特開 2023-166580 ＮＴ－３遺伝子治療のための方法及び材料

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023166580

(43)【公開日】2023-11-21

(54)【発明の名称】ＮＴ－３遺伝子治療のための方法及び材料

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20231114BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231114BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231114BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 3/02 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20231114BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/12 ZNA

C12N7/01

A61K35/76

A61P21/00

A61P25/00

A61K31/7088

A61K48/00

A61P35/00

A61P31/18

A61P5/14

A61P1/16

A61P13/12

A61P3/02

A61P3/10

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023151106

(22)【出願日】2023-09-19

(62)【分割の表示】P 2020522007の分割

【原出願日】2018-10-19

(31)【優先権主張番号】62/741,335

(32)【優先日】2018-10-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/574,828

(32)【優先日】2017-10-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/676,687

(32)【優先日】2018-05-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515289842

【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ザリフェ サヘンク

(57)【要約】

【課題】ニューロトロフィン３（ＮＴ－３）ポリヌクレオチドの組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）送達を提供すること。
【解決手段】本開示は、ｒＡＡＶ、並びに筋力を向上させ、筋成長を刺激し、筋ジストロフィー及びシャルコー・マリー・ツースニューロパチーなどの筋肉消耗疾患を治療するためのＮＴ－３遺伝子治療にｒＡＡＶを使用する方法を提供する。本開示は、対象における筋成長を刺激する方法を提供する。本方法は、治療的に有効な量のニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片、又はＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片をコードする核酸を、必要とする対象に投与することを含む。本開示は、ＮＴ－３の新規な効果、神経原性筋におけるタンパク質合成及び代謝リモデリングに直接影響を与えるその能力を説明する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／５７４，８２８号、２０１８年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６７６６８７号、及び２０１８年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／７４１，３３５号に対する優先権を主張するものであり、これらの開示内容は、全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

米国政府利益の記載
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた、認可番号ＮＳ１０５９８６及びＵ０１－ＮＳ０６６９１４の下での政府支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0003】

配列表の参照による援用
本出願は、本開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５３１２２Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；２０１８年１０月１８日に作成された１７，１３３バイトのＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0004】

本開示は、ニューロトロフィン３（ＮＴ－３）ポリヌクレオチドの組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）送達に関する。本開示は、ｒＡＡＶ、並びに筋力を向上させ、筋成長を刺激し、シャルコー・マリー・ツースニューロパチーなどの、ニューロパチー及び筋肉消耗疾患を治療するためのＮＴ－３遺伝子治療にｒＡＡＶを使用する方法を提供する。

【背景技術】

【0005】

最近の研究により、ニューロトロフィン３（ＮＴ－３）が、これまで知られていない又は正当に評価されていない特徴を有する多用途の分子であることが実証されている。末梢神経再生及びシュワン細胞（ＳＣ）に対するそのよく認識された効果に加えて、ＮＴ－３は、抗炎症及び免疫調節効果を有する。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｌ Ｔｉｔｅｒ，２２（２）：４４０－４５０（２０１４）。ＮＴ－３が、ヒトにおいて発生する慢性炎症性脱髄性末梢神経障害のげっ歯類モデルにおける自然発症自己免疫性末梢性多発ニューロパチーを軽減することが可能であることが最近実証された。Ｙａｌｖａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，２３（１）：９５－１０２（２０１５）。

【0006】

シャルコー・マリー・ツース（ＣＭＴ）ニューロパチーは、最も一般的な遺伝性ニューロパチーである。ＣＭＴ１は、突然変異されるときに４つの遺伝子によって引き起こされる５つのタイプのＣＭＴを含む。このグループは、ＣＭＴに罹患している人の大部分を含む。これらの遺伝子は、ＳＣ及び軸索を囲む髄鞘に関連しているが、それらは、様々な方法で相互作用し、したがって、表現型が不均一である。ＣＭＴ１Ａ型は、古典的なＣＭＴ１表現型の発生につながるＰＭＰ２２遺伝子を含む染色体１７ｐ１１のＤＮＡ重複の結果である。患者は、歩行補助具を必要とする重大な障害を引き起こす臨床兆候を２０歳以下で発生する。これらの患者において、末梢神経再生は、慢性ニューロパチーの一環として起こる長期の軸索切断及び除神経のために不完全である。ＮＴ－３は、神経再生を補助するシュワン細胞（ＳＣ）によって分泌される栄養因子である。除神経ＳＣが生存する能力は、ＳＣが、軸索成長を促進する足場である、成長因子及び基底膜の両方を提供するため、神経再生にとって重要である。長期の除神経は、除神経ＳＣの萎縮、ビュングナー帯の破壊、及びＳＣ基底膜足場の喪失をもたらす、再生に関連したＳＣ分子（神経栄養因子（ＮＴＦ）及びそれらの受容体）の発現の低下に関連した再生能の低下につながる。

【0007】

過去の研究は、シャルコー・マリー・ツース（ＣＭＴ）ニューロパチーのＴｒｅｍｂｌｅｒＪ（ＴｒＪ）マウスモデルにおけるＮＴ－３遺伝子治療が、ＳＣ数、有髄線維密度及びミエリン厚さの増加を伴い神経再生を改善するだけでなく、後肢の前部及び後部筋肉に示される、筋線維径も増加させることを示した。Ｓａｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２２（３）：５１１－５２１（２０１４）。過去の研究は、ニューロパチーの表現型が、速筋タイプＩＩ線維から遅筋タイプＩ線維への切り替えを含む、骨格筋の多様な変化を生じることが分かることを示した。ＴｒＪマウスにおいて、主に速筋タイプ線維から構成される長趾伸筋（ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌｏｎｇｕｓ）は、野生型（ＷＴ）と比較して著しく高いパーセンテージの遅筋線維を有することが分かっており、ヒラメ筋におけるタイプＩ線維のパーセンテージは、加齢に伴って劇的に増加した。Ｎｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，７２（１０）：９４２－９５４（２０１３）。興味深いことに、老化と並行して、ヒト及び他の哺乳動物における遅筋線維生成の同様の変化も起こる。Ｌａｒｓｓｏｎ Ｌ，Ｍｏｓｓ Ｒ，Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７２：５９５－６１４（１９９３）；Ｌａｒｓｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７２：Ｃ６３８－Ｃ６４９（１９９７）。

【0008】

常染色体優性疾患として遺伝されるＣＭＴ１Ａは、ＣＭＴの最も一般的なタイプである。ほとんどの場合、それは、相同染色体の不等乗換えによって生成される、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子を含む１７ｐ１１．２における１．５Ｍｂ重複によって引き起こされる（１）。これは、公知の治療なしでは緩徐に進行する疾患である。症状は、ほとんどの場合、２０歳以下で開始する。凹足及びハンマートウが存在する。短下肢装具などの歩行補助具が必要とされる。頻度は低いが、重篤な小児例では、車椅子又は人工呼吸器依存になり得る。典型的に、患者の９０％が、１６～３５ｍ／秒以下の、尺骨神経における運動神経伝導速度（ＮＣＶ）を有する（２）。遺伝的欠陥が、主にシュワン細胞（ＳＣ）に関与していたとしても、電気生理学的な臨床像は、長さ依存性の感覚運動型脱髄性ニューロパチーである。この臨床像は、シュワン細胞（ＳＣ）－軸索相互作用の障害に起因する軸索変性によって著しく影響される（３）。

【0009】

現在、この病態のための治療は存在しない。アスコルビン酸補給剤が、役立つと非常にもてはやされてきたが、多くの研究は、効果がないことを示した。低用量（１～２ｇ／日）（４～６）及び高用量療法（３～４ｇ／日）は両方とも、有益でないことが分かった（６、７）。最初に、ＮＴ－３の臨床試験は、治療後の腓腹神経生検における有髄神経線維の数の増加を伴い、治療の２４週間後の臨床的有効性を示した（８）。Ｔｒ^Ｊマウスにおいて、皮下ＮＴ－３治療は、軸索再生を改善し、髄鞘形成を促進した。しかしながら、ＮＴ－３の短い血中半減期は、持続的な皮下投与の大きな障害であることが分かり、この製品は中止された。

【0010】

多数の筋骨格疾患が、筋力の低下をもたらすことが示されている。これらとしては、限定はされないが、遺伝性若しくは劣性ミオパチー（筋ジストロフィーなど）、筋肉消耗疾患（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、関節リウマチ、癌、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び肝硬変などの基礎疾患に起因し得る悪液質など）、筋萎縮又は筋肉減衰の状態（老化の結果であり得るサルコペニアなど）、長期の不使用（麻痺、昏睡、長期の臥床、及びＩＣＵ在室など）、手術（人工関節置換術など）によって誘発される弱化、薬剤性ミオパチー及び横紋筋融解症が挙げられる。これらの疾患及び病態の筋肉の病理は、免疫、炎症、及び線維化反応の組合せによって、部分的に又は全体的に仲介される。これらの反応を遮断し、及び／又は損傷組織の再生を刺激することが可能な薬剤が、これらの障害における疾患の進行を遅らせるか又は食い止めることが可能であろう。

【0011】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損性パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５のヌクレオチド逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７において提供され；ＡＡＶ－２の完全ゲノムが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）において提供され；ＡＡＶ－３の完全ゲノムが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９において提供され；ＡＡＶ－４の完全ゲノムが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９において提供され；ＡＡＶ－５ゲノムが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６において提供され；ＡＡＶ－６の完全ゲノムが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００ １８６２において提供され；ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部が、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９において提供され；ＡＡＶ－９ゲノムが、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）において提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムが、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）において提供され；ＡＡＶ－１１ゲノムが、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）において提供される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング及び宿主細胞染色体組込みを指示するシス作用配列が、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモータ（それらの相対マップ位置のためにｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と命名される）が、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）に関連する２つのｒｅｐプロモータ（ｐ５及びｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２、及びｒｅｐ ４０）が生成される。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムを複製するのに関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモータから発現され、それは、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の生成に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。

【0012】

ＡＡＶは、例えば遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独自の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞障害性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、不顕性及び無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳類細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性がある。さらに、ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞に徐々に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）として、本質的にそれらの細胞の寿命の間、存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中のクローニングされたＤＮＡとして感染性であり、組み換えゲノムの構築を実現可能にする。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成及び組込みを指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）ゲノムの内部約４．３ｋｂの一部又は全てが、外来ＤＮＡで置換され得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、極めて安定した且つ丈夫なウイルスであることである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するのに使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐えるため、ＡＡＶの低温保存はそれほど重要でない。ＡＡＶは、凍結乾燥さえされ得る。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は、重複感染に耐性でない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｌ Ｔｉｔｅｒ，２２（２）：４４０－４５０（２０１４）

【非特許文献2】Ｙａｌｖａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，２３（１）：９５－１０２（２０１５）

【非特許文献3】Ｓａｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２２（３）：５１１－５２１（２０１４）

【非特許文献4】Ｎｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，７２（１０）：９４２－９５４（２０１３）

【非特許文献5】Ｌａｒｓｓｏｎ Ｌ，Ｍｏｓｓ Ｒ，Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７２：５９５－６１４（１９９３）

【非特許文献6】Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７２：Ｃ６３８－Ｃ６４９（１９９７）

【非特許文献7】Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）

【非特許文献8】Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）

【非特許文献9】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）

【非特許文献10】Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0014】

ＣＭＴニューロパチー及び他の筋肉消耗疾患のための療法を開発することが必要とされている。本発明は、ＣＭＴニューロパチー及び他の筋肉消耗疾患の治療のためにＮＴ－３を送達する遺伝子治療方法を提供する。

【0015】

本開示は、対象における筋成長を刺激する方法を提供する。本方法は、治療的に有効な量のニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片、又はＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片をコードする核酸を、必要とする対象に投与することを含む。本開示は、ＮＴ－３の新規な効果、神経原性筋におけるタンパク質合成及び代謝リモデリングに直接影響を与えるその能力を説明する。

【0016】

本開示の様々な実施形態において、本開示のＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片、又はＮＴ－３若しくはその有効な断片をコードする核酸は、筋肉内投与される。

【0017】

本開示の方法のいずれかにおいて、ＮＴ－３若しくはその有効な断片をコードする核酸は、ウイルスベクターを用いて投与される。特定の実施形態について、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。関連する実施形態において、本開示のＮＴ－３若しくはその有効な断片をコードする核酸は、３つ組の筋特異的クレアチンキナーゼプロモータなどの筋特異的プロモータに動作可能に連結される。様々な実施形態において、本開示のＮＴ－３若しくはその有効な断片をコードする核酸は、配列番号１を含む。

【0018】

本開示は、５’から３’の順に：（ｉ）第１のＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；（ｉｉ）配列番号１１のヌクレオチド１４７～８６０に記載される筋クレアチンキナーゼプロモータ／エンハンサー配列；（ｉｉｉ）ヒトＮＴ－３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び（ｉｖ）第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む核酸であって；ヒトＮＴ－３ポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか若しくは配列番号２と１００％同一であるか、又は配列番号１１のヌクレオチド１０７７～１８５０と９０％同一であるか若しくは配列番号１１のヌクレオチド１０７７～１８５０と１００％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する、核酸を提供する。

【0019】

ある実施形態において、本開示の核酸は、プロモータ／エンハンサーの３’側に、配列番号１１のヌクレオチド８９２～１０２４に記載されるキメライントロンをさらに含む。さらに、本開示の核酸は、ヒトＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列の３’側に、配列番号１１のヌクレオチド１８６０～２０５９に記載されるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。

【0020】

本開示の核酸のいずれかは、１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含み得る。例えば、核酸は、配列番号１１のヌクレオチド７～１１２に記載される第１のＩＴＲ、及び／又は配列番号１１のヌクレオチド２１２１～２２４８に記載される第２のＩＴＲを含み得る。

【0021】

ある実施形態において、核酸は、配列番号１１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３ゲノムを含む。

【0022】

本開示は、感染性である、本開示の核酸のいずれかを含む組み換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）も提供する。ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、又はＡＡＶｒｈ．７４などの任意のｒＡＡＶ血清型であり得る。さらに、本発明のｒＡＡＶ粒子のいずれかにおいて、ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ－１に由来する。

【0023】

本開示は、本開示のｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体を含む組成物も提供する。例えば、これらの組成物は、それを必要とする対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するために製剤化され、又はこれらの組成物は、それを必要とする対象における筋成長を刺激するために製剤化される。

【0024】

一実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療する方法であって、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸を、ヒト対象に投与する工程を含み；ここで、ａ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、ｂ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；ｃ）核酸が、配列番号２と少なくとも９０％であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ｄ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、本開示の核酸のいずれかであり、ｅ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量で投与され、ｆ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｇ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｈ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｉ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約４×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｊ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｋ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射であり、又はｌ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射である、方法を提供する。

【0025】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激する方法であって、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸を、ヒト対象に投与する工程を含み；ここで、ａ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、ｂ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；ｃ）核酸が、配列番号２と少なくとも９０％であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ｄ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、本開示の核酸のいずれかであり、ｅ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量で投与され、ｆ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｇ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｈ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｉ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約４×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｊ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｋ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射であり、又はｌ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射である、方法を提供する。

【0026】

本開示の方法のいずれかにおいて、核酸は、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて投与される。本開示の方法のいずれかは、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータなどの筋特異的プロモータに動作可能に連結される核酸を用いて行われ得る。さらに、本開示の方法のいずれかは、配列番号１１に記載されるＮＴ－３遺伝子カセットを含むｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３を用いて行われ得る。

【0027】

ある実施形態において、本開示は、ｓｃＡＡＶ１ベクター、自己相補性ＡＡＶ１血清型を用いて、筋特異的プロモータ、ｔＭＣＫの制御下でヒトニューロトロフィン－３遺伝子（ＮＴＦ３）を使用する遺伝子治療方法を提供する。本開示は、筋肉消耗疾患又はニューロパチーと診断された対象を治療する方法であって、ＮＴ－３を発現するＡＡＶベクターを投与することを含む方法を提供する。特に、本方法は、腓腹筋及び前脛骨筋における筋肉内（ＩＭ）注射によって構築物ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３を投与することを含む。例えば、ＮＴ－３を発現するＡＡＶベクター、例えばｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の筋肉内送達は、ＮＴ－３の局所産生及び循環中への分泌を開始させ、それによって、神経髄鞘形成及び線維再生を促進して、ＣＭＴ疾病表現型の安定化をもたらす。より具体的には、本開示は、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量又は約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量でｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３を投与する方法を提供する。ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３は、配列番号１１に記載されるＮＴ－３遺伝子カセットを含む。

【0028】

本開示は、筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための代替遺伝子治療として、ＮＴ－３を発現するＡＡＶベクターを投与する方法も提供する。ＮＴ－３は、短い半減期を有し、本開示の方法は、対象が内因性ＮＴ－３タンパク質を発現するとしても、ＮＴ－３タンパク質の持続放出のためにＡＡＶベクターを投与することを含む。代替遺伝子治療として、ＡＡＶベクターの投与は、筋細胞による持続的な分泌によってＮＴ－３タンパク質の持続的な送達を提供する。ＮＴ－３タンパク質のこの連続的で持続的な低い血中濃度は、毒性の最小のリスクで治療効果を提供する。遺伝子治療によるＮＴ－３の全身的な産生はまた、精製されたＮＴ－３ペプチドの反復注射と比較した際に、より好都合で且つコスト効率の高い治療選択肢である。

【0029】

本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療する方法であって、低濃度のＮＴ－３タンパク質の持続発現をもたらす組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量をヒト対象に投与する工程を含む、方法を提供する。

【0030】

本開示は、それを必要とするヒト対象における筋成長を刺激する方法であって、低濃度のＮＴ－３タンパク質の持続発現をもたらす組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量をヒト対象に投与する工程を含む、方法も提供する。

【0031】

一実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療する方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３をヒト対象に投与する工程を含み、ここで、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇである、方法を提供する。

【0032】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療する方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３をヒト対象に投与する工程を含み、ここで、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである、方法を提供する。

【0033】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療する方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３をヒト対象に投与する工程を含み、ここで、投与経路が、約１×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射である、方法を提供する。例えば、ｒＡＡＶは、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与され、例えば、各注入量は、０．５～１ｍｌであり、ここで、合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0034】

例示的な実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療する方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３をヒト対象に投与する工程を含み、ここで、投与経路が、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射である、方法を提供する。合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0035】

一実施形態において、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激する方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３をヒト対象に投与する工程を含み、ここで、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇである、方法を提供する。

【0036】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激する方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３をヒト対象に投与する工程を含み、ここで、投与経路が、筋肉内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである、方法を提供する。

【0037】

例示的な実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激する方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３をヒト対象に投与する工程を含み、ここで、投与経路が、約１×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射である、方法を提供する。例えば、ｒＡＡＶは、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与され、例えば、各注入量は、０．５～１ｍｌであり、ここで、合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0038】

例示的な実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激する方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３をヒト対象に投与する工程を含み、ここで、投与経路が、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて、低用量（患者当たり２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）及び高用量（患者当たり６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）で投与される約１×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射である、方法を提供する。合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0039】

本開示の方法のいずれかにおいて、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の投与経路は、腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭への筋肉内両側注射である。さらに、本発明の方法のいずれかにおいて、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の投与は、対象の上肢又は下肢における筋力の向上をもたらし、例えば、筋力の向上は、ＣＭＴ小児尺度（ＣＭＴ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｓｃａｌｅ）（ＣＭＴＰｅｄｓ）における複合スコアの減少として測定される。さらに、本発明の方法のいずれかにおいて、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の投与は、２年間の期間にわたって疾患進行の低下又は停止をもたらす。疾患進行は、ＣＭＴＰｅｄＳによって測定される。

【0040】

筋力はまた、筋電図検査、徒手筋力計（ｈａｎｄ ｈｅｌｄ ｍｙｏｍｅｔｒｙ）、固定システム筋力計、徒手筋力検査、及び／又はジェブセン（Ｊｅｂｓｅｎ）試験などの機能／活性試験、並びに６分間歩行試験、背臥位からの立ち上がり時間の計測（ｔｉｍｅｄ ｒｉｓｅ ｆｒｏｍ ｆｌｏｏｒ）、１０メートル歩行／走、４段昇る時間の計測（ｔｉｍｅｄ ｃｌｉｍｂ ４ ｓｔｅｐｓ）及び４段降りる時間（ｔｉｍｅ ｄｅｓｃｅｎｔ ４ ｓｔｅｐｓ）などの、対象が特定のタスクを実行するのにどのくらい時間がかかるかを評価する時間計測試験を用いて測定される。

【0041】

本開示の一態様において、本方法のいずれかにおいて、対象は、遺伝性ニューロパチー、例えばシャルコー・マリー・ツース（ＣＭＴ）ニューロパチー、例えばＣＭＴ１Ａ、ＣＭＴ２Ｋ、ＣＭＴ４Ａ、ＣＭＴＲＩＡ、並びに常染色体劣性遺伝的変異、若しくは常染色体優性遺伝的変異又はＸ連鎖遺伝的変異によって引き起こされる軸索及び脱髄性ニューロパチーに罹患している。遺伝性ニューロパチーは、表１に示される遺伝的変異のいずれかによって引き起こされ得る。さらに、遺伝性ニューロパチーは、以下の遺伝的変異：Ｖａｌ３０Ｍｅｔ、Ｉｌｅ１０７Ｖａｌ、及びＳｅｒ７７Ｔｙｒなどのトランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子の突然変異によって引き起こされるトランスサイレチン型アミロイドニューロパチーであり得る。

【0042】

本開示の別の態様において、本方法のいずれかにおいて、対象は、軸索消失及び／又は神経再生の障害を伴う後天性ニューロパチーに罹患している。後天性ニューロパチーは、ニューロパチーを引き起こすことが知られている任意の障害又は疾患によって引き起こされる末梢性ニューロパチーである。例えば、対象は、糖尿病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、甲状腺機能低下症などの甲状腺障害、低血糖症、尿毒症、腎不全、肝機能障害、肝不全、多血症、結合組織障害、癌、ライム病、セリアック病、ハンセン病、ポルフィリン症、シェーグレン症候群、ポリオウイルス感染症、末端肥大症、脂質／糖脂質代謝の障害、ウエストナイル病、アミロイド症、ミトコンドリア障害、良性単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）又はＰＯＥＭＳ症候群などの異常タンパク疾患によって引き起こされる末梢性ニューロパチーに罹患している。対象は、ビタミンＢ_１２欠乏症、ビタミンＥ欠乏症又は銅欠乏症などの、栄養／ビタミン欠乏症に罹患している。

【0043】

本開示のさらなる態様において、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、対象は、自己免疫性末梢性多発ニューロパチー、急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＡＩＤＰ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、血管炎による多発性単神経炎、パラニューロパチー（ｐａｒａｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、特発性神経節炎、筋萎縮性側索硬化症、多巣性運動伝導ブロックニューロパチー、又は下位運動ニューロン症候群に罹患している。

【0044】

後天性ニューロパチーは、中毒性ニューロパチーであり得る。例えば、中毒性ニューロパチーは、クロラムフェニコール、クロロキン、コルヒチン、ジスルフィラム、エタネルセプト、エタンブトール、金、ヒドロキシクロロキン、ニトロフラントイン、メトロニダゾール、スタブジン、ザルシタビン、インフリキシマブ、レフルノミド、サリドマイド又は化学療法剤（シスプラチン、シタラビン、ボルテゾミブ、ドセタキセル、レナリドミド、ミソニダゾール、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、スラミン、サリドマイド、ビンブラスチン若しくはビンクリスチンなど）、又はジスルフィラムなどの抗アルコール薬、又はフェニトイン若しくはダイランチンなどの抗けいれん薬、又は心臓若しくは血圧の薬剤（スタチン、アミオダロン、ヒドララジン、プロカインアミド、ペルヘキシリンなど）、又は抗生物質（フルオロキノロン、イソニアジド、Ｃｉｐｒｏ、Ｌｅｖａｑｕｉｎ、Ｆｌａｇｙｌ、若しくはメトロニダゾールなど）又はダプソンなどの皮膚状態治療薬などの、処方された薬剤の毒作用の結果である。中毒性ニューロパチーはまた、長期アルコール乱用又はビタミンＢ_６毒性によって引き起こされ得る。

【0045】

本開示の別の態様において、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、対象は、後天性ニューロパチーに罹患している癌患者である。例えば、癌患者は、栄養欠乏症、化学療法副作用、及び／又は腫瘍随伴症候群に関連したニューロパチーを発症している。

【0046】

本開示のさらに別の態様において、本方法のいずれかにおいて、対象は、後天性ニューロパチーに罹患している外科患者である。例えば、外科患者は、肥満症治療手術、複数回の整形外科手術、又は「絞扼神経」のための複数回の手術を受けた後にニューロパチーを発症している。

【0047】

本開示の別の態様において、本方法のいずれかにおいて、対象は、遺伝性ミオパチー、神経筋疾患、筋萎縮、薬物誘発性ミオパチー、サルコペニア、悪液質、タイプＩＩ筋線維萎縮、遺伝性筋ジストロフィー、加齢性筋萎縮又は後天性自己免疫性原発性筋疾患（ａｃｑｕｉｒｅｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｕｓｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）に罹患している。

【0048】

本開示の別の態様において、本方法のいずれかにおいて、対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、サルコグリカノパチー、筋強直性ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、ベスレムミオパチー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、脊髄性筋ジストロフィー、脊椎強直性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄ；肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ ２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏ及び２Ｑ；筋・眼・脳病；福山・ウォーカー・ワールブルグ症候群；筋無力症候群；先天性筋無力症；封入体ミオパチー；封入体筋炎；皮膚筋炎；中心核ミオパチー；三好型ミオパチー；ミトコンドリアミオパチー；ネマリンミオパチー；野中ミオパチー；重症筋無力症；又は多発性筋炎に罹患している。

