインが配列番号１３９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の
抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１４３と少なくとも９０％同一のアミノ
酸配列を含む、請求項１、２、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項87】

前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号１４０のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１４１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１４２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８６に記載のタンパク質。

【請求項88】

前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
配列番号１４４のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１４５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１４６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８７に記載のタンパク質。

【請求項89】

前記第２の抗原結合部位がＣＡ１２５に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可
変ドメインが配列番号１５５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の
抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１５９と少なくとも９０％同一のアミノ
酸配列を含む、請求項１、３、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項90】

前記第２の抗原結合部位がＣＡ１２５に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可
変ドメインが配列番号１６３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の
抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１６７と少なくとも９０％同一のアミノ
酸配列を含む、請求項１、３、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項91】

前記第２の抗原結合部位がＮａＰｉ２ｂに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖
可変ドメインが配列番号１７１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２
の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１７５と少なくとも９０％同一のアミ
ノ酸配列を含む、請求項１、４、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質
。

【請求項92】

前記第２の抗原結合部位がＮｅｃｔｉｎ４に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重
鎖可変ドメインが配列番号１７９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第
２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１８３と少なくとも９０％同一のア
ミノ酸配列を含む、請求項１、５、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク
質。

【請求項93】

前記第２の抗原結合部位がフコシル－ＧＭ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記
重鎖可変ドメインが配列番号１８７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記
第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１９１と少なくとも９０％同一の
アミノ酸配列を含む、請求項１、６、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパ
ク質。

【請求項94】

前記第２の抗原結合部位がＳＬＣ４４Ａ４に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重
鎖可変ドメインが配列番号１９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第
２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１９９と少なくとも９０％同一のア
ミノ酸配列を含む、請求項１、７、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク
質。

【請求項95】

前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請
求項１から９４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項96】

前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％
同一のアミノ酸配列を含む、請求項９５に記載のタンパク質。

【請求項97】

前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸
配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０
、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４
、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９
からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる、請求項９６に記載のタ
ンパク質。

【請求項98】

ＮＫＧ２Ｄに１０ｎＭのＫ_Ｄまたはそれよりも弱い親和性で結合する、請求項１から９
６のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項99】

先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質および薬学的に許容される担体を含
む製剤。

【請求項100】

請求項１から９８のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸
を含む細胞。

【請求項101】

請求項１から９８のいずれか一項に記載のタンパク質に腫瘍およびナチュラルキラー細
胞を曝露することを含む、腫瘍細胞死を直接的および／または間接的に増強する方法。

【請求項102】

請求項１から９８のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項９９に記載の製剤を
患者に投与することを含む、がんを処置する方法。

【請求項103】

前記第２の結合部位がＥｐＣＡＭに結合する場合、前記がんが、頭頸部がん、卵巣がん
、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、食道がん、および肺
がんからなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年９月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５５５，１１０号
、および２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６６，８２４号の
利益および優先権を主張しており、そのそれぞれの開示全体は、すべての目的のためにそ
の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表

【0002】

本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、その全体が参照に
より本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年９月６日に作成され、
ＤＦＹ－０３８ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３２１，３９５バイトのサイズで
ある。

【0003】

本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、および腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タン
パク質に関する。

【背景技術】

【0004】

がんは、この疾患を処置するための文献に報告されている相当の研究努力および科学進
歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんの中に
は、前立腺がん、乳がん、肺がん、および結腸直腸がんが含まれる。前立腺がんは、男性
におけるがんの最も一般的な形態である。乳がんは依然として女性における主要な死因で
ある。多発性骨髄腫、白血病、およびリンパ腫を含む血液および骨髄がんもまた、頻繁に
診断されるがんの種類である。これらのがんに対する現在の処置選択肢は、すべての患者
に効果的というわけではなく、および／または実質的な有害副作用を有する可能性がある
。他の種類のがんも、既存の治療選択肢を使用して処置することが依然として困難である
。

【0005】

がん免疫療法は、それらが非常に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞
の破壊を促進することができるので望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融
合タンパク質は、腫瘍細胞の破壊を促進するために腫瘍細胞およびＴ細胞に結合する、文
献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原およびある特定の免疫
細胞に結合する抗体は文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およ
びＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。

【0006】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の構成要素であり、循環リンパ球の約
１５％を構成する。ＮＫ細胞は実質的にすべての組織に浸潤し、最初は、事前感作を必要
とせずに腫瘍細胞を効果的に殺傷するそれらの能力によって特徴付けられた。活性化され
たＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリンおよび
グランザイムを含有する細胞傷害性顆粒を介して、ならびに死受容体経路を介して、標的
細胞を殺傷する。活性化されたＮＫ細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を促進す
るＩＦＮ－ガンマおよびケモカインなどの炎症性サイトカインを分泌する。

【0007】

ＮＫ細胞は、それらの表面における様々な活性化受容体および阻害受容体を介してシグ
ナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇すると、それらの活性は、キ
ラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいはＮＫ
細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇すると、それらは、それらの活性化受容体（例えば
、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介し
て活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面におけるＣＤ１６受容体を介していくつ
かの免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的
な感受性は、刺激シグナルおよび阻害シグナルの合計に依存する。

【0008】

上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、上皮におけるＣａ^２＋非依存性ホモタイプ細胞間
接着を媒介する膜貫通糖タンパク質である。ＥｐＣＡＭは、細胞シグナル伝達、遊走、増
殖、および分化にも関与する。さらに、ＥｐＣＡＭには、ｃ－ｍｙｃ、ｅ－ｆａｂｐ、な
らびにサイクリンＡおよびＥを上方調節する能力により腫瘍を形成させる潜在性がある。
ＥｐＣＡＭは上皮および上皮由来の新生物においてもっぱら発現されるので、ＥｐＣＡＭ
を、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝
がん、食道がん、および肺がんなどの種々のがんの診断マーカーとして使用することがで
きる。ＥｐＣＡＭは、腫瘍形成および癌の転移において役割を果たすようであり、したが
って、ＥｐＣＡＭはまた、潜在的な予後マーカーとしておよび免疫療法戦略の潜在的な標
的としての機能を果たし得る。

【0009】

ＣＡ１２５は、ムチン１６としても公知であり、ムチンファミリー糖タンパク質のメン
バーである。ＣＡ－１２５は、卵巣がん、子宮体がん、および膵がんを含む特定の種類の
がんを有する一部の患者の血液において上昇し得る腫瘍マーカーまたはバイオマーカーと
して適用されている。ＣＡ－１２５は、ナチュラルキラー細胞の応答を抑制し、それによ
り、がん細胞を免疫応答から保護することを含むいくつかの異なる機構によって、および
、細胞成長を可能にし、細胞運動性を促進することによって、腫瘍形成および腫瘍増殖の
進行において役割を果たすことが示されている。

【0010】

ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）は、Ｎａ＋共輸送による
リン酸の細胞内への能動的輸送に関与する。例えば、ＮａＰｉ２ｂは、腸の刷子縁膜にお
ける主要なリン酸輸送タンパク質であり、肺胞におけるサーファクタントの合成において
役割を有する。ＮａＰｉ２ｂはまた、肺がん、卵巣がん、および甲状腺がんなどの様々な
がんにおいて発現される抗原でもある。

【0011】

Ｎｅｃｔｉｎ４は、Ｃａ^２＋非依存性細胞接着に関与する細胞接着分子のファミリーで
あるネクチンファミリーのメンバーである。ネクチンは、遍在的に発現され、例えば、上
皮の接着結合またはニューロン組織の化学的シナプスなど、広範囲の組織における接着の
役割を有する。ネクチンはまた、腫瘍関連抗原でもあり、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、
膵がん、結腸直腸がん、および肺がんなどのがんにおいて発現される。

【0012】

ガングリオシドは、細胞シグナル伝達プロセスならびに細胞間相互作用および細胞マト
リックス間相互作用の両方をモジュレートすることを通じて、成長、分化、遊走、および
アポトーシスを含む多くの生理的プロセスに関係づけられている。ＧＭ１はガングリオシ
ドであり、フコシル－ＧＭ１は、非還元末端において末端ガラクトースがα－１，２－フ
コシル化された独特の構造を有するガングリオシドである。フコシル－ＧＭ１は、非常に
少数の正常組織において発現されるが、小細胞肺がん、神経芽細胞腫、肝がんなどの様々
ながんに存在する。したがって、フコシル－ＧＭ１は、腫瘍マーカーおよび小細胞肺がん
、神経芽細胞腫、肝がんの抗体免疫療法における標的抗原としての候補と考えられている
。

【0013】

ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）タンパク質は、膜に結合
した分子のタンパク質エクトドメインシェディングにおいて優勢な役割を有する。ＡＤＡ
Ｍタンパク質は、発生の間の細胞間シグナル伝達および恒常性の重要な調節因子として現
れ、その調節が変更されるがんなどの病理に寄与すると考えられている。ＡＤＡＭ８は、
ＡＤＡＭファミリーのメンバーであり、膵がん、乳がん、肺がん、および腎がんにおいて
過剰発現される。ＡＤＡＭ９は、ＥＧＦ、ＦＧＦＲ２ｉｉｉｂ、Ｔｉｅ－２、Ｆｌｋ－１
、ＥｐｈＢ４、ＣＤ４０、ＶＣＡＭ－１、およびＶＥ－カドヘリンなどの、腫瘍形成およ
び血管新生において重要な役割を有するいくつもの分子を切断し、放出することが示され
ている。ＡＤＡＭ９は、腎がん、乳がん、肺がん、肝がん、膵がん、黒色腫、子宮頸がん
、前立腺がん、骨肉腫、および脳がんにおいて過剰発現される。

【0014】

ＳＬＣ４４Ａ４は、ＣＴＬ４としても公知であり、コリン輸送体様タンパク質（ＣＴＬ
１－５）として公知の溶質キャリアタンパク質のファミリーのメンバーである。ＳＬＣ４
４Ａ４は、コリン輸送に関与することは示されていないが、アセチルコリン合成および輸
送ならびにビタミンＢ１のリン酸化された形態であるチアミンピロリン酸の取り込みに関
連付けられている。ＳＬＣ４４Ａ４は、通常、分泌性上皮細胞の頂端表面に発現されるが
、様々な上皮腫瘍、中でも、膵がん、前立腺がん、および胃がんにおいて著しく上方調節
される。
ＣＡ１９－９は、炭水化物抗原シアリルルイスａの一般用語である。ＣＡ１９－９は、
膵がん、結腸直腸がん、胆管癌、および肝がんなどの消化器のがんにおいて過剰発現され
る。したがって、ＣＡ１９－９は、これら上記のがんの診断のために最も頻繁に適用され
る血清腫瘍マーカーである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0015】

【特許文献1】国際公開第２０１６／１３４３７１号

【特許文献2】国際公開第２０１５／０９５４１２号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明は、腫瘍関連抗原（表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される
）、ならびにナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結
合する多重特異性結合タンパク質を提供する。かかるタンパク質は２種以上のＮＫ活性化
受容体と会合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断し得る。ある特
定の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにげっ歯動物およびカニクイザルなどの他
の種においてＮＫ細胞を刺激し得る。本発明の様々な態様および実施形態を以下にさらに
詳細に記載する。

【0017】

したがって、本発明の一態様は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、ＥｐＣ
ＡＭ、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ
）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル－ＧＭ１（モノシアロテトラ
ヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン
含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメ
イン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ
４４Ａ４）、ならびにシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９－９）から選択される抗原に結
合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一
部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを組み込んだタンパク質を提供す
る。抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、
抗体のように配列されるか、またはｓｃＦｖを形成するために一緒に融合される）を組み
込んでいてもよいか、または抗原結合部位の１つもしくは複数は、ラクダ科抗体のような
Ｖ_ＨＨ抗体もしくは軟骨魚類に見出されるもののようなＶ_ＮＡＲ抗体などの単一ドメイン
抗体であってもよい。

【0018】

本発明は、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６、ならびに、ＥｐＣＡＭ、がん抗原１２５（Ｃ
Ａ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン細胞接着分子
４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル－ＧＭ１（モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド
）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質８（ＡＤＡ
Ｍ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９（Ａ
ＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ならびにシア
リル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９－９）から選択される抗原に結合する多重特異性結合タン
パク質を提供する。

【0019】

本開示のいくつかのタンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインも
しくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に連結したＦａｂ断片を
含む。

【0020】

本開示のいくつかのタンパク質は、Ｆａｂ断片を含み、ここで、Ｆａｂ断片の重鎖部分
は重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、重鎖可変ドメインはＣＨ１ドメインに
連結している。

【0021】

本開示のいくつかのタンパク質は、抗体Ｆｃドメインに連結したＦａｂ断片を含む。

【0022】

一態様では、本発明は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合
部位と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合
部位と、（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分また
はＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを含むタンパク質を提供する。本発明は、Ｎ
ＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位がＦａｂ断片であり、腫瘍関連抗原ＥｐＣＡＭに
結合する第２の抗原結合部位がｓｃＦｖであるタンパク質を提供する。

