特開 2023-166489 ＭＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を調製する改善されたプロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023166489

(43)【公開日】2023-11-21

(54)【発明の名称】ＭＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を調製する改善されたプロセス

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20231114BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20231114BHJP

   C12N 15/00 20060101ALI20231114BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20231114BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20231114BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00 ZNA

A61K31/7105

A61K9/16

A61K47/12

A61K47/22

A61K47/24

A61K38/43

A61K38/18

A61K38/00

C12N15/00 100Z

B82Y5/00

B82Y40/00

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023141009

(22)【出願日】2023-08-31

(62)【分割の表示】P 2019524194の分割

【原出願日】2017-11-10

(31)【優先権主張番号】62/420,413

(32)【優先日】2016-11-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/580,155

(32)【優先日】2017-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】517316797

【氏名又は名称】トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】シュリラング カーブ

(72)【発明者】

【氏名】フランク デローサ

(72)【発明者】

【氏名】ザーナ バブサー

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ハートレイン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＭＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を調製する改善されたプロセスの提供。
【解決手段】本発明は、脂質ナノ粒子製剤およびｍＲＮＡ封入のための改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、予め形成された脂質ナノ粒子とｍＲＮＡの溶液を混合する工程を含む、脂質ナノ粒子にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する方法を提供する。特に、本発明は、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと組み合わせることにより、ｍＲＮＡを封入することが、ｍＲＮＡの予想外に効率的なｉｎ ｖｉｖｏ送達、ならびにｍＲＮＡがコードするタンパク質および／またはペプチドの驚くべき強力な発現を示す形成された粒子をもたらす。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１６年１１月１０日に出願された米国仮出願第６２／４２０，４１３号、および２０１７年１１月１日に出願された米国仮出願第６２／５８０，１５５号に対する優先権を主張するものであり、当該開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表

【0002】

本明細書は、配列表（「ＭＲＴ－１２４６ＷＯ＿ＳＬ」という名称のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして２０１７年１１月１０日に電子的に提出されたもの）を参照する。該テキストファイルは、２０１７年１１月１０日に作成されたものであり、サイズは１７，４８２バイトである。配列表の全内容が、参照によって本明細書に援用される。

【背景技術】

【0003】

メッセンジャーＲＮＡ療法（ＭＲＴ）は、様々な疾患の治療にますます重要なアプローチとなっている。ＭＲＴは、治療を必要とする患者にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与し、患者体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を産生するものである。一般的には、効率よくｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで送達するために、脂質ナノ粒子を使用してｍＲＮＡを封入する。

【0004】

脂質ナノ粒子送達を改善するために、多くの試みは、例えば、種々の種類の哺乳類組織、器官および／または細胞（例えば、哺乳類肝細胞）において、ｍＲＮＡの細胞内送達および／または発現に影響を与え得る新しい脂質または特定の脂質組成物を識別することに焦点を当てたものである。しかし、これらの既存のアプローチは、費用がかかり、時間がかかり、予測不可能である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を調製するための改善されたプロセスを提供する。特に、本発明は、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと組み合わせることにより、ｍＲＮＡを封入することが、ｍＲＮＡの予想外に効率的なｉｎ ｖｉｖｏ送達、ならびにｍＲＮＡがコードするタンパク質および／またはペプチドの驚くべき強力な発現を示す形成された粒子をもたらす。

【0006】

従来のプロセスと比較して、本明細書に記載の本発明のプロセスは、より高い効力およびより良好な有効性の脂質ナノ粒子により送達されるｍＲＮＡを提供し、それによって治療指数を正方向にシフトさせ、より低いコスト、より良好な患者コンプライアンス、およびより患者にやさしい投与計画などの追加的利点を提供する。本発明により提供されるｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子製剤は、静脈内、筋肉内、関節内、くも膜下腔内、吸入（呼吸）、皮下、硝子体内、および点眼などの異なる投与経路を介して、より強力かつ有効なタンパク質発現のため、ｉｎ ｖｉｖｏで首尾よく送達され得る。

【0007】

本発明のプロセスは、ポンプシステムを使用して実施することができ、従って拡張可能であり、例えば、臨床試験および／または商業販売の実施に十分な量の改善された粒子形成／製剤を可能にする。パルスレスフローポンプ、ギアポンプ、蠕動ポンプ、および遠心ポンプを含むがこれに限定されない様々なポンプシステムを、本発明を実施するために使用しうる。

【0008】

本発明のプロセスにより、優れた封入効率、ｍＲＮＡ回収率、および均質な粒子サイズももたらされる。

【0009】

従って、一態様では、本発明は、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液とｍＲＮＡを含む溶液とを混合する工程を含む脂質ナノ粒子中のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入し、ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子封入を形成するプロセスを提供する。本明細書で使用される場合、予め形成された脂質ナノ粒子はｍＲＮＡを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子は、空の脂質ナノ粒子と呼ばれる。

【0010】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、一つ以上の溶液を周囲温度よりも高い温度に加熱する（または温度に維持する）（すなわち、熱源からの熱を溶液に適用する）工程を含み、一つ以上の溶液は予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液であり、ｍＲＮＡを含む溶液であり、脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを含む混合溶液である。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程の前に、ｍＲＮＡ溶液および予め形成された脂質ナノ粒子溶液の一方または両方を加熱する工程を含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程の間、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液および脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを含む溶液の一つ、または一つ以上を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程の後、脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを加熱する工程を含む。いくつかの実施形態では、溶液の一つ以上が加熱される（または溶液の一つ以上が維持される）温度は、約３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、もしくは７０℃であるか、またはそれより高い。いくつかの実施形態では、溶液の一つ以上が加熱される温度は、約２５～７０℃、約３０～７０℃、約３５～７０℃、約４０～７０℃、約４５～７０℃、約５０～７０℃、または約６０～７０℃の範囲である。いくつかの実施形態では、溶液の一つ以上が加熱される周囲温度よりも高い温度は、約６５℃である。

【0011】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液および脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを含む混合溶液の一つ以上を周囲温度で維持する（すなわち、熱源からの熱を溶液に適用しない）ことを含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程の前に、ｍＲＮＡ溶液および予め形成された脂質ナノ粒子溶液の一方または両方を周囲温度で維持する工程を含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、混合工程中に、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液および脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを含む溶液の一つまたは一つ以上を周囲温度で維持することを含む。いくつかの実施形態では、プロセスには、混合工程の後、脂質ナノ粒子により封入されたｍＲＮＡを周囲温度で維持する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、溶液の一つ以上が維持される周囲温度は、約３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、もしくは１６℃であるか、またはそれ未満である。いくつかの実施形態では、溶液の一つ以上が維持される周囲温度は、約１５～３５℃、約１５～３０℃、約１５～２５℃、約１５～２０℃、約２０～３５℃、約２５～３５℃、約３０～３５℃、約２０～３０℃、約２０～３０℃、約２５～３０℃、または２０～２５℃の範囲である。いくつかの実施形態では、溶液の一つ以上が維持される周囲温度は、２０～２５℃である。

【0012】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液と、ｍＲＮＡを含む溶液とを混合して、ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子を形成する工程を周囲温度で実施することを含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子は、エタノール中に溶解した脂質を水溶液と混合することにより形成される。いくつかの実施形態では、資質は、一種以上のカチオン性脂質、一種以上のヘルパー脂質、および一種以上のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質には一種以上のコレステロール脂質も含まれる。予め形成された脂質ナノ粒子は、それらの脂質の混合によって形成される。従って、一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子は、一種以上のカチオン性脂質、一種以上のヘルパー脂質、および一種以上のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子は、一種以上のコレステロール脂質も含有する。

【0014】

いくつかの実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾールベース）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）、Ｎ１ＧＬ、Ｎ２ＧＬ、Ｖ１ＧＬならびにその組み合わせからなる群から選択される。

【0015】

一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、アミノ脂質である。本発明での使用に適したアミノ脂質は、国際公開第２０１７１８０９１７号に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１７１８０９１７号における典型的なアミノ脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、及び化合物１８などの段落［０７４４］で記載されたものが挙げられる。その他のアミノ脂質には、化合物２、化合物２３、化合物２７、化合物１０、および化合物２０が含まれる。本発明での使用に適したさらなるアミノ脂質には、国際公開第２０１７１１２８６５号に記載されているものが含まれ、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１７１１２８６５号における典型的なアミノ脂質は、式（Ｉ）、（Ｉａｌ）－（Ｉａ６）、（ｌｂ）、（ＩＩ）、（Ｉｌａ）、（ＩＩＩ）、（Ｉｌｉａ）、（ＩＶ）、（１７－１）、（１９－１）、（１９－１１）、および（２０－１）のうちの一つによる化合物、ならびに段落［００１８５］、［００２０１］、［０２７６］の化合物を含む。いくつかの実施形態では、本発明での使用に適したカチオン性脂質は、国際公開第２０１６１１８７２５号に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１６１１８７２５号における典型的なカチオン性脂質は、ＫＬ２２およびＫＬ２５などのものを含む。いくつかの実施形態では、本発明での使用に適したカチオン性脂質は、国際公開第２０１６１１８７２４号に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１６１１８７２５号におけるカチオン性脂質の例としては、ＫＬ１０、１，２－ジグリノレイロキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、及びＫＬ２５などのものが挙げられる。

【0016】

一部の実施形態では、一種以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））から選択される。

【0017】

一部の実施形態では、一種以上のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ_６－Ｃ_２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子は、接線流ろ過（ＴＦＦ）プロセスによって精製される。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、サイズ約１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ未満、約１４０ｎｍ未満、約１３５ｎｍ未満、約１３０ｎｍ未満、約１２５ｎｍ未満、約１２０ｎｍ未満、約１１５ｎｍ未満、約１１０ｎｍ未満、約１０５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約９５ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約８５ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ）を有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべては、１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ）のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くは、５０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべては、５０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くは、８０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべては、８０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。

【0019】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える封入率をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、ｍＲＮＡの６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える回収をもたらす。

【0020】

いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子とｍＲＮＡは、ポンプシステムを使用して混合される。いくつかの実施形態では、ポンプシステムは、パルスレスフローポンプを含む。いくつかの実施形態では、ポンプシステムはギアポンプである。いくつかの実施形態では、適切なポンプは、蠕動ポンプである。いくつかの実施形態では、適切なポンプは、渦巻ポンプである。いくつかの実施形態では、ポンプシステムを使用するプロセスは、大規模で実施される。例えば、一部の実施形態では、プロセスは、本明細書に記載されるポンプを使用して、少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇのｍＲＮＡの溶液を、予め形成された脂質ナノ粒子の溶液と混合し、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを生成することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを予め形成された脂質ナノ粒子と混合するプロセスは、少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇの封入ｍＲＮＡを含有する本発明による組成物を提供する。

【0021】

いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液は、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液は、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流量で混合される。

【0022】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で溶液中で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流量で溶液中で混合される。

【0023】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、エタノール中に溶解された脂質とクエン酸緩衝液を混合することによって予め形成された脂質ナノ粒子溶液をまず生成する工程を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、クエン酸緩衝液をｍＲＮＡストック溶液と混合することによってｍＲＮＡ溶液をまず生成する工程を含む。特定の実施形態では、好適なクエン酸緩衝液は、約１０Ｍｍクエン酸塩、約１５０Ｍｍ Ｎａｃｌを含有し、Ｐｈ約４．５である。いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約１ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、または約１００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でｍＲＮＡを含有する。

【0025】

いくつかの実施形態では、クエン酸緩衝液は、約１００～３００ｍｌ／分、３００～６００ｍｌ／分、６００～１２００ｍｌ／分、１２００～２４００ｍｌ／分、２４００～３６００ｍｌ／分、３６００～４８００ｍｌ／分、または４８００～６０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、クエン酸緩衝液は、約２２０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約１２００ｍｌ／分、約２４００ｍｌ／分、約３６００ｍｌ／分、約４８００ｍｌ／分、または約６０００ｍｌ／分の流量で混合される。

【0026】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約１０～３０ｍｌ／分、約３０～６０ｍｌ／分、約６０～１２０ｍｌ／分、約１２０～２４０ｍｌ／分、約２４０～３６０ｍｌ／分、約３６０～４８０ｍｌ／分、または約４８０～６００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液を、約２０ｍｌ／分、約４０ｍｌ／分、約６０ｍｌ／分、約８０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、または約６００ｍｌ／分の流量で混合する。

【0027】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡを含有する水溶液を予め形成された脂質ナノ粒子を含有する水溶液と混合することにより、予め形成された脂質ナノ粒子を用いて調製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する水溶液および／または予め形成された脂質ナノ粒子を含む水溶液は、トレハロース、スクロース、ラクトース、およびマンニトールのうちの一種以上を含むがこれに限定されない薬学的に許容可能な賦形剤を含む水溶液である。

【0028】

いくつかの実施形態では、エタノールなどの非水性溶媒、およびクエン酸塩の一方または両方は、ｍＲＮＡを予め形成された脂質ナノ粒子に添加する間、ｍＲＮＡを含有する溶液、予め形成された脂質ナノ粒子を含有する溶液の一方または両方に存在しない（すなわち、検出可能なレベル未満である）。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液、および予め形成された脂質ナノ粒子を含有する溶液の一方または両方は、ｍＲＮＡの予め形成された脂質ナノ粒子への混合の前に、エタノールのような非水性溶媒、およびクエン酸塩の一方または両方を除去するために交換される緩衝液である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液および予め形成された脂質ナノ粒子を含有する溶液の一方または両方は、ｍＲＮＡの予め形成された脂質ナノ粒子への混合中、除去できないクエン酸塩のみを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含む溶液および予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液の一方または両方は、エタノールなどの除去できない非水性溶媒のみを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の一方または両方と、予め形成された脂質ナノ粒子を含有する溶液は、予め形成された脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡの添加中に存在する、約１０ｍＭ未満（例えば、約９ｍＭ、約８ｍＭ、約７ｍＭ、約６ｍＭ、約５ｍＭ、約４ｍＭ、約３ｍＭ、約２ｍＭ、または約１ｍＭ未満）のクエン酸塩を含有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液と、予め形成された脂質ナノ粒子を含有する溶液の一方または両方が、予め形成された脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡの添加の間に存在する、約２５％未満（例えば、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％未満）のエタノールなどの非水性溶媒を含有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子を含む溶液は、予め形成された脂質ナノ粒子およびｍＲＮＡが混合されてその溶液を形成した後、さらなる下流処理（例えば、緩衝液交換および／またはさらなる精製工程）を必要としない。

【0029】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるプロセスにより生成されたｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、実質的な量の脂質ナノ粒子が予め形成される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）が予め形成される。いくつかの実施形態では、本発明は、精製された脂質ナノ粒子を含む組成物を提供し、精製された脂質ナノ粒子の約９０％より多くが、約１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の個々の粒子サイズを有し、精製された脂質ナノ粒子の約７０％より多くが、それぞれ個々の粒子内にｍＲＮＡを封入する。いくつかの実施形態では、精製された脂質ナノ粒子の約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％をより多くは、約１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の個々の粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、精製された脂質ナノ粒子の実質的にすべては、約１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の個々の粒子サイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くは、５０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべては、５０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くは、８０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべては、８０～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。

【0030】

いくつかの実施形態では、精製された脂質ナノ粒子の約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より多くは、それぞれ個々の粒子内にｍＲＮＡを封入する。いくつかの実施形態では、精製された脂質ナノ粒子の実質的に全ては、それぞれ個々の粒子内にｍＲＮＡを封入する。いくつかの実施形態では、本発明による組成物は、少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇの封入されたｍＲＮＡを含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子は、一種以上のカチオン性脂質、一種以上のヘルパー脂質、および一種以上のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、それぞれ個々の脂質ナノ粒子はまた、一種以上のコレステロール系脂質を含む。いくつかの実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾールベース）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）、Ｎ１ＧＬ、Ｎ２ＧＬ、Ｖ１ＧＬならびにその組み合わせからなる群から選択される。

【0032】

一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、アミノ脂質である。本発明での使用に適したアミノ脂質は、国際公開第２０１７１８０９１７号に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１７１８０９１７号における典型的なアミノ脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、及び化合物１８などの、段落［０７４４］で記載されたものが挙げられる。その他のアミノ脂質には、化合物２、化合物２３、化合物２７、化合物１０、および化合物２０が含まれる。本発明での使用に適したさらなるアミノ脂質には、国際公開第２０１７１１２８６５号に記載されているものが含まれ、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１７１１２８６５号における例示的なアミノ脂質は、式（Ｉ）、（Ｉａｌ）－（Ｉａ６）、（ｌｂ）、（ＩＩ）、（Ｉｌａ）、（ＩＩＩ）、（Ｉｌｉａ）、（ＩＶ）、（１７－１）、（１９－１）、（１９－１１）、および（２０－１）のうちの一つによる化合物と、段落［００１８５］、［００２０１］、［０２７６］の化合物を含む。いくつかの実施形態では、本発明での使用に適したカチオン性脂質は、国際公開第２０１６１１８７２５号に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１６１１８７２５号における典型的なカチオン性脂質は、ＫＬ２２およびＫＬ２５などのものを含む。いくつかの実施形態では、本発明での使用に適したカチオン性脂質は、国際公開第２０１６１１８７２４号に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１６１１８７２５号における典型的なカチオン性脂質としては、ＫＬ１０、１，２－ジグリノレイロキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、及びＫＬ２５などのものが挙げられる。

【0033】

一部の実施形態では、一種以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））から選択される。

【0034】

一部の実施形態では、一種以上のコレステロール系脂質は、コレステロールまたはＰＥＧ化コレステロールである。一部の実施形態では、一種または複数のＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ_６－Ｃ_２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、本発明は、一つ以上の修飾されたヌクレオチドを含有するｍＲＮＡを封入するために使用される。いくつかの実施形態では、一つ以上のヌクレオチドがプソイドウリジンに修飾されている。いくつかの実施形態では、一つ以上のヌクレオチドは、５－メチルシチジンに修飾される。いくつかの実施形態では、本発明は、修飾されていないｍＲＮＡを封入するために使用される。

