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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023166645
(43)【公開日】2023-11-22
(54)【発明の名称】植物細胞の培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/04 20060101AFI20231115BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20231115BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20231115BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20231115BHJP
C12N 15/84 20060101ALN20231115BHJP
C12N 15/74 20060101ALN20231115BHJP
【ＦＩ】
C12N5/04 ZNA
A01H1/00 A
A01H5/00 A
A01H6/46
C12N15/84 Z
C12N15/74 100Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020172481
(22)【出願日】2020-10-13
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000004569
【氏名又は名称】日本たばこ産業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】塚本 浩史
(72)【発明者】
【氏名】柳原 千寿
【テーマコード（参考）】
2B030
4B065
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD06
2B030CA16
2B030CA17
2B030CB02
2B030CD07
4B065AA88X
4B065AA89X
4B065AB01
4B065BA02
4B065BB16
4B065CA53
(57)【要約】
【課題】本発明は、植物細胞の培養方法及び植物体の再生方法に関する。
【解決手段】本発明の植物細胞の培養方法は、イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養することを含む。本発明の植物体の再生方法は、イネ科植物の細胞からの植物体の再生方法であって、（１）イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養し、そして、（２）再分化培地で培養する、ことを含む。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の植物細胞の培養方法は、イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養することを含む。本発明の植物体の再生方法は、イネ科植物の細胞からの植物体の再生方法であって、（１）イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養し、そして、（２）再分化培地で培養する、ことを含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養することを含む、植物細胞の培養方法。
【請求項2】
イネ科の植物細胞を培養し、植物細胞群及び／又は植物再生体を得る、ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
イネ科植物が、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、及びソルガムからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
イネ科植物が、コムギである、請求項１－３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
イネ科植物の細胞が、未熟胚、完熟種子、受精卵、カルス、プロトプラスト、又はそれらに由来する細胞群である、請求項１－４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
イネ科植物の細胞が、未熟胚又はそれに由来する細胞群である、請求項１－５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
イネ科植物の細胞に、核酸、タンパク質及び核酸タンパク質複合体からなる群から選択される物質を導入する工程を含む、請求項１－６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
物質の導入により形質転換又はゲノム編集を行う、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法によって物質を導入する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項10】
植物細胞の培養効率が向上する、請求項１－９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
物質の導入効率が向上する、請求項７－９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
イネ科植物の細胞からの植物体の再生方法であって、
（１）イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養し、そして、
（２）再分化培地で培養する、
ことを含む、植物体の再生方法。
（１）イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養し、そして、
（２）再分化培地で培養する、
ことを含む、植物体の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、植物細胞の培養方法及び植物体の再生方法に関する。
【背景技術】
【0002】
（１）植物細胞の培養と植物体の再生について
イネ、トウモロコシ、コムギなどのイネ科植物において、未熟胚あるいは完熟胚を単離・培養し、植物体を再生した例が報告されているが、培養効率の種間差、品種間差は大きく、培養がほとんどできないものも多い。とりわけ、主要な作物では、コムギやトウモロコシにおいて培養困難な品種が多く知られている。現在までに種々の創意工夫によって、その効率は徐々に改善されてきた。その手段としては、主として、培養培地の改変と植物組織片への前処理の２つがある。
イネ、トウモロコシ、コムギなどのイネ科植物において、未熟胚あるいは完熟胚を単離・培養し、植物体を再生した例が報告されているが、培養効率の種間差、品種間差は大きく、培養がほとんどできないものも多い。とりわけ、主要な作物では、コムギやトウモロコシにおいて培養困難な品種が多く知られている。現在までに種々の創意工夫によって、その効率は徐々に改善されてきた。その手段としては、主として、培養培地の改変と植物組織片への前処理の２つがある。
【0003】
１）培養培地
アグロバクテリウムによるトウモロコシ形質転換において様々な培養培地の改善が試されている。Ｎ６基本培地での形質転換細胞の選抜（非特許文献１）、培地へのＡｇＮＯ３及びカルベニシリンの添加（非特許文献１、非特許文献２）、共存培地へのシステインの添加（非特許文献３）などによって、培養効率の向上がなされた。共存培養培地の組成及びゲル化剤を改変することにより、インディカイネでの形質転換効率（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が高まることも報告されている（非特許文献４）。
アグロバクテリウムによるトウモロコシ形質転換において様々な培養培地の改善が試されている。Ｎ６基本培地での形質転換細胞の選抜（非特許文献１）、培地へのＡｇＮＯ３及びカルベニシリンの添加（非特許文献１、非特許文献２）、共存培地へのシステインの添加（非特許文献３）などによって、培養効率の向上がなされた。共存培養培地の組成及びゲル化剤を改変することにより、インディカイネでの形質転換効率（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が高まることも報告されている（非特許文献４）。
【0004】
２）植物組織片への前処理
Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）（非特許文献５）はアグロバクテリウムを接種する前のイネ及びトウモロコシの未熟胚に熱処理や遠心処理をすることにより形質転換効率が高まること、及びこれまで形質転換できなかった品種でも形質転換体が得られることを報告した。また、Ｉｓｈｉｄａ ａｎｄ Ｈｉｅｉ（ＷＯ２０１１／０１３７６４）（特許文献１）は、アグロバクテリウムと共存培養したコムギ未熟胚から胚軸を取り除くことにより、高い効率で形質転換植物が得られることを見出した。
Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）（非特許文献５）はアグロバクテリウムを接種する前のイネ及びトウモロコシの未熟胚に熱処理や遠心処理をすることにより形質転換効率が高まること、及びこれまで形質転換できなかった品種でも形質転換体が得られることを報告した。また、Ｉｓｈｉｄａ ａｎｄ Ｈｉｅｉ（ＷＯ２０１１／０１３７６４）（特許文献１）は、アグロバクテリウムと共存培養したコムギ未熟胚から胚軸を取り除くことにより、高い効率で形質転換植物が得られることを見出した。
【0005】
このように培地組成の改変や材料となる植物組織片への前処理などの工夫により、アグロバクテリウムによるイネ、トウモロコシ及びコムギの形質転換における培養法は、格段の効率の向上及び適応品種の拡大がなされている。
【0006】
その他の方法としては、近年では、形質転換体を作出する方法として、受精卵を用いる方法（非特許文献６）やインプランタパーティクルガン法（非特許文献７）がある。
（２）トレハロース
ネムリユスリカなどの微小動物、イワヒバなどの植物が砂漠などの極度に乾燥した環境の下で乾眠し、生存できるのは、トレハロースが生体内に高濃度で蓄積されるためであることが知られている。また、トレハロースは乾燥休眠時でも機能するほか、動植物に様々なストレス耐性機能性を付与することが報告されている（非特許文献８）。
（２）トレハロース
ネムリユスリカなどの微小動物、イワヒバなどの植物が砂漠などの極度に乾燥した環境の下で乾眠し、生存できるのは、トレハロースが生体内に高濃度で蓄積されるためであることが知られている。また、トレハロースは乾燥休眠時でも機能するほか、動植物に様々なストレス耐性機能性を付与することが報告されている（非特許文献８）。
【0007】
しかしながら、一般的な植物においては、極限環境で生存する前述の動植物ほどの高濃度のトレハロースを含有することはない。加えて、植物の一次代謝において、炭素源として、トレハロースが利用されることはない。事実、植物体内のスクロースと比較すると、トレハロースの含有濃度は低いことが明らかとなっている。例えば、シロイズナズナでは、葉中のスクロースの含有量は９ｍｇ／ｇ（乾燥重量）であるが、トレハロースの含有量は０ｍｇ／ｇ（乾燥重量）であり、茎中のスクロースの含有量は７．５ｍｇ／ｇ（乾燥重量）であるが、トレハロースの含有量は０．１ｍｇ／ｇ（乾燥重量）である（非特許文献９）。
【0008】
人工的な植物組織の培養では、常法として、炭素源はスクロース及び／又はマルトースが使用されている。一方、トレハロースの植物組織培養における利用はほとんどない。しかしながら、例外的に、熱帯性着生種のシンビジウムであるＣｙｍｂｉｄｉｕｍ ｆｉｎｌａｙｓｏｎｉａｎｕｍのプロトコーム様球体（ＰＬＢ）形成では、トレハロースの添加が有効であることが示されている。ショ糖５～４０ｇ／ｌやトレハロース１０～８０ｇ／ｌの濃度で、ＰＬＢ形成は促進され、それぞれ２０ｇ／ｌの濃度が最も有効であった。シュートからの発根はトレハロース添加区のみで認められ、トレハロースはシュートからの発根に有効と報告されている（非特許文献１０）。
【0009】
一方、コムギにおいては、トレハロース利用による小胞子の組織培養による植物体再生の試みがなされた研究があるが、トレハロースの効果はなかったと報告されている（非特許文献１１）。また、トレハロースは植物の代謝や生育を阻害することが知られている（非特許文献１２、非特許文献１３）。オオムギでは、トレハロースは炭水化物関連遺伝子の制御を妨げることが報告されている（非特許文献１４、非特許文献１５）。これらにより、トレハロースはスクロース及び／又はマルトースの代わりに、イネ科の植物の培養に利用されることはなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】ＷＯ２０１１／０１３７６４
【特許文献2】ＷＯ２０１７／１７１０９２
【特許文献3】ＷＯ２０１８／１４３４８０
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｚｈａｏ， Ｚ．－Ｙ．， Ｇｕ， Ｗ．， Ｃａｉ， Ｔ．， Ｔａｇｌｉａｎｉ， Ｌ．， Ｈｏｎｄｒｅｄ， Ｄ．， Ｂｏｎｄ， Ｄ．， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｓ．， Ｒｕｄｅｒｔ， Ｍ．， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｄ． （２００１） Ｍｏｌ． Ｂｒｅｅｄ． ８： ３２３－３３３．
【非特許文献2】Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． （２００３） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：５７－６６．
【非特許文献3】Ｆｒａｍｅ， Ｂ．Ｒ．， Ｓｈｏｕ， Ｈ．， Ｃｈｉｋｗａｍｂａ， Ｒ．Ｋ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｘｉａｎｇ， Ｃ．， Ｆｏｎｇｅｒ， Ｔ．Ｍ．， Ｐｅｇｇ， Ｓ．Ｅ．Ｋ．， Ｌｉ， Ｂ．， Ｎｅｔｔｌｅｔｏｎ， Ｄ．Ｓ．， Ｐｅｉ， Ｄ．， Ｗａｎｇ， Ｋ． （２００２） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２９： １３－２２．
【非特許文献4】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． （２００６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ８５：２７１－２８３．
【非特許文献5】Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ．， Ｋａｓａｏｋａ，Ｋ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ． （２００６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ８７：２３３－２４３．
【非特許文献6】Ｍａｒｙｅｎｔｉ， Ｔ．， Ｋａｔｏ， Ｎ．， Ｉｃｈｉｋａｗａ， Ｍ．， Ｏｋａｍｏｔｏ， Ｔ． （２０１９） Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ６０： ８３５－８４３，
【非特許文献7】Ｈａｍａｄａ, Ｈ.， Ｌｉｎｇｈｕ, Ｑ.， Ｎａｇｉｒａ, Ｙ.， Ｍｉｋｉ, Ｒ.， Ｔａｏｋａ, Ｎ., Ｉｍａｉ, Ｒ. （２０１７） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１１４４３
【非特許文献8】Ｇａｒｇ， Ａ． Ｋ．， Ｋｉｍ， Ｊ． －Ｋ．， Ｏｗｅｎｓ， Ｔ． Ｇ．， Ｒａｎｗａｌａ， Ａ． Ｐ．， Ｃｈｏｉ， Ｙ． Ｄ．， Ｋｏｃｈｉａｎ， Ｌ． Ｖ．， Ｗｕ， Ｒ． Ｊ．（２００２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９： １５８９８－１５９０３．
【非特許文献9】Ｍｕｌｌｅｒ， Ｊ．， Ａｅｓｃｈｂａｃｈｅｒ， Ｒ．Ａ．， Ｗｉｎｇｌｅｒ， Ａ．， Ｂｏｌｌｅｒ， Ｔ．， Ｗｉｅｍｋｅｎ， Ａ． （２００１） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２５： １０８６－１０９３．
【非特許文献10】ＳＨＩＭＡＳＡＫＩ, Ｋ.， ＴＡＮＩＢＵＣＨＩ, Ｙ., ＦＵＫＵＭＯＴＯ, Ｙ.（２００３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ． １５： １３０－１３４．
【非特許文献11】Ｒｅｄｈａ, Ａ.， Ｓｕｌｅｍａｎ, Ｐ. （２０１３）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ４： ２２１８－２２２６．
【非特許文献12】Ｆｒｉｓｏｎ，Ｍ., Ｐａｒｒｏｕ, Ｊ. Ｌ.， Ｇｕｉｌｌａｕｍｏｔ, Ｄ.， Ｍａｓｑｕｅｌｉｅｒ, Ｄ.， Ｆｒａｎcｏｉｓ, Ｊ.，Ｃｈａｕｍｏｎｔ, Ｆ.， Ｂａｔｏｋｏ, Ｈ.（２００７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ５８１： ４０１０－４０１６．
【非特許文献13】Ｍｕｌｌｅｒ， Ｊ．， Ａｅｓｃｈｂａｃｈｅｒ， Ｒ． Ａ．， Ｗｉｎｇｌｅｒ, Ａ.， Ｂｏｌｌｅｒ, Ｔ.， Ｗｉｅｍｋｅｎ, Ａ. （２００１） Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ． １２５： １０８６－１０９３．
【非特許文献14】Ｍｕｌｌｅｒ， Ｊ．， Ａｅｓｃｈｂａｃｈｅｒ， Ｒ． Ａ．， Ｓｐｒｅｎｇｅｒ， Ｎ．， Ｂｏｌｌｅｒ， Ｔ．， Ｗｉｅｍｋｅｎ， Ａ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２３： ２６５－２７３．
【非特許文献15】Ｗａｇｎｅｒ, Ｗ.， Ｗｉｅｍｋｅｎ, Ａ.， Ｍａｔｉｌｅ, Ｐ. （１９８６）． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８１： ４４４－４４７．