【0023】

本開示に記載のある特定のタンパク質は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを
含み、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１
６に結合する第３の抗原結合部位に、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒを含
むヒンジを介して連結した、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含む。本開示のいくつか
のタンパク質は、抗体Ｆｃドメインに連結した、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含む
。本開示のいくつかのタンパク質は、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖの重鎖可変ドメイ
ンを含み、この重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を
形成している。

【0024】

本開示のいくつかのタンパク質は、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ
１００との間でジスルフィド架橋が形成されている、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを
含む。

【0025】

本開示のいくつかのタンパク質は、抗体Ｆｃドメインに連結した、ＥｐＣＡＭを標的と
するｓｃＦｖを含み、ここで、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメ
インのＮ末端に位置しており、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインに、可動性リンカー（Ｇｌｙ
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）_４（Ｇ４Ｓ）_４）（配列番号２０６）を介して連結しており
、ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片は、抗体Ｆｃドメインに連結している。

【0026】

本開示のいくつかのタンパク質は、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含み、ここで、
重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置している
。

【0027】

本開示のいくつかのタンパク質は、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含み、ここで、
軽鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置している。

【0028】

本発明の一態様では、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む
第１の抗原結合部位と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ
１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合す
る第３の抗原結合部位とを含むタンパク質が提供される。ある特定の実施形態では、本開
示のタンパク質は、ＥｐＣＡＭに結合するさらなる抗原結合部位をさらに含む。ある特定
の実施形態では、本開示に記載のタンパク質の第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合
するＦａｂ断片である。ある特定の実施形態では、本開示に記載のタンパク質の第２のお
よびさらなる抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合するＦａｂ断片である。

【0029】

ある特定の実施形態では、本開示に記載のタンパク質の第２のおよびさらなる抗原結合
部位は、ＥｐＣＡＭに結合するｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに
結合するｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ
末端に位置している。ある特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合
するｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置している。

【0030】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、ＣＤ１６に結合するのに
十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部
位に連結している。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、ＣＤ１
６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する
第３の抗原結合部位に、Ａｌａ－Ｓｅｒ（例えば、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、ＮａＰｉ２
ｂ、Ｎｅｃｔｉｎ４、フコシル－ＧＭ１、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＳＬＣ４４Ａ４、も
しくはＣＡ１９－９に結合するさらなる抗原結合部位を含むＴｒｉＮＫＥＴにおいて）ま
たはＧｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒ（例えば、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、ＮａＰｉ２ｂ、Ｎｅｃ
ｔｉｎ４、フコシル－ＧＭ１、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＳＬＣ４４Ａ４、もしくはＣＡ
１９－９に結合するさらなる抗原結合部位を含まないＴｒｉＮＫＥＴにおいて）を含むヒ
ンジを介して連結している。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは
、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に
結合する第３の抗原結合部位のＣ末端に、Ｇ４Ｓを含む可動性リンカーを介して連結して
いる。ある特定の実施形態では、抗体ＦｃドメインのＣ末端は、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓ
ｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端に連結している。

【0031】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、ｓｃＦｖの重鎖可変ド
メインとｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとの間でジスルフィド架橋が形成されている。ある
特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメイ
ンのＣ１００との間で形成されている。

【0032】

本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２１０および配列番号２１１から選択され
る配列を含む。

【0033】

本開示のいくつかのタンパク質は、抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖを含み、ここ
で、抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖは、配列番号２０８および配列番号２０９から
選択される配列によって表される。

【0034】

本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０５および配列番号２１３の配列を含む
。

【0035】

本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２１０および配列番号２１１から選択され
るアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。

【0036】

本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２１０および配列番号２１１から選択され
るアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む。

【0037】

本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２１０および配列番号２１１から選択され
るアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含む。

【0038】

本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む。

【0039】

本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０３および配列番号２０４のアミノ酸配
列を含む。

【0040】

本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％
同一のアミノ酸配列を含む。本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０３のアミノ
酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。本開示のいくつかのタンパク質は
、配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。

【0041】

一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、例えば、配列番号
１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一のアミノ酸配列を有すること、
および／または配列番号１のＣＤＲ１配列（配列番号１０５）、ＣＤＲ２配列（配列番号
１０６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１０７）と同一のアミノ酸配列を組み込むこと
により、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。配列番号１に
関連する重鎖可変ドメインを様々な軽鎖可変ドメインと連結して、ＮＫＧ２Ｄ結合部位を
形成することができる。例えば、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込んだ第
１の抗原結合部位は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、
２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、および４０に関連する配列の
いずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインをさらに組み込んでいてもよい。例えば、
第１の抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一
のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号２、４、６、８、１０、１２、
１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、お
よび４０から選択される配列のいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００
％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。

【0042】

代替的に、第１の抗原結合部位は、配列番号４１に関連する重鎖可変ドメインと、配列
番号４２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結
合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１０
０％）同一であってよく、かつ／または配列番号４１のＣＤＲ１配列（配列番号４３）、
ＣＤＲ２配列（配列番号４４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号４５）と同一のアミノ酸
配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列
番号４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／ま
たは配列番号４２のＣＤＲ１配列（配列番号４６）、ＣＤＲ２配列（配列番号４７）、お
よびＣＤＲ３配列（配列番号４８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0043】

他の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号４９に関連する重鎖可変ドメイン
と、配列番号５０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１
の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４９と少なくとも９０％（例えば、９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もし
くは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号４９のＣＤＲ１配列（配列番号
５１）、ＣＤＲ２配列（配列番号５２）、およびＣＤＲ３配列（配列番号５３）と同一の
アミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメイン
は、配列番号５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、
かつ／または配列番号５０のＣＤＲ１配列（配列番号５４）、ＣＤＲ２配列（配列番号５
５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号５６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよ
い。

【0044】

代替的に、第１の抗原結合部位は、例えば、配列番号５７と少なくとも９０％（例えば
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
、または１００％）同一のアミノ酸配列と、配列番号５８と少なくとも９０％（例えば、
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、
または１００％）同一のアミノ酸配列とを有することにより、それぞれ、配列番号５７に
関連する重鎖可変ドメインと、配列番号５８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んで
いてもよい。

【0045】

別の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号５９に関連する重鎖可変ドメイン
と、配列番号６０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１
の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号５９と少なくとも９０％（例えば、９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もし
くは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号５９のＣＤＲ１配列（配列番号
１０９）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１０）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１１）と
同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ド
メインは、配列番号６０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であって
よく、かつ／または配列番号６０のＣＤＲ１配列（配列番号１１２）、ＣＤＲ２配列（配
列番号１１３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１４）と同一のアミノ酸配列を組み込
んでいてもよい。

【0046】

一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号６１に関
連する重鎖可変ドメインと、配列番号６２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでい
てもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６１と少なくと
も９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６１の
ＣＤＲ１配列（配列番号６３）、ＣＤＲ２配列（配列番号６４）、およびＣＤＲ３配列（
配列番号６５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合
部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００
％）同一であってよく、かつ／または配列番号６２のＣＤＲ１配列（配列番号６６）、Ｃ
ＤＲ２配列（配列番号６７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号６８）と同一のアミノ酸配
列を組み込んでいてもよい。

【0047】

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号６９に関連する重鎖可変ドメイ
ンと、配列番号７０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第
１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６９と少なくとも９０％（例えば、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、も
しくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６９のＣＤＲ１配列（配列番
号７１）、ＣＤＲ２配列（配列番号７２）、およびＣＤＲ３配列（配列番号７３）と同一
のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメイ
ンは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく
、かつ／または配列番号７０のＣＤＲ１配列（配列番号７４）、ＣＤＲ２配列（配列番号
７５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号７６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいても
よい。

【0048】

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号７７に関連する重鎖可変ドメイ
ンと、配列番号７８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第
１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７７と少なくとも９０％（例えば、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、も
しくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号７７のＣＤＲ１配列（配列番
号７９）、ＣＤＲ２配列（配列番号８０）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８１）と同一
のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメイ
ンは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく
、かつ／または配列番号７８のＣＤＲ１配列（配列番号８２）、ＣＤＲ２配列（配列番号
８３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいても
よい。

【0049】

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号８５に関連する重鎖可変ドメイ
ンと、配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第
１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、も
しくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号８５のＣＤＲ１配列（配列番
号８７）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８９）と同一
のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメイ
ンは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく
、かつ／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号
９１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいても
よい。

【0050】

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号９３に関連する重鎖可変ドメイ
ンと、配列番号９４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第
１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９３と少なくとも９０％（例えば、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、も
しくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号９３のＣＤＲ１配列（配列番
号９５）、ＣＤＲ２配列（配列番号９６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号９７）と同一
のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメイ
ンは、配列番号９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく
、かつ／または配列番号９４のＣＤＲ１配列（配列番号９８）、ＣＤＲ２配列（配列番号
９９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１００）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいて
もよい。

【0051】

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば配列番号１０１と少なくとも９０
％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列と、配列番号１０２と少なくとも９０
％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列とを有することにより、それぞれ、配
列番号１０１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１０２に関連する軽鎖可変ドメイ
ンとを組み込んでいてもよい。

【0052】

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば配列番号１０３と少なくとも９０
％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列と、配列番号１０４と少なくとも９０
％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列とを有することにより、それぞれ、配
列番号１０３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１０４に関連する軽鎖可変ドメイ
ンとを組み込んでいてもよい。

【0053】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合することができ、配列
番号１１５に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１１９に関連する軽鎖可変ドメイ
ンを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番
号１１５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／ま
たは配列番号１１５のＣＤＲ１配列（配列番号１１６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１７
）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよ
い。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１１９と少なくとも９
０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１１９のＣ
ＤＲ１配列（配列番号１２０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２１）、およびＣＤＲ３配列
（配列番号１２２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0054】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合することができ、配列
番号１２３に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１２７に関連する軽鎖可変ドメイ
ンを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番
号１２３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／ま
たは配列番号１２３のＣＤＲ１配列（配列番号１２４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２５
）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１２６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよ
い。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１２７と少なくとも９
０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１２７のＣ
ＤＲ１配列（配列番号１２８）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２９）、およびＣＤＲ３配列
（配列番号１３０）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0055】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合することができ、配列
番号１３１に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１３５に関連する軽鎖可変ドメイ
ンを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番
号１３１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／ま
たは配列番号１３１のＣＤＲ１配列（配列番号１３２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１３３
）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１３４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよ
い。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１３５と少なくとも９
０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１３５のＣ
ＤＲ１配列（配列番号１３６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１３７）、およびＣＤＲ３配列
（配列番号１３８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0056】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合することができ、配列
番号１３９に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１４３に関連する軽鎖可変ドメイ
ンを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番
号１３９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／ま
たは配列番号１３９のＣＤＲ１配列（配列番号１４０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１４１
）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１４２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよ
い。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１４３と少なくとも９
０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１４３のＣ
ＤＲ１配列（配列番号１４４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１４５）、およびＣＤＲ３配列
（配列番号１４６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0057】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＡ１２５に結合することができ、配列
番号１５５に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１５９に関連する軽鎖可変ドメイ
ンを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番
号１５５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／ま
たは配列番号１５５のＣＤＲ１配列（配列番号１５６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１５７
）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１５８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよ
い。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１５９と少なくとも９
０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１５９のＣ
ＤＲ１配列（配列番号１６０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１６１）、およびＣＤＲ３配列
（配列番号１６２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0058】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＡ１２５に結合することができ、配列
番号１６３に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１６７に関連する軽鎖可変ドメイ
ンを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番
号１６３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／ま
たは配列番号１６３のＣＤＲ１配列（配列番号１６４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１６５
）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１６６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよ
い。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１６７と少なくとも９
０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１６７のＣ
ＤＲ１配列（配列番号１６８）、ＣＤＲ２配列（配列番号１６９）、およびＣＤＲ３配列
（配列番号１７０）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0059】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＮａＰｉ２ｂに結合することができ、配
列番号１７１に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１７５に関連する軽鎖可変ドメ
インを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列
番号１７１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／
または配列番号１７１のＣＤＲ１配列（配列番号１７２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１７
３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１７４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいても
よい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１７５と少なくとも
９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１７５の
ＣＤＲ１配列（配列番号１７６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１７７）、およびＣＤＲ３配
列（配列番号１７８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0060】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、Ｎｅｃｔｉｎ４に結合することができ、
配列番号１７９に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１８３に関連する軽鎖可変ド
メインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配
列番号１７９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ
／または配列番号１７９のＣＤＲ１配列（配列番号１８０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１
８１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１８２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいて
もよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１８３と少なくと
も９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１８３
のＣＤＲ１配列（配列番号１８４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１８５）、およびＣＤＲ３
配列（配列番号１８６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0061】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、フコシル－ＧＭ１に結合することができ
、配列番号１８７に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１９１に関連する軽鎖可変
ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、
配列番号１８７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、か
つ／または配列番号１８７のＣＤＲ１配列（配列番号１８８）、ＣＤＲ２配列（配列番号
１８９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１９０）と同一のアミノ酸配列を組み込んでい
てもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９１と少なく
とも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１９
１のＣＤＲ１配列（配列番号１９２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１９３）、およびＣＤＲ
３配列（配列番号１９４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0062】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＳＬＣ４４Ａ４に結合することができ、
配列番号１９５に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１９９に関連する軽鎖可変ド
メインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配
列番号１９５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ
／または配列番号１９５のＣＤＲ１配列（配列番号１９６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１
９７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１９８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいて
もよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９９と少なくと
も９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１９９
のＣＤＲ１配列（配列番号２００）、ＣＤＲ２配列（配列番号２０１）、およびＣＤＲ３
配列（配列番号２０２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

