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特開2023-166478グリコシル化タンパク質の電気泳動のための脱グリコシル化方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023166478
(43)【公開日】2023-11-21
(54)【発明の名称】グリコシル化タンパク質の電気泳動のための脱グリコシル化方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/447 20060101AFI20231114BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20231114BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20231114BHJP
【ＦＩ】
G01N27/447 301A
C12Q1/34 ZNA
G01N33/68
G01N27/447 301B
G01N27/447 325A
G01N27/447 315K
G01N27/447 331E
【審査請求】未請求
【請求項の数】28
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023139726
(22)【出願日】2023-08-30
(62)【分割の表示】P 2022544080の分割
【原出願日】2021-01-20
(31)【優先権主張番号】62/963,646
(32)【優先日】2020-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】507302748
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ジャオ イーミン
(72)【発明者】
【氏名】チェン ハンター
(72)【発明者】
【氏名】ワン シャオ－チュン
(72)【発明者】
【氏名】リールマン ティモシー
(72)【発明者】
【氏名】カロー ガブリエル
(72)【発明者】
【氏名】ワン イン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】糖タンパク質が分析され得る、高速、正確、および高度に再現性のある高スループット方法を提供する。
【解決手段】対象のタンパク質を含む試料を分析する方法であって、（ａ）試料を変性させるステップと、（ｂ）試料を蛍光標識で標識して、標識された試料を生成する、標識するステップと、（ｃ）標識された試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、（ｄ）標識された試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、（ｅ）標識された試料の電気泳動を実施するステップとを含み、試料が、ステップ（ｄ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ａ）～（ｃ）で変性され、標識され、かつクエンチされる。
【選択図】図１
【解決手段】対象のタンパク質を含む試料を分析する方法であって、（ａ）試料を変性させるステップと、（ｂ）試料を蛍光標識で標識して、標識された試料を生成する、標識するステップと、（ｃ）標識された試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、（ｄ）標識された試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、（ｅ）標識された試料の電気泳動を実施するステップとを含み、試料が、ステップ（ｄ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ａ）～（ｃ）で変性され、標識され、かつクエンチされる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象のタンパク質を含む試料を分析する方法であって、
前記方法が、
（ａ）前記試料を変性させるステップと、
（ｂ）前記対象のタンパク質を蛍光標識で標識して、標識された試料を生成する、標識するステップと、
（ｃ）前記標識された試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、
（ｄ）前記標識された試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化して、脱グリコシル化された標識された試料を生成する、脱グリコシル化するステップと、
（ｅ）前記脱グリコシル化された標識された試料の電気泳動を実施するステップと
を含み、
前記試料が、ステップ（ｄ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ａ）～（ｃ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、
方法。
前記方法が、
（ａ）前記試料を変性させるステップと、
（ｂ）前記対象のタンパク質を蛍光標識で標識して、標識された試料を生成する、標識するステップと、
（ｃ）前記標識された試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、
（ｄ）前記標識された試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化して、脱グリコシル化された標識された試料を生成する、脱グリコシル化するステップと、
（ｅ）前記脱グリコシル化された標識された試料の電気泳動を実施するステップと
を含み、
前記試料が、ステップ（ｄ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ａ）～（ｃ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、
方法。
【請求項2】
前記対象のタンパク質が、少なくとも1つのグリコシル化部位を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記対象のタンパク質が、少なくとも1つの付着グリカンを含むグリコシル化タンパク質である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
前記対象のタンパク質が、抗原結合ドメインを含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記対象のタンパク質が、抗体、抗体断片、またはｓｃＦｖを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項6】
前記対象のタンパク質が、Ｆｃドメインおよび／または受容体融合タンパク質を含む、
請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記対象のタンパク質が、受容体融合タンパク質を含み、前記受容体融合タンパク質が、受容体－Ｆｃ融合タンパク質または可溶性ＴＣＲ－Ｆｃ融合タンパク質である、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
前記対象のタンパク質が、組換えヒトタンパク質である、請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記少なくとも1つの付着グリカンが、Ｎ結合している、請求項3に記載の方法。
【請求項10】
前記エンドグリコシダーゼが、Ｎ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、かつ／または
前記エンドグリコシダーゼが、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、およびエンドグリコシダーゼＦ4からなる群から選択される、
請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
前記エンドグリコシダーゼが、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、およびエンドグリコシダーゼＦ4からなる群から選択される、
請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＰＮＧａｓｅ Ｆが、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆである、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
前記Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆが、非還元性である、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
前記試料を脱グリコシル化するステップが、前記試料を約50℃で10分間加熱することを含む、請求項11または12に記載の方法。
【請求項14】
前記試料を脱グリコシル化するステップが、
0．2～1．5ｍｇの標識された対象のタンパク質と、エンドグリコシダーゼとを含む、反応混合物を形成すること
を含む、請求項1～13のいずれか一項に記載の方法。
0．2～1．5ｍｇの標識された対象のタンパク質と、エンドグリコシダーゼとを含む、反応混合物を形成すること
を含む、請求項1～13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記少なくとも1つのグリカンが、Ｏ結合型グリカンである、請求項3～8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記エンドグリコシダーゼが、Ｏ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、かつ／または
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミンダーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）を含む、
請求項15に記載の方法。
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミンダーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）を含む、
請求項15に記載の方法。
【請求項17】
前記試料を蛍光標識で標識するステップが、前記試料を約35℃で10～30分間加熱することを含む、請求項1～16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記試料が、還元性溶液または非還元性溶液を使用して変性される、請求項1～17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記試料が還元性溶液を使用して変性され、かつ前記還元性溶液がジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、または
前記試料が非還元性溶液を使用して変性され、かつ前記非還元性溶液がヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む、
請求項18に記載の方法。
前記試料が非還元性溶液を使用して変性され、かつ前記非還元性溶液がヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む、
請求項18に記載の方法。
【請求項20】
前記試料を変性させるステップが、前記試料を50℃～99℃の間で1～60分間加熱することを含む、
前記未反応蛍光標識をクエンチするステップが、停止溶液を添加することを含む、かつ／または
前記方法が、前記試料と同時に参照標準を分析するステップをさらに含む、
請求項1～19のいずれか一項に記載の方法。
前記未反応蛍光標識をクエンチするステップが、停止溶液を添加することを含む、かつ／または
前記方法が、前記試料と同時に参照標準を分析するステップをさらに含む、
請求項1～19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記電気泳動が、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）からなる群から選択される、請求項1～20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、20ｋＤａ未満の範囲内の遊離染料干渉の低減、および電気泳動図内のエンドグリコシダーゼピークの低減または非存在をもたらす、請求項1～21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、前記エンドグリコシダーゼピークが、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％低減される、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
対象のタンパク質の安定性を決定する方法であって、
前記方法が、
（ａ）ストレスを受けた試料を形成するために、前記対象のタンパク質を含む試料にストレスを加えるステップと、
（ｂ）ストレスを受けた前記試料、および前記対象のタンパク質を含むストレスを受けていない試料を、変性させるステップと、
（ｃ）前記ストレスを受けた試料中の対象のタンパク質および前記ストレスを受けていない試料中の対象のタンパク質を蛍光標識で標識して、標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料を生成する、標識するステップと、
（ｄ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、
（ｅ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化して、脱グリコシル化された標識されたストレスを受けた試料および脱グリコシル化された標識されたストレスを受けていない試料を生成する、脱グリコシル化するステップと、
（ｆ）前記脱グリコシル化された標識されたストレスを受けた試料および前記脱グリコシル化された標識されたストレスを受けていない試料のマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施して、前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料の電気泳動図を生成する、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施するステップと、
（ｇ）前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料からの前記電気泳動図を比較し、それによって、前記対象のタンパク質の安定性を決定する、比較するステップと
を含み、
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料が、ステップ（ｅ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ｂ）～（ｄ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、
方法。
前記方法が、
（ａ）ストレスを受けた試料を形成するために、前記対象のタンパク質を含む試料にストレスを加えるステップと、
（ｂ）ストレスを受けた前記試料、および前記対象のタンパク質を含むストレスを受けていない試料を、変性させるステップと、
（ｃ）前記ストレスを受けた試料中の対象のタンパク質および前記ストレスを受けていない試料中の対象のタンパク質を蛍光標識で標識して、標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料を生成する、標識するステップと、
（ｄ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、
（ｅ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化して、脱グリコシル化された標識されたストレスを受けた試料および脱グリコシル化された標識されたストレスを受けていない試料を生成する、脱グリコシル化するステップと、
（ｆ）前記脱グリコシル化された標識されたストレスを受けた試料および前記脱グリコシル化された標識されたストレスを受けていない試料のマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施して、前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料の電気泳動図を生成する、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施するステップと、
（ｇ）前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料からの前記電気泳動図を比較し、それによって、前記対象のタンパク質の安定性を決定する、比較するステップと
を含み、
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料が、ステップ（ｅ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ｂ）～（ｄ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、
方法。
【請求項25】
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料に熱的にストレスを加えること、少なくとも1回の凍結／解凍サイクル、前記試料を保存条件に曝露すること、前記試料を機械的に攪拌すること、前記試料を凍結乾燥および再水和すること、または前記試料を光、放射線、一重項酸素種、フリーラジカル、高ｐＨ条件、もしくは低ｐＨ条件に曝露することを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項26】
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料に熱的にストレスを加えることを含み、前記試料に熱的にストレスを加えることが、前記試料を約30℃～約45℃で少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、もしくは少なくとも8週間保持することを含む、または
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を保存条件に曝露することを含み、前記保存条件が、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも8か月間、少なくとも12か月間、少なくとも18か月間、少なくとも24か月間、もしくは少なくとも30か月間の約－80℃～－30℃の温度を含むか、もしくは少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも8か月間、少なくとも12か月間、もしくは少なくとも18か月間の約2℃～8℃の温度を含む、
請求項25に記載の方法。
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を保存条件に曝露することを含み、前記保存条件が、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも8か月間、少なくとも12か月間、少なくとも18か月間、少なくとも24か月間、もしくは少なくとも30か月間の約－80℃～－30℃の温度を含むか、もしくは少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも8か月間、少なくとも12か月間、もしくは少なくとも18か月間の約2℃～8℃の温度を含む、
請求項25に記載の方法。
【請求項27】
前記対象のタンパク質が、少なくとも1つの付着グリカンを含むグリコシル化タンパク質である、請求項24～26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料の前記電気泳動図を比較するステップが、ピーク数、高さ、位置、面積、またはそれらの組み合わせを比較することを含む、請求項24～27のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年１月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９６３，６４６号の優先権の利益を主張する。
本出願は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年１月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９６３，６４６号の優先権の利益を主張する。
【0002】
技術分野
本開示は、生化学、分子生物学、および電気泳動を介したタンパク質の分析の分野に関する。
本開示は、生化学、分子生物学、および電気泳動を介したタンパク質の分析の分野に関する。
【0003】
参照による配列表の援用
ここで電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＲＥＧＥ－０１９－００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２０年１２月２２日、ファイルサイズ１キロバイト）。
ここで電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＲＥＧＥ－０１９－００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２０年１２月２２日、ファイルサイズ１キロバイト）。
【背景技術】
【0004】
背景
キャピラリーベースの電気泳動（ＣＥ）およびマイクロチップベースのキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）は、タンパク質サイズに基づいて治療用タンパク質の完全性および純度を特性評価し、品質管理を提供するために使用される、製薬業界における一般的な分析方法である。標準的な業界推奨試料調製方法は、多くのタンパク質に効果的であるが、重度にグリコシル化されたタンパク質は、ＣＥおよびＭＣＥによる不十分な分離および定量により問題がある。加えて、ＭＣＥプロファイルにおける部分的にグリコシル化されたピークおよびグリコシル化されていないピークは、不純物ピークと重複し、定量化に干渉し得る。したがって、グリコシル化タンパク質を用いた作業の課題を克服し得る、追加の試料調製方法の必要性が当該技術分野に存在する。本発明は、ＣＥおよびＭＣＥなどの電気泳動方法による分析のためのタンパク質を調製するために使用され得る、重度にグリコシル化されたタンパク質を標識するための方法を提供する。
キャピラリーベースの電気泳動（ＣＥ）およびマイクロチップベースのキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）は、タンパク質サイズに基づいて治療用タンパク質の完全性および純度を特性評価し、品質管理を提供するために使用される、製薬業界における一般的な分析方法である。標準的な業界推奨試料調製方法は、多くのタンパク質に効果的であるが、重度にグリコシル化されたタンパク質は、ＣＥおよびＭＣＥによる不十分な分離および定量により問題がある。加えて、ＭＣＥプロファイルにおける部分的にグリコシル化されたピークおよびグリコシル化されていないピークは、不純物ピークと重複し、定量化に干渉し得る。したがって、グリコシル化タンパク質を用いた作業の課題を克服し得る、追加の試料調製方法の必要性が当該技術分野に存在する。本発明は、ＣＥおよびＭＣＥなどの電気泳動方法による分析のためのタンパク質を調製するために使用され得る、重度にグリコシル化されたタンパク質を標識するための方法を提供する。
【発明の概要】
【0005】
概要
本開示は、対象のタンパク質を含む試料を分析する方法であって、試料を変性、蛍光標識、クエンチ、および脱グリコシル化するステップを含み、変性、標識、およびクエンチするステップが、脱グリコシル化の前に生じる、方法に関する。本開示の試料を分析する方法は、エンドグリコシダーゼによる電気泳動図ピークを低減または排除することができ、遊離染料干渉を低減し、それによって、それを通して糖タンパク質が分析され得る、高速、正確、および高度に再現性のある高スループット方法を提供することができる。
本開示は、対象のタンパク質を含む試料を分析する方法であって、試料を変性、蛍光標識、クエンチ、および脱グリコシル化するステップを含み、変性、標識、およびクエンチするステップが、脱グリコシル化の前に生じる、方法に関する。本開示の試料を分析する方法は、エンドグリコシダーゼによる電気泳動図ピークを低減または排除することができ、遊離染料干渉を低減し、それによって、それを通して糖タンパク質が分析され得る、高速、正確、および高度に再現性のある高スループット方法を提供することができる。
【0006】
本開示は、対象のタンパク質を含む試料を分析する方法であって、（ａ）試料を変性させるステップと、（ｂ）試料を蛍光標識で標識して、標識された試料を生成する、標識するステップと、（ｃ）標識された試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、（ｄ）標識された試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、（ｅ）標識された試料の電気泳動を実施するステップとを含み、試料が、ステップ（ｄ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ａ）～（ｃ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、方法を提供する。
【0007】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、グリコシル化タンパク質である。いくつかの実施形態では、グリコシル化タンパク質は、少なくとも１つの付着グリカンを含む。いくつかの実施形態では、グリコシル化タンパク質の総重量の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、または少なくとも１０％は、グリカン（１０％ｗ／ｗ）を含む。
【0008】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、抗体、抗体断片、またはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、受容体融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、受容体融合タンパク質は、受容体－Ｆｃ融合タンパク質または可溶性ＴＣＲ－Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、受容体融合タンパク質は、トラップタンパク質またはミニトラップタンパク質である。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、トラップタンパク質またはミニトラップタンパク質である。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、組換えヒトタンパク質である。