【非特許文献16】Ｉｓｈｉｄａ, Ｙ.， Ｔｓｕｎａｓｈｉｍａ， Ｍ．， Ｈｉｅｉ， Ｙ．， Ｋｏｍａｒｉ， Ｔ．（２０１５）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：１， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２２３： １８９－１９８， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【非特許文献17】Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ， Ｓ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｊ． Ｋ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｃ．， Ｇａｏ， Ｈ．， Ｆａｌｃｏ， Ｓ． Ｃ．， Ｃｉｇａｎ， Ａ． Ｍ． （２０１５） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １６９： ９３１－９４５．
【非特許文献18】Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｌｉａｎｇ， Ｚ．， Ｚｏｎｇ， Ｙ．， Ｗａｎｇ， Ｙ．，Ｌｉｕ， Ｊ． Ｃｈｅｎ， Ｋ．， Ｑｉｕ， Ｊ．－Ｌ．， Ｇａｏ， Ｃ．（２０１６） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： １２６１７
【非特許文献19】Ｂａｒｃｅｌｏ， Ｐ．， Ｌａｚｚｅｒｉ， Ｐ． Ａ．（１９９５）Ｉｎ Ｊｏｎｅｓ， Ｈ．， ｅｄ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ： ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，： １１３－１２３．
【非特許文献20】Ｒａｓｃｏ‐Ｇａｕｎｔ, Ｓ.， Ｒｉｌｅｙ, Ａ.， Ｃａｎｎｅｌｌ, Ｍ.， Ｂａｒｃｅｌｏ, Ｐ.， Ｌａｚｚｅｒｉ, Ｐ. Ａ． （２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ ５２： ８６５－８７４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、植物細胞の培養方法及び植物体の再生方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは上記問題解決のために鋭意研究に努めた結果、コムギ未熟胚の培養・再生化において、常法で用いる炭素源（スクロースやマルトース）ではなく、トレハロースを含有する培地で培養することによって、常法培地と比較して、顕著に植物再生率が向上することを見出し、本発明を完成させた。本方法の利用によって、形質転換作物の作出やゲノム編集作物の作出が効率的に可能となった。
【0014】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養することを含む、植物細胞の培養方法。
［態様２］
イネ科の植物細胞を培養し、植物細胞群及び／又は植物再生体を得る、ことを含む、態様１に記載の方法。
［態様３］
イネ科植物が、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、及びソルガムからなる群から選択される、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］
イネ科植物が、コムギである、態様１－３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
イネ科植物の細胞が、未熟胚、完熟種子、受精卵、カルス、プロトプラスト、又はそれらに由来する細胞群である、態様１－４のいずれか１項に記載の方法。
［態様６］
イネ科植物の細胞が、未熟胚又はそれに由来する細胞群である、態様１－５のいずれか１項に記載の方法。
［態様７］
イネ科植物の細胞に、核酸、タンパク質及び核酸タンパク質複合体からなる群から選択される物質を導入する工程を含む、態様１－６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
物質の導入により形質転換又はゲノム編集を行う、態様７に記載の方法。
［態様９］
パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法によって物質を導入する、態様８又は９に記載の方法。
［態様１０］
植物細胞の培養効率が向上する、態様１－９のいずれか１項に記載の方法。
［態様１１］
物質の導入効率が向上する、態様７－９のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］
イネ科植物の細胞からの植物体の再生方法であって、
（１）イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養し、そして、
（２）再分化培地で培養する、
ことを含む、植物体の再生方法。
［態様１］
イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養することを含む、植物細胞の培養方法。
［態様２］
イネ科の植物細胞を培養し、植物細胞群及び／又は植物再生体を得る、ことを含む、態様１に記載の方法。
［態様３］
イネ科植物が、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、及びソルガムからなる群から選択される、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］
イネ科植物が、コムギである、態様１－３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
イネ科植物の細胞が、未熟胚、完熟種子、受精卵、カルス、プロトプラスト、又はそれらに由来する細胞群である、態様１－４のいずれか１項に記載の方法。
［態様６］
イネ科植物の細胞が、未熟胚又はそれに由来する細胞群である、態様１－５のいずれか１項に記載の方法。
［態様７］
イネ科植物の細胞に、核酸、タンパク質及び核酸タンパク質複合体からなる群から選択される物質を導入する工程を含む、態様１－６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
物質の導入により形質転換又はゲノム編集を行う、態様７に記載の方法。
［態様９］
パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法によって物質を導入する、態様８又は９に記載の方法。
［態様１０］
植物細胞の培養効率が向上する、態様１－９のいずれか１項に記載の方法。
［態様１１］
物質の導入効率が向上する、態様７－９のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］
イネ科植物の細胞からの植物体の再生方法であって、
（１）イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養し、そして、
（２）再分化培地で培養する、
ことを含む、植物体の再生方法。
【発明の効果】
【0015】
従来培養が困難であるといわれているイネ科植物の培養を容易とし、培養細胞から植物再生体を効率的に取得することが可能になった。
【発明を実施するための形態】
【0016】
１．植物細胞の培養方法
本発明は、植物の培養方法に関する。本発明の方法は、イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養することを含む。
本発明は、植物の培養方法に関する。本発明の方法は、イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養することを含む。
【0017】
植物
上記方法における「植物」は、イネ科の植物である。イネ科植物としては、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）に属するいずれの植物でも用いることができる。一態様として、非限定的に、イネ科植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、及びソルガムからなる群から選択される。（本明細書において、「一態様」と言及した場合には、非限定的であることを意図する。）上記培養方法は、特に、「難培養」とされる植物あるいは品種に用いることが可能である。「難培養」とは、培養が困難、具体的には、例えば、植物体から単離された細胞や組織等の培養が困難、脱分化等の処理によるカルスの形成や、カルスからの植物体への再分化が困難である、ことを意味する。
