▶ 学校法人近畿大学の特許一覧 ▶ 三井化学アグロ株式会社の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023167005
(43)【公開日】2023-11-22
(54)【発明の名称】新規アンペロマイセス菌株
(51)【国際特許分類】
C12N 1/14 20060101AFI20231115BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20231115BHJP
A01P 1/00 20060101ALI20231115BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20231115BHJP
A01N 63/30 20200101ALI20231115BHJP
【ＦＩ】
C12N1/14 A ZNA
C12N15/31
A01P1/00
A01P3/00
A01N63/30
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023077319
(22)【出願日】2023-05-09
(31)【優先権主張番号】P 2022077801
(32)【優先日】2022-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000125347
【氏名又は名称】学校法人近畿大学
(71)【出願人】
【識別番号】303020956
【氏名又は名称】三井化学クロップ＆ライフソリューション株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】野々村 照雄
(72)【発明者】
【氏名】マーク・ゼット・ネメス
(72)【発明者】
【氏名】ディアナ・セレス
【テーマコード（参考）】
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B065AA58X
4B065BA22
4B065BB18
4B065BB26
4B065BD43
4B065CA47
4H011AA01
4H011BB21
(57)【要約】 （修正有）
【課題】各種うどんこ病防除剤として有用な新規アンペロマイセス菌株を提供する。
【解決手段】アンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｈ株、Ｅｑ－ｍ株、Ｘｓ－ｑ株、７１００－ａ株、７１００－ｂ株、７１００－ｄ株、７１００－ｇ株又は７１２４－ｅ株のｒＤＮＡ－ＩＴＳ領域とアクチン遺伝子（ＡＣＴ）のＤＮＡ塩基配列、ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１（ＩＴＳ）、ＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９（ＡＣＴ）と９９％以上の相同性を有するかまたは分子系統樹クレード３およびクレード４に分類される菌株。
【選択図】なし
【解決手段】アンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｈ株、Ｅｑ－ｍ株、Ｘｓ－ｑ株、７１００－ａ株、７１００－ｂ株、７１００－ｄ株、７１００－ｇ株又は７１２４－ｅ株のｒＤＮＡ－ＩＴＳ領域とアクチン遺伝子（ＡＣＴ）のＤＮＡ塩基配列、ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１（ＩＴＳ）、ＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９（ＡＣＴ）と９９％以上の相同性を有するかまたは分子系統樹クレード３およびクレード４に分類される菌株。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｈ株、Ｅｑ－ｍ株、Ｘｓ－ｑ株、７１００－ａ株、７１００－ｂ株、７１００－ｄ株、７１００－ｇ株または７１２４－ｅ株のｒＤＮＡ－ＩＴＳ領域とアクチン遺伝子（ＡＣＴ）のＤＮＡ塩基配列、配列番号１～２６（ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１（ＩＴＳ））、配列番号２７～５２（ＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９（ＡＣＴ））と９９％以上の相同性を有するかまたは分子系統樹クレード３およびクレード４に分類される菌株。
【請求項2】
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６３７で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｈ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６３８で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｍ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６３９で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｘｓ－ｑ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４０で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ａ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４１で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｂ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４２で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｄ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４３で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｇ、 又は
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４４で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１２４－ｅ。
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６３８で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｍ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６３９で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｘｓ－ｑ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４０で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ａ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４１で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｂ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４２で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｄ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４３で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｇ、 又は
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ―０３６４４で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１２４－ｅ。
【請求項3】
請求項１又は２記載のアンペロマイセス菌株を含む、各種うどんこ病防除資材。
【請求項4】
各種うどんこ病の防除における請求項１又は２記載のアンペロマイセス菌株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規アンペロマイセス菌株に関する。
【背景技術】
【0002】