【0009】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、グリコシル化部位は、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの付着グリカンは、Ｎ結合している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの付着グリカンは、グリコシル化タンパク質中のアスパラギンにＮ結合している。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、Ｎ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、およびエンドグリコシダーゼＦ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、ＰＮＧａｓｅ Ｆである。いくつかの実施形態では、ＰＮＧａｓｅ Ｆは、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆである。いくつかの実施形態では、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆは、非還元性である。いくつかの実施形態では、ＰＮＧａｓｅ Ｆは、還元性である。
【0010】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料を脱グリコシル化するステップは、試料を約３５℃まで３０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、試料を脱グリコシル化するステップは、試料を約５０℃まで１０～３０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、試料を脱グリコシル化するステップは、試料を約５０℃まで１０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、試料を脱グリコシル化するステップは、０．２～１．５ｍｇの、標識された対象のタンパク質と、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆの体積を除く１０μＬの反応体積中の、１～５μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆとを含む、反応混合物を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、０．２ｍｇの標識された対象のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、５μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、緩衝液を含む。
【0011】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのグリカンは、Ｏ結合型グリカンである。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、Ｏ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミンダーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）を含む。
【0012】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料を蛍光標識で標識するステップは、試料を約３５℃まで１０～３０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、試料を蛍光標識で標識するステップは、試料を約３５℃まで１５分間加熱することを含む。
【0013】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料は、還元性溶液を使用して変性される。いくつかの実施形態では、還元性溶液は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む。いくつかの実施形態では、試料は、非還元性溶液を使用して変性される。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む。いくつかの実施形態では、試料を変性させるステップは、試料を４０℃と９９℃の間まで１分間～５時間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、試料を変性させるステップは、試料を５０℃と９９℃の間まで１～６０分間加熱することを含む。
【0014】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、未反応蛍光標識をクエンチするステップは、停止溶液を添加することを含む。
【0015】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、試料と同時に参照標準を分析するステップをさらに含む。
【0016】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、電気泳動は、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、電気泳動は、ＭＣＥである。いくつかの実施形態では、ＭＣＥは、ＭＣＥ機器を使用して実行される。
【0017】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、２０ｋＤａ未満の範囲内の遊離染料干渉の低減、および電気泳動図内のエンドグリコシダーゼピークの低減または非存在をもたらす。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼピークは、脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低減される。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼピークは、脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、電気泳動図に存在しない。
【0018】
本開示は、対象のタンパク質の安定性を決定する方法であって、（ａ）対象のタンパク質を含む試料にストレスを加えるステップと、（ｂ）ストレスを受けた試料、および対象のタンパク質を含むストレスを受けていない試料を、変性させるステップと、（ｃ）ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料を蛍光標識で標識して、標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料を生成する、標識するステップと、（ｄ）標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、（ｅ）標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、（ｆ）標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料のマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施して、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料の電気泳動図を生成する、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施するステップと、（ｇ）ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料からの電気泳動図を比較し、それによって、対象のタンパク質の安定性を決定する、比較するステップとを含み、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料が、ステップ（ｅ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ｂ）～（ｄ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、方法を提供する。
【0019】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料にストレスを加えるステップは、試料に熱的にストレスを加えることを含む。いくつかの実施形態では、試料に熱的にストレスを加えることは、試料を約３０℃～約４５℃で少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、または少なくとも８週間保持することを含む。
【0020】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料にストレスを加えるステップは、少なくとも１回の凍結／解凍サイクルを含む。
【0021】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料にストレスを加えるステップは、試料を保存条件に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、保存条件は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも８か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２４か月、または少なくとも３０か月間の約－８０℃～－３０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、保存条件は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも８か月、少なくとも１２か月、または少なくとも１８か月の約２℃～８℃の温度を含む。
【0022】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料にストレスを加えるステップは、試料を機械的に攪拌することを含む。
【0023】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料にストレスを加えるステップは、試料を凍結乾燥および再水和することを含む。
【0024】
試料にストレスを加えることが、試料を光、放射線、一重項酸素種、フリーラジカル、高ｐＨ条件、または低ｐＨ条件に曝露することを含む。
【0025】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、グリコシル化タンパク質である。いくつかの実施形態では、グリコシル化タンパク質は、少なくとも１つの付着グリカンを含む。いくつかの実施形態では、グリコシル化タンパク質の総重量の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、または少なくとも１０％は、グリカン（１０％ｗ／ｗ）を含む。いくつかの実施形態では、グリコシル化タンパク質の総重量の少なくとも１０％は、グリカン（１０％ｗ／ｗ）を含む。
【0026】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、抗体、抗体断片、またはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、受容体融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、受容体融合タンパク質は、受容体－Ｆｃ融合タンパク質または可溶性ＴＣＲ－Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、受容体融合タンパク質は、トラップタンパク質またはミニトラップタンパク質である。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、トラップタンパク質またはミニトラップタンパク質である。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、組換えヒトタンパク質である。
【0027】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、グリコシル化部位は、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの付着グリカンは、Ｎ結合している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの付着グリカンは、グリコシル化タンパク質中のアスパラギンにＮ結合している。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、Ｎ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、およびエンドグリコシダーゼＦ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、ＰＮＧａｓｅ Ｆである。いくつかの実施形態では、ＰＮＧａｓｅ Ｆは、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆである。いくつかの実施形態では、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆは、非還元性である。いくつかの実施形態では、ＰＮＧａｓｅ Ｆは、還元性である。
【0028】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料を脱グリコシル化するステップは、試料を約３５℃まで３０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料を脱グリコシル化するステップは、試料を約５０℃まで１０～３０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料を脱グリコシル化するステップは、試料を約５０℃まで１０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料を脱グリコシル化するステップは、０．２～１．５ｍｇの、標識された対象のタンパク質と、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆの体積を除く１０μＬの反応体積中の、１～５μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆとを含む、反応混合物を含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料のそれぞれについての反応混合物は、５μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料のそれぞれは、０．２ｍｇの標識された対象のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料のそれぞれについての反応混合物は、緩衝液を含む。
【0029】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのグリカンは、Ｏ結合型グリカンである。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、Ｏ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する。いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミンダーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）を含む。
【0030】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料を蛍光標識で標識するステップは、それぞれの試料を約３５℃まで３０分間加熱することを含む。
【0031】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料は、還元性溶液を使用して変性される。いくつかの実施形態では、還元性溶液は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料は、非還元性溶液を使用して変性される。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料を変性させるステップは、試料を４０℃と９９℃の間まで１分間～５時間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料を変性させるステップは、試料を５０℃と９９℃の間まで１～６０分間加熱することを含む。
【0032】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、未反応蛍光標識をクエンチするステップは、停止溶液を添加することを含む。
【0033】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料と同時に参照標準を分析するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料の電気泳動図を比較するステップは、ピーク数、高さ、位置、面積、またはそれらの組み合わせを比較することを含む。
[本発明1001]
対象のタンパク質を含む試料を分析する方法であって、
前記方法が、
（ａ）前記試料を変性させるステップと、
（ｂ）前記試料を蛍光標識で標識して、標識された試料を生成する、標識するステップと、
（ｃ）前記標識された試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、
（ｄ）前記標識された試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、
（ｅ）前記標識された試料の電気泳動を実施するステップと
を含み、
前記試料が、ステップ（ｄ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ａ）～（ｃ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、
方法。
[本発明1002]
前記対象のタンパク質が、少なくとも1つのグリコシル化部位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記対象のタンパク質が、グリコシル化タンパク質である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記グリコシル化タンパク質が、少なくとも1つの付着グリカンを含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記対象のタンパク質が、抗原結合ドメインを含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記対象のタンパク質が、抗体、抗体断片、またはｓｃＦｖを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記対象のタンパク質が、Ｆｃドメインを含む、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記対象のタンパク質が、受容体融合タンパク質を含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記受容体融合タンパク質が、受容体－Ｆｃ融合タンパク質または可溶性ＴＣＲ－Ｆｃ融合タンパク質である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記受容体融合タンパク質が、トラップタンパク質またはミニトラップタンパク質である、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
前記対象のタンパク質が、組換えヒトタンパク質である、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記グリコシル化部位が、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列を含む、本発明1002～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記少なくとも1つの付着グリカンが、Ｎ結合している、本発明1004～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記少なくとも1つの付着グリカンが、前記グリコシル化タンパク質中のアスパラギンにＮ結合している、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記エンドグリコシダーゼが、Ｎ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記エンドグリコシダーゼが、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、およびエンドグリコシダーゼＦ4からなる群から選択される、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記エンドグリコシダーゼが、ＰＮＧａｓｅ Ｆである、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記ＰＮＧａｓｅ Ｆが、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆが、非還元性である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記試料を脱グリコシル化するステップが、前記試料を約50℃まで10分間加熱することを含む、本発明1017～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記試料を脱グリコシル化するステップが、
0．2～1．5ｍｇの、標識された対象のタンパク質と、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆの体積を除く10μＬの反応体積中の、1～5μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆとを含む、反応混合物
を含む、本発明1001～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記反応混合物が、0．2ｍｇの、標識された対象のタンパク質を含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記反応混合物が、5μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆを含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記反応混合物が、緩衝液を含む、本発明1021～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記少なくとも1つのグリカンが、Ｏ結合型グリカンである、本発明1004～1011のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記エンドグリコシダーゼが、Ｏ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミンダーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）を含む、本発明1025または1026の方法。
[本発明1028]
前記試料を蛍光標識で標識するステップが、前記試料を約35℃まで10～30分間加熱することを含む、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記試料を蛍光標識で標識するステップが、前記試料を約35℃まで約15分間加熱することを含む、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記試料が、還元性溶液を使用して変性される、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記還元性溶液が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記試料が、非還元性溶液を使用して変性される、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記非還元性溶液が、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記試料を変性させるステップが、前記試料を40℃と99℃の間まで1分間～5時間加熱することを含む、本発明1001～1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記試料を変性させるステップが、前記試料を50℃と99℃の間まで1～60分間加熱することを含む、本発明1001～1033のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記未反応蛍光標識をクエンチするステップが、停止溶液を添加することを含む、本発明1001～1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記試料と同時に参照標準を分析するステップをさらに含む、本発明1001～1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記電気泳動が、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）からなる群から選択される、本発明1001～1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記電気泳動が、ＭＣＥである、本発明1001～1037のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記ＭＣＥが、ＭＣＥ機器を使用して実行される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、20ｋＤａ未満の範囲内の遊離染料干渉の低減、および電気泳動図内のエンドグリコシダーゼピークの低減または非存在をもたらす、本発明1001～1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、前記エンドグリコシダーゼピークが、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％低減される、本発明1041の方法。
[本発明1043]
脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、前記エンドグリコシダーゼピークが、電気泳動図に存在しない、本発明1041の方法。
[本発明1044]
対象のタンパク質の安定性を決定する方法であって、
前記方法が、
（ａ）前記対象のタンパク質を含む試料にストレスを加えるステップと、
（ｂ）ストレスを受けた前記試料、および前記対象のタンパク質を含むストレスを受けていない試料を、変性させるステップと、
（ｃ）前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を蛍光標識で標識して、標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料を生成する、標識するステップと、
（ｄ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、
（ｅ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、
（ｆ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料のマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施して、前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料の電気泳動図を生成する、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施するステップと、