上記方法における「植物」は、イネ科の植物である。イネ科植物としては、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）に属するいずれの植物でも用いることができる。一態様として、非限定的に、イネ科植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、及びソルガムからなる群から選択される。（本明細書において、「一態様」と言及した場合には、非限定的であることを意図する。）上記培養方法は、特に、「難培養」とされる植物あるいは品種に用いることが可能である。「難培養」とは、培養が困難、具体的には、例えば、植物体から単離された細胞や組織等の培養が困難、脱分化等の処理によるカルスの形成や、カルスからの植物体への再分化が困難である、ことを意味する。
【0018】
一態様として、イネ科の植物はコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属に属するものが好ましい。例えば、１粒系のコムギとして、Ｔ．ａｅｇｉｌｏｐｏｉｄｅｓ、Ｔ．ｔｈａｏｕｄａｒ、及び、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（１粒コムギ）を、２粒系のコムギとして、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｕｍ（２粒コムギ、エンマーコムギ）、Ｔ．ｐｙｒｏｍｉｄａｌｅ、Ｔ．ｏｒｉｅｎｔａｌｅ（コーラサンコムギ）、Ｔ．ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギ、マカロニコムギ）、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ（リベットコムギ）、Ｔ．ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ（ポーランドコムギ）、及びＴ．ｐｅｒｓｉｃｕｍ（ペルシャコムギ）を、並びに３粒系のコムギとして、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通コムギ、パンコムギ）、Ｔ．ｓｐｅｌｔａ（スペルトコムギ）、Ｔ．ｃｏｍｐａｃｔｕｍ（クラブコムギ、密穂コムギ）、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｏｃｏｃｃｕｍ（インド矮性コムギ）、Ｔ．ｍａｈａ（マカコムギ）、及びＴ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ（バビロビコムギ）を挙げることができる。本発明においてパンコムギ（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）又はマカロニコムギ（Ｔ．ｄｕｒｕｍ）に属する品種が好適であり、特に、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍに属する品種が好適である。
【0019】
イネ科植物の細胞
植物材料としては、限定されるものではないが、イネ科植物の未熟胚、完熟種子、受精卵、カルス、プロトプラスト、又はそれらに由来する細胞群が挙げられる。好ましくは、未熟胚又は完熟種子である。本明細書において「未熟胚」とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよいが、受粉後７から２１日後のものが好ましい。「完熟種子」とは、受粉後の登熟過程が終了して種子として完熟しているものをいう。「受精卵」とは、精細胞と卵細胞とが融合した細胞を意味する。「植物受精卵」とは、植物の胚嚢を含む組織から単離される受精した卵細胞である、即ち、植物体の段階で受粉・受精させ、該植物体から単離した受精卵、であってもよい。あるいは、受粉・受精前の植物体から卵細胞及び精細胞を単離したのち、それらを融合させて受精卵細胞を作出及び取得してもよい。なお、電気的な融合により受精卵を作成及び取得してもよい。また、異種の植物同士の卵細胞と精細胞の融合により得られた受精卵、であってもよい。「プロトプラスト」とは、植物細胞から細胞壁を取り除いた細胞である。
植物材料としては、限定されるものではないが、イネ科植物の未熟胚、完熟種子、受精卵、カルス、プロトプラスト、又はそれらに由来する細胞群が挙げられる。好ましくは、未熟胚又は完熟種子である。本明細書において「未熟胚」とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよいが、受粉後７から２１日後のものが好ましい。「完熟種子」とは、受粉後の登熟過程が終了して種子として完熟しているものをいう。「受精卵」とは、精細胞と卵細胞とが融合した細胞を意味する。「植物受精卵」とは、植物の胚嚢を含む組織から単離される受精した卵細胞である、即ち、植物体の段階で受粉・受精させ、該植物体から単離した受精卵、であってもよい。あるいは、受粉・受精前の植物体から卵細胞及び精細胞を単離したのち、それらを融合させて受精卵細胞を作出及び取得してもよい。なお、電気的な融合により受精卵を作成及び取得してもよい。また、異種の植物同士の卵細胞と精細胞の融合により得られた受精卵、であってもよい。「プロトプラスト」とは、植物細胞から細胞壁を取り除いた細胞である。
【0020】
トレハロースを含有する培養培地
上記植物の培養方法は、イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養することを含む。限定的に、一態様において、植物細胞の培養は、未熟胚から植物体を再生させる工程において行う。
上記植物の培養方法は、イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養することを含む。限定的に、一態様において、植物細胞の培養は、未熟胚から植物体を再生させる工程において行う。
【0021】
以下、植物細胞の培養方法の態様の例を説明する。植物細胞の培養培地は、植物細胞を通常培養するために通常使用されるものでもよく、特に限定されない。非限定的に、例えばＷＬＳ培地、ＷＬＳ－ＲＥＳ培地、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ６培地、Ｂ５培地、Ｒ２培地、ＣＣ培地を基本とする培地等が挙げられる。これらの培地は、基本の濃度から高濃度にされたものでも、希釈されたものであってもよい。好ましくは、１／１０倍から２倍量、より好ましくは、１／５倍から１倍量である。
【0022】
一態様において、基本となる培地は、ＷＬＳ培地、ＷＬＳ－ＲＥＳ培地である。これらの培地は以下の組成を有する。
ＷＬＳ培地： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＭＳビタミン、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、２．２ｍｇ／Ｌ ピクローラム、４％ マルトース一水和物、５００ｍｇ／Ｌ グルタミン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、３．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１９５％ ＭＥＳ、５７μＭ アスコルビン酸、５μＭ ＡｇＮＯ３、５ｇ／Ｌ アガロース、ｐＨ５．８
ＷＬＳ－ＲＥＳ培地（ＷＬＳ培地の２．２ｍｇ／ｌ ピクローラムを２．５ｍｇ／ｌ ダイカンバに置換した培地）： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＭＳビタミン、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、２．５ｍｇ／Ｌ ダイカンバ、４％ マルトース一水和物、５００ｍｇ／Ｌ グルタミン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、３．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１９５％ ＭＥＳ、５７μＭ アスコルビン酸、５μＭ ＡｇＮＯ３、５ｇ／Ｌ アガロース、ｐＨ５．８
「トレハロース」は、グルコースが１，１－グリコシド結合している二糖の一種である。適宜調整された培養培地にトレハロースを添加する。培養培地に添加されるトレハロースの濃度は特に限定されない。一態様において、培養培地中のトレハロースの濃度は、２０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、７５ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１２５ｍＭ以上、１５０ｍＭ以上、１８０ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、２２０ｍＭ以上、２４０ｍＭ以上、２５０ｍＭ以上である。一態様において、培養培地中のトレハロース濃度は、１０００ｍＭ以下、８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、４５０ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３５０ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２８０ｍＭ以下である。非限定的に、培養培地中のトレハロースの濃度は２０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下、５０ｍＭ以上８００ｍＭ以下、１００ｍＭ以上６００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以上４００ｍＭ以下である。