【0036】

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるプロセスにより生成されたｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子の組成物を被験者に投与することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質生成のためｍＲＮＡを送達する方法を提供し、ｍＲＮＡは、一つ以上の関心対象のタンパク質またはペプチドをコードする。

【0037】

別の態様では、本発明は、脂質ナノ粒子中にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する方法を提供し、この方法はエタノールの使用なしに実施される。いくつかの実施形態では、一種以上のカチオン性脂質、一種以上の非カチオン性脂質、および一種以上のＰＥＧ修飾脂質を含む溶液を、ｍＲＮＡを含む溶液と混合する工程を含む。いくつかの実施形態では、一種以上のカチオン性脂質、一種以上の非カチオン性脂質、および一種以上のＰＥＧ修飾脂質を含む溶液において、一種以上のカチオン性脂質、一種以上の非カチオン性脂質、および一種以上のＰＥＧ修飾脂質の少なくとも一部は、予め形成された脂質ナノ粒子として存在する。いくつかの実施形態では、クエン酸塩を使用することなく、方法はまた実施される。

【0038】

特定の実施形態では、方法は、非水性溶媒を全く使用することなく実施される。いくつかの実施形態では、検出可能なエタノールはなく、および／または検出可能な非水性溶媒もない。いくつかの実施形態では、検出可能なクエン酸塩は存在しない。いくつかの実施形態では、溶液の約２５％未満（例えば、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％未満）で存在するエタノールおよび／または非水溶媒の残留量のみが存在する。いくつかの実施形態では、１０ｍＭ未満（例えば、約９ｍＭ、約８ｍＭ、約７ｍＭ、約６ｍＭ、約５ｍＭ、約４ｍＭ、約３ｍＭ、約２ｍＭ、または約１ｍＭ未満）のクエン酸塩の残量のみが存在する。

【0039】

本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。本出願において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの用語の変化形は、他の添加物、成分、整数、または工程を除外することを意図するものではない。本出願において使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は同意語として用いられている。両方の用語は、当業者によって理解される任意の通常のゆらぎを網羅することを意味する。

【0040】

本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すが、単に例示のために与えられるものであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者には明らかになるであろう。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
脂質ナノ粒子にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する方法であって、
ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子が形成されるように、予め形成された脂質ナノ粒子およびｍＲＮＡを含む溶液を混合することを含む、方法。
（項目２）
予め形成された脂質ナノ粒子およびｍＲＮＡを含む前記溶液が、１０ｍＭ未満のクエン酸塩を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
予め形成された脂質ナノ粒子およびｍＲＮＡを含む前記溶液が、２５％未満の非水性溶媒を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
混合後に、前記脂質ナノ粒子およびｍＲＮＡを周囲温度よりも高い温度に加熱することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ｍＲＮＡおよび／または前記予め形成された脂質ナノ粒子が、前記混合前に周囲温度よりも高い温度に加熱される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記温度が、約３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、もしくは７０℃であるか、またはそれより高い、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記温度が、約２５～７０℃、約３０～７０℃、約３５～７０℃、約４０～７０℃、約４５～７０℃、約５０～７０℃、または約６０～７０℃の範囲である、項目４～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記温度が約６５℃である、項目４～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記予め形成された脂質ナノ粒子が、エタノール中に溶解された脂質を水溶液と混合することによって形成される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記脂質が、一種以上のカチオン性脂質、一種以上のヘルパー脂質、一種以上のコレステロール系脂質、およびＰＥＧ脂質を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記一種以上のカチオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾールベース）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）、およびその組み合わせからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記一種以上のカチオン性脂質がターゲット２４を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記一種以上のカチオン性脂質がＩＣＥを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記一種以上のカチオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１２を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記一種以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記一種以上のＰＥＧ修飾脂質が、Ｃ_６－Ｃ_２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した長さ最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記予め形成された脂質ナノ粒子が、接線流ろ過（ＴＦＦ）プロセスによって精製される、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より多くが、７５～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記精製されたナノ粒子の実質的にすべてが７５～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する、項目１７または１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くが、５０～８０ｎｍの範囲のサイズを有する、項目１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記精製されたナノ粒子の実質的にすべてが７５～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する、項目１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える封入率をもたらす、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
ｍＲＮＡの約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える回収率をもたらす、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記予め形成された脂質ナノ粒子およびｍＲＮＡが、ポンプシステムを使用して混合される、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ポンプシステムが、パルスレスフローポンプを備える、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記ポンプがギアポンプである、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
予め形成された脂質ナノ粒子を含む前記溶液が、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
予め形成された脂質ナノ粒子を含む前記溶液が、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流量で混合される、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記ｍＲＮＡが、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記ｍＲＮＡが、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流量で混合される、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
クエン酸緩衝液をｍＲＮＡストック溶液と混合することによってｍＲＮＡ溶液をまず生成する工程を含む、項目１～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記クエン酸緩衝液が約１０ｍＭのクエン酸塩、約１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、約４．５のｐＨを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記ｍＲＮＡストック溶液が、約１ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の前記ｍＲＮＡを含む、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３４）
前記クエン酸緩衝液が、約１００～３００ｍｌ／分、３００～６００ｍｌ／分、６００～１２００ｍｌ／分、１２００～２４００ｍｌ／分、２４００～３６００ｍｌ／分、３６００～４８００ｍｌ／分、または４８００～６０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される、項目２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記クエン酸緩衝液が、約２２０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約１２００ｍｌ／分、約２４００ｍｌ／分、約３６００ｍｌ／分、約４８００ｍｌ／分、または約６０００ｍｌ／分の流量で混合される、項目２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記ｍＲＮＡストック溶液が、約１０～３０ｍｌ／分、約３０～６０ｍｌ／分、約６０～１２０ｍｌ／分、約１２０～２４０ｍｌ／分、約２４０～３６０ｍｌ／分、約３６０～４８０ｍｌ／分、または約４８０～６００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される、項目２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記ｍＲＮＡストック溶液が、約２０ｍｌ／分、約４０ｍｌ／分、約６０ｍｌ／分、約８０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、または約６００ｍｌ／分の流量で混合される、項目２９～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子がトレハロース溶液中の前記予め形成された脂質ナノ粒子で調製される、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子が、さらなる下流処理を必要としない、項目１～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
項目１～３９のいずれか一項に記載の方法により生成されたｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子の組成物。
（項目４１）
前記ｍＲＮＡが、一個以上の修飾ヌクレオチドを含む、項目１～４０のいずれか一項に記載の方法または組成物。
（項目４２）
前記ｍＲＮＡが修飾されていない、項目１～４１のいずれか一項に記載の方法または組成物。
（項目４３）
前記ナノ粒子が約７５ｎｍ～１５０ｎｍのサイズを有する、項目３９に記載の組成物。
（項目４４）
前記ナノ粒子が、約０．２５未満～０．１６未満のＰｄＩを含む、項目３９に記載の組成物。
（項目４５）
前記投与製剤が、約０．０１６ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの脂質ナノ粒子に封入されているｍＲＮＡの濃度を含む、項目３９に記載の組成物。
（項目４６）
ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質産生のためのｍＲＮＡの送達方法であって
項目１～３９のいずれか一項に記載の方法により生成されたｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子の組成物を対象に投与することを含み、前記ｍＲＮＡが関心対象のタンパク質をコードする、方法。
（項目４７）
ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質産生のためのｍＲＮＡの送達方法であって
項目４０～４５のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。

【図面の簡単な説明】

【0041】

図面は、解説のみを目的とするものであり、限定のためではない。

【0042】

【図1】図１ポンプシステムを使用して、水性緩衝液中に溶解されたｍＲＮＡとエタノール中に溶解された脂質を混合することを含む、例示的な脂質ナノ粒子ｍＲＮＡの封入プロセス（プロセスＡ）の概略図を示す。

【0043】

【図2】図２ポンプシステムを使用して、水性緩衝液中に溶解されたｍＲＮＡと予め形成された空の脂質ナノ粒子を混合することを含む、例示的な脂質ナノ粒子ｍＲＮＡの封入プロセス（プロセスＢ）の概略図を示す。

【0044】

【図3】図３プロセスＡまたはプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子中に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与の２４時間後のＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓中の発現されたヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ｈＯＴＣ）タンパク質（シトルリン産生に関する）の典型的な活性を示す。使用前、プロセスＡおよびプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子は、（ｉ）Ｔ＝０ヵ月（凍結せず新鮮）、または（ｉｉ）Ｔ＝２．５ヶ月間－８０^℃での凍結形態で保存された。

【0045】

【図4】図４異なるポンプの組み合わせを使用したプロセスＡによりまたはプロセスＢにより作成された脂質ナノ粒子製剤中に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与の２４時間後のメスＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓中の発現されたｈＯＴＣタンパク質（シトルリン産生に関する）の典型的な活性を示す。プロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤は、（１）ギアポンプを使用して、（２）蠕動ポンプを使用して、（３）低流量で蠕動ポンプを使用して、および（４）ｍＲＮＡおよび空の未成形の脂質ナノ粒子の異なる流量で蠕動ポンプを使用して調製された。

【0046】

【図5】図５プロセスＡまたはプロセスＢによって生成されたネイキッドｈＡＳＳ１ ｍＲＮＡ（リポフェクタミンを含む）または脂質ナノ粒子で封入されたｈＡＳＳ１ ｍＲＮＡ（リポフェクタミンを含まない）のいずれかでの、トランスフェクションの１６時間後の、２９３Ｔ細胞における典型的なヒトアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）タンパク質発現を示す。

【0047】

【図6】図６異なるカチオン性脂質を使用してプロセスＢにより調製されたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の吸入の２４時間後のラット肺内のヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス受容体（ｈＣＦＴＲ）タンパク質の典型的な免疫組織化学的検出を示す。気管支上皮細胞ならびに肺胞領域の両方でタンパク質が検出された。生理食塩水処置対照ラットの肺と比較して、すべてのｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試験物群で陽性（茶色）染色が観察された。

【0048】

【図7】図７プロセスＢにより調製されたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の吸入の２４時間後のマウス肺中のｈＣＦＴＲタンパク質の免疫組織化学的検出の例を示す。タンパク質は、気管支上皮細胞ならびに肺胞領域の両方で検出された。生理食塩水で処理した対照マウスの肺と比較して、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試験物品群について、陽性（茶色）染色が観察された。

【0049】

【図8】図８プロセスＢにより調製された脂質ナノ粒子に封入されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡの硝子体内投与の２４時間後の、野生型マウスの生物発光画像の例を示す。

【0050】

【図9】図９ポリビニルアルコールで製剤され、プロセスＢによって調製された脂質ナノ粒子で封入されたＦＦＬ ｍＲＮＡを含有する点眼薬の局所適用の２４時間後の、野生型マウスの生物発光画像の例を示す。

【0051】

【図10】図１０プロセスＢにより調製された脂質ナノ粒子中に封入されたヒトＰＡＨ（ｈＰＡＨ）ｍＲＮＡの処置前および後のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ノックアウト（ＫＯ）マウスにおける血清フェニルアラニンレベルの例を示す。単回皮下投与の２４時間後に血清試料を測定した。

【0052】

【図11】図１１プロセスＢにより調製された脂質ナノ粒子で封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回皮下投与の２４時間後のＯＴＣ ＫＯ ｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓における発現ｈＯＴＣタンパク質（シトルリン産生に関する）の活性の例を示す。

【0053】

【図12】図１２プロセスＢにより調製された脂質ナノ粒子で封入されたｈＡＳＳ１ ｍＲＮＡの単回皮下投与の２４時間後のＡＳＳ１ ＫＯマウスの肝臓で測定されたヒトＡＳＳ１タンパク質レベルの例を示す。

【0054】

【図13】図１３プロセスＢにより調製された脂質ナノ粒子で封入されたｈＥＰＯ ｍＲＮＡの異なる用量の単回投与の６時間および２４時間後での、処置されたマウスの血清中の測定されたヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質レベルの例を示す。使用された投与経路は、皮内、皮下、および筋肉内送達であった。

【0055】

【図14】図１４プロセスＡによってまたはプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤に封入されたｈＥＰＯ ｍＲＮＡの単回皮内投与の６時間後および２４時間後の、処置されたマウスの血清中の測定されたｈＥＰＯタンパク質レベルの比較を示す。

【0056】

【図15】図１５プロセスＡによってまたはプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤に封入されたｈＥＰＯ ｍＲＮＡの単回筋肉内投与の６時間後および２４時間後の、処置されたマウスの血清中の測定されたｈＥＰＯタンパク質レベルの比較を示す。

【0057】

【図16】図１６は、アンモニア負荷に参加したＳｐｆ^ａｓｈマウスにおける、投与および検査のスキームの例を示す。

【0058】

【図17】図１７は、ＮＨ４Ｃｌでのアンモニア負荷後、それぞれプロセスＢを介して調製された、異なる用量レベルのｈＯＴＣ ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子での処置後のＳｐｆ^ａｓｈマウスにおける血漿アンモニアレベルの例を示す。

【0059】

【図18】図１８プロセスＡによってまたはプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内投与（すなわち、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１６ｍｇ／ｋｇ）の２４時間後のＳｐｆ^ａｓｈマウス肝臓におけるｈＯＴＣタンパク質発現を示すを含む。

【0060】

【図19】図１９プロセスＡによってまたはプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内投与（すなわち、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１６ｍｇ／ｋｇ）の２４時間後のＯＴＣｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓組織におけるｈＯＴＣ ｍＲＮＡコピー数の比較を示す。

【0061】

【図20】図２０プロセスＡによってまたはプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内投与（すなわち、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、および０．０１６ｍｇ／ｋｇ）の２４時間後のＯＴＣｓｐｆ^ａｓｈマウスの試験されたＲＮＡにおけるｈＯＴＣ ｍＲＮＡコピー数の比較を示す。

【0062】

【図21】図２１野生型マウス（ＷＴ）、未処置のｓｐｆ^ａｓｈマウス（未処置）、ならびにプロセスＢにより製造された１．０ｍｇ／ｋｇのｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与の２４時間（２日目）、４８時間（３日目）、７２時間（４日目）、９６時間（５日目）、８日（８日目）、１１日（１１日目）、および１５日（１５日目）後のｓｐｆ^ａｓｈマウスのそれぞれにおける、アンモニア負荷の対象にされた４０分後の血漿アンモニア結果を示す。

【0063】

【図22】図２２野生型マウス（ＷＴ）、未処置ｓｐｆ^ａｓｈマウス（未処置）、ならびにプロセスＢにより製造された１．０ｍｇ／ｋｇのｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与の２４時間（２日目）、４８時間（３日目）、７２時間（４日目）、９６時間（５日目）、８日（８日目）、１１日（１１日目）、および１５日（１５日目）後のｓｐｆ^ａｓｈマウスのそれぞれにおける、シトルリン産生によって測定されたｈＯＴＣタンパク質活性を示す。

【0064】

【図23】図２３ｓｐｆ^ａｓｈマウス（未処置）、プロセスＢにより産生された１．０ ｍｇ／ｋｇ ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与の２４時間（２日目）、４８時間（３日目）、７２時間（４日目）、９６時間（５日目）、８日（８日目）、１１日（１１日目）、および１５日（１５日目）後のｓｐｈ^ａｓｈマウス、ならびに未処置の野生型マウス（未処置Ｃ５７ＢＬ／６）のぞれそれにおける維持された低レベルの尿オロチン酸産生により測定されたｈＯＴＣタンパク質活性を示す。

【0065】

【図24】図２４プロセスＡによってまたはプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤に封入された、異なる用量レベルのｈＯＴＣ ｍＲＮＡでの、単回静脈内投与の２４時間後のＯＴＣ ｓｐｈ^ａｓｈマウスの肝臓における発現されたｈＯＴＣタンパク質（シトルリン産生に関する）の典型的な活性を示す。

【0066】

【図25】図２５様々な投与レベルでの、プロセスＡによってまたはプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内投与後の、ウェスタンブロットによるマウス肝臓における発現されたｈＯＴＣタンパク質の免疫組織化学的検出を示す。

【0067】

【図26】図２６プロセスＡによって作製されたものと比較した、プロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの０．５ｍｇ／ｋｇ単回静脈内投与の２４時間後のＯＴＣｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓における、発現されたｈＯＴＣタンパク質（シトルリン産生に関する）の例示的な活性を示す。

【0068】

【図27】図２７（ａ）～（ｄ）免疫組織化学染色を介した、プロセスＡによりまたはプロセスＢにより調製されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与の２４時間後の、マウス肝臓組織中のｈＯＴＣタンパク質の免疫組織化学的検出を示す。図２７（ａ）～（ｂ）プロセスＢにより産生されたｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の結果を示す。図２７（ｃ）～（ｄ）プロセスＡにより産生されたｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の結果を示す。

【0069】

【図28】図２８カチオン性脂質としてＨＧＴ ５００１を使用して製剤された、プロセスＡ及びプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。

【0070】

【図29】図２９ＩＣＥをカチオン性脂質として使用して製剤された、プロセスＡおよびプロセスＢによって産生された脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。

【0071】

【図30】図３０ＣＫＫ－Ｅ１２をカチオン性脂質として使用して製剤化された、プロセスＡ及びプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。

【0072】

【図31】図３１カチオン性脂質としてＣ１２－２００を使用して製剤された、プロセスＡ及びプロセスＢにより製造された脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。

【0073】

【図32】図３２カチオン性脂質としてＨＧＴ４００３を使用して製剤された、プロセスＡ及びプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。

【発明を実施するための形態】

【0074】

定義
本発明をより容易に理解するために、いくつかの用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して述べられている。