【0063】

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位に存在する軽鎖可変
ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込んでい
る。

【0064】

一部の実施形態では、タンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン
の一部を組み込んでおり、ここで、抗体Ｆｃドメインは、ヒンジおよびＣＨ２ドメイン、
ならびに／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４～３３２と少なくとも９０％同一
のアミノ酸配列を含む。

【0065】

本開示のいくつかのタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに１０ｎＭのＫ_Ｄまたはそれよりも弱い
親和性で結合する。

【0066】

これらのタンパク質の１つを含有する製剤；これらのタンパク質を発現する１つまたは
複数の核酸を含有する細胞、およびこれらのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する
方法も提供される。

【0067】

本発明の別の態様は、患者におけるがんを処置する方法を提供する。方法は、治療有効
量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を、それを必要とする患者に投与するこ
とを含む。多重特異性結合タンパク質を使用して処置される例示的ながんとしては、例え
ば、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝
がん、食道がん、および肺がんが挙げられる。

【図面の簡単な説明】

【0068】

【図1】図１は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ））の図である。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、または腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかを表し得る。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインと腫瘍関連抗原結合ドメインは共通の軽鎖を共有し得る。

【0069】

【図2】図２は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の図である。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかは、ｓｃＦｖフォーマットを取り得る（右アーム）。

【0070】

【図3】図３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。

【0071】

【図4】図４は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。

【0072】

【図5】図５は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。

【0073】

【図6】図６は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）倍率を示すフローサイトメトリーによる、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフである（ＦＯＢ）。

【0074】

【図7】図７は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）倍率を示すフローサイトメトリーによる、マウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフである（ＦＯＢ）。

【0075】

【図8】図８は、天然リガンドのＵＬＢＰ－６と競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。

【0076】

【図9】図９は、天然リガンドのＭＩＣＡと競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。

【0077】

【図10】図１０は、天然リガンドのＲａｅ－１デルタと競合することによる、組換えマウスＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。

【0078】

【図11】図１１は、ヒトＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ－アルファ陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。

【0079】

【図12】図１２は、マウスＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ－アルファ陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。

【0080】

【図13】図１３は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。

【0081】

【図14】図１４は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。

【0082】

【図15】図１５は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。

【0083】

【図16】図１６は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。

【0084】

【図17】図１７は、腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の細胞傷害効果を示す棒グラフである。

【0085】

【図18】図１８は、示差走査型蛍光定量法によって測定された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の融解温度を示す棒グラフである。

【0086】

【図19】図１９Ａ～１９Ｃは、ＣＤ１６結合およびＮＫＧ２Ｄ結合を使用したＮＫ細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図１９Ａは、ＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９Ｂは、ＩＦＮ－γのレベルを示し、図１９Ｃは、ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ－γのレベルを示す。グラフは、平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。データは、５名の異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。

【0087】

【図20】図２０は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体であるＴｒｉｏｍａｂ形態における三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、ラット抗体の１／２およびマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体構築物であり得る。

【0088】

【図21】図２１は、ノブイントゥホール（ＫＩＨ：ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）技術を用いるＫｉＨ共通の軽鎖形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＫｉＨは、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、およびヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖と、両方の重鎖と対合する共通の軽鎖とを含有する、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物であり得る。

【0089】

【図22】図２２は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）とは、抗原２を標的とする可変ドメインが、抗原１を標的とするＦａｂ断片の可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）形態は通常のＦｃを含有する。

【0090】

【図23】図２３は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、直交性Ｆａｂ界面（オルト－Ｆａｂ）形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。軽鎖（ＬＣ）－重鎖（ＨＣ）対合は、直交界面によって確実になっている。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける変異によって確実になっている。

【0091】

【図24】図２４は、２－ｉｎ－１ ＩｇフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。

【0092】

【図25】図２５は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング変異によって確実になっている。

【0093】

【図26】図２６は、Ｆａｂ断片アーム交換形態におけるＴｒｉＮＫＥＴ、すなわち、重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖－軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体の図である。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。

【0094】

【図27】図２７は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。

【0095】

【図28】図２８は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ－Ｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬｕＺ－Ｙ形態は、Ｆｃに融合した標的１および２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確実になっている。

【0096】

【図29】図２９は、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。

【0097】

【図30-1】図３０Ａおよび３０Ｂは、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλ－Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。抗原１を標的とする１つのＦａｂ断片はカッパＬＣを含有し、抗原２を標的とする第２のＦａｂ断片はラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ－Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ－Ｂｏｄｙの例示的な図である。

【図30-2】図３０Ａおよび３０Ｂは、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλ－Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。抗原１を標的とする１つのＦａｂ断片はカッパＬＣを含有し、抗原２を標的とする第２のＦａｂ断片はラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ－Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ－Ｂｏｄｙの例示的な図である。

【0098】

【図31】図３１は、どちらもＦｃドメインに融合した、標的１に結合するＦａｂ断片と、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメインにおける変異によって確実になっている。

【0099】

【図32】図３２は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂである。Ｆａｂ断片１および２は、軽鎖および重鎖の正確な対合を確実にする特異なＳ－Ｓ架橋を含有する。

【0100】

【図33】図３３は、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬと一列をなして融合しており、ＣＬは、ＶＨと一列をなして融合している。

【0101】

【図34】図３４は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ－Ｉｇである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。

【0102】

【図35】図３５は、腫瘍関連抗原に結合するｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂ、およびＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化した抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含有する三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）（ｓｃＦｖ－Ｆａｂフォーマット）を例示する。この抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと称される。

【0103】

【図36】図３６は、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ第１の抗原結合部位、腫瘍関連抗原（例えば、ＥｐＣＡＭ）に結合する第２の抗原結合部位、腫瘍関連抗原（例えば、ＥｐＣＡＭ）に結合するさらなる腫瘍関連抗原結合部位、およびＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化した抗体定常領域を含む、例示的な三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を例示する。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと称される。

【0104】

【図37】図３７は、ＴｒｉＮＫＥＴおよびｍＡｂが、Ｈ７４７ヒト結腸直腸がん細胞上に発現されるＥｐＣＡＭに結合することを示す線グラフである。

【0105】

【図38】図３８は、ＴｒｉＮＫＥＴおよびｍＡｂが、ＨＣＣ８２７ヒト肺がん細胞上に発現されるＥｐＣＡＭに結合することを示す線グラフである。

【0106】

【図39】図３９は、ＴｒｉＮＫＥＴおよびｍＡｂが、ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸がん細胞上に発現されるＥＰＣＡＭに結合することを示す線グラフである。

【0107】

【図40】図４０Ａおよび図４０Ｂは、２名の異なるドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞を用いた、Ｈ７４７細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介殺滅を示す線グラフである。エフェクター対標的比は１０：１であった。

【0108】

【図41】図４１Ａおよび図４１Ｂは、２名の異なるドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞を用いた、ＨＣＣ８２７細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介殺滅を示す線グラフである。エフェクター対標的比は１０：１であった。

【0109】

【図42】図４２Ａおよび図４２Ｂは、２名の異なるドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞を用いた、ＭＣＦ７細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介殺滅を示す線グラフである。エフェクター対標的比は１０：１であった。

【0110】

【図43】図４３Ａおよび図４３Ｂは、２名の異なるドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞を用いた、ＨＣＴ１１６細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介殺滅を示す線グラフである。エフェクター対標的比は１０：１であった。

【発明を実施するための形態】

【0111】

詳細な説明
本発明は、がん細胞におけるＥＰＣＡＭならびにナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ
２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化させる多重特
異性結合タンパク質、かかる多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに、が
んの処置などのためにかかる多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法
を提供する。本発明の様々な態様を複数のセクションに分けて以下に記述する。しかしな
がら、１つの特定のセクションに記載される本発明の態様は、いずれかの特定のセクショ
ンに限定されるものではない。

【0112】

本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および句を以下に定義する。

【0113】

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は
、「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数を含む。

【0114】

本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫
グロブリン分子の一部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖お
よび軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重
鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」
または「ＦＲ」として公知である、より保存された隣接するストレッチの間に介在してい
る「超可変領域」と称される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにお
ける超可変領域の間におよびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト
抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合
表面を形成するように三次元空間において互いに対して配置される。抗原結合表面は、結
合した抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定
の動物において、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって
形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体中、抗原結合表面を保持する抗体の抗原
結合断片中、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチド中に存在し、ペプチドリンカーを
使用して単一ポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに連結すること
ができる。

【0115】

本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」という用語は、がんに関連するタンパク
質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない、任
意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞において、または腫瘍関連血管、細胞
外マトリックス、間葉系間質、もしくは免疫浸潤物におけるような腫瘍微小環境中で発現
され得る。

【0116】

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の
方法および組成物によって処置される生物を指す。かかる生物には、好ましくは、限定さ
れないが、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含
まれ、より好ましくはヒトが含まれる。

【0117】

本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をも
たらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回または
複数回の投与、適用または投薬量で投与されてもよく、特定の製剤または投与経路に限定
されることを意図しない。本明細書中で使用される場合、「処置する」という用語は、何
らかの効果、例えば、状態、疾患、障害などの好転をもたらす、減少、低減、モジュレー
ト、改善もしくは除去、またはそれらの症状の改善を含む。

【0118】

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、組成物を、ｉｎ ｖｉｖｏ
またはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的使用または治療的使用に特に適切にする、活性剤と、不
活性または活性な担体との組合せを指す。

【0119】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生
理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水または水／油エマルションなど）、お
よび種々の種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定
剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤およびアジュバントの例に関しては、例え
ば、Martin、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１５版、Mack Publ.Co.、Eas
ton、PA［１９７５年］を参照されたい。

【0120】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与する
と、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残留物を提供することができる、本
発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に
公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導
され得る。例示的な酸には、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸
、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエ
ン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、
ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが含
まれる。シュウ酸などの他の酸は、それら自体では薬学的に許容されないが、本発明の化
合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製
に利用され得る。

【0121】

例示的な塩基には、限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、
アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニアおよび式ＮＷ_４ ^＋（式
中、ＷはＣ_１～４アルキルである）の化合物などが含まれる。

【0122】

例示的な塩には、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギ
ン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノ
ウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ド
デシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸
、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、
２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－
ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫
酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸
塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれる。塩の他の
例には、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋およびＮＷ_４ ^＋（式中、ＷはＣ_１～４アルキル基である）など
の適切なカチオンと配合された本発明の化合物のアニオンが含まれる。

【0123】

治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されると意図される。しか
しながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合
物の調製または精製において使用することができる。

【0124】

組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐ
ｒｉｓｉｎｇ）と記載されているか、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有す
る、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されて
いる説明全体にわたって、さらに、列挙された成分から本質的になる、またはそれからな
る本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙されたプロセスステップから本質的にな
る、またはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが意図される。

【0125】

一般的事項として、パーセンテージを特定する組成物は、特に明記しない限り、重量に
よる。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の以前の定義が優先する。
Ｉ．タンパク質

【0126】

本発明は、ナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、な
らびに表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に結合す
る多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載
の医薬組成物および治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ
２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に多重特異性結合タンパク質が結合すると、表１１に提
示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の破壊
に向けてのナチュラルキラー細胞の活性が増強される。腫瘍関連抗原を発現する細胞に多
重特異性結合タンパク質が結合すると、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近接させるた
め、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的な破壊が容易になる。い
くつかの例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる記載を以下に提供する。

【0127】

多重特異性結合タンパク質の第１の構成成分は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８^＋
αβＴ細胞を含み得るがこれらに限定されない、ＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する細胞に結合
する。多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合すると、ＵＬＢＰ６（ＵＬ１６結
合タンパク質６）およびＭＩＣＡ（主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩ鎖関連Ａ）など
の天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合することおよびＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化することを
遮断し得る。