【0049】

一実施形態において、本開示は、対象における筋成長を刺激するための薬剤の製造のための、治療的に有効な量のニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片、又はＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片をコードする核酸の使用を提供する。例えば、薬剤は、筋肉内投与のために製剤化される。

【0050】

例示的な実施形態において、薬剤は、ＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片をコードする核酸を含み、ここで、核酸は、ウイルスベクター中にある。関連する実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。様々な実施形態において、核酸は、３つ組の筋特異的クレアチンキナーゼプロモータなどの筋特異的プロモータに動作可能に連結される。様々な実施形態において、核酸は配列番号１を含む。

【0051】

本発明は、ヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための薬剤の製造のための、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸の使用であって、ここで、ａ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、ｂ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；ｃ）核酸が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ｄ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、本開示の核酸のいずれかであり、ｅ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量であり、ｆ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｇ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｈ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｉ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約４×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｊ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｋ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化され、又はｌ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化される、使用も提供する。

【0052】

本開示は、ヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するための薬剤の製造のための、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸の用量の使用であって、ここで、ａ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、ｂ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；ｃ）核酸が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ｄ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、本開示の核酸のいずれかであり、ｅ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量であり、ｆ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｇ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｈ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｉ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約４×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｊ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｋ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化され、又はｌ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、薬剤が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化される、使用も提供する。

【0053】

例えば、本開示の薬剤のいずれかは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いた投与のために製剤化される核酸を含み得る。さらに、本開示の薬剤のいずれかは、筋特異的プロモータに動作可能に連結される核酸を含み得、例えば、筋特異的プロモータは、筋特異的クレアチンキナーゼプロモータ（ＭＣＫ）である。別の実施形態において、薬剤又は本開示のいずれかにおいて、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３は、配列番号１１に記載されるＮＴ－３遺伝子カセットを含む。一実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、薬剤が、低濃度のＮＴ－３タンパク質の持続発現をもたらす、使用を提供する。

【0054】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋成長を刺激するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、用量が、低濃度のＮＴ－３タンパク質の持続発現をもたらす、使用を提供する。

【0055】

一実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、薬剤が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇである、ｒＡＡＶの用量を含む、使用を提供する。

【0056】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、薬剤が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである、ｒＡＡＶの用量を含む、使用を提供する。

【0057】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、薬剤が、約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌである、ｒＡＡＶの濃度を含む、使用を提供する。例えば、薬剤が、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（例えば各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて投与され、ここで、合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0058】

例示的な実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、薬剤が、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて投与される約１×１０^１３ｖｇ／ｍｌである、ｒＡＡＶの用量を含む、使用を提供する。合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0059】

一実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、薬剤が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇである、ｒＡＡＶの用量を含む、使用を提供する。

【0060】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、薬剤が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである、ｒＡＡＶの用量を含む、使用を提供する。

【0061】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、薬剤が、低用量（患者当たり２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）及び高用量（患者当たり６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）で投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌである、ｒＡＡＶの濃度を含む、使用を提供する。ある実施形態において、薬剤は、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（例えば各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて投与される。合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0062】

例示的な実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するための薬剤の調製のための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用であって、薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、薬剤が、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて、低用量（患者当たり２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）及び高用量（患者当たり６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）で投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌである、ｒＡＡＶの濃度を含む、使用を提供する。合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0063】

本開示の使用のいずれかにおいて、薬剤は、腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭への筋肉内両側注射のために製剤化される。さらに、本発明の使用のいずれかにおいて、薬剤は、対象の上肢又は下肢における筋力の向上をもたらし、例えば、筋力の向上は、ＣＭＴ小児尺度（ＣＭＴ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｓｃａｌｅ）（ＣＭＴＰｅｄｓ）における複合スコアの減少として測定される。さらに、本発明の使用のいずれかにおいて、この薬剤は、２年間の期間にわたって疾患進行の低下又は停止をもたらす。疾患進行は、ＣＭＴＰｅｄＳによって測定される。

【0064】

本開示の一態様において、本開示の使用のいずれかにおいて、対象は、シャルコー・マリー・ツース（ＣＭＴ）ニューロパチー、例えばＣＭＴ１Ａ、ＣＭＴ２Ｋ、ＣＭＴ４Ａ、ＣＭＴＲＩＡ、並びに常染色体劣性遺伝的変異、若しくは常染色体優性遺伝的変異又はＸ連鎖遺伝的変異によって引き起こされる軸索及び脱髄性ニューロパチーなどの遺伝性ニューロパチーに罹患している。遺伝性ニューロパチーは、表１に示される遺伝的変異のいずれかによって引き起こされ得る。さらに、遺伝性ニューロパチーは、以下の遺伝的変異：Ｖａｌ３０Ｍｅｔ、Ｉｌｅ１０７Ｖａｌ、及びＳｅｒ７７Ｔｙｒなどのトランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子の突然変異によって引き起こされるトランスサイレチン型アミロイドニューロパチーであり得る。

【0065】

本開示の別の態様において、本発明の方法のいずれかにおいて、対象は、軸索消失及び／又は神経再生の障害を伴う後天性ニューロパチーに罹患している。後天性ニューロパチーは、ニューロパチーを引き起こす任意の障害又は疾患によって引き起こされる末梢性ニューロパチーである。例えば、対象は、糖尿病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、甲状腺機能低下症などの甲状腺障害、低血糖症、尿毒症、腎不全、肝機能障害、肝不全、多血症、結合組織障害、癌、ライム病、セリアック病、ハンセン病、ポルフィリン症、シェーグレン症候群、ポリオウイルス感染症、末端肥大症、脂質／糖脂質代謝の障害、ウエストナイル病、アミロイド症、ミトコンドリア障害、良性単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）又はＰＯＥＭＳ症候群などの異常タンパク疾患によって引き起こされる末梢性ニューロパチーに罹患している。対象は、ビタミンＢ_１２欠乏症、ビタミンＥ欠乏症又は銅欠乏症などの、栄養／ビタミン欠乏症に罹患していてもよい。

【0066】

さらに、本開示の使用のいずれかにおいて、対象は、自己免疫性末梢性多発ニューロパチー、急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＡＩＤＰ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、血管炎による多発性単神経炎、パラニューロパチー、特発性神経節炎、筋萎縮性側索硬化症、多巣性運動伝導ブロックニューロパチー、又は下位運動ニューロン症候群に罹患している。

【0067】

後天性ニューロパチーは、中毒性ニューロパチーである。例えば、中毒性ニューロパチーは、クロラムフェニコール、クロロキン、コルヒチン、ジスルフィラム、エタネルセプト、エタンブトール、金、ヒドロキシクロロキン、ニトロフラントイン、メトロニダゾール、スタブジン、ザルシタビン、インフリキシマブ、レフルノミド、サリドマイド又は化学療法剤（シスプラチン、シタラビン、ボルテゾミブ、ドセタキセル、レナリドミド、ミソニダゾール、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、スラミン、サリドマイド、ビンブラスチン若しくはビンクリスチンなど）、又はジスルフィラムなどの抗アルコール薬、又はフェニトイン若しくはダイランチンなどの抗けいれん薬、又は心臓若しくは血圧の薬剤（スタチン、アミオダロン、ヒドララジン、プロカインアミド、ペルヘキシリンなど）、又は抗生物質（フルオロキノロン、イソニアジド、Ｃｉｐｒｏ、Ｌｅｖａｑｕｉｎ、Ｆｌａｇｙｌ、若しくはメトロニダゾールなど）、又はダプソンなどの皮膚状態治療薬などの、処方された薬剤の毒作用の結果である。中毒性ニューロパチーは、長期アルコール乱用又はビタミンＢ_６毒性によって引き起こされ得る。

【0068】

別の態様において、本開示の使用のいずれかにおいて、対象は、後天性ニューロパチーに罹患している癌患者である。例えば、癌患者は、栄養欠乏症、化学療法副作用、及び／又は腫瘍随伴症候群に関連したニューロパチーを発症している。

【0069】

さらに別の態様において、本開示の使用のいずれかにおいて、対象は、後天性ニューロパチーに罹患している外科患者である。例えば、外科患者は、肥満症治療手術、複数回の整形外科手術、又は「絞扼神経」のための複数回の手術を受けた後にニューロパチーを発症している。

【0070】

別の態様において、本開示の使用のいずれかにおいて、対象は、遺伝性ミオパチー、神経筋疾患、筋萎縮、薬物誘発性ミオパチー、サルコペニア、悪液質、タイプＩＩ筋線維萎縮、遺伝性筋ジストロフィー、加齢性筋萎縮又は後天性自己免疫性原発性筋疾患に罹患している。

【0071】

別の態様において、本開示の使用のいずれかにおいて、対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、サルコグリカノパチー、筋強直性ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、ベスレムミオパチー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、脊髄性筋ジストロフィー、脊椎強直性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄ；肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ ２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏ及び２Ｑ；筋・眼・脳病；福山・ウォーカー・ワールブルグ症候群；筋無力症候群；先天性筋無力症；封入体ミオパチー；封入体筋炎；皮膚筋炎；中心核ミオパチー；三好型ミオパチー；ミトコンドリアミオパチー；ネマリンミオパチー；野中ミオパチー；重症筋無力症；又は多発性筋炎に罹患している。

【0072】

一実施形態において、本開示は、対象における筋成長を刺激するのに使用するための、治療的に有効な量のニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片、又はＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片をコードする核酸を含む組成物を提供する。例えば、本開示の組成物は、筋肉内投与のために製剤化される。

【0073】

例示的な実施形態において、この組成物は、ＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片をコードする核酸を含む。関連する実施形態において、核酸は、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクター中にある。様々な実施形態において、核酸は、３つ組の筋特異的クレアチンキナーゼプロモータなどの筋特異的プロモータに動作可能に連結される。様々な実施形態において、この組成物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

【0074】

本開示は、ヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するのに使用するための、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物であって、ここで、ａ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、ｂ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；ｃ）核酸が、配列番号２と少なくとも９０％であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ｄ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、本開示の核酸のいずれかであり、ｅ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量で投与され、ｆ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｇ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｈ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｉ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約４×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｊ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｋ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化され、又はｌ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化される、組成物も提供する。

【0075】

別の実施形態において、本開示は、ヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するのに使用するための、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物であって、ここで、ａ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、ｂ）核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；ｃ）核酸が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ｄ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、本開示の核酸のいずれかであり、ｅ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量であり、ｆ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｇ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｈ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｉ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約４×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｊ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、ｒＡＡＶの用量が、約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、ｋ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化され、又はｌ）ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、組成物が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化される、組成物を提供する。

【0076】

例えば、本開示の組成物のいずれかは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いた投与のために製剤化される核酸を含み得る。さらに、本開示の組成物のいずれかは、筋特異的プロモータに動作可能に連結される核酸を含み得、例えば、筋特異的プロモータは、筋特異的クレアチンキナーゼプロモータ（ＭＣＫ）である。別の実施形態において、組成物又は本開示のいずれかにおいて、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３は、配列番号１１に記載されるＮＴ－３遺伝子カセットを含む。

【0077】

一実施形態において、本開示は、低濃度のＮＴ－３タンパク質の持続発現をもたらす、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量を含む組成物を提供する。

【0078】

別の実施形態において、本開示は、低濃度のＮＴ－３タンパク質の持続発現をもたらす、それを必要とするヒト対象における筋成長を刺激するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の使用を提供する。

【0079】

一実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量を含む組成物であって、組成物が、筋肉内投与のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇである、組成物を提供する。

【0080】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量を含む組成物であって、組成物が、筋肉内投与のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである、組成物を提供する。

【0081】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量を含む組成物であって、組成物が、筋肉内投与のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、低用量（患者当たり２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）及び高用量（患者当たり６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）で投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌである、組成物を提供する。ある実施形態において、この組成物は、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて投与される。合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0082】

例示的な実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量を含む組成物であって、組成物が、筋肉内投与のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて、低用量（患者当たり２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）及び高用量（患者当たり６×１０^１２ｖｇ／ｋｇで投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌである、組成物を提供する。合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0083】

一実施形態において、本開示は、ヒト対象における筋力を向上させるための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量を含む組成物であって、組成物が、筋肉内投与のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇである、組成物を提供する。

【0084】

別の実施形態において、本開示は、ヒト対象における筋力を向上させるための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量を含む組成物であって、組成物が、筋肉内投与のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、又は約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである、組成物を提供する。

【0085】

別の実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量を含む組成物であって、組成物が、筋肉内投与のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、低用量（患者当たり２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）及び高用量（患者当たり６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）で投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌである、組成物を提供する。ある実施形態において、この組成物は、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて投与される。合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0086】

例示的な実施形態において、本開示は、それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の用量を含む組成物であって、組成物が、筋肉内投与のために製剤化され、投与されるｒＡＡＶの用量が、それぞれ筋肉当たり３～６回の注射（各注入量は、０．５～１ｍｌである）を用いて、低用量（患者当たり２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）及び高用量（患者当たり６×１０^１２ｖｇ／ｋｇで投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌである、組成物を提供する。合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、各脚における腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭に投与される。

【0087】

本開示の組成物のいずれかにおいて、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の投与経路は、腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭への筋肉内両側注射である。さらに、本発明の組成物のいずれかにおいて、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の投与は、対象の上肢又は下肢における筋力の向上をもたらし、例えば、筋力の向上は、ＣＭＴ小児尺度（ＣＭＴ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｓｃａｌｅ）（ＣＭＴＰｅｄＳ）における複合スコアの減少として測定される。さらに、本開示の組成物のいずれかにおいて、この組成物の投与は、２年間の期間にわたって疾患進行の低下又は停止をもたらす。疾患進行は、ＣＭＴＰｅｄＳによって測定される。ＣＭＴＰｅｄＳは、機能的巧緻性試験（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｅｘｔｅｒｉｔｙ Ｔｅｓｔ）、９ホールペグ試験（Ｎｉｎｅ－Ｈｏｌｅ Ｐｅｇ Ｔｅｓｔ）（９ＨＰＴ）、徒手筋力計を用いたハンドグリップ、足底屈、及び足の背屈強度、針刺し及び振動感覚、ブルイニンクス・オセレツキー試験－バランス評価、歩容評価、走り幅跳び、及び６分間歩行試験（６ＭＷＴ）から構成される１１項目の尺度である。遺伝子導入の２年後の時点でこの尺度によって測定される能力の低下の停止として定義される有効性。

【0088】

本開示の態様において、この組成物のいずれかにおいて、対象は、遺伝性ニューロパチー、例えばシャルコー・マリー・ツース（ＣＭＴ）ニューロパチー、例えばＣＭＴ１Ａ、ＣＭＴ２Ｋ、ＣＭＴ４Ａ、ＣＭＴＲＩＡ、並びに常染色体劣性遺伝的変異、若しくは常染色体優性遺伝的変異又はＸ連鎖遺伝的変異によって引き起こされる軸索及び脱髄性ニューロパチーに罹患している。遺伝性ニューロパチーは、表１に示される遺伝的変異のいずれかによって引き起こされ得る。さらに、遺伝性ニューロパチーは、以下の遺伝的変異：Ｖａｌ３０Ｍｅｔ、Ｉｌｅ１０７Ｖａｌ、及びＳｅｒ７７Ｔｙｒなどのトランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子の突然変異によって引き起こされるトランスサイレチン型アミロイドニューロパチーであり得る。

【0089】

本開示の別の態様において、この組成物のいずれかにおいて、対象は、軸索消失及び／又は神経再生の障害を伴う後天性ニューロパチーに罹患している。後天性ニューロパチーは、ニューロパチーを引き起こす任意の障害又は疾患によって引き起こされる末梢性ニューロパチーである。例えば、対象は、糖尿病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、甲状腺機能低下症などの甲状腺障害、低血糖症、尿毒症、腎不全、肝機能障害、肝不全、多血症、結合組織障害、癌、ライム病、セリアック病、ハンセン病、ポルフィリン症、シェーグレン症候群、ポリオウイルス感染症、末端肥大症、脂質／糖脂質代謝の障害、ウエストナイル病、アミロイド症、ミトコンドリア障害、良性単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）又はＰＯＥＭＳ症候群などの異常タンパク疾患によって引き起こされる末梢性ニューロパチーに罹患している。対象は、ビタミンＢ_１２欠乏症、ビタミンＥ欠乏症又は銅欠乏症などの、栄養／ビタミン欠乏症に罹患している。

【0090】

さらに、本開示の組成物のいずれかにおいて、対象は、自己免疫性末梢性多発ニューロパチー、急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＡＩＤＰ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、血管炎による多発性単神経炎、パラニューロパチー、特発性神経節炎、筋萎縮性側索硬化症、多巣性運動伝導ブロックニューロパチー、又は下位運動ニューロン症候群に罹患している。

【0091】

本開示の組成物のいずれかにおいて、後天性ニューロパチーは、中毒性ニューロパチーである。例えば、中毒性ニューロパチーは、クロラムフェニコール、クロロキン、コルヒチン、ジスルフィラム、エタネルセプト、エタンブトール、金、ヒドロキシクロロキン、ニトロフラントイン、メトロニダゾール、スタブジン、ザルシタビン、インフリキシマブ、レフルノミド、サリドマイド又は化学療法剤（シスプラチン、シタラビン、ボルテゾミブ、ドセタキセル、レナリドミド、ミソニダゾール、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、スラミン、サリドマイド、ビンブラスチン若しくはビンクリスチンなど）、又はジスルフィラムなどの抗アルコール薬、又はフェニトイン若しくはダイランチンなどの抗けいれん薬、又は心臓若しくは血圧の薬剤（スタチン、アミオダロン、ヒドララジン、プロカインアミド、ペルヘキシリンなど）、又は抗生物質（フルオロキノロン、イソニアジド、Ｃｉｐｒｏ、Ｌｅｖａｑｕｉｎ、Ｆｌａｇｙｌ、若しくはメトロニダゾールなど）及びダプソンなどの皮膚状態治療薬などの、処方された薬剤の毒作用の結果である。中毒性ニューロパチーはまた、長期アルコール乱用又はビタミンＢ_６毒性によって引き起こされる。

【0092】

本開示の別の態様において、この組成物のいずれかにおいて、対象は、後天性ニューロパチーに罹患している癌患者である。例えば、癌患者は、栄養欠乏症、化学療法副作用、及び／又は腫瘍随伴症候群に関連したニューロパチーを発症している。

【0093】

本開示のさらに別の態様において、この組成物のいずれかにおいて、対象は、後天性ニューロパチーに罹患している外科患者である。例えば、外科患者は、肥満症治療手術、複数回の整形外科手術、又は「絞扼神経」のための複数回の手術を受けた後にニューロパチーを発症している。

【0094】

本開示の別の態様において、このいずれかにおいて、対象は、遺伝性ミオパチー、神経筋疾患、筋萎縮、薬物誘発性ミオパチー、サルコペニア、悪液質、タイプＩＩ筋線維萎縮、遺伝性筋ジストロフィー、加齢性筋萎縮又は後天性自己免疫性原発性筋疾患に罹患している。

【0095】

本開示の別の態様において、この組成物のいずれかにおいて、対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、サルコグリカノパチー、筋強直性ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、ベスレムミオパチー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、脊髄性筋ジストロフィー、脊椎強直性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄ；肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ ２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏ及び２Ｑ；筋・眼・脳病；福山・ウォーカー・ワールブルグ症候群；筋無力症候群；先天性筋無力症；封入体ミオパチー；封入体筋炎；皮膚筋炎；中心核ミオパチー；三好型ミオパチー；ミトコンドリアミオパチー；ネマリンミオパチー；野中ミオパチー；重症筋無力症；又は多発性筋炎に罹患している。

【0096】

本開示の別の態様において、この組成物のいずれかにおいて、対象は、圧迫、ダブルクラッシュ又は切断によって引き起こされる神経損傷などの外傷性神経損傷に罹患している。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
５’から３’の順に：
（ｉ）第１のＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；
（ｉｉ）配列番号１１のヌクレオチド１４７～８６０に記載される筋クレアチンキナーゼプロモータ／エンハンサー配列；
（ｉｉｉ）ヒトＮＴ－３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び
（ｉｖ）第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列
を含む核酸であって；
前記ヒトＮＴ－３ポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか若しくは配列番号２と１００％同一であるか、又は配列番号１１のヌクレオチド１０７７～１８５０と９０％同一であるか若しくは配列番号１１のヌクレオチド１０７７～１８５０と１００％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する、核酸。（項目２）
前記プロモータ／エンハンサーの３’側に、配列番号１１のヌクレオチド８９２～１０２４に記載されるキメライントロンをさらに含む、項目１に記載の核酸。
（項目３）
ヒトＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列の３’側に、配列番号１１のヌクレオチド１８６０～２０５９に記載されるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目１又は２に記載の核酸。
（項目４）
前記第１のＩＴＲが、配列番号１１のヌクレオチド７～１１２に記載され、及び／又は
前記第２のＩＴＲが、配列番号１１のヌクレオチド２１２１～２２４８に記載される、項目１～３のいずれか一項に記載の核酸。
（項目５）
前記第１のＩＴＲが、配列番号１１のヌクレオチド７～１１２に記載され、
前記第２のＩＴＲが、配列番号１１のヌクレオチド２１２１～２２４８に記載される、項目１～３のいずれか一項に記載の核酸。
（項目６）
配列番号１１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３ゲノムを含む核酸。
（項目７）
配列番号１１に記載されるｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３ゲノムを含む核酸。
（項目８）
感染性である、項目１～７のいずれか一項に記載の核酸を含む組み換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）。
（項目９）
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、又はＡＡＶｒｈ．７４である、項目８に記載のｒＡＡＶ粒子。
（項目１０）
前記ｒＡＡＶゲノム中の前記ＡＡＶ ＤＮＡが、ＡＡＶ－１に由来する、項目８～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子。
（項目１１）
項目８～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目１２）
前記組成物が、それを必要とする対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するために製剤化される、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記組成物が、それを必要とする対象における筋成長を刺激するために製剤化される、項目１１に記載の組成物。
（項目１４）
それを必要とするヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療する方法であって、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸を、前記ヒト対象に投与する工程を含み；ここで、
ａ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、
ｂ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；
ｃ）前記核酸が、配列番号２と少なくとも９０％であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、
ｄ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、項目１～７のいずれか一項に記載の核酸であり、
ｅ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量で投与され、
ｆ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｇ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｈ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｉ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約４×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｊ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｋ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射であり、又は
ｌ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射である、方法。
（項目１５）
それを必要とするヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激する方法であって、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸を、前記ヒト対象に投与する工程を含み；ここで、
ａ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、
ｂ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；
ｃ）前記核酸が、配列番号２と少なくとも９０％であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、
ｄ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、項目１～７のいずれか一項に記載の核酸であり、
ｅ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量で投与され、
ｆ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｇ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｈ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｉ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約４×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｊ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、筋肉内経路であり、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約６×１０１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｋ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射であり、又は
ｌ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、投与経路が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射である、方法。
（項目１６）
前記核酸が、ウイルスベクターを用いて投与される、項目１４又は１５に記載の方法。（項目１７）
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸が、筋特異的プロモータに動作可能に連結される、項目１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記筋特異的プロモータが、筋特異的クレアチンキナーゼプロモータである、項目１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３が、配列番号１１に記載されるＮＴ－３遺伝子カセットを含む、項目１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記投与経路が、筋肉内注射である、項目１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記投与経路が、腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭への筋肉内両側注射である、項目１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記対象において向上される筋力が、上肢又は下肢内にある、項目１５～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記筋力の向上が、ＣＭＴ小児尺度（ＣＭＴＰｅｄｓ）における複合スコアの低下として、又は２年間の期間にわたる疾患進行の低下として測定される、項目１５～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
ヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するのに使用するための、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物であって、ここで：
ａ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、
ｂ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；
ｃ）前記核酸が、配列番号２と少なくとも９０％であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、
ｄ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、項目１～７のいずれか一項に記載の核酸であり、
ｅ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量で投与され、
ｆ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｇ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｈ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｉ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｊ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｋ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化され、又は
ｌ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化される、組成物。
（項目２６）
ヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するのに使用するための、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物であって、ここで、
ａ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、
ｂ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；
ｃ）前記核酸が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、
ｄ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、項目１～７のいずれか一項に記載の核酸であり、
ｅ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量であり、
ｆ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｇ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｈ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｉ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｊ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｋ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化され、又は
ｌ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化される、組成物。
（項目２７）
前記核酸が、ウイルスベクターを用いた投与のために製剤化される、項目２５又は２６に記載の組成物。
（項目２８）
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
前記核酸が、筋特異的プロモータに動作可能に連結される、項目２５～２８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３０）
前記筋特異的プロモータが、筋特異的クレアチンキナーゼプロモータである、項目２５～２９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３１）
前記ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３が、配列番号１１に記載されるＮＴ－３遺伝子カセットを含む、項目２５～２９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
前記組成物が、筋肉内注射のために製剤化される、項目２５～３１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３）
前記組成物が、腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭への筋肉内両側注射のために製剤化される、項目２５～３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３４）
前記向上される筋力が、前記対象の上肢又は下肢内にある、項目２６～３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５）
前記筋力の向上が、ＣＭＴ小児尺度（ＣＭＴＰｅｄｓ）における複合スコアの低下として、又は２年間の期間にわたる疾患進行の低下として測定される、項目２６～３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
ヒト対象における筋肉消耗疾患又はニューロパチーを治療するための薬剤の製造のための、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸の使用であって、ここで：
ａ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、
ｂ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；
ｃ）前記核酸が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、
ｄ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、項目１～７のいずれか一項に記載の核酸であり、
ｅ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量であり、
ｆ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｇ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｈ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｉ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｊ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｋ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化され、又は
ｌ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化される、使用。
（項目３７）
ヒト対象における筋力を向上させるか又は筋成長を刺激するための薬剤の製造のための、ＮＴ－３ポリペプチドをコードする核酸の用量の使用であって、ここで：
ａ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列と９０％同一のヌクレオチド配列を含み、
ｂ）前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含み；
ｃ）前記核酸が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか又は配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、
ｄ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、項目１～７のいずれか一項に記載の核酸であり、
ｅ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記ｒＡＡＶが、低濃度のＮＴ－３ポリペプチドの持続発現をもたらす用量であり、
ｆ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記組成物が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｇ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｈ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｉ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、前記ｒＡＡＶの用量が、約４×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｊ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、筋肉内投与経路のために製剤化され、投与される前記ｒＡＡＶの用量が、約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇであり、
ｋ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、約０．５～１ｍｌの筋肉当たり３～６回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化され、又は
ｌ）前記ＮＴ－３ポリペプチドをコードする前記核酸が、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３であり、前記薬剤が、約５～１４ｍｌの総体積での複数回の注射を用いて投与される約２×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度での筋肉内注射のために製剤化される、使用。
（項目３８）
前記核酸が、ウイルスベクターを用いた投与のために製剤化される、項目３６又は３７に記載の使用。
（項目３９）
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、項目３６～３８のいずれか一項に記載の使用。
（項目４０）
前記核酸が、筋特異的プロモータに動作可能に連結される、項目３６～３９のいずれか一項に記載の使用。
（項目４１）
前記筋特異的プロモータが、筋特異的クレアチンキナーゼプロモータである、項目３６～４０のいずれか一項に記載の使用。
（項目４２）
前記ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３が、配列番号１１に記載されるＮＴ－３遺伝子カセットを含む、項目３６～４１のいずれか一項に記載の使用。
（項目４３）
薬剤が、筋肉内注射のために製剤化される、項目３６～４２のいずれか一項に記載の使用。
（項目４４）
薬剤が、腓腹筋及び前脛骨筋の内側頭及び外側頭への筋肉内両側注射のために製剤化される、項目３６～４３のいずれか一項に記載の使用。
（項目４５）
前記対象において向上される筋力が、上肢又は下肢内にある、項目３７～４４のいずれか一項に記載の使用。
（項目４６）
前記筋力の向上が、ＣＭＴ小児尺度（ＣＭＴＰｅｄｓ）における複合スコアの低下として、又は２年間の期間にわたる疾患進行の低下として測定される、項目３７～４５のいずれか一項に記載の使用。
（項目４７）
前記対象が、筋萎縮を発症するリスクがある、項目１４～４６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
（項目４８）
前記対象が、筋萎縮に罹患している、項目１４～４６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
（項目４９）
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、項目１４～４６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
（項目５０）
前記対象が、ニューロパチーに罹患している、項目１４～４６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
（項目５１）
前記対象が、シャルコー・マリー・ツース（ＣＭＴ）ニューロパチーに罹患している、項目１４～４６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
（項目５２）
前記対象が、表１に示される遺伝的変異の１つを有する、項目５１に記載の方法、組成物又は使用。
（項目５２）
前記対象が、トランスサイレチン型アミロイドニューロパチーに罹患している、項目１４～４６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
（項目５３）
前記対象が、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ、Ｉｌｅ１０７Ｖａｌ、及びＳｅｒ７７Ｔｙｒの遺伝的変異の１つを有する、項目５２に記載の方法、組成物又は使用。
（項目５４）
前記対象が、癌、糖尿病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、甲状腺障害、甲状腺機能低下症、低血糖症、尿毒症、腎不全、肝機能障害、肝不全、多血症、結合組織障害、ライム病、セリアック病、ハンセン病、ポルフィリン症、シェーグレン症候群、ポリオウイルス感染症、末端肥大症、脂質／糖脂質代謝の障害、ウエストナイル病、アミロイド症、ミトコンドリア障害、異常タンパク疾患、良性単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ＰＯＥＭＳ症候群、栄養／ビタミン欠乏症、ビタミンＢ_１２欠乏症、ビタミンＥ欠乏症又は銅欠乏症によって引き起こされる後天性ニューロパチーに罹患している、項目１４～４６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。
（項目５５）
前記対象が、遺伝性ミオパチー、末梢性ニューロパチー、中毒性ニューロパチー、自己免疫性末梢性多発ニューロパチー、急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＡＩＤＰ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、血管炎による多発性単神経炎、パラニューロパチー、特発性神経節炎、筋萎縮性側索硬化症、多巣性運動伝導ブロックニューロパチー、又は下位運動ニューロン症候群、神経筋疾患、筋萎縮、薬剤性ミオパチー、サルコペニア、悪液質、タイプＩＩ筋線維萎縮、加齢性筋萎縮又は後天性自己免疫性原発性筋疾患に罹患している、項目１４～４６のいずれか一項に記載の方法、組成物又は使用。