【0075】

アルキル：本明細書において使用される場合、「アルキル」とは、１～２０個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基のラジカル（「Ｃ_１－２０アルキル」）を指す。一部の実施形態では、アルキル基は、１～３個の炭素原子を有する（Ｃ_１－３アルキル）。Ｃ_１－３アルキル基の例としては、メチル（Ｃ_１）、エチル（（Ｃ_２））、ｎ－プロピル（Ｃ_３）、およびイソプロピル（Ｃ_３）が挙げられる。一部の実施形態では、アルキル基は、８～１２個の炭素原子を有する（Ｃ_８－１２アルキル）。Ｃ_８－１２アルキル基の例としては、限定されないが、ｎ－オクチル（Ｃ_８）、ｎ－ノニル（Ｃ_９）、ｎ－デシル（Ｃ_１０）、ｎ－ウンデシル（Ｃ_１１）、ｎ－ドデシル（Ｃ_１２）などが挙げられる。接頭辞の“ｎ－”（直鎖状）とは、非分枝状アルキル基を指す。たとえば、ｎ－Ｃ_８アルキルとは、－（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３を指し、ｎ－Ｃ_１０アルキルとは、－（ＣＨ_２）_９ＣＨ_３を指すなどである。

【0076】

アミノ酸：本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ_２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態ではアミノ酸は合成アミノ酸であり、一部の実施形態ではアミノ酸はＤ－アミノ酸であり、一部の実施形態ではアミノ酸はＬ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに通常見られる２０個の標準Ｌ－アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸」は、合成して調製されるか天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。本明細書で使用される場合、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、及び／または置換を含むがこれらに限定されない、化学修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチドにカルボキシ末端アミノ酸及び／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基によって修飾され、及び／またはその活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変更することができる他の化学基との置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与する場合がある。アミノ酸は、一つ以上の化学成分（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合といった、一修飾または翻訳後の修飾を含み得る。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指す場合がある。この用語が遊離アミノ酸かまたはペプチドの残基を指すか否かについては、用語が使用される文脈から明らかになるであろう。

【0077】

動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。

【0078】

略または約：本明細書で使用する場合、関心対象の一つ以上の値に適用される「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載された基準値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、特段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、いずれかの方向（より大きいまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の値の範囲を指す。

【0079】

送達：本明細書で使用される場合、用語「送達」は局所送達及び全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質またはペプチドが発現され、標的組織内で保持される状況（「局所分布」もしくは「局所送達」とも称される）、およびｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質またはペプチドが発現され、患者の循環系（例えば、血清）に分泌され、全身に分配され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。

【0080】

有効性：本明細書で使用される場合、用語「有効性」または文法上の相当語句は、関連するタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡの送達に関連する、生物学的に関連するエンドポイントの改善を指す。いくつかの実施形態では、生物学的エンドポイントは、投与後の特定の時点での塩化アンモニウム負荷に対する保護である。

【0081】

封入：本明細書で使用される場合、用語「封入」または文法上の相当語句は、ナノ粒子内に個々のｍＲＮＡ分子を閉じ込めるプロセスを指す。

【0082】

発現：本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡの「発現」は、ペプチド（例えば、抗原）、ポリペプチド、またはタンパク質（例えば、酵素）へのｍＲＮＡの翻訳を指し、また文脈によって示されるように、ペプチド、ポリペプチド、または完全に組み立てられたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾も含みうる。この用途において、用語「発現」及び「産生」ならびに文法的等価物は互換的に使用される。

【0083】

改善、増加または低減：本明細書で使用される場合、用語「改善する」、「増加する」、もしくは「低減する」、または文法上の相当語句は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体での測定値、あるいは本明細書に記載される処置を受けていない対照試料あるいは被験体（または複数の対照試料もしくは被験体）での測定値などのベースラインの測定値に相当する値を示す。「対照試料」は、試験物品を除き、試験試料と同じ条件の対象にされた試料である。「対照被験体」とは、治療を受けている対象と同じ疾患形態を患っており、治療を受けている対象とほぼ同じ年齢の対象のことである。

【0084】

不純物：本明細書で使用される場合、用語「不純物」は、限定された量の液体、気体、または固体内の物質を指し、これは標的物質または化合物の化学組成とは異なる。不純物は混入物とも呼ばれる。

【0085】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。

【0086】

ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞型系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ系の対語として）使用され得る。

【0087】

単離された：本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、（１）最初に生成された際に（自然界において及び／または実験的な環境においてにかかわらず）会合した成分の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）人の手によって生成、調製、及び／もしくは製造された、物質及び／または要素を意味する。単離された物質及び／または要素は、それらが最初に会合した他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の構成成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質及び／または要素のパーセント純度の計算は、賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）を含むべきではない。

【0088】

局所分布または局所送達：本明細書において使用される場合、「局所分布」、「局所送達」またはその文法的に均等な用語は、組織特異的な送達または分布を指す。典型的には、局所分布または局所送達は、ｍＲＮＡにコードされるペプチドまたはタンパク質（たとえば酵素）が、細胞内でまたは患者の循環系への侵入を無効にする限られた分泌物と共に、翻訳および発現されることを必要とする。

【0089】

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、少なくとも一つのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾されたものと修飾されていないＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、一つ以上のコード領域及び非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、天然供給源から精製されてもよく、組換え発現系を用いて産生されてもよく、また任意選択的に精製、化学合成などをされてもよい。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾などを有する類似体といった、ヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段に示されない限り、５’から３’の方向に提示される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、プソイドウリジン、および５－メチルシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｂａｓｅ）；修飾された糖類（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；ならびに／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）を含む。

【0090】

核酸：本明細書で用いられる場合、用語「核酸」は、最も広い意味において、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を意味する。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る化合物及び／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を意味する。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を意味する。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖ＤＮＡ及び／または二本鎖ＤＮＡ及び／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。

【0091】

患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物が、例えば、実験、診断、予防、美容、及び／または治療目的のために投与され得る任意の生物体を意味する。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトなどの哺乳類）が含まれる。一部の実施形態では、患者はヒトである。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。

【0092】

医薬的に許容される：本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的な利益／リスクの比率に相応で、ヒト及び動物の組織に接触させて使用することに適した物質を指す。

【0093】

薬学的に許容される塩：薬学的に許容される塩は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１－１９において薬学的に許容される塩について詳述している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、好適な無機酸及び有機酸ならびに無機塩基及び有機塩基に由来するものを含む。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸などの無機酸を用いて、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸を用いて、あるいはイオン交換などの当該技術分野において使用される他の方法を用いて形成されたアミノ基の塩がある。他の薬学的に許容される塩として、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩として、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、及びＮ^＋（Ｃ_１－４アルキル）_４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適宜、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成される非毒性アンモニウムカチオン、四級アンモニウムカチオン、及びアミンカチオンが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な求電子物質（例えば、ハロゲン化アルキル）を使用して四級化アルキル化アミノ塩を形成する、アミンの四級化から形成される塩が含まれる。

【0094】

効力：本明細書で使用される場合、用語「効力」または文法上の相当語句は、ｍＲＮＡがコードするタンパク質もしくはペプチドの発現、および／または得られた生物学的効果を指す。

【0095】

塩：本明細書で使用される場合、用語「塩」は、酸と塩基との間の中和反応から生じるか、または生じ得るイオン化合物を意味する。

【0096】

全身分布または全身送達：本明細書で使用される場合、用語「全身分布」、「全身送達」、または文法的等価物は、全身もしくは生物体全体に影響を及ぼす送達または分布のメカニズムまたはアプローチを意味する。典型的には、全身分布または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して成し遂げられる。「局所分布または局所送達」の定義と比較される。

【0097】

対象：本明細書で使用する「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を意味する。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に来院するヒトを意味する。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と交換可能に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれに感受性を有するが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。

【0098】

実質的：本明細書で使用される場合、用語「実質的」は、関心対象の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的な現象が、完了すること及び／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的」は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。

【0099】

標的組織：本明細書で使用される場合、用語「標的組織」は、治療されるべき疾患の影響を受ける任意の組織を意味する。一部の実施形態では、標的組織には、疾患関連病態、症状、または特徴を現す組織が含まれる。

【0100】

治療：本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」または「治療している」は、ある特定の疾患、障害、及び／または症状の一つ以上の徴候または特徴を、部分的にまたは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延する、その重篤度を低減する、及び／またはその発症率を低減するために使用する任意の方法を意味する。疾患の症状を提示していない対象、及び／または疾患の初期の症状のみを提示している対象に対して、該疾患に関連する病態を発症させる危険性を減らすために、治療が行われる場合もある。

【0101】

収率：本明細書で使用される場合、用語「収率」は、開始材料としての総ｍＲＮＡと比較した、封入後に回収されたｍＲＮＡの割合を指す。いくつかの実施形態では、用語「回収」は、用語「収率」と互換的に使用される。

【0102】

詳細な説明
本発明は、脂質ナノ粒子製剤およびｍＲＮＡ封入のための改善されたプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、予め形成された脂質ナノ粒子に脂質を形成する（すなわち、ｍＲＮＡの不存在下で形成される）工程、次に、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと組み合わせる工程を含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒子に封入するプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、新規製剤プロセスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、脂質ナノ粒子を予め成形する工程なしに（例えば、脂質をｍＲＮＡと直接組み合わせる工程）調製された同一のｍＲＮＡ製剤と比較して潜在的により良好な忍容性を有する、より高い効力（ペプチドまたはタンパク質の発現）とより高い有効性（生物学的に関連性のあるエンドポイントの改善）を有するｍＲＮＡ製剤をもたらす。こうした製剤の効力および／または有効性が高いほど、薬物製品のより低い用量および／またはより少ない頻度の投与が提供されうる。いくつかの実施形態では、本発明は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、およびＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む改善された脂質製剤を特徴とする。

【0103】

いくつかの実施形態では、本脂質ナノ粒子製剤および製造方法について得られた封入効率は、約９０％である。核酸の送達のため、高い封入効率を達成することは、薬物物質の保護を達成し、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性の喪失を減少させるために重要である。さらに、本発明の新規な方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤についての驚くべき結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察される有意に高いトランスフェクション効率である。

【0104】

本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に説明される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：

【0105】

本発明は、任意のｍＲＮＡを封入するために使用されてもよい。ｍＲＮＡは、ＤＮＡからリボソームに情報を運ぶＲＮＡのタイプと一般的に考えられる。典型的には、真核生物において、ｍＲＮＡ処理は、５’末端に「キャップ」を付加すること、および３’末端の「尾部」に不可することを含む。典型的なキャップは、７－メチルグアノシンキャップであり、これは最初に転写されたヌクレオチドに結合した５’－５’－三リン酸塩を介して連結されたグアノシンである。キャップの存在は、大半の真核生物細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を付与するのに重要である。尾部の付加は、典型的にはポリアデニル化現象であり、これによりポリアデニリル部分がｍＲＮＡ分子の３’末端に加えられる。この「尾部」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つ。メッセンジャーＲＮＡは、タンパク質を構成する一連のアミノ酸にリボソームによって翻訳される。

【0106】

ｍＲＮＡは、様々な公知の方法のいずれかに従い合成することができる。たとえば本発明に従うｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。簡潔に述べると、ＩＶＴは多くの場合、プロモーターを含む直線状または環状のＤＮＡ鋳型、一群のリボヌクレオチド三リン酸塩、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、ならびに／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。厳密な条件は具体的なアプリケーションに従い変化するであろう。

【0107】

いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたｍＲＮＡは、製剤および封入前に精製されて、ｍＲＮＡ合成中に使用された様々な酵素および他の試薬を含む望ましくない不純物が除去されてもよい。

【0108】

本発明は、さまざまな長さのｍＲＮＡを製剤し、封入するために使用されうる。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ長より長いｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたｍＲＮＡが製剤され、封入され得る。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、長さ約１～２０ｋｂ、約１～１５ｋｂ、約１～１０ｋｂ、約５～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、約５～１２ｋｂ、約５～１０ｋｂ、約８～２０ｋｂ、または約８～１５ｋｂの範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたｍＲＮＡが製剤され、封入され得る。

【0109】

本発明は、修飾されていないｍＲＮＡ、または一般的に安定性を強化する一つ以上の修飾を含むｍＲＮＡを製剤し、封入するために使用されうる。いくつかの実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸塩骨格、ならびに５’および／または３’非翻訳領域から選択される。

【0110】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。本発明による修飾ｍＲＮＡは、たとえば骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、限定されないが、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））もしくはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含む天然で生じるヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成されてもよく、ならびにたとえば１－メチルアデニン、２－メチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、プソイドウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－プソイドウラシル、キューオシン、ベータ－Ｄ－マンノシル－キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、ならびにホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン、プソイドウリジン、５－メチルシチジンおよびイノシンなどのプリン類ならびにピリミジン類の修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として合成されてもよい。こうした類似体の調製は、米国特許第４，３７３，０７１号、同第４，４０１，７９６号、同第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、同第５，０４７，５２４号、同第５，１３２，４１８号、同第５，１５３，３１９号、第５，２６２，５３０号および第５，７００，６４２号（その開示は参照によりその全範囲において本明細書に含まれる）から当業者に公知である。

【0111】

ｍＲＮＡ合成には、５’末端への「キャップ」及び３’末端への「テール」の付加が含まれるのが典型的である。キャップの存在は、大半の真核生物細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を付与するのに重要である。「テール」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つものである。

【0112】

したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去して２つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’５’５三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７－窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。２’－Ｏ－メチル化は、７－メチルグアノシン三リン酸塩残基の後の第一の塩基および／または第二の塩基で生じうる。キャップ構造の例には、ｍ７ＧｐｐｐＮｐ－ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐ－ＲＮＡおよびｍ７ＧｐｐｐＮｍｐＮｍｐ－ＲＮＡ（式中、ｍは２’－Ｏ－メチル残基を示す）が含まれるが、これに限定されない。

【0113】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす一つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０～５００のヌクレオチドであり得る。

【0114】

一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つ以上の結合部位のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ約５０～５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。

【0115】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応からもたらされたｍＲＮＡが、一部の実施形態で望ましい一方、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生されたｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの他の供給源が、本発明の範囲内であると意図される。