うどんこ病（Ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ）は、重要作物を含む1万種以上の宿主植物に寄生する絶対寄生菌（従属栄養病原体）による植物病害であり、農作物生産、林業に深刻な損失を与える。うどんこ病の防除には、殺菌剤を定期的に散布することが必要である。殺菌剤の使用頻度や使用量が不十分な場合、一部の殺菌剤に対し耐性を示すうどんこ病が出現する可能性がある。この問題を軽減するために、新しい代替防除法が試行されている。化学的防除を補完し、あるいは代替する物理的・生物的防除法が提案されている。たとえば、うどんこ病に対する生物防除資材（ＢＣＡ）としてマイコパラサイトの可能性が示されている。このようなＢＣＡとしては、Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ、Ｍｏｅｓｚｉｏｍｙｃｅｓ ｒｕｇｕｌｏｓｕｓ、Ｇｊａｅｒｕｍｉａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｅｃａｎｉｉおよびＡｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓが挙げられる。アンペロマイセス（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ）属菌は生育の遅い糸状菌で、多くの栽培植物や野生植物に広く分布し、各種うどんこ病菌の菌寄生体または超寄生体としてよく知られている。アンペロマイセスは、核内リボソームＤＮＡ内部転写スペーサー（ｒＤＮＡ－ＩＴＳ）領域とアクチン遺伝子（ＡＣＴ）断片の配列に基づいて、遺伝的に異なる系統に属することがいくつかの研究により示されており、各研究において、クレード１～４または１～５に分類されている（非特許文献１、２、３）。これらのクレードは、アンペロマイセス属の別種を表すと考えられ、別系統に属する菌株のコロニー形態の違いも言及されているが、属および種の分類学的な見直しはまだ行われていない。
【0003】
アンペロマイセス属菌の各種うどんこ病菌への寄生性は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究や、異なるアンペロマイセス菌株と数種のうどんこ病菌を用いた野外実験などの接種実験により明らかにされている（非特許文献１、２、３）。実際、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ属（リンゴうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、キュウリおよびメロンうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ）、ブドウうどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒ））等から分離した菌株を中心に、クレードとの関係性について検証されており、１つのクレードの中には異なるうどんこ病菌から分離された菌株が含まれることが明らかにされている（非特許文献１、２、３）。
【0004】
Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓについては、うどんこ病菌に対する活性が明確化され、一部が微生物農薬として市販されている。実際、ＡＱ１０（登録商標）（Ｅｃｏｇｅｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ， ＵＳＡ）はＡＱ１０（ＣＮＣＭ:１－８０７）菌株（特許文献１、非特許文献４）、Ｑ－ｆｅｃｔ（Ｇｒｅｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｋｏｒｅａ）はＡＱ９４０１３ （ＫＴＣＣ ８９４０Ｐ）菌株（特許文献２、非特許文献２），Ｐｏｗｄｅｒｙｃａｒｅ（登録商標）（ＡｇｒｉＬｉｆｅ，Ｉｎｄｉａ：ＲＳＡＱ７６９０）、Ｆｅｍ３０７はＣＢＳ１２６８９５菌株（特許文献３）、ＣＡＰ－９（ＣＥＣＴ２０７４９）菌株（特許文献４、非特許文献５）などが挙げられ、ＡＱ１０（登録商標）、Ｑ－ｆｅｃｔ（登録商標）、 Ｐｏｗｄｅｒｙｃａｒｅ（登録商標）は、実際にうどんこ病を対象とした微生物農薬として市販、使用されている。
【0005】
Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ属の種の同定は、ｒＤＮＡ－ＩＴＳ領域とアクチン遺伝子（ＡＣＴ）断片により解析が進められているが、形態的特徴およびＤＮＡ塩基配列の相同性から、明確な種の同定には至っていない。菌類の種の同定には、一般的にリボゾーム ＲＮＡ 遺伝子のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）領域あるいは ２６／２８Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子 の Ｄ１/Ｄ２（Ｄｏｍａｉｎ １ および ２ ：可変領域）領域が用いられる。酵母の場合、染色体 ＤＮＡ の交雑試験の結果から、同一種の菌株間では ＩＴＳ 領域の塩基配列の相同性が ９９％以上であることが示されており、絶対的ではないが、この数値が同定の目安とされている（非特許文献６、７）。糸状菌や担子菌類の場合、ＤＮＡ 類似度に基づく知見はほとんどないが、多くの実験データに基づき概ねその数値が支持されている（非特許文献８）。
【0006】
植物病原菌においては、種と宿主への病原性（宿主範囲）の関係が明確にされている（非特許文献９）。宿主特異性が高い病原菌では、種によって宿主が限定されている。一方、宿主が広い多犯性の植物病原菌では、種以下の菌群によって異なる場合があり、菌糸融合群、分化型等によって、分類学的に異なることが明らかにされている。しかしながら、病原菌における種と病原性には明確な関係があるものの、種の違いで病原性が異なる事例はない。また、植物病原菌であるＣｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａでは、クレードと病原性に関する関連性が明確にされており、クレードによって宿主植物が異なることが明らかにされている（非特許文献１０）。一方、菌寄生菌であるＡｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ属においても、クレードと各種うどんこ病菌への寄生性には一定の傾向が認められている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】ＵＳ５１９０７５４
【特許文献2】ＫＲ１００３３２４８０
【特許文献3】ＷＯ２０１４４４７２３
【特許文献4】ＥＳ２４７０４９０
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１２）１０２:７０７－７１６
【非特許文献2】Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０）１１４：２３５－２４７
【非特許文献3】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ（２０１１）２０：１４９２－１５０７
【非特許文献4】Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）５９：４７５－４８３
【非特許文献5】Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ（２０２０）２６７：１０９３３７
【非特許文献6】Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９１） １４ : １２４－１２９
【非特許文献7】モダンメディア（２００９）５５ ９ ：２３７‐２４２
【非特許文献8】Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ（２００４） ９６ ： ５５８－５７１
【非特許文献9】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｃｕｌｔ. Ｃｏｌｌ. ２９（２）・７９－９０．２０１３
【非特許文献10】植物防疫 第 ６６ 巻 第 １１ 号 （２０１２ ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
うどんこ病防除剤として、Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓの一部の菌株の防除効果、微生物農薬としての実用性は明らかにされているが、Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓ以外の種の菌株(Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ)によるうどんこ病菌に対する寄生性、効果は明確にされていない。
【0010】
Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ属菌の１つのクレードの中には異なるうどんこ病菌から分離された菌株が含まれることが明らかにされている。しかしながら、各クレードと各種うどんこ病菌に対する寄生性の範囲は明確にされていない。
【0011】
本発明の課題は、各種うどんこ病防除剤として有用な新規アンペロマイセス菌株を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは上記課題を解決すべく、各種作物のうどんこ病菌からアンペロマイセス属菌を分離・同定し、オオムギうどんこ病菌、レッドクローバーうどんこ病菌、キュウリおよびメロンうどんこ病菌、イチゴうどんこ病菌、及びトマトうどんこ病菌に対する寄生性を指標に評価を行った結果、従来のＡｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓとは異なる新規アンペロマイセス菌株が各種うどんこ病菌に寄生すること、また、植物に薬害を示さず、微生物防除資材として効果を示す可能性を見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は、以下のとおりである。