（ｇ）前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料からの前記電気泳動図を比較し、それによって、前記対象のタンパク質の安定性を決定する、比較するステップと
を含み、
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料が、ステップ（ｅ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ｂ）～（ｄ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、
方法。
[本発明1045]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料に熱的にストレスを加えることを含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記試料に熱的にストレスを加えることが、前記試料を約30℃～約45℃で少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、または少なくとも8週間保持することを含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記試料にストレスを加えるステップが、少なくとも1回の凍結／解凍サイクルを含む、本発明1044の方法。
[本発明1048]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を保存条件に曝露することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1049]
前記保存条件が、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも8か月間、少なくとも12か月間、少なくとも18か月間、少なくとも24か月間、または少なくとも30か月間の約－80℃～－30℃の温度を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記保存条件が、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも8か月間、少なくとも12か月間、または少なくとも18か月間の約2℃～8℃の温度を含む、本発明1048の方法。
[本発明1051]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を機械的に攪拌することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1052]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を凍結乾燥および再水和することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1053]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を光、放射線、一重項酸素種、フリーラジカル、高ｐＨ条件、または低ｐＨ条件に曝露することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1054]
前記対象のタンパク質が、少なくとも1つのグリコシル化部位を含む、本発明1044～1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記対象のタンパク質が、グリコシル化タンパク質である、本発明1044～1053のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記グリコシル化タンパク質が、少なくとも1つの付着グリカンを含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記対象のタンパク質が、抗原結合ドメインを含む、本発明1044～1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記対象のタンパク質が、抗体、抗体断片、またはｓｃＦｖを含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記対象のタンパク質が、Ｆｃドメインを含む、本発明1044～1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記対象のタンパク質が、受容体融合タンパク質を含む、本発明1044～1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記受容体融合タンパク質が、受容体－Ｆｃ融合タンパク質または可溶性ＴＣＲ－Ｆｃ融合タンパク質である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記受容体融合タンパク質が、トラップタンパク質またはミニトラップタンパク質である、本発明1060または1061の方法。
[本発明1063]
前記対象のタンパク質が、組換えヒトタンパク質である、本発明1044～1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記グリコシル化部位が、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列を含む、本発明1054～1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記少なくとも1つの付着グリカンが、Ｎ結合している、本発明1056～1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記少なくとも1つの付着グリカンが、前記グリコシル化タンパク質中のアスパラギンにＮ結合している、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記エンドグリコシダーゼが、Ｎ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、本発明1044～1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記エンドグリコシダーゼが、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、およびエンドグリコシダーゼＦ4からなる群から選択される、本発明1044～1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記エンドグリコシダーゼが、ＰＮＧａｓｅ Ｆである、本発明1044～1067のいずれかの方法。
[本発明1070]
前記ＰＮＧａｓｅ Ｆが、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆである、本発明1069の方法。
[本発明1071]
前記Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆが、非還元性である、本発明1070の方法。
[本発明1072]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を脱グリコシル化するステップが、前記試料を約50℃まで10分間加熱することを含む、本発明1044～1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を脱グリコシル化するステップが、
0．2～1．5ｍｇの、標識された対象のタンパク質と、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆの体積を除く10μＬの反応体積中の、1～5μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆとを含む、それぞれの試料についての反応混合物
を含む、本発明1044～1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料のそれぞれについての前記反応混合物が、5μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆを含む、本発明1073の方法。
[本発明1075]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料のそれぞれが、0．2ｍｇの、標識された対象のタンパク質を含む、本発明1073または1074の方法。
[本発明1076]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料のそれぞれについての前記反応混合物が、緩衝液を含む、本発明1073～1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
前記少なくとも1つのグリカンが、Ｏ結合型グリカンである、本発明1044～1063のいずれかの方法。
[本発明1078]
前記エンドグリコシダーゼが、Ｏ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミンダーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）を含む、本発明1077または1078の方法。
[本発明1080]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を蛍光標識で標識するステップが、それぞれの試料を約35℃まで10～30分間加熱することを含む、本発明1044～1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を蛍光標識で標識するステップが、それぞれの試料を約35℃まで約15分間加熱することを含む、本発明1044～1079のいずれかの方法。
[本発明1082]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料が、還元性溶液を使用して変性される、本発明1044～1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
前記還元性溶液が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、本発明1082の方法。
[本発明1084]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料が、非還元性溶液を使用して変性される、本発明1044～1081のいずれかの方法。
[本発明1085]
前記非還元性溶液が、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む、本発明1084の方法。
[本発明1086]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を変性させるステップが、前記試料を40℃と99℃の間まで1分間～5時間加熱することを含む、本発明1044～1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を変性させるステップが、前記試料を50℃と99℃の間まで1～60分間加熱することを含む、本発明1044～1085のいずれかの方法。
[本発明1088]
前記未反応蛍光標識をクエンチするステップが、停止溶液を添加することを含む、本発明1044～1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料と同時に参照標準を分析するステップをさらに含む、本発明1044～1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料の前記電気泳動図を比較するステップが、ピーク数、高さ、位置、面積、またはそれらの組み合わせを比較することを含む、本発明1044～1089のいずれかの方法。
[本発明1001]
対象のタンパク質を含む試料を分析する方法であって、
前記方法が、
（ａ）前記試料を変性させるステップと、
（ｂ）前記試料を蛍光標識で標識して、標識された試料を生成する、標識するステップと、
（ｃ）前記標識された試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、
（ｄ）前記標識された試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、
（ｅ）前記標識された試料の電気泳動を実施するステップと
を含み、
前記試料が、ステップ（ｄ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ａ）～（ｃ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、
方法。
[本発明1002]
前記対象のタンパク質が、少なくとも1つのグリコシル化部位を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記対象のタンパク質が、グリコシル化タンパク質である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記グリコシル化タンパク質が、少なくとも1つの付着グリカンを含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記対象のタンパク質が、抗原結合ドメインを含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記対象のタンパク質が、抗体、抗体断片、またはｓｃＦｖを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記対象のタンパク質が、Ｆｃドメインを含む、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記対象のタンパク質が、受容体融合タンパク質を含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記受容体融合タンパク質が、受容体－Ｆｃ融合タンパク質または可溶性ＴＣＲ－Ｆｃ融合タンパク質である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記受容体融合タンパク質が、トラップタンパク質またはミニトラップタンパク質である、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
前記対象のタンパク質が、組換えヒトタンパク質である、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記グリコシル化部位が、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列を含む、本発明1002～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記少なくとも1つの付着グリカンが、Ｎ結合している、本発明1004～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記少なくとも1つの付着グリカンが、前記グリコシル化タンパク質中のアスパラギンにＮ結合している、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記エンドグリコシダーゼが、Ｎ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記エンドグリコシダーゼが、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、およびエンドグリコシダーゼＦ4からなる群から選択される、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記エンドグリコシダーゼが、ＰＮＧａｓｅ Ｆである、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記ＰＮＧａｓｅ Ｆが、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆが、非還元性である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記試料を脱グリコシル化するステップが、前記試料を約50℃まで10分間加熱することを含む、本発明1017～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記試料を脱グリコシル化するステップが、
0．2～1．5ｍｇの、標識された対象のタンパク質と、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆの体積を除く10μＬの反応体積中の、1～5μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆとを含む、反応混合物
を含む、本発明1001～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記反応混合物が、0．2ｍｇの、標識された対象のタンパク質を含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記反応混合物が、5μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆを含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記反応混合物が、緩衝液を含む、本発明1021～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記少なくとも1つのグリカンが、Ｏ結合型グリカンである、本発明1004～1011のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記エンドグリコシダーゼが、Ｏ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミンダーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）を含む、本発明1025または1026の方法。
[本発明1028]
前記試料を蛍光標識で標識するステップが、前記試料を約35℃まで10～30分間加熱することを含む、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記試料を蛍光標識で標識するステップが、前記試料を約35℃まで約15分間加熱することを含む、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記試料が、還元性溶液を使用して変性される、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記還元性溶液が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記試料が、非還元性溶液を使用して変性される、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記非還元性溶液が、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記試料を変性させるステップが、前記試料を40℃と99℃の間まで1分間～5時間加熱することを含む、本発明1001～1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記試料を変性させるステップが、前記試料を50℃と99℃の間まで1～60分間加熱することを含む、本発明1001～1033のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記未反応蛍光標識をクエンチするステップが、停止溶液を添加することを含む、本発明1001～1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記試料と同時に参照標準を分析するステップをさらに含む、本発明1001～1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記電気泳動が、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、またはマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）からなる群から選択される、本発明1001～1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記電気泳動が、ＭＣＥである、本発明1001～1037のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記ＭＣＥが、ＭＣＥ機器を使用して実行される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、20ｋＤａ未満の範囲内の遊離染料干渉の低減、および電気泳動図内のエンドグリコシダーゼピークの低減または非存在をもたらす、本発明1001～1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、前記エンドグリコシダーゼピークが、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％低減される、本発明1041の方法。
[本発明1043]
脱グリコシル化後に標識された試料を使用して生成された電気泳動図と比較した場合に、前記エンドグリコシダーゼピークが、電気泳動図に存在しない、本発明1041の方法。
[本発明1044]
対象のタンパク質の安定性を決定する方法であって、
前記方法が、
（ａ）前記対象のタンパク質を含む試料にストレスを加えるステップと、
（ｂ）ストレスを受けた前記試料、および前記対象のタンパク質を含むストレスを受けていない試料を、変性させるステップと、
（ｃ）前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を蛍光標識で標識して、標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料を生成する、標識するステップと、
（ｄ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、
（ｅ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、
（ｆ）前記標識されたストレスを受けた試料および前記標識されたストレスを受けていない試料のマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施して、前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料の電気泳動図を生成する、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施するステップと、
（ｇ）前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料からの前記電気泳動図を比較し、それによって、前記対象のタンパク質の安定性を決定する、比較するステップと
を含み、
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料が、ステップ（ｅ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ｂ）～（ｄ）で変性され、標識され、かつクエンチされる、
方法。
[本発明1045]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料に熱的にストレスを加えることを含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記試料に熱的にストレスを加えることが、前記試料を約30℃～約45℃で少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、または少なくとも8週間保持することを含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記試料にストレスを加えるステップが、少なくとも1回の凍結／解凍サイクルを含む、本発明1044の方法。
[本発明1048]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を保存条件に曝露することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1049]
前記保存条件が、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも8か月間、少なくとも12か月間、少なくとも18か月間、少なくとも24か月間、または少なくとも30か月間の約－80℃～－30℃の温度を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記保存条件が、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、少なくとも3か月間、少なくとも6か月間、少なくとも8か月間、少なくとも12か月間、または少なくとも18か月間の約2℃～8℃の温度を含む、本発明1048の方法。
[本発明1051]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を機械的に攪拌することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1052]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を凍結乾燥および再水和することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1053]
前記試料にストレスを加えるステップが、前記試料を光、放射線、一重項酸素種、フリーラジカル、高ｐＨ条件、または低ｐＨ条件に曝露することを含む、本発明1044の方法。
[本発明1054]
前記対象のタンパク質が、少なくとも1つのグリコシル化部位を含む、本発明1044～1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記対象のタンパク質が、グリコシル化タンパク質である、本発明1044～1053のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記グリコシル化タンパク質が、少なくとも1つの付着グリカンを含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記対象のタンパク質が、抗原結合ドメインを含む、本発明1044～1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記対象のタンパク質が、抗体、抗体断片、またはｓｃＦｖを含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記対象のタンパク質が、Ｆｃドメインを含む、本発明1044～1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記対象のタンパク質が、受容体融合タンパク質を含む、本発明1044～1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記受容体融合タンパク質が、受容体－Ｆｃ融合タンパク質または可溶性ＴＣＲ－Ｆｃ融合タンパク質である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記受容体融合タンパク質が、トラップタンパク質またはミニトラップタンパク質である、本発明1060または1061の方法。