【0116】

本発明は、様々なタンパク質をコードするｍＲＮＡを製剤し、封入するために使用されうる。本発明に適したｍＲＮＡの非限定的な例には、脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス受容体（ＣＦＴＲ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）をコードするｍＲＮＡが含まれる。本明細書に開示されるｍＲＮＡ配列の例を以下に挙げる：
コドン最適化ヒトＯＴＣコード配列
AUGCUGUUCAACCUUCGGAUCUUGCUGAACAACGCUGCGUUCCGGAAUGGUCACAACUUCAUGGUCCGGAACUUCAGAUGCGGCCAGCCGCUCCAGAACAAGGUGCAGCUCAAGGGGAGGGACCUCCUCACCCUGAAAAACUUCACCGGAGAAGAGAUCAAGUACAUGCUGUGGCUGUCAGCCGACCUCAAAUUCCGGAUCAAGCAGAAGGGCGAAUACCUUCCUUUGCUGCAGGGAAAGUCCCUGGGGAUGAUCUUCGAGAAGCGCAGCACUCGCACUAGACUGUCAACUGAAACCGGCUUCGCGCUGCUGGGAGGACACCCCUGCUUCCUGACCACCCAAGAUAUCCAUCUGGGUGUGAACGAAUCCCUCACCGACACAGCGCGGGUGCUGUCGUCCAUGGCAGACGCGGUCCUCGCCCGCGUGUACAAGCAGUCUGAUCUGGACACUCUGGCCAAGGAAGCCUCCAUUCCUAUCAUUAAUGGAUUGUCCGACCUCUACCAUCCCAUCCAGAUUCUGGCCGAUUAUCUGACUCUGCAAGAACAUUACAGCUCCCUGAAGGGGCUUACCCUUUCGUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUUCUGCACAGCAUUAUGAUGAGCGCUGCCAAGUUUGGAAUGCACCUCCAAGCAGCGACCCCGAAGGGAUACGAGCCAGACGCCUCCGUGACGAAGCUGGCUGAGCAGUACGCCAAGGAGAACGGCACUAAGCUGCUGCUCACCAACGACCCUCUCGAAGCCGCCCACGGUGGCAACGUGCUGAUCACCGAUACCUGGAUCUCCAUGGGACAGGAGGAGGAAAAGAAGAAGCGCCUGCAAGCAUUUCAGGGGUACCAGGUGACUAUGAAAACCGCCAAGGUCGCCGCCUCGGACUGGACCUUCUUGCACUGUCUGCCCAGAAAGCCCGAAGAGGUGGACGACGAGGUGUUCUACAGCCCGCGGUCGCUGGUCUUUCCGGAGGCCGAAAACAGGAAGUGGACUAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCCCUGCUGACCGAUUACUCCCCGCAGCUGCAGAAACCAAAGUUCUGA（配列番号１）
コドン最適化ヒトＡＳＳ１コード配列
AUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGA（配列番号２）
コドン最適化ヒトＣＦＴＲコード配列
AUGCAACGCUCUCCUCUUGAAAAGGCCUCGGUGGUGUCCAAGCUCUUCUUCUCGUGGACUAGACCCAUCCUGAGAAAGGGGUACAGACAGCGCUUGGAGCUGUCCGAUAUCUAUCAAAUCCCUUCCGUGGACUCCGCGGACAACCUGUCCGAGAAGCUCGAGAGAGAAUGGGACAGAGAACUCGCCUCAAAGAAGAACCCGAAGCUGAUUAAUGCGCUUAGGCGGUGCUUUUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGCAUCUUCCUCUACCUGGGAGAGGUCACCAAGGCCGUGCAGCCCCUGUUGCUGGGACGGAUUAUUGCCUCCUACGACCCCGACAACAAGGAAGAAAGAAGCAUCGCUAUCUACUUGGGCAUCGGUCUGUGCCUGCUUUUCAUCGUCCGGACCCUCUUGUUGCAUCCUGCUAUUUUCGGCCUGCAUCACAUUGGCAUGCAGAUGAGAAUUGCCAUGUUUUCCCUGAUCUACAAGAAAACUCUGAAGCUCUCGAGCCGCGUGCUUGACAAGAUUUCCAUCGGCCAGCUCGUGUCCCUGCUCUCCAACAAUCUGAACAAGUUCGACGAGGGCCUCGCCCUGGCCCACUUCGUGUGGAUCGCCCCUCUGCAAGUGGCGCUUCUGAUGGGCCUGAUCUGGGAGCUGCUGCAAGCCUCGGCAUUCUGUGGGCUUGGAUUCCUGAUCGUGCUGGCACUGUUCCAGGCCGGACUGGGGCGGAUGAUGAUGAAGUACAGGGACCAGAGAGCCGGAAAGAUUUCCGAACGGCUGGUGAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCAGUGAAGGCCUACUGCUGGGAAGAGGCCAUGGAAAAGAUGAUUGAAAACCUCCGGCAAACCGAGCUGAAGCUGACCCGCAAGGCCGCUUACGUGCGCUAUUUCAACUCGUCCGCUUUCUUCUUCUCCGGGUUCUUCGUGGUGUUUCUCUCCGUGCUCCCCUACGCCCUGAUUAAGGGAAUCAUCCUCAGGAAGAUCUUCACCACCAUUUCCUUCUGUAUCGUGCUCCGCAUGGCCGUGACCCGGCAGUUCCCAUGGGCCGUGCAGACUUGGUACGACUCCCUGGGAGCCAUUAACAAGAUCCAGGACUUCCUUCAAAAGCAGGAGUACAAGACCCUCGAGUACAACCUGACUACUACCGAGGUCGUGAUGGAAAACGUCACCGCCUUUUGGGAGGAGGGAUUUGGCGAACUGUUCGAGAAGGCCAAGCAGAACAACAACAACCGCAAGACCUCGAACGGUGACGACUCCCUCUUCUUUUCAAACUUCAGCCUGCUCGGGACGCCCGUGCUGAAGGACAUUAACUUCAAGAUCGAAAGAGGACAGCUCCUGGCGGUGGCCGGAUCGACCGGAGCCGGAAAGACUUCCCUGCUGAUGGUGAUCAUGGGAGAGCUUGAACCUAGCGAGGGAAAGAUCAAGCACUCCGGCCGCAUCAGCUUCUGUAGCCAGUUUUCCUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAGGAAAACAUCAUCUUCGGCGUGUCCUACGAUGAAUACCGCUACCGGUCCGUGAUCAAAGCCUGCCAGCUGGAAGAGGAUAUUUCAAAGUUCGCGGAGAAAGAUAACAUCGUGCUGGGCGAAGGGGGUAUUACCUUGUCGGGGGGCCAGCGGGCUAGAAUCUCGCUGGCCAGAGCCGUGUAUAAGGACGCCGACCUGUAUCUCCUGGACUCCCCCUUCGGAUACCUGGACGUCCUGACCGAAAAGGAGAUCUUCGAAUCGUGCGUGUGCAAGCUGAUGGCUAACAAGACUCGCAUCCUCGUGACCUCCAAAAUGGAGCACCUGAAGAAGGCAGACAAGAUUCUGAUUCUGCAUGAGGGGUCCUCCUACUUUUACGGCACCUUCUCGGAGUUGCAGAACUUGCAGCCCGACUUCUCAUCGAAGCUGAUGGGUUGCGACAGCUUCGACCAGUUCUCCGCCGAAAGAAGGAACUCGAUCCUGACGGAAACCUUGCACCGCUUCUCUUUGGAAGGCGACGCCCCUGUGUCAUGGACCGAGACUAAGAAGCAGAGCUUCAAGCAGACCGGGGAAUUCGGCGAAAAGAGGAAGAACAGCAUCUUGAACCCCAUUAACUCCAUCCGCAAGUUCUCAAUCGUGCAAAAGACGCCACUGCAGAUGAACGGCAUUGAGGAGGACUCCGACGAACCCCUUGAGAGGCGCCUGUCCCUGGUGCCGGACAGCGAGCAGGGAGAAGCCAUCCUGCCUCGGAUUUCCGUGAUCUCCACUGGUCCGACGCUCCAAGCCCGGCGGCGGCAGUCCGUGCUGAACCUGAUGACCCACAGCGUGAACCAGGGCCAAAACAUUCACCGCAAGACUACCGCAUCCACCCGGAAAGUGUCCCUGGCACCUCAAGCGAAUCUUACCGAGCUCGACAUCUACUCCCGGAGACUGUCGCAGGAAACCGGGCUCGAAAUUUCCGAAGAAAUCAACGAGGAGGAUCUGAAAGAGUGCUUCUUCGACGAUAUGGAGUCGAUACCCGCCGUGACGACUUGGAACACUUAUCUGCGGUACAUCACUGUGCACAAGUCAUUGAUCUUCGUGCUGAUUUGGUGCCUGGUGAUUUUCCUGGCCGAGGUCGCGGCCUCACUGGUGGUGCUCUGGCUGUUGGGAAACACGCCUCUGCAAGACAAGGGAAACUCCACGCACUCGAGAAACAACAGCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCCACCUCCUCUUAUUACGUGUUCUACAUCUACGUCGGAGUGGCGGAUACCCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCAGAGGACUGCCGCUGGUCCACACCUUGAUCACCGUCAGCAAGAUUCUUCACCACAAGAUGUUGCAUAGCGUGCUGCAGGCCCCCAUGUCCACCCUCAACACUCUGAAGGCCGGAGGCAUUCUGAACAGAUUCUCCAAGGACAUCGCUAUCCUGGACGAUCUCCUGCCGCUUACCAUCUUUGACUUCAUCCAGCUGCUGCUGAUCGUGAUUGGAGCAAUCGCAGUGGUGGCGGUGCUGCAGCCUUACAUUUUCGUGGCCACUGUGCCGGUCAUUGUGGCGUUCAUCAUGCUGCGGGCCUACUUCCUCCAAACCAGCCAGCAGCUGAAGCAACUGGAAUCCGAGGGACGAUCCCCCAUCUUCACUCACCUUGUGACGUCGUUGAAGGGACUGUGGACCCUCCGGGCUUUCGGACGGCAGCCCUACUUCGAAACCCUCUUCCACAAGGCCCUGAACCUCCACACCGCCAAUUGGUUCCUGUACCUGUCCACCCUGCGGUGGUUCCAGAUGCGCAUCGAGAUGAUUUUCGUCAUCUUCUUCAUCGCGGUCACAUUCAUCAGCAUCCUGACUACCGGAGAGGGAGAGGGACGGGUCGGAAUAAUCCUGACCCUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACCCUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUCGACGUGGACAGCCUGAUGCGAAGCGUCAGCCGCGUGUUCAAGUUCAUCGACAUGCCUACUGAGGGAAAACCCACUAAGUCCACUAAGCCCUACAAAAAUGGCCAGCUGAGCAAGGUCAUGAUCAUCGAAAACUCCCACGUGAAGAAGGACGAUAUUUGGCCCUCCGGAGGUCAAAUGACCGUGAAGGACCUGACCGCAAAGUACACCGAGGGAGGAAACGCCAUUCUCGAAAACAUCAGCUUCUCCAUUUCGCCGGGACAGCGGGUCGGCCUUCUCGGGCGGACCGGUUCCGGGAAGUCAACUCUGCUGUCGGCUUUCCUCCGGCUGCUGAAUACCGAGGGGGAAAUCCAAAUUGACGGCGUGUCUUGGGAUUCCAUUACUCUGCAGCAGUGGCGGAAGGCCUUCGGCGUGAUCCCCCAGAAGGUGUUCAUCUUCUCGGGUACCUUCCGGAAGAACCUGGAUCCUUACGAGCAGUGGAGCGACCAAGAAAUCUGGAAGGUCGCCGACGAGGUCGGCCUGCGCUCCGUGAUUGAACAAUUUCCUGGAAAGCUGGACUUCGUGCUCGUCGACGGGGGAUGUGUCCUGUCGCACGGACAUAAGCAGCUCAUGUGCCUCGCACGGUCCGUGCUCUCCAAGGCCAAGAUUCUGCUGCUGGACGAACCUUCGGCCCACCUGGAUCCGGUCACCUACCAGAUCAUCAGGAGGACCCUGAAGCAGGCCUUUGCCGAUUGCACCGUGAUUCUCUGCGAGCACCGCAUCGAGGCCAUGCUGGAGUGCCAGCAGUUCCUGGUCAUCGAGGAGAACAAGGUCCGCCAAUACGACUCCAUUCAAAAGCUCCUCAACGAGCGGUCGCUGUUCAGACAAGCUAUUUCACCGUCCGAUAGAGUGAAGCUCUUCCCGCAUCGGAACAGCUCAAAGUGCAAAUCGAAGCCGCAGAUCGCAGCCUUGAAGGAAGAGACUGAGGAAGAGGUGCAGGACACCCGGCUUUAA（配列番号３）
コドン最適化ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列の比較
AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA（配列番号４）
コドン最適化ヒトＰＡＨコード配列
AUGAGCACCGCCGUGCUGGAGAACCCCGGCCUGGGCCGCAAGCUGAGCGACUUCGGCCAGGAGACCAGCUACAUCGAGGACAACUGCAACCAGAACGGCGCCAUCAGCCUGAUCUUCAGCCUGAAGGAGGAGGUGGGCGCCCUGGCCAAGGUGCUGCGCCUGUUCGAGGAGAACGACGUGAACCUGACCCACAUCGAGAGCCGCCCCAGCCGCCUGAAGAAGGACGAGUACGAGUUCUUCACCCACCUGGACAAGCGCAGCCUGCCCGCCCUGACCAACAUCAUCAAGAUCCUGCGCCACGACAUCGGCGCCACCGUGCACGAGCUGAGCCGCGACAAGAAGAAGGACACCGUGCCCUGGUUCCCCCGCACCAUCCAGGAGCUGGACCGCUUCGCCAACCAGAUCCUGAGCUACGGCGCCGAGCUGGACGCCGACCACCCCGGCUUCAAGGACCCCGUGUACCGCGCCCGCCGCAAGCAGUUCGCCGACAUCGCCUACAACUACCGCCACGGCCAGCCCAUCCCCCGCGUGGAGUACAUGGAGGAGGAGAAGAAGACCUGGGGCACCGUGUUCAAGACCCUGAAGAGCCUGUACAAGACCCACGCCUGCUACGAGUACAACCACAUCUUCCCCCUGCUGGAGAAGUACUGCGGCUUCCACGAGGACAACAUCCCCCAGCUGGAGGACGUGAGCCAGUUCCUGCAGACCUGCACCGGCUUCCGCCUGCGCCCCGUGGCCGGCCUGCUGAGCAGCCGCGACUUCCUGGGCGGCCUGGCCUUCCGCGUGUUCCACUGCACCCAGUACAUCCGCCACGGCAGCAAGCCCAUGUACACCCCCGAGCCCGACAUCUGCCACGAGCUGCUGGGCCACGUGCCCCUGUUCAGCGACCGCAGCUUCGCCCAGUUCAGCCAGGAGAUCGGCCUGGCCAGCCUGGGCGCCCCCGACGAGUACAUCGAGAAGCUGGCCACCAUCUACUGGUUCACCGUGGAGUUCGGCCUGUGCAAGCAGGGCGACAGCAUCAAGGCCUACGGCGCCGGCCUGCUGAGCAGCUUCGGCGAGCUGCAGUACUGCCUGAGCGAGAAGCCCAAGCUGCUGCCCCUGGAGCUGGAGAAGACCGCCAUCCAGAACUACACCGUGACCGAGUUCCAGCCCCUGUACUACGUGGCCGAGAGCUUCAACGACGCCAAGGAGAAGGUGCGCAACUUCGCCGCCACCAUCCCCCGCCCCUUCAGCGUGCGCUACGACCCCUACACCCAGCGCAUCGAGGUGCUGGACAACACCCAGCAGCUGAAGAUCCUGGCCGACAGCAUCAACAGCGAGAUCGGCAUCCUGUGCAGCGCCCUGCAGAAGAUCAAGUAA
（配列番号５）

【0117】

一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のヌクレオチド配列を有する。１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４．いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号と同一のヌクレオチド配列を含む。１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４．
ｍＲＮＡ溶液

【0118】

ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入されうるように、脂質溶液と混合されるべき溶液で提供されうる。適切なｍＲＮＡ溶液は、様々な濃度で封入されるべきｍＲＮＡを含む任意の水溶液であってもよい。例えば、適切なｍＲＮＡ溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌより高い濃度でｍＲＮＡを含有してもよい。いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約０．０１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．２～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．３～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．４～０．７ｍｇ／ｍｌ、または０．５～０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でｍＲＮＡを含有してもよい。いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、最高約５．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、または０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でｍＲＮＡを含有してもよい。

【0119】

典型的には、適切なｍＲＮＡ溶液は、緩衝剤および／または塩も含みうる。一般に、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムを含みうる。いくつかの実施形態では、緩衝剤の適切な濃度は、約０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．５ｍＭ～９０ｍＭ、１．０ｍＭ～８０ｍＭ、２ｍＭ～７０ｍＭ、３ｍＭ～６０ｍＭ、４ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～４０ｍＭ、６ｍＭ～３０ｍＭ、７ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～１５ｍＭ、または９～１２ｍＭの範囲でありうる。いくつかの実施形態では、緩衝剤の適切な濃度は、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭ以上である。

【0120】

例示的な塩には、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムが含まれうる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中の塩の適切な濃度は、約１ｍＭ～５００ｍＭ、５ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５ｍＭ～３００ｍＭ、２０ｍＭ～２５０ｍＭ、３０ｍＭ～２００ｍＭ、４０ｍＭ～１９０ｍＭ、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、５０ｍＭ～１７０ｍＭ、５０ｍＭ～１６０ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、または５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲でありうる。適切なｍＲＮＡ溶液中の塩濃度は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭ以上である。

【0121】

いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約３．５～６．５、３．５～６．０、３．５～５．５、３．５～５．０、３．５～４．５、４．０～５．５、４．０～５．０、４．０～４．９、４．０～４．８、４．０～４．７、４．０～４．６、または４．０～４．５の範囲のｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約３．５、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．３、及び６．５以下のｐＨを有していてもよい。

【0122】

本発明に適したｍＲＮＡ溶液を調製するために、様々な方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載される緩衝液溶液中に直接溶解されてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、封入のために脂質溶液と混合する前に、ｍＲＮＡストック溶液を緩衝液と混合することにより生成されうる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、封入のために脂質溶液と混合する直前に、ｍＲＮＡストック溶液をバッファ溶液と混合することにより生成され得る。いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、または５．０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で水中にｍＲＮＡを含有してもよい。

【0123】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、ポンプを使用して緩衝液と混合される。例示的ポンプとしては、ギアポンプ、蠕動ポンプ、および遠心ポンプが挙げられるがこれらに限定されない。

【0124】

典型的には、緩衝溶液は、ｍＲＮＡストック溶液のものよりも速い速度で混合される。例えば、緩衝溶液は、ｍＲＮＡストック溶液の速度よりも少なくとも１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×または２０×の速度で混合されてもよい。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、約１００～６０００ｍｌ／分（例えば、約１００～３００ｍｌ／分、３００～６００ｍｌ／分、６００～１２００ｍｌ／分、１２００～２４００ｍｌ／分、２４００～３６００ｍｌ／分、３６００～４８００ｍｌ／分、４８００～６０００ｍｌ／分、または６０～４２０ｍｌ／分）の流量で混合される。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、約６０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、１４０ｍｌ／分、１８０ｍｌ／分、２２０ｍｌ／分、２６０ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、３４０ｍｌ／分、３８０ｍｌ／分、４２０ｍｌ／分、４８０ｍｌ／分、５４０ｍｌ／分、６００ｍｌ／分、１２００ｍｌ／分、２４００ｍｌ／分、３６００ｍｌ／分、４８００ｍｌ／分、または６０００ｍｌ／分以上の流量で混合される。

【0125】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約１０～６００ｍｌ／分（例えば、約５～５０ｍｌ／分、約１０～３０ｍｌ／分、約３０～６０ｍｌ／分、約６０～１２０ｍｌ／分、約１２０～２４０ｍｌ／分、約２４０～３６０ｍｌ／分、約３６０～４８０ｍｌ／分、または約４８０～６００ｍｌ／分）の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液を、約５ｍｌ／分、１０ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、２０ｍｌ／分、２５ｍｌ／分、３０ｍｌ／分、３５ｍｌ／分、４０ｍｌ／分、４５ｍｌ／分、５０ｍｌ／分、６０ｍｌ／分、８０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、２００ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、４００ｍｌ／分、５００ｍｌ／分、または６００ｍｌ／分以上の流量で混合する。
脂質溶液

【0126】

本発明によれば、脂質溶液は、ｍＲＮＡの封入のために脂質ナノ粒子を形成するのに適切な脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液はエタノール系である。例えば、適切な脂質溶液は、純エタノール（すなわち、１００％エタノール）に溶解した所望の脂質の混合物を含みうる。別の実施形態では、好適な脂質溶液はイソプロピルアルコール系である。別の実施形態では、好適な脂質溶液はジメチルスルホキシドベースである。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、エタノール、イソプロピルアルコール、およびジメチルスルホキシドを含むがこれに限定されない適切な溶媒の混合物である。