【0097】

本発明は、以下の図を参照することによって、より容易に理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0098】

【図1-1】ＴｒＪ筋肉におけるＡＡＶ１．ＮＴ－３誘発性線維タイプリモデリングを示すグラフ及び画像を示す。注射の１６週間後の時点でのＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴ－３処理Ｔｒｅｍｂｌｅｒ Ｊ（ＴｒＪ）（図１Ａ）及び非処理（ＴｒＪ－ＰＢＳ）腓腹筋（図１Ｂ）のＳＤＨ染色した組織切片の代表的な画像。遅筋（Ｓｌｏｗ ｔｗｉｔｃｈ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ）（ＳＴＯ、矢印）、中間筋（ｆａｓｔ ｔｗｉｔｃｈ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ）（ＦＴＯ、矢じり）及び速筋（ｆａｓｔ ｔｗｉｔｃｈ ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ）（ＦＴＧ、アスタリスク）が示される（図１Ｂ）。有酸素系の線維（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｆｉｂｅｒ）がａにおいて減少される。ＴｒＪ－ＰＢＳ筋肉（図１Ｂ）において、増加した数の小さいＳＴＯ線維及び全ての線維タイプの角張った線維が、神経変化に適合する小さいタイプの集団に沿って存在する。ａ、ｂについてのスケールバー＝３０ｇｍ。ＮＴ－３遺伝子治療（図１Ｃ）によるＴｒＪ筋肉におけるＳＴＯからＦＴＯ／ＦＴＧ線維への線維タイプの切り替え。両方の処理群におけるＳＴＯの平均パーセント（各群においてｎ＝３～５のマウスから得られる）は、野生型（ＷＴ）筋肉と有意に異なっておらず、これは、ＴｒＪ神経原性筋におけるＮＴ－３による線維タイプ分布の正規化に対する変化を示す。

【図1-2】ＴｒＪ筋肉におけるＡＡＶ１．ＮＴ－３誘発性線維タイプリモデリングを示すグラフ及び画像を示す。注射の１６週間後の時点でのＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴ－３処理Ｔｒｅｍｂｌｅｒ Ｊ（ＴｒＪ）（図１Ａ）及び非処理（ＴｒＪ－ＰＢＳ）腓腹筋（図１Ｂ）のＳＤＨ染色した組織切片の代表的な画像。遅筋（Ｓｌｏｗ ｔｗｉｔｃｈ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ）（ＳＴＯ、矢印）、中間筋（ｆａｓｔ ｔｗｉｔｃｈ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ）（ＦＴＯ、矢じり）及び速筋（ｆａｓｔ ｔｗｉｔｃｈ ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ）（ＦＴＧ、アスタリスク）が示される（図１Ｂ）。有酸素系の線維（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｆｉｂｅｒ）がａにおいて減少される。ＴｒＪ－ＰＢＳ筋肉（図１Ｂ）において、増加した数の小さいＳＴＯ線維及び全ての線維タイプの角張った線維が、神経変化に適合する小さいタイプの集団に沿って存在する。ａ、ｂについてのスケールバー＝３０ｇｍ。ＮＴ－３遺伝子治療（図１Ｃ）によるＴｒＪ筋肉におけるＳＴＯからＦＴＯ／ＦＴＧ線維への線維タイプの切り替え。両方の処理群におけるＳＴＯの平均パーセント（各群においてｎ＝３～５のマウスから得られる）は、野生型（ＷＴ）筋肉と有意に異なっておらず、これは、ＴｒＪ神経原性筋におけるＮＴ－３による線維タイプ分布の正規化に対する変化を示す。

【図2-1】ｍＴＯＲシグナル伝達及び代謝マーカーに対するＡＡＶ １．ＮＴ３処理の影響を示すグラフ及び画像を示す。注射の１６週間後の時点でのＴｒＪ（図２Ａ）及び野生型（ＷＴ）（図２Ｂ）腓腹筋におけるｍＴＯＲ標的、Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｐ）－４ＥＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６）、及びＰ－Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）の代表的なウエスタンブロット画像及び分析。グラフは、ＧＡＰＤＨに対して正規化されたタンパク質のリン酸化形態の発現レベルを示す。クマシーブルー染色された膜が、同等のゲルローディングを表す。エラーバーは±ＳＥＭであり；各群でｎ＝５～６、^＊Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定。（図２Ｃ）ｑＰＣＲによる解糖系（１－１Ｋ１及びＰＫ１）及び有酸素系調節因子（ＰＧＣ１α）の相対的発現；ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用した。エラーバーは±ＳＥＭであり；各群でｎ＝５～６、^＊Ｐ＜０．０５、一元配置Ａｎｏｖａ、続いてテューキーの多重比較検定。

【図2-2】ｍＴＯＲシグナル伝達及び代謝マーカーに対するＡＡＶ １．ＮＴ３処理の影響を示すグラフ及び画像を示す。注射の１６週間後の時点でのＴｒＪ（図２Ａ）及び野生型（ＷＴ）（図２Ｂ）腓腹筋におけるｍＴＯＲ標的、Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｐ）－４ＥＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６）、及びＰ－Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）の代表的なウエスタンブロット画像及び分析。グラフは、ＧＡＰＤＨに対して正規化されたタンパク質のリン酸化形態の発現レベルを示す。クマシーブルー染色された膜が、同等のゲルローディングを表す。エラーバーは±ＳＥＭであり；各群でｎ＝５～６、^＊Ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定。（図２Ｃ）ｑＰＣＲによる解糖系（１－１Ｋ１及びＰＫ１）及び有酸素系調節因子（ＰＧＣ１α）の相対的発現；ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用した。エラーバーは±ＳＥＭであり；各群でｎ＝５～６、^＊Ｐ＜０．０５、一元配置Ａｎｏｖａ、続いてテューキーの多重比較検定。

【図3-1】筋管に対するＮＴ－３の直接の影響を示すグラフ及び画像を示す。（図３Ａ）３０分間にわたって組み換えヒトＮＴ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＰＢＳ（対照）とともにインキュベートされた筋管におけるＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路、Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｐ）－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、Ｐ－４ＥＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６）、及びＰ－Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）の代表的なウエスタンブロット画像及び分析。リン酸化タンパク質バンドの密度値を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、対照群におけるパーセントとして示した。クマシーブルー染色された膜が、同等のゲルローディングを表す。筋管を、４８時間にわたってＮＴ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、次に、代謝マーカー（ＰＧＣ１ａ、ＨＫ１、ＰＫ１）の相対的ｍＲＮＡ発現を、ｑＰＣＲ（図３Ｂ）によって検出し、細胞培養培地中の乳酸産生に対するグルコース消費を、ＥＬＩＳＡ（図３Ｃ）によって検出した。（図３Ｄ）４８時間にわたるＮＴ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）処理後の筋管に対する筋芽細胞中のミオゲニン及びＮＴ－３受容体、Ｐ７５ＮＴＲ及びＴｒｋＣの相対的発現レベル。ＧＡＰＤＨを、分析におけるハウスキーピング遺伝子として使用した。示される結果は、少なくとも３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである（^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントの対応のあるｔ検定）。

【図3-2】筋管に対するＮＴ－３の直接の影響を示すグラフ及び画像を示す。（図３Ａ）３０分間にわたって組み換えヒトＮＴ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＰＢＳ（対照）とともにインキュベートされた筋管におけるＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路、Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｐ）－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、Ｐ－４ＥＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６）、及びＰ－Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）の代表的なウエスタンブロット画像及び分析。リン酸化タンパク質バンドの密度値を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、対照群におけるパーセントとして示した。クマシーブルー染色された膜が、同等のゲルローディングを表す。筋管を、４８時間にわたってＮＴ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、次に、代謝マーカー（ＰＧＣ１ａ、ＨＫ１、ＰＫ１）の相対的ｍＲＮＡ発現を、ｑＰＣＲ（図３Ｂ）によって検出し、細胞培養培地中の乳酸産生に対するグルコース消費を、ＥＬＩＳＡ（図３Ｃ）によって検出した。（図３Ｄ）４８時間にわたるＮＴ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）処理後の筋管に対する筋芽細胞中のミオゲニン及びＮＴ－３受容体、Ｐ７５ＮＴＲ及びＴｒｋＣの相対的発現レベル。ＧＡＰＤＨを、分析におけるハウスキーピング遺伝子として使用した。示される結果は、少なくとも３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである（^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントの対応のあるｔ検定）。

【図4】処理及び非処理マウスにおけるＮＴ－３の血中濃度を示すグラフを示す。エンドポイントにおいて、血清を各マウスから収集し、循環ＮＴ－３レベルを、ＥＬＩＳＡによって検出した。

【図5】ＴｒＪ及びＷＴ腓腹筋におけるＰ７５^ＮＴＲ及びＴｒｋＣの相対的ｍＲＮＡ発現を示す。ＧＡＰＤＨを、分析においてハウスキーピング遺伝子として使用した。示される結果は、少なくとも３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである（^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。

【図6】構築物ＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３（配列番号１１）の概略図を示す。ベクターは、筋特異的ｔＭＣＫプロモータ（配列番号３）、キメライントロン（配列番号５）、コンセンサスコザック配列（配列番号６）、ＮＴＦ３ ｃＤＮＡ（配列番号１）、及びポリアデニル化シグナル（配列番号７）を含有する。

【図7】制限マップ及びＯＲＦ分析ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３を示す。

【図8】ヒト対象におけるＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の筋肉内（ＩＭ）注射の位置を示す。

【図9-1】ＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。

【図9-2】ＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0099】

ＴｒＪ筋肉におけるＡＡＶ．ＮＴ－３処理に誘発される線維サイズの増加を、この増加が単に神経再生の結果であるかどうか、又はＮＴ－３が、神経再生と無関係の筋肉タンパク質合成に直接影響を与え、それによって筋線維サイズを増加させることが可能であるかどうかを決定するために調べた。

【0100】

ＮＴ－３の新規な効果；神経原性筋におけるタンパク質合成及び代謝リモデリングに直接影響を与えるその能力が、本明細書に開示される。

【0101】

本明細書に記載される研究は、遺伝子注入の１６週間後の時点でのＴｒＪ筋肉の酸化状態に対するＡＡＶ．ＮＴ－３遺伝子治療の効果をまず評価し、筋線維サイズの増加が、ＷＴに見られる線維タイプ比率の正規化に対する筋線維の酸化状態の変化に関連していたことを見出した。処理は、遅筋（ＳＴＯ）線維のパーセントの低下をもたらした一方、中間筋及び速筋（ＦＴＯ及びＦＴＧ）線維集団が増加し、これは、非処理ＴｒＪ筋肉に見られるパターンの逆転を反映している。ＮＴ－３に誘発される線維サイズの増加は、ＦＴＧ線維集団について最も顕著であった。次に、ラパマイシン複合体１（ｍＴＯＲＣ１）活性化の哺乳動物標的が、特に、解糖系線維の優先的な肥大成長に重点を置いて、ＮＴ－３に誘発される筋肉タンパク質合成において役割を果たしたかどうかを調べた。ｍＴＯＲＣ１は、翻訳調節因子真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４Ｅ－ＢＰ１）及びＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）のリン酸化を介して翻訳及びリボソーム生合成を調節する。Ｌａｐｌａｎｔｅ Ｍ，Ｓａｂａｔｉｎｉ Ｄ．，Ｃｅｌｌ，１４９（２）：２７４－２９３（２０１２）。さらに、ｍＴＯＲＣ１は、細胞解糖の活性化に関連しており、細胞解糖の活性化は、解糖酵素又はそれらの転写調節因子の翻訳の増加に関与する。Ｄｕｖｅｌ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ，３９（２）：１７１－１８３（２０１０）。ＴｒＪ筋肉における組織化学的変化に、ｍＴＯＲＣ１活性化の証拠として４Ｅ－ＢＰ１及びＳ６タンパク質（Ｓ６Ｐ）のリン酸化レベルの増加が伴っていたことが分かった。並行して、ミトコンドリア生合成調節因子（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ｙコアクチベータ１ａ、ＰＧＣ１α）、及び解糖のマーカー（ヘキソキナーゼ－１、ＨＫ１及びピルビン酸キナーゼ１、ＰＫ１）の発現レベルが、ＴｒＪ筋肉において増加した。これらの変化は、ＡＡＶ．ＮＴ－３処理されたＷＴ筋肉において有意でなかった。さらに、インビトロ試験は、組み換えＮＴ－３が、ＴｒｋＣ発現筋管においてＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路活性化を直接誘発し得るが、筋芽細胞においては誘発しないことを示した。さらに、ミオゲニン発現レベルは、筋管において有意に高かった一方、ｐ７５ＮＴＲ発現は、筋芽細胞と比較して下方制御され、これは、ＮＴ－３に誘発される筋芽細胞分化が、ｍＴＯＲＣ１活性化に関連していることを示す。

【0102】

本明細書に記載される所見は、神経及び筋肉の両方に利益を有するニューロパチーの治療のためだけでなく、さらには老化、癌悪液質又はタイプＩＩ筋線維萎縮を含む筋消耗疾患、並びにｍＴＯＲＣ１シグナル伝達の乱れ及び欠陥のあるミトコンドリア生合成が関与し得る再生の肥大成長期の障害に関連する遺伝性又は後天性自己免疫性原発性筋疾患のための、ＮＴ－３の潜在的使用に対する多くの示唆を与える。

【0103】

本開示は、対象における筋成長を刺激する方法に関する。本方法は、治療的に有効な量のニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片、又はＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片をコードする核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む。筋成長を刺激することを必要とする対象としては、筋ジストロフィー又は筋萎縮に罹患している対象が挙げられる。

【0104】

本発明は、筋消耗を阻害する方法であって、ＡＡＶベクターを投与して、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）をコードするＮＴＦ３遺伝子を送達することを含む、方法を提供する。一実施形態において、本発明は、シャルコー・マリー・ツース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）を治療する遺伝子治療方法を提供し、ここで、ＮＴ－３をコードするＮＴＦ３遺伝子が、筋特異的ｔＭＣＫプロモータの制御下で、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）１型を用いて対象に送達される。別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象、例えばＣＭＴなどの筋肉消耗疾患と診断されたか又はそれに罹患している対象における筋力を増加させる遺伝子治療方法を提供する。

【0105】

前臨床試験は、ＣＭＴ１のための天然マウスモデルであるｔｒｅｍｂｌｅｒ Ｊマウス９（Ｔｒ^Ｊ）の腓腹筋への構築物ＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の送達が、神経再生、髄鞘形成、有髄線維密度、座骨神経複合筋活動電位振幅並びにロータロッド試験における機能的性能及び後肢握力強度を向上させたことを実証した（実施例３を参照）。

【0106】

本明細書において使用される際、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、所望の薬理的又は生理的効果を得ることを指す。この効果は、疾患又は疾患に起因する有害作用の部分的又は完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書において使用される際の「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、疾患又は病態を抑制すること、すなわち、その発症を停止させること；及び疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を生じさせることを含み得る。

【0107】

本明細書において使用される際の予防は、ニューロパチー、脱髄性多発ニューロパチー、筋肉消耗疾患又は萎縮などの病態又は疾患に罹患するリスクのある対象に利益をもたらす任意の作用を指す。

【0108】

本明細書において使用される際の「薬学的に許容される」は、化合物又は組成物が、疾患の重症度及び治療の必要性を考慮して過度の有害な副作用なしに、本明細書に記載される方法のための対象への投与に好適であることを意味する。

【0109】

「治療的に有効な」及び「薬理学的に有効な」という用語は、疾患の重症度及び発生の頻度の改善の目標を達成する薬剤の量を適格とすることが意図される。治療の有効性は、ＮＴ－３の投与に応答した対象における症状の軽減を評価することによって測定され得る。

【0110】

「有効な断片」という用語は、ＮＴ－３ポリペプチドの機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列の一部を指す。「有効な断片」という用語は、ＮＴ－３成長因子活性を保持するＮＴ－３ポリペプチドアミノ酸配列の一部も指す。例示的なＮＴ－３成長因子活性としては、既に存在するニューロンの生存及び分化を補助すること、並びに新たなニューロン及びシナプスの成長及び分化を誘発及び補助することが挙げられる。さらに、ＮＴ－３活性としては、筋成長及び筋機能を刺激することが挙げられる。

【0111】

本明細書において使用される際、「診断」という用語は、対象が疾患を発症する可能性、又は対象における疾患の存在若しくは性質を決定することを包含し得る。本明細書において使用される際の診断という用語は、疾患の重症度及び起こりそうな結果又は疾患の発現又は回復の見込み（一般に予後と呼ばれる）を決定することも包含する。「診断」は、合理的な治療との関連における診断も包含することができ、ここで、診断は、治療の最初の選択、治療の変更委（例えば、用量又は投薬計画の調整）などを含め、治療の指針になる。

【0112】

本明細書において使用される際の「対象」は、任意の動物であることができ、患者とも呼ばれ得る。好ましくは、対象は脊椎動物であり、より好ましくは、対象は、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ）又はペット（例えば、イヌ、ネコ）などの哺乳動物である。ある実施形態において、対象はヒトである。

【0113】

「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｅＤＮＡ又はゲノム若しくは合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ若しくは合成ＲＮＡ）、並びに非天然ヌクレオチド類似体、非天然ヌクレオシド間結合、若しくはその両方を含むＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含む。核酸は、任意のトポロジー構造であり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｄ）、部分的な二本鎖、分岐、ヘアピン、環状、又はパドロック構造（ｐａｄｌｏｃｋｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）であり得る。

【0114】

本明細書において使用される際の「遺伝子」という用語は、酵素又は他のポリペプチド分子（例えば、コード配列、例えば、ポリペプチドをコードする連続したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る）の合成を指示するか、又はそれ自体が生物において機能的であり得るヌクレオチド配列を指す。生物中の遺伝子は、本明細書に定義されるように、オペロン中で密集することができ、ここで、オペロンは、遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから分離される。オペロン中に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子間の遺伝子間ＤＮＡなしで重なり合うことができる。

【0115】

本明細書において使用される際、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、特定の機能が共感染ヘルパーウイルスによって提供された細胞内のみで成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられているＡＡＶの１３の血清型がある。ＡＡＶの一般的な情報及び概説が、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見られる。しかしながら、様々な血清型が、遺伝子レベルでさえ、構造的に且つ機能的にかなり密接に関連していることは周知であるため、これらの同じ原理が、さらなるＡＡＶ血清型に適用可能である。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．；及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照）。例えば、全てのＡＡＶ血清型が、相同ｒｅｐ遺伝子によって仲介される非常に類似した複製特性を示すようであり；全てが、ＡＡＶ２中で発現されるものなどの３つの関連するカプシドタンパク質を保有する。類似度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーション；及び「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似のセルフアニーリング部分の存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が、類似の調節制御下にあることも示唆する。

【0116】

「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、転写されることが可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物を指す。発現ベクターは、様々な制御配列、構造遺伝子（例えば、対象とする遺伝子）、及び他の機能も同様に果たす核酸配列を含有し得る。

【0117】

「ベクター」とは、通常、プラスミド又はバクテリオファージに由来するＤＮＡ分子を意味し、その中にＤＮＡの断片が挿入又はクローニングされ得る。組み換えベクターは、１つ以上の独自の制限部位を含有し、クローン配列が再生可能であるように規定の宿主又は媒介生物において自己複製可能であり得る。ベクターは、受容細胞にトランスフェクションされると、ＲＮＡが発現されるように、遺伝子又はコード領域に動作可能に連結されるプロモータを含有する。

【0118】

本明細書において使用される際の「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される対象とする１つ以上のポリヌクレオチド（又は導入遺伝子）を含むベクターを指す。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在するとき、感染性ウイルス粒子中に複製及びパッケージングされ得る。

【0119】

「ＡＡＶビリオン」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的に、「ＡＡＶベクター粒子」又は単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ＡＡＶベクター粒子の産生は、ＡＡＶベクターの産生を必然的に含むが、それは、このようなベクターが、ＡＡＶベクター粒子内に含まれるためである。