ＷＬＳ培地： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＭＳビタミン、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、２．２ｍｇ／Ｌ ピクローラム、４％ マルトース一水和物、５００ｍｇ／Ｌ グルタミン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、３．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１９５％ ＭＥＳ、５７μＭ アスコルビン酸、５μＭ ＡｇＮＯ３、５ｇ／Ｌ アガロース、ｐＨ５．８
ＷＬＳ－ＲＥＳ培地（ＷＬＳ培地の２．２ｍｇ／ｌ ピクローラムを２．５ｍｇ／ｌ ダイカンバに置換した培地）： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＭＳビタミン、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、２．５ｍｇ／Ｌ ダイカンバ、４％ マルトース一水和物、５００ｍｇ／Ｌ グルタミン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、３．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１９５％ ＭＥＳ、５７μＭ アスコルビン酸、５μＭ ＡｇＮＯ３、５ｇ／Ｌ アガロース、ｐＨ５．８
「トレハロース」は、グルコースが１，１－グリコシド結合している二糖の一種である。適宜調整された培養培地にトレハロースを添加する。培養培地に添加されるトレハロースの濃度は特に限定されない。一態様において、培養培地中のトレハロースの濃度は、２０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、７５ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１２５ｍＭ以上、１５０ｍＭ以上、１８０ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、２２０ｍＭ以上、２４０ｍＭ以上、２５０ｍＭ以上である。一態様において、培養培地中のトレハロース濃度は、１０００ｍＭ以下、８００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、４５０ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３５０ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２８０ｍＭ以下である。非限定的に、培養培地中のトレハロースの濃度は２０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下、５０ｍＭ以上８００ｍＭ以下、１００ｍＭ以上６００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以上４００ｍＭ以下である。
【0023】
一態様において、上記トレハロースを含む培養培地は、トレハロースを含む代わりに、常法で用いる炭素源（例えば、スクロースやマルトース）を含まない、あるいは、含量を減じてもよい。一態様において、培養培地はトレハロース以外の炭素源を含まない。炭素源とは、スクロースや、マルトース、グルコース等を意味する。但し、培地中の糖がトレハロースのみである場合を長期間とすることはできない。言い換えると、トレハロース以外を含まない炭素源での長期培養は除く。
【0024】
上記トレハロースの濃度は、例えば培地が固体のように、トレハロースが必ずしも培地全体に均一に含まれているとは限らない場合、培地単位体積当たりの含有量として把握することができる。
【0025】
培養工程において、トレハロースを培地に添加する時期は特に限定されない。添加時期は、培養開始時もしくはそれ以降でもよい。非限定的に、一態様において、トレハロースを含む培養培地を、植物細胞が再生分化能を有する時期まで、植物細胞を培養する工程の、いずれかの時期に使用する。一態様において、トレハロースを含む培養培地を未熟胚が調製されてからの短期間、例えば、１６日以内、８日以内、５日以内、３日以内、２日以内使用する。一態様において、トレハロースを含む培養培地を未熟胚が調製されてから植物への物質の導入を行うまでの期間使用する。培養期間中、トレハロースを培養培地に、一度に添加してもよく、あるいは、（例えば数回に）分けて添加してもよい。一態様において、パーティクルガンで物質導入を伴う培養においては、パーティクルガン処理前の当日、１日前、あるいは２日前からトレハロースを含む培養培地上に未熟胚及びそれに由来する細胞群を置床し、培養するのが良い。また、一態様において、アグロバクテリウムで物質導入を伴う培養においては、未熟胚に由来する細胞群を材料とした場合、アグロバクテリウム接種処理前の当日、１日前、あるいは、接種後２日後までトレハロースを含む培養培地上にそれらを置床し、培養するのが良く、未熟胚を材料とした場合、アグロバクテリウム接種処理の当日、あるいは、接種後２日後までトレハロースを含む培養培地上にそれらを置床し、培養するのが良い。
【0026】
非限定的に、一態様において、培地は、植物成長調整物質を含んでもよい。植物成長調整物質は、オーキシン類である。具体的には、例えば、オーキシン類として特にインドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、ピクローラム、ダイカンバ、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸又は他のオーキシン類を添加することができる。一態様において、オーキシン類は、２，４－Ｄ、ＩＡＡ、ＮＡＡからなる群より選択される植物ホルモンである。あるいは、カイネチンや４ＰＵのようなサイトカイニンなど、他の植物成長調節物質を添加することもできる。これらの植物成長調節物質は、単独でも複数を異なる濃度で混合させてもよい。
【0027】
一様態において、培養培地に、フィーダー（ナース）細胞を加えてもよい。フィーダー細胞の種類は特に限定されない。例えば、イネの液体培養細胞や、コムギの液体培養細胞などを用いることが可能である。公知のフィーダー細胞や植物外植片を用いることが可能である。例えば、イネ浮遊細胞培養物（Ｏｃ、理化学研究所バイオリソース研究センター）や、コムギ懸濁培養細胞（ＨＴ３－１）などが挙げられる。植物外植片としては、子房などが挙げられる。フィーダー細胞を添加する時期は限定されるものではなく、植物細胞の培養開始前、開始時、開始後であってもよい。
【0028】
培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは１８℃－３５℃、さらに好ましくは２０－３０℃、最も好ましくは２３－２８℃で行われる。また、この工程の培養は好ましくは暗所、もしくは薄暗い所で行われるが、これに限定されない。
【0029】
一態様において、上記培養方法は、イネ科の植物細胞を培養し、植物細胞群及び／又は植物再生体を得る、ことを含む。
細胞群は、胚様体、球状様胚、カルスなどであってもよい。受精卵を分裂誘導し細胞増殖させ、胚様体、球状様胚、カルスなどを形成させる工程は、植物によって最適条件が異なるため特に限定されない。
細胞群は、胚様体、球状様胚、カルスなどであってもよい。受精卵を分裂誘導し細胞増殖させ、胚様体、球状様胚、カルスなどを形成させる工程は、植物によって最適条件が異なるため特に限定されない。
【0030】
「植物再生体を得る」ことについて、「２．植物体の再生方法」において詳述する。
本発明はまた、イネ科植物の細胞を培養するための、トレハロースを含有する培養培地、トレハロースの、イネ科植物の細胞の培養培地への使用、イネ科植物の細胞の培養培地に使用されるトレハロースも含む。
本発明はまた、イネ科植物の細胞を培養するための、トレハロースを含有する培養培地、トレハロースの、イネ科植物の細胞の培養培地への使用、イネ科植物の細胞の培養培地に使用されるトレハロースも含む。
【0031】
一態様において、上記培養方法により、トレハロースを含まない培地で培養した場合と比較して、植物細胞の培養効率が向上する。植物細胞の培養効率は、非限定的に、例えば、培養におけるカルス化率等を意味する。
【0032】
非限定的に、培養効率（例えば、カルス化率）が、例えば、１．１倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、３０倍以上に向上する。「培養効率が向上する」には、トレハロースを含まない培地で培養した場合にはカルスが形成されなかったイネ科の品種において、カルス形成が生じるようになる場合も含む。
【0033】
２．植物体の再生方法
本発明は、植物体の再生方法に関する。本発明の再生方法は、イネ科植物の細胞からの植物体の再生方法であって、
（１）イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養し、そして、