［１］アンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｈ株、Ｅｑ－ｍ株、Ｘｓ－ｑ株、７１００－ａ株、７１００－ｂ株、７１００－ｄ株、７１００－ｇ株又は７１２４－ｅ株のｒＤＮＡ－ＩＴＳ領域とアクチン遺伝子（ＡＣＴ）のＤＮＡ塩基配列、配列番号１～２６（ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１（ＩＴＳ））、配列番号２７～５２（ＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９（ＡＣＴ））と９９％以上の相同性を有するかまたは分子系統樹クレード３およびクレード４に分類される菌株。
［２］２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３７で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｈ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３８で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｍ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３９で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｘｓ－ｑ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４０で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ａ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４１で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｂ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４２で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｄ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４３で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｇ、又は
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４４で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１２４－ｅ。
［３］ ［１］又は［２］記載のアンペロマイセス菌株を含む、うどんこ病防除剤。
［４］うどんこ病菌の処置における［１］又は［２］記載のアンペロマイセス菌株の使用。
本発明は、以下のとおりである。
［１］アンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｈ株、Ｅｑ－ｍ株、Ｘｓ－ｑ株、７１００－ａ株、７１００－ｂ株、７１００－ｄ株、７１００－ｇ株又は７１２４－ｅ株のｒＤＮＡ－ＩＴＳ領域とアクチン遺伝子（ＡＣＴ）のＤＮＡ塩基配列、配列番号１～２６（ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１（ＩＴＳ））、配列番号２７～５２（ＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９（ＡＣＴ））と９９％以上の相同性を有するかまたは分子系統樹クレード３およびクレード４に分類される菌株。
［２］２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３７で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｈ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３８で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｅｑ－ｍ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３９で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）Ｘｓ－ｑ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４０で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ａ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４１で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｂ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４２で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｄ、
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４３で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１００－ｇ、又は
２０２２年５月２日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構に、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６４４で寄託されたアンペロマイセス・ストレイン（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）７１２４－ｅ。
［３］ ［１］又は［２］記載のアンペロマイセス菌株を含む、うどんこ病防除剤。
［４］うどんこ病菌の処置における［１］又は［２］記載のアンペロマイセス菌株の使用。
【発明の効果】
【0013】
本発明の新規アンペロマイセス菌株は、従来のＡｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓと比較し、各種うどんこ病菌に感染し死滅させることができる。これらの効果は、同業者であっても予想だにできなかった事実である。
【0014】
次に、本明細書で使用する各種の用語について説明する。
【0015】
本発明に記載のＤＮＡ塩基配列とは、ｒＤＮＡ－ＩＴＳ（ＩＴＳ）とアクチン遺伝子（ＡＣＴ）の遺伝子断片であり、ｒＤＮＡ－ＩＴＳのＤＮＡ塩基配列は、ＰＣＲ反応によって、プライマーＩＴＳ１ＦとＩＴＳ４によって増幅される断片、条件として、９４℃で５分間の初期熱変性、その後９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１分間の３５サイクルの条件で増幅される断片である。アクチン遺伝子（ＡＣＴ）のＤＮＡ塩基配列は、ＰＣＲ反応によって、プライマーＡｃｔ－１およびＡｃｔ－５ｒａによって増幅される断片、条件として、最初の熱変性は９８℃で５分間、その後９８℃３０秒、５４℃１分間、７２℃１分間の３５サイクルで増幅される断片である。例えば、ｒＤＮＡ－ＩＴＳのＤＮＡ塩基配列として、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１、アクチン遺伝子（ＡＣＴ）のＤＮＡ塩基配列として、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９の配列が挙げられる。
【0016】
本発明における新規アンペロマイセス菌株（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ）は、ｒＤＮＡ－ＩＴＳのＤＮＡ塩基配列として、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１、アクチン遺伝子（ＡＣＴ）のＤＮＡ塩基配列として、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９の配列と９９％以上の相同性を示すＤＮＡ塩基配列を有する菌株が該当する。遺伝子断片菌類の種の同定には、一般的にリボゾーム ＲＮＡ 遺伝子のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）領域あるいは ２６／２８Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子 の Ｄ１/Ｄ２（Ｄｏｍａｉｎ １ および ２ ：可変領域）領域が用いられる。酵母の場合、染色体 ＤＮＡ の交雑試験の結果から、同一種の菌株間では ＩＴＳ 領域の塩基配列の相同性が ９９％以上であることが示されており、絶対的ではないが、この数値が同定の目安とされている（Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９１）１４:１２４－１２９）。糸状菌や担子菌類の場合、ＤＮＡ 類似度に基づく知見はほとんどないが、多くの実験データに基づき概ねその数値が支持されている（Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ（２００４）９６：５５８－５７１）ことが根拠である。