【0120】

本明細書において使用される際、「約」という用語は、基本値からの＋／－１０％の偏差を指す。

【0121】

特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0122】

末梢性ニューロパチーの遺伝子治療
一態様において、本発明は、遺伝子治療を用いて、筋萎縮に罹患している対象を治療する方法を提供する。

【0123】

治療的核酸を送達するのに使用され得るベクターとしては、ウイルス及び非ウイルスベクターが挙げられる。使用され得る好適なベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）及びプラスミドが挙げられる。単純ヘルペスウイルスベクターの利点は、感覚ニューロンに対するそれらの天然の向性である。しかしながら、アデノウイルスに関連するウイルスベクターが、挿入突然変異及び免疫原性のそれらの低いリスク、それらの内因性ウイルス遺伝子の欠如、及び高い力価で産生されるそれらの能力のため、最も人気がある。Ｋａｎｔｏｒらが、中枢神経系への遺伝子導入の様々な方法を概説している一方、Ｇｏｉｎｓらは、慢性の末梢神経系の疼痛の治療のための遺伝子治療の方法を説明している。開示内容が参照により本明細書に援用される、Ｋａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ．８７，１２５－１９７（２０１４）、及びＧｏｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．４８（２），２５５－２７０（２０１２）を参照されたい。特に、末梢神経の常在グリア細胞である、シュワン細胞への成功した遺伝子送達が、様々なウイルスベクターを用いて報告されている。Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１，７５－８９（２０１１）。ベクターがウイルスベクター内にあり、ベクターがパッケージングされている場合、ビリオンが、細胞を感染させるのに使用され得る。裸のＤＮＡが使用される場合、特定の宿主細胞に適しているようなトランスフェクション又は形質転換手順が使用され得る。ポリマー、リポソーム、又はナノスフェアを用いる裸のＤＮＡの製剤が、遺伝子送達に使用され得る。核酸は、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、及びポリマーへの複合体化を含む、十分に効率的な送達レベルをもたらす任意の所望のフォーマットで投与され得る。

【0124】

その発現が末梢性ニューロパチーを軽減する遺伝子をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又は導入遺伝子）は、導入遺伝子発現及び核酸の下流のポリアデニル化配列を駆動する（構成的又は調節可能）プロモータなどの調節要素を有する発現カセットへとクローニングされ得る。例えば、１）身体の組織又は領域に特異的であり；２）構成的であり；及び／又は３）誘導可能／調節可能である調節要素が使用され得る。

【0125】

ある実施形態において、筋特異的調節要素が使用される。筋特異的調節要素としては、哺乳動物筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳動物デスミンプロモータ、哺乳動物トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモータ、又は哺乳動物骨格α－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモータを含む筋特異的プロモータが挙げられる。本発明において有用な筋特異的エンハンサーは、哺乳動物ＭＣＫエンハンサー、哺乳動物ＤＥＳエンハンサー、及び脊椎動物トロポニンＩ ＩＲＥ（ＴＮＩ ＩＲＥ、以後、ＦＩＲＥと呼ばれる）エンハンサーからなる群から選択される。これらの筋特異的エンハンサー要素の１つ以上が、本発明の筋特異的プロモータと組み合わせて使用されて、組織特異的調節要素を提供し得る。

【0126】

遺伝子治療によって筋萎縮を治療するのに使用するための好ましいベクターはＡＡＶである。ＡＡＶに媒介される遺伝子送達は、神経障害の前臨床及び臨床試験の両方のための有効で且つ安全な手段として浮上している。Ｏｊａｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．，２１（１）：８４－９８（２０１５）。現在、ＡＡＶは、神経障害の臨床試験に最も広く使用されているベクターであり、このベクターの使用に関連する有害作用は、臨床試験からこれまで報告されていない：アデノ随伴ウイルスは、その生活環を実現するために、アデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスなどの他のウイルスからのヘルパー機能を必要とするパルボウイルス科の非病原性ディペンドウイルスである。野生型（ＷＴ）ＡＡＶは、カプシドによって囲まれる約５ｋｂの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を両端に有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムによって特徴付けられる。

【0127】

インビボ遺伝子治療及びインビトロ試験及び／又は導入遺伝子の産物の産生などの用途のために、導入遺伝子を細胞に送達するのに使用するためのアデノウイルスベクターは、一般的に、初期領域１（Ｅｌ）遺伝子の欠失によってアデノウイルスから得られる（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８ Ｌ３９－６６ １９９２）。Ｅｌ遺伝子の欠失は、このようなアデノウイルスベクター複製に欠陥を生じさせ、ベクター内に存在する、残っているウイルス遺伝子の発現を著しく低下させる。組み換えアデノウイルスベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に対する向性、最小の病原性の可能性、ベクター株の調製のために高い力価に複製する能力、及び大きな挿入物を運ぶ能力を含む、遺伝子送達ビヒクルとして使用するためのいくつかの利点を有する。しかしながら、アデノウイルスベクター中に残っているウイルス遺伝子の存在は有害であり得ると考えられる。

【0128】

したがって、ある実施形態において、様々なアデノウイルス遺伝子配列の欠失を有するアデノウイルスベクター。特に、「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルス」又はミニアデノウイルスベクターとしても知られている偽アデノウイルス（ｐｓｅｕｄｏａｄｅｎｏｖｉｒａｌ）ベクター（ＰＡＶ）が、ベクターゲノムの複製及びパッケージングに必要とされる最小のシス作用性ヌクレオチド配列を含有し、且つ１つ以上の導入遺伝子を含有し得るアデノウイルスのゲノムに由来するアデノウイルスベクターである（参照により本明細書に援用される、偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）及びＰＡＶを製造する方法をカバーする米国特許第５，８８２，８７７号明細書を参照）。最大で約３６ｋｂの外来核酸を収容し得るこのようなＰＡＶは、ベクターの運搬能力が最適化される一方、ベクターに対する宿主免疫応答の可能性又は複製能を有するウイルスの生成が減少されるため、有利である。ＰＡＶベクターは、複製起点を含有する５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列、並びにＰＡＶゲノムのパッケージングに必要とされるシス作用性ヌクレオチド配列を含有し、適切な調節要素、例えばプロモータ、エンハンサーなどとともに１つ以上の導入遺伝子を収容し得る。

【0129】

ＡＡＶ
本発明の組み換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子及び核酸分子に隣接している１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２及びＡＡＶ－１３を含むがこれらに限定されない、組み換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９９：１１８５４－１１８５９（（２００２）；及びＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍａｃｈｉｄａ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００３を参照）。さらに、偽型ＡＡＶベクターも、本明細書に記載される方法に用いられ得る。偽型ＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型のゲノムを、第２のＡＡＶ血清型のカプシド中に含有するもの；例えば、ＡＡＶ２カプシド及びＡＡＶ１ゲノムを含有するＡＡＶベクター、又はＡＡＶ５カプシド及びＡＡＶ２ゲノムを含有するＡＡＶベクターである。（Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０（２６）：３０７５－８１）。偽型ｒＡＡＶの産生が、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに開示されている。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド突然変異を有するｒＡＡＶも考えられる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景の項に示されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において公知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８又はＡＡＶｒｈ．７４が使用され得る。

【0130】

本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、感染性ウイルス粒子へのｒＡＡＶゲノムのアセンブリのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス又はヘルペスウイルス）による感染について許容される細胞に移送される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を生成する技術が、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の構成要素が、単一の細胞（本明細書において、パッケージング細胞と示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離された（すなわち、ｒＡＡＶゲノム中でない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組み換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２及びＡＡＶ－１３を含むがこれらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲと異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生が、例えば、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに開示されている。

【0131】

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子産生のための全ての必要な構成要素を安定的に発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いたｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）又は直接の平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミド中に導入されてきた。次に、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模な産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞中に導入するために、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。

【0132】

ｒＡＡＶ産生の一般的な原理が、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）において概説されている。様々な手法が、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に記載されている。上記の文献は、特に、ｒＡＡＶ産生に関連する文献の項に重点を置いて、全体が参照により本明細書に援用される。

【0133】

したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（同種の２９３細胞株）などの安定的に形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

【0134】

本発明の組み換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な実施形態において、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ゲノムのＩＴＲの間にＡＡＶ ｒｅｐ又はｃａｐ ＤＮＡはない。本発明の核酸分子を含むように構成され得るｒＡＡＶの例が、全体が参照により本明細書に援用される国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号明細書（国際公開第２０１３／０１６３５２号パンフレット）に記載されている。

【0135】

ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配などの、当該技術分野において標準的な方法によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）；米国特許第６，５６６，１１８号明細書及び国際公開第９８／０９６５７号パンフレットに開示されている方法が挙げられる。

【0136】

別の実施形態において、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を想定している。本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体を含む。この組成物は、希釈剤及び助剤などの他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤及び助剤は、レシピエントに無害であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、ホスフェート、シトレート、若しくは他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、プルロニック（登録商標）（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【0137】

本発明の方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型に応じて変動し、当該技術分野において標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、ｍｌ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３～約１×１０^１４又はそれ以上のＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投与量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。

【0138】

インビトロ又はインビトロで、ｒＡＡＶで標的細胞に形質導入する方法が、本発明によって想定される。インビボ方法は、有効な用量、又は有効な複数用量の、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与する工程を含む。用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、この投与は予防的である。用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、この投与は治療的である。本発明の実施形態において、有効な用量は、治療される障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（除去又は軽減）し、障害／疾患の状態の進行を遅らせるか若しくは予防し、障害／疾患の状態の進行を遅らせるか若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、疾患の寛解（部分的又は完全な）をもたらし、及び／又は生存を延長する用量である。

【0139】

特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組み換えベクターを、動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって行われ得る。本発明に係る投与としては、限定はされないが、筋肉、血流への注射及び／又は肝臓への直接の注射が挙げられる。リン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを単に再懸濁させることは、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の構成要素に対する公知の制限はない（ただし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いた通常の方法では回避されるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの対象とする特定の標的組織を標的とするように修飾され得る。例えば、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第０２／０５３７０３号パンフレットを参照されたい。医薬組成物は、注射用製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多くの製剤が、以前に開発されており、本発明の実施に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用され得る。

【0140】

形質導入は、組織特異的な制御要素を含む遺伝子カセットを用いて行われ得る。例えば、本発明の一実施形態は、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリー、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照］、筋細胞特異的なエンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心臓アクチン遺伝子に由来する制御要素、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照］及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘導性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、ステロイド誘導性要素及びグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモータ（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照）、並びに他の制御要素を含むがこれらに限定されない、筋特異的な制御要素によって誘導される筋細胞及び筋組織に形質導入する方法を提供する。

【0141】

筋組織は、生命維持に不可欠な器官ではなく、到達しやすいため、インビボＤＮＡ送達のための魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋線維からのｍｉＲＮＡの持続発現を想定している。

【0142】

「筋細胞」又は「筋組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管又は心臓組織からの、例えば、骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞又は細胞群を意味する。筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞及び心筋芽細胞などのこのような筋細胞は、分化又は未分化であり得る。

【0143】

「形質導入」という用語は、受容細胞によるＮＴ－３の発現をもたらす、本発明の複製欠損性ｒＡＡＶを介した、インビボ又はインビトロのいずれかでの受容細胞へのＮＴ－３のコード領域の投与／送達を指すために使用される。

【0144】

一実施形態において、遺伝子治療は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達を介したＮＴ－３遺伝子治療である。本発明者らは、ＣＭＶプロモータ又は３つ組の筋特異的クレアチンキナーゼ（ｔＭＣＫ）プロモータのいずれかの制御下でヒトＮＴ－３ ｃＤＮＡコード配列を保有するＡＡＶ発現カセットを開発した。本発明者らは、末梢神経の運動機能、病理組織学、及び電気生理学の改善が、組み換えＡＡＶ１ベクターを用いて達成されて、シャルコー・マリー・ツース病変異型ＣＭＴ１Ａのモデルであるｔｒｅｍｂｌｅ（Ｔｒｙ）マウスにおけるニューロトロフィン－３発現を増加させ得ることを以前に示した。開示内容が参照により本明細書に援用される、Ｓａｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２２（３）：５１１－２１（２０１４）を参照されたい。

【0145】

したがって、本発明は、有効な用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔を置いて与えられる用量）の、ＮＴ－３をコードするｒＡＡＶを、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。

【0146】

投与の用量及び経路
本発明は、本発明の併用療法を含む、有効な用量のｒＡＡＶ及び本発明の組成物の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与は、全身が影響を受けるような循環系への投与である。全身投与は、消化管を介した吸収などの腸内投与、及び注射、注入又は移植を介した非経口投与を含む。

【0147】

したがって、上記の方法において想定されるｒＡＡＶの投与の経路としては、限定はされないが、腹腔内（ＩＰ）、筋肉内（ＩＭ）及び血管内［例えば、動脈内四肢灌流（ＩＬＰ）及び静脈内（ＩＶ）を含む］経路が挙げられる。

【0148】

本明細書に開示される方法において投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型に応じて変動し、当該技術分野において標準的な方法によって決定され得る。２以上の用量が、例えば、１、２、３又はそれ以上の用量が投与され得る。用量中のｒＡＡＶの力価は、ｍｌ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１^１１、約１×１０^１２、約１．５×１０^１２、約１×１０^１２、約３×１０^１２、約４×１０^１２、約５×１０^１２、約６×１０^１２、約６．５×１０^１２、約７×１０^１２、１×１０^１３、約１×１０^１４、又は～約１×１０^１５又はそれ以上のＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投与量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（すなわち、それぞれ、１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、約１．５×１０^１２ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇ、約３×１０^１２ｖｇ、約４×１０^１２ｖｇ、約５×１０^１２ｖｇ、約６×１０^１２ｖｇ、約６．５×１０^１２ｖｇ、約７×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇ、１×１０^１４ｖｇ、１×１０^１５）。ＡＡＶを滴定するための方法が、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９（１９９９）に記載されている。

【0149】

投与経路が筋肉内（ＩＭ）経路である上記の方法のある実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．５×１０^１２～少なくとも約６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。（本明細書における全ての範囲は、その範囲内のそれぞれの個々の値、並びに各範囲の個々の上限値及び下限値を表すことが意図される）。投与経路が筋肉内（ＩＭ）である、上記の方法のある実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、２×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。投与経路が筋肉内（ＩＭ）である、上記の方法のある実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、４×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。投与経路が筋肉内（ＩＭ）である、上記の方法のある実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、６×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。

【0150】

ヒト患者が、治療のために本明細書において想定される対象である。ヒト患者が、筋肉内（ＩＭ）送達による治療のために本明細書において想定される対象である。このような患者は、以下の患者を含む。例えば：ｉ）ＣＭＴ１Ａと診断された成人対象（１８歳を超える）、ｉｉ）末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子を含む１７ｐ１１．２における１．５Ｍｂ重複を示す、ｉｉｉ）任意の民族又は人種集団の男性及び女性、ｉｖ）足関節背屈の筋力の低下を示す（重力に逆らって完全なＲＯＭを有するべきであるが、重力に逆らって完全な背屈を維持することができないか、又は３秒間以上つま先立ちすることができない（Ｎｏｒｔｈｓｔａｒ基準））、ｉｖ）異常な神経伝導速度、ｖ）臨床評価及び反復神経伝導検査に協力する能力、及びｖｉ）性的に活発な対象では、試験の間、信頼性のある避妊法を実施する意思があること。好適な患者は、例えば、以下を有するものを含んではならない。ｉ）臨床観察、又はＨＩＶ、又はＡ型肝炎、Ｂ型肝炎若しくはＣ型肝炎感染の血清学的証拠に基づいた活性なウイルス感染、ｉｉ）進行中の免疫抑制療法又は試験の開始の６か月以内の免疫抑制療法（例えば、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン）、ｉｉｉ）持続的な白血球減少若しくは白血球増加（ＷＢＣ≦３．５Ｋ／μＬ又は≧２０．０Ｋ／μＬ）又は１．５Ｋ／μＬ未満の絶対好中球数、ｉｖ）ＥＬＩＳＡ免疫測定法によって決定される際に１：５０以上のＡＡＶ１結合抗体力価、ｖ）研究室の主宰者（ＰＩ）の意見によれば、遺伝子導入の不必要なリスクが発生することから、併発疾患又は長期の薬物療法の必要性、ｖｉ）適切な筋力試験を妨げる、足関節拘縮若しくは手術、ｖｉｉ）妊娠、授乳、又は妊娠を計画している、ｖｉｉｉ）ニューロパチーの他の原因、及び／又はｉｘ）過去６か月以内の四肢の手術。例示的な臨床プロトコルにおいて、ＣＭＴ１Ａ患者は、ＣＭＴにおける足関節の弱化及び不安定性を優先的に引き起こす脚の腓腹筋及び前脛骨筋（ＴＡ）の内側頭及び外側頭に分割された総量のベクターｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３を投与される。対象は、以下のうちの１つを投与される：ｉ）２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ（総量）の低用量のベクター又はｉｉ）６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ（総量）の高用量のベクター。

【0151】

一実施形態において、ベクターは、希釈剤なしで筋肉内（ＩＭ）注射によって投与される。代替的な実施形態において、筋肉内注射用の組成物は、ゴマ油若しくはピーナッツ油などの助剤を含み、又はプロピレングリコール水溶液、並びに滅菌水溶液が用いられ得る。このような水溶液は、必要に応じて緩衝され得、液体希釈剤が、まず、生理食塩水又はグルコースと等張にされる。遊離酸（ＤＮＡが酸性リン酸基を含有する）又は薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と水中で好適に混合されて調製され得る。ｒＡＡＶの分散体はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中並びに油中で調製され得る。通常の貯蔵及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に得ることができる。

【0152】

注射用途に好適な医薬担体、希釈剤又は賦形剤としては、滅菌水溶液又は分散体、及び滅菌注射用溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流体でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合は必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサーなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収が、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。

【0153】

滅菌注射用溶液は、必要な量のｒＡＡＶを、必要に応じて、上記に列挙される様々な他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散体は、滅菌された有効成分を、塩基性分散媒及び上記に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製の方法は、有効成分及びその予め滅菌ろ過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。

【0154】

ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロでも行われ得る。一実施形態において、所望の標的筋細胞が、対象から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。或いは、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生じない場合、同系又は異種の筋細胞が使用され得る。

【0155】

別の態様において、ｒＡＡＶゲノムが、本明細書において提供される。投与されるｒＡＡＶのゲノムは、転写調節配列の制御下でＮＴ－３ポリヌクレオチドを含む。ｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いている。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１及びＡＡＶｒｈ．７４を含むがこれらに限定されない、組み換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。上記の背景の項に示されるように、これらのＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知である。

【0156】

ある実施形態において、ｒＡＡＶゲノムの転写調節配列は、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリー、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照］、筋細胞特異的なエンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心臓アクチン遺伝子に由来する制御要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９）］及びＭＣＫエンハンサー、ＭＨＣＫ７プロモータ（ミオシン重鎖からのエンハンサーを組み込むＭＣＫプロモータの修飾形態（Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５：３２０－３２９（２００７））、デスミンプロモータ、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘導性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、ステロイド誘導性要素及びグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモータ（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照）、及び他の制御要素を含むがこれらに限定されない、筋特異的な制御要素である。ある実施形態において、転写調節要素としては、ＭＣＫプロモータが挙げられる。ある実施形態において、転写調節要素としては、ＭＨＣＫ７プロモータが挙げられる。

【0157】

ある実施形態において、ｒＡＡＶゲノム中のＮＴ－３ポリヌクレオチドは、配列番号１に記載されるＮＴ－３ ｃＤＮＡ（配列番号１１のヌクレオチド１０７７～１８５０に対応する）である。ある実施形態において、ｒＡＡＶゲノム中のＮＴ－３ポリヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１０２６５４に記載されるＮＴ－３ ｃＤＮＡ若しくは配列番号１に記載されるＮＴ－３ ｃＤＮＡ配列であるか、又はＮＴ－３ ｃＤＮＡに対する８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する変異体ポリヌクレオチドである。ある実施形態において、変異体ＮＴ－３ポリヌクレオチドは、配列番号１のＮＴ－３ ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドと同じＮＴ－３ポリペプチドをコードする。配列番号１として記載されるか又はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１０２６５４として提供されるＮＴ－３ ｃＤＮＡによってコードされるＮＴ－３ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２に記載される。ある実施形態において、変異体ＮＴ－３ポリヌクレオチドは、配列番号１に記載されるか又はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１０２６５４として提供されるＮＴ－３ ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較して、少なくとも１つのアミノ酸配列変化を有する変異体ＮＴ－３ポリペプチドをコードする。アミノ酸配列変化は、例えば、置換、欠失、又は１つ以上のアミノ酸の挿入、好ましくは、保存的置換であり得る。変異体ＮＴ－３ポリペプチドは、ポリペプチドの活性が保たれる場合、アミノ酸置換、欠失又は挿入の任意の組合せを有し得る。一態様において、変異体ＮＴ－３ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、配列番号１として記載されるか又はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１０２６５４として提供されるＮＴ－３ ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）との少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９又は９９．５％の同一性を共有するように、いくつかのアミノ酸変化を有し得る。

【0158】

ある実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３ゲノムであり、そのＮＴ－３遺伝子カセットの配列が、配列番号１１に記載され、表４において注釈を付けられている（実施例３を参照）。

【0159】

さらに別の態様において、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。ある実施形態において、単離された核酸は、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列からなる。

【0160】

５’から３’の順に：（ｉ）第１のＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）（配列番号４）；（ｉｉ）筋クレアチンキナーゼプロモータ配列（配列番号３）；（ｉｉｉ）ヒトＮＴ－３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）；及び（ｉｖ）第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列（配列番号８）を含む単離された核酸も提供され、ここで、ヒトＮＴ－３ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか、配列番号２と１００％同一であるか、又は配列番号１１のヌクレオチド１０７７～１８５０によってコードされるアミノ酸配列を有する。

【0161】

上記の核酸を含む組み換えＡＡＶ、並びに配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶが想定される。

【0162】

本開示のｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドが提供される。ＤＮＡプラスミドは、本明細書において想定されるｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、感染性ウイルス粒子へのｒＡＡＶゲノムのアセンブリのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス又はヘルペスウイルス）による感染について許容される細胞に移送される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を生成する技術が、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の構成要素が、単一の細胞（本明細書において、パッケージング細胞と示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離された（すなわち、ｒＡＡＶゲノム中でない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組み換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１及びＡＡＶ ｒｈ７４を含むがこれらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲと異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生が、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに開示されている。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド突然変異を有するｒＡＡＶも想定される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。

【0163】

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子産生のための全ての必要な構成要素を安定的に発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いたｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）又は直接の平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミド中に導入されてきた。次に、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模な産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞中に導入するために、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。自己相補性ゲノムを用いてｒＡＡＶを産生するための方法も、当該技術分野において公知である。

【0164】

ｒＡＡＶ産生の一般的な原理が、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々な手法が、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に記載されている。上記の文献は、特に、ｒＡＡＶ産生に関連する文献の項に重点を置いて、全体が参照により本明細書に援用される。

【0165】

したがって、さらなる態様において、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（同種の２９３細胞株）などの安定的に形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

【0166】

ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配などの、当該技術分野において標準的な方法によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）；米国特許第６，５６６，１１８号明細書及び国際公開第９８／０９６５７号パンフレットに開示されている方法が挙げられる。

【0167】

したがって、別の態様において、本開示は、ＮＴ－３ポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶを想定している。ある実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ ｒｈ７４カプシド及びＮＴ－３ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いている。本方法のある実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３である。ある実施形態において、ｒＡＡＶは、自己相補性ゲノムである。

【0168】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるｒＡＡＶを含む組成物を想定している。本開示の組成物は、薬学的に許容される担体中のｒＡＡＶを含む。この組成物は、希釈剤などの他の成分も含み得る。許容される担体及び希釈剤は、レシピエントに無害であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、ホスフェート、シトレート、若しくは他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、プルロニック（登録商標）（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。ある実施形態において、ｒＡＡＶは、トリス、ＭｇＣｌ_２、ＮａＣｌ及びプルロニック（登録商標）（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８中で製剤化される。ある実施形態において、ｒＡＡＶは、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び０．００１％のプルロニック（登録商標）（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８を含有する２００ｍＭのＮａＣｌ中で製剤化される。

【0169】

併用治療も本明細書において想定される。本明細書において使用される際の組合せは、同時治療又は逐次治療を含む。本開示の方法と、標準的な医療処置（例えば、コルチコステロイド及び／又は免疫抑制剤）との組合せが、新規な治療との組合せと同様に、特に想定される。様々な実施形態において、対象は、対象が本明細書において想定される方法にしたがって治療される前、その間又はその後に（又は３つの可能性のうちの２つ以上の組合せの任意の並べ替えを伴い）コルチコステロイドで治療される。例えば、組合せは、ｒＡＡＶベクターの投与の前、その間及び／又はその後に、コルチコステロイド、例えばプレドニゾロンを投与することを含む。

【0170】

滅菌注射用溶液は、必要な量のｒＡＡＶを、必要に応じて、上記に列挙される様々な他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散体は、滅菌された有効成分を、塩基性分散媒及び上記に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製の方法は、有効成分及びその予め滅菌ろ過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。

【0171】

筋成長の刺激
本発明の一態様は、対象における筋成長を刺激する方法であって、治療的に有効な量のニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片、又はＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片をコードする核酸を；それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0172】

ある実施形態において、本発明の方法は、筋力、筋肉量、又は筋持久性を増加させ、対象における筋疲労を軽減するのに使用され得る。

【0173】

筋肉は、３つのタイプ：骨格筋、心筋、及び平滑筋に分類され得る。骨格筋は、力を発生させ、その力を骨格に伝達することが可能な筋組織であり、呼吸、運動、及び姿勢の維持を可能にする。心筋は、心臓の筋肉である。平滑筋は、動脈壁及び腸壁の筋組織である。本発明の方法及び組成物は、主に、骨格筋に適用されるが、さらに平滑筋に良い影響を及ぼし得る。「骨格筋」及び「骨格筋」は、骨、腱、及び関節との相互作用を有する筋肉として定義される。