【0128】

多重特異性結合タンパク質の第２の構成成分は、表１１に提示されている抗原のいずれ
か１つから選択される腫瘍関連抗原に結合する。例えば急性骨髄性白血病およびＴ細胞白
血病などの白血病において見出すことができる腫瘍関連抗原を発現する細胞。

【0129】

多重特異性結合タンパク質の第３の構成要素は、ナチュラルキラー細胞、マクロファー
ジ、好中球、好酸球、マスト細胞、および濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面にあるＦｃ
受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。

【0130】

本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、様々なフォーマットをとることができ
る。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン
軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、および第２の免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量
体の多重特異性抗体（図１）である。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ
－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインと、第１の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第１のＣＨ１
重鎖ドメインとを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメインおよび第
１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖
と一緒に、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は
、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要
に応じて第２のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖
可変ドメインおよび第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２
の免疫グロブリン重鎖と一緒に、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択さ
れる腫瘍関連抗原に結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメインおよび第２の
Ｆｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図１）。一部の実施形態では、
第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。

【0131】

別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖
、および免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（図２）に関する。
第１の免疫グロブリン重鎖は、対合し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、または表１１に提示され
ている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に結合する重鎖可変ドメインおよ
び軽鎖可変ドメインから構成される一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に、リンカーまたは抗体
ヒンジのいずれかを介して融合した第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインを含
む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインと、
第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じてＣＨ１重鎖ドメインとを含む。免疫グロブリン
軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は
、免疫グロブリン軽鎖と対合し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、または表１１に提示されている
抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に結合する。第１のＦｃドメインおよび
第２のＦｃドメインは、一緒にＣＤ１６に結合することができる（図２）。

【0132】

１つまたは複数のさらなる結合モチーフが、必要に応じてリンカー配列を介して、定常
領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合され得る。ある特定の実施形態では、抗原結合モチー
フは、四価分子または三価分子を形成する一本鎖またはジスルフィド安定化可変領域（ｓ
ｃＦｖ）である。

【0133】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性
の二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由
来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。

【0134】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ
）技術を用いるＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態である。ＫＩＨは、ヘテロ二量体化を促進す
るために、Ｃ_Ｈ３ドメインを工学操作して各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれか
を作出することを伴う。「ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後にある概
念は、小さな残基を嵩高の残基で置換することにより、１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ
）に「ノブ」（例えば、ＥＵ付番でＴ３６６Ｗ_ＣＨ３Ａ）を導入することであった。この
「ノブ」に適応するように、他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）において、ノブに最も近
い隣接残基をより小さな残基に置き換えること（すなわち、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ
４０７Ｖ_ＣＨ３Ｂ）により、相補的な「ホール」表面が作出された。「ホール」突然変異
は、構造情報に基づくファージライブラリスクリーニング（Atwell S、Ridgway JB、We
lls JA、Carter P.、Stable heterodimers from remodeling the domain interf
ace of a homodimer using a phage display library、J Mol Biol（１９９７
年）２７０巻（１号）：２６～３５頁）によって最適化された。ＫｉＨ Ｆｃ変異体のＸ
線結晶構造（Elliott JM、Ultsch M、Lee J、Tong R、Takeda K、Spiess Cら、Ant
iparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homo
dimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J Mol Biol
（２０１４年）４２６巻（９号）：１９４７～５７頁、Mimoto F、Kadono S、Katada
H、Igawa T、Kamikawa T、Hattori K. Crystal structure of a novel asymmet
rically engineered Fc variant with improved affinity for FcγRs. Mol
Immunol（２０１４年）５８巻（１号）：１３２～８頁）は、ＣＨ３ドメイン間のコア
界面では、立体的相補性によって推進される疎水性相互作用がヘテロ二量体化に熱力学的
に有利に働くが、ノブ－ノブおよびホール－ホールの界面は、それぞれ立体障害および好
ましい相互作用の妨害が原因でホモ二量体化に有利に働かないことを示した。

【0135】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、自然起源の可動性リンカーを介し
て２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をも
たらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態におけるもので
ある。

【0136】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交性Ｆａｂ界面（オルト－Ｆａ
ｂ）形態におけるものである。オルト－Ｆａｂ ＩｇＧアプローチ（Lewis SM、Wu X、
Pustilnik A、Sereno A、Huang F、Rick HLら、Generation of bispecific IgG
antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Na
t. Biotechnol.（２０１４年）３２巻（２号）：１９１～８頁）では、構造に基づく領
域デザインにより、一方のＦａｂ断片におけるＬＣおよびＨＣ_{ＶＨ－ＣＨ１}の界面にのみ
相補的突然変異が導入され、他方のＦａｂが変化することはない。

【0137】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２－ｉｎ－１ Ｉｇフォーマット
におけるものである。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合し
た標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物
である、ＥＳ形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリ
ング変異によって確実になっている。

【0138】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化変異によって安定
化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κ
λ－Ｂｏｄｙ形態におけるものである。抗原１を標的とするＦａｂ断片１はカッパＬＣを
含有し、抗原２を標的とする第２のＦａｂ断片はラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κ
λ－Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ－Ｂｏｄｙの例示的な
図である。

【0139】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態（重鎖およ
び結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖－軽鎖対とスワップすることによりＦａｂア
ームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体）である。

【0140】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態における
ものである。ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏ
ｍａｉｎ）プラットフォームは、天然抗体の治療用途を広げる可能性がある非対称かつ二
重特異性抗体様の分子を生成するためにデザインされた。このタンパク質工学操作プラッ
トフォームは、保存されたＣＨ３ドメインにおける免疫グロブリンの構造的に関連した配
列の交換に基づく。ＳＥＥＤデザインは、ＡＧおよびＧＡ ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインの
ホモ二量体化を回避しつつ、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効果的な生成を可能にする（Muda
M.ら、Protein Eng. Des. Sel.（２０１１年、２４巻（５号）：４４７～５４頁）
）。

【0141】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体
化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ－Ｙ形態におけるものである（
Wranik, BJ.ら、J. Biol. Chem.（２０１２年）、２８７巻：４３３３１～９頁）。

【0142】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ形態におけ
るものである。二重特異性ＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙでは、分枝状のアゼチジノンリンカーを使
用して２つの異なるペプチドをひとつに結合させ、温和な条件下にてスキャフォールド抗
体に部位特異的様式で融合させる。機能的活性に関与するのはファルマコフォアだが、抗
体スキャフォールドは長い半減期およびＩｇ様の分布をもたらす。最適化された、または
独特の二重特異性抗体を生成するために、ファルマコフォアは化学的に最適化するか、ま
たは他のファルマコフォアに置き換えることができる（Doppalapudi VRら、PNAS（２０
１０年）、１０７巻（５２号）；２２６１１～２２６１６頁）。

【0143】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した、標的１に結合す
るＦａｂ断片と、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体
形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっ
ている。

【0144】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１および２に結合する２つの
異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有す
るヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂ形態におけるものである。Ｆａｂ断片１お
よび２は、ＬＣおよびＨＣの正確な対合を確実にする特異なＳ－Ｓ架橋を含有する。

【0145】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化さ
れたＦｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ
二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態におけるものである。ＣＬドメインおよびＣ
Ｈ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ
１は、ＶＬとインラインで融合しており、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合している。

【0146】

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原
１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ
－Ｉｇ形態におけるものである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。

【0147】

表１は、組み合わさってＮＫＧ２Ｄに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽
鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対
するそれらの結合親和性が変動し得るにもかかわらず、すべてがヒトＮＫＧ２ＤおよびＮ
Ｋ細胞を活性化する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【0148】

代替的に、ＵＳ９，２７３，１３６において説明されているように、配列番号１０１に
よって表される重鎖可変ドメインを配列番号１０２によって表される軽鎖可変ドメインと
対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。

【化1】

【0149】

代替的に、ＵＳ７，８７９，９８５において説明されているように、配列番号１０３に
よって表される重鎖可変ドメインを配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメインと
対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。

【化2】

【0150】

表２は、組み合わさってＥｐＣＡＭに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽
鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【0151】

代替的に、ＥｐＣＡＭに結合することができる新規の抗原結合部位は、配列番号１４７
によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定
することができる。

【化3】

【0152】

腫瘍関連抗原ＣＡ１２５に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１４８によ
って定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定する
ことができる。

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【0153】

腫瘍関連抗原ＮａＰｉ２ｂに結合することができる抗原結合部位は、配列番号１４９に
よって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定す
ることができる。

【化10】

【0154】

腫瘍関連抗原Ｎｅｃｔｉｎ４に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５０
によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定
することができる。

【化11】

【0155】

腫瘍関連抗原フコシル－ＧＭ１に結合することができる抗原結合部位は、モノシアロテ
トラヘキソシルガングリオシドへの結合についてスクリーニングすることによって同定す
ることができる。

【0156】

腫瘍関連抗原ＡＤＡＭ８に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５１によ
って定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定する
ことができる。

【化12】

【0157】

腫瘍関連抗原ＡＤＡＭ９に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５２によ
って定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定する
ことができる。

【化13】

【化14】

【0158】

腫瘍関連抗原ＳＬＣ４４Ａ４に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５３
によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定
することができる。

【化15】

【0159】

腫瘍関連抗原ＣＡ１９－９に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５４に
よって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定す
ることができる。

【化16】

【0160】

代替的に、表３は、組み合わさって、ＣＡ１２５（アバゴボマブ、ソフィツズマブ）、
ＮａＰｉ２ｂ（リファスツズマブ）、Ｎｅｃｔｉｎ４（エンホルツマブ）、フコシル－Ｇ
Ｍ１（米国特許出願公開第２０１３０１４２７８９号に記載、具体的な配列が参照により
本明細書に組み込まれる）、またはＳＬＣ４４Ａ４（国際出願公開第ＷＯ２０１０１１１
０１８号に記載、具体的な配列が参照により本明細書に組み込まれる）に結合することが
できる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0161】

２本のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を可能にする変異も含む抗体定常領域に連結し
たｓｃＦｖの例を以下に列記する。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体由来の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）お
よび軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含有するｓｃＦｖを本開示の多重特異性タンパク質の調
製に使用する。各配列は、ヘテロ二量体化変異を含有するＶ_Ｌ－（Ｇ４Ｓ）_４－Ｖ_Ｈ－ヒ
ンジ（ＡＳまたはＧＡＳ）－Ｆｃを表す（下線）。Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、１００Ｖ_Ｌ－４４
Ｖ_ＨＳ－Ｓ架橋（下線）を含有し、腫瘍を標的とするまたはＮＫＧ２Ｄに結合する任意の
抗体に由来するものであってよい。柔軟性と最適な幾何学的形状との間のバランスをとる
ためにＡｌａ－Ｓｅｒ（ＡＳ、太字および下線）をエルボーヒンジ領域配列に含める。あ
る特定の実施形態では、さらなるＧｌｙをＡＳ配列のＮ末端に付加し、それにより、Ｇｌ
ｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒの配列（ＧＡＳ、太字および下線）を有するヒンジを生成することが
できる。ある特定の実施形態では、さらなる配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－ＧｌｙをヒンジのＡＳ
配列に付加することができる。以下の段落に列記されている配列において（Ｇ４Ｓ）_４リ
ンカーに下線が引かれている。

【0162】

本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、配列番号２０３の配列を含む第１のポリペプチド（Ｆ４－
ＥｐＣＡＭＦｃ－ＡＪｃｈａｉｎＢ－ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ）と、配列番号２０４の配
列を含む第２のポリペプチド（抗ＥｐＣＡＭ ＨＣ－ヒンジ－Ｆｃ）とを含むＮＫＧ２Ｄ
結合Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＥｐＣＡＭである。ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ－
ＥｐＣＡＭは、それぞれが配列番号２１４の配列を含む抗ＥｐＣＡＭ Ｖ_Ｌ定常ドメイン
を含む２本のＥｐＣＡＭを標的とする軽鎖も含む。例えば、図３６の構造において、Ｆａ
ｂ断片がＥｐＣＡＭを標的とする場合、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＥｐＣＡ
Ｍは、ＴｒｉＮＫＥＴの１つのアームを形成する配列番号２０３および配列番号２１４、
ならびにＴｒｉＮＫＥＴの第２のアームを形成する配列番号２０４および配列番号２１４
を含む。

【0163】

アームの各々は、ＥｐＣＡＭ結合Ｆａｂ断片を含み、ＥｐＣＡＭ結合Ｆａｂ断片は、重
鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分であって、重鎖可変ドメインとＣＨ
１ドメインが連結している重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（配列
番号２１４）を含む軽鎖部分とを含む。第１のアームにおいて（例えば、Ｆ４－ＥｐＣＡ
ＭＦｃ－ＡＪｃｈａｉｎＢ－ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖにおいて）、ＣＨ１ドメインはＦｃ
ドメインに連結し、ＦｃドメインはＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖに連結して、配列番
号２０３の配列を含むポリペプチドが形成される。第２のアームにおいて、ＣＨ１ドメイ
ンはＦｃドメインに連結して、配列番号２０４の配列を含むポリペプチドが形成される。