【0127】

適切な脂質溶液は、様々な濃度で望ましい脂質の混合物を含みうる。例えば、適切な脂質溶液は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、７．０ｍｇ／ｍｌ、８．０ｍｇ／ｍｌ、９．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌ以上の総濃度の所望の脂質の混合物を含みうる。いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液は、約０．１～１００ｍｇ／ｍｌ、０．５～９０ｍｇ／ｍｌ、１．０～８０ｍｇ／ｍｌ、１．０～７０ｍｇ／ｍｌ、１．０～６０ｍｇ／ｍｌ、１．０～５０ｍｇ／ｍｌ、１．０～４０ｍｇ／ｍｌ、１．０～３０ｍｇ／ｍｌ、１．０～２０ｍｇ／ｍｌ、１．０～１５ｍｇ／ｍｌ、１．０～１０ｍｇ／ｍｌ、１．０～９ｍｇ／ｍｌ、１．０～８ｍｇ／ｍｌ、１．０～７ｍｇ／ｍｌ、１．０～６ｍｇ／ｍ、または１．０～５ｍｇ／ｍｌの範囲の総濃度の所望の脂質を含有してもよい。いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液は、最高約１００ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または１０ｍｇ／ｍｌの総濃度の所望の脂質の混合物を含有してもよい。

【0128】

任意の望ましい脂質は、ｍＲＮＡの封入に適した任意の比で混合されうる。いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／もしくはコレステロール脂質）ならびに／またはＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液は、一つ以上のカチオン性脂質、一種以上のヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）ならびに一種以上のＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。
カチオン性脂質

【0129】

本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法で使用するのに特に好適なカチオン性脂質は、国際特許公開第２０１０／０５３５７２号（具体的には、段落［００２２５］に記載されているＣ１２－２００）及び国際公開第２０１２／１７０９３０号に記載されているものを含み、その両方の文献は、参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法に適したカチオン性脂質は、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－ｌ－アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００２）などの、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたイオン化可能なカチオン性脂質を含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法に適したカチオン性脂質は、３，６－ビス（４－（ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）－２－ヒドロキシオクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン（ＯＦ－０２）などのカチオン性脂質を含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）などの名称「核酸の送達のための生分解性脂質」の国際公開第２０１５／１８４２５６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるカチオン性脂質を含む。

【0132】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、名称「メッセンジャーＲＮＡの送達のための脂質製剤」の国際公開第２０１３／０６３４６８号と米国仮出願に記載されるカチオン性脂質を含み、その両方の文献は、参照により本明細書に援用される。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ－ｃ１－ａの化合物を含む：

【化1】

またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、
各Ｒ^２は独立して水素またはＣ_１－３アルキルであり；
各ｑは独立して２～６であり；
各Ｒ’は独立して水素またはＣ_１－３アルキルであり；
各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８－１２アルキルである。

【0133】

一部の実施形態では、各Ｒ^２は独立して水素、メチル、またはエチルである。一部の実施形態では、各Ｒ^２は独立して水素またはメチルである。一部の実施形態では、各Ｒ^２は水素である。

【0134】

一部の実施形態では、各ｑは独立して３～６である。一部の実施形態では、各ｑは独立して３～５である。一部の実施形態では、各ｑは４である。

【0135】

一部の実施形態では、各Ｒ’は独立して水素、メチル、またはエチルである。一部の実施形態では、各Ｒ’は独立して水素またはメチルである。一部の実施形態では、各Ｒ’は独立して水素である。

【0136】

一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８－１２アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してｎ－Ｃ_８－１２アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_９－１１アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してｎ－Ｃ_９－１１アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_１０アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してｎ－Ｃ_１０アルキルである。

【0137】

一部の実施形態では、各Ｒ^２は独立して水素またはメチルであり、各ｑは独立して３～５であり、各Ｒ’は独立して水素またはメチルであり、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８－１２アルキルである。

【0138】

一部の実施形態では、各Ｒ^２は水素であり、各ｑは独立して３～５であり、各Ｒ’は水素であり、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８－１２アルキルである。

【0139】

一部の実施形態では、各Ｒ^２は水素であり、各ｑは４であり、各Ｒ’は水素であり、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８－１２アルキルである。

【0140】

一部の実施形態では、カチオン性脂質は、以下の式Ｉ－ｇの化合物：

【化2】

またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８－１２アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してｎ－Ｃ_８－１２アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_９－１１アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してｎ－Ｃ_９－１１アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_１０アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ^Ｌはｎ－Ｃ_１０アルキルである。

【0141】

特定の実施形態では、適切なカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２または（３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン）である。ｃＫＫ－Ｅ１２の構造を以下に示す：

【化3】

【0142】

カチオン性脂質のさらなる例として、式Ｉのカチオン性脂質と、

【化4】

その薬学的に許容される塩とが挙げられ、
式中、
Ｒは

【化5】

（「ＯＦ－００」）であるか、
Ｒは

【化6】

（「ＯＦ－０１」）であるか、
Ｒは

【化7】

（「ＯＦ－０２」）であるか、または
Ｒは

【化8】

（「ＯＦ－０３」）である（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ，Ｏｗｅｎ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ Ａｌｋｅｎｙｌ Ａｍｉｎｏ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）を参照のこと）。

【0143】

一部の実施形態では、本発明に適した一種以上のカチオン性脂質は、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、または「ＤＯＴＭＡ」であってもよい。（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。他の好適なカチオン性脂質として、例えば、５－カルボキシスペルミルグリジンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）すなわち「ＤＯＧＳ」、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウムすなわち「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパンすなわち「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパンすなわち「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。

【0144】

さらなる例示的なカチオン性脂質として、ｌ，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＤＡＢ」、Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－ｌ－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－ｌ－（シス，シス－９’，ｌ－２’－オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「ＤＭＯＢＡ」、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ－ －ＤＭＡ」、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」、及び２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ ２－ジエン－１－イル）－ｌ，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ））（国際公開第２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０）を参照のこと）、またはこれらの混合物が挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。一部の実施形態では、カチオン性脂質のうちの一つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジウム部分のうちの少なくとも一つを含む。

【0145】

一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ－１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン））、ＮＣ９８－５（４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザへキサデカン－１，１６－ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２－ジオレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（国際公開第２０１２／１７０８８９号、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、ＩＣＥ（国際公開第２０１１／０６８８１０号、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、ＨＧＴ５０００（米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）またはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（仮特許出願第６１／６１７，４６８号）、国際公開第２０１０／０５３５７２号に開示されるものなどのアミノアルコールリピドイド、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６－２８７）、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ
ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２－１７６）、Ｃ１２－２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ ２０１０，１０７，１８６４－１８６９）から選択され得る。

【0146】

一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、アミノ脂質である。本発明での使用に適したアミノ脂質は、国際公開第２０１７１８０９１７号に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１７１８０９１７におけるアミノ脂質の例としては、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、及び化合物１８などの段落［０７４４］で記載されたものが挙げられる。その他のアミノ脂質には、化合物２、化合物２３、化合物２７、化合物１０、および化合物２０が含まれる。本発明での使用に適したさらなるアミノ脂質には、国際公開第２０１７１１２８６５号に記載されているものが含まれ、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１７１１２８６５号における例示的なアミノ脂質は、式（Ｉ）、（Ｉａｌ）－（Ｉａ６）、（ｌｂ）、（ＩＩ）、（Ｉｌａ）、（ＩＩＩ）、（Ｉｌｉａ）、（ＩＶ）、（１７－１）、（１９－１）、（１９－１１）、および（２０－１）のうちの一つによる化合物と、段落［００１８５］、［００２０１］、［０２７６］の化合物を含む。いくつかの実施形態では、本発明での使用に適したカチオン性脂質は、国際公開第２０１６１１８７２５号に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１６１１８７２５号における典型的なカチオン性脂質は、ＫＬ２２およびＫＬ２５などのものを含む。いくつかの実施形態では、本発明での使用に適したカチオン性脂質は、国際公開第２０１６１１８７２４号に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に援用される。国際公開第２０１６１１８７２５号におけるカチオン性脂質の例としては、ＫＬ１０、１，２－ジグリノレイロキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、及びＫＬ２５などのものが挙げられる。

【0147】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、重量またはモルで、総脂質混合物の約３０～７０重量％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５重量％、約３０～４０重量％、約３５～５０重量％、約３５～４５重量％、または約３５～４０重量％）を構成する。

非カチオン性／ヘルパー脂質

【0148】

本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性脂質、双性イオン性脂質、または陰イオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を運ぶ多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。

【0149】

いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％を構成しうる。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の約３０～５０％（例えば、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。
コレステロール系脂質

【0150】

いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液は、一種以上のコレステロール系脂質を含む。例として、好適なコレステロール系カチオン性脂質として、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、ｌ，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の約３０～５０％（例えば、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。
ＰＥＧ化脂質

【0151】

いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液は、一種以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質およびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化脂質も、本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ_６－Ｃ_２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大２ｋＤａ、最大３ｋＤａ、最大４ｋＤａ、または最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。一部の実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ_１４またはＣ_１８）を有するＰＥＧセラミドである。

【0152】

ＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成しうる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の約３０～５０％（例えば、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。

【0153】

予め形成された脂質ナノ粒子を調製するために使用でき、それに含まれる脂質、すなわち、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および任意選択的にコレステロールの種々の組み合わせが、文献および本明細書に記載される。例えば、適切な脂質溶液は、ＣＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＰＰＣ、コール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含有してもよい。脂質のさらなる組み合わせは、当該技術分野、例えば、米国特許第６２／４２０，４２１号（２０１６年１１月１０日出願）、米国特許第６２／４２１，０２１号（２０１６年１１月１１日出願）、米国特許第６２／４６４，３２７号（２０１７年２月２７日出願）、および名称「ｍＲＮＡの送達のための新規ＩＣＥベースの脂質ナノ粒子製剤」のＰＣＴ出願（２０１７年１１月１０日出願）に記載され、これらの開示は、全範囲が、参照により本明細書に含まれる。脂質混合物を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこれらの脂質の相互の相対的モル比は、選択される脂質の特徴、ならびに封入されるべきｍＲＮＡの性質および特徴に基づいく。さらなる考慮すべき事項には、例えば、選択される脂質のアルキル鎖の飽和度、ならびに大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、及び毒性が含まれる。したがって、モル割合はそれらに応じて調節され得る。
予め形成されたナノ粒子の製剤および混合プロセス

【0154】

本発明は、空の予め形成された脂質ナノ粒子（すなわち、ｍＲＮＡが存在しないで形成された脂質ナノ粒子）とｍＲＮＡを混合することが、得られた封入されたｍＲＮＡに効力および有効性をもたらすという驚くべき予期せぬ効果の発見に基づく。

【0155】

いくつかの以前に開示されたプロセスにおいては、名称「メッセンジャーＲＮＡの封入」の米国特許出願第１４／７９０，５６２号（２０１５年７月２日出願）およびその米国仮特許出願第６２／０２０，１６３号（２０１４年７月２日出願）（これらの開示は、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照し、いくつかの実施形態では、先行発明は、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合することにより、脂質ナノ粒子中にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する工程を提供し、ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は、混合の前に、周囲温度より高い予め決められた温度まで加熱されて、ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子が形成される。

【0156】

本発明は、ｍＲＮＡ含有脂質ナノ粒子を製剤する新規方法に関する。本発明では、ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子を調製する新規のプロセスが特定され、これはこうした構成成分の追加順に起因し、得られた形成された粒子は改善された効力および有効性を示す条件下で、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと組み合わせることを含む。構成成分の混合は、プロセスを通じて一定の脂質／ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を維持し、また容易なスケールアップをもたらすポンプシステムで達成される。いくつかの実施形態では、プロセスは、大規模で実施される。例えば、一部の実施形態では、本発明による組成物は、少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇの封入ｍＲＮＡを含有する。

【0157】

ｍＲＮＡの高い封入を達成するために、ｍＲＮＡの特定のカチオン性脂質ナノ粒子製剤については、ｍＲＮＡの保護および送達に必須であるが、クエン酸緩衝液中のｍＲＮＡは加熱されなければならない。それらのプロセスまたは方法では、製剤後（ナノ粒子の形成後）の加熱は、脂質ナノ粒子中のｍＲＮＡの封入効率を増加させないので、加熱は、製剤プロセス前に生じることが要求される（すなわち、別々の成分を加熱すること）。対照的に、本発明の新規のプロセスの一部の実施形態では、ｍＲＮＡの加熱順序は、ｍＲＮＡの封入率に影響を及ぼさないようである。いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液および脂質ナノ粒子で封入されたｍＲＮＡを含む混合溶液の一つ以上を加熱すること（すなわち、周囲温度で維持すること）は、製剤プロセスの前または後に行う必要がない。混合後の制御された温度変化は達成しやすいので、これは、潜在的には、精密にスケールアップに大きな利点をもたらす。

【0158】

この新規なプロセスでは、一部の実施形態では、ｍＲＮＡを空の（すなわち、ｍＲＮＡのない）予め形成された脂質ナノ粒子と混合する工程を使用することによりｍＲＮＡを封入すること（プロセスＢ）は、ｍＲＮＡを脂質成分のみと混合すること（すなわち、脂質ナノ粒子に予め形成されない）によりｍＲＮＡを封入すること（プロセスＡ）と比較して、顕著により高い効力をもたらす。以下の実施例、例えば、表３および４に記載されるように、試験された、脂質ナノ粒子に封入された任意のｍＲＮＡの効力は、プロセスＡと比較して、プロセスＢによって調製された場合、１００％より高い効力から１０００％より高い効力である。

【0159】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのない空の（すなわち、ｍＲＮＡのない）脂質ナノ粒子は、溶媒中に溶解した脂質を含む脂質溶液と水性／緩衝溶液を混合することにより形成される。いくつかの実施形態では、溶媒はエタノールであり得る。いくつかの実施形態では、水溶液は、クエン酸緩衝液であり得る。

【0160】

本明細書で使用される場合、用語「周囲温度」は、部屋の温度、あるいは加熱または冷却なしに、関心対象の物体（例えば、予め形成された空の脂質ナノ粒子溶液、ｍＲＮＡ溶液、もしくはｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子溶液）を囲む温度を意味する。いくつかの実施形態では、一つ以上の溶液が維持される周囲温度は、約３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、または１６℃未満である。いくつかの実施形態では、一つ以上の溶液が保持される周囲温度は、約１５～３５℃、約１５～３０℃、約１５～２５℃、約１５～２０℃、約２０～３５℃、約２５～３５℃、約３０～３５℃、約２０～３０℃、約２５～３０℃または約２０～２５℃の範囲である。いくつかの実施形態では、一つ以上の溶液が維持される周囲温度は２０～２５℃である。

【0161】

したがって、周囲温度よりも高い予め決められた温度は典型的には約２５℃より高い。いくつかの実施形態では、本発明に適した予め決められた温度は、約３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃以上である。いくつかの実施形態では、本発明に適した予め決められた温度は、約２５～７０℃、約３０～７０℃、約３５～７０℃、約４０～７０℃、約４５～７０℃、約５０～７０℃、または約６０～７０℃以上である。特定の実施形態では、本発明に適した予め決められた温度は約６５℃である。

【0162】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡもしくは予め形成された空（すなわち、ｍＲＮＡのない）脂質ナノ粒子溶液、または両方は、混合前に周囲温度より高い予め決められた温度に加熱されてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡおよび予め形成された空の脂質ナノ粒子溶液は、混合前に別々に予め決められた温度に加熱される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡおよび予め形成された空の脂質ナノ粒子溶液は、周囲温度で混合されるが、次に、混合後に予め決められた温度まで加熱される。いくつかの実施形態では、予め形成された空の脂質ナノ粒子溶液は、予め決められた温度に加熱され、周囲温度でｍＲＮＡと混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、予め決められた温度に加熱され、周囲温度で予め形成された空の脂質ナノ粒子溶液と混合される。

【0163】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、所望の予め決められた温度を達成するために、周囲温度にあるｍＲＮＡストック溶液を加熱された緩衝溶液に添加することによって、予め決められた温度に加熱される。

【0164】

いくつかの実施形態では、溶解した脂質を含む脂質溶液、もしくは水性／緩衝溶液、または両方は、混合前に周囲温度より高い予め決められた温度に加熱されてもよい。いくつかの実施形態では、溶解した脂質を含む脂質溶液および水溶液は、混合前に別々に予め決められた温度に加熱される。いくつかの実施形態では、溶解した脂質を含む脂質溶液および水溶液は、周囲温度で混合されるが、次に、混合後に予め決められた温度まで加熱される。いくつかの実施形態では、溶解した脂質を含む脂質溶液は、予め決められた温度に加熱され、周囲温度で水溶液と混合される。いくつかの実施形態では、水溶液は、予め決められた温度に加熱され、周囲温度で溶解した脂質を含む脂質溶液と混合される。いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液および脂質ナノ粒子で封入されたｍＲＮＡを含む混合溶液の一つ以上を加熱することは、製剤プロセスの前または後に起こらない。

【0165】

いくつかの実施形態では、脂質溶液および水性または緩衝溶液は、ポンプを使用して混合されうる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および予め形成された空の脂質ナノ粒子溶液は、ポンプを使用して混合されうる。封入手段は、広範囲のスケールで起こり得るため、望ましいスケールに順応するために異なるタイプのポンプが使用されうる。しかしながら、一般的にはパルスより小さな流れポンプを使用することが望ましい。本明細書で使用される場合、パルスレスフローポンプは、安定した流量と連続的な流れを確立できる任意のポンプを意味する。適切なポンプのタイプには、ギアポンプおよび遠心ポンプが含まれうるが、これに限定されない。例示的ギアポンプとしては、コール－パーマーまたはジーナーギアポンプが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な遠心ポンプとしては、限定されないが、グレンジャーまたはコールパーマーによって製造されるものが挙げられる。

【0166】

ｍＲＮＡ溶液および予め形成された空の脂質ナノ粒子溶液は、様々な流量で混合されうる。典型的には、ｍＲＮＡ溶液は、脂質溶液のものよりも速い速度で混合されてもよい。例えば、ｍＲＮＡ溶液は、脂質溶液の速度よりも少なくとも１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×または２０×の速度で混合されてもよい。