【0017】
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
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【化19】
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【化23】
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【化25】
【化26】
【0018】
【化27】
【化28】
【化29】
【化30】
【化31】
【化32】
【化33】
【化34】
【化35】
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【化39】
【化40】
【化41】
【化42】
【化43】
【化44】
【化45】
【化46】
【化47】
【化48】
【化49】
【化50】
【化51】
【化52】
【0019】
本発明におけるアンペロマイセス属菌の分子系統学的分類であるクレードとは、ＩＴＳおよびＡＣＴ配列から分類される単系統群であり、以下の方法で解析されたものを指す。ＩＴＳおよびＡＣＴ配列（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１２）１０２:７０７－７１６；Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０）;１１４：２３５－２４７;Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ（２０１１）２０：１４９２－１５０７、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１９）１０９：１４０４－１４１６）を既知のアンペロマイセス属菌の指標とし、アウトグループとしてＰｈｏｍａ ｈｅｒｂａｒｕｍ株（ＣＢＳ ５６７．６３）（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１２）１０２：７０７－７１６）と共に解析し、合計１３０菌株（Ｐｈ．ｈｅｒｂａｒｕｍを含む）を解析対象とした。アライメントおよび最終的な解析用データセットを、Ｎｅｍｅｔｈら（２０１９）の記載にしたがって作成した。ＩＴＳ＿ＡＣＴ データセットを、ＩＴＳとＡＣＴに対応するパーティションを設定し、最尤法（ＭＬ）とベイズ推定法（ＢＩ）を用いて解析した。ＩＴＳは５０１文字、ＡＣＴは８２０文字からなり、合計１３２１文字からなるデータセットである。ＭＬ解析にはｒａｘｍｌＧＵＩ １．５を使用し、詳細はＮｅｍｅｔｈら（２０１９）のとおりである。ＢＩはＭｒＢａｙｅｓ ３．１．２を用い、以前に記述された方法にしたがった（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１８）１５０：８１７－８２４）。ＢＩでサンプリングした樹木から、最初の４，０００本のサンプリング（バーンイン）を省き、多数決（５０％）合意樹木を算出した。解析結果の系統樹をＴｒｅｅＧｒａｐｈ ２．１４．０で可視化し、ＴｒｅｅＢＡＳＥ（ｓｔｕｄｙ ＩＤ ２５８６１）とした。本発明の新規アンペロマイセス菌株は、分子系統樹のクレード３およびクレード４に分類される菌株であり、ｒＤＮＡ－ＩＴＳのＤＮＡ塩基配列として、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１、アクチン遺伝子（ＡＣＴ）のＤＮＡ塩基配列として、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９の配列と９９％以上の相同性を示すＤＮＡ塩基配列を有する菌株が該当する。
【0020】
本発明におけるうどんこ病菌とは、子のう菌類ウドンコカビ目ウドンコカビ科に属する菌類の総称であり、宿主として、野菜、果樹、草花、観葉植物などの多くの植物に感染し、白いうどん粉状の標徴の病気を引き起こす。うどんこ病菌は培地等で人工培養できない絶対寄生菌である。うどんこ病菌は多く属を含み、例えば、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ属（バラ科：イチゴ、ウリ科）、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ属（ナス科：トマト／マメ科：エンドウ/カシ類）、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ属（ウリ科／バラ科）、Ｂｌｕｍｅｒｉａ属（イネ科／ムギ科）、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ属（キク科／ナス科：ホオズキ）、Ｎｅｏｅｒｙｓｉｐｈｅ属、Ｃｙｓｔｏｔｈｅｃａ属（ブナ科）、Ｓａｗａｄａｅａ属（ムクロジ科：カエデ）、Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ属（カキノキ科／バラ科／クワ科）、Ｐｌｅｏｃｈａｅｔａ属、Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ属（ナス科/ピーマン）に分類されている。また、うどんこ病菌は寄生性によって表生寄生（Ｅｃｔｏｐｈｙｔｉｃ）、半内部寄生（Ｐａｒｔｌｙ Ｅｃｔｏｐｈｙｔｉｃ）、内部寄生（Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ）の３つに分類される。例えば、Ａｒｔｈｒｏｃｌａｄｉｅｌｌａ属、Ｂｌｕｍｅｒｉａ属、Ｂｒａｓｉｌｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｙｓｔｏｔｈｅｃａ属、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ属、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓａｗａｄａｅａ属、Ｔｙｐｈｕｌｏｃｈａｅｔａ属菌は表生寄生、Ｐｌｅｏｃｈａｅｔａ属、Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ属は半内部寄生、Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ属は内部寄生に分類される。
【0021】
本発明における菌株が寄生するうどんこ病菌の宿主植物体としては、稲、芝、トウモロコシ及びサトウキビ等のイネ科、コムギ、オオムギ、ライムギ及びエンバク等のムギ科、ミカン、レモン、キンカン及びユズ等のミカン科、バナナ等のバショウ科、リンゴ、ナシ、モモ、オウトウ、イチゴ及びバラ等のバラ科、ブドウ等のブドウ科、カキ等のカキノキ科、キュウリ、スイカ、メロン及びカボチャ等のウリ科、ナス、トマト、ジャガイモ、ピーマン及びタバコ等のナス科、キャベツ及びレタス等のアブラナ科、大豆、インゲン、サヤエンドウ及びラッカセイ等のマメ科、サトイモ及びコンニャク等のサトイモ科、イチジククワ科、サツマイモ等のヒルガオ科、シイ、クヌギ、カシ及びコナラ等のカシノキ科、カエデ、ガラナ及びトチノキ等のムクロジ科、ホウレンソウ及びテンサイ等のヒユ科、レタス、ゴボウ、キク及びヒマワリ等のキク科、チューリップ等のユリ科、その他コーヒーや綿などを示しており、更に、植物体およびそれらのＦ１品種等が挙げられる。また、遺伝子等を人工的に操作することにより生み出され、元来自然界に存在するものではない遺伝子組み換え作物も含み、例えば、除草剤耐性を付与した大豆、トウモロコシ、綿等、寒冷地適応したイネ、タバコ等、殺虫物質生産能を付与したトウモロコシ、綿等の農園芸作物等が挙げられるが、これら範囲に限定されるものではない。
【0022】
また、本発明における菌株の植物体への施用方法としては、植物体と接触させる方法、または、栽培土壌に含有させて、植物の根もしくは地下茎に接触させる方法が挙げられる。具体例として、組成物の植物個体への茎葉散布処理、注入処理、苗箱処理、セルトレー処理、温室ダクトを介した処理、植物種子への吹き付け処理、植物種子への塗沫処理、植物種子への浸漬処理、植物種子への粉衣処理、土壌表面への散布処理、土壌表面への散布処理後の土壌混和、土壌中への注入処理、土壌中での注入処理後の土壌混和、土壌潅注処理、土壌潅注処理後の土壌混和等が挙げられる。通常、当業者が利用するいかなる施用方法を用いても十分な効力を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本発明で単離した２６菌株（太字）を含む、日本分離菌株の１２９菌株のアンペロマイセス属菌のｒＤＮＡ－ＩＴＳ配列とＡＣＴ配列を最尤度（ＭＬ）解析した結果、最も尤度の高い系統樹を示す。本系統樹は、先行研究に基づき、Ｐｈｏｍａ ｈｅｒｂａｒｕｍ ＣＢＳ５６７６３株に根ざしている。ＭＬ解析の１０００反復から計算したブートストラップ値をパーセントで表記した（７０％以下とサブクレードの値は表示しない）。その後にベイズ解析による事後確率（０．９以下とサブクレードでは値を示さない）をスラッシュで区切って示す。棒グラフは１枝につき、１部位あたり０．０２の変化量の見込みを示す。Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓの菌株に関する追加データ（収集場所とデータ、宿主菌種）および解析に含まれる配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、以前の研究に記載されている。