（２）再分化培地で培養する、
ことを含む。
本発明は、植物体の再生方法に関する。本発明の再生方法は、イネ科植物の細胞からの植物体の再生方法であって、
（１）イネ科植物の細胞を、トレハロースを含有する培養培地を用いて培養し、そして、
（２）再分化培地で培養する、
ことを含む。
【0034】
「植物」、「イネ科植物」、「（イネ科植物の）細胞」、「培養培地」、「トレハロース」等の用語の意義は、「１．植物細胞の培養方法」において記載した通りである。
再分化工程、すなわち、再分化培地での培養工程は特に限定されない。培養細胞群を、任意の培地、例えば、本明細書の実施例に記載したＬＳＦ培地（例えば、ＬＳＦＣｕＰ５（－Ｃ）培地）からなる再分化培地に移し、培養する。非限定的に、再分化工程は光を照射して行ってもよい。再分化培地には、例えば、ＬＳＦ培地、ＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地であり、アガロース、寒天やゲランガム、ゲルライト等固化材を使用した固体培地を含まない液体培地であってもよい。
再分化工程、すなわち、再分化培地での培養工程は特に限定されない。培養細胞群を、任意の培地、例えば、本明細書の実施例に記載したＬＳＦ培地（例えば、ＬＳＦＣｕＰ５（－Ｃ）培地）からなる再分化培地に移し、培養する。非限定的に、再分化工程は光を照射して行ってもよい。再分化培地には、例えば、ＬＳＦ培地、ＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地であり、アガロース、寒天やゲランガム、ゲルライト等固化材を使用した固体培地を含まない液体培地であってもよい。
【0035】
再分化培地には、オーキシン、サイトカイニンを含む植物成長調節物質を添加してもよい。一態様において、再分化培地は、オーキシン類を含む。「オーキシン」、「サイトカイニン」等の用語の意義は、「１．植物細胞の培養方法」において記載した通りである。
【0036】
再分化工程によって、根、シュートなどが再分化した個体を、土が入ったポットなどに移植すれば、正常な植物個体として育成させることができる。
上記植物再生法によって再生されたイネ科植物（再生植物体）も提供される。再生された植物とは、未熟胚の培養、再分化により再生された植物、該植物から得られた細胞、組織等や、上記植物再生法により得られた再分化当代である「Ｔ０世代」やＴ０世代の植物の自殖種子に由来するＴ１世代」などの後代植物、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物を含む。
上記植物再生法によって再生されたイネ科植物（再生植物体）も提供される。再生された植物とは、未熟胚の培養、再分化により再生された植物、該植物から得られた細胞、組織等や、上記植物再生法により得られた再分化当代である「Ｔ０世代」やＴ０世代の植物の自殖種子に由来するＴ１世代」などの後代植物、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物を含む。
【0037】
本発明以前は、イネ科植物において特に「難培養」とされる種や品種について、効率よく培養することができず、再生された植物を得ることは困難或いは不可能であった。上記植物再生法により、このような植物、品種についても簡便な方法で効率よく培養、再生植物体を得ることが可能になった。
【0038】
３．植物への物質の導入
植物、特に単子葉植物の遺伝子組換え技術は、１９９０年代にアグロバクテリウムを利用した方法がイネ、トウモロコシで開発されたことを契機に急速に利用が普及した。現在までに様々な形質転換方法が開発されてきている。
植物、特に単子葉植物の遺伝子組換え技術は、１９９０年代にアグロバクテリウムを利用した方法がイネ、トウモロコシで開発されたことを契機に急速に利用が普及した。現在までに様々な形質転換方法が開発されてきている。
【0039】
また、近年効率的にゲノム編集を行うことが可能になりつつあるが、これも作物種、品種ごとに組織培養の容易性が異なる点が、ゲノム編集効率（ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）に大きな影響を与えるため、実用化の妨げとなっている。
【0040】
本発明の、植物細胞の培養方法、植物再生方法により、イネ科植物の細胞を培養することによって得た細胞群から、安定して効率よく再生植物体を得ることが可能になった。上記植物細胞の培養方法、再生方法の工程におけるいずれかの段階において、植物細胞に物質を導入することにより、物質が導入された再生植物を安定して効率よく取得することができる。一態様において、未熟胚に形質転換物質を導入する。
【0041】
一態様において、上記培養方法、植物再生方法の植物細胞は、物質が導入された植物細胞である。一態様において、発明の培養方法、植物再生方法の植物細胞は、イネ科植物の細胞に、核酸、タンパク質及び核酸タンパク質複合体からなる群から選択される物質を導入する工程を含む。
【0042】
導入する物質は、非限定的に、核酸、タンパク質及び核酸タンパク質複合体からなる群から選択される。核酸は特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、両者の結合体、混合物であってもよい。好ましくはベクターのような環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＲＮＡ又は直鎖ＲＮＡである。使用される形質転換方法に応じた任意の長さのものを使用可能である。タンパク質は、決まった順番で様々なアミノ酸が、アミド結合（「ペプチド結合」ともいう）でつながった分子の総称である。タンパク質は、ゲノム編集のためのＣａｓ９ヌクレアーゼ等ヌクレアーゼや、修飾酵素、抗体等を含む。核酸タンパク質複合体は、核酸とタンパク質が複合体を形成したものである。例えば、デオキシリボ核タンパク質（ＤＮＡとＶｉｒＤ２タンパク質の複合体等）、リボ核タンパク質（ガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体等）などが含まれる。
【0043】
２種類以上の核酸、タンパク質及び核酸タンパク質複合体を導入してもよい。核酸は、２種類以上のＤＮＡ又はＲＮＡでも、ＤＮＡとＲＮＡの組み合わせでもよい。核酸とタンパク質など異なる種の物質を導入してもよい。
【0044】
物質を植物に導入する方法は、植物に所望の物質を導入することのできる公知の方法ならば特に限定されず、植物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）あるいはアグロバクテリウム法などの生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）を好ましく用いることができる。一態様において、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法によって物質を導入する。
【0045】
植物への物質の導入は、非限定的に、例えば、国際公開ＷＯ２０１７／１７１０９２（特許文献２）、国際公開ＷＯ２０１８／１４３４８０（特許文献３）に記載の方法によって行うことができる。
【0046】
一態様において、物質の導入により形質転換又はゲノム編集を行ってもよい。
ゲノム編集とは、部位特異的ヌクレアーゼを利用して、思い通りに標的遺伝子を改変する技術である。部位特異的ヌクレアーゼとしては、２００５年以降に開発・発見された、ＺＦＮ（ズィーエフエヌ、又は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（タレン）、ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９（クリスパー・キャスナイン）などが知られている。
ゲノム編集とは、部位特異的ヌクレアーゼを利用して、思い通りに標的遺伝子を改変する技術である。部位特異的ヌクレアーゼとしては、２００５年以降に開発・発見された、ＺＦＮ（ズィーエフエヌ、又は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（タレン）、ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９（クリスパー・キャスナイン）などが知られている。
【0047】
イネ科植物、例えば、コムギの組織培養と再生体作出は、コムギの品種開発においては、必要な技術である。とりわけ、遺伝子組換えコムギを作出する際やゲノム編集コムギを作出する際には、例えば、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法で遺伝子導入した未熟胚や培養細胞を組織培養し、カルスから再生体を取得する方法が標準法となっている。なお、ゲノム編集作出では、ＤＮＡの導入に代わって、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を導入した未熟胚や培養細胞を培養し、再生体を取得してもよい。
【0048】
一態様において、上記培養方法により、トレハロースを含まない培地で培養した場合と比較して、物質の導入効率が向上する。物質の導入効率は、非限定的に、例えば、培養におけるカルス化率、形質転換率（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、ゲノム編集率（ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）等を意味する。