【0167】

混合に適切な流量は、スケールに基づいて決定されうる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約４０～４００ｍｌ／分、６０～５００ｍｌ／分、７０～６００ｍｌ／分、８０～７００ｍｌ／分、９０～８００ｍｌ／分、１００～９００ｍｌ／分、１１０～１０００ｍｌ／分、１２０～１１００ｍｌ／分、１３０～１２００ｍｌ／分、１４０～１３００ｍｌ／分、１５０～１４００ｍｌ／分、１６０～１５００ｍｌ／分、１７０～１６００ｍｌ／分、１８０～１７００ｍｌ／分、１５０～２５０ｍｌ／分、２５０～５００ｍｌ／分、５００～１０００ｍｌ／分、１０００～２０００ｍｌ／分、２０００～３０００ｍｌ／分、３０００～４０００ｍｌ／分、または４０００～５０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約１０００ｍｌ／分、約２０００ｍｌ／分、約３０００ｍｌ／分、約４０００ｍｌ／分、または約５０００ｍｌ／分の流量で混合される。

【0168】

いくつかの実施形態では、脂質溶液または予め形成された脂質ナノ粒子溶液は、約２５～７５ｍｌ／分、２０～５０ｍｌ／分、２５～７５ｍｌ／分、３０～９０ｍｌ／分、４０～１００ｍｌ／分、５０～１１０ｍｌ／分、７５～２００ｍｌ／分、２００～３５０ｍｌ／分、３５０～５００ｍｌ／分、５００～６５０ｍｌ／分、６５０～８５０ｍｌ／分、または８５０～１０００ｍｌの範囲の流量で混合される。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流量で混合される。

【0169】

一般に、一部の実施形態では、溶解した脂質を含む脂質溶液および水性または緩衝溶液は、脂質がｍＲＮＡなしでナノ粒子（または空の予め形成された脂質ナノ粒子）を形成できるように、溶液に混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および予め形成された脂質ナノ粒子溶液は、ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子内に封入されるように、溶液に混合される。こうした溶液は、製剤または封入溶液とも呼ばれる。適切な製剤または封入溶液は、エタノールなどの溶媒を含む。例えば、適切な製剤または封入溶液は、約１０％エタノール、約１５％エタノール、約２０％エタノール、約２５％エタノール、約３０％エタノール、約３５％エタノール、または約４０％エタノールを含む。

【0170】

いくつかの実施形態では、適切な製剤または封入溶液は、イソプロピルアルコールなどの溶媒を含む。例えば、適切な製剤または封入溶液は、約１０％イソプロピルアルコール、約１５％イソプロピルアルコール、約２０％イソプロピルアルコール、約２５％イソプロピルアルコール、約３０％イソプロピルアルコール、約３５％イソプロピルアルコール、または約４０％イソプロピルアルコールを含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、適切な製剤または封入溶液は、ジメチルスルホキシドなどの溶媒を含む。例えば、適切な製剤または封入溶液は、約１０％ジメチルスルホキシド、約１５％ジメチルスルホキシド、約２０％ジメチルスルホキシド、約２５％ジメチルスルホキシド、約３０％ジメチルスルホキシド、約３５％ジメチルスルホキシド、または約４０％ジメチルスルホキシドを含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、適切な製剤または封入溶液は、緩衝剤または塩も含みうる。例示的な緩衝剤には、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムが含まれうる。例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムを含む。いくつかの実施形態では、この新規ナノ粒子製剤を作製する際に使用される空の予め形成された脂質ナノ粒子製剤は、１０％トレハロース溶液中で安定的に凍結させることができる。

【0173】

いくつかの実施形態では、この新規ナノ粒子製剤を作製する際に使用される空の（すなわち、ｍＲＮＡのない）予め形成された脂質ナノ粒子製剤は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％トレハロース溶液中に安定的に凍結されうる。いくつかの実施形態では、空の脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを添加すると、下流の精製または処理を必要としない最終製剤が得られ、凍結形態で安定的に保存されうる。

【0174】

いくつかの実施形態では、エタノール、クエン酸緩衝液、および他の不安定化剤は、ｍＲＮＡの添加中に存在せず、そのため製剤はさらなる下流処理を必要としない。いくつかの実施形態では、この新規プロセスにより調製される脂質ナノ粒子製剤であり、トレハロース溶液中の予め形成された脂質ナノ粒子から成る。不安定化剤の欠如およびトレヘルス溶液の安定性は、製剤のスケールアップおよびｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の産生の容易さを増加させる。
精製

【0175】

いくつかの実施形態では、空の予め形成された脂質ナノ粒子またはｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子は、精製され、および／または濃縮される。様々な精製方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、接線流ろ過を使用して精製される。交差流ろ過とも呼ばれる接線流ろ過（ＴＦＦ）は濾過のタイプであり、濾過されるべき物質は、フィルターを通過するよりむしろ、その接線方向に通過する。ＴＦＦでは、望ましくない透過物はフィルターを通過し、一方で望ましい保持物はフィルターに沿って通過し、下流に収集される。望ましい物質は、通常はＴＦＦにおいて保持物に含有され、通常の全量濾過において普通出会うものの反対であることに注意することが重要である。

【0176】

濾過されるべき物質に応じて、ＴＦＦは通常、微量濾過または限外ろ過のいずれかに使用される。微量濾過は、典型的には、フィルターが０．０５μｍ～１．０μｍ（それぞれを含む）の孔径を有する場合として定義され、一方で限外ろ過は通常、０．０５μｍ未満の孔径を有するフィルターを伴う。孔サイズはまた、特定のフィルターについて分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）とも呼ばれる公称分画分子量（ＮＭＷＬ）を決定し、これは、１，０００キロダルトン（ｋＤａ）を超えるＮＭＷＬを典型的に有する微量濾過膜、およびマイクロ濾過膜および１ｋＤａ～１，０００ｋＤａのＮＭＷＬを有する限外濾過フィルターを有する。

【0177】

接線流ろ過の主な利点は、従来的な「全量」濾過の間にフィルターに凝集してフィルターを塞ぎ、代わりにフィルターの表面に沿って運ばれる非透過性粒子（ときに、「濾過ケーク」と呼ばれる）である。この利点により、フィルターは一般的に除去および掃除される必要がないため、中断時間が有意に低減されるので、連続的な操作を必要とする工業プロセスで接線流ろ過を広く使用できるようになる。

【0178】

接線流ろ過は、特に濃縮及び透析ろ過を含むいくつかの目的に使用することができる。濃縮は、溶媒が溶液から除去され、一方溶質分子は保持される、プロセスである。試料を効果的に濃縮するために、保持されるべき溶質分子の分子量よりも実質的に小さいＮＭＷＬまたはＭＷＣＯを有する膜が使用される。一般的に、当業者は、標的分子の分子量より３～６倍小さいＮＭＷＬまたはＭＷＣＯを有するフィルターを選択し得る。

【0179】

透析ろ過は分画プロセスであり、それによって小さな望ましくない粒子がフィルターを通過し、一方大きな所望のナノ粒子は、溶液中のそれらのナノ粒子の濃度を変化させることなく、保持物内に維持される。透析ろ過は、溶液から塩または反応緩衝液を除去するためにしばしば使用される。透析ろ過は、連続または不連続のいずれかであってもよい。連続透析ろ過では、透析ろ過溶液を、濾液が生成されるのと同じ速度で試料供給に添加する。不連続透析ろ過では、溶液はまず希釈され、次に開始濃度まで濃縮される。不連続透析ろ過は、所望のナノ粒子濃度に達するまで繰り返されてもよい。

【0180】

精製および／または濃縮された脂質ナノ粒子は、例えば、ＰＢＳなどの望ましい緩衝液中で製剤化されうる。
提供されるｍＲＮＡを封入しているナノ粒子

【0181】

本発明によるプロセスは、より高い効力および有効性をもたらし、それによってより低い用量を可能にし、それによって治療指数を正の方向にシフトさせる。いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、従来の技術のプロセスと比較して、均質かつ小さな粒子サイズ（例えば、１５０ｎｍ未満）、ならびに有意に改善された封入効率および／またはｍＲＮＡ回収率をもたらす。

【0182】

したがって、本発明は、本明細書に記載の精製されたナノ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物中の精製されたナノ粒子の大部分、すなわち、精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、約１５０ｎｍ（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、または約８０ｎｍ）のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべてが、約１５０ｎｍ（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、または約８０ｎｍ）のサイズを有する。

【0183】

さらに、細い粒子サイズ範囲を有するより均質なナノ粒子が、本発明のプロセスによって達成される。例えば、本発明により提供される組成物中の精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くが、約７５～１５０ｎｍ（例えば、約７５～１４５ｎｍ、約７５～１４０ｎｍ、約７５～１３５ｎｍ、約７５～１３０ｎｍ、約７５～１２５ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、約７５～１１５ｎｍ、約７５～１１０ｎｍ、約７５～１０５ｎｍ、約７５～１００ｎｍ、約７５～９５ｎｍ、約７５～９０ｎｍ、または７５～８５ｎｍ）の範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべてが、約７５～１５０ｎｍ（例えば、約７５～１４５ｎｍ、約７５～１４０ｎｍ、約７５～１３５ｎｍ、約７５～１３０ｎｍ、約７５～１２５ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、約７５～１１５ｎｍ、約７５～１１０ｎｍ、約７５～１０５ｎｍ、約７５～１００ｎｍ、約７５～９０ｎｍ、または７５～８５ｎｍ）の範囲のサイズを有する。

【0184】

いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物中のナノ粒子の、分子のサイズの分散性、または分子のサイズの不均一性の測定値（ＰＤＩ）は、約０．２３未満（例えば、約０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、または０．０８未満）である。特定の実施形態では、ＰＤＩは約０．１６未満である。

【0185】

いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物中の精製された脂質ナノ粒子の約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より多くが、各々個別粒子内にｍＲＮＡを封入する。いくつかの実施形態では、組成物中の精製された脂質ナノ粒子の実質的にすべてが、各々個々の粒子内にｍＲＮＡを封入する。

【0186】

いくつかの実施形態では、本発明による組成物には、少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇの封入されたｍＲＮＡが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、ｍＲＮＡの６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える回収をもたらす。

【0187】

いくつかの実施形態では、本発明による組成物は、用量を対象に投与するために製剤される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、１．０ｍｇ／ｋｇ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子（例えば、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ）未満の用量濃度で製剤化される。０．０５ｍｇ／ｋｇ、および０．０１６ｍｇ／ｋｇ。いくつかの実施形態では、用量は、より低い用量が高い効力および有効性を生じるという予想外の知見に起因し、減少される。いくつかの実施形態では、用量は約７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％または４０％減少する。

【0188】

いくつかの実施形態では、プロセスＢにより産生されたｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の効力は、プロセスＡと比較して、プロセスＢによって調製された時、１００％より高い（すなわち、２００％より高い、３００％より高い、４００％より高い、５００％より高い、６００％より高い、７００％より高い、８００％より高い、または９００％より高い）効力から、１０００％より高い効力である。

【実施例0189】

本発明の特定の化合物、組成物、及び方法について、特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。
脂質材料

【0190】

以下の実施例に記載されている製剤は、特に規定されない限り、以前に考察するように、様々な核酸材料を封入するよう設計された一つ以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質、および／またはコレステロール脂質）ならびにＰＥＧ化脂質を用いた、変動する割合の多成分の脂質混合物を含む。
実施例１．脂質ナノ粒子製剤プロセスＡ

【0191】

この例は、ｍＲＮＡを封入するための例示的な脂質ナノ粒子製剤プロセスを例示する。本明細書で使用される場合、プロセスＡは、最初に脂質を脂質ナノ粒子に予め形成することなく、ｍＲＮＡを脂質の混合物と混合することによってｍＲＮＡを封入する方法を指す。以下に記載するプロセスＢと比較して、プロセスＡは脂質ナノ粒子の予め形成を伴わない。

【0192】

例示的な製剤プロセスＡが、図１に示される。このプロセスでは、一部の実施形態では、エタノール脂質溶液およびｍＲＮＡの緩衝液溶液を別個に調製した。脂質の混合物（カチオン性脂質、ヘルパー脂質、双性イオン脂質、ＰＥＧ脂質など）の溶液を、エタノール中で溶解することによって調製した。ｍＲＮＡをクエン酸緩衝液中に溶解することによってｍＲＮＡ溶液を調製し、ｐＨ４．５のクエン酸緩衝液中０．０８３３ｍｇ／ｍｌの濃度でｍＲＮＡを得た。図１に示すように、その後、混合前に、混合物両方を、６５℃に加熱した。次に、これらの２つの溶液をポンプシステムを使用して混合した。一部の実例では、２つの溶液をギアポンプシステムを使用して混合した。特定の実施形態では、２つの溶液を「Ｔ」接合部（または「Ｙ」接合部）を使用して混合した。次いで、混合物をＴＦＦプロセスで透析ろ過により精製した。結果として得られた製剤を、濃縮し、さらなる使用まで２～８℃で保存した。
実施例２．予め形成された脂質ナノ粒子を用いた、脂質ナノ粒子製剤プロセスＢ

【0193】

本実施例は、ｍＲＮＡを封入するための模範的プロセスＢを例示する。本明細書で使用される場合、プロセスＢは、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入するプロセスを指す。変化する温度（すなわち、混合物の加熱または非加熱）、緩衝液、および濃度などの広範囲の異なる条件が、プロセスＢに用いられてもよい。このおよび他の例で説明した例示的な条件は、例示目的のみである。

【0194】

例示的な製剤プロセスＢは、図２に示される。このプロセスでは、一部の実施形態では、エタノールおよびクエン酸緩衝液に溶解した脂質を、ポンプシステムを使用して混合した。２つの流れの瞬間混合により、空の脂質ナノ粒子が形成され、これは自己組織化プロセスであった。得られた製剤混合物は、アルコールを含有するクエン酸緩衝液中の空の脂質ナノ粒子であった。次いで、製剤をＴＦＦ精製プロセスに供し、バッファ交換を行った。次いで、予め形成された空の脂質ナノ粒子の得られた懸濁液をポンプシステムを使用してｍＲＮＡと混合した。ある特定のカチオン性脂質については、混合後の溶液の加熱によって、ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子の割合が高く、ｍＲＮＡの合計収率が高くなった。

【0195】

加えて、プロセスＢにおけるｍＲＮＡの添加中のクエン酸緩衝液の存在の効果を研究した。表１は、クエン酸緩衝液（Ｐｈ４．５）を伴う脂質ナノ粒子製剤プロセスＢの封入効率の例を示す。予め形成された空の脂質ナノ粒子とｍＲＮＡの混合中にクエン酸緩衝液が存在した場合、ｍＲＮＡの封入効率の減少を観察した。クエン酸緩衝液の存在下で、脂質ナノ粒子製剤プロセスＢの封入効率は６０％未満であった。クエン酸緩衝液を含まないプロセスＢによって調製された脂質ナノ粒子製剤の封入効率は、９０％以上であった。
表１ クエン酸緩衝液を含むプロセスＢおよび含まないプロセスＢを用いた脂質ナノ粒子製剤の封入効率。

【表1】

実施例３．ｓｐｆ^ａｓｈ マウスにおける発現したｈＯＴＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性

【0196】

本実施例は、プロセスＢによって生成された脂質ナノ粒子を介して送達されたｍＲＮＡは、プロセスＡによって生成されたものより予想外により効果的であったことを示している。

【0197】

この例では、ＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスに、プロセスＡまたはプロセスＢにより調製された脂質ナノ粒子に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回０．５ｍｇ／ｋｇ用量を投与した。これらのマウス由来の肝組織を、シトルリン産生について投与の２４時間後に解析した。製剤を、保存することなく混合した直後にまず試験し、ならびに製剤の混合後試験し、－８０℃で２．５ヶ月間保存した。

【0198】

図３は、プロセスＡまたはプロセスＢによって作製された脂質ナノ粒子製剤に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与の２４時間後のＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスを示す。

【0199】

一般的に、シトルリンの産生を使用して、発現したｈＯＴＣタンパク質の活性を評価できる。図３に示すように、ＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウス肝臓における発現したｈＯＴＣタンパク質によるシトルリン活性を、それぞれプロセスＡおよびプロセスＢで作製された脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の単回投与の２４時間後に測定した。図３中のグラフ（ｉ）は、製剤の混合直後、かつ保存時間なしに、それぞれ、プロセスＡおよびプロセスＢによる脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後、発現したｈＯＴＣに起因したシトルリン活性を示す。図３中のグラフ（ｉｉ）は、製剤の混合物を、２．５ヶ月間－８０℃で保存後、それぞれ、プロセスＡおよびプロセスＢによる脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後、発現したｈＯＴＣに起因したシトルリン活性を示す。

【0200】

図３に示す結果は、予め形成された空の脂質ナノ粒子でプロセスＢにより調製された製剤が、プロセスＡによって調製された製剤と比較して、ｈＯＴＣタンパク質の約３倍のシトルリン活性をもたらしたことを示す。グラフ（ｉ）および（ｉｉ）に示した結果の類似性が証拠となる通り、プロセスＡによってとプロセスＢによっての産生された製剤の両方は、－８０℃での延長した保存後、安定性および機能性を示した。
実施例４．異なるプロセスＢパラメータ下でのｓｐｆ^ａｓｈマウスにおける発現したｈＯＴＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性

【0201】

この実施例は、異なるパラメータを有するプロセスＢによって製造された脂質ナノ粒子が、ｓｐｆ^ａｓｈマウスに送達されたとき、野生型マウスに見られるものに匹敵するシトルリン活性を導くことを示す。

【0202】

この実施例では、ＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスに、プロセスＡまたはプロセスＢにより調製した脂質ナノ粒子に封入したｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回０．５ｍｇ／ｋｇ用量を投与した。これらのマウス由来の肝組織を、シトルリン産生について投与の２４時間後に解析した。４つの異なる脂質ナノ粒子製剤を、それぞれが異なるタイプのポンプを使用して調製し、プロセスＢによって作製した。