[本発明1063]
前記対象のタンパク質が、組換えヒトタンパク質である、本発明1044～1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記グリコシル化部位が、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列を含む、本発明1054～1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記少なくとも1つの付着グリカンが、Ｎ結合している、本発明1056～1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記少なくとも1つの付着グリカンが、前記グリコシル化タンパク質中のアスパラギンにＮ結合している、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記エンドグリコシダーゼが、Ｎ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、本発明1044～1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記エンドグリコシダーゼが、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ1、エンドグリコシダーゼＦ2、およびエンドグリコシダーゼＦ4からなる群から選択される、本発明1044～1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記エンドグリコシダーゼが、ＰＮＧａｓｅ Ｆである、本発明1044～1067のいずれかの方法。
[本発明1070]
前記ＰＮＧａｓｅ Ｆが、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆである、本発明1069の方法。
[本発明1071]
前記Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆが、非還元性である、本発明1070の方法。
[本発明1072]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を脱グリコシル化するステップが、前記試料を約50℃まで10分間加熱することを含む、本発明1044～1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を脱グリコシル化するステップが、
0．2～1．5ｍｇの、標識された対象のタンパク質と、Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆの体積を除く10μＬの反応体積中の、1～5μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆとを含む、それぞれの試料についての反応混合物
を含む、本発明1044～1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料のそれぞれについての前記反応混合物が、5μＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆを含む、本発明1073の方法。
[本発明1075]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料のそれぞれが、0．2ｍｇの、標識された対象のタンパク質を含む、本発明1073または1074の方法。
[本発明1076]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料のそれぞれについての前記反応混合物が、緩衝液を含む、本発明1073～1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
前記少なくとも1つのグリカンが、Ｏ結合型グリカンである、本発明1044～1063のいずれかの方法。
[本発明1078]
前記エンドグリコシダーゼが、Ｏ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミンダーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）を含む、本発明1077または1078の方法。
[本発明1080]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を蛍光標識で標識するステップが、それぞれの試料を約35℃まで10～30分間加熱することを含む、本発明1044～1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を蛍光標識で標識するステップが、それぞれの試料を約35℃まで約15分間加熱することを含む、本発明1044～1079のいずれかの方法。
[本発明1082]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料が、還元性溶液を使用して変性される、本発明1044～1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
前記還元性溶液が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、本発明1082の方法。
[本発明1084]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料が、非還元性溶液を使用して変性される、本発明1044～1081のいずれかの方法。
[本発明1085]
前記非還元性溶液が、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む、本発明1084の方法。
[本発明1086]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を変性させるステップが、前記試料を40℃と99℃の間まで1分間～5時間加熱することを含む、本発明1044～1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料を変性させるステップが、前記試料を50℃と99℃の間まで1～60分間加熱することを含む、本発明1044～1085のいずれかの方法。
[本発明1088]
前記未反応蛍光標識をクエンチするステップが、停止溶液を添加することを含む、本発明1044～1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料と同時に参照標準を分析するステップをさらに含む、本発明1044～1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
前記ストレスを受けた試料および前記ストレスを受けていない試料の前記電気泳動図を比較するステップが、ピーク数、高さ、位置、面積、またはそれらの組み合わせを比較することを含む、本発明1044～1089のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】脱グリコシル化を伴わない方法Ａ、標識前の脱グリコシル化の方法Ｂ、および標識後の脱グリコシル化の方法Ｃのためのプロトコルを示す図である。ＮＲ：非還元、Ｒ：還元、ＭＣ：マイクロチップキャピラリー電気泳動。
【図2】脱グリコシル化を伴わないプロトコル（方法Ａ、赤色で示される）およびタンパク質標識前の脱グリコシル化を伴うプロトコル（方法Ｂ、青色で示される）を使用した、非還元条件下でタンパク質１を使用して生成された電気泳動図である。数値ピークラベルは、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）によって測定された通りのタンパク質の分子量を示す。Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＰＮＧａｓｅ）ピークが、示される場合、電気泳動図に出現する。
【図3】方法Ｂ（標識前の脱グリコシル化）を使用した、非還元条件下でタンパク質１を使用して生成された３つの電気泳動図を示す。タンパク質１試料は、時間なし（０、赤色、上）、２週間（青色、中央）、または４週間（黒色、下）の３７℃における分析の前に熱ストレスで処理された。低分子量１ピーク（ＬＭＷ１）のピークは、ストレスとともに増加し、ＰＮＧａｓｅピークとマージした。
【図4】脱グリコシル化を伴わないプロトコル（方法Ａ、赤色で示される）およびタンパク質標識前の脱グリコシル化を伴うプロトコル（方法Ｂ、青色で示される）を使用した、還元条件下でタンパク質１を使用して生成された電気泳動図である。数値ピークラベルは、ＭＣＥによって測定された通りのタンパク質の分子量を示す。ＰＮＧａｓｅ Ｆピークは、示されるように、方法Ｂの電気泳動図に出現する。灰色の影付きボックスは、遊離染料ピークを示す。
【図5】タンパク質１が標識後に脱グリコシル化された（方法Ｃ）、タンパク質１を用いて生成された一対の電気泳動図である。上：脱グリコシル化反応は、１μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅを用いて、５０℃において１０分間、１５分間、２０分間、および３０分間実行された。下：脱グリコシル化反応は、２μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅを用いて、５０℃において１０分間、１５分間、２０分間、および３０分間実行された。
【図6】５０℃で１０分間保持された反応における１、２、３、または４μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いた脱グリコシル化の結果を示す、方法Ｃおよびタンパク質１を使用して生成された電気泳動図である。挿入図は、増加した量のＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅを伴うグリコシル化タンパク質の低減を示す矢印を伴って、タンパク質１の不完全に脱グリコシル化されたピーク（主要ピークの右側ショルダー）を示す。遊離染料ピークが、灰色の影付きボックスによって示される。ＭＰ：主要ピーク、ＬＭＷ１：低分子量１ピーク。
【図7】方法Ｃ（標識後の脱グリコシル化）および１、２、３、または４μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ（上から下）で脱グリコシル化されたタンパク質１を使用して生成された一連の４つの電気泳動図である。低分子量（ＬＭＷ）ピーク１～５、主要ピーク（ＭＰ）、および高分子量ピーク（ＨＭＷ）が示されている。
【図8】タンパク質を３７℃で４週間（３７Ｃ ４ｗ、黒色）を保持することによって熱的にストレスを加えられたタンパク質１およびストレスを受けていないタンパク質１（ｔ＝０、赤色）を使用して方法Ｃ（標識後の脱グリコシル化）から生成された電気泳動図である。脱グリコシル化は、Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して実行された。
【図9】非還元条件下で、脱グリコシル化を伴って標識されたタンパク質２（方法Ｃ）、および脱グリコシル化を伴わずに標識されたタンパク質２（方法Ａ）を比較する、タンパク質２を使用して生成された電気泳動図である。ＰＮＧａｓｅ Ｆは、３７ＫＤａの予想サイズを有し、このピークは、存在しない。遊離染料ピークは、影付きボックスによって示される。
【図10】非還元条件下で、標識後に脱グリコシル化で処理されたタンパク質３（青色、方法Ｃ）および脱グリコシル化を伴わないタンパク質３（赤色、方法Ａ）を比較する、タンパク質３を使用して生成された電気泳動図である。数値ピークラベルは、ＭＣＥによって測定されたタンパク質およびタンパク質断片の分子量を示す。
【図11】非還元条件下で、標識後に脱グリコシル化で処理されたタンパク質３（青色、方法Ｃ）および脱グリコシル化を伴わないタンパク質３（赤色、方法Ａ）を比較する、電気泳動図である。数値ピークラベルは、ＭＣＥによって測定されたタンパク質およびタンパク質断片の分子量を示す。
【図12】脱グリコシル化を伴わないタンパク質４（方法Ａ、赤色）および標識後に脱グリコシル化されたタンパク質４（方法Ｃ、青色）を比較する、電気泳動図である。タンパク質４は、非還元（ＮＲ）条件を使用して変性された。数値ピークラベルは、ＭＣＥによって測定された分子量を示す。ＬＭＷ：低分子量、ＤＧＭＰ：脱グリコシル化主要ピーク、ＧＭＰ：グリコシル化主要ピーク。遊離染料ピークは、影付きボックスによって示される。
【図13】脱グリコシル化を伴わずに標識されたタンパク質４（方法Ａ、赤色）および標識後に脱グリコシル化されたタンパク質４（方法Ｃ、青色）を比較する、電気泳動図である。タンパク質４は、還元（Ｒ）条件を使用して変性された。ＬＣ：軽鎖、ＤＨＣ：脱グリコシル化重鎖、ＧＨＣ：グリコシル化重鎖。遊離染料ピークは、影付きボックスによって示される。
【図14】方法Ｃおよびタンパク質１を使用して非還元条件下で生成されたタンパク質安定性に対する光ストレスの効果をアッセイする、３つの電気泳動図を示す。タンパク質１は、１２０万ルクス時間（ＭＬＨ）累積曝露（青色、中央）および２．４ＭＬＨ累積曝露（黒色、下）を伴って青味を帯びた白色（ＣＷ）蛍光ランプ光下で光ストレスを加えられ、ストレスを受けていないタンパク質１（赤色、上）と比較された。脱グリコシル化は、Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して実行された。ＬＭＷ：低分子量、ＭＰ：主要ピーク、ＨＭＷ：高分子量。
【図15】方法Ｃおよびタンパク質１を使用して非還元条件下で生成されたタンパク質安定性に対する光ストレスの効果をアッセイする、３つの電気泳動図を示す。タンパク質１は、２００ワット時間／平方メートル（青色、中央）および４００ワット時間／平方メートル（黒色、下）の積分近紫外線（ＵＶＡ）エネルギー下で光ストレスを加えられ、ストレスを受けていないタンパク質１（赤色、上）と比較された。脱グリコシル化は、Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して実行された。ＬＭＷ：低分子量、ＭＰ：主要ピーク、ＨＭＷ：高分子量。
【発明を実施するための形態】
【0035】
詳細な説明
本開示は、電気泳動を介した分析のための対象のタンパク質を含む試料を調製するための新しい方法を提供する。本明細書に提供される方法では、対象のタンパク質は、変性され、その後、蛍光染料を使用したタンパク質の共有結合標識、続いて、標識反応をクエンチすることが続く。標識後、標識されたタンパク質は、エンドグリコシダーゼなどの酵素と接触させ、さらなる精製を伴わずに対象のタンパク質からグリカンを除去する。標識前にタンパク質を脱グリコシル化する、電気泳動のためのグリコシル化タンパク質を調製する以前の方法とは異なり、本明細書に記載の方法は、質量に基づいてタンパク質およびペプチド種の明確な分離を可能にする。これらの方法はまた、マイクロチップ電気泳動（ＭＣＥ）電気泳動図内で、脱グリコシル化で使用される酵素からの干渉および標識反応からの遊離染料を排除する。本方法は、高速で、高度に再現性があり、高スループットであり、グリコシル化タンパク質を分析するために成功裏に使用されている。理論に拘束されることを所望するものではないが、重度グリコシル化が、ＭＣＥまたはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析プラットフォームにおけるタンパク質の遊走に干渉し、タンパク質分子量の不正確な測定および不精密な電気泳動図ピークをもたらすため、本明細書に記載の方法が重度にグリコシル化されたタンパク質に関して有利であると考えられる。本明細書に記載の方法は、ＣＥおよびＭＣＥなどの方法によって分析される任意のグリコシル化タンパク質に適用可能であるプラットフォームアプローチにおいて、およびタンパク質を特性評価するために、または品質管理目的のために、使用され得る。例えば、本明細書に記載の方法は、様々な温度における長期の保持時間または異なる配合物などの様々な条件を受けたときに対象のタンパク質の安定性を測定するために使用され得る。
本開示は、電気泳動を介した分析のための対象のタンパク質を含む試料を調製するための新しい方法を提供する。本明細書に提供される方法では、対象のタンパク質は、変性され、その後、蛍光染料を使用したタンパク質の共有結合標識、続いて、標識反応をクエンチすることが続く。標識後、標識されたタンパク質は、エンドグリコシダーゼなどの酵素と接触させ、さらなる精製を伴わずに対象のタンパク質からグリカンを除去する。標識前にタンパク質を脱グリコシル化する、電気泳動のためのグリコシル化タンパク質を調製する以前の方法とは異なり、本明細書に記載の方法は、質量に基づいてタンパク質およびペプチド種の明確な分離を可能にする。これらの方法はまた、マイクロチップ電気泳動（ＭＣＥ）電気泳動図内で、脱グリコシル化で使用される酵素からの干渉および標識反応からの遊離染料を排除する。本方法は、高速で、高度に再現性があり、高スループットであり、グリコシル化タンパク質を分析するために成功裏に使用されている。理論に拘束されることを所望するものではないが、重度グリコシル化が、ＭＣＥまたはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析プラットフォームにおけるタンパク質の遊走に干渉し、タンパク質分子量の不正確な測定および不精密な電気泳動図ピークをもたらすため、本明細書に記載の方法が重度にグリコシル化されたタンパク質に関して有利であると考えられる。本明細書に記載の方法は、ＣＥおよびＭＣＥなどの方法によって分析される任意のグリコシル化タンパク質に適用可能であるプラットフォームアプローチにおいて、およびタンパク質を特性評価するために、または品質管理目的のために、使用され得る。例えば、本明細書に記載の方法は、様々な温度における長期の保持時間または異なる配合物などの様々な条件を受けたときに対象のタンパク質の安定性を測定するために使用され得る。
【0036】
したがって、本開示は、（ａ）試料を変性させるステップと、（ｂ）試料を蛍光標識で標識して、標識された試料を生成する、標識するステップと、（ｃ）標識された試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、（ｄ）標識された試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、（ｅ）標識された試料の電気泳動を実施するステップとを含み、試料が、ステップ（ｄ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ｂ）および（ｃ）で標識およびクエンチされる、電気泳動を使用した分析のための対象のタンパク質を含む試料を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動は、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）であり、出力は、電気泳動図である。
【0037】
定義
本明細書において別段の示唆がない限り、または文脈から明確に相反しない限り、本明細書で請求される発明を記載する文脈（特に特許請求の範囲の文脈）における「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」という用語、および類似の指示対象の使用は、単数および複数の両方を網羅すると解釈されるものである。
本明細書において別段の示唆がない限り、または文脈から明確に相反しない限り、本明細書で請求される発明を記載する文脈（特に特許請求の範囲の文脈）における「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」という用語、および類似の指示対象の使用は、単数および複数の両方を網羅すると解釈されるものである。
【0038】
本明細書において別段の示唆がない限り、本明細書において値の範囲の列挙は単に、当該範囲内にある各別個の値を個々に言及するための簡潔表現法としての機能を果たすことが意図されており、各別個の値は、それが個々に本明細書において列挙されているように本明細書内に組み込まれる。
【0039】
「約」という用語の使用は、記述される値のおよそ±１０％の範囲内で上回るか、または下回るかのいずれかの値を記述することが意図されている。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±５％の範囲内で上回るか、または下回るかのいずれかの値の範囲であり得る。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±２％の範囲内で上回るか、または下回るかのいずれかの値の範囲であり得る。他の実施形態では、値は、記述される値のおよそ±１％の範囲内で上回るか、または下回るかのいずれかの値の範囲であり得る。先行する範囲は、文脈で明白となることが意図されており、さらなる限定は示唆されない。
【0040】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」とは、ペプチド結合によって相互に継合された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質には、ポリペプチドおよびペプチドが含まれ、また、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰ－リボシル化などの修飾も含まれ得る。タンパク質は、タンパク質系薬剤を含む科学的または商業的な対象のものであり得、タンパク質は、とりわけ、酵素、リガンド、受容体、抗体、およびキメラまたは融合タンパク質を含む。タンパク質は、周知の細胞培養法を使用して様々なタイプの組換え細胞によって産生され、一般的に遺伝子操作技術（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロンレス配列など）によって細胞に導入され、そこでエピソームとして存在するか、または細胞ゲノムに統合され得る。
【0041】
本明細書において別段の示唆がない限り、または文脈から明確に相反しない限り、本明細書に記載のすべての方法は、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的文言（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより詳細に解説することが意図されており、別段の請求がない限り、本発明の範囲に限定を加えるものではない。本明細書において、請求されていない要素を、本発明の実施に必須の要素であると示唆すると解釈されるべき文言はない。
【0042】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれた場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0043】
変性
本開示は、試料中の対象のタンパク質を変性させる方法を提供する。タンパク質を変性させることは、ペプチド結合を破壊するには不十分な条件下での、二次および三次タンパク質構造の破壊を伴い、一次構造はインタクトのまま残す。
本開示は、試料中の対象のタンパク質を変性させる方法を提供する。タンパク質を変性させることは、ペプチド結合を破壊するには不十分な条件下での、二次および三次タンパク質構造の破壊を伴い、一次構造はインタクトのまま残す。
【0044】
還元条件および非還元条件の両方の下で対象のタンパク質を変性させる方法は、本開示の範囲内である。
【0045】
タンパク質還元剤は、ジスルフィド結合を破壊する薬剤である。これらのジスルフィド結合は、単一のポリペプチド内、または別個のポリペプチド上でコードされるタンパク質の複数のサブユニット間にあり得る。サブユニット間のジスルフィド結合を破壊することは、個別に分析されるマルチサブユニットタンパク質の個々のサブユニットの分析を可能にする。還元剤は、当業者に公知であろう。例示的な還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、ＣＡＳ ３４８３－１２－３）、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ、２ＢＭＥ、２－ＭＥ、ｂ－ｍｅｒ、ＣＡＳ ６０－２４－２）、２－アミノエタンチオール（シスタミン－ＨＣｌとも呼ばれる２－ＭＥＡ－ＨＣｌ、ＣＡＳ １５６－５７－０）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、（ＴＣＥＰ、ＣＡＳ ５９６１－８５－３）、システイン塩酸塩（Ｃｙｓ－ＨＣｌ、ＣＡＳ ５２－８９－１）、または２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ）を含むが、これらに限定されない。チオール系還元剤がペプチドおよびタンパク質ジスルフィド結合の固相還元を可能にするように固定化されている樹脂を含有する、固定化還元剤カラムなどのタンパク質結合を還元するための他の方法が、当該技術分野で公知である。ポリペプチド間の化学相互作用を還元するための好適である酸化剤を含む還元剤も想定される。
【0046】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、還元性溶液を使用して変性される。いくつかの実施形態では、還元性溶液は、１３５～１５５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する。いくつかの実施形態では、還元性溶液は、リン酸ナトリウムおよびドデシル硫酸リチウムをさらに含む。いくつかの実施形態では、還元性溶液は、０．６９％のドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、６９ｍＭのリン酸ナトリウム、および１４２ｍＭのジチオスレイトールを含むか、または本質的にそれらからなる。いくつかの実施形態では、還元性溶液は、４０～１２０ｍＭのＤＴＴ、４０～８０ｍＭのリン酸ナトリウム、および０．５％～２．０％のＬＤＳを含有する。いくつかの実施形態では、還元性溶液は、６０～１００ｍＭのＤＴＴ、５０～７０ｍＭのリン酸ナトリウム、および０．７５％～１．５％のＬＤＳを含有する。いくつかの実施形態では、還元性溶液は、約８０ｍＭのＤＴＴ、約６０ｍＭのリン酸ナトリウム、および約１．２％のＬＤＳを含有する。いくつかの実施形態では、還元性溶液は、体積で約１：４の比率において対象のタンパク質を含む試料に添加される。
【0047】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、非還元性溶液を使用して、すなわち、対象のタンパク質中のジスルフィド結合を保存する条件下で変性される。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、１００～２００ｍＭのヨードアセトアミドを含む。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、リン酸ナトリウムおよびドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、１６６ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を含む。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、１６６ｍＭのヨードアセトアミド、０．８１％のドデシル硫酸リチウム、および８１ｍＭのリン酸ナトリウムを含むか、または本質的にそれらからなる。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、１００～３００ｍＭのヨードアセトアミド、４０～８０ｍＭのリン酸ナトリウム、および０．５％～２．０％のＬＤＳを含む。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、１５０～２５０ｍＭのヨードアセトアミド、５０～７０ｍＭのリン酸ナトリウム、および０．７５％～１．５％のＬＤＳを含む。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、約２００ｍＭのヨードアセトアミド、約６０ｍＭのリン酸ナトリウム、および約１．２％のＬＤＳを含む。いくつかの実施形態では、非還元性溶液は、体積で約１：４の比率において対象のタンパク質を含む試料に添加される。