【図2】トマトうどんこ病菌ＫＴＰ－０３菌糸体上のＡｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ系統 Ｘｓ－ｑの高解像能デジタル顕微鏡写真（Ａ，Ｂ）および光顕顕微鏡写真（Ｃ）。Ａ：ＫＴＰ－０３菌糸体上に形成された成熟分生子殻（Ｐｙ１）および未熟分生子殻（Ｐｙ２）。Ｂ：ＫＴＰ－０３の分生子柄（Ｃｐ）に形成された分生子殻（Ｐｙ）。Ｃ：蒸留水（１０μＬ）を滴下し、分生子殻から胞子（Ｓｐ）が出現した。１０日齢のＫＴＰ－０３菌叢に胞子を噴霧接種し、１４日目に顕微鏡写真を撮影した。スケールバーは５０μｍ（Ａ）および３０μｍ（ＢおよびＣ）を表す。Ｈｐ：トマトうどんこ病菌ＫＴＰ－０３の菌糸。
【図3】トマトうどんこ病菌ＫＴＰ－０３に感染したＡｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ Ｘｓ－ｑ株の高解像能デジタル顕微鏡写真（ＡおよびＢ）および光学顕微鏡写真（Ｃ～Ｆ）。Ａ：ＫＴＰ－０３の菌糸がトマトのタイプＩトリコーム細胞に感染した。Ｂ：Ｘｓ－ｑ菌糸が、ＫＴＰ－０３の分生子内に侵入した。矢印はＸｓ－ｑ菌糸の侵入部位を示す。Ｃ：ＫＴＰ－０３の菌糸と分生子柄の原基細胞内で生育したＸｓ－ｑ菌糸。Ｄ：Ｘｓ－ｑ菌糸が生長し、ＫＴＰ－０３分生子柄内で産生された分生子殻。Ｅ：ＫＴＰ－０３の分生子柄で作られたＸｓ－ｑの分生子殻とその分生子殻から生じた豊富な胞子。Ｆ：トマトのタイプＩトリコーム細胞上に形成されたＫＴＰ－０３分生子柄内で形成されたＸｓ－ｑ分生子殻。スケールバーは、６０μｍ（Ａ，Ｆ）、２０μｍ（Ｂ～Ｅ）を表す。Ａｈｐ：Ｘｓ－ｑ菌糸；Ｃｏ：ＫＴＰ－０３分生子柄；Ｃｐ：ＫＴＰ－０３分生子；Ｈｐ：ＫＴＰ－０３菌糸；Ｐｙ：Ｘｓ－ｑ分生子殻；Ｓｐ：Ｘｓ－ｑ胞子；Ｔｃ：トマトのタイプＩトリコーム細胞。
【図4】トマトうどんこ病菌ＫＴＰ－０３へのＡｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ系統 Ｘｓ－ｑの感染過程。ＫＴＰ－０３はトマトのタイプＩトリコーム細胞上で旺盛に生育した。トマト葉に分生子殻を接種後、０日（Ａ）、２日（Ｂ）、３日（Ｃ）、５日（Ｄ）、６日（Ｅ）、７日（Ｆ）の高解像能デジタル顕微鏡写真をトリコーム細胞近辺で撮影した。ＫＴＰ－０３の分生子柄（Ｃｐ）と菌糸（矢印）は、Ｘｓ－ｑ菌糸（Ａｈｐ）がＫＴＰ－０３の菌糸に侵入した後、萎縮した。スケールバーは、２０μｍを表す。
【図5】Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ系統 Ｘｓ－ｑのＫＴＰ－０３における分生子殻の形成過程。ＫＴＰ－０３の分生子をマイクロマニピュレーション法でトマトの葉に接種後、１０日目の菌叢を形成させた。１０日目のＫＴＰ－０３菌叢にＸｓ－ｑ胞子を噴霧接種してから０（Ａ），５（Ｂ），７（Ｃ），１０（Ｄ），１２日目（Ｅ）にデジタル顕微鏡写真を撮影した。ＫＴＰ－０３の分生子柄（Ｃｐ）は、タイプＩトリコーム細胞（Ｔｃ）付近に形成され、Ｘｓ－ｑ菌糸（Ａｈｐ）のＫＴＰ－０３菌糸への侵入後、完全に萎縮した（矢印）。Ｘｓ－ｑの分生子殻（Ｐｙ）はＫＴＰ－０３の分生子柄内で正常に形成された。スケールバーは、２０μｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本研究の主な目的は、１）日本由来のアンペロマイセス菌株の形態的・生理的特徴と系統的配置を明らかにすること、２）異なるマイコホスト種におけるマイコパラシーの割合を検定し定量すること、３）アンペロマイセス菌株のトマトうどんこ病菌への感染過程と分生子殻の形成過程を詳細に観察することであった。日本分離菌株について、系統学的、形態学的、及び生理学的特徴の解析、そして菌寄生率などの詳細な解析を行ったのは、我々の知る限り本研究が初めてである。また、本研究は、高解像能デジタル顕微鏡を用いて、選択されたアンペロマイセス菌株とうどんこ病菌間の相互作用を詳細に観察し、この特異なタイプの菌寄生活性を特徴付ける定量的データを提供した最初の研究である。また、農薬として使用される実際処理方法として、胞子懸濁液の茎葉散布により防除効果を示すことを明らかにした。
【0025】
本発明者らは、日本国内の宿主植物で自然感染した６種類のうどんこ病菌の菌糸から、合計２６菌株のアンペロマイセス属菌を分離した。これらの菌株は、形態学的特徴、リボソームＤＮＡ内部転写スペーサー（ｒＤＮＡ－ＩＴＳ）領域およびアクチン遺伝子（ＡＣＴ）断片の配列に基づいて特徴づけされた。収集した菌株は６種類の遺伝子型を有し、アンペロマイセス属の３つの異なるクレードに分類された。また、形態は他のアンペロマイセス属の菌株と一致したが、いずれの菌株も遺伝学的解析で同定されたグループとは関連しなかった。５種のうどんこ病菌に８種のアンペロマイセス菌株を接種し、その菌寄生活性を検討した。その結果、いずれの菌株もすべてのうどんこ病菌に感染し、うどんこ病菌コロニー（菌叢）に形成した分生子殻の数から判断して、その寄生能に有意差は認められなかった。トマトうどんこ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｉｄｉｕｍ ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ系統 ＫＴＰ－０３）とアンペロマイセス属菌 ８株の相互作用について、実験室において高解像能デジタル顕微鏡を用いた研究を行った。その結果、トマトの葉の上で発芽した菌寄生菌の胞子およびその菌糸が、Ｐｓ．ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉの菌糸を貫通することが確認された。アンペロマイセス菌株の菌糸は、内部で生育を続け、接種後５日（ｄｐｉ）でうどんこ病菌の分生子柄の萎縮が始まり、６ｄｐｉで萎縮を生じ、そして７ｄｐｉで寄生された分生子柄は完全に崩壊した。アンペロマイセス菌株は、Ｐｓ． ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉの菌糸が菌寄生菌によって破壊された８～１０ｄｐｉ頃に、Ｐｓ． ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ分生子柄内で新しく分生子殻を形成した。成熟した分生子殻は１０～１４ｄｐｉで胞子を放出し、これが無傷のうどんこ病菌に感染する源となった。成熟した単一分生子殻は、約２００から１，５００個の胞子を含んでいた。本研究は、日本で単離されたアンペロマイセス属菌における初めての詳細な解析であり、高解像能デジタル顕微鏡技術を用いて系統学的に多様なアンペロマイセス菌株によるＰｓ．ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉの菌寄生性を最初に定量化したものである。開発したモデル系は、今後のアンペロマイセス属菌（菌寄生菌）を利用した生物防除や生態学的研究に有用である。
【実施例0026】
材料と方法
新規に分離したアンペロマイセス菌株における宿主うどんこ病菌の同定
宿主うどんこ病菌は、形態、宿主植物、ｒＤＮＡ－ＩＴＳ配列に基づき同定した。うどんこ病菌の宿主植物での形態観察は、先に記載したように試料を調製した後に行った（Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）５４：１８３－１８７）。うどんこ病菌の菌糸からのＤＮＡ抽出は、記載されたとおりに行った（Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（２０１６）１５：５６）。ＩＴＳ増幅を２段階で行う場合、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ II Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用い、反応液組成および反応条件は、メーカー推奨、プライマーアニーリング温度は５８℃に設定した。ＤＮＡ鋳型を含まないチューブはネガティブコントロールとして含まれる。ＰＣＲの結果得られたアンプリコンを１％アガロースゲルで電気泳動した。断片はＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ （ドイツ）に送付し、塩基配列を決定した。配列決定は増幅に使用したものと同じプライマーを用いて行われた。得られたクロマトグラムは、Ｓｔａｄｅｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）１３２：１１５－１３０）を用いて処理した。配列はＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号ＭＴ６４５８４４～ＭＴ６４５８４９で寄託された。
新規に分離したアンペロマイセス菌株における宿主うどんこ病菌の同定