【0164】

例えば、Ｆ４－ＥｐＣＡＭＦｃ－ＡＪｃｈａｉｎＢ－ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ（配列番
号２０３）は、ＥｐＣＡＭを標的とする重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）（配列番号１３９）と
、Ｆｃドメイン（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）に連結したＣＨ１ドメインとを含み、これは
、ＦｃのＣ末端においてＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に連結してい
る。配列番号２０３内のＦｃドメインは、Ｓ３５４Ｃ置換を含み、これは別のＦｃドメイ
ンにおけるＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する（配列番号２０４、下記）。配
列番号２０３内のＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換、およびＦ４０５Ｔ
置換を含む。ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、配列番号２０５のアミノ酸配列によって
表され、（Ｇ４Ｓ）_４リンカー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号
２０６）を介して重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）に連結した軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む
。配列番号２０５内に含まれるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは、Ｖ_Ｌ－（Ｇ４Ｓ）_４－Ｖ_Ｈとして連結
しており、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、１００Ｖ_Ｌ－４４Ｖ_ＨＳ－Ｓ架橋を含有する（それぞれＧ
１００Ｃ置換およびＧ４４Ｃ置換に起因する）（システイン残基は太字のイタリック体で
あり、下線が引かれている）。配列番号２０３に表される通り、ＦｃドメインのＣ末端は
ｓｃＦｖのＮ末端（配列番号２０５）に、短いＳＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号２０
７）を介して連結している。
ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ

【化17】

Ｆ４－ＥｐＣＡＭＦｃ－ＡＪｃｈａｉｎＢ－ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ

【化18】

【0165】

抗ＥｐＣＡＭ ＨＣ－ヒンジ－Ｆｃ（配列番号２０４）は、ＥｐＣＡＭを標的とする重
鎖可変ドメインおよびＦｃドメイン（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）に連結したＣＨ１ドメイ
ンを含む。配列番号２０４内のＦｃドメインは、Ｙ３４９Ｃ置換を含み、これは、ＮＫＧ
２Ｄに結合するｓｃＦｖに連結したＦｃのＣＨ３ドメイン（配列番号２０３）におけるＳ
３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号２０４において、Ｆｃドメインは
、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換も含む。
抗ＥｐＣＡＭ Ｖ_Ｈ－ＣＨ１－Ｆｃ

【化19】

【0166】

抗ＥｐＣＡＭ Ｖ_Ｌ定常ドメイン（配列番号２１４）は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖
定常ドメインを含む、ＥｐＣＡＭを標的とする軽鎖部分を含む。
抗ＥｐＣＡＭ Ｖ_Ｌ定常ドメイン

【化20】

【0167】

例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３
６０ＥおよびＫ４０９Ｗの変異を含み、ＥＰＣＡＭ Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメイン
は、ヘテロ二量体を形成するための適合した変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０
５Ｔを含む。

【0168】

例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ＣＨ３ド
メインにおけるＹ３４９Ｃ置換を含み、これは、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖに連結していな
いＦｃドメインにおけるＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。

【0169】

本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＥＰＣＡＭ
であり、その配列を以下に記載する（ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ付番）に下線が引かれている）
。

【0170】

本開示の一部のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＥＰＣＡＭの形
態であり、その配列を以下に提供する（ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ付番）に下線が引かれている
）。

【0171】

Ａ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＥＰＣＡＭは、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒン
ジを介してＦｃドメインに連結した、ＥＰＣＡＭに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）
（配列番号２０８および２０９は、かかるＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖポリペプチドの例示的
な配列である）（例えば、配列番号２１０および配列番号２１１）と、重鎖可変ドメイン
（配列番号８５）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配
列番号８６）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含むＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片（
「Ａ４９」）であって、重鎖可変ドメインがＣＨ１ドメインに連結しており、ＣＨ１ドメ
インがＦｃドメインに連結している、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片（「Ａ４９」）とを含む
。ＥｐＣＡＭを標的とするＦａｂに連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４
０９Ｗ置換を含むＦａｂとヘテロ二量体を形成するためのＱ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置
換、およびＦ４０５Ｔ置換を含む（例えば、下記の配列番号２１２を参照されたい）。

【0172】

本開示のＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）_４リンカーで軽鎖可変ドメインに連結
した重鎖可変ドメインを含み得る（Ｖ_ＬがＶ_ＨのＮ末端側にある場合Ｖ_Ｌ（Ｇ４Ｓ）_４Ｖ
_ＨまたはＬＨと表され、Ｖ_ＨがＶ_ＬのＮ末端側にある場合、Ｖ_Ｈ（Ｇ４Ｓ）_４Ｖ_Ｌまたは
ＨＬと表される）。配列番号２０８および２０９は、かかるＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖポリ
ペプチドの例示的な配列である。ｓｃＦｖ（配列番号２０８または２０９）内に含まれる
Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、１００Ｖ_Ｌ－４４Ｖ_ＨＳ－Ｓ架橋（それぞれＧ１００Ｃ置換およびＧ
４４Ｃ置換に起因する）を含有する（以下の配列においてシステイン残基は太字のイタリ
ック体であり、下線が引かれている）。（Ｇ４Ｓ）_４は、配列番号２０８および配列番号
２０９において太字の下線が引かれた配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（
配列番号２０６）である。
ＥＰＣＡＭ（ＭＴ１１０ＬＨ）ｓｃＦｖ

【化21】

ＥＰＣＡＭ（ＭＴ１００ＨＬ）ｓｃＦｖ

【化22】

【0173】

配列番号２１０および配列番号２１１は、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジ（太字
、下線）を介してＦｃドメインに連結することができるＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖの２つの
配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換、お
よびＦ４０５Ｔ置換を含む。
ＥＰＣＡＭ（ＭＴ１１０ＬＨ）ｓｃＦｖ－Ｆｃ

【化23】

ＥＰＣＡＭ（ＭＴ１１０ＨＬ）ｓｃＦｖ－Ｆｃ

【化24】

【0174】

配列番号２１２は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号８５）、および
Ｆｃドメインに連結したＣＨ１ドメインを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号
２１２内のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃ置換を含み、これは、Ｅ
ｐＣＡＭに結合するｓｃＦｖに連結したＦｃにおけるＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合
を形成する（例えば、配列番号２１０および配列番号２１１）。配列番号２１２において
、Ｆｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換も含む。
Ａ４９－Ｖ_Ｈ

【化25】

Ａ４９ Ｖ_Ｈ－ＣＨ１－Ｆｃ

【化26】

【0175】

配列番号２１３は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）、および
軽鎖定常ドメインを含むＦａｂ断片の軽鎖部分を表す。
Ａ４９－Ｖ_Ｌ

【化27】

Ａ４９ ＬＣ Ｖ_Ｌ定常ドメイン

【化28】

【0176】

例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｑ３４
７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔの変異を含み、ＥＰＣＡＭ ｓｃＦｖに連結したＦ
ｃドメインは、ヘテロ二量体を形成するための適合した変異Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ
を含む。例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、
ＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ置換を含み、これは、ＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖに連結
したＦｃにおけるＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。

【0177】

Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６結合はヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介され
る。例えば、ヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６
５～Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７～Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７～Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ
２３４～Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメインにおける炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－
グルコサミンに焦点が当てられている（Sondermannら、Nature、４０６巻（６７９３号）
：２６７～２７３頁を参照されたい）。既知のドメインに基づいて、突然変異は、ファー
ジディスプレイライブラリもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリを使用する
ことなどによって、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは低減させるように選択さ
れ得るか、または相互作用の既知の三次元構造に基づいてデザインされ得る。

【0178】

ヘテロ二量体抗体重鎖の構築は、同じ細胞内で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させる
ことによって達成することができ、これにより、各抗体重鎖のホモ二量体の構築およびヘ
テロ二量体の構築をもたらすことができる。ヘテロ二量体の選択的構築の促進は、ＵＳ１
３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７
５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７
、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０およびＵＳ１４／８３０３３６に示
されているように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン内に異なる突然変異を組み込む
ことによって達成することができる。例えば、突然変異は、ヒトＩｇＧ１に基づき、これ
らの２つの鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする第１のポリペプチド
および第２のポリペプチド内にアミノ酸置換の異なる対を組み込んでいるＣＨ３ドメイン
内で作製され得る。以下に例示したアミノ酸置換の位置は、Ｋａｂａｔにおけるように、
すべてＥＵインデックスに従って番号付けしている。

【0179】

１つの状況では、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アル
ギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）か
ら選択される、より大きなアミノ酸で置換し、第２のポリペプチドにおける少なくとも１
つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、より大きなアミノ酸置換（突出）が、より小さな
アミノ酸置換（空洞）の表面に適合するように、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオ
ニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択される、より小さなアミノ酸で置換する。例え
ば、一方のポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方のポリペプチドは
、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる
。

【0180】

本発明の抗体重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを有するまたは有さ
ないヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの、抗体定常領域と
少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と連結され得る。一部の実施形態では、定常領
域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、ま
たはＩｇＧ４定常領域などの、ヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一部の
他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウ
マなどの別の哺乳動物由来の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。１つまたは複
数の突然変異が、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３
５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３
６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４
０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９において定常領域に組み込
まれ得る。例示的な置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９
Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３
５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、
Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４
Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３
６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、
Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４
Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４
０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、
Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅが含
まれる。

【0181】

ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る突然変異は
、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、
Ｐ１７１、および／またはＶ１７３であり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１
定常領域のＣκに組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、
Ｖ１６３、Ｓ１７４、および／またはＴ１６４であり得る。

【0182】

あるいは、アミノ酸置換は以下の表４にされる置換のセットから選択され得る。

【表4】

【0183】

代替的に、アミノ酸置換は以下の表５に示される置換のセットから選択され得る。

【表5】

【0184】

代替的に、アミノ酸置換は以下の表６に示される置換のセットから選択され得る。

【表6】

【0185】

代替的に、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は表７から選択さ
れ得る。

【表7】

【0186】

代替的に、以下の表８の置換のセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択しても
よく、ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の負に
帯電したアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置（複
数可）は、任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられる。

【表8】

【0187】

代替的に、以下の表９のセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、
ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の正に帯電し
たアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置（複数可）
は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられる。

【表9】

【0188】

代替的に、アミノ酸置換は、以下の表１０のセットから選択され得る。

【表10】

【0189】

代替的にまたは加えて、ヘテロ多量体タンパク質の構造安定性は、第１または第２のポ
リペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、反対のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導
入することによって増大させることができ、これにより、２つのポリペプチドの界面内に
人工ジスルフィド架橋を形成する。

【0190】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６位において異なり、抗体定常領域の他方のポリペ
プチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｌ３６８お
よびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。

【0191】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択さ
れる１つまたは複数の位置において異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミ
ノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６位において異なる。

【0192】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ
３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、およびＴ４１１からなる群から選択される１つ
または複数の位置において異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列
は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ
３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つま
たは複数の位置において異なる。

【0193】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ
３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の
位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、
ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６
８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、およびＴ４１１からなる群から選択され
る１つまたは複数の位置において異なる。

【0194】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群
から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポ
リペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｎ３９
０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置
において異なる。

【0195】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１
からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域
の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５
１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置
において異なる。

【0196】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０およびＫ４０９からなる群
から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポ
リペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｅ３５
７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異
なる。

【0197】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群
から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポ
リペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｋ３６
０、Ｑ３４７およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異
なる。

【0198】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群
から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポ
リペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｄ３５６、Ｅ３５
７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。

【0199】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択さ
れる１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド
鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０
９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。

【0200】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群
から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポ
リペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｌ３５
１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置
において異なる。

【0201】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９
からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域
の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５
１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置
において異なる。

【0202】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｓ３５４Ｃ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポ
リペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９Ｃ置換に
よって異なる。

【0203】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９Ｃ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポ
リペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｓ３５４Ｃ置換に
よって異なる。

【0204】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換によって異なり、抗
体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列
と、Ｏ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換およびＦ４０５Ｔ置換によって異なる。

【0205】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｏ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換およびＦ４０５Ｔ置換に
よって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領
域のアミノ酸配列と、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換によって異なる。

【0206】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｗ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポ
リペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｓ置換、
Ｔ３６８Ａ置換およびＹ４０７Ｖ置換によって異なる。

【0207】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｓ置換、Ｔ３６８Ａ置換およびＹ４０７Ｖ置換に
よって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領
域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｗ置換によって異なる。

【0208】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ置換、Ｌ３５１Ｙ置換、Ｆ４０５Ａ置換および
Ｙ４０７Ｖ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は
、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ置換、Ｔ３６６Ｌ置換、Ｋ３９２Ｌ置
換およびＴ３９４Ｗ置換によって異なる。