【0048】
いくつかの実施形態では、試料を変性させることは、還元性または非還元性溶液を試料に添加することと、組み合わせられた試料および還元性または非還元性溶液を加熱することとを含む。いくつかの実施形態では、試料は、熱によって変性される。例えば、組み合わせられた試料および還元性または非還元性溶液は、３０℃と９９℃の間、３０℃と９０℃の間、３０℃と８０℃の間、３０℃と７０℃の間、３０℃と６０℃の間、３０℃と５０℃の間、３０℃と４０℃の間、４０℃と９９℃の間、４０℃と９０℃の間、４０℃と８０℃の間、４０℃と７０℃の間、４０℃と６０℃の間、４０℃と５０℃の間、５０℃と９９℃の間、５０℃と９０℃の間、５０℃と８０℃の間、５０℃と７０℃の間、または５０℃と６０℃の間まで加熱され得る。いくつかの実施形態では、組み合わせられた試料および還元性または非還元性溶液は、１分間～１２時間、１分間～１０時間、１分間～５時間、１分間～４時間、１分間～３時間、１分間～２時間、１分間～６０分間、１分間～３０分間、１分間～１５分、１分間～１０分間、１分間～５分間、５分間～６０分間、５分間～３０分間、５分間～１５分間、５分間～１０分間、１０分間～６０分間、１０分間～４５分間、１０分間～３０分間、または１０分間～１５分間加熱され得る。いくつかの実施形態では、組み合わせられた試料および還元性または非還元性溶液は、４０℃と９９℃の間まで１分間～６０分間加熱され得る。いくつかの実施形態では、組み合わせられた試料および還元性または非還元性溶液は、５０℃と９９℃の間まで１分間～６０分間加熱され得る。さらなる例として、組み合わせられた試料および還元性または非還元性溶液は、６０℃と８５℃の間まで５分間～３０分間加熱され得る。代替的に、組み合わせられた試料および還元性または非還元性溶液は、７５℃まで１０分間加熱され得る。いくつかの実施形態では、組み合わせられた試料および還元性または非還元性溶液は、７０℃まで１０分間加熱され得る。
【0049】
脱グリコシル化
本開示は、試料中の対象のタンパク質を脱グリコシル化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、本明細書に記載の方法を使用して蛍光標識で標識された後に脱グリコシル化される。脱グリコシル化は、エンドグリコシダーゼなどの酵素を使用して実施され得る。
本開示は、試料中の対象のタンパク質を脱グリコシル化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、本明細書に記載の方法を使用して蛍光標識で標識された後に脱グリコシル化される。脱グリコシル化は、エンドグリコシダーゼなどの酵素を使用して実施され得る。
【0050】
糖タンパク質は、アミノ酸側鎖に共有結合したオリゴ糖鎖（グリカン）を含有するタンパク質である。これらのオリゴ糖鎖は、共翻訳または翻訳後修飾においてタンパク質に付着している。
【0051】
本明細書で使用される場合、「多糖類」および「オリゴ糖」と同義的に使用され得る「グリカン」という用語は、グリコシド結合単糖類を含むか、またはそれからなる化合物を指す。グリカンという用語はまた、炭水化物が単糖類である場合でさえも、糖タンパク質または糖脂質に結合された炭水化物を指すために使用され得る。ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅグリカンは、単糖類のＯ－グリコシド結合を含み得る。グリカンは、単糖類のホモまたはヘテロポリマーであり得、直鎖または分枝鎖であり得る。例示的なグリカンは、とりわけ、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、ガラクトース、シアル酸、およびフコースの単量体を含み得る。
【0052】
グリカンは、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかを介して対象のタンパク質に結合され得、対象のタンパク質は、Ｎ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、またはＮ結合型およびＯ結合型グリカンの組み合わせを含むことができる。本明細書で参照される場合、「Ｎ結合型グリカン」または「Ｎ結合型グリコシル化」は、タンパク質のアスパラギン（Ａｓｎ）アミノ酸のアミド窒素などの窒素原子への糖単量体または多糖類の付着を指す。本明細書で使用される場合、「Ｏ結合型グリカン」または「Ｏ結合型グリコシル化」は、タンパク質のセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸の酸素原子への糖単量体または多糖類の付着を指す。例示的Ｏ結合型グリカンには、Ｏ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｏ－ＧａｌＮＡｃ）、Ｏ－Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ）、Ｏ－マンノース、Ｏ－ガラクトース、Ｏ－フコース、およびＯ－グルコースが含まれるが、これらに限定されない。
【0053】
エンドグリコシダーゼは、オリゴ糖中の内部グリコシド結合を加水分解する酵素である。オリゴ糖が糖タンパク質の一部である場合、それによって、オリゴ糖は、糖タンパク質から放出される。
【0054】
本明細書で使用される場合、「エンドグリコシダーゼ」は、糖タンパク質または糖脂質からグリカンを放出する酵素を指す。エンドグリコシダーゼは、末端残基ではない残基間の多糖類変化を切断し得、したがって、その同族タンパク質コンジュゲートから長鎖炭水化物を放出することが可能である。例示的なエンドグリコシダーゼとしては、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３、Ｏ－グリコシダーゼ、およびエンド－β－ガラクトシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【0055】
いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、Ｎ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する。Ｎ結合型グリカンを標的とする例示的なエンドグリコシダーゼとしては、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（Ｅｎｄｏ Ｓ）、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、およびエンドグリコシダーゼＦ４が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態、例えば、対象のタンパク質がＮ結合型グリカンを含む、実施形態では、エンドグリコシダーゼは、ＰＮＧａｓｅ Ｆである。
【0056】
いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、Ｏ結合型グリカンの脱グリコシル化を触媒する。Ｏ結合型グリカンを標的とする例示的なエンドグリコシダーゼの例としては、エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）が含まれるが、これに限定されない。
【0057】
いくつかの実施形態では、エンドグリコシダーゼは、ＰＮＧＡｓｅ Ｆである。ＰＮＧａｓｅ Ｆは、Ｎ結合型糖タンパク質中の高マンノースのハイブリッド複合オリゴ糖の最も内側のＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とアスパラギン残基との間で切断するアミダーゼである。いくつかの実施形態では、ＰＮＧａｓｅ Ｆは、組換えである。いくつかの実施形態では、ＰＮＧａｓｅ Ｆは、Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆである。Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆは、当該技術分野で公知であり、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓおよび他のベンダーから入手可能である。いくつかの実施形態では、Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆは、対象のタンパク質中のジスルフィド結合を保存する非還元形式である。いくつかの実施形態では、Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆは、対象のタンパク質中のジスルフィド結合を保存しない還元形式である。
【0058】
いくつかの実施形態では、試料を脱グリコシル化することは、０．１～３．０ｍｇの標識された対象のタンパク質を含む、反応混合物を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、０．１～２．０ｍｇの標識された対象のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、０．１～１．５ｍｇの対象のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、０．５～１．５ｍｇの対象のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、０．２ｍｇの標識された対象のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、酵素の体積を除く１０μＬの反応体積中の、１～７μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、酵素の体積を除く１０μＬの反応体積中の、１～５μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、標識された対象のタンパク質を含む、１０μＬの体積に添加された１μＬ、２μＬ、３μＬ、４μＬ、５μＬ、６μＬ、または７μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、酵素の体積を除く１０μＬの反応体積中の、５μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、標識された対象のタンパク質を含む１０μＬの体積に添加された５μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、追加の緩衝液、例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素の作用を促進する反応緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、追加の緩衝液を含まない。
【0059】
いくつかの実施形態、例えば、エンドグリコシダーゼがＰＮＧａｓｅ Ｆである実施形態では、試料を脱グリコシル化することは、試料を２５℃～６５℃まで１００～６０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、試料を脱グリコシル化することは、試料を３０℃～５０℃まで２０～４０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、試料を脱グリコシル化することは、試料を３５℃まで３０分間加熱することを含む。
【0060】
いくつかの実施形態、例えば、エンドグリコシダーゼがＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆである実施形態では、試料を脱グリコシル化することは、試料を５０℃まで１０～３０分間加熱することを含む。いくつかの実施形態では、試料を脱グリコシル化することは、試料を５０℃まで１０分間加熱することを含む。
【0061】
タンパク質標識
本開示は、対象のタンパク質を標識する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、脱グリコシル化の前に標識される。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、蛍光染料などの蛍光標識で標識される。任意の好適な標識が、本開示の範囲内であると想定される。
本開示は、対象のタンパク質を標識する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、脱グリコシル化の前に標識される。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、蛍光染料などの蛍光標識で標識される。任意の好適な標識が、本開示の範囲内であると想定される。
【0062】
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」または「標識」とは、対象のタンパク質などの標的物質の識別および／または定量を促進するために使用される化学物質を指す。例示的標識には、直接的に観察もしくは測定されるか、または間接的に観察もしくは測定され得る標識が含まれる。そのような標識には、放射線計数装置で測定され得る放射性標識、分光光度計で視覚的に観察もしくは測定され得る色素、染料、または他の色素原、光電子増倍管ベースの機器もしくは写真フィルムによって測定され得る化学発光標識、スピン標識分析器で測定され得るスピン標識、および出力シグナルが好適な分子付加体の励起によって生成され、染料によって吸収されるか、または標準的な蛍光光度計もしくは撮像システムで測定され得る光を用いた励起によって可視化され得る、蛍光部分を含むが、これらに限定されない。標識は、リン光体もしくは蛍光体などの発光物質、生体発光物質、出力シグナルがシグナル化合物の化学修飾によって生成される化学発光物質、金属含有物質、または酵素であり得、無色の基質からの着色生成物の形成または好適な前駆体からの自発的化学発光生成物の形成などの酵素依存性の二次世代のシグナルが生じる。標識という用語はまた、標識分子が、後に添加されると、検出可能なシグナルを生成するために使用されるように、標識分子に選択的に結合し得る「タグ」またはハプテンも指し得る。
【0063】
多数の標識が、当業者に知られており、微粒子、蛍光染料、ハプテン、酵素ならびにそれらの発色性、蛍光性および化学発光物質、ならびにその内容が参照により組み込まれる、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ Ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ６ｔｈ Ｅｄ．（１９９６）、ならびにそれぞれ１９９９年１１月および２００１年５月にＣＤ Ｒｏｍで発行されたその後続の第７版および第８版更新に説明されている他の標識を含むが、これらに限定されない。
【0064】
例示的な蛍光標識としては、蛍光染料が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「蛍光染料」とは、光を吸収し、より長い波長において発光する、非タンパク質分子を指す。例示的な蛍光染料としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルロダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＤｙＬｉｇｈｔ蛍光、Ｃｙ染料、ＩＲＤｙｅ、ＨｉＬｙｔｅ染料、スルホン化および／またはペグ化クマリン染料、スルホン化および／またはペグ化キサンテン染料、スルホン化またはペグ化シアニン染料、ならびにスルホン化および／またはペグ化ピレン染料が含まれるが、これらに限定されない。
【0065】
追加の検出可能な標識には、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステルが含まれるが、これに限定されない。使用され得る他の検出可能な標識としては、他の染料、フルオロフォア、発色団、質量タグ、量子ドット、および同等物、ならびに参照によりその全体で本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２４，３７２号に開示されるものが含まれる。
【0066】
例示的な蛍光標識には、緑色蛍光タンパク質などの生物学的フルオロフォア、および量子ドットなどのナノスケール結晶も含まれるが、これらに限定されない。
【0067】
さらなる例示的な蛍光標識は、Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｃｏ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔとも称される、部品番号７６０４９８）の一部として、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能である。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｉｃｏ標識染料を含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質を標識することは、体積で約１：１の比率において、４～２０μＭのＰｉｃｏ染料溶液を、対象のタンパク質を含む試料に添加することを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質を標識することは、４μＭ、５μＭ、６μＭ、１０μＭ、１２μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１８μＭ、２０μＭ、または２５μＭのＰｉｃｏ染料溶液を、対象のタンパク質を含む試料に添加することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐｉｃｏ染料溶液は、体積で約１：５の染料対試料、体積で１：４の染料対試料、体積で１：３の染料対試料、体積で１：２の染料対試料、体積で１：１、体積で２：１の染料対試料、体積で３：１の染料対試料、体積で４：１の染料対試料、または体積で５：１の染料対試料の比率において、対象のタンパク質を含む試料に添加される。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質を標識することは、体積で約１：１の比率において、１６μＭのＰｉｃｏ染料溶液を、対象のタンパク質を含む試料に添加することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、試料および染料を加熱することを含む。
【0068】
いくつかの実施形態では、蛍光標識または染料は、対象のタンパク質に共有結合している。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、アミン反応性基を含み、対象のタンパク質中の遊離アミンに共有結合している。いくつかの実施形態では、標識は、高親和性相互作用を通して対象のタンパク質に非共有結合している。
【0069】
タンパク質標識のための追加の好適なキットが、当業者に公知であろう。例示的なキットとしては、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓからの抗体／タンパク質標識キット－ＦＩＴＣ、および（高速）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）コンジュゲーションキットが含まれるが、これらに限定されない。
【0070】
任意の共有結合した蛍光標識、および蛍光標識を付着させる任意の方法は、本方法の範囲内であると想定される。
【0071】
いくつかの実施形態では、試料および染料は、約３０℃と４０℃の間まで約５～４０分間加熱される。いくつかの実施形態では、試料および染料は、約３０℃と４０℃の間まで約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、または約４０分間加熱される。いくつかの実施形態では、試料および染料は、約３５℃まで約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、または約４０分間加熱される。いくつかの実施形態では、試料および染料は、約３５℃まで約１５分間加熱される。この加熱ステップは、変性した標識された対象のタンパク質を含む試料を生成することができる。過剰な標識は、例えば、スピンフィルターを使用することによって、任意に試料から除去され得る。
【0072】
いくつかの実施形態では、標識反応は、脱グリコシル化反応の前に停止される（クエンチする）。例えば、蛍光標識がＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｉｃｏ標識染料である実施形態では、標識反応は、等量のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｉｃｏ停止緩衝液を標識反応に添加することによって停止され得る。いくつかの実施形態では、標識反応は、５μＬ、６μＬ、７μＬ、８μＬ、９μＬ、１０μＬ、１１μＬ、１２μＬ、１３μＬ、１４μＬ、１５μＬ、１６μＬ、１７μＬ、１８μＬ、１９μＬ、または２０μＬの適切な停止溶液を標識反応に添加することによって、クエンチされる。いくつかの実施形態では、染料は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｉｃｏ標識染料であり、標識反応は、５μＬのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｐｉｃｏ停止溶液を標識反応に添加することによってクエンチされる。さらなる例示的な停止緩衝液は、例えば、標識がアミン反応性蛍光染料を含む場合、１．５Ｍのヒドロキシルアミン（ｐＨ８．５）を含む。当業者は、様々な染料標識反応のための適切な停止緩衝液を選択することが可能であろう。理論に拘束されることを所望するものではないが、標識反応をクエンチすることは、後続の脱グリコシル化ステップに使用されるエンドグリコシダーゼ酵素の標識を防止すると考えられる。これは、標識された試料を可視化するために使用される電気泳動図内の標識されたエンドグリコシダーゼピークを防止または低減する。
【0073】
対象のタンパク質
本開示は、電気泳動を使用した分析のための対象のタンパク質を含む試料を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、方法は、対象のタンパク質を標識することを含み、その後に、脱グリコシル化が続く。
本開示は、電気泳動を使用した分析のための対象のタンパク質を含む試料を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、方法は、対象のタンパク質を標識することを含み、その後に、脱グリコシル化が続く。
【0074】
Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化などの翻訳後修飾を含むすべての対象のタンパク質は、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、原薬、製剤化された原薬、または医薬品であり得る、治療用抗体などの治療用タンパク質である。
【0075】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、抗体、抗体断片、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、抗体、抗体断片、またはｓｃＦｖである。
【0076】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、組換えヒトタンパク質を含む。例えば、対象のタンパク質は、ヒト抗体もしくは抗体断片、またはヒト化抗体もしくは抗体断片を含むことができる。
【0077】
本明細書で使用される場合、「抗体」とは、４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）および重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方の言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するためにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの組換え手段によって調製、発現、作成、または単離される抗体分子を含む。抗体という用語はまたは、１つを超えるエピトープに結合し得るヘテロ四量体免疫グロブリンを含む、二重特異性抗体も含む。二重特異性抗体は、概して、参照により本出願に組み込まれる、米国特許第８，５８６，７１３号に記載されている。
【0078】
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。「抗体結合部分」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）ＶＬおよびＶＨ領域がペアリングして一価分子を形成する、単一タンパク質鎖を形成するように合成リンカーによって継合された、Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわち、ＶＬおよびＶＨからなる、ｓｃＦｖが挙げられる。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も、「抗体」という用語の下に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８、Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１ １２１－１ １２３を参照）。
【0079】
なおもさらに、抗体またはその抗原結合部分は、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの抗体または抗体部分の共有結合性または非共有結合性会合によって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であり得る。そのような免疫付着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３－１０１）、ならびに二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７－１０５８）が含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、抗体全体のパパインまたはペプシン消化を介したものなどの従来の技法を使用して、抗体全体から調製され得る。さらに、抗体、抗体部分、および免疫接着分子は、当該技術分野で一般的に知られている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して取得され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照）。
【0080】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的な変異誘導によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。
【0081】