宿主うどんこ病菌は、形態、宿主植物、ｒＤＮＡ－ＩＴＳ配列に基づき同定した。うどんこ病菌の宿主植物での形態観察は、先に記載したように試料を調製した後に行った（Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）５４：１８３－１８７）。うどんこ病菌の菌糸からのＤＮＡ抽出は、記載されたとおりに行った（Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（２０１６）１５：５６）。ＩＴＳ増幅を２段階で行う場合、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ II Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用い、反応液組成および反応条件は、メーカー推奨、プライマーアニーリング温度は５８℃に設定した。ＤＮＡ鋳型を含まないチューブはネガティブコントロールとして含まれる。ＰＣＲの結果得られたアンプリコンを１％アガロースゲルで電気泳動した。断片はＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ （ドイツ）に送付し、塩基配列を決定した。配列決定は増幅に使用したものと同じプライマーを用いて行われた。得られたクロマトグラムは、Ｓｔａｄｅｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）１３２：１１５－１３０）を用いて処理した。配列はＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号ＭＴ６４５８４４～ＭＴ６４５８４９で寄託された。
【0027】
アンペロマイセス菌株の分離・培養
自然感染宿主植物から採取したうどんこ病菌６検体から、合計２６菌株のアンペロマイセス属菌を分離した（表１）。アンペロマイセス菌株の菌糸は、うどんこ病菌からＬｉａｎｇらに従って分離した（Ｆｕｎｇａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（２００７）２４：２２５－２４０）。２％麦芽エキス添加Ｃｚａｐｅｘ－Ｄｏｘ寒天培地（ＭＣｚＡ；３ｇ ＮａＮＯ３，１ｇ Ｋ２ＨＰＯ４，０．５ｇ ＫＣｌ，０．５ｇ ＭｇＳＯ４，１５ｇ寒天及び２０ｇ麦芽エキス）上で、２５±２℃、照度２２．２μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１の条件下で培養した。菌株は２ヶ月ごとに継代培養した。
自然感染宿主植物から採取したうどんこ病菌６検体から、合計２６菌株のアンペロマイセス属菌を分離した（表１）。アンペロマイセス菌株の菌糸は、うどんこ病菌からＬｉａｎｇらに従って分離した（Ｆｕｎｇａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（２００７）２４：２２５－２４０）。２％麦芽エキス添加Ｃｚａｐｅｘ－Ｄｏｘ寒天培地（ＭＣｚＡ；３ｇ ＮａＮＯ３，１ｇ Ｋ２ＨＰＯ４，０．５ｇ ＫＣｌ，０．５ｇ ＭｇＳＯ４，１５ｇ寒天及び２０ｇ麦芽エキス）上で、２５±２℃、照度２２．２μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１の条件下で培養した。菌株は２ヶ月ごとに継代培養した。
【0028】
【表1】
【0029】
アンペロマイセス菌株からのＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅、塩基配列の決定
ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて、キットに付属のプロトコールに従って、２週間前のアンペロマイセス菌株のコロニー約１ｃｍ２からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出後、ｒＤＮＡ－ＩＴＳとアクチン遺伝子（ＡＣＴ）の断片の２つの遺伝子座を増幅し、塩基配列を決定した。ＩＴＳの増幅には、プライマーＩＴＳ１ＦとＩＴＳ４、および以下のＰＣＲプロトコールを用いた：９４℃で５分間の初期熱変性、その後９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１分間の３５サイクル（ＩＴＳＩＦ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ（１９９３）２：１１３－１１８；ＩＴＳ４：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９０）１８：３１５－３２２）。反応を、７２℃で１０分間最終インキュベートして終了させた。プライマーＡｃｔ－１およびＡｃｔ－５ｒａをＡＣＴ増幅に使用し、以下のＰＣＲプロトコールを用いた：最初の熱変性は９８℃で５分間、その後９８℃３０秒、５４℃１分間、７２℃１分間の３５サイクル（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）１５５：１７９－１９５）。反応終了後、７２℃で５分間インキュベートした。２０μＬの反応をＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、５００ｎＭの最終濃度のプライマー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて実行した。ネガティブコントロールとして、ＤＮＡ鋳型を欠くＰＣＲミックスを常に含むようにした。配列決定とクロマトグラムの処理は、上記で詳述したように行った。配列をＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１（ＩＴＳ）およびＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９（ＡＣＴ）で寄託した。
ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて、キットに付属のプロトコールに従って、２週間前のアンペロマイセス菌株のコロニー約１ｃｍ２からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出後、ｒＤＮＡ－ＩＴＳとアクチン遺伝子（ＡＣＴ）の断片の２つの遺伝子座を増幅し、塩基配列を決定した。ＩＴＳの増幅には、プライマーＩＴＳ１ＦとＩＴＳ４、および以下のＰＣＲプロトコールを用いた：９４℃で５分間の初期熱変性、その後９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１分間の３５サイクル（ＩＴＳＩＦ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ（１９９３）２：１１３－１１８；ＩＴＳ４：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９０）１８：３１５－３２２）。反応を、７２℃で１０分間最終インキュベートして終了させた。プライマーＡｃｔ－１およびＡｃｔ－５ｒａをＡＣＴ増幅に使用し、以下のＰＣＲプロトコールを用いた：最初の熱変性は９８℃で５分間、その後９８℃３０秒、５４℃１分間、７２℃１分間の３５サイクル（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）１５５：１７９－１９５）。反応終了後、７２℃で５分間インキュベートした。２０μＬの反応をＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、５００ｎＭの最終濃度のプライマー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて実行した。ネガティブコントロールとして、ＤＮＡ鋳型を欠くＰＣＲミックスを常に含むようにした。配列決定とクロマトグラムの処理は、上記で詳述したように行った。配列をＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号ＭＴ６４４６２６～ＭＴ６４４６５１（ＩＴＳ）およびＭＴ６５６３０４～ＭＴ６５６３２９（ＡＣＴ）で寄託した。
【0030】
シークエンスアラインメントと系統樹解析
日本で分離された新菌株の塩基配列を、これまでに決定された他の１０３株のアンペロマイセス属菌のＩＴＳおよびＡＣＴ配列（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１２）１０２：７０７－７１６；Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０）１１４：２３５－２４７；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ（２０１１）２０：１４９２－１５０７；Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１９）１０９：１４０４－１４１６）と、アウトグループとしてＰｈｏｍａ ｈｅｒｂａｒｕｍ株（ＣＢＳ ５６７．６３）（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１２）１０２：７０７－７１６）と共に解析し、合計１３０菌株（Ｐｈ．ｈｅｒｂａｒｕｍを含む）を解析対象とした。アラインメントおよび最終的な解析用データセットを、Ｎｅｍｅｔｈら（２０１９）の記載に従って作成した。ＩＴＳ＿ＡＣＴ データセットを、ＩＴＳとＡＣＴに対応するパーティションを設定し、最尤法（ＭＬ）とベイズ推定法（ＢＩ）を用いて解析した。ＩＴＳは５０１文字、ＡＣＴは８２０文字からなり、合計１３２１文字からなるデータセットである。ＭＬ解析にはｒａｘｍｌＧＵＩ １．５を使用し、詳細はＮｅｍｅｔｈら（２０１９）のとおりである。ＢＩはＭｒＢａｙｅｓ ３．１．２を用い、以前に記述された方法に従った（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１８）１５０：８１７－８２４）。ＢＩでサンプリングした樹木から、最初の４，０００本のサンプリング（バーンイン）を省き、多数決（５０％）合意樹木を算出した。解析結果の系統樹をＴｒｅｅＧｒａｐｈ ２．１４．０で可視化し、ＴｒｅｅＢＡＳＥ（ｓｔｕｄｙ ＩＤ ２５８６１）に提出した。