【0049】
本明細書中で、「物質の導入効率が高い」とは、高い効率で目的物質が植物細胞へ導入されること、未熟胚等から高い効率でカルスが誘導されること、形質転換カルスから高い効率で再分化が起こること、を包含する概念である。また、本明細書において「物質の導入効率が向上する」とは、目的物質の植物細胞への導入効率が向上すること、未熟胚等からのカルス誘導率が向上すること、形質転換カルスからの再分化効率が向上すること、を包含する概念である。
【0050】
非限定的に、物質の導入効率（例えば、形質転換効率）が、例えば、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、１０倍以上、２５倍以上に向上する。「物質の導入効率が向上する」には、トレハロースを含まない培地で培養した場合には形質転換ができない、あるいは、ゲノム編集ができないイネ科の品種において、これらができるようになる場合も含む。
【実施例0051】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【0052】
実施例１：コムギ未熟胚からのカルス誘導
（１）未熟胚の調製及び培養
ＷＯ２０１１／０１３７６４（特許文献１）及びＩｓｈｉｄａ（２０１５）（非特許文献１６）の方法の一部を改変してコムギの未熟胚の調製を行った。Ｆｉｅｌｄｅｒ、Ｃｌａｉｒｅ、Ｍａｃｅ、ＪＴＸ００１、Ｃａｄｅｎｚａ、Ｐａｒａｇｏｎ、ＪＴＸ００２、Ｃｒｏｎｏｘ及びＪａｇｇｅｒの９種類の品種を試験に供した。
（１）未熟胚の調製及び培養
ＷＯ２０１１／０１３７６４（特許文献１）及びＩｓｈｉｄａ（２０１５）（非特許文献１６）の方法の一部を改変してコムギの未熟胚の調製を行った。Ｆｉｅｌｄｅｒ、Ｃｌａｉｒｅ、Ｍａｃｅ、ＪＴＸ００１、Ｃａｄｅｎｚａ、Ｐａｒａｇｏｎ、ＪＴＸ００２、Ｃｒｏｎｏｘ及びＪａｇｇｅｒの９種類の品種を試験に供した。
【0053】
開花後１４日前後のコムギの未熟種子を脱頴し、７０％エタノール中で４５秒間表面殺菌処理した後、Ｔｗｅｅｎ ２０を１滴含む１％次亜塩素酸ナトリウムで１０分間表面殺菌処理した。処理後の未熟種子を滅菌水で４回洗浄し、実体顕微鏡下で未熟胚を採取し、そして、ＷＬＳ－ｌｉｑ培地中に回収した。ＷＬＳ－ｌｉｑ培地で１度未熟胚を洗浄後、５，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心処理した。
【0054】
２５個の未熟胚をシャーレに移し、胚軸をメスで除去した後、以下の「ＷＬＳ９０－ＲＥＳ培地」又は「ＷＬＳ０／９０－ＲＥＳ」上に胚盤側を上向きにして置床し、２５℃、暗黒下で、１日間培養した。得られた未熟胚を（３）のパーティクルガン処理に用いた。
【0055】
各培地の組成は以下の通りである。
ＷＬＳ－ｌｉｑ培地： ０．１×ＬＳメジャー無機塩、１０μＭ ＦｅＥＤＴＡ、０．１×ＬＳマイナー無機塩、０．１×ＭＳビタミン、１％グルコース、０．０５％ＭＥＳ、ｐＨ５．８
ＷＬＳ９０－ＲＥＳ培地： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＭＳビタミン、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、２．５ｍｇ／Ｌ ダイカンバ、９％ マルトース一水和物（２５０ｍＭ）、５００ｍｇ／Ｌ グルタミン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、３．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１９５％ ＭＥＳ、５７μＭ アスコルビン酸、５μＭ ５ｇ／Ｌ アガロース、ｐＨ５．８
ＷＬＳ０／９０－ＲＥＳ培地：ＷＬＳ９０－ＲＥＳ培地のマルトース一水和物を、濃度９．４６％のトレハロース二水和物（２５０ｍＭ）に変更した培地。
ＷＬＳ－ｌｉｑ培地： ０．１×ＬＳメジャー無機塩、１０μＭ ＦｅＥＤＴＡ、０．１×ＬＳマイナー無機塩、０．１×ＭＳビタミン、１％グルコース、０．０５％ＭＥＳ、ｐＨ５．８
ＷＬＳ９０－ＲＥＳ培地： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＭＳビタミン、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、２．５ｍｇ／Ｌ ダイカンバ、９％ マルトース一水和物（２５０ｍＭ）、５００ｍｇ／Ｌ グルタミン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、３．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１９５％ ＭＥＳ、５７μＭ アスコルビン酸、５μＭ ５ｇ／Ｌ アガロース、ｐＨ５．８
ＷＬＳ０／９０－ＲＥＳ培地：ＷＬＳ９０－ＲＥＳ培地のマルトース一水和物を、濃度９．４６％のトレハロース二水和物（２５０ｍＭ）に変更した培地。
【0056】
（２）ｂａｒ遺伝子、Ｃａｓ９遺伝子及びｓｇＲＮＡ遺伝子のプラスミド構築及び調製
ｂａｒ遺伝子、Ｃａｓ９遺伝子及びｓｇＲＮＡ遺伝子を含むプラスミドを構築した。ｂａｒ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示した。ｂａｒ遺伝子は３５Ｓプロモーターで制御し、ターミネーターにはＮｏｓを用いた。これらをｐＵＣ１９ベクター内に挿入した。
ｂａｒ遺伝子、Ｃａｓ９遺伝子及びｓｇＲＮＡ遺伝子を含むプラスミドを構築した。ｂａｒ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示した。ｂａｒ遺伝子は３５Ｓプロモーターで制御し、ターミネーターにはＮｏｓを用いた。これらをｐＵＣ１９ベクター内に挿入した。
【0057】
ＳｐＣａｓ９（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９）遺伝子の塩基配列を配列番号２に示した。配列番号２はＳｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）の報告（非特許文献１７）より引用した。ＳｐＣａｓ９は、トウモロコシユビキチンの第１イントロンを有するトウモロコシユビキチンプロモーターとＮｏｓ及び３５Ｓターミネーターの間に挿入し、加えて、アミノ末端（Ｎ末端）側にＳＶ４０由来核移行シグナル（９アミノ酸）及びカルボキシル末端（Ｃ末端）側にｖｉｒＤ２由来核移行シグナル（１８アミノ酸）をコードする配列が含まれるように、ｐＵＣ１９ベクター内に挿入したプラスミドを構築した。ｓｇＲＮＡ転写ユニットの塩基配列を配列番号３に示した。コムギＵ６ポリメラーゼＩＩＩのプロモ―ター及びターミネーターを含むｓｇＲＮＡ遺伝子配列をｐＵＣ１８ベクター内に挿入したプラスミドを構築した。なお、ｓｇＲＮＡ遺伝子配列として、コムギＬＯＸ２遺伝子のターゲット配列を用いた（非特許文献１８）。
【0058】
（３）パーティクルガンによるＤＮＡ導入及びその後の培養
コムギに対するバーティクルガンによるＤＮＡの導入する方法は、基本的にはＢａｒｃｅｌｏ ａｎｄ Ｌａｚｚｅｒｉ（１９９５）（非特許文献１９）及びＲａｓｃｏ－Ｇａｕｎｔ（２００１）（非特許文献２０）の方法を参考とした。
コムギに対するバーティクルガンによるＤＮＡの導入する方法は、基本的にはＢａｒｃｅｌｏ ａｎｄ Ｌａｚｚｅｒｉ（１９９５）（非特許文献１９）及びＲａｓｃｏ－Ｇａｕｎｔ（２００１）（非特許文献２０）の方法を参考とした。
【0059】
１５ｍｇの金粒子（ＢＩＯ－ＲＡＤ製、粒径０．６μｍ）を１．５ｍｌチューブに取り分けた。前述のチューブに０．５ｍｌの７０％エタノールを加え、超音波を９０秒間行った後、１５分間振とうした。５秒間遠心し、上清を捨てた。０．５ｍｌの滅菌水に懸濁し、１分間ボルテックスし、遠心後上清を除去した。上記処理を３回繰り返した。０．３７５ｍｌの５０％グリセロールに懸濁（４０ｍｇ／ｍｌ）後、金粒子懸濁液として４℃で保存した。
【0060】
調製した金粒子懸濁液（４０ｍｇ／ｍｌ）を均一になるまで５分間ボルテックスした。プラスミドＤＮＡの金粒子へのコーティングとマイクロキャリヤーへの接着を行った。金粒子２０μｌ（０．８ｍｇ）、（２）で調整したプラスミドＤＮＡ（ｂａｒ遺伝子６８０ｆｍｏｌ、Ｃａｓ９遺伝子２０４ｆｍｏｌ及びｓｇＲＮＡ遺伝子２０４ｆｍｏｌ）を混和した後、合計で４０μｌになるように水を加えた後、ＴｒａｎｓＩＴ－２０２０（登録商標）（０．８ μｌ）を加えた。その後、２、３分間続けてボルテックスした後、１分間チューブを静地した。フラッシュ（２ｓ）遠心後、上清を捨て、次に、５６μｌの７０％エタノールで洗浄した。フラッシュ（２ｓ）遠心後、上清を捨て、５６μｌの１００％エタノールで洗浄した。フラッシュ（２ｓ）遠心後、上清を捨てた後、３４μｌのエタノール（１００％）で再懸濁した。タッピングで穏やかに懸濁した後、ボルテックス処理した（２－３秒）。その後、超音波洗浄機で３０秒処理した。
【0061】