【0203】

図４は、プロセスＡまたはプロセスＢで作製した脂質ナノ粒子製剤に封入したｈＯＴＣ
ｍＲＮＡの単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与の２４時間後のＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈのマウスの肝臓において発現したｈＯＴＣタンパク質（シトルリン産生について）の典型的な活性を示す。プロセスＢで作製した脂質ナノ粒子製剤を、（１）ギアポンプを使用して、（２）ぜん動ポンプを使用して、（３）より低い流量でぜん動ポンプを使用して、および（４）異なる流量のｍＲＮＡと空の予め形成した脂質ナノ粒子を使用して、調製した。

【0204】

いくつかの実施形態では、プロセスＢによる脂質ナノ粒子製剤を、表２に示す通り、異なるプロセスパラメータ下で調製することができる。
表２

【表2】

【0205】

いくつかの実施形態では、１～４に番号付けしたプロセスＡおよびプロセスＢ製剤によって調製した異なる製剤を、ｉｎ ｖｉｖｏで試験した。

【0206】

一般的に、シトルリンの産生を使用して、発現したｈＯＴＣタンパク質の活性を評価することができる。図４に示すように、ＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウス肝臓におけるｈＯＴＣタンパク質のシトルリン活性を、異なるパラメータを有するプロセスＡまたはプロセスＢのいずれかによって作製した脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の単回投与の２４時間後に測定した。

【0207】

図４に示すように、模範的データは、プロセスＢによって作製した異なる脂質ナノ粒子製剤（１～４）をｓｐｆ^ａｓｈマウスに投与した時に、処置は、野生型マウスのものと匹敵する、驚くべきレベルのｈＯＴＣタンパク質のシトルリン活性を導いたことを示す。同一の投薬レベル（０．５ｍｇ／ｋｇ）のＯＴＣ ｍＲＮＡでは、プロセスＢによって調製した脂質ナノ粒子製剤は、プロセスＡによって調製した製剤の２～４倍高いｉｎ ｖｉｖｏ活性を示した。
実施例５．２９３Ｔ細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＳＳ１発現

【0208】

本実施例は、プロセスＢによって調製した脂質ナノ粒子が、遺伝子導入した細胞において予想外に高いタンパク質発現をもたらしたことを示している。

【0209】

図５は、プロセスＡまたはプロセスＢによって産生されたｈＡＳＳ１ ｍＲＮＡ（リポフェクタミンで）またはｈＡＳＳ１ ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子（リポフェクタミンなし）のいずれかでのトランスフェクションの１６時間後の、２９３Ｔ細胞におけるヒトＡＳＳ１タンパク質発現の例を示す。

【0210】

この実施例では、プロセスＡによってまたはプロセスＢによって調製したＡＳＳ１ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤を用いて２９３Ｔ細胞を形質導入した。１μｇのＡＳＳ１をリポフェクタミンを使用して形質導入するか、または１０μｇの、脂質ナノ粒子製剤に封入したＡＳＳ１ ｍＲＮＡを、１０^６細胞当たり２４時間形質導入した。ＡＳＳ１タンパク質発現を、ＥＬＩＳＡによって決定した。

【0211】

図５に示すように、プロセスＢにより調製した脂質ナノ粒子製剤は、プロセスＡにより調製した製剤よりもずっと高いレベルのＡＳＳ１タンパク質発現をもたらす。プロセスＢによって調製した脂質ナノ粒子でのトランスフェクションから生じたＡＳＳ１タンパク質発現のレベルは、ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ－リポフェクタミン複合体でのトランスフェクションから生じたレベルと同等であった。ｍＲＮＡ－リポフェクタミン複合体、脂質ナノ粒子製剤－プロセスＡ及び脂質ナノ粒子製剤－プロセスＢについての１０^６細胞当たりのＡＳＳ１タンパク質レベルは、それぞれ、１２．４３、０．４３、及び１２．１１μｇであった。プロセスＢによって調製した脂質ナノ粒子製剤を用いたトランスフェクションから生じたＡＳＳ１タンパク質レベルは、プロセスＡにより調製した脂質ナノ粒子製剤を用いたトランスフェクション由来のものの２８倍であった。
実施例６．ラット肺におけるｈＣＦＴＲのｉｎ ｖｉｖｏ発現

【0212】

図６は、異なるカチオン性脂質を使用してプロセスＢにより調製されｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子吸入の２４時間後のラット肺中のｈＣＦＴＲタンパク質の免疫組織化学的検出の例を示す。

【0213】

オスのスプラーグドーリーラットに、プロセスＢにより調製されたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子製剤を、吸入を介して投与した。ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥまたはターゲット２４脂質をカチオン性脂質として使用して、脂質ナノ粒子製剤を作製した。これらのラット由来の固定肺組織を、免疫組織化学染色によりｈＣＦＴＲタンパク質の存在について解析した。

【0214】

気管支上皮細胞と肺胞領域の両方でタンパク質を検出した。生理食塩水で処置した対照ラットの肺における茶色の染色の欠如と比較して、すべてのｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試験物品群で、陽性（茶色）染色を観察した。ラットに、（ｉ）生理食塩水、（ｉｉ）プロセスＢにより調製したｃＫＫ－Ｅ１２脂質の脂質ナノ粒子製剤、（ｉｉｉ）プロセスＢにより調製したＩＣＥ脂質の脂質ナノ粒子製剤、または（ｉｖ）プロセスＢによって調製したターゲット２４脂質の脂質ナノ粒子製剤を、吸入を介して投与した。
実施例７．マウス肺におけるｈＣＦＴＲのｉｎ ｖｉｖｏ発現

【0215】

図７は、プロセスＢにより調製したｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の吸入の２４時間後のマウス肺におけるｈＣＦＴＲタンパク質の免疫組織化学的検出の例を示す。

【0216】

この実施例において、Ｃ５７ＢＬマウスに、ｃＫＫ－Ｅ１２を含み、ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡを含有する、プロセスＢによって調製した脂質ナノ粒子を吸入を介して投与した。これらのマウス由来の固定肺組織を、免疫組織化学染色によりｈＣＦＴＲタンパク質の存在について解析した。

【0217】

気管支上皮細胞と肺胞領域の両方でタンパク質を検出した。生理食塩水で処置した対照マウスの肺における茶色の染色の欠如と比較して、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子試験物品群について陽性（茶色）染色を観察した。
実施例８．硝子体内投与後のマウスにおけるホタルルシフェラーゼタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ発現

【0218】

本実施例は、プロセスＢにより生成されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の投与方法の例およびｉｎ ｖｉｖｏの標的組織におけるホタルルシフェラーゼの解析方法の例を解説する。

【0219】

図８は、脂質ナノ粒子に封入したＦＦＬ ｍＲＮＡの硝子体内投与の２４時間後の野生型マウスの生物発光画像を描写するものである。

【0220】

この実施例において、野生型マウスを、硝子体内投与を介してプロセスＢにより産生されたＦＦＬをコードするｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子を用いて処置した。５μｇのＦＦＬ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を含む溶液をマウスの左眼に注入した。発光を、注射の２４時間後にモニターした。

【0221】

図８に示す結果は、これらのマウスの眼における活性ＦＦＬタンパク質の十分な産生を表す、有意な発光を観察したことを示す。さらに、持続ＦＦＬ活性を、少なくとも２４時間維持した。
実施例９．局所眼適用後のマウスにおけるホタルルシフェラーゼタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ発現

【0222】

本実施例は、プロセスＢにより生成したホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の投与方法の例およびｉｎ ｖｉｖｏの標的組織におけるホタルルシフェラーゼの解析方法の例を解説する。

【0223】

図９は、ポリビニルアルコールで製剤した脂質ナノ粒子に封入されたＦＦＬ ｍＲＮＡを含有する点眼薬の局所適用の２４時間後の野生型マウスの生物発光画像を描写する。

【0224】

この実施例では、野生型マウスを、局所適用（点眼）を介してプロセスＢにより産生されたＦＦＬをコードするｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子を用いて処置した。ポリビニルアルコールを用いて製剤した５μｇのＦＦＬ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を含む溶液をマウスの右眼に適用した。発光を、適用の２４時間後にモニターした。

【0225】

図９に示す結果は、これらのマウスの眼における活性ＦＦＬタンパク質の十分な産生を表す、有意な発光を観察したことを示す。さらに、持続ＦＦＬ活性を、少なくとも２４時間維持した。
実施例１０．マウスで発現したＰＡＨのｉｎ ｖｉｖｏ活性

【0226】

この実施例では、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ノックアウト（ＫＯ）マウスに、プロセスＢによって産生された２０．０ｍｇ／ｋｇ ｈＰＡＨ脂質ナノ粒子の単回皮下注射を投与した。マウス血清中のフェニルアラニンレベルを、投与の２４時間後に測定した。

【0227】

図１０は、プロセスＢによって産生された脂質ナノ粒子に封入したヒトＰＡＨ（ｈＰＡＨ）ｍＲＮＡでの処置の前および後の、ＰＡＨ ＫＯマウスにおける血清フェニルアラニンレベルの例を示す。血清試料を、単回皮下投与の２４時間後に測定した。

【0228】

カスタムｅｘ ｖｉｖｏ活性アッセイを使用して血清フェニルアラニン低下のレベルを測定することにより示すように、ｍＲＮＡ由来ｈＰＡＨタンパク質は酵素的に活性であることを示した。一般的に、 血清フェニルアラニンの低減を使用して、効力（すなわち、発現したＰＡＨタンパク質）の活性および送達方法の有効性を評価することができる。図１０に示すように、ＰＡＨ ＫＯマウスにおける典型的な血清フェニルアラニンレベルを、皮下で送達されたプロセスＢによって調製したｈＰＡＨｍＲＮＡ製剤の単回投与の前および２４時間後に測定した。比較として、生理食塩水で処置したＰＡＨ ＫＯマウスにおける血清フェニルアラニンレベルも測定した。

【0229】

図１０に示す結果は、皮下注射した脂質ナノ粒子ｈＰＡＨｍＲＮＡ製剤が、有意なフェニルアラニンレベルの減少をもたらしたことを示す。投与前および後の生理食塩水で処置したＰＡＨ ＫＯマウスにおいてフェニルアラニンレベルにおける有意差は存在しなかった。
実施例１１．マウスにおける発現したＯＴＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性

【0230】

この実施例は、生理食塩水で処置したＯＴＣ ＫＯｓｐｆ^ａｓｈマウスおよびプロセスＢによって作製したｈＯＴＣ ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の皮下投与で処置したＯＴＣ ＫＯ ｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓におけるＯＴＣタンパク質のレベルの比較を示す。

【0231】

図１１に示すように、ＯＴＣ ＫＯｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓における発現したｈＯＴＣタンパク質の結果としてのシトルリン産生の例を、プロセスＢによって作製したｈＯＴＣ ｍＲＮＡ製剤を封入している脂質ナノ粒子の単回皮下投与の２４時間後に測定した。加えて、ＯＴＣ ＫＯｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓におけるシトルリン産生を、生理食塩水を注入した後に、測定した。

【0232】

図１１に示す結果は、プロセスＢによって作製した皮下注射した脂質ナノ粒子ｈＯＴＣ
ｍＲＮＡ製剤が、生理食塩水で処置した病気のマウスと比較して、投与の２４時間後の発現したｈＯＴＣタンパク質の有意な活性をもたらしたことを示す。
実施例１２．マウスにおけるＡＳＳ１のｉｎ ｖｉｖｏ発現

【0233】

図１２は、プロセスＢによって作製したｈＡＳＳ１ ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子製剤の単回皮下投与の２４時間後の、ＡＳＳ１ ＫＯマウス肝臓における測定したヒトＡＳＳ１タンパク質レベルの例を示す。

【0234】

一般的に、発現したｈＡＳＳ１タンパク質レベルを使用して、送達方法の効率を評価することができる。図１２に示すように、ＳＡＳ１ＫＯマウスにおける例示的なｈＡＳＳ１タンパク質レベルを、プロセスＢによって作製したｈＡＳＳ１ ｍＲＮＡ製剤の単回皮下投与の２４時間後に測定した。加えて、比較として、生理食塩水で処置したＡＳＳ１ ＫＯマウスにおけるｈＡＳＳ１タンパク質レベルも測定した。

【0235】

図１２に示す結果は、プロセスＢによって作製した皮下注射したｈＡＳＳ１ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤が、生理食塩水で処置したｈＡＳＳ１ ＫＯマウスと比較したとき、投与の２４時間後のｈＡＳＳ１ ＫＯマウスにおいて有意なｈＡＳＳ１タンパク質レベルを生じたことを示す。
実施例１３．様々な投与経路を介したマウスにおけるｈＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏ発現

【0236】

本実施例は、プロセスＢによって作製した脂質ナノ粒子に封入したｈＥＰＯ ｍＲＮＡの投与後の、野生型マウスにおける発現したヒトＥＰＯ（ＨｅＰＯ）の比較を示す。本実施例は、様々な用量レベルでの皮内投与および筋肉内投与のためのプロセスＡおよびプロセスＢによって産生された脂質ナノ粒子を介して送達されたｍＲＮＡの効力の比較をさらに例示する。プロセスＢによって産生された脂質ナノ粒子を介して送達されたｍＲＮＡは、評価した皮内または筋肉内投与経路によって送達されたかどうかにかかわらず、すべての投薬量および時点でプロセスＡにより産生されたものよりも実質的に強力であることが示されている。

【0237】

この実施例では、野生型マウスに、皮内、皮下、または筋肉内経路を介して、プロセスＢによって作製したｈＥＰＯ ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の様々な濃度（すなわち、１μｇ、１０μｇ、または５０μｇ）の単回用量を投与した。ｈＥＰＯタンパク質の血清レベルを、投与の６時間後および２４時間後に測定した。さらに、野生型マウスに、皮内、または筋肉内経路を介して、プロセスＡまたはプロセスＢにより産生されたｈＥＰＯ
ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の様々な濃度（すなわち、１μｇ、１０μｇ、または５０μｇ）の単回用量を投与した。ｈＥＰＯタンパク質の血清レベルを、投与の６時間後および２４時間後に測定した。

【0238】

図１３は、プロセスＢによって作製したｈＥＰＯ ｍＲＮＡ製剤の単回投与の６時間後および２４時間後に処置したマウスの血清において測定したｈＥＰＯタンパク質レベルの例を示す。比較した経路は、皮内、皮下、または筋肉内注射による投与であった。

【0239】

治療後のマウスの血清中のｈＥＰＯタンパク質のレベルを使用して、異なる送達方法を介したｍＲＮＡの効力を評価することができる。図１３に示すように、マウス血清中の例示的ｈＥＰＯタンパク質レベルタンパク質を、１μｇ、１０μｇ、および５０μｇでプロセスＢにより作製したｈＥＰＯ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤の単回投与の６時間後および２４時間後に、ＥＬＩＳＡにより評価した。さらに、皮内、皮下、および筋肉内投与経路由来のｈＥＰＯタンパク質レベルを比較した。

【0240】

図１３に示す結果は、筋肉内注入したｈＥＰＯ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤が、皮内および皮下経路に比べたとき、一般的に最高レベルのｈＥＰＯタンパク質をもたらしたことを示す。投与後６時間で、ｈＥＰＯタンパク質レベルは、皮内投与からよりも皮下投与からわずかに高かった。
様々な用量レベルでの皮内投与および筋肉内投与についてのプロセスＡおよびプロセスＢにより産生されたｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の比較。

【0241】

図１４は、プロセスＡまたはプロセスＢによって作製した脂質ナノ粒子製剤に封入したｈＥＰＯ ｍＲＮＡの単回皮内投与の６時間後および２４時間後の、処置したマウスの血清中で測定したｈＥＰＯタンパク質レベルの比較を示す。図１４は、すべての用量で、プロセスＢによって調製した製剤が、プロセスＡによって調製した製剤と比較して、約２～４倍高いｈＥＰＯタンパク質レベル発現をもたらしたことを示す。

【0242】

図１５は、プロセスＡまたはプロセスＢによって作製した脂質ナノ粒子製剤に封入したｈＥＰＯ ｍＲＮＡの単回筋肉内投与の６時間後および２４時間後の、処置したマウスの血清中で測定したｈＥＰＯタンパク質レベルの比較を示す。図１５は、すべての用量で、プロセスＢによって調製した製剤が、プロセスＡによって調製した製剤と比較して、約２～４倍高いｈＥＰＯタンパク質レベル発現をもたらしたことを示す。

【0243】

図１４および図１５に示すように、マウス血清中のｈＥＰＯタンパク質レベルタンパク質を、それぞれ皮内投与および筋肉内投与により、１μｇ、１０μｇおよび５０μｇの、プロセスＡまたはプロセスＢによって作製したｈＥＰＯ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤の単回投与の６時間後および２４時間後にＥＬＩＳＡにより評価した。結果は、プロセスＢによって産生されたｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の実質的に高い効力を示している。プロセスＢ製剤のより高い効力は、外皮系の様々な細胞（すなわち、筋細胞、線維芽細胞、マクロファージ、脂肪細胞など）と関連したことを観察した。
実施例１４．動物モデルにおけるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子からのタンパク質発現

【0244】

この実施例は、広範囲の用量レベルに渡る、プロセスＡと比較して、プロセスＢにより生成した脂質ナノ粒子を介して送達したｍＲＮＡでの有意に改善したｉｎ ｖｉｖｏタンパク質発現を説明する。

【0245】

この研究では、オスのｓｐｆ^ａｓｈマウスを、プロセスＡまたはプロセスＢによって作製したｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を用いて、４つの異なる用量レベル（０．５０ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、および０．０１６ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれの場合で処置した。試験全体を通して使用した試験物品は、脂質ナノ粒子製造プロセス（プロセスＡ対プロセスＢ）および用量の示した差異を除いて同じであった。

【0246】

試験物品を、尾静脈注射を介して単回投与として投与した。投与の２４時間後に、マウスにアンモニア負荷をし、塩化アンモニウム（５ｍｍｏｌ／ｋｇ ＮＨ４Ｃｌ）のボーラス注入を、腹腔内投与した。全血のアリコートをリチウムヘパリン血漿チューブに集めることにより、ＮＨ４Ｃｌ負荷の４０分後に血液を集め、これを血漿に処理し、血漿アンモニアを、ＩＤＥＸＸ Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｄｘ分析器を用いて解析した。次いで、動物を屠殺し、それらの肝臓を採取し、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してｈＯＴＣ発現について評価した。