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されているか、または別様にヒトにおいて自然に産生される抗体バリアントとのその類似性を増加させるように修飾されている、抗体を含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２０３５７９Ａ１に記載されているような抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド－１（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１に記載されているような抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン－２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載されているような抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載されているような抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載されているような抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載されているような抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体Ｃ５抗体（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０３１３１９４Ａ１に記載されているような抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗表皮成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載されているような抗ＥＧＦＲ抗体、または米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２５９４２３Ａ１に記載されているような抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン－９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許第９，５４０，４４９号に記載されているような抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗成長および分化因子－８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号または第９，２６０，５１５号に記載されているような抗ＧＤＦ８抗体）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３３７０４５Ａ１号または第ＵＳ２０１６／００７５７７８Ａ１号に記載されているような抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２７１６８１Ａ１号または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは第８，９４５，５５９号に記載されているような抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、第８，０４３，６１７号または第９，１７３，８８０号に記載されているような抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許第９，４５３，０７２号または第９，６３７，５３５号に記載されているような抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第９，４４７，１７３号に記載されているような抗－ＲＳＶ抗体）、抗分化クラスター３（例えば、米国特許第９，４４７，１７３号および第９，４４７，１７３号、ならびに米国特許出願第６２／２２２，６０５号に記載されているような抗ＣＤ３抗体）、抗分化クラスター２０（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号および第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載されているような抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化クラスター４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載されているような抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載されているような）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３３７０２９Ａ１号に記載されているような抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０２１５０４０号に記載されているような）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／００１７０２９号ならびに米国特許第８，３０９，０８８号および第９，３５３，１７６号に記載されているような抗ＮＧＦ抗体）、および抗タンパク質Ｙ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１号および第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号に記載されているような）、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃｉｎ １６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、および抗ＣＤ３×抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。
【0083】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アダリムマブ－ａｔｔｏ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ－ａｔｔｏ）、ａｄｏ－トラスツズマブ（ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アリロクマブ（ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ブロダルマブ（ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カプロマブペンデチド（ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セルトリズマブペゴル（ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ジヌツキシマブ（ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、デュピリマブ（ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、エクリズマブ（ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エロツズマブ（ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エミシズマブ－ｋｘｗｈ（ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ－ｋｘｗｈ）、エムタンシンアリロクマブ（ｅｍｔａｎｓｉｎｅａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エビナクマブ（ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、ファシヌマブ（ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、グセルクマブ（ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、イブリツモマブチウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イダルシズマブ（ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、インフリキシマブ－ａｂｄａ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ－ａｂｄａ）、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ－ｄｙｙｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イキセキズマブ（ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、メポリズマブ（ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネスバクマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、オビルトキサキシマブ（ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ラキシバクマブ（ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レスリズマブ（ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リヌクマブ（ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、サリルマブ（ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、セクキヌマブ（ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、トレボグルマブ（ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、およびベドリズマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）からなる群から選択される。
【0084】
対象のタンパク質は、当該技術分野で公知である任意の手段によって作成または単離され得る。これらは、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたタンパク質（例えば、抗体）などの組換え手段を含む。対象のタンパク質である抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照）か、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作成、もしくは単離される、組換え型組み合わせヒト抗体ライブラリーから単離され得る。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する。ある特定の実施形態では、組換えヒト抗体は、インビトロで変異誘発（またはヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物が使用される場合は、インビボで体細胞の変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関連する一方で、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー内には自然に存在し得ない、配列である。
【0085】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメインを含む。例えば、対象のタンパク質は、受容体－Ｆｃ融合タンパク質または可溶性ＴＣＲ－Ｆｃ融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、受容体－Ｆｃ融合タンパク質は、トラップタンパク質である。
【0086】
融合タンパク質は、本質的に別様にともに見出されないタンパク質の２つ以上の部分を含む。例えば、「Ｆｃ融合タンパク質」は、受容体リガンド結合ドメインなどの別の異種ドメインに融合される、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を含むことができる。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合された異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ８８： １０５３５，１９９１、Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０、およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１ － １０．１９．１１，１９９２に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、いくつかの実施形態では、ヒンジ領域を含み、その後に免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインが続く、Ｆｃ部分に結合された受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のリガンドに結合する２つ以上の明確に異なる受容体鎖を含有する。例えば、Ｆｃ－融合タンパク質は、インターロイキン１（ＩＬ－１）トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩＬ－１ Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ－１ ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有するリロナセプト、米国特許第６，９２７，００４号参照）、または血管内皮細胞成長因子Ａ（ＶＥＧＦ）トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有する、アフリベルセプト、米国特許第７，０８７，４１１号および第７，２７９，１５９号参照）である。
【0087】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、受容体融合タンパク質などの融合タンパク質である。受容体融合タンパク質には、特に、トラップタンパク質およびミニトラップタンパク質が含まれ得る。
【0088】
「融合タンパク質」という用語は、任意に、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を通して生成される、その個々のペプチド骨格を介した共有結合によって結合された２つ以上のタンパク質またはその断片を含む、分子を指す。
【0089】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、トラップタンパク質またはミニトラップタンパク質である。いくつかの実施形態では、トラップタンパク質は、標的タンパク質に結合し、その活性に拮抗するか、またはそれを調節するためにデコイ受容体として作用することが可能である、操作された治療用タンパク質である。例示的なトラップタンパク質は、任意に、リンカー、二量体形成または多量体形成ドメイン、および切断部位などの追加のドメインを含む、ヒトＩｇＧ定常領域に融合されたその標的タンパク質（例えば、Ｆｌｔ－１のＶＥＧＦ受容体Ｉｇドメイン２およびＩｇドメイン３）に対する受容体の結合ドメインを模倣する、１つ以上の受容体成分を含む。いくつかの実施形態では、トラップタンパク質は、例えば、ミニトラップの組織浸透を補助し得るタンパク質切断を通して、切断されるか、または縮小サイズである（ミニトラップ）。トラップタンパク質の非限定的な例としては、ＩＬ－１トラップ（例えば、ひいてはｈｌｇＧｌのＦｃに融合される、ＩＬ－１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ－ｌＲＡｃＰリガンド結合領域を含有するリロナセプト）（例えば、配列番号１）（米国特許第６，９２７，００４号参照）、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、ひいてはｈｌｇＧｌのＦｃに融合される、ＶＥＧＦ受容体ＦｌｋｌのＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体ＦｌｔｌのＩｇドメイン２を含有するアフリベルセプトが挙げられる。例えば、それぞれの内容が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０８７，４１１号、第７，２７９，１５９号参照、また、エタネルセプト（ＴＮＦトラップ）については米国特許第５，６１０，２７９号も参照されたい。
【0090】
タンパク質産生
本明細書に記載の方法によってアッセイされる対象のタンパク質は、当該技術分野で公知である任意の方法によって産生され得る。例えば、対象のタンパク質は、細胞培養によって産生され得る。細胞培養は、細胞および培養培地が最初に培養管に供給され、培養の終了前に定期的な細胞および／または生成物の回収の有りまたは無しで、追加の培養栄養素が、個別の増分で培養中にゆっくりと培養物に供給される、「流加細胞培養」または「流加培養」であり得る。流加培養は、定期的に全培養物（細胞および培地を含み得る）が除去され、新たな培地で置き換えられる、「半連続的流加培養」が含まれる。流加培養が、単純な「バッチ培養」とは区別される一方で、細胞培養のためのすべての構成要素（動物細胞およびすべての培養栄養素を含む）は、バッチ培養における培養プロセスの開始時に培養管に供給される。流加培養は、標準的な流加培養プロセス中に培養管から上清が除去される限りにおいては、「かん流培養」とは異なり得る一方で、かん流培養では、細胞は、例えば、ろ過により培養物中に残され、培養培地は、連続的または断続的に導入され、培養管から除去される。しかしながら、流加細胞培養物中の検証目的のための試料の除去が企図される。流加培養プロセスは、最大作動量および／または最大タンパク質産生に達したと決定されるまで継続され、その後、タンパク質が回収される。
本明細書に記載の方法によってアッセイされる対象のタンパク質は、当該技術分野で公知である任意の方法によって産生され得る。例えば、対象のタンパク質は、細胞培養によって産生され得る。細胞培養は、細胞および培養培地が最初に培養管に供給され、培養の終了前に定期的な細胞および／または生成物の回収の有りまたは無しで、追加の培養栄養素が、個別の増分で培養中にゆっくりと培養物に供給される、「流加細胞培養」または「流加培養」であり得る。流加培養は、定期的に全培養物（細胞および培地を含み得る）が除去され、新たな培地で置き換えられる、「半連続的流加培養」が含まれる。流加培養が、単純な「バッチ培養」とは区別される一方で、細胞培養のためのすべての構成要素（動物細胞およびすべての培養栄養素を含む）は、バッチ培養における培養プロセスの開始時に培養管に供給される。流加培養は、標準的な流加培養プロセス中に培養管から上清が除去される限りにおいては、「かん流培養」とは異なり得る一方で、かん流培養では、細胞は、例えば、ろ過により培養物中に残され、培養培地は、連続的または断続的に導入され、培養管から除去される。しかしながら、流加細胞培養物中の検証目的のための試料の除去が企図される。流加培養プロセスは、最大作動量および／または最大タンパク質産生に達したと決定されるまで継続され、その後、タンパク質が回収される。
【0091】
細胞培養は、通常は特定の増殖期で細胞を継続的に増殖させるために使用される技法である、「連続的細胞培養」であり得る。例えば、細胞の定常供給が必要とされる場合、または特定の対象のタンパク質の産生が必要とされる場合、細胞培養は、特定の増殖期に維持を必要とし得る。したがって、条件は、細胞をその特定の相に維持するために継続的に監視され、状況に応じて調整されなければならない。
【0092】
細胞は、細胞培養培地中で培養される。「細胞培養培地」および「培養培地」という用語は、典型的には、炭水化物エネルギー源、必須アミノ酸（例えばフェニルアラニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、リシン、およびヒスチジン）ならびに非必須アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリンおよびチロシン）、微量元素、エネルギー源、脂質、ビタミンなどの細胞の増殖を強化するために必要な栄養素を供給する、哺乳動物細胞を増殖させるために使用される栄養溶液を指す。細胞培養培地は、細胞増殖を支援する原材料を供給する抽出物、例えば、血清またはペプトン（加水分解物）を含有し得る。培地は、動物由来抽出物の代わりに酵母由来抽出物または大豆抽出物を含有し得る。化学的に規定された培地とは、化学的構成要素がすべて判明している（すなわち、公知の化学的構造を有する）細胞培養培地を指す。化学的に規定された培地は、例えば、血清または動物由来ペプトンなどの動物由来構成要素を完全に含まない。一実施形態では、培地は、化学的に規定された培地である。
【0093】
「細胞株」とは、細胞の連続的な継代または継代培養を通した特定の系統に由来する１つまたは複数の細胞を指す。「細胞」という用語は、「細胞集団」と同義的に使用される。「細胞」という用語は、組換え核酸配列の発現に好適な任意の細胞を含む。細胞には、細菌細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物などの原核生物および真核生物の細胞が含まれる。ある特定の実施形態では、細胞は，ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。他の実施形態では、細胞は、以下の細胞から選択される：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、リンパ球、例えば、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ Ｋ１細胞である。
【0094】
細胞は、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、および同等物を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、対象のタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドで形質転換され得る。
【0095】
「異種ポリヌクレオチド」という用語は、対象のタンパク質をコードする配列を含み得る、野生型細胞では見出されない異種ヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。例示的な異種ポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージおよびウイルス粒子を含むがこれらに限定されない、対象のタンパク質をコードする配列を含むベクターを含む。任意に、ベクターは、特定の核酸分子の細胞への移入を可能にする。適切な細胞に導入されると、発現ベクターは、対象のタンパク質の発現を指示するために必要な遺伝子要素を含有する。例示的なベクターは、対象のタンパク質をコードする配列に動作可能に結合される転写プロモーター要素（すなわち、発現制御配列）を含むことができる。ベクターは、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、または２つの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ）から構成され得る。任意に、ベクターは、ポリアデニル化配列、１つ以上の制限部位、ならびにホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼなどの１つ以上の選択可能マーカーを含み得る。加えて、選択される細胞型および採用されるベクターに応じて、複製の起源、追加の核酸制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を付与する配列などの他の遺伝的要素もまた、ベクターに組み込まれ得る。適切なベクターおよび形質転換方法の選択が、当業者には明らかであろう。
【0096】
グリコシル化
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、グリコシル化されている。グリコシル化は、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、またはそれらの組み合わせを含むことができる。細胞培養で産生される多くの対象のタンパク質およびポリペプチドは、オリゴ糖鎖（グリカン）を含む共有結合炭水化物構造を含有する、糖タンパク質である。これらのオリゴ糖鎖は、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかを介して小胞体およびゴルジ装置内のタンパク質に結合される。オリゴ糖鎖は、糖タンパク質の質量のかなりの部分を含み得る。オリゴ糖鎖は、糖タンパク質の正しい折り畳みの促進、タンパク質－タンパク質相互作用の媒介、安定性の付与、有利な薬力学および／または薬物動態特性の付与、タンパク質消化の阻害、糖タンパク質の適切な分泌経路への標的化、ならびに糖タンパク質の１つもしくは複数の特定の器官への標的化を含む、役割を果たすことができる。
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、グリコシル化されている。グリコシル化は、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、またはそれらの組み合わせを含むことができる。細胞培養で産生される多くの対象のタンパク質およびポリペプチドは、オリゴ糖鎖（グリカン）を含む共有結合炭水化物構造を含有する、糖タンパク質である。これらのオリゴ糖鎖は、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかを介して小胞体およびゴルジ装置内のタンパク質に結合される。オリゴ糖鎖は、糖タンパク質の質量のかなりの部分を含み得る。オリゴ糖鎖は、糖タンパク質の正しい折り畳みの促進、タンパク質－タンパク質相互作用の媒介、安定性の付与、有利な薬力学および／または薬物動態特性の付与、タンパク質消化の阻害、糖タンパク質の適切な分泌経路への標的化、ならびに糖タンパク質の１つもしくは複数の特定の器官への標的化を含む、役割を果たすことができる。
【0097】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化を含む。一般的に、Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、小胞体の内腔内の新生移行タンパク質に付加される。オリゴ糖は、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒまたはいくつかの事例ではＡｓｎ－Ｘ－Ｃｙｓなどの標的コンセンサス配列内に含有されるアスパラギン残基の側鎖上のアミノ基に付加される。初期オリゴ糖鎖は通常、小胞体中の特定のグリコシダーゼ酵素によってトリミングされ、２つのＮ－アセチルグルコサミンおよび３つのマンノース残基からなる短い分岐コアオリゴ糖をもたらす。
【0098】
小胞体における初期処理の後、糖タンパク質は、細胞表面に分泌される前にさらに処理を受け得る。Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、マンノース残基の付加によって修飾され、高マンノースオリゴ糖をもたらし得る。代替的に、Ｎ－アセチルグルコサミンの１つ以上の単糖単位が、コアマンノースサブユニットに付加され、複雑なオリゴ糖を形成し得る。ガラクトースが、Ｎ－アセチルグルコサミンサブユニットに付加され得、シアル酸サブユニットが、ガラクトースサブユニットに付加され、シアル酸、ガラクトース、またはＮ－アセチルグルコサミン残基のいずれかで終端する鎖をもたらし得る。加えて、フコース残基が、コアオリゴ糖のＮ－アセチルグルコサミン残基に付加され得る。これらの付加のそれぞれは、特定のグリコシルトランスフェラーゼによって触媒される。