日本で分離された新菌株の塩基配列を、これまでに決定された他の１０３株のアンペロマイセス属菌のＩＴＳおよびＡＣＴ配列（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１２）１０２：７０７－７１６；Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０）１１４：２３５－２４７；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ（２０１１）２０：１４９２－１５０７；Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１９）１０９：１４０４－１４１６）と、アウトグループとしてＰｈｏｍａ ｈｅｒｂａｒｕｍ株（ＣＢＳ ５６７．６３）（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１２）１０２：７０７－７１６）と共に解析し、合計１３０菌株（Ｐｈ．ｈｅｒｂａｒｕｍを含む）を解析対象とした。アラインメントおよび最終的な解析用データセットを、Ｎｅｍｅｔｈら（２０１９）の記載に従って作成した。ＩＴＳ＿ＡＣＴ データセットを、ＩＴＳとＡＣＴに対応するパーティションを設定し、最尤法（ＭＬ）とベイズ推定法（ＢＩ）を用いて解析した。ＩＴＳは５０１文字、ＡＣＴは８２０文字からなり、合計１３２１文字からなるデータセットである。ＭＬ解析にはｒａｘｍｌＧＵＩ １．５を使用し、詳細はＮｅｍｅｔｈら（２０１９）のとおりである。ＢＩはＭｒＢａｙｅｓ ３．１．２を用い、以前に記述された方法に従った（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１８）１５０：８１７－８２４）。ＢＩでサンプリングした樹木から、最初の４，０００本のサンプリング（バーンイン）を省き、多数決（５０％）合意樹木を算出した。解析結果の系統樹をＴｒｅｅＧｒａｐｈ ２．１４．０で可視化し、ＴｒｅｅＢＡＳＥ（ｓｔｕｄｙ ＩＤ ２５８６１）に提出した。
【0031】
アンペロマイセス菌株 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生育特性に関する形態学的観察
４つのうどんこ病菌試料に由来し、系統解析により４つの異なるハプロタイプに属するアンペロマイセス属菌の代表８菌株を選び、培養特性をより詳細に検討した（表２）。この８菌株には、同じうどんこ病菌試料に由来する菌株も含まれており、菌株レベルでの特性の違いの可能性を明らかにするために、この８菌株を選択した。３０日齢のアンペロマイセス菌株の胞子形成コロニーを１．０～１．５ｍＬの滅菌蒸留水で洗浄した。コロニーを滅菌メスでかきとり、各コロニーから胞子懸濁液を調整した。その濃度をヘモサイトメーター（日本理化学工業株式会社、東京、日本）で測定した。懸濁液を５×１０５胞子・ｍＬ－１に希釈した。Ｔｗｅｅｎ２０を添加し、最終Ｔｗｅｅｎ２０濃度が０．０５％になるようにした。滅菌セロハンシートを敷いた素水寒天培地プレートに、いずれかのアンペロマイセス菌株の胞子懸濁液をそれぞれ噴霧し、室温（２５±２℃）で培養した。接種３日後の胞子発芽率および菌糸長を高解像能デジタル顕微鏡（ＫＨ－２７００ ＤＭ；Ｈｉｒｏｘ、東京、日本）下で測定した。データは５反復の平均値と標準偏差で示した（１反復で１００胞子）。アンペロマイセス菌株のコロニーの径方向成長速度を、２０日間培養後の各コロニーの直径を測定することによって評価した。データは５反復（１反復で１０コロニー）の平均と標準偏差として示した。
４つのうどんこ病菌試料に由来し、系統解析により４つの異なるハプロタイプに属するアンペロマイセス属菌の代表８菌株を選び、培養特性をより詳細に検討した（表２）。この８菌株には、同じうどんこ病菌試料に由来する菌株も含まれており、菌株レベルでの特性の違いの可能性を明らかにするために、この８菌株を選択した。３０日齢のアンペロマイセス菌株の胞子形成コロニーを１．０～１．５ｍＬの滅菌蒸留水で洗浄した。コロニーを滅菌メスでかきとり、各コロニーから胞子懸濁液を調整した。その濃度をヘモサイトメーター（日本理化学工業株式会社、東京、日本）で測定した。懸濁液を５×１０５胞子・ｍＬ－１に希釈した。Ｔｗｅｅｎ２０を添加し、最終Ｔｗｅｅｎ２０濃度が０．０５％になるようにした。滅菌セロハンシートを敷いた素水寒天培地プレートに、いずれかのアンペロマイセス菌株の胞子懸濁液をそれぞれ噴霧し、室温（２５±２℃）で培養した。接種３日後の胞子発芽率および菌糸長を高解像能デジタル顕微鏡（ＫＨ－２７００ ＤＭ；Ｈｉｒｏｘ、東京、日本）下で測定した。データは５反復の平均値と標準偏差で示した（１反復で１００胞子）。アンペロマイセス菌株のコロニーの径方向成長速度を、２０日間培養後の各コロニーの直径を測定することによって評価した。データは５反復（１反復で１０コロニー）の平均と標準偏差として示した。
【0032】
【表2】
【0033】
植物材料
温室内の自家受粉子孫（自殖）から得たトマトＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｍｉｌｌ．ｃｖ． Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ（ＭＭ）の種子を，シャーレ内の水に浸したろ紙上でＬＨ－２４０Ｎ人工気象器（日本医化器械工業、東京、日本）において３日間かけて発芽させた。白色蛍光ランプ ＦＬ４０ＳＳ Ｗ／３７（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた連続照明（１９．８～４０．３μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１；４００～７００ｎｍ）のもと、２５±２℃で行った。子葉期の苗をポリウレタン製立方体スポンジ支持体（３×３×３ｃｍ３）に挟んだ。苗を挟んだスポンジ支持体を、２０ｍＬの水耕栽培用養液（４．０ｍＭ ＫＮＯ３，１．５ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２，１．０ｍＭ ＭｇＳＯ４，０．６６ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４，０．０５７ｍＭ ＦｅＥＤＴＡ，０．０４８ｍＭ Ｈ３ＢＯ３および０．００９ｍＭ ＭｎＳＯ４）を入れた３０ｍＬ円筒型プラスチックケース（直径３ｃｍ、長さ５ｃｍ）に挿入し、温度管理された部屋で１４日間以下の条件でインキュベーションを行った。２５±２℃、５０～７０％相対湿度（ＲＨ）、５９．５μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１の連続照度である。
温室内の自家受粉子孫（自殖）から得たトマトＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｍｉｌｌ．ｃｖ． Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ（ＭＭ）の種子を，シャーレ内の水に浸したろ紙上でＬＨ－２４０Ｎ人工気象器（日本医化器械工業、東京、日本）において３日間かけて発芽させた。白色蛍光ランプ ＦＬ４０ＳＳ Ｗ／３７（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた連続照明（１９．８～４０．３μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１；４００～７００ｎｍ）のもと、２５±２℃で行った。子葉期の苗をポリウレタン製立方体スポンジ支持体（３×３×３ｃｍ３）に挟んだ。苗を挟んだスポンジ支持体を、２０ｍＬの水耕栽培用養液（４．０ｍＭ ＫＮＯ３，１．５ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２，１．０ｍＭ ＭｇＳＯ４，０．６６ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４，０．０５７ｍＭ ＦｅＥＤＴＡ，０．０４８ｍＭ Ｈ３ＢＯ３および０．００９ｍＭ ＭｎＳＯ４）を入れた３０ｍＬ円筒型プラスチックケース（直径３ｃｍ、長さ５ｃｍ）に挿入し、温度管理された部屋で１４日間以下の条件でインキュベーションを行った。２５±２℃、５０～７０％相対湿度（ＲＨ）、５９．５μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１の連続照度である。
【0034】
うどんこ病菌の材料、接種、および培養