（１）に記載の通り調製した未熟胚２５個に対して、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ取扱説明書（ＢＩＯ－ＲＡＤ）に従って、パーティクルガン（ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ ＰＤＳ１０００／Ｈｅ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で遺伝子導入した。１ショット当たり５μｌの金粒子懸濁液を使用した。ターゲット距離はストッピングプレートから５ｃｍで、撃ち込み圧は６５０ｐｓｉとした。パーティクルガン処理後、プレート培地上の未熟胚を２８℃で１日間（暗所）、続いて２５℃で培養した。
【0062】
以下の表は、未熟胚調性から葉サンプリングまでの各工程の日数、培地、実験内容（工程）をまとめたものである。
【0063】
【表1】
【0064】
ＷＬＳ６０－Ｐ５の組成： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＭＳビタミン、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、２．２ｍｇ／Ｌ ピクローラム、６％ マルトース一水和物、５００ｍｇ／Ｌ グルタミン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、３．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１９５％ ＭＥＳ、５７μＭ アスコルビン酸、５μＭ ＡｇＮＯ３、５ｍｇ／Ｌ ホスフィノトリシン、５ｇ／Ｌ アガロース、ｐＨ５．８
ＷＬＳ－Ｐ１０の組成： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＭＳビタミン、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、２．２ｍｇ／Ｌ ピクローラム、４％ マルトース一水和物、５００ｍｇ／Ｌ グルタミン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、３．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１９５％ ＭＥＳ、５７μＭ アスコルビン酸、５μＭ ＡｇＮＯ３、１０ｍｇ／Ｌ ホスフィノトリシン、５ｇ／Ｌ アガロース、ｐＨ５．８
ＬＳＦＣｕＰ５（－Ｃ）の組成： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＬＳビタミン、０．２ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ、１０μＭ ＣｕＳＯ４、１．５％ スクロース、０．０５％ ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ ホスフィノトリシン、３ｇ／Ｌ ゲライト、ｐＨ５．８
（４）結果
（ｉ）カルス化率及び形質転換率に対するトレハロース添加培地の効果
（３）においてパーティクルガンによるＤＮＡ導入を行った未熟胚について、カルス化率及び形質転換率を調べた。
ＷＬＳ－Ｐ１０の組成： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＭＳビタミン、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、２．２ｍｇ／Ｌ ピクローラム、４％ マルトース一水和物、５００ｍｇ／Ｌ グルタミン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、３．７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１９５％ ＭＥＳ、５７μＭ アスコルビン酸、５μＭ ＡｇＮＯ３、１０ｍｇ／Ｌ ホスフィノトリシン、５ｇ／Ｌ アガロース、ｐＨ５．８
ＬＳＦＣｕＰ５（－Ｃ）の組成： １×ＬＳメジャー無機塩、１００μＭ ＦｅＥＤＴＡ、１×ＬＳマイナー無機塩、１×ＬＳビタミン、０．２ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ、１０μＭ ＣｕＳＯ４、１．５％ スクロース、０．０５％ ＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌ ホスフィノトリシン、３ｇ／Ｌ ゲライト、ｐＨ５．８
（４）結果
（ｉ）カルス化率及び形質転換率に対するトレハロース添加培地の効果
（３）においてパーティクルガンによるＤＮＡ導入を行った未熟胚について、カルス化率及び形質転換率を調べた。
【0065】
カルス化率は、表１の工程６において、（生じたカルス数／供試未熟胚数）×１００（％）により求めた。形質転換率は、表１の工程７において、選択マーカーｂａｒ遺伝子による選択を行うためのホスフィノトリシンを含有する培地にカルスを植え替えて培養し、（再生個体が生じた供試未熟胚数／供試未熟胚数）×１００（％）により求めた。結果を表２に示す。
【0066】
【表2】
【0067】
表２に示す通り、（３）においてパーティクルガンによるＤＮＡ導入を行った、供試した９品種、Ｆｉｅｌｄｅｒ、Ｃｌａｉｒｅ、Ｍａｃｅ、ＪＴＸ００１、Ｃａｄｅｎｚａ、Ｐａｒａｇｏｎ、ＪＴＸ００２、Ｃｒｏｎｏｘ及びＪａｇｇｅｒにおいて、マルトース含有の標準培地よりも、トレハロース培地において、カルス化率（％）が顕著に向上した。さらに７品種、Ｃｌａｉｒｅ、Ｍａｃｅ、ＪＴＸ００１、Ｃａｄｅｎｚａ、Ｐａｒａｇｏｎ、ＪＴＸ００２及びＣｒｏｎｏｘにおいて、マルトース含有の標準培地よりも、トレハロース培地において、形質転換率（％）が顕著に向上した。
【0068】
（ｉｉ）ゲノム編集率に対するトレハロース添加培地の効果
（３）においてパーティクルガンによるＤＮＡ導入を行った未熟胚について、ゲノム編集率を調べた。ゲノム編集率は以下のように調べ、（ゲノム編集個体が生じた供試未熟胚数／供試未熟胚数）×１００（％）により求めた。
（３）においてパーティクルガンによるＤＮＡ導入を行った未熟胚について、ゲノム編集率を調べた。ゲノム編集率は以下のように調べ、（ゲノム編集個体が生じた供試未熟胚数／供試未熟胚数）×１００（％）により求めた。
【0069】
パーティクルガン処理約８５日後、プラントボックス内で１０ｃｍ～１５ｃｍ程度に伸びた葉５～１０ｍｇ程度を切り取り、サンプリングした。液体窒素で葉サンプルを凍結し、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて凍結した葉サンプルを粉砕した。その後、ＱＩＡｃｕｂｅＨＴ（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコールに従い、ＱＩＡｃｕｂｅＨＴでＤＮＡを抽出した。ゲノム編集の標的とした、Ａ、ＢおよびＤゲノムのＴａＬＯＸ２遺伝子について、ＰＣＲ／ＲＥ分析を行い、ゲノム編集による変異を検出した。
【0070】
ＰＣＲ反応は、２０μｌ反応液中に、１０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）１．６μｌ、プライマーＬＯＸ２－Ｆ（１０μＭ）０．４μｌ、プライマーＬＯＸ２－Ｒ（１０μＭ）０．４μｌ、ＥｘＴａｑＨＳ ０．１μｌ、ゲノムＤＮＡ４μｌを混和し、９８℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３０回行った。ＰＣＲプライマーはＺｈａｎｇら（非特許文献１８）のプライマーを使用した。得られたＰＣＲ産物を５μｌとり、１０×ＮＥＢ ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、制限酵素ＳａｃＩ－ＨＦ（２０Ｕ／μｌ）を１μｌ含む２０μｌの溶液を調製し、３７℃で３時間インキュベーションした後、１．５％ＴｙｐｅＩＩアガロースゲルを用いた電気泳動で分析した。なお、ネガティブコントロールにはＦｉｅｌｄｅｒのゲノムＤＮＡを用いた。制限酵素ＳａｃＩによって、ＰＣＲ産物が切断された場合はゲノム編集されていないと判断し、切断されない場合はゲノム編集されていると判断した。
【0071】
結果を表３に示す。
【0072】
【表3】
【0073】
表３の通り、供試した５品種、Ｃｌａｉｒｅ、Ｍａｃｅ、ＪＴＸ００１、Ｐａｒａｇｏｎ及びＪＴＸ００２において、マルトース含有の標準培地よりも、トレハロース培地において、ゲノム編集率が顕著に向上した。
【産業上の利用可能性】
【0074】
本発明により、従来培養が困難であるといわれているイネ科植物の培養を容易とし、培養細胞から植物再生体を効率的に取得することが可能になった。上記植物細胞の培養方法、再生方法の工程におけるいずれかの段階において、植物細胞に物質を導入することにより、物質が導入された再生植物を安定して効率よく取得することもできる。本方法の利用によって、従来困難であったイネ科植物の形質転換作物の作出やゲノム編集作物の作出が効率的にできることとなる。
【配列表フリーテキスト】
【0075】
配列番号１は、ｂａｒ遺伝子の塩基配列である。
配列番号２は、ＳｐＣａｓ９遺伝子の塩基配列である。
配列番号３は、ｓｇＲＮＡ発現ユニットの配列の塩基配列である。
配列番号２は、ＳｐＣａｓ９遺伝子の塩基配列である。
配列番号３は、ｓｇＲＮＡ発現ユニットの配列の塩基配列である。
【配列表】