【0247】

図１６は、研究のアンモニア負荷部分の概略図を示し、これは、ＯＴＣ欠損症に罹患している患者が経験しうる高アンモニア血症発症を再現するよう実施した。

【0248】

図１７は、アンモニア負荷したマウス、特に正常なマウスＯＴＣ（ＷＴ）を有する野生型マウス、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子（ＫＯ）を受けなかったｓｐｆ^ａｓｈマウス、およびプロセスＢにより製造した０．５、０．１６、０．０５または０．０１６ｍｇ／ｋｇ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の単回投与を受けたｓｐｆ^ａｓｈマウスのそれぞれの血漿アンモニアレベルを示す。図が示す通り、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子（ＫＯ）を受けなかったｓｐｆ^ａｓｈマウスについて同一条件下での血漿アンモニアの顕著な上昇と比較して、プロセスＢにより作成したｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．１６ｍｇ／ｋｇで、モデル高アンモニア血症発症の統計上有意な防御を達成した。このデータは、プロセスＢによって産生され、０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．１６ｍｇ／ｋｇの用量で投与したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子が、塩化アンモニウム負荷に対する保護において投与後少なくとも２４時間有効であることを説明する。

【0249】

図１８および表３は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与の２４時間後に屠殺した動物の肝臓からのｈＯＴＣタンパク質レベルを示す。これらの結果を示す通り、プロセスＢによって調製したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子で処置したマウスの肝臓から発現したｈＯＴＣタンパク質は、プロセスＡによって調製した同じｍＲＮＡ脂質ナノ粒子で処置したマウスの肝臓由来のものよりも約１０００％（すなわち、１０倍）高かった。表３は、投与の２４時間後に全ての用量について、プロセスＡによりおよびプロセスＢにより調製したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子で処置したマウスの肝臓から発現したｈＯＴＣタンパク質の特定量（総タンパク質のパーセントとして）を提供する。
表３ プロセスＡまたはプロセスＢにより製剤したｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の異なる用量（示した通り）の投与の２４時間後に測定したＩｎ ｖｉｖｏ ｈＯＴＣタンパク質発現。

【表3】

【0250】

表３が示す通り、プロセスＢにより調製したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子で処置したマウスの肝臓から発現したｈＯＴＣタンパク質の量は、全ての用量に渡り投与後２４時間で、プロセスＡによって調製したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子で処置した肝臓から発現したｈＯＴＣタンパク質の約７００％（約８倍）、最大約１０００％（約１１倍）超過した。プロセスＢによって調製されたｍＲＮＡ脂質ナノ粒子対プロセスＡによって調製されたｍＲＮＡ脂質ナノ粒子で処置したマウスの肝臓から発現したｈＯＴＣタンパク質の量の全体平均増加は、全ての投薬量に渡り投与後２４時間で８８４％（９．６５倍）であった。このデータは、プロセスＢによって製造したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子が、全ての用量で、投与後２４時間でプロセスＡにより産生された同一ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子よりも有意に強力であることを示している。

【0251】

図１９は、プロセスＡまたはプロセスＢで作製した脂質ナノ粒子製剤に封入した様々な用量（すなわち、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、および０．０１６ｍｇ／ｋｇ）のｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内注射の２４時間後のＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓組織におけるｈＯＴＣタンパク質量の比較を示す。図に示し得る通り、プロセスＢによって作製した製剤用量は、プロセスＡによって製造した製剤よりも組織１ｍｇ当たりより多いコピーのｈＯＴＣ ｍＲＮＡを生じた。図２０は、プロセスＡまたはプロセスＢにより作成した脂質ナノ粒子製剤に封入した様々な用量（すなわち、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇおよび０．０１６ｍｇ／ｋｇ）でのｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内注射の２４時間後のＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスの試験したＲＮＡにおけるｈＯＴＣタンパク質量の比較を示す。図において見られる通り、プロセスＢによって産生された製剤用量は、プロセスＡによって産生された製剤よりも、試験したＲＮＡ １μｇ当たり多いコピーのｈＯＴＣ ｍＲＮＡをもたらした。
実施例１５．動物モデルにおけるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子から発現したタンパク質による活性の持続時間

【0252】

この実施例では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子からｉｎ ｖｉｖｏで発現した例示的なタンパク質の活性は、少なくとも１５日間の延長した持続時間、持続した。

【0253】

この研究では、オスのｓｐｆ^ａｓｈマウスに、プロセスＢによって製造した１．０ｍｇ／ｋｇ ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の単回静脈内尾静脈注射を介して投与した。投与後２４時間（２日目）、４８時間（３日目）、７２時間（４日目）、９６時間（５日目）、８日（８日目）、１１日（１１日目）、および１５日（１５日目）のそれぞれの時間ポイントで、マウスのコホートを取り除いた。

【0254】

それぞれの取り除いたコホートについて、動物をアンモニア負荷に供し、その後、血漿アンモニア（μｍｏｌ／Ｌ）測定のために血液を採取した。その後、動物を屠殺し、シトルリン（シトルリンμｍｏｌ／ｈｒ／総タンパク質ｍｇ）と尿オロチン酸（μｍｏｌ／クレアチニン ｍｍｏｌ）を測定した。

【0255】

アンモニア負荷および血漿アンモニア測定については、一般的な概略図の図１６を、この試験の説明については、実施例１４を参照。

【0256】

シトルリン測定値のため、マウス肝臓ホモジネートを調製し、１×ＤＰＢＳで希釈し、その後、超純水に加えた。予め決めた量のシトルリン標準物を加え、内部参照として役立てた。リン酸カルバモイル、オルニチンおよびトリエタノールアミンを含む反応混合物を加え、３０分間、３７℃で反応を進行させた。リン酸と硫酸の混合物を使用して反応を停止させ、ジアセチルモノオキシムを加えた。試料を８５℃で３０分間インキュベートし、簡潔に冷却し、４９０ｎｍで読み取り、シトルリン標準に対してシトルリンを定量した。

【0257】

尿オロチン酸測定のため、動物の尿試料からのオロチン酸定量を、イオン交換カラムを使用した超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を介して行った。簡潔に記載すると、尿サンプルを、ＲＮａｓｅフリー水を使用して２倍に希釈し、一部をＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １００ｘカラムにローディングした。アセトニトリルと２５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む移動相によりオロチン酸が分離され、２８０ｎｍの吸光度に基づいた検出でオロチン酸が定量された。

【0258】

図２１は、プロセスＢにより産生された１．０ｍｇ／ｋｇ ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与後２４時間（２日目）、４８時間（３日目）、７２時間（４日目）、９６時間（５日目）、８日（８日目）、１１日（１１日目）、および１５日（１５日目）での、野生型マウス（ＷＴ）、未処置のｓｐｆ^ａｓｈマウス（未処置）、及びｓｐｆ^ａｓｈマウスのそれぞれについて、アンモニア負荷に供した４０分後の動物における血漿アンモニアを示す。破線は、野生型対照群（ＷＴ）の平均血漿アンモニアレベルを表す。図に示す結果によって見られるように、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の単回投与は、少なくとも１５日間、高アンモニア血症に対する有意な保護をもたらす。具体的には、負荷後の血漿アンモニアレベルは、野生型レベル（ＷＴ）に匹敵するか、または１５日まで評価したすべての時点で未処置のレベル（未処置）未満である。

【0259】

図２２は、プロセスＢにより製造した１．０ｍｇ／ｋｇ ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与後２４時間（２日目）、４８時間（３日目）、７２時間（４日目）、９６時間（５日目）、８日（８日目）、１１日（１１日目）、および１５日（１５日目）の野生型マウス（ＷＴ）、未処置のｓｐｆ^ａｓｈマウス（未処置）、及びｓｐｆ^ａｓｈマウスのそれぞれにおけるシトルリン産生により測定したｈＯＴＣタンパク質活性を示す。図に示す結果により見られる通り、単回用量のｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、野生型対照（ＷＴ）を超えるか、またはそれに匹敵する生じたシトルリンレベル、および１５日まで評価した全ての時点で未処置対照（未処置）をはるかに超える生じたシトルリンレベルをもたらす。

【0260】

図２３は、未処置のｓｐｆ^ａｓｈマウス（未処置）、プロセスＢにより産生された１．０ｍｇ／ｋｇ ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与後２４時間（２日目）、４８時間（３日目）、７２時間（４日目）、９６時間（５日目）、８日（８日目）、１１日（１１日目）、および１５日（１５日目）でのｓｐｆ^ａｓｈマウス、および未処置の野生型マウス（未処置のＣ５７ＢＬ／６）のそれぞれにおける維持した低レベルの尿オロチン酸産生により測定したｈＯＴＣタンパク質活性を示す。図に示される結果によって見られるように、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の単回投与は、野生型対照（未処置のＣ５７ＢＬ／６）よりも低いか、またはそれに匹敵する生じた低レベルの尿オロチン酸、および１５日まで評価した全ての時点で未処置ｓｐｆ^ａｓｈマウス（未処置）よりずっと少ない生じた低レベルの尿オロチン酸をもたらす。

【0261】

まとめると、本実施例のデータは、プロセスＢによって産生された例示的なｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の単回静脈内投与が、少なくとも１５日間、いくつかの測定にわたって活性な活性タンパク質を生じることを示す。
実施例１６．様々な用量でのｓｐｆ^ａｓｈマウスにおける発現したｈＯＴＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性

【0262】

本実施例は、３つの異なる用量レベル（１．０ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、及び０．３ｍｇ／ｋｇ）での、プロセスＢによって産生された脂質ナノ粒子を介して送達されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡが、評価した各用量でプロセスＡによって生成したものよりも予想外に強力であったことを説明する。

【0263】

この実施例では、ＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスに、プロセスＡまたはプロセスＢによって産生された脂質ナノ粒子に封入したｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内投与（様々な濃度、すなわち、１ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇで）投与した。これらのマウス由来の肝組織を、シトルリン産生の投与の２４時間後に解析した。

【0264】

図２４は、プロセスＡまたはプロセスＢにより作製した脂質ナノ粒子製剤に封入したｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内投与の２４時間後のＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓における発現したｈＯＴＣタンパク質（シトルリン産生に関する）の典型的な活性を表す。ｈＯＴＣ ｍＲＮＡを、１．０ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、および０．３ｍｇ／ｋｇの異なる投与レベルで投与した。

【0265】

一般的に、シトルリンの産生を使用して、発現したｈＯＴＣタンパク質の活性を評価することができる。図２４に示すように、ＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウス肝臓における発現したｈＯＴＣタンパク質によるシトルリン活性を、様々な用量レベルでの、それぞれプロセスＡおよびプロセスＢにより作製した脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の単回投与の２４時間後に測定した。図２４中のグラフは、上記のプロセス毎に製剤した、プロセスＡおよびプロセスＢによる脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後の発現したｈＯＴＣに起因するシトルリン活性を示す。

【0266】

図２４に示す結果は、予め形成した空の脂質ナノ粒子を用いてプロセスＢにより調製した製剤が、プロセスＡにより調製した製剤と比較した場合、ｈＯＴＣタンパク質のより高いシトルリン活性をもたらしたことを示す。

【0267】

図２５は、様々な投与レベル（すなわち、１．０ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、および０．３ｍｇ／ｋｇ）でのプロセスＡまたはプロセスＢによって作製したｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内投与後のウェスタンブロット画像によるマウス肝臓におけるｈＯＴＣタンパク質の免疫組織化学的検出を表す。図に示すように、全３種の用量で、発現したｈＯＴＣタンパク質は、バンドの強度が証拠とする通り、プロセスＡに比べてプロセスＢによって作製した脂質ナノ粒子製剤により投与した群についてより高かった。
実施例１７．ｓｐｆ^ａｓｈマウスにおける発現したｈＯＴＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性

【0268】

本実施例は、プロセスＢによって産生された脂質ナノ粒子を介して送達されたｈＯＴＣ
ｍＲＮＡが、プロセスＡによって生成したものよりも予想外に有効であったことを示している。

【0269】

図２６は、プロセスＡまたはプロセスＢによって作製した脂質ナノ粒子製剤に封入したｈＯＴＣ ｍＲＮＡの単回静脈内０．５ｍｇ／ｋｇ投与の２４時間後のＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウスの肝臓における発現したｈＯＴＣタンパク質（シトルリン産生に関する）の例示的活性を示す。

【0270】

一般的に、シトルリンの産生を使用して、発現したｈＯＴＣタンパク質の活性を評価することができる。図２６に示すように、ＯＴＣ ｓｐｆ^ａｓｈマウス肝臓における発現したｈＯＴＣタンパク質によるシトルリン活性を、用量を投与した２４時間後に測定し、結果は、等しい用量で、プロセスＢにより調製した製剤が、プロセスＡにより調製した製剤と比較して、ｈＯＴＣタンパク質のより高いシトルリン活性をもたらしたことを示す。

【0271】

図２７（ａ）～（ｄ）は、免疫組織化学染色を介した、プロセスＡまたはプロセスＢにより調製したｈＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与の２４時間後の、マウス肝臓中のｈＯＴＣタンパク質の免疫組織化学的検出を示す。図で見られるように、ｈＯＴＣタンパク質の染色は、プロセスＡ（図２７（ｃ）～（ｄ））と比較して、プロセスＢ（図２７（ａ）～（ｂ））により調製したＬＭＰ製剤を投与したマウス群についてより強かった。図２７（ａ）～（ｄ）に示す結果は、図２６に示す通り、プロセスＡと比較して、プロセスＢによって調製した製剤の用量のより高いシトルリン産生と合致する。
実施例１８．異なるカチオン性脂質を使用したプロセスＢおよびプロセスＡにより調製したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤のｉｎ ｖｉｖｏ発現

【0272】

本実施例は、プロセスＢによって産生された脂質ナノ粒子（様々な異なるカチオン性脂質から成る）を介して送達されたＥＰＯ ｍＲＮＡが、プロセスＡによって生成したものよりも予想外に効果的であったことを示している。

【0273】

この研究では、オスＣＤ１マウスに、１日目に、それぞれ、５つの異なるカチオン性脂質のうちの一つを使用して調製し、プロセスＡまたはプロセスＢにより作製した（前述のように）１．０ｍｇ／ｋｇ ｈＥＰＯ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の用量で単回静脈内尾静脈注射を投与した。

【0274】

表４は、ＥＬＩＳＡによって測定した、それぞれが、５種の異なるカチオン性脂質のうちの一つを使用して調製し、プロセスＡによってまたはプロセスＢによって製造したｈＥＰＯ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与後６時間で屠殺した動物の血清において測定した特定のｈＥＰＯタンパク質発現レベルをもたらす。これらの結果が示すように、マウス血清中で測定した、プロセスＢによって調製したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子から発現したｈＥＰタンパク質は、評価したすべての異なるカチオン性脂質に渡り、プロセスＡにより調製した同じｍＲＮＡ脂質ナノ粒子よりも実質的に高かった。増加率は１３３％～６０３％の範囲であり、研究で試験した５つの異なる脂質にわたって観察した１００％より高い効力の一貫した増加を伴った。

【0275】

図２８は、カチオン性脂質としてＨＧＴ ５００１を使用して製造したプロセスＡ及びプロセスＢによって作製した脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。図２９は、ＩＣＥをカチオン性脂質として使用して製剤化した、プロセスＡおよびプロセスＢによって産生された脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。図３０は、ｃＫＫ－Ｅ１２をカチオン性脂質として製剤化した、プロセスＡ及びプロセスＢによって作製した脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。図３１は、カチオン性脂質としてＣ１２－２００を使用して製剤した、プロセスＡ及びプロセスＢにより製造した質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。図３２は、カチオン性脂質としてＨＧＴ ４００３を使用して製剤した、プロセスＡ及びプロセスＢによって作製した脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤の送達後のｈＥＰＯタンパク質発現を表す。これらの図２８～３２グラフのそれぞれにおける結果が示す通り、マウス血清において測定した、 プロセスＢによって調製したｍＲＮＡ脂質ナノ粒子からの発現したｈＥＰＯタンパク質が、評価した５つの異なるカチオン性脂質全てにわたり、プロセスＡによって調製した同じｍＲＮＡ脂質ナノ粒子より実質的に高かった。
表４．プロセスＡまたはプロセスＢにより製剤したｈＥＰＯ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子（様々なカチオン性脂質に渡る）の投与の６時間後のマウス血清中で測定したｉｎ ｖｉｖｏヒトＥＰＯタンパク質発現。

【表4】

【0276】

表５は、様々なカチオン性脂質を使用して、プロセスＡまたはプロセスＢによって調製したｈＥＰＯ脂質ナノ粒子の構造詳細を示す。特に、表５は、異なるカチオン性脂質を用いるとき、プロセスＡまたはプロセスＢにより調製した、ｈＥＰＯ脂質ナノ粒子のナノ粒子サイズ（ｎｍ）およびＰｄＩを表す。表に示す通り、プロセスＢにより調製したｈＥＰＯ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子のナノ粒子サイズは、評価した５つのカチオン性脂質を使用して調製した全ナノ粒子に渡り約９０ｎｍ～１５０ｎｍであり、一方、プロセスＡにより調製したものは、評価した５つのカチオン性脂質を使用して調製した全ナノ粒子に渡り約７５ｎｍ～９５ｎｍであった。
表５

【表5】

【0277】

まとめると、本実施例のデータは、様々な異なる脂質成分を含む脂質ナノ粒子に渡り、プロセスＡによるものと比較して、プロセスＢにより産生されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子についての効力の実質的な増加が存在する。
均等

【0278】

当業者は、日常的な実験手法を越えない手法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【配列表】

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【外国語明細書】