【0174】

ある実施形態において、本発明は、筋力の低下を引き起こす病気、疾患、障害、及び病態（本明細書において、筋骨格疾患、及び筋機能不全及び筋肉消耗疾患とも呼ばれる）の治療の方法を提供する。筋骨格疾患の主なカテゴリーは、筋ジストロフィー及び筋萎縮である。

【0175】

ある実施形態において、本発明は、筋機能不全及び筋肉消耗疾患若しくは障害（遺伝性ミオパチー、神経筋疾患、筋萎縮、薬物誘発性ミオパチーを含む）、又は筋力の低下を引き起こす病気、疾患、障害若しくは病態を含む筋骨格疾患の治療のための方法を提供する。本発明は、ニューロパチー、例えば遺伝性ＣＭＴ及びＣＭＴ１Ａ、並びに軸索及び脱髄性多発ニューロパチー、例えば慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーの治療のための方法も提供する。治療の方法は、それを必要とする患者に、治療的に有効な量のニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片、又はＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、若しくはその有効な断片をコードする核酸を投与することを含む。ある実施形態において、対象は、サルコペニア、悪液質、タイプＩＩ筋線維萎縮、及び再生の肥大成長期の障害に関連する後天性自己免疫性原発性筋疾患からなる群から選択される筋疾患に罹患している。

【0176】

ある実施形態において、ＮＴ－３は、筋萎縮を治療するのに使用され得る。筋萎縮は、様々な疾患、障害、他の病態、又は事象に起因する筋組織の消耗又は減少を特徴とする病態を表すのに使用される一般的な用語である。筋萎縮は、限定はされないが、重度の熱傷からの回復、大きな人工関節置換術、神経因性疼痛、末梢性ニューロパチー、壊死性脈管炎、無重力環境（例えば、宇宙飛行士（ａｓｔｒｏｎａｕｔ ａｎｄ ｃｏｓｍｏｎａｕｔ））、長期入院、変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）及び臓器移植並びに脊髄損傷、長期血液透析、及び脳卒中に起因する長期の固定化の結果であり得る。

【0177】

ある実施形態において、ＮＴ－３は、廃用性筋萎縮を治療するのに使用され得る。廃用性筋萎縮は、長期間の運動不足に起因する筋組織の消耗又は減少を特徴とする病態である。廃用性筋萎縮は、限定はされないが、重度の熱傷からの回復、大きな人工関節置換術、神経因性疼痛、無重力環境（例えば、宇宙飛行士（ａｓｔｒｏｎａｕｔ ａｎｄ ｃｏｓｍｏｎａｕｔ））、長期入院、拒食症、及び臓器移植並びに脊髄損傷、長期血液透析、及び脳卒中に起因する長期の固定化の結果であり得る。

【0178】

ある実施形態において、ＮＴ－３は、加齢性筋萎縮を治療するのに使用され得る。加齢性筋萎縮は、筋組織の消耗又は減少及び対象の加齢に伴う線維化組織による筋組織の置換を特徴とする病態である。

【0179】

ある実施形態において、ＮＴ－３は、サルコペニアを治療するのに使用され得る。サルコペニアは、筋組織の消耗又は減少及び対象の加齢に伴う線維化組織による筋組織の置換を特徴とする病態である。

【0180】

ある実施形態において、ＮＴ－３は、悪液質における筋消耗を治療するのに使用され得る。悪液質は、積極的に減量しようとしていない人の、慢性疾患の結果としての、体重の減少、筋萎縮、疲労、衰弱及びかなりの食欲不振である。悪液質の筋消耗の構成要素は、限定はされないが、癌、多発性硬化症、結核、後天性免疫不全症候群、ヒト免疫不全ウイルス、栄養失調、パーキンソン病、気腫、心不全、運動ニューロン病、嚢胞性線維症、認知症、サルコペニア、慢性閉塞性肺疾患、腎疾患、及び腎不全の結果であり得る。

【0181】

ある実施形態において、ＮＴ－３は、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、エプスタイン・バーウイルス）、細菌感染（例えば、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びリケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ））、ポリオ後症候群、及び寄生虫感染（例えば、トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）及び住血吸虫（ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ））（ここで、対象は筋萎縮を発症するリスクがある）に起因する筋消耗を治療するのに使用され得る。

【0182】

ニューロトロフィン－３
ある実施形態において、治療的に有効な量のＮＴ－３、プロ－ＮＴ－３、又はそのＮＴ－３類似体が、筋成長を刺激するために対象に投与される。ニューロトロフィン３（ＮＴ－３）は、ニューロトロフィンのＮＧＦ（神経成長因子）ファミリーの神経栄養因子である。ＮＴ－３は、末梢及び中枢神経系の特定のニューロンに対する活性を有するタンパク質成長因子であり；既に存在するニューロンの生存及び分化を補助し、新たなニューロン及びシナプスの成長及び分化を促進するのに役立つことが最もよく知られている。

【0183】

本開示は、Ｃｘ２６の細胞外領域のアミノ酸配列の少なくとも一部に実質的に類似したブロッキングペプチドを含む。本明細書において使用される際の「一部（ａ ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語は、少なくとも４つのアミノ酸を含むＣｘ２６の細胞外領域内のアミノ酸配列を指す。さらなる実施形態において、一部は、少なくとも６アミノ酸長であるアミノ酸配列、少なくとも８アミノ酸長であるアミノ酸配列、又は少なくとも１０アミノ酸長であるアミノ酸配列を指す。したがって、ブロッキングペプチドは、少なくとも４、６、８、又は１０のアミノ酸からなる。同様に、本明細書に記載されるブロッキングペプチドは、最大サイズを有し得る。ブロッキングペプチドの最大サイズは、ペプチドの全体サイズに関連し、タンパク質形質導入ドメインなどの、ペプチドに連結される任意のさらなる配列を含む。ある実施形態において、ブロッキングペプチドは、約２００アミノ酸未満の最大サイズを有する一方、他の実施形態において、ブロッキングペプチドは、約１００アミノ酸未満の最大サイズを有する。他の実施形態において、ブロッキングペプチドは、７５アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、又は２０アミノ酸以下の最大サイズを有する。

【0184】

本明細書において使用される際、「ポリペプチド」という用語は、オリゴペプチド、ペプチド、若しくはタンパク質配列、又はこれらの断片、部分、若しくはサブユニット、及び天然若しくは合成分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合、すなわち、ペプチドイソスターによって互いに結合されたアミノ酸も含み、任意のタイプの修飾アミノ酸を含有し得、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド及びポリペプチド断片、モチーフなど、グリコシル化ポリペプチド、全ての「模倣」及び「ペプチド模倣」ポリペプチド形態、並びにレトロインベルソ型（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）ペプチド（オール－Ｄ－レトロ（ａｌｌ－Ｄ－ｒｅｔｒｏ）又はｍｔｒｏ－エナンチオ（ｍｔｒｏ－ｅｎａｎｔｉｏ）ペプチドとも呼ばれる）も含む。

【0185】

「実質的に類似した」は、所与のアミノ酸（又は核酸）配列が、参照配列と、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％の同一性を共有することを意味する。このような配列に関連する同一性又は相同性は、最大パーセント相同性を達成するために、必要に応じて、配列を整列し、ギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部とみなさずに、公知のペプチドと同一である候補の配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書に定義される。Ｎ末端、Ｃ末端又は内部の伸長部、欠失、又はペプチド配列への挿入が、相同性に影響を与えると解釈されるべきではない。

【0186】

実質的に類似したペプチドは、１つ以上のアミノ酸変化だけ異なるものを含み、ここで、変化、例えば、アミノ酸残基の置換、付加又は欠失は、ＦＡＫ又はＮＡＮＯＧに関連するそれらの能力などの、関連するペプチドの特性を無効にしない。さらに、保存的置換のみが保存領域においてなされたタンパク質を記述又はコードする配列のみが、全体に実質的に類似している。好ましくは、実質的に類似した配列はまた、ポリペプチドの独特の活性を保持する。

【0187】

保存的置換の例は、イソロイシン、ロイシン、又はメチオニンなどの非極性（疎水性）残基の、別のものとの置換を含む。同様に、本発明は、アルギニン及びリジン間、グルタミン及びアスパラギン間、及びグリシン及びセリン間の１つの極性（親水性）残基の置換を想定している。さらに、リジン、アルギニン若しくはヒスチジンなどの塩基性残基の、別のものとの置換、又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの酸性残基の、別のものとの置換も想定される。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性；疎水性）残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リジンなどの極性（親水性）残基との置換、及び／又は極性残基の、非極性残基との置換を含む。

【0188】

「保存的置換」という語句は、ペプチドがＮＴ－３と結合する必要な能力を保持する限り、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化された残基の使用も含む。実質的に類似したペプチドは、さらなるアミノ酸の存在、又はＮＴ－３と結合する必要な能力に影響を与えない１つ以上のアミノ酸の欠失も含み、例えば、実質的に類似したペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端システインを含有することができ、それによって、必要に応じて、ペプチドは、担体タンパク質、例えば、アルブミンに共有結合され得る。このような結合は、血液からのペプチドの除去を減少させ、ペプチドのタンパク質分解の速度も低下させ得る。さらに、本発明の趣旨では、Ｌ－アミノ酸の代わりにＤ－アミノ酸を含有するペプチドも、「保存的置換」という用語に含まれる。このようなＤ－異性体の存在は、タンパク質分解活性及びペプチドの除去を最小限に抑えるのに役立ち得る。

【0189】

ある実施形態において、プロ－ニューロトロフィン－３タンパク質（プロ－ＮＴ－３）が、対象に投与される。ニューロトロフィン－３のプロ形態は、酵素的切断及び約１５ｋＤａのＮ末端プロドメインの除去によって成熟ＮＴに変換されるＮＴ－３の約３０ｋＤａの前駆体形態である。Ｔａｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，３３（４），６２２－６３１（２０１１）を参照されたい。

【0190】

筋萎縮の治療
本発明は、末梢の筋萎縮を有する対象を治療する方法を提供する。ピルベート化合物が、予防的及び／又は治療的処置を提供するために使用され得る。ピルベート化合物は、例えば、末梢性ニューロパチーの発症の前に、対象に予防的に投与され得る。予防のための（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）（すなわち、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ））投与は、対象における末梢性ニューロパチーの後の発症の可能性を低下させ、又は後に発症する末梢性ニューロパチーの重症度を低下させるのに有効である。予防的処置は、末梢性ニューロパチーを発症するリスクが高い対象、例えば、末梢性ニューロパチーの家族歴を有する対象に提供され得る。ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）の突然変異の発現は、シャルコー・マリー・ツースニューロパチーの全ての発生の７０～８０％に相当し、したがって、それらの存在は、本明細書に記載されるピルベート化合物を用いた治療を受ける患者を選択するための基準として有用であり得る。

【0191】

或いは、本発明の化合物は、末梢性ニューロパチーに既に罹患した対象に治療的に投与され得る。治療的投与の一実施形態において、この化合物の投与は、末梢性ニューロパチーを取り除くのに有効であり；別の実施形態において、ピルベート化合物の投与は、末梢性ニューロパチーの重症度を低下させ、又はそれに罹患した対象の寿命を延長するのに有効である。ある実施形態において、治療の方法は、治療的に有効な量の、薬学的に許容される製剤中のピルベート化合物を、かなりの期間にわたって対象に投与することからなる。

【0192】

ＣＭＴ変異体
シャルコー・マリー・ツース（ＣＭＴ）遺伝性ニューロパチーは、遺伝性運動及び感覚性ニューロパチーとして知られている、慢性運動及び感覚性多発ニューロパチーによって特徴付けられる疾患群を指す。常染色体優性ＣＭＴニューロパチータイプは、脱髄性（ＣＭＴ１とも呼ばれる）、軸索非脱髄性（ＣＭＴ２とも呼ばれる）及び優性中間型ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）である。また、ＣＭＴと同等の他のニューロパチーは、遠位型遺伝性運動ニューロパチー９ｄＨＭＮ）及び遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）及びデジェリン・ソッタス症候群（ＤＳＳ）である。ＣＭＴニューロパチーの説明及び分類が、Ｂｉｒｄ，ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｅａｔｔｌｅ ＰＩＭ ２０３０１５３２，Ｕｐｄａｔｅｄ ２０１８ Ｊｕｎ ２８に提供されている。

【0193】

現在、ＣＭＴ関連遺伝子に対して知られている７０を超える公知の遺伝的変異がある。これらの遺伝的変異は、Ｍａｇｙら（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ９０：ｅ８７０－６，２０１８）の分類システムを用いて以下の表１に示される。各ＣＭＴ関連遺伝的変異についての遺伝形式は、常染色体優性（ＡＤ）、常染色体劣性（ＡＲ）又はＸ連鎖性（ＸＬ）である。各ＣＭＴ関連遺伝的変異についてのニューロパチーは、軸索（Ａｘ）、脱髄性（Ｄｅ）及び中間型（Ｉｎ）である。表１に示される「他の表記」は、優性中間型ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、遠位型脊髄性筋ジストロフィー（ＤＳＭＡ）、遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー（ＨＳＡＮ）及び遠位型遺伝性運動ニューロパチー（ｄＨＭＮ）を含む他の分類システムにおいて使用される表記である。

【0194】

【表1-1】

【0195】

【表1-2】

【0196】

【表1-3】

【0197】

【表1-4】

【0198】

【表1-5】

【0199】

投与及び製剤化
本発明のある実施形態とともに使用されるベクター又はペプチドは、対象への投与に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、本発明のベクター及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用される際、「薬学的に許容される担体」としては、生理学的に適合する、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにそれらの組合せのうちの１つ以上が挙げられる。多くの場合、組成物中の等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいことがある。薬学的に許容される担体は、ベクター又は医薬組成物の保存期間又は有効性を向上させる、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝液などの、少量の補助物質をさらに含み得る。

【0200】

ベクター又はペプチドは、急性に（すなわち、発症の際又は筋萎縮をもたらす事象の直後に）投与され得るか、又は予防的に（例えば、予定された手術の前、又は兆候若しくは症状が現れる前）投与され得るか、又は本来なら発生し得る症状の進行を軽減若しくは改善するために筋萎縮の過程において投与され得る。投与のタイミング及び間隔は、対象の症状に応じて変化され、当業者によって決定され得るように、数時間、数日間、数週間又はそれ以上の期間にわたって、数時間から数日間の間隔で投与され得る。

【0201】

ベクター又はペプチドを含有する組成物は、一般に、静脈内投与される。静脈内投与される場合、この組成物は、担体及び／又は助剤などの他の成分と組み合わされ得る。ペプチドはまた、ペプチドの除去を最小限に抑えるように、アルブミンなどのタンパク質担体に共有結合され得る。このような成分が薬学的に許容されるものであり、それらの意図される投与に有効でなければならず、組成物の有効成分の活性を低下させてはならないことを除いて、他の成分の性質に対する制限はない。

【0202】

注射に好適な医薬品形態としては、滅菌水溶液又は分散体、及び滅菌注射用溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、最終的な溶液形態は、滅菌した流体でなければならない。典型的な担体としては、例えば、水で緩衝された水溶液（すなわち、生体適合性緩衝液）、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、それらの好適な混合物など）、界面活性剤又は植物油を含有する溶媒又は分散媒が挙げられる。滅菌は、ろ過又は抗菌剤若しくは抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸若しくはチメロサールの添加を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において承認されている任意の技術によって行われ得る。さらに、糖又は塩化ナトリウムなどの等張剤が、本発明の組成物に組み込まれ得る。

【0203】

本発明のペプチドを含有する滅菌注射用溶液の製造は、必要な量のこれらの化合物を、必要に応じて、上記に列挙される様々な成分とともに適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌、好ましくはろ過滅菌することによって行われる。滅菌粉末を得るために、上記の溶液は、必要に応じて、真空乾燥又は凍結乾燥される。

【0204】

本発明のペプチドが経口投与される場合、有効な用量のペプチドを含有するそれらの医薬組成物はまた、吸収可能な食用担体などとして不活性希釈剤を含有し得、ハード又はソフトシェルゼラチンカプセル中であり得、錠剤へと圧縮され得、又はエリキシル剤、懸濁液、シロップなどの中であってもよい。したがって、本発明のペプチドは、治療的に有効な量の好適な薬学的に許容される担体とともに、薬学的に有効な量で、好都合且つ有効な投与のために配合される。

【0205】

本明細書において使用される際の「有効量」又は「治療的に有効な量」という表現は、筋成長を刺激するか、又は筋萎縮を軽減若しくは防止するのに十分な、薬剤の量を指す。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、特定の治療剤、その投与方法及び／又は投与経路などに応じて、対象ごとに異なる。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の総一日使用量が、妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定可能であることが理解されるであろう。任意の特定の対象又は生物のための具体的な治療的に有効な用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物；対象の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食習慣；用いられる具体的な組成物の投与時期、投与経路、及び排せつ速度；治療の期間；用いられる具体的な組成物と組み合わせて若しくは同時に使用される薬物；並びに医学の技術分野において周知の同様の要因を含む様々な要因に応じて決まる。

【0206】

ベクター又はペプチドは、剤形と適合する方法で、また、治療的に有効であるような量で投与され得る。全身投与量は、患者の年齢、体重及び状態並びに投与経路に応じて決まる。例えば、成人への投与のためのペプチドの好適な用量は、体重のキログラム当たり約０．００１～約２０．０ｍｇの範囲である。ペプチドは、好ましくは、投与当たり少なくとも約５０ｍｇの量で、より好ましくは、投与当たり最大で約５００ｍｇ～約１グラムの量で投与されるべきである。本発明のペプチド組成物は、血流から最終的に除去されるため、組成物の再投与が指示され、好ましい。

【実施例0207】

ここで、本発明の態様及び実施形態が、以下の実施例によって例示される。しかしながら、本発明の範囲内に含まれる様々な他の実施形態が存在し、これは、本明細書に示される特定の例に限定されるべきではない。

【0208】

実施例１
ＡＡＶ１．ＮＴ－３遺伝子治療は、ＣＭＴマウスモデルにおけるＭＴＯＲ経路及び代謝リモデリングの活性化によって筋線維径を増加させる
ＮＴ－３は、軸索再生及びそれに付随する髄鞘形成を促進する、末梢神経及びシュワン細胞に対するよく認識された効果を有する。遺伝子注入の１６週間後の時点でのＴｒｅｍｂｌｅｄ（ＴｒＪ）マウスからの神経原性筋の酸化状態に対するＡＡＶ．ＮＴ－３遺伝子治療の効果を評価したところ、筋線維サイズの増加が、野生型に見られる線維タイプ比率の正規化に対する筋線維の酸化状態の変化に関連していたことが分かった。ＮＴ－３に誘発される線維サイズの増加は、速筋線維集団について最も顕著であった。ＴｒＪ筋肉のこれらの変化には、ｍＴＯＲＣ１活性化の証拠としての４Ｅ－ＢＰ１及びＳ６タンパク質のリン酸化レベルの増加が伴っていた。並行して、ミトコンドリア生合成調節因子ＰＧＣ １α、及び解糖のマーカー（ＨＫ１及びＰＫ１）の発現レベルが、ＴｒＪ筋肉において増加した。インビトロ試験は、組み換えＮＴ－３が、ＴｒｋＣ発現筋管においてＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路活性化を直接誘発し得るが、筋芽細胞においては誘発しないことを示した。これとともに、ミオゲニン発現レベルは、筋管において有意に高かった一方、ｐ７５ＮＴＲ発現は、筋芽細胞と比較して下方制御され、これは、ＮＴ－３に誘発される筋芽細胞分化が、ｍＴＯＲＣ１活性化に関連していることを示す。これらの研究は、ＮＴ－３が、ｍＴＯＲ経路の直接の活性化によって神経原性筋における筋線維径を増加させ、線維サイズの増加が、速筋線維についてより顕著であることを初めて示した。

【0209】

方法
動物、治療プロトコル及び病理組織学：ＴｒＪマウス（Ｂ６．Ｄ２－Ｐｍｐ２２Ｔｒ－Ｊ／Ｊ）及びＣ５７ＢＬ／６野生型を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。９～１２週齢のＴｒＪマウスの左腓腹筋に、ＰＢＳ（ｎ＝６）又は３×１０^１０ｖｇの自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴ－３ベクター（ｎ＝６）のいずれかを注射した。別のコホートのＴｒＪマウスに、１×１０^１１ｖｇの一本鎖ＡＡＶ１．ＣＭＶ．ＮＴ－３を注射して、比較（ｎ＝６）のために高ＮＴ－３発現レベルを誘発した。ＷＴマウスに、ＰＢＳ（ｎ＝６）又は３×１０^１０ｖｇのｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴ－３ベクター（ｎ＝４）のいずれかを投与した。マウスの群を安楽死させ、それらの筋肉を、遺伝子注入の１６週間後の時点で採取し、クライオスタット切断のために処理した。コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）酵素組織化学を用いて、社内で確立された標準的なプロトコルを用いて代謝線維タイプ分化を評価した。筋線維タイプ特異的な直径の測定を、厚さ１２μｍのＳＤＨ染色断面から得た。（動物当たり区域当たり断面当たり）正中線軸に沿って腓腹筋の３つの異なる領域（ＳＴＯから主に構成される深部領域、ＳＴＯ及びＦＴＯ若しくはＦＴＧの格子縞模様の外観を示す中間領域、及びＦＴＧ線維から主に構成される表面領域）をそれぞれ表す３つの画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１顕微鏡及びＳＰＯＴカメラを用いて、２０倍の倍率で撮影した。処理による代謝性変化に応答した、各領域内の線維の酸化状態の変化を捉えるために、この手法を選択した。暗色（ＳＴＯ）、中間（ＦＴＯ）及び明色ＦＴＧ）線維の直径を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ＬＥ４ソフトウェアを用いて、筋線維を横切る最短距離を測定することによって測定し、合計におけるパーセントとして表した。平均線維径（平均±ＳＥＭ）を、各コホートにおいて３つ全ての線維タイプを組み合わせることから得た。群当たり平均で１２５０の線維（９６０～１４８６）を測定した。

【0210】

ＡＡＶ．ＮＴ－３ベクター産生及び効力：ｔＭＣＫ又はＣＭＶプロモータ下でＮＴ－３を含有する血清型１を有する自己相補性ＡＡＶウイルスベクターの設計は、以前に記載されており、これは、ネーションワイド・チルドレンズ病院（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）のウイルスベクターコア（Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）において作成された。Ｓａｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２２（３）：５１１－５２１（２０１４）。アリコートにされたウイルスを、使用するまで－８０℃に保持した。血液試料を、注射の６及び１６週間後の時点で、麻酔下での眼内出血によって処理及び非処理マウスから採取し、血清を、捕捉ＥＬＩＳＡを用いてＮＴ－３レベルについてアッセイした。

【0211】

Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞培養及び筋管形成：Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、加湿されたチャンバ中で、３７℃及び５％のＣＯ２で１０％のＦＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃２６－１４０－０７９ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５６４００５５ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が補充されたＤＭＥＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１０５６９０１０，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からなる成長培地（ＧＭ）中で培養した。ＧＭを、分化培地［５％のウマ血清（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２６０５００８８，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５６４００５５ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１９６５０９２，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）］に交換することによって、コンフルエント培養細胞において筋管形成を誘発した。ＱＰＣＲ、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡを含む、筋管に関する全てのその後のアッセイは、筋管形成の誘発の３日後に開始した。筋芽細胞及び筋管の両方を、６ウェルプレートにおいて１００ｎｇ／ｍｌの濃度で組み換えヒトＮＴ－３（Ｐｅｐｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）に曝露した。製造業者の説明にしたがって、グルコース及びラクテートアッセイキット（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用することによって、培養培地を、グルコース消費及びラクテート形成のために収集した。

【0212】

ＱＰＣＲ実験：総ＲＮＡを、エンドポイントでＮＴ－３処理及び非処理対照マウスの腓腹筋から単離した。総ＲＮＡを、ＮＴ－３処理の前及び４８時間後に筋芽細胞及び筋管から単離した。ｍｉｒＶａｎａ ＲＮＡ単離キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃ＡＭ１５６０，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用し、その後、製造業者の説明にしたがって、Ｔｒａｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ，＃ ０４３７９０１２００１ Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）を使用することによって、ｃＤＮＡを合成した。他のｑＰＣＲ実験を、ｉＴａｑＴｍ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ，＃１７２５１２２，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用することによって行った。ＰＧＣ １α（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５０（７１７０）：７３６－７４０（２００７））及びＧＡＰＤＨ（Ｔｏｓｃａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１８（５）：１０３５－１０４５（２０１０））（ハウスキーピング遺伝子）についてのプライマー配列は、文献に見られる。他のプライマー配列は、Ｐｒｉｍｅｒ Ｂａｎｄ．Ｗａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１１４４－１１４９（２０１２）から見出される。全てのｑＰＣＲ実験を、ＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ機械を使用することによって行い、結果を、Ｄａｔａ Ａｓｓｉｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡＢＩ）を用いて分析した。