【0209】

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ
１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ置換、Ｔ３６６Ｌ置換、Ｋ３９２Ｌ置換および
Ｔ３９４Ｗ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は
、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ置換、Ｌ３５１Ｙ置換、Ｆ４０５Ａ置
換およびＹ４０７Ｖ置換によって異なる。

【0210】

上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され
得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベク
ターにクローニングすることができ、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸
配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ、免疫グロブリン軽鎖をコード
する第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ、第１、第２お
よび第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定にトランスフェクトして多量体タンパク
質を産生することができる。

【0211】

多重特異性タンパク質の最も高い収率を達成するために、第１、第２および第３の発現
ベクターの異なる比率を調べて宿主細胞へのトランスフェクションのための最適比率を決
定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微
鏡法、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野において公知の方法を使用して、細胞バ
ンク生成のために単一クローンを単離することができる。

【0212】

クローンは、バイオリアクタスケールアップに適した条件下で培養することができ、多
重特異性タンパク質の発現を維持することができる。多重特異性タンパク質は、遠心分離
、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、およびミックスモードクロマトグ
ラフィーを含む、当技術分野において公知の方法を使用して単離され、精製され得る。
ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴

【0213】

本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位、ＣＤ１６結合部位、
および表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原を含む。
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ｄおよび／また
はＣＤ１６を発現する細胞と、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択され
る腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞に同時に結合する。多重特異性タンパク質がＮＫ細胞
に結合すると、腫瘍細胞の破壊に向けてのＮＫ細胞の活性が増強され得る。

【0214】

【表11】

【0215】

一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、表１１に提示されている抗原のいずれ
か１つから選択される腫瘍関連抗原に、対応するモノクローナル抗体（すなわち、多重特
異性タンパク質に組み込まれているものと同じ腫瘍関連抗原結合部位を含有するモノクロ
ーナル抗体（表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される））と同様の親
和性で結合する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、表１１に提示されてい
る抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の殺滅に関して、
対応するモノクローナル抗体よりも効果的である。

【0216】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位および表１１に提示されている抗原のい
ずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に対する結合部位を含む本明細書に記載の多重特
異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞と共培養すると初代ヒトＮＫ細胞を活性
化させる。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ－γサイトカイン産生
量の増加によって示される。さらに、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選
択される腫瘍関連抗原に対する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タン
パク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示し得
る。

【0217】

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位および表１１に提示されている抗原のい
ずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に対する結合部位を含む本明細書に記載の多重特
異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞と共培養して休止ヒトＮＫ細胞およびＩ
Ｌ－２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。

【0218】

ある特定の実施形態では、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される
腫瘍関連抗原に結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質
は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を標的とすることに関して利点をもたらす。本明細
書に記載の多重特異性結合タンパク質は、腫瘍成長の低減およびがん細胞の殺滅に関して
、より効果的であり得る。

【0219】

ある特定の実施形態では、ＥｐＣＡＭを標的とするＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｎ
ＫＧ２Ｄ結合Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＥｐＣＡＭ）は、ＥｐＣＡＭを標的とする親ｍＡｂ
よりも効果的に標的細胞を死滅させた。ある特定の実施形態では、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ
はまた、Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ｅ
ｐＣＡＭ）よりも強力に標的細胞を死滅させ、これは、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴが標的細胞
により強力に結合することを反映し得る。
ＩＩＩ．治療用途

【0220】

本発明は、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載
の医薬組成物を使用してがんを処置するための方法を提供する。本方法は、それを必要と
する患者に、治療有効量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を投与することに
より、ＥＰＣＡＭを発現する様々ながんを処置するために使用され得る。

【0221】

この治療方法は、処置されるがんによって特徴付けられ得る。例えば、ある特定の実施
形態では、がんは、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫
、胸腺腫、腺様嚢胞癌、胃腸がん、腎がん、乳がん、神経膠芽腫、肺がん、卵巣がん、脳
がん、前立腺がん、膵がん、または黒色腫である。

【0222】

ある特定の他の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。ある特定の他の実施形態では
、がんは、結腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、食道がん、白血病、肝がん、
直腸がん、胃がん、精巣がん、または子宮がんである。さらに他の実施形態では、がんは
、血管化腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫（
例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん（bilary tract c
ancer）、甲状腺がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄
性白血病、腺様嚢胞癌（adenoid cycstic carcinoma）、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、
肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆
管がん、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫
（chondosarcoma）、脈絡叢乳頭腫（choriod plexus papilloma）／癌、慢性リンパ球性
白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指
腸がん、内分泌系がん、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌
、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼および眼窩のがん、女性
性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃前庭部がん、胃底部がん、ガストリノーマ
、神経膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓がん、血管芽腫（hemangiblastoma）、血管内皮腫
、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリ
ノーマ、上皮内新生物（intaepithelial neoplasia）、上皮間扁平上皮新生物（interepi
thelial squamouscell neoplasia）、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節
がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子黒色腫、リン
パ腫、男性生殖器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮
がん、転移性癌、口腔がん（mouth cancer）、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉がん、鼻道
がん（nasal tract cancer）、神経系がん、神経上皮腺癌 結節性黒色腫、非上皮性皮膚
がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起神経膠がん（oligodendroglialcancer）
、口腔がん（oral cavity cancer）、骨肉腫、漿液性乳頭腺癌、陰茎がん、咽頭がん、下
垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細
胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑
筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、
中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん
、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸部がん、子宮体がん、ぶどう膜黒色腫、膣がん、疣状
癌、ビポーマ、外陰部がん、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。

【0223】

ある特定の他の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非
ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大
細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ
腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性
辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細
胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫などのＢ細
胞リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ
芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リン
パ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎
様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リン
パ腫である。

【0224】

処置されるがんは、がん細胞の表面で発現する特定の抗原の存在に従って特徴付けられ
得る。ある特定の実施形態では、がん細胞は、ＥｐＣＡＭに加えて、以下：ＣＤ２、ＣＤ
１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲ
ＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ＴＲＯ
Ｐ２、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲ
ＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１のうちの
１つまたは複数を発現し得る。

【0225】

一部の他の実施形態では、第２の結合部位がＥｐＣＡＭに結合する場合、処置されるが
んは、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、
肝がん、食道がん、および肺がんから選択される。一部の他の実施形態では、第２の結合
部位が、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２
ｂ）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル－ＧＭ１（モノシアロテト
ラヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイ
ン含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼド
メイン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬ
Ｃ４４Ａ４）、およびシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９－９）から選択される抗原に結
合する場合、処置されるがんは、卵巣がん、子宮体がん、膵がん、肺がん、甲状腺がん、
膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、小細胞肺がん、神経芽細胞腫、肝がん、腎がん、黒色
腫、子宮頸がん、前立腺がん、骨肉腫、脳がん、胃がん、胆管癌から選択される。
ＩＶ．併用療法

【0226】

本発明の別の態様は併用療法を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質
は、がんを処置するためにさらなる治療剤と組み合わせて使用することができる。

【0227】

がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤には、例えば、
放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン
、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、
カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾ
ール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルフ
ァシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベス
ナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケ
タンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン
、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキ
サン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、
プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エ
ノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオス
タン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン－アルファ、インターフェ
ロン－２アルファ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ
）、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキンディフティトックス、
インターロイキン－２、黄体形成ホルモン放出因子、ならびにその同種受容体に対して特
異な結合、および増加したまたは減少した血清半減期を示し得る上述の薬剤の変形型が含
まれる。

【0228】

がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る薬剤のさらなるクラスは免疫チ
ェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、（ｉ）細胞傷
害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（Ｐ
Ｄ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ
４、および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つまたは複数を阻害する薬剤が含まれる。ＣＴ
ＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫を処置するために米国食品医薬品局によって
承認されている。

【0229】

がんを処置する際に併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェック
ポイント標的を標的とするモノクローナル抗体薬剤（例えば、ハーセプチン）および非細
胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。

【0230】

抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、
Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、
ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存
性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫおよびｍＴＯＲの両方の阻害剤、
ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害
剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害
剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチ
ド３－キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１およびＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻
害剤、トポイソメラーゼ－ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、な
らびにＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０
、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト；な
らびに（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＧ－ＣＳＦから選択さ
れるサイトカインが含まれる。

【0231】

本発明のタンパク質はまた、原発病巣の外科的除去の補助として使用され得る。

【0232】

多重特異性結合タンパク質およびさらなる治療剤の量ならびに投与の相対的タイミング
は、所望の併用療法効果を達成するために選択され得る。例えば、このような投与を必要
とする患者に併用療法を投与する場合、組み合わせる治療剤、または治療剤を含む１つも
しくは複数の医薬組成物は、例えば、連続的に、併せて、一緒に、同時になどの任意の順
序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、さらなる治療剤がそ
の予防効果または治療効果を発揮する時間の間投与されてもよく、またはその逆であって
もよい。
Ｖ．医薬組成物

【0233】

本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載のタンパク質を含有する医薬組成物を特徴
とする。組成物は、種々の薬物送達系で使用されるように製剤化することができる。適切
な製剤を作るために、１種または複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を組成物
に含めることもできる。本開示で使用される好適な製剤は、Remington's Pharmaceutica
l Sciences、Mack Publishing Company、Philadelphia、Pa.、第１７版、１９８５年
に見出される。薬物送達のための方法に関する簡潔な概説については、例えば、Langer（
Science、２４９巻：１５２７～１５３３頁、１９９０年）を参照されたい。

【0234】

医薬組成物は、治療有効量の、抗原（表１１に列記されている）部位を含む多重特異性
結合タンパク質を含有し得る。

【0235】

本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、または注射器に含有されてもよい。あ
る特定の実施形態では、バッグはチューブおよび／または針を含むチャネルに接続されて
もよい。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤または液体製剤であってもよい。
ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライ（凍結乾燥）されてもよく、約１２～６
０個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライさ
れてもよく、４５ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい
。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ～約１００ｍｇのフリーズドライされた製剤が１
個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、１２、２７、または４５個
のバイアルからのフリーズドライされた製剤は、静脈内薬物製剤中に治療用量のタンパク
質を得るために組み合わされてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であっ
てもよく、約２５０ｍｇ／バイアル～約１０００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい
。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約６００ｍｇ／バイアルと
して保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２
５０ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。

【0236】

タンパク質は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む液体水性医
薬製剤中に存在し得る。

【0237】

これらの組成物は従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、または濾過滅菌されても
よい。得られた水溶液はそのままで使用するためにパッケージ化されてもよく、または凍
結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。
調製物のｐＨは、典型的に、３から１１の間、より好ましくは５から９の間または６から
８の間、最も好ましくは７から８の間、例えば７～７．５である。得られた固形の組成物
は複数の単回用量単位でパッケージ化されてもよく、各々は一定量の上述の１つまたは複
数の薬剤を含有する。固形の組成物はまた、柔軟な量のための容器にパッケージ化されて
もよい。

【0238】

ある特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナト
リウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウ
ム、ポリソルベート８０、水、および酸化ナトリウムと組み合わせて本開示のタンパク質
を含む、延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。

【0239】

ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製
される。本発明の緩衝液は、約４～約８、例えば、約４．５～約６．０、もしくは約４．
８～約５．５の範囲のｐＨを有してもよく、または約５．０～約５．２のｐＨを有しても
よい。上記に列挙したｐＨの中間の範囲も、本開示の一部であることが意図される。例え
ば、上限および／または下限として上記に列挙した値のいずれかの組合せを使用する値の
範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御する緩衝液の例には、酢酸塩
（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、
ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が含まれる。

【0240】

ある特定の実施形態では、製剤は、ｐＨを約４～約８の範囲に維持するためにクエン酸
塩およびリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨの範囲は、約
４．５～約６．０、または約ｐＨ４．８～約５．５、または約５．０～約５．２のｐＨ範
囲であってもよい。ある特定の実施形態では、緩衝系には、クエン酸一水和物、クエン酸
ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、および／またはリン酸二水素ナトリウム二水
和物が含まれる。ある特定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（
例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、
０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、
１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば
、０．８６）、および約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／
ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系は、１～１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、
０．２５～０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、１．２５～１．７５ｍｇ／ｍＬのリ
ン酸二ナトリウム二水和物、０．７～１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和
物、および６．０～６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では
、製剤のｐＨは水酸化ナトリウムを用いて調整される。

【0241】

トニシファイヤー（tonicifier）として作用し、抗体を安定化させることができるポリ
オールも、製剤に含めることができる。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化
し得る量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張性であってもよ
い。添加されるポリオールの量も、ポリオールの分子量に関して変化し得る。例えば、二
糖（トレハロースなど）と比較して、少量の単糖（例えば、マンニトール）が添加されて
もよい。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用され得るポリオールはマン
ニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は約５～約２０ｍｇ／ｍｌ
であってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約７．５～１５ｍｇ／
ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１０～１４ｍｇ
／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１２ｍｇ／ｍ
ｌであってもよい。ある特定の実施形態では、ポリオールソルビトールを製剤に含めるこ
とができる。