【0099】
Ｎ結合型グリコシル化経路によって修飾されることに加えて、糖タンパク質はまた、ゴルジ装置で処理されるにつれて特定のセリンまたはトレオニン残基へのＯ結合型オリゴ糖鎖の付加によって修飾され得る。Ｏ結合型オリゴ糖の残基は、一度に１つずつ付加され、各残基の付加は、特定の酵素によって触媒される。Ｎ結合型グリコシル化とは対照的に、Ｏ結合型グリコシル化のためのコンセンサスアミノ酸配列は、あまり明確に定義されていない。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、Ｏ結合型グリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、Ｏ結合型グリコシル化は、対象のタンパク質のセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸への糖分子の付着を含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、グリコシル化タンパク質である。いくつかの実施形態では、グリコシル化タンパク質は、少なくとも１つの付着グリカンを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、少なくとも１個の付着グリカン、少なくとも２個の付着グリカン、少なくとも３個の付着グリカン、少なくとも４個の付着グリカン、少なくとも５個の付着グリカン、少なくとも６個の付着グリカン、少なくとも７個の付着グリカン、少なくとも８個の付着グリカン、少なくとも９個の付着グリカン、少なくとも１０個の付着グリカン、少なくとも１１個の付着グリカン、少なくとも１２個の付着グリカン、少なくとも１５個の付着グリカン、少なくとも２０個の付着グリカン、または少なくとも２５個の付着グリカンを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の付着グリカンを有する。いくつかの実施形態では、グリカンは、Ｎ結合している。いくつかの実施形態では、グリカンは、Ｏ結合している。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、ＮおよびＯ結合型グリカンの両方を含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、グリコシル化タンパク質である。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、少なくとも１個のグリコシル化部位、少なくとも２個のグリコシル化部位、少なくとも３個のグリコシル化部位、少なくとも４個のグリコシル化部位、少なくとも５個のグリコシル化部位、少なくとも６個のグリコシル化部位、少なくとも７個のグリコシル化部位、少なくとも８個のグリコシル化部位、少なくとも９個のグリコシル化部位、少なくとも１０個のグリコシル化部位、少なくとも１０個のグリコシル化部位、少なくとも１１個のグリコシル化部位、少なくとも１２個のグリコシル化部位、少なくとも１５個のグリコシル化部位、少なくとも２０個のグリコシル化部位、または少なくとも２５個のグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、少なくともグリコシル化部位は、Ｎ結合型グリコシル化部位、例えば、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列内のアスパラギンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのグリコシル化部位は、Ｏ結合型グリコシル化部位、例えば、セリンまたはトレオニンである。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位および少なくとも１つのＯ結合型グリコシル化部位の両方を含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、グリカンは、グリコシル化タンパク質の総重量の少なくとも０．５％、１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７５％（５％重量／重量もしくはｗ／ｗ）を含む。いくつかの実施形態では、グリカンは、グリコシル化タンパク質の総重量の少なくとも５％（５％ｗ／ｗ）を含む。いくつかの実施形態では、グリカンは、グリコシル化タンパク質の総重量の少なくとも１０％（１０％ｗ／ｗ）を含む。グリカンから構成されるタンパク質重量の割合を決定する方法は、当業者に容易に明らかであり、アミノ酸配列に由来する予想重量を本明細書に記載の電気泳動分析方法によって決定される実際の重量と比較することを含むが、これに限定されない。
【0103】
参照標準
いくつかの実施形態では、参照標準は、対象のタンパク質を含む試料と同時に同じ調製方法を受け、対象のタンパク質を含む試料と同時に分析される。いくつかの実施形態では、方法は、対象のタンパク質の１つ以上の特性を参照標準と比較することを含む。例えば、方法は、対象のタンパク質および参照標準の電気泳動図を比較することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、参照標準は、対象のタンパク質を含む試料と同時に同じ調製方法を受け、対象のタンパク質を含む試料と同時に分析される。いくつかの実施形態では、方法は、対象のタンパク質の１つ以上の特性を参照標準と比較することを含む。例えば、方法は、対象のタンパク質および参照標準の電気泳動図を比較することを含むことができる。
【0104】
本明細書で使用される場合、「参照標準」とは、当該技術分野で公知の方法を使用して以前に分析されており、その特性が公知である、タンパク質を含む試料を指す。公知の特性は、参照標準（例えば、予測される分子量）のアミノ酸配列から決定するか、または実験的に決定することができる（例えば、電気泳動図プロファイル）。これらの特性には、予想分子量および実験的に決定される分子量、本明細書に記載の方法または当該技術分野で公知の方法を使用して生成された電気泳動図、等電点、吸光係数（対象のタンパク質が所与の波長における光をどの程度強く吸収するかという尺度）、グリコシル化部位の数、および付着グリカンの分子量が含まれ得るが、これらに限定されない。参照標準は、１つ以上の特性において対象のタンパク質と類似し得る。例えば、対象のタンパク質および参照標準の両方は、モノクローナル抗体であるか、またはＦｃドメインを含むか、類似分子量であるか、もしくは同等物であり得る。
【0105】
いくつかの実施形態では、参照標準は、対象のタンパク質を含む。例えば、参照標準は、以前に特性評価され、分解を防止するために制御された条件下で保存されている、試料とは別個の対象のタンパク質のバッチに由来し得る。
【0106】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ａ）試料および参照標準を変性させるステップと、（ｂ）対象のタンパク質および参照標準を蛍光標識で標識して、標識された試料および標識された参照標準を生成する、標識するステップと、（ｃ）対象のタンパク質および参照標準の標識反応をクエンチするステップと、（ｄ）標識された試料および標識された参照標準をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、（ｅ）標識された試料および標識された参照標準の電気泳動を実施するステップとを含み、試料および参照標準は、ステップ（ｄ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ｂ）および（ｃ）で標識およびクエンチされる、電気泳動を使用した分析のための対象のタンパク質および参照標準を含む試料を調製する方法を提供する。
【0107】
いくつかの実施形態では、電気泳動は、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）であり、出力は、電気泳動図である。いくつかの実施形態では、方法は、対象のタンパク質および参照標準の主要ピーク強度を決定することと、対象のタンパク質の主要ピークおよび参照標準の主要ピークの強度値を比較することとを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質または参照標準の主要ピークは、グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質または参照標準の主要ピークは、グリコシル化されておらず、すなわち、本明細書に記載の方法を使用して標識した後に脱グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、主要ピークを決定することは、主要ピークの高さを決定することを含む。いくつかの実施形態では、主要ピークを決定することは、主要ピークの面積を決定することを含む。いくつかの実施形態では、主要ピークを決定することは、その移動時間によって割られたピーク面積である、主要ピークの時間補正面積を決定することを含む。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質の主要ピーク強度は、参照標準の主要ピーク強度の５０％～１５０％、５０％～１４０％、５０％～１３０％、５０％～１２０％、５０％～１１０％、５０％～１００％、５０％～９０％、６０％～１５０％、７０％～１５０％、８０％～１５０％、９０％～１５０％、１００％～１５０％、１１０％～１５０％、１２０％～１５０％、１３０％～１５０％、１４０％～１５０％、６０％～１４０％、７０％～１４０％、７０％～１３０％、７０％～１２０％、７０％～１１０％、８０％～１４０％、８０％～１３０％、８０％～１２０％、８０％～１１０％、８０％～１００％、９０％～１４０％、９０％～１３０％、９０％～１２０％、９０％～１１０％、または９０％～１００％以内である。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質の主要ピーク強度は、参照標準の主要ピーク強度の６０％～１４０％、７０％～１３０％、８０％～１２０％、または９０％～１１０％以内である。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質の主要ピーク強度は、参照標準の主要ピーク強度の７０％～１３０％以内である。参照標準に対して対象のタンパク質の主要ピーク強度を決定することは、ＣＥまたはＭＣＥ機器による適切な分離、およびデータ品質を確実にすることができる。
【0108】
電気泳動
本明細書では、電気泳動を使用した本明細書に記載の方法を使用して調製された対象のタンパク質を含む試料を分析する方法が提供される。
本明細書では、電気泳動を使用した本明細書に記載の方法を使用して調製された対象のタンパク質を含む試料を分析する方法が提供される。
【0109】
タンパク質を分析するための電気泳動ベースの方法には、ドデシル（ラウリル）硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸リチウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動、自由流動電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、およびマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）などのゲルベースの方法が含まれるが、これらに限定されない。
【0110】
いくつかの実施形態では、電気泳動は、ＣＥである。いくつかの実施形態では、ＣＥは、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）緩衝液を含む。
【0111】
いくつかの実施形態では、電気泳動は、ＭＣＥである。「ＭＣＥ」または「マイクロチップキャピラリー電気泳動」および「キャピラリー電気泳動（ＣＥ）」という用語は、試料中の分析物を分離するために使用される、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびそのマイクロ流体対応物（ＭＣＥ）を指す。ＭＣＥ技術が、対象のタンパク質、タンパク質試料中の不純物を分離、識別、および定量化し、タンパク質断片などの対象のタンパク質の分解産物を分析するために使用され得る。ＣＥおよびＭＣＥは、電圧が試料に印加されたときの電気泳動移動度に基づいて、分析物を分離する。ゲルマトリックス（例えば、ゲル電気泳動）の存在は、サイズならびに電荷に基づいて分析物を分離するであろう。試料中の不純物としては、タンパク質凝集体、タンパク質断片、タンパク質多量体、およびアッセイ汚染物質が含まれるが、これらに限定されない。
【0112】
ＭＣＥでは、変性した標識された対象のタンパク質が、希釈され、ＭＣＥに供されて、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上で希釈タンパク質試料が分離され、電気泳動図が生成される。複数の試料が同じマイクロチップ上で同時に実行され得るため、ＭＣＥベースの方法は、高スループットアプローチに容易に適合可能である。さらに、ＭＣＥは、迅速であり、最小限の試料量を使用する。
【0113】
本明細書で使用される場合、電気泳動図は、ＣＥまたはＭＣＥなどの電気泳動方法から生じるプロットである。電気泳動図は、対象のタンパク質および不純物に対応するピークを含有する。
【0114】
電気泳動図を分析する方法は、当該技術分野で公知であり、個々のピーク下の位置、サイズ、および面積を比較することを含む。電気泳動図のピーク面積（ピーク下面積）を計算する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、積分してピーク下面積を推定することを含む。ピーク面積は、Ｅｍｐｏｗｅｒなどのソフトウェアを使用して計算され得る。
【0115】
開示されるＭＣＥアッセイを行うための器具が、市販されている。いくつかの実施形態では、開示されるＭＣＥアッセイは、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（商標）、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（商標）ＨＴ、およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ ＬａｂＣｈｉｐ（ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐ）を使用して実施される。
【0116】
開示されるＣＥアッセイを行うための器具も、市販されている。例えば、ＣＥアッセイは、ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍなどのＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒキャピラリー電気泳動システムを使用して実施され得る。
【0117】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、方法は、タンパク質標準分子量ラダーを標識および実行し、対象のタンパク質のサイズを評価することをさらに含む。タンパク質分子量ラダーは、当業者に公知となり、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手可能なＰａｇｅＲｕｌｅｒ、Ｍａｒｋ１２、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｈｉｇｈ Ｒａｎｇｅ、およびＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ、ならびにＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから入手可能なＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｃｏ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ＫｉｔからのＨＴ ＰＩＣＯ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓラダーを含む。対象のタンパク質のサイズに基づく適切なラダーの選択が、当業者に明らかであろう。
【0118】
用途
本開示は、本明細書に記載の標識、脱グリコシル化、および電気泳動の方法を使用して、対象のタンパク質を特性評価する方法を提供する。
本開示は、本明細書に記載の標識、脱グリコシル化、および電気泳動の方法を使用して、対象のタンパク質を特性評価する方法を提供する。
【0119】
対象のタンパク質を分析することは、ＣＥまたはＭＣＥによって生成される電気泳動図中の１つ以上のピークの数、位置、高さ、幅、強度、サイズ、または面積を特性評価することを含むことができるが、これに限定されない。
【0120】
電気泳動図中のピークの数および位置を特性評価することは、例えば、主要ピークの分子量よりも少ない分子量を伴うピークとして、対象のタンパク質の分解産物が試料中に存在するかどうかを決定することができる。対象の非脱グリコシル化タンパク質ならびに本明細書に記載の方法を使用して脱グリコシル化および標識された対象のタンパク質から生成されたピークの比較は、対象のタンパク質の脱グリコシル化主要ピークが、対象のタンパク質のグリコシル化主要ピークよりも低い分子量を有するため、対象のタンパク質のグリコシル化形態が試料中に存在するかどうかを決定することができる。
【0121】
本開示の方法は、様々な条件下で対象のタンパク質の安定性をアッセイするために使用され得る。これらには、原薬または医薬品として製剤化された対象のタンパク質のための保存条件が含まれる。例えば、対象のタンパク質を含む参照試料とそのストレスを受けた試料との間のピーク数およびピーク面積の比較は、経時的に、および高もしくは低ｐＨまたは光への曝露などの様々な条件下で、対象のタンパク質の安定性を決定するために使用され得る。
【0122】
したがって、本開示は、本明細書に記載の対象のタンパク質を標識および脱グリコシル化する方法を使用して、対象のタンパク質の安定性を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）対象のタンパク質を含む試料にストレスを加えるステップと、（ｂ）ストレスを受けた試料、および対象のタンパク質を含むストレスを受けていない試料を、変性させるステップと、（ｃ）ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料を蛍光標識で標識して、標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料を生成する、標識するステップと、（ｄ）標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料中の未反応蛍光標識をクエンチするステップと、（ｅ）標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料をエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化するステップと、（ｆ）標識されたストレスを受けた試料および標識されたストレスを受けていない試料のマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施して、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料の電気泳動図を生成する、マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）を実施するステップと、（ｇ）ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料からの電気泳動図を比較するステップとを含み、ストレスを受けた試料およびストレスを受けていない試料は、ステップ（ｅ）における脱グリコシル化の前に、ステップ（ｃ）および（ｄ）で標識およびクエンチされる。
【0123】
化学物質、ｐＨ、放射線、光、凍結・解凍サイクル、凍結乾燥、および熱を含むがこれらに限定されない、試料中の対象のタンパク質にストレスを加える任意の方法は、本開示の方法の範囲内であると想定される。
【0124】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質にストレスを加えることは、試料に熱的にストレスを加えることを含む。試料に熱的にストレスを加えることは、原薬または製剤化された医薬品として製剤化された対象のタンパク質のための保存条件をシミュレートすることを含み、すなわち、ストレスを受けた試料は、それぞれ、約－８０℃～－３０℃または約２℃～約８℃で保持される。他の実施形態では、試料に熱的にストレスを加えることは、試料のための取扱および輸送条件をシミュレートすることを含む。他の実施形態では、試料に熱的ストレスを加えることは、例えば、試料が曝露される温度を上昇させることによって、試料の強制分解を誘発することを含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質を含む試料にストレスを加えることは、試料に熱的にストレスを加えることを含む。いくつかの実施形態では、熱ストレスは、２５℃～４５℃で試料を保持することを含む。いくつかの実施形態では、熱ストレスは、２℃、４℃、６℃、８℃、１０℃、１２℃、１４℃、１６℃、１８℃、２０℃、２２℃、２４℃、２６℃、２８℃、３０℃、３２℃、３５℃、３７℃、または４０℃で試料を保持することを含む。いくつかの実施形態では、熱ストレスは、３７℃で試料を保持することを含む。いくつかの実施形態では、熱ストレスは、２２℃～２６℃で試料保持することを含む。いくつかの実施形態では、熱ストレスは、３０℃で試料を保持することを含む。いくつかの実施形態では、熱ストレスは、約２５℃～４５℃でタンパク質を保持することを含む。いくつかの実施形態では、熱ストレスは、ストレスを受けた試料を少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、または１年間保持することを含む。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料は、２週間保持される。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた試料は、４週間保持される。
【0126】
いくつかの実施形態では、試料に熱的にストレスを加えることは、試料を約２５℃～約４５℃で少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、または少なくとも８週間保持することを含む。いくつかの実施形態では、試料に熱的にストレスを加えることは、試料を約３０℃～約４５℃で少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、または少なくとも８週間保持することを含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、試料にストレスを加えることは、少なくとも１回の凍結／解凍サイクルを含む。例えば、液体試料から始めて、試料が凍結するまで温度を下げ、次いで、分析前に試料を液体となる温度に戻す。
【0128】
いくつかの実施形態では、試料にストレスを加えることは、試料を保存条件に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、保存条件は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも８か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間、少なくとも２４か月間、または少なくとも３０か月間の約－８０℃～－３０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、保存条件は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも８か月間、少なくとも１２か月間、または少なくとも１８か月間の約２℃～８℃の温度を含む。
【0129】
いくつかの実施形態では、試料にストレスを加えることは、例えば、Ｖｏｒｔｅｘまたは磁気攪拌器を使用して、試料を機械的に攪拌することを含む。
【0130】
いくつかの実施形態では、試料にストレスを加えることは、試料を凍結乾燥および再水和することを含む。対象のタンパク質を含む試料を凍結乾燥する方法は、当業者に公知となり、例えば、凍結乾燥および噴霧乾燥を含む。
【0131】
いくつかの実施形態では、試料にストレスを加えることは、試料を光、放射線、一重項酸素種、フリーラジカル、高ｐＨ条件、または低ｐＨ条件に曝露することを含む。例示的な低ｐＨ条件には、特に、試料を７．０未満のｐＨ、例えば、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．０、１．５、または１．０未満のｐＨに曝露することを含む。例示的な高ｐＨ条件には、特に、試料を、７．０を超えるｐＨ、例えば、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０．０を超えるｐＨに曝露することを含む。
【0132】
いくつかの実施形態では、試料にストレスを加えることは、試料を光に曝露することを含む。光への曝露は、任意の波長、または任意の波長範囲の光を含むことができる。例示的な実施形態では、試料は、青味を帯びた白色蛍光灯または近紫外線光に曝露される。例示的な青味を帯びた白色蛍光灯は、約４，１００～約４，５００ケルビン（Ｋ）の相関色温度（ＣＣＴ）を有する混合波長の光を含む。いくつかの態様では、青味を帯びた白色蛍光灯は、４，１００ＫのＣＣＴを有する。いくつかの態様では、試料を光に曝露することは、試料を、青味を帯びた白色光の約５０万、６０万、７０万、８０万、９０万、１００万、１１０万、１２０万、１３０万、１４０万、１５０万、１６０万、１７０万、１８０万、１９０万、２００万、２１０万、２２０万、２３０万、２４０万、２５０万、２６０万、２７０万、２８０万、２９０万、または３００万ルクス時間の累積曝露に曝露することを含む。いくつかの態様では、試料を光に曝露することは、試料を、青味を帯びた白色光の約１２０万または約２４０万ルクス時間の累積曝露に曝露することを含む。例示的な近紫外線光は、約３００ｎｍ～約４００ｎｍの波長を有する。いくつかの態様では、近紫外線光は、約１００ワット時／平方メートル～約６００ワット時／平方メートルの集積エネルギーを有する。いくつかの態様では、近紫外線光は、約１００、２００、３００、４００、５００、または６００ワット時／平方メートルの集積エネルギーを有する。
【0133】
参照試料とそのストレスを受けたバージョンとの間の主要ピーク面積の低減は、例えば、分解を通した主要ピークにおける対象のタンパク質の低減を示し得る。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた対象のタンパク質の主要ピークの面積は、ストレスを受けていない対象のタンパク質の主要ピークと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６ 少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％低減される。同様に、参照試料と比較したストレスを受けた参照試料中の低分子量ピークの面積の増加は、対象のタンパク質の分解産物を表す低分子量種の存在量が増大するにつれて、対象のタンパク質の分解を示し得る。いくつかの実施形態では、ストレスを受けた対象のタンパク質の少なくとも１つの低分子量ピークの面積は、ストレスを受けていない対象のタンパク質の少なくとも１つの低分子量ピークと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６ 少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％増加される。