【0213】

タンパク質抽出及びウエスタンブロット実験：凍結した腓腹筋ブロックを、２０μｍの厚さに切断し、小さい２ｍｌのプラスチック管に入れ（ブロック当たり１５～２０の切片）、２０秒間で３回にわたって自動ペレットミキサー及び使い捨ての乳棒を用いてｌｘ Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，＃７８４２９，ＵＳＡ）及びｌｘホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ００４４，ＵＳＡ）］とともに溶解緩衝液［ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，＃８９９００，ＵＳＡ）中で均質化した。インビトロシグナル形質導入アッセイでは、筋芽細胞及び筋管を、ＮＴ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）とのインキュベーションの３０分後に小さい２ｍｌの管中に採取し、上述されるのと同じように溶解させた。溶解物を４℃で１０分間にわたって１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を注意深く収集した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，＃２３２５２，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用することによって測定した。タンパク質試料（１０～４０ｉｔｇ）を、４～１２％のＢｏｌｔ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ ｐｒｅｃａｓｔ １０又は１５ウェルポリアクリルアミドゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，＃ＮＷ０４１２０ＢＯＸ）中で電気泳動し、ＰＤＶＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃１０６０００２１，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＵＳＡ）に移した。膜を、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳ－Ｔ，Ａｍｒｅｓｃｏ，ＯＨ，ＵＳＡ）を含むＴＢＳ緩衝液中で、５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、室温で２時間ブロックし、４℃で、低温の部屋で一晩、５％のＢＳＡを含むＴＢＳ－ＴＳ緩衝液中で、適切な一次抗体とともにインキュベートした。この試験に使用される一次抗体は以下のとおりであった：抗ｐｈｏｓｐｈｏ Ｓ６タンパク質Ｓｅｒ２３５／２３６（＃４８５８）、抗Ｓ６タンパク質（＃２２１７）、抗Ｐｈｏｓｐｈｏ Ａｋｔ Ｓｅｒ４７３（＃４０６０）、抗Ａｋｔ（＃９２７２）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ ４Ｅ－ＢＰ１ ｔｈｒ３７／４６（＃２８５５）、抗４Ｅ－ＢＰ１（＃９６４４）、抗ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ，＃ｓｃ３６５０６２）。ＴＢＳ－Ｔを含むオービタルシェーカーにおいて５回にわたって５分間洗浄した後、膜を、１時間にわたってＴＢＳ－Ｔ緩衝液中の５％の脱脂粉乳中の、二次抗体［ＨＲＰ共役抗ウサギ（＃ＨＡＦ００８）、ＨＲＰ共役抗マウス（ＨＡＦ００７）］Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）製］とともにインキュベートした。膜を、上記と同じようにＴＢＳ－Ｔで再度洗浄し、次に、１～３分間にわたってＥＣＬ Ｐｒｉｍｅウェスタン検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ，＃ＲＰＮ２２３２ ＮＪ，ＵＳＡ）とともにインキュベートした後、複数回の曝露時間を用いて、Ｘ線フィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ，＃Ｅ３０１８，ＭＡ，ＵＳＡ）に曝露した。フィルムにおけるタンパク質バンドを、カメラ（Ｓｏｎｙ Ａ６００，Ｊａｐａｎ）を用いて撮影し、バンド強度を、（Ｑｕａｎｔｉｔｙ－Ｏｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＢｉｏＲａｄ，ｖ．４．６．９）を用いて定量化した。各試料中の分析されるタンパク質の相対含量を、バンド強度を同じ試料中のＧＡＰＤＨの含量に対して正規化することによって決定した。膜を０．１％のＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）で染色し、すすぎ、撮影して、各レーンで同等のタンパク質充填を確認した。

【0214】

統計：処理群及び非処理群の間の筋線維サイズ比較のために、統計分析を、一元配置分散分析（Ａｎｏｖａ）を用いてＧｒａｐｈ ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアにおいて行った。スチューデントのｔ検定又は一元配置Ａｎｏｖａを、他の統計分析に適用可能である場合に行った。有意なレベルは、Ｐ＜０．０５に設定した。全ての実験において、結果を平均±ＳＥＭとして示した。

【0215】

結果
ＴｒＪ筋肉におけるＡＡＶ１．ＮＴ－３誘発性線維タイプリモデリング
以前に、ＴｒＪ筋肉において、速筋タイプ線維から遅筋タイプ線維への切り替えが、ニューロパチー表現型の一環として観察された。Ｎｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，７２（１０）：９４２－９５４（２０１３）。この試験において、記載されるように筋肉の深部、中間及び表面領域から試料を採取することによって、ＳＤＨ染色を用いて、ＴｒＪ及び同齢のＷＴの腓腹筋における代謝線維タイプ分化を評価した。遺伝子注入の１６週間後の時点で、神経変化、小さい角張った線維及びタイプの集団を示した非処理（ＰＢＳ）群と比較して、特にＦＴＯ及びＦＴＧタイプの線維サイズの増加とともにＳＴＯ線維の著しい減少があった（図１Ａ及びＢ）。定量的試験は、ＴｒＪ－ＰＢＳ筋肉において、ＳＴＯ線維の単位面積当たりの数並びにパーセンテージの両方が、過去の試験と一致して、ＷＴ筋肉より有意に高いことを示した。処理群において、低（ｔＭＣＫ）又は高（ＣＭＶ）ＮＴ－３発現のいずれかをもたらす（図４）、両方のプロモータを含む１×１０^１１ｖｇの用量のＡＡＶ１．ＮＴ－３は、ＳＴＯからＦＴＯ／ＦＴＧ線維への線維タイプの切り替えを示した。両方の処理群におけるＳＴＯの平均密度又はパーセント（各群においてｎ＝３～５のマウスから得られる）は、ＷＴ筋肉と有意に異なっておらず、これは、ＮＴ－３による線維タイプ分布の正規化に対する変化を示す（図１Ｃ）。さらに、ＡＡＶ１．ＮＴ－３で処理されたＷＴ筋肉は、線維タイプ分布プロファイルの有意な変化を示さなかった。

【0216】

ＴｒＪマウスにおけるＮＴ－３処理は、筋線維サイズの増加に対する異なる効果を示した（表２）。ＮＴ－３が、ｔＭＣＫプロモータの制御下で発現されたとき、有意な直径の増加が、ＦＴＧ線維のみにおいて観察された。高ＮＴ－３発現がＣＭＶプロモータで得られた、第２の処理コホートにおいて、全ての線維タイプにおいて有意な直径の増加があった。興味深いことに、この用量依存的なＮＴ－３効果は、神経原性ＴｒＪ筋肉のみにおいて見られ；同じ時点、すなわち遺伝子注入の１６週間後の時点で、ＮＴ－３遺伝子治療によるＷＴ筋肉における線維タイプのいずれにおいても有意な直径変化は見られなかった。

【0217】

表２は、ＮＴ－３遺伝子治療後の神経原性ＴｒＪ筋肉における線維サイズの増加が、速筋線維についてより顕著であることを示す。

【0218】

【表2】

【0219】

ＡＡＶ－ＮＴ－３は、ＴｒＪ筋肉におけるｍＴＯＲシグナル伝達及び代謝マーカーを改善した
ＡＡＶ１．ＮＴ－３処理に応答するＴｒＪ筋肉における上記に示される組織学的所見により、ｍＴＯＲＣ１活性化がＮＴ－３に誘発される筋線維の肥大成長において役割を果たすかどうかの調査が促された。ｍＴＯＲＣ１の活性を、その下流の基質、群からの筋肉試料における４ＥＢＰ－１及びリボソームＳ６Ｐのリン酸化レベルによって評価した。ＡＡＶ１．ＮＴ－３で処理されたＴｒＪ筋肉において、リン酸化された４ＥＢＰ－１及びＳ６Ｐのレベルは、ＴｒＪ－ＰＢＳ対照から得られる非処理の同等物と比較して有意に増加した（図２Ａ）。対照的に、ＮＴ－３処理が、ＷＴ筋肉における４ＥＢＰ－１及びＳ６Ｐのリン酸化レベルに有意に影響を与えなかったことが分かった（図２Ｂ）。

【0220】

４Ｅ－ＢＰを介して、ｍＴＯＲＣ１は、核にコードされたミトコンドリアタンパク質の合成を調節し、ミトコンドリア活性及び生合成を制御し、したがって、エネルギー消費及び生成を調整する［１７］。したがって、ミトコンドリア生合成のマスターレギュレータ、ＰＧＣ １αが、ＮＴ－３処理ＴｒＪ筋肉において上方制御され、これは、ＮＴ－３が、神経原性筋に見られるＰＧＣ １αの発現レベルの欠陥を阻止することが可能であることを示す（図２Ｃ）。ｍＴＯＲＣ１活性化の欠如に呼応して、ＰＧＣ １α発現レベルの変化が、ＮＴ－３処理によるＷＴ筋肉において見られなかった（図２Ｃ）。ＮＴ－３遺伝子治療によるＴｒＪ筋肉における線維サイズの増加は、遅筋線維より高い解糖系活性を有するＦＴＯ及びＦＴＧ線維において主に起こる［１８］。これと一致して、処理されたＴｒＪ筋肉における解糖の律速酵素、ＨＫ１及びＰＫ１の発現が上方制御されたことも分かり、これは、解糖流量の増加を示唆している。これらの変化は、ＡＡＶ．ＮＴ－３で処理されたＷＴ筋肉において有意でなかった。

【0221】

ＮＴ－３は、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるＴｒｋＣ受容体を介したＡｋｔ／ｍＴＯＲＣ１経路を活性化する
本明細書に記載されるインビボ試験は、ＴｒＪ筋肉におけるＡＡＶ１．ＮＴ－３処理に誘発される線維サイズの増加及び線維タイプリモデリングが、ｍＴＯＲＣ１活性化に関連していることを示した。しかしながら、この変化が単に神経再生の結果であるかどうか、又はＮＴ－３が、神経再生と無関係に、筋肉タンパク質合成及び細胞代謝を直接変化させ得るかどうかという疑問が解決される必要がある。次の工程として、インビトロシステムにおけるｍＴＯＲ経路に対するＮＴ－３の直接の影響を、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞及び筋管を組み換えＮＴ－３に曝露することによって、神経の影響なしで調査した。結果は、ＮＴ－３が、筋管におけるＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路活性化を誘発し得るが（図３Ａ）、筋芽細胞においては誘発しないことを示した。３０分間にわたる１００ｎｇの組み換えＮＴ－３による筋管の処理は、対照群と比較して、Ａｋｔ、４ＥＢＰ１及びＳ６Ｐの有意に高いリン酸化をもたらした（図３Ａ）。別の組の実験において、ＮＴ－３は、４８時間のインキュベーションの後、筋管におけるミトコンドリア生合成マーカーＰＧＣ １α及び解糖のマーカー、ＰＫ１の発現を有意に高めたことが分かった（図３Ｂ）。したがって、この時点での上清の分析は、対照と比較して、ＮＴ－３で処理された筋管における増加したグルコース消費及び乳酸産生を示した（図３Ｃ）。これらの実験を行った条件下で、ＨＫ１発現レベルに対するＮＴ－３の効果は観察されなかった。

【0222】

筋芽細胞及び筋管培養物における分化経路への筋芽細胞の移入のマーカーである、ｐ７５ＮＴＲ及びＴｒｋＣ受容体、及びミオゲニンの発現を分析した。ＮＴ－３は、その好ましい受容体ＴｒｋＣ又は低親和性ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲへの結合を介して、その生物学的影響を及ぼす。Ｓｃｈｅｃｔｅｒｓｏｎ ＬＣ，Ｂｏｔｈｗｅｌｌ Ｍ，Ｎｅｕｒｏｎ，９（３）：４４９－４６３（１９９２）。ｐ７５ＮＴＲは、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞において発現され、筋肉分化中に下方制御される。Ｓｅｉｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１７６（１）：１０－２１（１９９８）。神経栄養因子、ＮＧＦが、ｐ７５ＮＴＲを介して筋肉分化及び細胞成長に影響を与え、ｐ７５ＮＴＲの下方制御が、筋肉分化に不可欠であると考えられることが示された。ＮＧＦの効果と同様に、ＮＴ－３も、筋管におけるミオゲニンの発現を促進することが分かり、予測されるように、これは、筋管と比較して筋芽細胞におけるｐ７５ＮＴＲの著しく高い発現に関連していた一方、ＴｒｋＣ発現レベルは、両方の群において異なっていなかった（図３Ｄ）。ＮＴ－３は、筋芽細胞又は筋管におけるこれらの受容体の発現レベルに対して異なる影響を及ぼさなかった。

【0223】

説明
ＮＴ－３が、ｍＴＯＲＣ１の活性化による正規化に対する線維サイズの増加及び線維タイプリモデリングをもたらす神経原性筋代謝に直接の影響を及ぼし得るというエビデンスが本明細書に示される。線維サイズの増加は、タイプＩＩ線維、特にＦＴＯサブタイプについて最も顕著であった。さらに、ＮＴ－３が、神経原性筋におけるそのインビボ効果への重要な寄与因子として、筋管におけるＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路活性化を誘発し得るが、筋芽細胞においては直接誘発しないことが示される。興味深いことに、同じ用量でのＷＴ筋肉におけるＮＴ－３遺伝子治療は、これらの特性に影響を与えなかったが、遺伝子治療パラダイムを用いた除神経ＷＴ筋肉に対するＮＴ－３効果は、試験されなかった。タイプＩＩ筋線維サブタイプに対するＮＴ－３の異なる効果が、神経挫滅部位へのＮＴ－３の局所送達を用いた又は用いない神経修復の８か月後にラット腓腹筋において以前に示されており、タイプＩＩｂ線維の割合及びサイズの両方が正常に戻ったことが見出された。Ｓｔｅｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１３９（３）：７０９－７１５（１９９７）。しかしながら、この効果は、運動標的器官における有益な結果を有するＮＴ－３に促進される軸索再生として解釈されるとともに、ＮＴ－３の可能性が、タイプＩＩｂ筋線維表現型を決定する運動ニューロンのサブセットに特に影響を与え得る。本発明者らのインビボ試験からの所見は、神経及び筋肉の両方に対するＮＴ－３の組合せ効果を表し得ることが主張され得る。しかしながら、本発明者らのインビトロデータは、ＮＴ－３が、Ａｋｔ／ｍＴＯＲＣ１の活性化によって筋肉代謝に対して直接の影響を与えること、及びこの直接の影響が、ＦＴＧ、すなわち、タイプＥｒｂ線維における優先的なサイズ増加をもたらす神経原性筋において重要である可能性が高いというエビデンスを強調する。

【0224】

コンディショナルトランスジェニックマウスにおいて、Ａｋｔの構成的に活性な形態を発現することが、タイプＩＩＩ）筋線維の成長のために筋肉肥大をもたらした。Ｉｚｕｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，７（２）：１５９－１７２（２００８）。これは、解糖に関与する転写産物の上方制御に関連しており、グルコース消費及び乳酸産生を増加させ（これは、より低いインスリンレベルに関連していた）、血液中のグルカゴンレベル及び高脂肪食に誘発される肥満に対する耐性を増加させた。逆に、ｍＴＯＲ不活性化は、解糖酵素、ＰＫ１及びＨＫ１の減少に関連していた。Ｒｉｓｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１８７（６）：８５９－８７４（２００９）。本発明者らの試験において、ＴｒＪ筋肉におけるＡＡＶ．ＮＴ－３処理は、ＦＴＧ線維のサイズ並びに解糖酵素ＰＫ－１及びＨＫ－１の発現の両方を増加させた。さらに、インビトロ試験は、ＮＴ－３が、ＰＫ－１の上方制御とともに、筋管におけるグルコース取り込み及びラクテート形成を増加させたことを示した。これらの結果は、ＮＴ－３が、速筋／解糖系線維を調節することによって全身の代謝を制御するのに関与し得ることを示唆しているが、さらなる試験がその役割を詳細に特徴付けるのに必要とされる。さらに、ＡＡＶ．ＮＴ－３処理は、活性化４Ｅ－ＢＰ１の高められたレベルとともに、ＴｒＪ神経原性筋に見られるＰＧＣ１αの発現レベルの欠陥を阻止することが可能であった。骨格筋において、ｍＴＯＲが、４Ｅ－ＢＰ１／ＰＧＣ１αを介してミトコンドリア生合成及び代謝を調節することは以前に示唆された。Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２５（８）：２９５２－２９６４（２０１５）。ＮＴ－３はまた、筋肉における４ＥＢＰ１及びＰＧＣ ｌαの活性化を介して、酸化的リン酸化を促進する役割を果たし得る。

【0225】

ＮＴ－３は、最初に、胎児発達中に中枢神経系（ＣＮＳ）において高いレベルで見られ、成人脳において減少され、これは、ＮＴ－３が、初期の神経発達中に重要な役割を果たすことを示唆する［２８、２９］。ＮＴ－３は、末梢神経においても重要であり、神経筋発達の多くの段階で好影響を及ぼす。ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）神経－筋肉共培養において、筋肉由来のＮＴ－３は、神経筋接合部におけるシナプス伝達の成熟を著しく促進する［３０～３３］。さらに、ＮＴ－３は、神経筋系の重要な要素、ＳＣの生存率を高める［３４］。ＮＴ－３は、ＳＣ中で発現されて、神経再生を促進し、自己分泌生存ループの重要な構成要素であり、成人神経におけるＳＣ生存及び分化を確実にする［３５～３９］。ＣＭＴ１Ａマウスモデルにおける試験において、ＮＴ－３のいくつかの重要な生物学的影響、すなわち、（ｉ）ＳＣ数の増加、（ｉｉ）有髄線維の数の増加、及び（ｉｉｉ）軸索神経フィラメント細胞骨格の正規化が観察された［５、４０］。本明細書において特に興味深い別のＮＴ－３効果は、ミエリン厚さの増加であり、これは、ＮＴ－３がミエリンタンパク質産生に影響を与え得るという形態的証拠として認識された。

【0226】

以前の研究は、ｍＴＯＲＣ１が、ＣＮＳにおける髄鞘形成の調節において役割を果たすというかなりの証拠を示した。構成的に活性なＡｋｔキナーゼのトランスジェニック過剰発現は、ｍＴＯＲシグナル伝達を介してＣＮＳにおけるミエリン膜成長を促進するのに十分であり［４１、４２］、オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＩＧＦ－１に刺激されるタンパク質合成が、ＰＩ３ＫＪＡｋｔ及びＭＥＲ／ＥＲＫ経路を必要とする［４３］。ミエリンタンパク質合成を刺激する、翻訳機構を標的とするＮＴ－３の能力が、まず、オリゴデンドロサイト初代培養において示された［４４］。ＮＴ－３は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路を介してオリゴデンドロサイトにおける４ＥＢＰ１リン酸化を上方制御することが分かった。遺伝子不活性化手法を用いて、特にＳＣにおけるｍＴＯＲ機能を取り除くことは、それらの正常に有髄化する能力に影響を与えた［４５］。実際に、突然変異体において、髄鞘は、薄いことが分かり、節間長は短く、軸索の肥大成長が低下された。これとともに、ｍＴＯＲの下流の標的、Ｓ６及び４Ｅ－ＢＰ１は、あまりリン酸化されなかった［４５］。

【0227】

これらの過去の研究を考慮すると、筋線維径の増加に対するＮＴ－３の効果が同じ機構を介している可能性があった（ｍＴＯＲＣ１の活性化を介した直接の効果）。ＴｒＪにおいて使用される同じ用量でのＷＴ筋肉におけるＮＴ－３遺伝子治療が、線維タイプのサイズ又はタイプ分布の有意な変化を誘発しなかったことに留意することが重要である。ＷＴ筋肉におけるこれらの観察は、ＮＴ－３の効果が、高度に分化した細胞又は正常に機能している細胞に向けられておらず、病理学的過程に起因し得るリモデリングされた細胞代謝に対して機能することを示唆する。１つの補強証拠は、ＮＴ－３が、ＷＴ動物における挫滅外傷後の機能回復を改変せず、対照又はＮＧＦ処理動物よりわずかに多い軸索をもたらすに過ぎないことである［４６］。ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴ－３を評価する本発明者らの毒性試験は、これらの観察と一致して、ＣＭＴ１Ａの処理のために臨床試験について提案される最も高い用量より１０倍多い１×１０^１３ｖｇ／ｋｇで投与されて、Ｃ５７ＢＬ／６又はＴｒＪマウスにおける器官組織の処理に関連した毒性又は組織病理学的異常を示さない。

【0228】

筋肉発達中、ｐ７５ＮＴＲが、筋管／筋線維を形成するか又は衛星細胞へと分化することになる筋芽細胞において一時的に発現される［２３］。受容体の一時的な発現パターンは、ｐ７５ＮＴＲが分化前に筋芽細胞の生存を媒介すること、及び筋形成中のこの受容体の活性が、筋肉を発達させるのに重要であることを示す［２３］。ＮＧＦの効果［２１］と同様に、ＮＴ－３が、筋管においてミオゲニンの発現を促進することが分かり、予測されるように、これは、筋芽細胞におけるｐ７５ＮＴＲの著しく高い発現に関連し、これは、筋管において有意に下方制御された。ＴｒＪ及びＷＴ筋肉試料におけるｐ７５ＮＴＲ及びＴｒｋＣ発現を調べたところ、ＷＴと比較して神経ＴｒＪ筋肉における両方の有意に高い発現レベルが見られ、これらのレベルは、ＮＴ－３に応答して低下した（図５）。興味深いが、この観察は、その細胞型がこれらの受容体を発現するか、又はそれらが、衛星細胞若しくはＳＣにおいて、全ての筋線維内で発現されるか若しくは筋線維の１つのサブタイプのみで発現されるかについての結論を可能にしない。ヒト筋疾患におけるＮＴ－３及び他のニューロトロフィン及びそれらの受容体の発現についての利用可能なデータは限られる。しかしながら、筋肉生検の組織学的調査を、主要な筋肉前駆細胞の分子及び細胞分析と組み合わせたこれまでの最近の研究は、ｐ７５ＮＴＲが、インビボでほとんどの衛星細胞によって発現され、炎症及びジストロフィー筋肉における再生線維のマーカーであることを示した［４７、４８］。神経原性筋における本発明者らの所見は、特に興味深く、様々な疾患経過の機構についてのより包括的な研究が必要とされる。

【0229】

保存されるＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼとして、ｍＴＯＲが、栄養素、成長因子、エネルギー状態、及び環境ストレスからのシグナルを統合することによる細胞成長の中心的調節因子である。細胞生物学及び病理生物学における、特に、優れた代謝及び形態学的適応能力を有する筋肉における、ｍＴＯＲの重要な役割は、現在、大きな関心を集めている。ｍＴＯＲは、ラプター（ｒａｐｔｏｒ）と結合して、ｍＴＯＲＣ１を形成し、ラプターの筋特異的不活性化が、筋萎縮、酸化能力の低下、及びグリコーゲン貯蔵の増加をもたらし、有酸素系筋肉において最も顕著であったジストロフィー特徴をもたらすことが示された［４９］。ｍＴＯＲ活性の低下は、一方で、遅筋及び速筋の両方においてミオパチー特徴を悪化させ、酸化的代謝の低下、ミトコンドリア制御の変化、及びグリコーゲン蓄積を含む、ラプターを欠いた筋肉において観察されるものと同様の代謝性変化を示す［２６］。筋肉壊死／再生の、心臓毒性に誘発されるサイクルのパラダイムを用いた研究において、本発明者らは、最近、肢帯型筋ジストロフィー２Ａ型のマウスモデルにおける再生の低下を示し、カルパイン－３欠損筋肉が、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達の乱れ及び欠陥のあるミトコンドリア生合成に関連していることを示した（検討中）。総合すれば、本明細書に記載される所見は、神経及び筋肉の両方に利益を有するニューロパチーの治療のためだけでなく、さらには老化、癌悪液質又はタイプＩＩ筋線維萎縮を含む筋消耗疾患並びに再生の肥大成長期の障害に関連する遺伝性又は後天性自己免疫性原発性筋疾患のための、ＮＴ－３の潜在的な使用についての多くの示唆を有する［５０～５２］。これらの障害におけるｍＴＯＲシグナル伝達の乱れの役割を理解することは、ＮＴ－３が重要な役割を果たし得る新規な併用治療法の開発を可能にするはずである。

【0230】

実施例２
ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＦＴ３ベクターを用いたＮＴ－３送達
投与される組成物は、図３に示される、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３と呼ばれる非複製的な組み換えアデノ随伴ウイルスである。ベクターは、ｔＭＣＫ筋特異的プロモータの制御下で、ヒトＮＴ－３遺伝子を含有する。インビボでの生物学的効果が、Ｃ５７Ｂ１６マウスの腓腹筋へのベクター（１×１０^１１ｖｇ）の筋肉内注射の後に試験され、その後、遺伝子注入の４～６週間後の時点で、ＥＬＩＳＡによる血清における循環ＮＴ－３の定量化が行われる。