【0242】

洗剤または界面活性剤もまた、製剤に添加してもよい。例示的な洗剤としては、ポリソ
ルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロクサマー（例えば、ポロ
クサマー１８８）などの非イオン性洗剤が挙げられる。添加される洗剤の量は、製剤化さ
れた抗体の凝集を低減させ、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最低限に抑え、かつ／
または吸着を低減させるようなものである。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリソル
ベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は、洗剤のポリソル
ベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチ
レン（２０）ソルビタンモノオレエートを表すために使用される用語である（Fiedler、L
exikon der Hifsstoffe、Editio Cantor Verlag Aulendorf、第４版、１９９６年を
参照されたい）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ
／ｍＬの間のポリソルベート８０、または約０．５ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの間を
含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加さ
れ得る。

【0243】

実施形態では、本開示のタンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は
、ゴム栓で閉じ、アルミニウムクリンプシールクロージャで密封した、ＵＳＰ／Ｐｈ Ｅ
ｕｒいずれかのタイプＩ ５０Ｒバイアルにおいて、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得
る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ Ｅｕｒに準拠したエラストマーで作られていてもよい。あ
る特定の実施形態では、６０ｍＬの採取容量を可能にするために、バイアルに６１．２ｍ
Ｌのタンパク質産物溶液が充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、０．９
％の生理食塩水で希釈され得る。

【0244】

ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせた１０
ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は水性担体
中で調製され得る。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまた
は不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖
は、二糖、例えば、スクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤はまた、
緩衝剤、界面活性剤、および保存剤のうちの１つまたは複数を含み得る。

【0245】

ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは薬学的に許容される酸および／または塩基
の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸で
あり得る。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。

【0246】

凝集に加えて、脱アミドは、発酵、採取／細胞清澄化、精製、薬物物質／薬物製品貯蔵
の間および試料分析の間に発生し得るペプチドおよびタンパク質の一般的な産物のバリア
ントである。脱アミドは、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク
質からのＮＨ_３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質
量減少をもたらす。その後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシン
イミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性に起因して困難である。したがって、脱
アミドは、典型的に１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミ
ドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかを生じる。脱アミドの速度に
影響を及ぼすパラメータには、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポ
リペプチド立体配座および三次構造が含まれる。ペプチド鎖におけるＡｓｎに隣接するア
ミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響を及ぼす。タンパク質配列におけるＡｓｎに続くＧ
ｌｙおよびＳｅｒは、脱アミドに対してより高い感受性を生じる。

【0247】

ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノを阻止する
ためのｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。

【0248】

本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒
であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（
ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水
）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。

【0249】

保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加する
ことができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易に
することができる。

【0250】

静脈内（ＩＶ）製剤は、患者が、移植後に入院しており、ＩＶ経路を介してすべての薬
物を受けている場合などの特定の場合に好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形
態では、液体製剤は、投与前に０．９％の塩化ナトリウム溶液により希釈される。ある特
定の実施形態では、注射のための希釈された薬物製品は等張であり、静脈内注入による投
与に適している。

【0251】

ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加するこ
とができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミ
ンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では
、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート
、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはア
ンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。

【0252】

保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加する
ことができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の生産を容易に
することができる。

【0253】

本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒
であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（
ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水
）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。

【0254】

本開示のタンパク質は、タンパク質および凍結乾燥保護剤を含む凍結乾燥製剤として存
在することもできる。凍結乾燥保護剤は糖、例えば二糖であり得る。ある特定の実施形態
では、凍結乾燥保護剤は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤はまた
、緩衝剤、界面活性物質、増量剤、および／または保存剤のうちの１つまたは複数を含ん
でもよい。

【0255】

凍結乾燥された薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なく
とも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であり得る。ある特定の
実施形態では、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は１：２～１：５であ
り得る。

【0256】

ある特定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／
または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される
酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリ
ウムであり得る。

【0257】

凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは６から８の間に調整され得
る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥した薬物製品についてのｐＨ範囲は７～８であり
得る。

【0258】

ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加するこ
とができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミ
ンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では
、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート
、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはア
ンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。

【0259】

ある特定の実施形態では、「増量剤」を添加することができる。「増量剤」は、凍結乾
燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放気孔構
造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的
な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが
含まれる。本発明の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。

【0260】

保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減するために本明細書における製剤に添加するこ
とができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にす
ることができる。

【0261】

ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品は水性担体で構成され得る。本明細書にお
ける目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与に安全かつ無毒であり
）、凍結乾燥後、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤には、注射用
滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生
理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。

【0262】

ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物製品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷ
ＦＩ）または０．９％の塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構
成の間、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。

【0263】

ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、約４．５ｍＬの注射用
水に構成され、０．９％の生理食塩水溶液（塩化ナトリウム溶液）により希釈される。

【0264】

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性を生じず、特定
の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効である活性
成分の量を得るように変化し得る。

【0265】

特定の用量は、各患者に対して均一な用量、例えば、５０～５０００ｍｇのタンパク質
であってもよい。代替的に、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせ
られ得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、処置または予防される疾患または
状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および医学的状態が含まれ得
る。処置のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、特に、本
明細書に開示される投薬量情報およびアッセイを考慮して当業者によって慣用的になされ
る。投薬量はまた、適切な用量応答データと併せて使用される投薬量を決定するための公
知のアッセイの使用によって決定することができる。個々の患者の投薬量は、疾患の進行
がモニターされるにつれて調節されてもよい。患者における標的化可能な構築物または複
合物の血中レベルは、有効濃度に達するか、または有効濃度を維持するように投薬量が調
節される必要があるかどうかを調べるために測定され得る。どの標的化可能な構築物およ
び／または複合物、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に対して効果的である可能性
が高いかを決定するために薬理ゲノム学が使用され得る（Schmitzら、Clinica Chimica
Acta ３０８巻：４３～５３頁、２００１年；Steimerら、Clinica Chimica Acta
３０８巻：３３～４１頁、２００１年）。

【0266】

一般に、体重に基づく投薬量は、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、
約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約
０．０１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０
１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１
μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～
約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約５
０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１ｍｇ／ｋ
ｇ体重、約０．１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重
、約０．１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～
約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体
重、約１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～
約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０ｍｇ
／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約
１０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～
約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１０ｍｇ
／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、
約１００μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０
０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１０
０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重
、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍ
ｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0267】

用量は、１日に１回もしくは複数回、１週間に１回もしくは複数回、１ヶ月に１回もし
くは複数回または１年に１回もしくは複数回、またはさらに２～２０年に１回与えられ得
る。当業者は、体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の測定された滞留時
間および濃度に基づいて投薬のための反復率を容易に推定することができる。本発明の投
与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内であってもよく、
カテーテルを介する潅流によってでもよく、または直接的な病巣内注射によってでもよい
。これは、１日に１回または複数回、１週間に１回または複数回、１ヶ月に１回または複
数回、および１年に１回または複数回、投与され得る。

【0268】

上記の説明は本発明の複数の態様および実施形態を記載している。本出願は特に、態様
および実施形態のすべての組合せおよび置換を意図する。

【実施例0269】

ここで概して記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易
に理解され、これらの実施例は本発明のある特定の態様および実施形態の例示の目的のた
めにのみ含まれ、本発明を限定することを意図していない。
（実施例１）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製した組換えＮＫＧ２Ｄに結合する

【0270】

ヒト、マウス、またはカニクイザルＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの核酸配列を、ヒトＩｇ
Ｇ１ Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現させる哺乳動物細胞に導入し
た。精製後、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。非
特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした後、ＮＫＧ２Ｄ
結合ドメインを滴定し、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加
した。一次抗体結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、Ｆｃ交差反応
を回避するためにヒトカッパ軽鎖特異的に認識する二次抗体を使用して検出した。西洋ワ
サビペルオキシダーゼの基質である３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭにて測定し、
５４０ｎＭにて補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照または陽
性対照（配列番号１０１～１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメイン、またはｅ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ－６およびＣＸ－
５を含む）を各ウェルに添加した。

【0271】

アイソタイプ対照は組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質に対してわずかな結合を示した
が、陽性対照が組換え抗原に対して最も強く結合した。クローン毎に親和性は異なったが
、すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒト、マウス、およ
びカニクイザルの組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質のすべてで結合を示した。概して、
各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図３）およびカニクイザル（図４）の組換えＮＫＧ２
Ｄ－Ｆｃに同様の親和性で結合したが、マウス（図５）の組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対す
る親和性は比較的低かった。
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する

【0272】

ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を、ヒトまたはマウスのＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ゼータシグナ
ル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように工学操作した。ＮＫＧ２Ｄ結合クロー
ン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭ濃度にて使用して、ＥＬ４細胞におい
て発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色した。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二
次抗体を使用して抗体結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親
ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグ
ラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を計算した。

【0273】

すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒトおよびマウスの
ＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合した。陽性対照抗体（配列番号１０１～１０４か
ら選択される重鎖および軽鎖可変ドメイン、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて入手
可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ－６およびＣＸ－５を含む）が最も良好なＦＯＢ
結合シグナルをもたらした。各クローンのＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発
現する細胞（図６）とマウスＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図７）との間で同様であった。
（実施例２）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を遮断する
ＵＬＢＰ－６との競合

【0274】

組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特
異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした。飽和濃度
のＵＬＢＰ－６－Ｈｉｓ－ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインク
ローンを添加した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ
でコーティングされたウェルに結合したままであったＵＬＢＰ－６－Ｈｉｓ－ビオチンを
、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジンおよびＴＭＢ基
質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バック
グラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの
特異的結合を、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質への結合を遮断されたＵＬＢＰ－
６－Ｈｉｓ－ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１～
１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合
ドメインはＮＫＧ２ＤへのＵＬＢＰ－６の結合を遮断したが、アイソタイプ対照はＵＬＢ
Ｐ－６との競合をほとんど示さなかった（図８）。ＵＬＢＰ－６配列は配列番号１０８に
より表される

【化29】

ＭＩＣＡとの競合

【0275】

組換えヒトＭＩＣＡ－Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異
的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした。ＮＫＧ２Ｄ
－Ｆｃ－ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキ
ュベーションおよび洗浄後、ＭＩＣＡ－Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したまま
であったＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンを、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよびＴＭＢ基質
を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バック
グラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの
特異的結合を、ＭＩＣＡ－Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を遮断されたＮＫＧ
２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１～
１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合
ドメインはＮＫＧ２ＤへのＭＩＣＡの結合を遮断したが、アイソタイプ対照はＭＩＣＡと
の競合をほとんど示さなかった（図９）。
Ｒａｅ－１デルタとの競合

【0276】

組換えマウスＲａｅ－１デルタ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した）をマイ
クロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミン
でウェルをブロッキングした。マウスＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンをウェルに添加し、続
いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、Ｒａｅ－１
デルタ－Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビ
オチンを、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を
４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、Ｎ
ＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、Ｒａｅ－１デル
タ－Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を遮断されたＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチン
のパーセンテージから計算した。陽性対照（配列番号１０１～１０４から選択される重鎖
および軽鎖可変ドメイン、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて入手可能な抗マウスＮ
ＫＧ２ＤクローンＭＩ－６およびＣＸ－５を含む）ならびに種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメイ
ンクローンはマウスＮＫＧ２ＤへのＲａｅ－１デルタの結合を遮断したが、アイソタイプ
対照抗体はＲａｅ－１デルタとの競合をほとんど示さなかった（図１０）。
（実施例３）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはＮＫＧ２Ｄを活性化させる

【0277】

ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に、ヒトおよびマウスＮＫＧ
２Ｄの核酸配列を融合させて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次に、ギブソ
ンアセンブリを使用してＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ構築物をレトロウイルスベクターにクローニ
ングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。８μ
ｇ／ｍＬのポリブレンと共にＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを含有するウイルスにＥＬ４細胞を感染
させた。感染の２４時間後、ＥＬ４細胞中のＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲの発現レベルをフローサ
イトメトリーによって分析し、細胞表面で高レベルのＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを発現するクロ
ーンを選択した。

【0278】

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化させるかどうかを判定するために、それ
らをマイクロプレートのウェルに吸着させ、抗体断片でコーティングされたウェルにおい
てＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＥＬ４細胞をブレフェルジン－Ａおよびモネンシンの存在下で４
時間にわたって培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化の指標である細胞内ＴＮＦα産生をフローサ
イトメトリーによってアッセイした。陽性対照で処置した細胞に対してＴＮＦα陽性細胞
のパーセンテージを正規化した。すべてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがヒトＮＫＧ２Ｄ（図
１１）およびマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化させた。
（実施例４）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化させる
初代ヒトＮＫ細胞