【0134】
キットおよび製造品
本開示は、本明細書に記載の脱グリコシル化および標識の方法で使用される、１つ以上の開示される緩衝液、酵素、染料、および参照標準を含む、キットを提供する。キットは、成分用の容器を含むことができる。緩衝液は、溶液または凍結乾燥形態であり得る。いくつかの実施形態では、キットは、凍結乾燥製剤用の希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器と、任意に、溶液もしくは再構成の使用、および／または凍結乾燥緩衝液もしくは粉末成分の使用のための説明書を含む。
本開示は、本明細書に記載の脱グリコシル化および標識の方法で使用される、１つ以上の開示される緩衝液、酵素、染料、および参照標準を含む、キットを提供する。キットは、成分用の容器を含むことができる。緩衝液は、溶液または凍結乾燥形態であり得る。いくつかの実施形態では、キットは、凍結乾燥製剤用の希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器と、任意に、溶液もしくは再構成の使用、および／または凍結乾燥緩衝液もしくは粉末成分の使用のための説明書を含む。
【0135】
本明細書に記載のキットは、緩衝液、希釈剤、およびフィルターのうちの１つ以上を含む、開示されるＭＣＥアッセイを実施するために必要な追加の試薬をさらに含み得る。緩衝液および試薬は、ボトル、バイアル、または試験管内にあり得る。
【0136】
いくつかの実施形態では、キットは、取扱説明書を含む。
【0137】
本説明は、多数の例示的な構成、方法、パラメータ、および同等物を記載する。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲への限定として意図されるものではなく、代わりに例示的実施形態の説明として提供されることが認識されるべきである。
【実施例0138】
実施例１：試薬
材料および機器
材料および機器
【0139】
（表１）材料（同等の品物も使用することができる）
【0140】
（表２）化学物質（同等の品物も使用することができる）
【0141】
（表３）機器
【0142】
（表４）試薬溶液
【0143】
（表５）ＭＣＥ方法の概要
【0144】
（表６）実施例で使用されたタンパク質の概要
【0145】
実施例２：脱グリコシル化を伴わないマイクロチップキャピラリー電気泳動のためのプロトコル（方法Ａ）
このプロトコルは、純度および不純物レベルを推定するためのＧＸＩＩ機器を使用した非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）による試験タンパク質の分析のための調製方法を説明する。これらの方法は、タンパク質特性評価またはタンパク質試料中の断片化のレベルの決定に使用される。これらの従来的な方法は、脱グリコシル化を伴わずに実行される。
このプロトコルは、純度および不純物レベルを推定するためのＧＸＩＩ機器を使用した非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）による試験タンパク質の分析のための調製方法を説明する。これらの方法は、タンパク質特性評価またはタンパク質試料中の断片化のレベルの決定に使用される。これらの従来的な方法は、脱グリコシル化を伴わずに実行される。
【0146】
手順
この手順のための情報のみのフローの経路については、図１を参照されたい。
この手順のための情報のみのフローの経路については、図１を参照されたい。
【0147】
（１）変性。タンパク質参照標準または被験物質を水で約０．２～２．０ｍｇ／ｍＬまで希釈する。９６ウェルプレート内で、４：１の体積比（体積は様々であり得る）でタンパク質試料および非還元（ＮＲ）／還元（Ｒ）性溶液を添加する。プレートをポリプロピレンシールで密封し、プレートをタンパク質特異的変性温度（典型的には、５０～９９℃）で、最適化された時間（典型的には、１～６０分）の間加熱する。
【0148】
（２）標識。表４に記載されるように、５μＭの染料を調製する。１：１の体積比（体積は様々であり得る）で５μＭの染料を変性タンパク質溶液に添加する。サーモサイクラー内の９６ウェルプレートを３５℃で３０分間加熱する。標識反応をクエンチするために、１０５μＬの希釈停止溶液（表４に従って調製される）および５μＬの標識タンパク質を新しい９６ウェルプレートに添加し、よく混合する。
【0149】
（３）ＧＸ－ＩＩで実行する。ＭＣＥ機器およびマイクロチップを準備し、製造業者の指示に従って測定を実施する。
【0150】
実施例３：タンパク質標識の前に脱グリコシル化を伴うマイクロチップキャピラリー電気泳動のためのプロトコル（方法Ｂ）
この方法は、ＭＣＥ測定を受ける前に脱グリコシル化される必要のある糖タンパク質に適用される。別段の指定がない限り、すべてのプロトコル、化学物質、試薬、および分析は、実施例１～２に記載されるものと同じである。
この方法は、ＭＣＥ測定を受ける前に脱グリコシル化される必要のある糖タンパク質に適用される。別段の指定がない限り、すべてのプロトコル、化学物質、試薬、および分析は、実施例１～２に記載されるものと同じである。
【0151】
（表７）追加の試薬
【0152】
手順
（１）脱グリコシル化。０．１％のＲａｐｉＧｅｓｔ ＳＦを用いて、合計１００μｇのタンパク質試料を９０μＬまで希釈する。タンパク質重量は、ＵＶベースの方法によって決定することができる。１０μＬのＮＥＢ ＰＮＧａｓｅ Ｆストックを添加し、１００μＬの脱グリコシル化混合物を作製し、ボルテックスし、沈降させる。４００回転／分（ｒｐｍ）で振とうしながら、加熱ブロック上で、混合物を３７℃で３時間インキュベートする。
（１）脱グリコシル化。０．１％のＲａｐｉＧｅｓｔ ＳＦを用いて、合計１００μｇのタンパク質試料を９０μＬまで希釈する。タンパク質重量は、ＵＶベースの方法によって決定することができる。１０μＬのＮＥＢ ＰＮＧａｓｅ Ｆストックを添加し、１００μＬの脱グリコシル化混合物を作製し、ボルテックスし、沈降させる。４００回転／分（ｒｐｍ）で振とうしながら、加熱ブロック上で、混合物を３７℃で３時間インキュベートする。
【0153】
（２）変性。実施例２に記載されるように、上述の脱グリコシル化試料の変性を進める。
【0154】
（３）標識。実施例２に記載されるように、変性された試料の標識を進める。
【0155】
（４）ＧＸ－ＩＩで実行する。ＭＣＥ機器およびマイクロチップを準備し、製造業者の指示に従って測定を実施する。
【0156】
実施例４：タンパク質標識の後に脱グリコシル化を伴うマイクロチップキャピラリー電気泳動のためのプロトコル（方法Ｃ）
この方法は、ＭＣＥ測定を受ける前に脱グリコシル化される必要のある糖タンパク質に適用される。別段の指定がない限り、すべてのプロトコル、化学物質、試薬、および分析は、実施例１～３に記載されるものと同じである。
この方法は、ＭＣＥ測定を受ける前に脱グリコシル化される必要のある糖タンパク質に適用される。別段の指定がない限り、すべてのプロトコル、化学物質、試薬、および分析は、実施例１～３に記載されるものと同じである。
【0157】
タンパク質標識後の脱グリコシル化のためのプロトコルの図は、図１で見ることができる。
【0158】
（表８）追加の試薬
【0159】
手順
（１）変性。実施例２に記載されるように試料を希釈し、変性させる。
（１）変性。実施例２に記載されるように試料を希釈し、変性させる。
【0160】
（２）標識。表４に記載されるように、５μＭの染料を調製する。５μＭの染料および上述の変性タンパク質溶液を１：１の体積比で混合する。例えば、試料の体積が１０μＬである場合、１０μＬの５μＭ染料を添加する。９６ウェルプレートをポリプロピレンシールで密封し、サーモサイクラー内で３５℃で３０分間加熱する。標識反応をクエンチするために、未使用の９６ウェルプレートを用意する。試料実行設定に従って、２．５μＬの停止緩衝液（Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔからの橙色キャップバイアル、キットからの元の溶液を使用する）を空のプレートのウェルに添加する。２．５μＬの標識された試料を、停止溶液を含有するプレートウェルに移す。各ウェルに混合試料をピペットで注入し、少なくとも３分間保持する。
【0161】
（３）脱グリコシル化。各ウェルに、３μＬのＭｉｌｌｉＱ水および２μＬの５ｘ Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ緩衝液（ＮＥＢからの非還元形式）を添加し、１０μＬの反応体積を作製する。各ウェルに、１～４μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ（ＮＥＢからの非還元形式）を添加する。９６ウェルプレートをポリプロピレンシールで密封し、サーモサイクラー内で５０℃で１０～３０分間加熱する。脱グリコシル化後、各ウェルに１７μＬの試料緩衝液（Ｐｉｃｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔからの白色キャップバイアル）および８０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を添加する。
【0162】
（４）ＧＸ－ＩＩで実行する。ＭＣＥ機器およびマイクロチップを準備し、製造業者の指示に従って測定を実施する。
【0163】
実施例５：重度にグリコシル化されたシアル酸含有タンパク質を使用したタンパク質標識前の脱グリコシル化なしおよび脱グリコシル化の比較
タンパク質１は、ペプチド質量によってサイズが４９ｋＤａであり、８つの予測されるＮ－グリコシル化部位を有する、ジスルフィド結合組換え融合タンパク質である（注：すべての部位がグリコシル化されていると予想されるわけではない）。
タンパク質１は、ペプチド質量によってサイズが４９ｋＤａであり、８つの予測されるＮ－グリコシル化部位を有する、ジスルフィド結合組換え融合タンパク質である（注：すべての部位がグリコシル化されていると予想されるわけではない）。
【0164】
１つの目標は、研究安定性試験および品質管理（ＱＣ）試験のために、重度にグリコシル化されたシアル酸含有タンパク質（例えば、タンパク質１）の低分子量（ＬＭＷ）断片を特性評価および監視するためのマイクロチップキャピラリー電気泳動ベースの方法を開発することであった。
【0165】
タンパク質１の特性が、以下の表９に示される。
【0166】
（表９）タンパク質１の分子特性
略語：インタクトＭＳ、インタクトタンパク質質量分析；ＳＥＣ－ＭＡＬＳ、サイズ排除クロマトグラフィー多重角度レーザー光散乱。
【0167】
脱グリコシル化を伴わないプロトコル（方法Ａ、実施例２）および標識前に脱グリコシル化を伴うプロトコル（方法Ｂ、実施例３）の比較が、図１に示される。方法Ａおよび方法Ｂによって生成されたタンパク質１の電気泳動図の比較は、それぞれ、非還元（ＮＲ）条件については図２に、還元（Ｒ）条件については図４に示される。ＮＲ条件については、方法Ａ（脱グリコシル化を伴わない）の結果として、ピーク分離能を伴わない（すなわち、主要、高分子量（ＨＭＷ）、および低分子量（ＬＭＷ）ピークの分離がない）電気泳動図中の広範なピークが存在した。加えて、ピーク位置は、直交法に基づいて約６４ｋＤａと予想されたものよりもはるかに高い分子量（ＭＷ）領域（７０～１２０ｋＤａ）に出現した。ＭＣＥアッセイは、タンパク質がグリコシル化されている場合に、より大きな誤差を伴ってサイズを不正確に推定し得る（Ｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０１５ Ａｕｇ；３６（１５）：１７５４－８によって説明されている）。加えて、２０ｋＤａを下回る任意のＬＭＷピークをマスクし得る、＜２０ｋＤａにおける遊離染料ピーク干渉があった。
【0168】
対照的に、脱グリコシル化が標識前に生じる方法Ｂ（実施例３）の結果として、ピーク間のピーク分解能およびベースライン分離（主要、ＨＭＷ、ＬＭＷピーク）が存在する。主要ピークは、予想ＭＷ（約４９ｋＤａ）の近くに出現した。プロトコルは、安定性を示し、より正確に分子サイズを決定する。しかしながら、方法Ｂのプロトコルはまた、アッセイの全体的なスループットを制限する、３時間の脱グリコシル化も必要とする。さらに、ＰＮＧａｓｅピーク（約３６ｋＤａ）は、ＬＭＷ１および２ピーク（タンパク質１の断片からの不純物ピーク）に干渉する。特に、熱的にストレスを受けたタンパク質１試料については、ＬＭＷ１ピークは、増加および拡大し、ＰＮＧａｓｅピークとマージする（図３）。別の近くのアーチファクトは、＜２０ｋＤａにおける遊離染料ピーク干渉である。これらのアーチファクトの組み合わせは、不純物を定量化するときに不正確な積分につながり得、アッセイの安定性を示す能力を制限する。
【0169】
類似の観察が、還元条件（図４）について見出され、糖タンパク質の脱グリコシル化は、主要、ＬＭＷ、およびＨＭＷピークの正確なサイズ決定、分離、および分解能のために必要とされる。
【0170】
実施例６：重度にグリコシル化されたシアル酸含有タンパク質を使用したタンパク質標識後の脱グリコシル化
標識前（方法Ｂ）および標識後（方法Ｃ）に脱グリコシル化を伴うプロトコルの比較が、図１に示される。
標識前（方法Ｂ）および標識後（方法Ｃ）に脱グリコシル化を伴うプロトコルの比較が、図１に示される。
【0171】
標識後に脱グリコシル化を伴うプロトコルを開発するために、グリコシル化ピークの非完全除去が最初に３０分間の脱グリコシル化反応で観察されたため、脱グリコシル化反応条件が最適化された。温度、時間、濃度、および緩衝条件は、タンパク質１の最適な脱グリコシル化を決定するために変更された。
【0172】
タンパク質１のＮＲ電気泳動図内の不完全に脱グリコシル化されたピークを除去するための最適化は、プロトコルにいくつかの改善を生じた。これらは、ＮＥＢ Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用し、５０℃の高温で脱グリコシル化を１０分間実施すること（従来のＰＮＧａｓｅ Ｆを使用することは、３７℃で３時間のインキュベーションを必要とする）と、エンドグリコシダーゼ濃度を増加させることと、ＮＥＢ ＰＮＧａｓｅキットからグリコタンパク質緩衝液を添加することとを含んだ。
【0173】
実験は、増加する反応時間には脱グリコシル化の明らかな改善がないことを示した。図５は、５０℃で１μＬまたは２μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆ（非還元形式、ＮＥＢ Ｐ０７１１）とともにタンパク質１を使用して生成された電気泳動図を示し、反応時間は、１０～３０分まで様々である。図５から分かるように、１０分を超える反応時間では、明らかな改善（すなわち、不完全に脱グリコシル化されたピークの低減）はなかった。
【0174】
Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆ濃度を増加させることは、脱グリコシル化を改善した。標識後の脱グリコシル化のためのプロトコルを使用して、１、２、３、または４μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを、脱グリコシル化反応に添加し、反応を、５０℃で１０分間進行させた。結果は、図６および図７に示される。図６の挿入図から分かるように、Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆの濃度を増加させることは、タンパク質１の不完全な脱グリコシル化のショルダーピークを減少させる。
【0175】
１～４μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを添加することは、ロバストな結果を提供した。１、２、３、または４μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して脱グリコシル化された参照タンパク質１を使用して生成された電気泳動図が、図７に示される。示されたピークの下の面積は、Ｅｍｐｏｗｅｒを使用して積分され、結果は、以下の表１０に提供される。
【0176】
（表１０）異なる量のＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して生成されたタンパク質１ピークの積分
【0177】
％ＲＳＤは、相対標準偏差率を表す。
【0178】
積分結果は、より高いＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆ濃度を伴って観察された、主要ピーク後のショルダーピークの減少（不完全に脱グリコシル化されたタンパク質１）があったが、主要ピーク（ＭＰ）の総積分率は、約３μＬにおいて最も高い値を有することを示した。１μＬ～４μＬのＰＮＧａｓｅから、ＭＰの％ＲＳＤは、０．３３％であり、反応当たり１～４μＬのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆ濃度を使用することがロバストな結果を提供することを示唆した。この傾向に従って、より多くのＲａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅを使用することは、類似結果を提供すると予想される。
【0179】
脱グリコシル化が標識後に起こる方法Ｃは、このＭＣＥアッセイが、精密であることおよび安定性を示すことの両方を可能にする。タンパク質１は、タンパク質溶液を３７℃で４週間保持することによってストレスを受け（「ＲＳ」、すなわちストレスを受けていない参照標準、と比較した、表１１および１２のストレスを受けた参照標準、すなわち「ＳＲＳ」、「３７℃４ｗ」）、標識後の脱グリコシル化のプロトコルおよび本明細書に記載のＭＣＥを使用してアッセイされた。このストレスを受けたタンパク質１は、ストレスを受けていないタンパク質１（０またはｔ０に等しい時間、すなわち、３７℃の保持がない）と比較された。電気泳動図が、ストレスを受けたタンパク質１およびストレスを受けていないタンパク質１について生成され（図８）、示されたピークが、Ｅｍｐｏｗｅｒを使用して積分された。測定は、３回の反復（Ｓ１～Ｓ３）で繰り返された。結果は、以下の表１１および１２に示される。
【0180】
（表１１）標識プロトコル後に脱グリコシル化を使用したストレスを受けた（ＳＲＳ）タンパク質１およびストレスを受けていない（ＲＳ）タンパク質１の比較
【0181】
（表１２）ストレスを受けたタンパク質１およびストレスを受けていないタンパク質１（Ｎ＝３）の相対標準偏差率（％ＲＳＤ）
【0182】
ＲＳおよびＳＲＳの３回の反復測定は、複数のＬＭＷピークおよびＨＭＷピークが、実行間で一貫して識別されたことと、ＬＭＷおよびＭＰピークについて１％未満のＲＳＤで積分されたこととを示した。すべての変化は、ＲＳからＳＲＳまで有意であった。方法Ｃによって調製されたストレスを受けたタンパク質１およびストレスを受けていないタンパク質１の電気泳動図の比較（図８）は、この方法が精密であり、安定性を示すことを示した。
【0183】
ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いた脱グリコシル化が染料標識の前に実施される場合（方法Ｂ）、ＰＮＧａｓｅ Ｆピークは、電気泳動図プロファイルで可視的であり、ＬＭＷ１およびＬＭＷ２ピークに干渉する。長い脱グリコシル化時間（３時間）が使用され、遊離染料干渉（＜２０ｋＤａ）が存在する。
【0184】
Ｒａｐｉｄ（商標）ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いた脱グリコシル化が染料を用いた標識後に実施される（方法Ｃ）場合、いずれのＰＮＧａｓｅピークも電気泳動図で可視的ではない。（例えば、１０分で）高速かつ完全な脱グリコシル化が存在する。ＭＰ、ＨＭＷ、およびＬＭＷピークの分解能は、約１０ｋＤａ領域までの最小限の遊離染料干渉とともに達成される（例えば、図８では、ＬＭＷ５ピークは、１１ｋＤａであり、遊離染料ピークアーチファクトからベースライン分解される）。
【0185】
要約すると、方法Ｃなどの染料標識後に脱グリコシル化を使用するＭＣＥ方法は、良好な分解能を有し、安定性を示し、高スループットであり、再現性があり、ＰＮＧａｓｅ Ｆ ピーク干渉および遊離染料干渉からのアッセイアーチファクトを回避する。方法はまた、良好な精度、線形性、およびロバスト性も示す。これらのアッセイは、品質管理目的のために好適であるプレートベースの高スループット形式で使用され得る。
【0186】
実施例７：タンパク質２を使用した脱グリコシル化の有りおよび無しで生成されたＭＣＥ結果の比較
タンパク質２は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）のリンカーによって結合されたリガンド結合ドメインを含む一本鎖融合タンパク質を含む、一本鎖組換え（Ｆａｂ’）２様タンパク質である。タンパク質は、４８ｋＤａの予測分子量（ペプチド骨格）を有する。タンパク質２は、８個のＮ－グリコシル化部位を有する。
タンパク質２は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）のリンカーによって結合されたリガンド結合ドメインを含む一本鎖融合タンパク質を含む、一本鎖組換え（Ｆａｂ’）２様タンパク質である。タンパク質は、４８ｋＤａの予測分子量（ペプチド骨格）を有する。タンパク質２は、８個のＮ－グリコシル化部位を有する。
【0187】
タンパク質２のＭＣＥ電気泳動図が、非還元条件および還元条件の両方の下で、脱グリコシル化を伴わないプロトコル（方法Ａ、実施例２）および標識後に脱グリコシル化を伴うプロトコル（方法Ｃ、実施例４）を使用して生成された。図９から分かるように、脱グリコシル化がないと、理論値（約４８ｋＤａ）よりもはるかに大きい、ＭＷ領域（９０～１４０ｋＤａ）に出現する分離を伴わない広範なピークのみがあった。反対に、脱グリコシル化は、予想ＭＷ（４８ｋＤａ）の近くの主要ピークおよび明確に分解されたＬＭＷピークを生じた。さらに、ＰＮＧａｓｅピーク（約３６ｋＤａ）は、電気泳動図に出現しなかった。
【0188】
実施例８：タンパク質３を使用した脱グリコシル化の有りおよび無しで生成されたＭＣＥ結果の比較
タンパク質３は、組換えシステインプロテアーゼによって特定の部位で切断された組換えヒトＩｇＧ １ Ｆｃサブユニットである。タンパク質は、２３ｋＤａの予測分子量を有する。タンパク質は、１つのＮ－グリコシル化部位を有する。
タンパク質３は、組換えシステインプロテアーゼによって特定の部位で切断された組換えヒトＩｇＧ １ Ｆｃサブユニットである。タンパク質は、２３ｋＤａの予測分子量を有する。タンパク質は、１つのＮ－グリコシル化部位を有する。
【0189】
ＭＣＥ電気泳動図が、非還元条件下で、脱グリコシル化を伴わないプロトコル（方法Ａ、実施例２）および標識後に脱グリコシル化を伴うプロトコル（方法Ｃ、実施例４）を使用して生成された。結果は、図１０で見ることができる。非脱グリコシル化プロファイルでは、元の試料中の非グリコシル化集団（ＭＰ１、左）およびグリコシル化集団（ＭＰ２、右）を表す、２つの主要ピーク（ＭＰ）が見出された。脱グリコシル化プロファイルでは、非グリコシル化ピークのみが観察され、いくつかのＨＭＷピークが分解された。同じ比較が、還元条件下でも実施された（図１１）。
【0190】
実施例９：モノクローナル抗体の安定性評価
タンパク質４は、１４５ｋＤａの分子量および２つのＮ結合型グリコシル化部位を有するヒトＩｇＧ４系モノクローナル抗体である。
タンパク質４は、１４５ｋＤａの分子量および２つのＮ結合型グリコシル化部位を有するヒトＩｇＧ４系モノクローナル抗体である。
【0191】
ＭＣＥ電気泳動図が、脱グリコシル化を伴わないプロトコル（図１２および１３の方法Ａ）を使用して、ならびに標識後に脱グリコシル化を伴うプロトコル（図１２および１３の方法Ｃ）を使用して調製されたタンパク質４試料について生成された。タンパク質は、非還元条件（図１２）および還元条件（図１３）の両方の下で変性を使用してアッセイされた。図１３から分かるように、脱グリコシル化は、グリカンの除去の結果として、より低い分子量においてグリコシル化主要ピーク（ＧＭＰ）を脱グリコシル化主要ピーク（ＤＧＭＰ）にシフトさせる。図１３では、脱グリコシル化は、脱グリコシル化重鎖（ＤＧＨＣ）ピークおよびグリコシル化重鎖（ＦＧＨＣ）ピークを比較することによって分かるように、重鎖（ＨＣ）ピークのサイズを縮小する。
【0192】
実施例１０：光ストレスを受けたタンパク質１の安定性評価
タンパク質１は、１２０万および２４０万ルクス時間（ＭＬＨ）の累積曝露を伴う青味を帯びた白色（ＣＷ）蛍光ランプの光の下で（図１４）、または２００および４００ワット時間／平方メートルのエネルギーを伴う積分近紫外線（ＵＶＡ）の下で（図１５）、タンパク質溶液を曝露することによって光ストレスを加えられた。試料は、実施例１および４に記載されるように、標識後の脱グリコシル化のプロトコル（方法Ｃ）およびＭＣＥを使用してアッセイされた。ストレスを受けたタンパク質１試料は、ストレスを受けていないタンパク質１対照（同じ条件下でインキュベートされたが、アルミニウムホイルで覆われた）と比較された。電気泳動図が、ストレスを受けたタンパク質１およびストレスを受けていないタンパク質１について生成され、示されたピークが、Ｅｍｐｏｗｅｒを使用して積分された。結果は、表１３に示される。ＣＷおよびＵＶＡ曝露の両方は、ＬＭＷピークのわずかな増加およびＨＭＷピークの有意な増加につながり、これは、共有結合二量体および多量体の光開始形成に起因し得る。結果は、この方法が、安定性を示し、ストレス条件下でのタンパク質の断片化および共有結合ＨＭＷ形成を評価することができることを示す。
タンパク質１は、１２０万および２４０万ルクス時間（ＭＬＨ）の累積曝露を伴う青味を帯びた白色（ＣＷ）蛍光ランプの光の下で（図１４）、または２００および４００ワット時間／平方メートルのエネルギーを伴う積分近紫外線（ＵＶＡ）の下で（図１５）、タンパク質溶液を曝露することによって光ストレスを加えられた。試料は、実施例１および４に記載されるように、標識後の脱グリコシル化のプロトコル（方法Ｃ）およびＭＣＥを使用してアッセイされた。ストレスを受けたタンパク質１試料は、ストレスを受けていないタンパク質１対照（同じ条件下でインキュベートされたが、アルミニウムホイルで覆われた）と比較された。電気泳動図が、ストレスを受けたタンパク質１およびストレスを受けていないタンパク質１について生成され、示されたピークが、Ｅｍｐｏｗｅｒを使用して積分された。結果は、表１３に示される。ＣＷおよびＵＶＡ曝露の両方は、ＬＭＷピークのわずかな増加およびＨＭＷピークの有意な増加につながり、これは、共有結合二量体および多量体の光開始形成に起因し得る。結果は、この方法が、安定性を示し、ストレス条件下でのタンパク質の断片化および共有結合ＨＭＷ形成を評価することができることを示す。
【0193】
（表１４）標識プロトコル後に脱グリコシル化を使用した光ストレスを受けたタンパク質１および光ストレスを受けていないタンパク質１の比較（方法Ｃ）
【0194】
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> Deglycosylation Methods for Electrophoresis of Glycosylated
Proteins
<150> US 62/963,646
<151> 2020-01-21
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> Deglycosylation Methods for Electrophoresis of Glycosylated
Proteins
<150> US 62/963,646
<151> 2020-01-21
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】