【0231】

最初に、腓腹筋に送達されたｓｓＡＡＶ１．ＣＭＶ．ＮＴＦ３が、ＴｒＪ神経の機能的、電気生理学的及び組織病理学的改善を提供するのに十分な持続する且つ治療的なＮＴ－３血中濃度をもたらしたことが実証された。次に、必要なベクター用量を生成し、ｓｃＡＡＶ１によって発現カセットをパッケージングすることによって同じレベルの発現を達成することが可能であったかどうかが調べられた。用量反応試験を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて行い、３つの用量（３×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ及び３×１０^１０ｖｇ）のｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３及びｓｃＡＡＶ１．ＣＭＶ．ＮＴＦ３の筋肉内注射後の血清ＮＴ－３ ＥＬＩＳＡデータを比較した。１×１０^１１ｖｇのｓｃ．ｒＡＡＶ１．ＣＭＶ．ＮＴＦ３ベクターの投与が、自己相補性ベクターを用いたより高い効力と一致して、同じ用量の一本鎖ベクターより有意に高いＮＴ－３レベルをもたらした。半ｌｏｇ低用量（３×１０^１０ｖｇ）で、ＣＭＶ及びｔＭＣＫベクターの両方が、生物学的応答をもたらした、１×１０^１１ｖｇの用量のｓｓ．ＡＡＶ１．ＣＭＶ．ＮＴＦ３を投与されたマウスから得られたものと同等のＮＴ－３血中濃度をもたらした。注射の２４週間後の時点でのＴｒＪマウスからのＮＴ－３レベル（平均±ＳＥＭ）。全ての７つの群の間でＮＴ－３レベルの有意差が存在する（ｐ値＜０．０００１）。ＮＴ－３レベルの有意差が、プロモータ及び対照の両方について、最も高い用量及び中間用量のベクターについて観察された。しかしながら、分析は、両方のベクターについて、より低い用量について有意差を見出すことができなかった。クラスカル・ウォリス検定を用いて、全ての群（ＰＢＳ、ＣＭＶ ３Ｅ＋０９／１Ｅ＋１０／３Ｅ＋１０及びｔＭＣＫ ３Ｅ＋０９／１Ｅ＋１０／３Ｅ＋１０）の間の血清ＮＴ－３を比較する。マン・ホイットニーのＵ検定を用いて、各群及びＰＢＳ（対照）群の間のＮＴ－３を比較し、ボンフェローニ補正を用いて、多重比較について調整する。全体が参照により本明細書に援用される、Ｓａｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（３）：５１１－５２１，２０１４を参照されたい。

【0232】

処理の４０週間後の時点での筋肉直径の増加：ＮＴ－３遺伝子治療の効果を、ＰＢＳと比較してｓｓＡＡＶ１．ＣＭＶ．ＮＴＦ３（１×１０^１１ｖｇ）を注射された動物のサブセットにおいて、注射の４０週間後の時点での筋線維サイズについてＴｒＪマウスにおいて評価した。萎縮症の角張った線維及び群萎縮によって特徴付けられる神経性の変化が、非処理のマウスからの筋肉において明らかであった一方、線維タイプ集団及び全体的な線維サイズの増加としての神経再生のエビデンスが、治療効果として認識可能であった。左下肢の外側前部及び後部筋肉（前脛骨筋及び腓腹筋）から作成された筋線維サイズヒストグラムが、線維径の増加を示した。

【0233】

本発明者らの実験室におけるさらなる試験は、ＮＴ－３が、ＳＣ細胞におけるＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路を刺激し、神経における軸索の髄鞘形成及び肥大成長の改善を生じ、ＮＴ－３は、Ｔｒｋ－Ｃ受容体を介した筋管に対する直接の刺激作用も有し、これは、ＴｒＪマウスの筋肉における線維径の増加におけるその役割を示すことを示した。図３Ａは、ＮＴ－３が、ＳＣ及び筋管培養においてＡｋｔ（Ｐ－Ａｋｔ）及びｍＴＯＲ標的、４ＥＢＰ－１（Ｐ－４ＥＢＰ１）及びＰＳ６Ｋ（Ｐ－Ｓ６Ｋ）のリン酸化を増加させたことを示す。これらの試験は、この臨床試験においてベクター送達のために下腿の前部及び後部筋肉を選択することを正当化するエビデンスを提供する。

【0234】

自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶ１を用いた試験及び筋特異的切断型クレアチンキナーゼ（ｔＭＣＫ）プロモータの使用
ｓｃＡＡＶは、向上した安全性を生むより低い投与量及び生産規格を満たす投与量レベルを可能にする。ｔＭＣＫプロモータの使用は、オフターゲット効果を回避することによって、より高い安全性を同様に提供する価値のある目的である。以下の組の実験において、ＣＭＶプロモータの制御下のｓｃＡＡＶ１．ＮＴＦ３の有効性を、半ｌｏｇ範囲内の３つの用量（３×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ及び３×１０^１０ｖｇ）でいずれも投与される筋特異的ｔＭＣＫプロモータと比較した。ＴｒＪマウス末梢神経におけるＡＡＶ１．ＮＴＦ３遺伝子導入の有効性を、遺伝子導入の２４週間後に電気生理学的（表３）及び形態学的試験によって評価した。導入遺伝子発現のエビデンスを、ＥＬＩＳＡを用いて血清ＮＴ－３レベルを測定することによって評価した。

【0235】

【表3】

【0236】

電気診断試験中の調査者には、処理群を知らされていなかった。ＣＭＡＰについてＡＡＶ１．ＮＴＦ３．ＣＭＶ（高用量、ＨＤ）及びＡＡＶ１．ＮＴＦ３．ｔＭＣＫ（高用量、ＨＤ）の間に統計学的差異はなく、筋特異的ｔＭＣＫプロモータを使用することが好ましかった。これは、ＥＬＩＳＡ ＡｓｓａｙにおいてＮＴ－３レベルによってさらに裏付けられ、ここで、ＮＴ－３レベルの有意差が、プロモータ及び対照の両方について、最も高い用量及び中間用量のベクターについて観察された。

【0237】

全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに本明細書に引用される電子的に入手可能な資料の完全な開示内容が、参照により援用される。上記の詳細な説明及び例は、理解の明瞭さのために示されているに過ぎない。不必要な限定が、それらから理解されるべきではない。本発明は、示され、記載される正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形が、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれる。

【0238】

実施例３
ＮＴ－３発現ＡＡＶ構築物の構築
ｔＭＣＫ又はＣＭＶプロモータ下でＮＴ－３ ｃＤＮＡを含有する血清型１を有する自己相補性ＡＡＶウイルスベクターの設計が、全体が参照により本明細書に援用される、Ｓａｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２２（３）：５１１－５２１（２０１４）に以前に記載されている。アリコートにされたウイルスを、使用するまで－８０℃に保持した。血液試料を、注射の６及び１６週間後の時点で、麻酔下での眼内出血によって処理及び非処理マウスから採取し、血清を、捕捉ＥＬＩＳＡを用いてＮＴ－３レベルについてアッセイした。この構築物は、本明細書においてｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３と呼ばれる。

【0239】

ｔＭＣＫプロモータ／エンハンサー配列は、筋特異的遺伝子発現を促すのに使用され、それに融合されるエンハンサー要素（ｅｎｈ３５８ＭＣＫ、５８４－ｂｐ）が追加された筋クレアチンキナーゼプロモータから構成される。ＭＣＫエンハンサー（２０６－ｂｐ）のトリプルタンデム（ｔｒｉｐｌｅ ｔａｎｄｅｍ）を、ｔＭＣＫプロモータ／エンハンサーにおいて８７－ｂｐ基本プロモータにライゲートした。

【0240】

ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３薬物製品を、（ｉ）ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３－ベクタープラスミド（図７を参照）、（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ２及びＣａｐ１野生型遺伝子を含有するＲ８８／Ｃ１と呼ばれるＡＡＶ１ヘルパープラスミド及び（ｉｉｉ）ヘルパーアデノウイルスプラスミドを用いた、ヒトＨＥＫ２９３ Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ細胞の３プラスミドＤＮＡトランスフェクションによって製造した。

【0241】

分子構造及びオープンリーディングフレームによるプラスミドの概略図が、７に示される。ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３プラスミドに由来するＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接されるヒトＮＴＦ３ ｃＤＮＡ発現カセットを含有する自己相補性ＤＮＡゲノムである。ＡＡＶ１ビリオンに封入されるのはこの配列である。ｔＭＣＫ発現カセットを挿入して、ＮＴＦ３遺伝子配列をＡＡＶクローニングベクターｐｓｕｂ２０１に入れることによって、プラスミドｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３を構築した。ヒトＮＴＦ３遺伝子は、マウストリプルタンデムＭＣＫプロモータから発現され、これは、以前に記載されたＣＫ６プロモータの修飾であり、３つ組のＥ ｂｏｘ配列を含有する。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが、効率的な転写終結に使用される。カセットは、遺伝子発現の増加のためにキメライントロンも含有し、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロンからの５’供与部位、及び分岐点、及び免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のリーダー及びボディの間のイントロンからの３’スプライス受容部位から構成される。ＮＴＦ３発現カセットは、効率的なｍＲＮＡ終結のためにＡＴＧ開始及び２００ｂｐ ＳＶ４０ポリＡシグナルのすぐ前にコンセンサスコザックを有する。ＮＴＦ３ ｃＤＮＡは、その全体が含まれる（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１０２６５４）。このベクターに含まれるウイルス配列のみが、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列であり、これは、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングの両方に必要とされる。ＡＡＶ ＩＴＲは、両方においてほぼ同一であるが、反対の配向である配列である。「左」（突然変異）ＩＴＲは、ゲノムのヘアピン形成を可能にするように欠失された末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を有する。全てのＤＮＡプラスミド要素の同一性が、プラスミド源ストックにおけるＤＮＡプラスミドシーケンシングによって確認される。

【0242】

表４に示されるのは、配列番号１１のＡＡＶベクターＤＮＡプラスミド内の関連する分子構造の塩基対位置である。

【0243】

【表4】

【0244】

実施例４
第Ｉ相筋肉内試験
最初の第Ｉ相筋肉内（ＩＭ）安全性試験では、持続的なＮＴ－３導入遺伝子発現が、いくつかの理由で重要な、この第１段階における提案される転帰尺度である。毒性の真の評価は、遺伝子発現の実証に左右される。筋肉が形質導入されない場合、毒性（有害作用）の試験は、解釈するのがより難しくなる（遺伝子発現の低下に対する形質導入の欠如）。試験は、導入遺伝子発現を明確に認識し、それを内因性遺伝子発現と区別するための方法を確立する機会を提供する。

【0245】

この臨床試験は、非盲検、単回注射漸増投与試験であり、ここで、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３が、ＰＭＰ２２遺伝子重複を有するＣＭＴ１Ａ対象の両脚の腓腹筋及び前脛骨筋への筋肉内注射によって投与される。１８歳以上の９人の成人ＣＭＴ１Ａ患者が、この試験の２つのコホートのうちの１つに参加する。最初の３人の対象は、コホート１において両手足の間で両側に分配される有効な最小用量（２．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）で参加する。さらなる６人の対象は、コホート２において３倍用量漸増（６．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ）で参加する。遺伝子導入後のモニタリングは、２年間に及ぶ試験の残りの期間の間、７、１４、３０、６０、９０、１２０日、及び３か月間隔の追跡調査来院を含む。安全性は、この臨床的な遺伝子導入試験の主要エンドポイントである。停止基準は、２週間後に消散していない何らかのグレードＩＩの眼若しくは全身毒性又は何らかのグレードＩＩＩ以上の毒性の発生として定義される、許容できない毒性の発生に基づいている。二次エンドポイントは、遺伝子導入の２年後の時点でＣＭＴ小児尺度（ＣＭＴＰｅｄＳ）によって測定される能力の低下の停止として定義される有効性である。ＣＭＴＰｅｄＳは、機能的巧緻性試験（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｅｘｔｅｒｉｔｙ Ｔｅｓｔ）、９ホールペグ試験（Ｎｉｎｅ－Ｈｏｌｅ Ｐｅｇ Ｔｅｓｔ）（９ＨＰＴ）、徒手筋力計を用いたハンドグリップ、足底屈、及び足の背屈強度、針刺し及び振動感覚、ブルイニンクス・オセレツキー試験－バランス評価、歩容評価、走り幅跳び、及び６分間歩行試験（６ＭＷＴ）から構成される１１項目の尺度である。試験結果の測定は、１００メートル計測試験（１００Ｍ）、腓骨及び尺骨ＣＭＡＰ振幅及び感覚及び運動伝導速度、針刺しに対する感受性を増加するように修正された感覚試験、タッチテスト及び振動評価、疼痛及び疲労についての視覚的アナログ尺度、クオリティ・オブ・ライフの尺度としての簡易健康調査（Ｓｈｏｒｔ Ｆｏｒｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｒｖｅｙ）（ＳＦ－３６）、及び循環ＮＴ－３レベルを含む。

【0246】

試験に参加する患者は、任意の人種、民族、又は性別の背景を含む。この疾患の基準は、定義されており、Ｓｈｙら（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６４：１２０９－１２１４，２００１及びＮｅｕｒｏｌｏｇｙ ７０：３７８－３８３，２００８）によって既に確立された指針に従うことになる。

【0247】

試験の選択基準は以下のとおりである：
・ＣＭＴ１Ａと診断された成人対象（１８歳を超える）
・末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子を含む１７ｐ１１．２における１．５Ｍｂ重複を示さなければならない。
・任意の民族又は人種集団の男性及び女性
・足関節背屈の筋肉の低下を示さなければならない（重力に逆らって完全なＲＯＭを有するべきであるが、重力に逆らって完全な背屈を維持することができないか、又は３秒間以上つま先立ちすることができない（Ｎｏｒｔｈｓｔａｒ基準）］
・異常な神経伝導速度
・臨床評価及び反復神経伝導検査に協力する能力
・性的に活発な対象では、試験の間、信頼性のある避妊法を実施する意思があること。

【0248】

試験の除外基準は以下のとおりである：
・臨床観察、又はＨＩＶ、又はＡ型肝炎、Ｂ型肝炎若しくはＣ型肝炎感染の血清学的証拠に基づいた活性なウイルス感染
・進行中の免疫抑制療法又は試験の開始の６か月以内の免疫抑制療法（例えば、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン）
・持続的な白血球減少若しくは白血球増加（ＷＢＣ≦３．５Ｋ／μＬ又は≧２０．０Ｋ／μＬ）又は１．５Ｋ／μＬ未満の絶対好中球数
・ＥＬＩＳＡ免疫測定法によって決定される際に１：５０以上のＡＡＶ１結合抗体力価を有する対象
・研究室の主宰者（ＰＩ）の意見によれば、遺伝子導入の不必要なリスクが発生することから、併発疾患又は長期の薬物療法の必要性
・適切な筋力試験を妨げる、足関節拘縮若しくは手術
・妊娠、授乳、又は妊娠を計画している
・ニューロパチーの他の原因
・過去６か月以内の四肢の手術

【0249】

【表5】

【0250】

注射前のベースライン測定（－３０日目～－１日目）
書面によるインフォームド・コンセントを得て、病院登録手続き（ｈｏｓｐｉｔａｌ ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を完了した後、以下のベースライン医療処置及び測定が行われる。
・病歴
・併用薬の摂取
・身体検査
・胸部Ｘ線
・心エコー図
・ＥＫＧ
・血液学的血液実験室検査（ｂｌｏｏｄ ｌａｂｓ）（ＣＢＣ）
・凝固パラメータ：血小板、ＰＴ／ＩＮＲ、ＰＴＴ
・臨床化学血液実験室検査：ビリルビン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ＧＧＴ，
・アルカリホスファターゼ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、クレアチニン、アミラーゼ、血清タンパク質電気泳動、電解質、グルコース、クレアチンキナーゼ
・尿検査
・ウイルススクリーニング（肝炎及びＨＩＶ）
・妊娠検査（妊娠可能年齢の女性のみ）
・血液免疫学：中和抗体（ＡＡＶ１）及びエリスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）
・（ＮＴ－３及びＡＡＶ１）
・ＥＬＩＳＡのための血清（循環ＮＴ－３）
・有効性測定
・調査測定
・注射部位の写真

【0251】

注射前のプレドニゾロン投与
遺伝子導入の前に、各患者に、最大で６０ｍｇ／日で経口プレドニゾン１ｍｇ／ｋｇ／日の投与、続いて、遺伝子導入当日に第２の投与を与える。対象に、合計４回の投与のために、遺伝子導入の２４時間後及び４８時間後にプレドニゾンを投与する。

【0252】

遺伝子導入のためのプロトコル
ｔＭＣＫプロモータ（ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３）の制御下でヒトＮＴＦ３遺伝子を保有する自己相補性ＡＡＶ１が、腓腹筋及び前脛骨筋（ＴＡ）の内側頭及び外側頭に単回両側筋肉内注射において投与される。

【0253】

遺伝子導入手順
遺伝子導入手順は、以下のとおりである：
・遺伝子導入注入手順が、滅菌条件下で行われる。
・ベクターが、患者当たり合計約１０ｍＬ～２８ｍＬ（３つの筋肉に分けられる、四肢当たり５～１４ｍＬ）で、希釈剤なしで送達される。
・ベクターが、指定のラベル貼付された冷却器中で搬送される、二重の漏れ防止袋に密封された予めラベル貼付されたシリンジ中で処置室に送達される。
・合計５ｍＬ～１４ｍＬのベクターが、筋肉当たり合計３～６回の注射（各注入量は、０．５～１．０ｍｌである）において腓腹筋及びＴＡ筋肉の各頭部及び外側頭に投与される。図８Ａ及び８Ｂにおける注射部位の概略図を参照されたい。
・注射は、筋膜の少なくとも０．２５ｃｍ下に行い、注射は、超音波によってガイドされる筋肉の縦軸に沿って行う。
・各注射は、約１．５ｃｍ間隔を開ける。

【0254】

入院患者のモニタリング
遺伝子導入注射の後、対象は、バイタルサイン及び呼吸機能の緊密なモニタリングを続けながら、指定の入院患者用ベッドに戻る。バイタルサインを、最初の４時間にわたって約１時間ごとに、次に、退院まで４時間ごとにモニターする。安全性を、身体検査及び実験室評価によって評価する。対象に、経口プレドニゾンの第３の投与を与え（１日目）、プレドニゾンの第４及び最終投与を、翌日与える（注射の４８時間後、２日目）。患者は、遺伝子導入の約４８時間後に退院することになる（副作用が観察されない場合）。

【0255】

外来患者のモニタリング
退院後、患者は、遺伝子導入後２年間に及ぶ試験の残りの期間にわたって、７、１４、３０、６０、９０、１２０日、及び３か月間隔で追跡調査来院のために通院する。全ての通院時に得られた血液試料を、血清ＥＬＩＳＡにおいて抗ＮＴ－３抗体を用いて実証されるように、ＮＴ－３タンパク質発現について評価する。さらに、患者は、７、９、１１、１３及び１４回目の通院の時点で、有効性及び調査測定について試験される。血清ＥＬＩＳＡは、循環導入遺伝子の有効性を実証する二次転帰尺度を用いた機能的遺伝子発現の直接的測定法である。

【0256】

主要エンドポイント：
安全性は、この臨床的遺伝子導入試験の主要エンドポイントである。これは、いずれか１つのグレードＩＩＩ以上の予想外の処理に関連する毒性の発生として定義される許容できない毒性の発生に基づいて評価される。

【0257】

安全性測定
安全性は、身長及び体重、バイタルサイン、身体検査及びシステムレビュー、及び一連の血液実験室検査の収集により、各試験で測定される。実験室検査は、ＣＢＣ、血小板、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ＧＧＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、α－フェトプロテイン、クレアチニン、アミラーゼ、血清タンパク質電気泳動、電解質、グルコース、ＰＴ／ＩＮＲ及びＰＴＴ、ＣＫ、尿検査を含む。免疫学は、ＡＡＶ１に対する中和抗体及びＮＴ－３に対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ、ＡＡＶ１及びＮＴ－３に対するＴ細胞応答を検出するためのエリスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）からなる。全ての有害事象が記録され、遺伝子導入との関連性について評価される。

【0258】

二次エンドポイント
臨床的な遺伝子導入試験の二次エンドポイントは、遺伝子導入の２年後の時点でＣＭＴ小児尺度（ＣＭＴＰｅｄＳ）によって測定される能力の低下の停止として定義される有効性である。

【0259】

上肢及び下肢筋力試験が、上肢（ハンドグリップ）及び脚（足の背屈）の遠心運動（ｄｉｓｔａｌ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）について徒手筋力計（ｈａｎｄ ｈｅｌｄ ｄｙｎａｍｏｍｅｔｅｒ）を用いて行われる。試験のための四肢を、試験のために固定し、これは、足の等尺性収縮測定の信頼性を著しく向上させる（２９）。上肢機能が、９ホールペグ試験（９ＨＰＴ）により測定される。下肢機能が、計測１０メートル走／歩行（Ｔ１０ＭＷ）試験により測定される。

【0260】

試験結果測定
試験結果は、１００メートル計測試験（１００Ｍ）、腓骨及び尺骨ＣＭＡＰ振幅及び感覚及び運動伝導速度、針刺しに対する感受性を増加するように修正された感覚試験、タッチテスト及び振動評価、疼痛及び疲労についての視覚的アナログ尺度、クオリティ・オブ・ライフの尺度としての簡易健康調査（Ｓｈｏｒｔ Ｆｏｒｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｒｖｅｙ）（ＳＦ－３６）、及び循環ＮＴ－３レベルを含む。

【0261】

電気生理学的試験は、尺骨感覚神経振幅及び尺骨神経の複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）振幅（小指外転筋から記録される）並びに腓骨神経（前脛骨筋から記録される）並びに感覚及び運動伝導速度の測定を含む。前脛骨筋からの腓骨ＣＭＡＰ振幅が、ＣＭＴ１Ａを有する患者における臨床試験のための有用な転帰尺度であることが示されており（３０）；上肢運動症状については、尺骨ＣＭＡＰ振幅が、最も有益なパラメータであることが分かった（３１）。足及び手の温度は、これらの試験手順中、３２～３４℃に保たれる。視覚的アナログ尺度が、疼痛及び疲労の尺度に使用される（３２）。簡易健康調査（Ｓｈｏｒｔ
Ｆｏｒｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｒｖｅｙ）（ＳＦ－３６）が、処理の前及び後の疾患の負担をモニターし、比較するためにクオリティ・オブ・ライフの記録として使用される。

【0262】

任意選択の束状腓腹神経生検を行う患者に報奨金を与える。選出された場合、生検が、処理の開始前に（左腓腹から）、及び試験の最後に（右腓腹から）得られる。生検は、局所麻酔下で外来患者診察として行われる。組織が処理され、有髄線維再生に対するＮＴ－３の効果を評価するために調べられる。神経全体の長さに対して処理前及び処理後の材料のレベルを適合させるために、切開の近位端（長さ２．５ｃｍ）が、アキレス腱の正確に１０ｃｍ上に配置される（８）。

【0263】

統計分析
安全性は、この臨床的遺伝子導入試験の主要エンドポイントである。これは、いずれか１つのグレードＩＩＩ以上の予想外の処理に関連する毒性の発生として定義される許容できない毒性の発生に基づいて評価される。安全性は、身長及び体重、バイタルサイン、身体検査及びシステムレビュー、及び一連の血液実験室検査の収集により、各試験で測定される。実験室検査は、ＣＢＣ、血小板、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ＧＧＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、α－フェトプロテイン、クレアチニン、アミラーゼ、血清タンパク質電気泳動、電解質、Ｂ１２、グルコース、ＰＴ／ＩＮＲ及びＰＴＴ、ＣＫ、尿検査を含む。免疫学は、ＡＡＶ１に対する中和抗体及びＮＴ－３に対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ、ＡＡＶ１及びＮＴ－３に対するＴ細胞応答を検出するためのエリスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）からなる。全ての有害事象が記録され、遺伝子導入との関連性について評価される。

【0264】

主な二次転帰尺度は、ＣＭＴ疾患小児尺度（ＣＭＴ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｓｃａｌｅ）スコア（ＣＭＴＰｅｄＳ）における疾患重症度の低下の欠如として定義される。ＣＭＴＰｅｄＳのコンピュータ化された採点システムは、患者の成績が健康な集団と異なる標準偏差の数値に基づいて個々のスコアを決定するために、基準試料からのｚスコアを使用する。ＣＭＴＰｅｄＳの採点は、試験全体を通して全ての患者について２０歳の一定年齢で行い、これは、２つの理由から必要である。第１の理由は、元のＣＭＴＰｅｄＳ尺度が、最終的なスコアの計算の際に個々の尺度項目についての基準値に依拠するが、基準値は、２０３０の年齢を超える個体については存在しないことである。第２の理由は、小児と健康な同等の人とのスコアの比較が、まだ発達中の小児にとって不可欠であるが、それは、小児が誕生日を迎えたときに機能低下を課すという制限を有することである。試験に関する小児の素点が変化しなくても、採点基準は、彼らの加齢とともにより厳しくなるように設計され、これは、健康な子供に通常見られる予測される運動技能の向上を反映している。しかしながら、変性疾患の臨床試験において、実際の進行の停止により、成功した試験が継続され得る。基準制御データの年齢を、試験全体を通して一貫して保つことは、ＣＭＴＰｅｄＳに組み込まれる有効な採点システムの使用を可能にする。それはまた、進行の停止が検出されるような評価の実際の変化の観察を可能にする。

【0265】

ＣＭＴＰｅｄＳスコアが、２項検定を用いて２年間の期間にわたって改善されたか又は同じままでであった患者の割合は、９５％信頼区間を用いて推定される。調査の目的として、ＣＭＴＰｅｄＳの１１項目のそれぞれにおいて低下を有さない患者の割合が、別々に、並びに１００メートル計測試験（１００Ｍ）、ＣＭＡＰ振幅、疼痛強度の視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）、簡易健康調査（Ｓｈｏｒｔ Ｆｏｒｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｒｖｅｙ）（ＳＦ－３６）におけるスコア、及び循環ＮＴ－３レベルにおいて推定される。さらに、ピアソン又はスピアマン相関係数が、循環ＮＴ－３レベルと各転帰尺度との間の関連性を評価するために各測定時点で使用される。この試験は、予備段階にあるため、多重比較のためのｐ値が調整されない。しかしながら、感度分析が行われ、ボンフェローニ・ホルムステップダウン手順に基づいて、どの関連性が調整後に統計的に有意であるかを示す。