【0279】

密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血バフィコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細
胞（ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋）を単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９５％で
あった。次に、単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含有する培地中で
２４～４８時間にわたって培養した後、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させた
マイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、
ブレフェルジン－Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。培養後、ＣＤ３、
ＣＤ５６およびＩＦＮ－γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフロー
サイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞におけるＣＤ
１０７ａおよびＩＦＮ－γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７
ａ／ＩＦＮ－γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合
による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（
例えば、重鎖可変ドメインは配列番号１０１または配列番号１０３によって表され、軽鎖
可変ドメインは配列番号１０２または配列番号１０４によって表される）では、アイソタ
イプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ^＋およびＩＦＮ－γ^＋にな
ることが示された（図１３および図１４は、ＮＫ細胞の調製のために異なるドナーのＰＢ
ＭＣをそれぞれ使用した、２つの独立した実験からのデータを表す）。
初代マウスＮＫ細胞

【0280】

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレイナーを通して押しつぶし
て、単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆ
ｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した、＃Ａ１０４９２０１；１５５ｍＭ塩化
アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウム、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血
球を除去した。残りの細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－２と共に７２時間にわたって培
養し、その後採取し、ＮＫ細胞単離の用意をした。次に、磁気ビーズを用いたネガティブ
ディプリーション（negative depletion）技術を使用し、典型的には＞９０％の純度で脾
臓細胞からＮＫ細胞（ＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋）を単離した。精製されたＮＫ細胞を、１０
０ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ－１５を含有する培地中で４８時間にわたって培養した後、ＮＫＧ
２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジ
ュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン－Ａ、およびモネンシンを含有する培地中
で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインでコーティングされたウェルにおいて培養した後、
ＣＤ３、ＮＫ１．１およびＩＦＮ－γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用
したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋細胞
におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ－γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した
。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ－γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化
受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよ
び陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭ
Ｉ－６およびＣＸ－５から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージ
のＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ^＋およびＩＦＮ－γ^＋になることを示した（図１５および図１
６は、ＮＫ細胞の調製のために異なるマウスをそれぞれ使用した、２つの独立した実験か
らのデータを表す）。
（実施例５）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする

【0281】

ヒトおよびマウス初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキ
ュベーション後、ＮＫ細胞における細胞傷害性マーカーの増加を実証した。これが腫瘍細
胞溶解の増加につながるかどうかに対処するために、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが単一特
異性抗体に発達させる細胞ベースのアッセイを利用した。Ｆｃ領域を１つの標的化アーム
として使用し、一方、Ｆａｂ断片領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）はＮＫ細胞を活性化す
るための別の標的化アームとして働いた。ヒト起源であり、高レベルのＦｃ受容体を発現
するＴＨＰ－１細胞を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ
細胞傷害性キットを使用した。ＴＨＰ－１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識し、１０^５／ｍＬ
にて培養培地に再懸濁した。次に、標識したＴＨＰ－１細胞をＮＫＧ２Ｄ抗体と組み合わ
せ、マイクロタイタープレートのウェル中で３７℃にて３時間、マウスＮＫ細胞を単離し
た。インキュベーション後、２０μＬの培養上清を取り出し、２００μＬのユーロピウム
溶液と混合し、暗所で１５分間振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光モジュー
ル（励起３３７ｎＭ、発光６２０ｎＭ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーに
よって蛍光を経時的に測定し、キットの指示に従って特異的溶解を計算した。

【0282】

Ｆｃとコンジュゲートした陽性対照のＵＬＢＰ－６（ＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンド
である）は、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ－１標的細胞の特異的溶解の増加を示した。Ｎ
ＫＧ２Ｄ抗体も、ＴＨＰ－１標的細胞の特異的溶解を増加させたが、アイソタイプ対照抗
体は特異的溶解の低減を示した。点線は、抗体を添加していないマウスＮＫ細胞によるＴ
ＨＰ－１細胞の特異的溶解を示す（図１７）。
（実施例６）
ＮＫＧ２Ｄ抗体は高い熱安定性を示す

【0283】

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度を、示差走査型蛍光定量法を使用してアッセイした
。外挿した見かけの融解温度は典型的なＩｇＧ１抗体と比較して高い（図１８）。
（実施例７）
ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６の架橋によるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ

【0284】

密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血バフィコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
を単離した。ネガティブ磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＃１７９５５）を使用してＰＢ
ＭＣからＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定して＞９
０％のＣＤ３^－ＣＤ５６^＋であった。次に、細胞を、活性化アッセイに使用する前に１０
０ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０２）を含有する培地中で
４８時間増やした。抗体を、滅菌ＰＢＳ １００μＬ中２μｇ／ｍＬ（抗ＣＤ１６、Ｂｉ
ｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０２０１３）および５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ ＃ＭＡ
Ｂ１３９）の濃度にて４℃で一晩、９６ウェル平底プレート上にコーティングし、続いて
ウェルを十分に洗浄して過剰の抗体を除去した。脱顆粒の評価のために、ＩＬ－２活性化
ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２（ｈＩＬ２）および１μｇ／ｍＬのＡＰＣ
コンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３２８６１９）を補充
した培養培地に５×１０^５個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。次に、１×１０^５個の細胞／
ウェルを、抗体でコーティングされたプレート上に添加した。タンパク質輸送阻害剤であ
るブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０６０１）およびモネンシン
（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０７０１）を、それぞれ１：１０００および１：２７０の
最終的希釈度にて添加した。蒔いた細胞を、３７℃にて４時間にわたって５％ＣＯ_２中で
インキュベートした。ＩＦＮ－γの細胞内染色のために、ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３（Ｂｉｏ
ｌｅｇｅｎｄ ＃３００４５２）および抗ＣＤ５６ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３
１８３２８）で標識し、続いて固定し、透過処理し、抗ＩＦＮ－γ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅ
ｇｅｎｄ ＃５０６５０７）で標識した。ＮＫ細胞を、生ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－細胞におい
てゲーティングした後、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ－γの
発現について分析した。

【0285】

受容体の組合せの相対的効力を調査するため、プレート結合刺激により、ＮＫＧ２Ｄま
たはＣＤ１６の架橋および両受容体の共架橋を行った。図１９（図１９Ａ～１９Ｃ）に示
したように、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄの組み合わせた刺激は、ＣＤ１０７ａのレベル（
脱顆粒）（図１９Ａ）および／またはＩＦＮ－γ産生（図１９Ｂ）の大きな上昇をもたら
した。点線は、各受容体の個々の刺激の相加効果を表す。
抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄまたは両方のモノクローナル抗体の組合せを用いた４時間の
プレート結合刺激の後、ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａレベルおよび細胞内ＩＦ
Ｎ－γ産生を分析した。グラフは、平均（ｎ＝２）±Ｓｄを示している。図１９Ａは、Ｃ
Ｄ１０７ａのレベルを示し、図１９Ｂは、ＩＦＮ－γのレベルを示し、図１９Ｃは、ＣＤ
１０７ａおよびＩＦＮ－γのレベルを示す。図１９Ａ～１９Ｃに示したデータは、５名の
異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。
（実施例８）
三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）に媒介される標的細胞の細胞傷害性の増
強
ヒトがん抗原を発現した細胞へのＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂの結合の評価

【0286】

ＥＰＣＡＭを発現するヒトがん細胞株を使用して、Ｆ４フォーマットおよびＦ３’フォ
ーマットの、ＥＰＣＡＭを標的とするクローンＭＴ１１０に由来するＴｒｉＮＫＥＴの腫
瘍抗原結合を評価した。ヒト細胞株Ｈ７４７、ＨＣＣ８２７およびＨＣＴ１１６を使用し
て、ＴｒｉＮＫＥＴおよびｍＡｂのＥＰＣＡＭを発現した細胞への結合を評価した。Ｔｒ
ｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを希釈し、それぞれの細胞とインキュベートした。フルオロフォ
アコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイト
メトリーによって分析し、ＥＰＣＡＭを発現した細胞に対する結合ＭＦＩをヒト組換えＩ
ｇＧ１で染色した対照に対して正規化してバックグラウンド値に対する倍率を得た。

【0287】

図３７は、本開示の三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）（Ａ４９－Ｆ４－Ｔ
ｒｉＮＫＥＴ－ＭＴ１１０およびＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＴ１１０）および
親モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＥｐＣＡＭを発現するＨ７４７ヒト結腸直腸がん細胞
への結合を示す。図３８は、本開示の三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）（Ａ
４９－Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＴ１１０およびＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＴ
１１０）および親モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＥｐＣＡＭを発現するＨＣＣ８２７ヒ
ト肺がん細胞への結合を示す。図３９は、本開示の三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮ
ＫＥＴ）（Ａ４９－Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＭＴ１１０およびＡ４９－Ｆ３’－ＴｒｉＮ
ＫＥＴ－ＭＴ１１０）および親モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＥｐＣＡＭを発現するＨ
ＣＴ１１６ヒト結腸直腸がん細胞への結合を示す。全体的な結合は、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥ
Ｔでは、ＭＴ１１０ ＥＰＣＡＭ結合体が組み込まれたＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと比較し
てより強力であった。
初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ

【0288】

密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血バフィコートからＰＢＭＣを単離した。単離さ
れたＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞単離のために用意した。磁気ビーズを用いたネガティブ
セレクション技術を使用してＮＫ細胞を単離した。達成された単離されたＮＫ細胞の純度
は、典型的には９０％よりも高いＣＤ３^－ＣＤ５６^＋であった。単離されたＮＫ細胞をサ
イトカインなしで一晩インキュベートし、翌日、細胞傷害性アッセイに使用した。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ

【0289】

目的の標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、ＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤ
Ａ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＡＤ０１１６）で標識するために成長培地に１０^６
個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。製造業者の指示に従って標的細胞を標識した。標識後、
細胞をＨＢＳで３回洗浄し、０．５×１０^５個の細胞／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。
バックグラウンドウェルを用意するために、標識した細胞のアリコートを取っておき、細
胞を培地からスピンアウトした。培地１００μＬを、ペレット化した細胞を乱さないよう
に３連でウェルに注意深く添加した。１００μＬのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレ
ートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、１％のＴ
ｒｉｔｏｎ－Ｘの添加による標的細胞の溶解のために用意した。目的の腫瘍標的に対する
モノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地で希釈し、５０μＬの希釈したｍＡ
ｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。休止ＮＫ細胞を培養物から採取し、洗浄
し、所望のエフェクター細胞と標的細胞の比に応じて培養培地に１．０×１０^５～２．０
×１０^６個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。５０μＬのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添
加して合計２００μＬの培養体積にした。アッセイの展開前にプレートを３７℃にて５％
ＣＯ_２で２～４時間にわたってインキュベートした。

【0290】

２～３時間培養した後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を２００×ｇ
で５分間の遠心分離によってペレット化した。２０μＬの培養上清を、製造業者から提供
された清浄なマイクロプレートに移し、２００μＬの室温ユーロピウム溶液を各ウェルに
添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカーにおいて２５０ｒｐｍにて１５
分にわたってインキュベートした。プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３
Ｘ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読み取り、パーセント特異的
溶解を計算した（特異的溶解％＝（実験的放出－自然放出）／（最大放出－自然放出））
×１００）。

【0291】

図４０Ａおよび図４０Ｂは、Ｈ７４７ヒトがん細胞に対する、２名の異なる健康なドナ
ー由来の休止ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害性である。図４１Ａおよび図４
１Ｂは、ＨＣＣ８２７ヒトがん細胞に対する、２名の異なる健康なドナー由来の休止ヒト
ＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害性である。図４２Ａおよび図４２Ｂは、ＭＣＦ７
ヒトがん細胞に対する、２名の異なる健康なドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫ
ＥＴ媒介細胞傷害性である。図４３Ａおよび図４３Ｂは、ＨＣＴ１１６ヒトがん細胞に対
する、２名の異なる健康なドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害
性である。ＥＰＣＡＭを標的とするＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、ＥＰＣＡＭを標的とする親
ｍＡｂよりも効果的に標的細胞を死滅させた。Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴはまた、Ｆ３’－Ｔ
ｒｉＮＫＥＴよりも強力に標的細胞を死滅させ、これは、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴの標的細
胞への結合がより強力であることを反映するものであり得る。
参照による組込み

【0292】

本明細書で参照される特許文書および科学論文の各々の開示全体は、すべての目的のた
めに参照により組み込まれる。
等価物

【0293】

本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の特定の形態で実現されても
よい。したがって、前述の実施形態は、本明細書で記載している本発明を限定するのでは
なく、すべての点で例示的であるとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は
、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲
の等価の意味および範囲に入るすべての変更はその中に包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30-1】

【図30-2】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【配列表】

2023166409000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-09-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）に結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭ、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル－ＧＭ１（モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、およびシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される抗原に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）表面抗原分類１６（ＣＤ１６）に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。

【外国語明細書】