【0266】

縦軸の自然経過（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ）データ（３１、３２）に基づいて、成功した二次転帰尺度が、ハンドグリップ及び足関節背屈強度、９ホールペグ試験を完了させる時間及び１０メートル歩行する／走る時間の標準化された複合スコアの低下率の停止として定義される。

【0267】

実施例５
毒物学的試験
この試験の目的は、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）及び腓腹筋における単回筋肉内注射後のＴｒｅｍｂｌｅｒ（Ｔｒ^Ｊ）マウスにおける、筋特異的ｔＭＣＫプロモータ（ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３）の制御下でヒトニューロトロフィン因子３（ＮＴＦ３）ｃＤＮＡを発現する自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターの安全性を評価することであった。この報告の結果は、野生型及びｔｒｅｍｂｌｅｒマウスにおける単回筋肉内注射が安全であり、注射の最大で４８週間後に忍容性良好であることを実証している。

【0268】

試験動物
野生型Ｃ５７ＢＬ／６（陰性対照）及びＴｒ^Ｊ（被験物質）マウスに、ビヒクル（０．９％の滅菌生理食塩水）又は５０μｌの総体積の１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３のいずれかを筋肉内注射した。この系統のキャリアマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ストック番号０００６６４）又はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（ストック番号０２７）から入手可能である。Ｔｒ^Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ストック番号００２５０４）から入手可能である。

【0269】

Ｔｒｅｍｂｌｅｒマウスは、注射の時点で８～１０週齢であった。動物の入手可能性及び動物系統の公知の育種問題のため、動物のサブセットを、１２週齢で処理した。

【0270】

合計で８８匹（４４匹の雄／４４匹の雌）の動物が、試験に含まれていた。４４匹の動物（２２匹のＣ５７ＢＬ／６、２２匹のＴｒＪ）を、生理食塩水対照で処理し、４４匹の動物（２２匹のＣ５７ＢＬ／６、２２匹のＴｒＪ）を、ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３被験物質で処理した。これらの数のうち、各コホートからの動物の半分を、処理の２４週間後に安楽死させ、残りの動物を、処理の４８週間後に安楽死させた。動物を、耳標によって一意的に識別した。

【0271】

試験設計
ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３被験物質の安全性を評価するために、４～６週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６及び８～１２週齢のＴｒ^Ｊマウスに、ビヒクル（０．９％の滅菌生理食塩水）又は左腓腹筋における単回筋肉内（ＩＭ）注射による５０μｌの総体積の１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３のいずれかを注射した。動物を、全体的な健康及び罹患率について、試験の全経過を通じて毎日観察した。死亡率のチェックを、１日２回行った。体重を２週間置きに測定した。８週間置きの過敏性についての機能試験（ホットプレート及び聴覚驚愕試験）。行動試験（ロータロッド及びワイヤーハンギング）を２週間置きに行った。

【0272】

温度感度を、注射の２週間前から開始して、続いて０日目、及び８週間置きに、げっ歯類ホットプレート試験を用いて試験した。試験を行うために、動物を、５５℃の温度に維持されたプレート表面上に載せ、プレート表面を囲む高さ１５ｃｍのＰｌｅｘｉｇｌａｓ壁を用いて、移動を１００ｃｍ^２の面積に制限した。動物を加熱表面に載せた時点でタイマーを開始し、反応潜時を、ストップウォッチによって０．１秒まで記録した。以下の活動が、熱刺激に対する応答とみなされる：後足をなめる又はさっと動かす（ｆｌｉｃｋ）／揺らす（ｆｌｕｔｔｅｒ）、跳ねて逃げようとするのも、許容される応答である。この応答が観察された場合、マウスをすぐに取り出した。

【0273】

音響感度を、注射の２週間前、続いて０日目（ベースライン）、血清ＮＴ－３レベルのピーク時（８～１２週間）及びその後は８週間置きに試験し、全ての動物を、聴覚驚愕試験（ＡＳＴ）を用いて聴覚過敏性について試験した。驚愕反応性を、Ｂｅｉｇｎｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１７１：２９５－３０２，２００６に以前に記載されているように、単一の驚愕反応実験チャンバ（ｓｔａｒｔｌｅ ｃｈａｍｂｅｒ）（ＳＲ－Ｌａｂ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて測定した。

【0274】

チャンバは、換気されたチャンバの内部の台に載っている透明の非制限的Ｐｌｅｘｉｇｌａｓシリンダからなっていた。チャンバの内部の高周波の拡声器が、６５ｄＢの連続的な背景雑音及び様々な音刺激の両方を発生させた。動物の全身驚愕反応によって引き起こされるＰｌｅｘｉｇｌａｓシリンダの振動が、台に取り付けられた圧電ユニットによってアナログ信号に変換された。次に、信号がデジタル化され、コンピュータによって保存された。６５の読み取り値を、刺激開始から開始して１ｍｓ間隔で取り、平均振幅（Ｖ_ａｖｇ）を用いて、聴覚驚愕反応を決定した。６５ｄＢの背景雑音レベルが、５分間の順応期間にわたって示され、試験セッションを通して続いた。全てのプレパルス抑制（ＰＰＩ）試験セッションは、驚愕試験（パルス単独）、プレパルス試験（プレパルス＋パルス）、及び無刺激試験（無刺激）からなっていた。パルス単独試験は、４０ｍｓの１２０ｄＢパルスの広帯域雑音からなっていた。ＰＰＩは、プレパルス＋パルス試験によって測定され、これは、２０ｍｓの雑音プレパルス、１００ｍｓの遅延、及び次に４０ｍｓの１２０ｄＢの驚愕パルスからなっていた。音響プレパルス強度は、６９、７３、及び８１ｄＢであった。無刺激試験は、背景雑音のみからなっていた。試験セッションは、パルス単独試験の５つの提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を伴い、開始及び終了し；その間に、各試験タイプは、疑似乱数順序で１０回提示された。試験の間は平均で１５秒（１２～３０秒の範囲）であった。

【0275】

ロータロッド分析では、全ての対象が同程度にタスクを学習するのに、少なくとも１週間の訓練が必要とされた。加速回転プロトコルにおいて、動物をロッドに載せ、このロッドは、５ｒｐｍに加速し、次に５ｒｐｍ／ｓｅｃ７で上昇する。動物に、１つのセッションにつき３つの試験を行い、それを平均した。

【0276】

ワイヤーハンギング分析では、動物を、柔らかいベッドの厚い層の３５ｃｍ上で水平方向に維持された直径２ｍｍのワイヤー金属ワイヤー上に四つの足によって載せた。マウスがワイヤーから落下するまでの時間の長さを記録し、各落下後、マウスに１分間の回復期間を与えた。各試験セッションは、３つの試験からなっており、それらからスコアを平均した。

【0277】

注射の２２及び４６週間後の時点で（安楽死の２週間前）、血液学試験（赤血球数、ヘマトクリット値、ヘモグロビン、白血球数（総数及び分画）、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球容積、平均血小板容積、血小板数、網状赤血球数）のために眼窩後方洞（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）から血液を採取した。臨床化学を、以下のパラメータ：アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、（総及び直接）ビリルビン、血中尿素窒素、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、グルコース、総タンパク質について分析した。

【0278】

注射の２４及び４８週間後の時点で、血液を心穿刺によって採取し、血清を免疫試験に使用した。血清試料を、各コホート（処理又は性別にかかわらず）における全ての動物のための抗ＡＡＶ１及び抗ＮＴ－３抗体価測定のために採取した。血清試料を、循環ＮＴ－３レベルのＥＬＩＳＡアッセイにさらに使用した。

【0279】

注射の２４及び４８週間後の時点で、Ｔｒ^Ｊ動物からの以下の組織を、病理組織学分析のために採取した：生殖腺、脳、脾臓、腎臓、空腸、結腸、膵臓、心臓、肺、胃、肝臓、鼠径部リンパ節、脊髄、（右及び左）腓腹筋、及び肉眼的病変（もしある場合）。組織を、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定し、切片化し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織学的分析を、ＳＮＢＬ ＵＳＡによって行った。

【0280】

注射の２４及び４８週間後の時点で、社内での病理組織学調査用の組織を、Ｔｒ^Ｊ対照コホート（ｎ＝５、３匹の雄、２匹の雌）を除いて、コホート当たり６匹の動物（３匹の雄、３匹の雌）について採取した。マウスを殺処分し、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中４％のパラホルムアルデヒドを用いて経心的に灌流した。腰髄、後根神経節（ＤＲＧ）及び全座骨神経部分（坐骨切痕から膝窩まで）を切開した。そのインサイチュ長さで座骨神経部分の近位の半分及び１つの腰部ＤＲＧを、グルタルアルデヒド固定液に移し、プラスチック包埋及び１μｍの厚さの切片化のために処理した。座骨神経組織及び腰部ＤＲＧの残りの部分を、３０％のスクロース中で抗凍結保護し、液体窒素中で冷却されたイソペンタン中で凍結させ、ＤＲＧニューロン及び軸索（脊髄におけるＣＧＲＰ陽性の検出のための免疫組織化学のために１２μｍの切片に切断し、ＴｒＪマウスからの脳を、１０％の中性緩衝ホルマリンに入れた。

【0281】

【表6】

【0282】

動物への投与、観察及び分析
示される動物に、左腓腹筋への単回筋肉内（ＩＭ）注射によって５０μＬの体積を０日目に１回投与した。正確な投与を行うために、最小で１５分間にわたって、イソフルラン吸入により動物に麻酔をかけた。左腓腹筋への直接の注射によって用量を投与した。全ベクター用量を筋肉中に正確に入れるように注意を払う。投与を行った後、動物を、歩行するまで観察し、ケージに戻した。各動物の観察を、試験の全期間にわたって毎日行った。体重を２週間置きに測定した。死亡率チェックを、１日２回行った。

【0283】

適切な月齢で、マウスに、ケタミン／キシラジン混合物（２００ｍｇ／ｋｇ／２０ｍｇ／ｋｇ）を過量投与した。血液を、心臓穿刺によって採取した。次に、組織を採取し、分析に送った。

【0284】

各時点で各コホートについて、体重、マウス血液学及び臨床化学をプロットする。抗ＡＡＶ１循環抗体、抗ＮＴ－３循環抗体、及び循環ＮＴ－３レベルのためのＥＬＩＳＡアッセイを、全てのエンドポイントについて行った。げっ歯類ホットプレート及び聴覚驚愕装置を用いた過敏性機能試験を、全ての動物について８週間置きに行った。行動試験を、全ての動物についてロータロッド及びワイヤーハンギング試験について、２週間置きに行った。器官における形態病理組織学を、全ての動物について行った。腰髄及びＤＲＧにおける社内での病理組織学を、５匹の動物（３匹の雄、２匹の雌）を含むＴｒ^Ｊコホートを除いて、コホート当たり６匹のマウス（３匹の雄、３匹の雌）において行った。病理組織学評価は、ＣＧＲＰ陽性の免疫細胞化学分布（腰部ＤＲＧニューロン及び脊髄中）並びに病理学的変化の分析のための座骨神経及びＤＲＧニューロンのプラスチック包埋を含んでいた。

【0285】

結果
罹患率及び死亡率
全てのマウスは、注射手順を経て生存し、最初の観察期間が、苦痛の兆候なく経過した。４匹のＴｒ^Ｊ動物は、水道システムの故障により死亡した。被験物質に関連する死亡はなかった。

【0286】

体重
各群における全てのマウスの体重を、試験の全経過を通じて２週間置きに測定した。全ての処理群が、試験全体を通して体重増加を一定に保った。

【0287】

Ｃ５７ＢＬ／６雄動物において、被験物質を注射された動物と対照との間で有意差はなかった。雌動物において、被験物質を注射された動物と比較して、対照動物で体重がわずかに高かった。Ｔｒ^Ｊ雄動物において、生理食塩水処理コホートが、ＮＴ－３処理コホートよりわずかに重かった。雌Ｔｒ^Ｊマウスについては、体重の有意差はなかった。

【0288】

血液学及び臨床化学
２２及び４６週間の時点で血液学パラメータにおいて、又は２４及び４８週間の時点で血清化学において被験物質に関連する変化はなかった。

【0289】

ＥＬＩＳＡアッセイ
抗ＡＡＶ１抗体、抗ＮＴ－３抗体及び循環ＮＴ－３のためのＥＬＩＳＡアッセイを、２４及び４８週間の解剖中に採取された血清試料を用いて行った。

【0290】

循環抗ＡＡＶ１抗体を測定するために、血清試料を、ベクター投与の２４及び４８週間後に採取し、抗体力価を、結合酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した（以下の表７を参照）。ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３で処理された動物は、ＡＡＶ１カプシドに対する増加した循環抗体を有していた。抗体力価は、両方の時点で雄及び雌の両方において同様であった。陽性力価（＞１：５０）は、生理食塩水対照で処理された動物において検出されなかった。

【0291】

【表7】

【0292】

抗ＮＴ－３循環抗体を測定するために、血清試料を、ベクター投与の２４及び４８週間後に採取し、ＮＴ－３に対する抗体力価を、結合酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。全てのマウスは、ベクター投与の２４及び４８週間後の時点で１：５０未満の抗体力価（陰性とみなされる）を有していた。表８を参照されたい。

【0293】

【表8】

【0294】

循環ＮＴ－３レベルを、標準的な結合ＥＬＩＳＡアッセイによって、ベクター投与の２４及び４８週間後の時点で採取されたＴｒ^Ｊマウスの血清試料において決定した。ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３ベクターの筋肉内注射は、ベクター投与の２４及び４８週間後の時点でＴｒ^ＪマウスにおいてＮＴ－３の着実な発現及び分泌をもたらした。表９は、生理食塩水及びベクター注射群からのＴｒ^Ｊにおいて注射の２４及び４８週間後の時点での血清ＮＴ－３レベルの平均及び標準偏差を示す。性別は、循環ＮＴ－３レベルに影響を与えなかった。

【0295】

【表9】

【0296】

過敏性試験
温度感度試験を、ベースライン（対照生理食塩水の被験物質のいずれかによる処理の前）で、及びＣ５７ＢＬ／６及びＴｒＪマウスにおいて注射の４８週間後になるまで８週間置きに行った。Ｃ５７ＢＬ／６及びＴｒＪコホートにおいて対照及びベクターを注射されたマウスの間に差はなかった。各コホートにおいて雄及び雌マウスの間に退避反応潜時の有意差はなかった。

【0297】

聴覚驚愕試験において行われる聴覚感度測定の結果は、ＡＳＴが、全ての強度（６９、７３及び８１ｄＢ）においてプレパルスによって明らかに阻害され、阻害のレベルが、野生型及びＴｒＪマウスの両方においてプレパルスの強度に依存していたことを実証した。被験物質による処理は、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおいてＰＰＩ応答を変化させなかった。％－ＰＰＩは、対照物質で処理されたＴｒＪ動物において検出可能により低く、被験物質（ＮＴ－３）で処理されたＴｒＪ動物において正規化に向かって改善された。ＮＴ－３で処理されたＴｒ^Ｊ動物におけるこの改善は、主に雄動物において見られた。

【0298】

行動試験
ロータロッド評価では、Ｃ５７ＢＬ／６コホートにおける動物は、処理にかかわらずロータロッド機能試験の差を示さなかった。ＴｒＪ ＮＴ－３で処理されたコホートにおける動物は、処理の１６週間後の時点で開始する、対照ＴｒＪ動物と比較してロータロッド性能の有意な改善を示し、これはエンドポイントまで持続した。

【0299】

ワイヤーハング評価では、Ｃ５７ＢＬ／６コホートにおける動物は、処理にかかわらずワイヤーハンギング機能試験の差を示さなかった。ＴｒＪ ＮＴ－３で処理されたコホートにおける動物は、処理の２８週間後の時点で開始する、対照ＴｒＪ動物と比較してワイヤーハンギング能力の有意な改善を示し、これはエンドポイントまで持続した。

【0300】

病理組織学
形態病理組織学を行った。分析される器官及び組織のリストが、表１０において以下に示される。

【0301】

【表10】

【0302】

安楽死の後、腰髄、後根神経節（ＤＲＧ）、及び全座骨神経（坐骨切痕から膝窩まで）を取り出し、組織病理学的評価のために処理した。社内での病理組織学のために含まれる個々の動物のリストが、表１１に示される。

【0303】

【表11】

【0304】

ＣＧＲＰ分布の免疫細胞化学分析
ＣＧＲＰ分布の免疫細胞化学分析のために、注射の２４及び４８週間後の時点での腰髄部分からの断面の調査を行った。この分析は、処理物質にかかわらず、Ｔｒ^Ｊ及びＣ５７ＢＬ／６動物においてＮＴ－３とのＣＧＲＰ反応性の増加を示さなかった。

【0305】

プラスチック包埋された切片の病理学的変化を分析した。注射の２４及び４８週間後の時点で調べられたプラスチック包埋された左座骨神経及び左腰ＤＲＧニューロンは、Ｃ５７ＢＬ／６動物において病理学的変化を示さなかった。軸索萎縮を示唆する、ミエリンのコルゲーション（ｃｏｒｒｕｇａｔｉｏｎ）／内側折り畳み（ｉｎｆｏｌｄｉｎｇ）及び外側折り畳み（ｏｕｔｆｏｌｄｉｎｇ）などの加齢に伴う変化が、処理の４８週間後の時点でＣ５７ＢＬ／６動物の両方の処理コホートにおいて見られた。生理食塩水で処理されたＴｒ^Ｊ動物において、有髄線維の顕著な脱落及び多くの髄鞘形成不全又は裸の軸索があった。被験物質で処理されたＴｒ^Ｊ動物は、小有髄線維、ミエリン厚さの視認可能な増加及び裸の軸索の減少を示す。ＤＲＧ内の軸索分枝の欠如から明らかなように、ＴｒＪマウスにおいてＮＴ－３処理の有害作用はなかった。

【0306】

概して、Ｃ５７ＢＬ／６及びＴｒ^Ｊ動物の両方において試験全体を通して処理に関連する不利な所見がないことは、処理が、注射の４８週間後まで忍容性良好であったことを示す。

【0307】

説明
単回筋肉内注射によって送達されるｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３の安全性を評価するために、合計８８匹（４４匹の雄／４４匹の雌）の動物を含む、毒性試験を設計した。４４匹の動物（２２匹のＣ５７ＢＬ／６、２２匹のＴｒＪ）を、０．９％の滅菌生理食塩水対照で処理し、４４匹の動物（２２匹のＣ５７ＢＬ／６、２２匹のＴｒＪ）を、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの濃度のｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３被験物質で処理した。これらの動物のうち、各コホートからの動物の半分を、処理の２４週間後の時点で安楽死させ、残りの動物を、処理の４８週間後の時点で安楽死させた。

【0308】

この報告におけるデータは、提案される臨床用量より１０倍多い用量による動物の処理が、被験物質に関連する、安全性への不利な影響の発現をもたらさなかったことを実証している。試験全体を通して、動物を、全体的な健康及び罹患率について毎日観察し、死亡率チェックを１日２回行った。動物の体重を２週間置きに測定した。過敏性（温度及び音響）についての機能試験を、８週間置きに行った。行動試験を２週間置きに行った。全ての動物は、注射手順を経て生存し、最初の観察期間が、苦痛の兆候なく経過した。水道システムの故障のため、被験物質の投与に関連しない、ＴｒＪ動物の４匹の死亡があった。その他の死亡はこの試験において記録されなかった。

【0309】

解剖の後、血液学及び臨床化学を測定したところ、被験物質に関連する差は示されなかった。抗ＡＡＶ１血清ＥＬＩＳＡを行ったところ、被験物質で処理された動物における循環抗体の予測される増加が示され、これは性別特異的でなかった。抗ＮＴ－３血清ＥＬＩＳＡを、全ての動物で行ったところ、全ての時点について陰性の抗体力価を示した。また、循環ＮＴ－３レベルが、全ての処理群について測定され、被験物質で処理された動物のみにおいて増加した。循環ＮＴ－３レベルに対する性別特異的な影響はなかった。温度過敏性試験は、Ｃ５７ＢＬ／６又はＴｒ^Ｊ動物における処理又は性別特異的な変化を示さなかった。聴覚感度測定は、Ｃ５７ＢＬ／６動物において被験物質に関連する変化を示さなかったが、被験物質で処理されたＴｒ^Ｊ動物における正規化に対する改善とともに、対照物質で処理されたＴｒ^Ｊ動物における障害を実証した。この改善は、主に雄Ｔｒ^Ｊ動物において見られた。Ｃ５７ＢＬ／６動物における運動制御のロータロッド評価は、被験物質による処理に関連する差を示さなかった。被験物質で処理されたＴｒＪ動物は、処理の１６週間後の時点で開始する、対照Ｔｒ^Ｊ動物と比較して有意な改善を示した。同様に、ワイヤーハンギング評価は、被験物質に関連するＣ５７ＢＬ／６コホートにおける差を示さなかった。被験物質で処理されたＴｒ^Ｊ動物は、処理の２８週間後の時点で開始する、ワイヤーハンギング時間の有意な改善を示し、これはエンドポイントまで持続した。

【0310】

処理の２４及び４８週間後の時点で全てのコホートから採取された組織及び器官を評価した。要約すると、単核細胞の最小の浸潤が、２４週間の解剖からの３／４の群１の雄及び４／５の群１の雌において、被験物質を注射された左腓腹筋において観察された。しかしながら、同様の浸潤が、残りの群１の雌（動物３９４２）において注射されていない腓腹筋においても観察された。この変化は、２４週間の解剖からのいずれかの群２（対照）動物において生理食塩水を注射された左腓腹筋又は非注射の右腓腹筋のいずれにおいても観察されなかった。４８週間の解剖動物において、単核細胞の最小の浸潤が、２／５の群１の雄及び１／６の群１の雌の被験物質を注射された左腓腹筋において再度観察された。全ての他の顕微鏡所見は、対照及び処理された動物にわたってランダムに分配されるか、種についてのバックグラウンド所見であるか、又は被験物質投与に付随するものとみなされた。

【0311】

社内での組織学を、動物（群当たり３匹の雄、３匹の雌）のサブセットの腰髄切片、後根神経節及び座骨神経において行った。腰髄部分からの断面の調査は、処理にかかわらず、動物においてＮＴ－３によるＣＧＲＰ活性の増加を示さなかった。プラスチック包埋された座骨神経及び腰部ＤＲＧニューロンの病理学評価は、Ｃ５７ＢＬ／６動物において加齢に関連する差を超えた変化を示さなかった。Ｔｒ^Ｊ動物において、被験物質による処理は、小有髄線維の増加、ミエリン厚さの増加及び裸の軸索の減少から明らかなように、病理の改善をもたらした。ＤＲＧにおける軸索分枝の欠如は、被験物質の安全性をさらに裏付ける。

【0312】

概して、この試験において示される収集されたデータは、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量での単回筋肉内注射によって腓腹筋に直接注射された被験物質ｓｃＡＡＶ１．ｔＭＣＫ．ＮＴＦ３が、上記に示される多重測定から明らかなように、雄及び雌Ｃ５７ＢＬ／６野生型及びＴｒ^Ｊマウスの両方において、注射の４８週間後まで忍容性良好であったことを示す。

【0313】

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２７．Ｓｈｙ ＭＥ，Ｂｌａｋｅ Ｊ，Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｖａｌｉｄｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＣＭＴ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｓｃｏｒｅ ａｓ ａ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００５；６４：１２０９－１２１４．
２８．Ｓｈｙ ＭＥ，Ｃｈｅｎ Ｌ，Ｓｗａｎ ＥＲ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ １Ａ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００８；７０：３７８－３８３．
２９．Ｓｏｌａｒｉ Ａ，Ｌａｕｒａ Ｍ，Ｓａｌｓａｎｏ Ｅ，Ｒａｄｉｃｅ Ｄ，Ｐａｒｅｙｓｏｎ Ｄ．Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｉｎ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２００８；１８：１９－２６．
３０．Ｋｏｍｙａｔｈｙ Ｋ，Ｎｅａｌ Ｓ，Ｆｅｅｌｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｅｒｉｏｒ ｔｉｂｉａｌｉｓ ＣＭＡＰ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｎ ＣＭＴ１Ａ．Ｍｕｓｃｌｅ ＆ ｎｅｒｖｅ ２０１３；４７：４９３－４９６．
３１．Ｍａｎｎｉｌ Ｍ，Ｓｏｌａｒｉ Ａ，Ｌｅｈａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ （ＣＭＴ） Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ Ｓｃｏｒｅ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｓｅｒｖｅ ａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ ＣＭＴ１Ａ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１４；２４：１００３－１０１７．
３２．Ｐａｒｅｙｓｏｎ Ｄ，Ｓｃｈｅｎｏｎｅ Ａ，Ｆａｂｒｉｚｉ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ １Ａ （ＣＭＴ－ＴＲＩＡＡＬ）:ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ［ＥｕｄｒａＣＴ ｎｏ．:２００６－００００３２－２７］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００６；５４：４３６－４４１．
３３．Ｐｉｓｃｏｓｑｕｉｔｏ Ｇ，Ｒｅｉｌｌｙ ＭＭ，Ｓｃｈｅｎｏｎｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｉｎ Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ :ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ２０１５；２２：１５５６－１５６３．

【0314】

本発明が特定の実施形態について説明されてきたが、変形及び変更が当業者に想到されることが理解される。したがって、特許請求の範囲に見られるような限定のみが、本発明に対してなされるべきである。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【配列表】

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【外国語明細書】