本研究では、人工気象器で継続的に継代培養しているトマトうどんこ病菌分離菌株（Ｐｓｅｕｄｏｉｄｉｕｍ ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ Ｌ． Ｋｉｓｓ ＫＴＰ－０３）を用いた（関西病虫研究会報（２０１４）５６：１７－２０）。感染葉上のコロニーから既報（Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００９）１１３：３６４－３７２）の静電胞子捕集器を用いて成熟分生子を採取し、高解像能デジタル顕微鏡（ＫＨ－２７００）下で１４日齢の健全トマト苗（ＭＭ）の本葉に接種した。接種した苗を、２５±１℃、５０～７０％ＲＨの人工気象器内で、２２．２μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１の連続照明下で４０日間インキュベートした。
本研究では、人工気象器で継続的に継代培養しているトマトうどんこ病菌分離菌株（Ｐｓｅｕｄｏｉｄｉｕｍ ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ Ｌ． Ｋｉｓｓ ＫＴＰ－０３）を用いた（関西病虫研究会報（２０１４）５６：１７－２０）。感染葉上のコロニーから既報（Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００９）１１３：３６４－３７２）の静電胞子捕集器を用いて成熟分生子を採取し、高解像能デジタル顕微鏡（ＫＨ－２７００）下で１４日齢の健全トマト苗（ＭＭ）の本葉に接種した。接種した苗を、２５±１℃、５０～７０％ＲＨの人工気象器内で、２２．２μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１の連続照明下で４０日間インキュベートした。
【0035】
日本産アンペロマイセス菌株による菌寄生性試験
形態学的特性調査で使用した８菌株のアンペロマイセス属菌を菌寄生性試験に供試した。温室で管理している以下のうどんこ病菌を使用した。Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ． ｈｏｒｄｅｉ Ｍａｒｃｈａｌ ｒａｃｅ １ ＫＢＰ－０１株（オオムギうどんこ病菌）、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ Ｇｒｅｖｉｌｌｅ ＫＲＣＰ－４Ｎ株 （レッドクローバーうどんこ病菌）、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ａｐｈａｎｉｓ Ｕ． Ｂｒａｕｎ ＆ Ｓ． Ｔａｋａｍａｔｓｕ ＫＳＰ－７Ｎ株（イチゴうどんこ病菌）、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ Ｐｏｌｌａｃｃｉ ＫＭＰ－６Ｎ株（メロンうどんこ病菌）およびＰｓｅｕｄｏｉｄｉｕｍ ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ Ｌ． Ｋｉｓｓ ＫＴＰ－０３株（トマトうどんこ病菌）を用いた。これらの実験で接種したうどんこ病菌コロニーは１０日齢であった。アンペロマイセス菌株の胞子懸濁液を、上記のように調整した。各菌株について５本のうどんこ病菌感染植物に、アンペロマイセス菌株の胞子懸濁液を接種し、プラスチックの箱に入れた。各菌株について５本の非接種植物を対照区とした。ガーゼを滅菌水道水で湿らせ、箱に入れた。２５±１℃、８０～９０％ＲＨ、２２．２μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１の連続照度の人工気象器で１０～２０日間培養した。
形態学的特性調査で使用した８菌株のアンペロマイセス属菌を菌寄生性試験に供試した。温室で管理している以下のうどんこ病菌を使用した。Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ． ｈｏｒｄｅｉ Ｍａｒｃｈａｌ ｒａｃｅ １ ＫＢＰ－０１株（オオムギうどんこ病菌）、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ Ｇｒｅｖｉｌｌｅ ＫＲＣＰ－４Ｎ株 （レッドクローバーうどんこ病菌）、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ａｐｈａｎｉｓ Ｕ． Ｂｒａｕｎ ＆ Ｓ． Ｔａｋａｍａｔｓｕ ＫＳＰ－７Ｎ株（イチゴうどんこ病菌）、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ Ｐｏｌｌａｃｃｉ ＫＭＰ－６Ｎ株（メロンうどんこ病菌）およびＰｓｅｕｄｏｉｄｉｕｍ ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ Ｌ． Ｋｉｓｓ ＫＴＰ－０３株（トマトうどんこ病菌）を用いた。これらの実験で接種したうどんこ病菌コロニーは１０日齢であった。アンペロマイセス菌株の胞子懸濁液を、上記のように調整した。各菌株について５本のうどんこ病菌感染植物に、アンペロマイセス菌株の胞子懸濁液を接種し、プラスチックの箱に入れた。各菌株について５本の非接種植物を対照区とした。ガーゼを滅菌水道水で湿らせ、箱に入れた。２５±１℃、８０～９０％ＲＨ、２２．２μｍｏＬ・ｍ－２・ｓ－１の連続照度の人工気象器で１０～２０日間培養した。
【0036】
菌糸寄生時に形成された分生子殻と胞子の形態学的解析
アンペロマイセス菌株の分生子殻と胞子を実体顕微鏡（ＳＺ６０ ＳＭ；オリンパス、東京、日本）と高解像能デジタル顕微鏡で観察し、菌糸寄生性試験中に形成された胞子を調べた。２５±２℃で１４日間生育させたトマトうどんこ病菌のコロニー内で形成された成熟分生子殻の長さと幅をスライドグラス上で測定した。データは５反復（１反復で分生子殻２０個、胞子１００個）の平均値および標準偏差として示した。
アンペロマイセス菌株の分生子殻と胞子を実体顕微鏡（ＳＺ６０ ＳＭ；オリンパス、東京、日本）と高解像能デジタル顕微鏡で観察し、菌糸寄生性試験中に形成された胞子を調べた。２５±２℃で１４日間生育させたトマトうどんこ病菌のコロニー内で形成された成熟分生子殻の長さと幅をスライドグラス上で測定した。データは５反復（１反復で分生子殻２０個、胞子１００個）の平均値および標準偏差として示した。
【0037】
菌寄生活性の定量化
アンペロマイセス菌株の菌寄生活性を特徴付けるために、上記５種のうどんこ病菌の１０個のコロニーに形成された分生子殻の数を接種後１４日目（ｄｐｉ）に測定した。分生子殻の数は、分生子殻が存在しない、うどんこ病菌単一菌叢あたり１１～１００分生子殻、うどんこ病菌単一菌叢に１０１分生子殻以上形成された、の３段階でスコア化した。また、トマトうどんこ病菌分生子柄内で形成された単一分生子殻で産生したアンペロマイセス胞子の数を高解像能デジタル顕微鏡下で計数した。うどんこ病菌を接種したトマト１０株のトマト植物から２０枚の葉片（約１×１ｃｍ２の大きさ）を採取した。そのサンプルを高解像能デジタル顕微鏡下で直接観察した。データを５反復の平均値と標準偏差で示した（１レプリケーションで５個の分生子殻）。
アンペロマイセス菌株の菌寄生活性を特徴付けるために、上記５種のうどんこ病菌の１０個のコロニーに形成された分生子殻の数を接種後１４日目（ｄｐｉ）に測定した。分生子殻の数は、分生子殻が存在しない、うどんこ病菌単一菌叢あたり１１～１００分生子殻、うどんこ病菌単一菌叢に１０１分生子殻以上形成された、の３段階でスコア化した。また、トマトうどんこ病菌分生子柄内で形成された単一分生子殻で産生したアンペロマイセス胞子の数を高解像能デジタル顕微鏡下で計数した。うどんこ病菌を接種したトマト１０株のトマト植物から２０枚の葉片（約１×１ｃｍ２の大きさ）を採取した。そのサンプルを高解像能デジタル顕微鏡下で直接観察した。データを５反復の平均値と標準偏差で示した（１レプリケーションで５個の分生子殻）。
【0038】
トマトうどんこ病菌（Ｐｓ．ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）に対するアンペロマイセス菌株の菌寄生活性の連続モニタリング
試験管内で胞子形成が良好なＸｓ－ｑ株を選び、うどんこ病菌の感染構造体内における菌寄生活性をより詳細に解析した。Ｘｓ－ｑ株をトマトのうどんこ病菌に噴霧接種し、うどんこ病菌における菌寄生過程と分生子殻の形成を観察した。接種した葉は、高解像能デジタル顕微鏡を用いて定期的に観察した。また、光学顕微鏡（ＢＸ－６０ ＬＭ；オリンパス、東京、日本）用の試料を準備した。ラクトフェノール・エタノール溶液（１０ｍＬ グリセロール、１０ｍＬ フェノール、１０ｍＬ 乳酸、１０ｍＬ 蒸留水、４０ｍＬ ９９．８％ エタノール）中で１～２分間クロロフィルを除去し、試料を固定した後、前記のように蒸留水に溶解した０．１％ Ａｎｉｌｉｎｅ Ｂｌｕｅ（ナカライテスク株式会社、東京、日本）で染色した。試料を光学顕微鏡下で観察した。
試験管内で胞子形成が良好なＸｓ－ｑ株を選び、うどんこ病菌の感染構造体内における菌寄生活性をより詳細に解析した。Ｘｓ－ｑ株をトマトのうどんこ病菌に噴霧接種し、うどんこ病菌における菌寄生過程と分生子殻の形成を観察した。接種した葉は、高解像能デジタル顕微鏡を用いて定期的に観察した。また、光学顕微鏡（ＢＸ－６０ ＬＭ；オリンパス、東京、日本）用の試料を準備した。ラクトフェノール・エタノール溶液（１０ｍＬ グリセロール、１０ｍＬ フェノール、１０ｍＬ 乳酸、１０ｍＬ 蒸留水、４０ｍＬ ９９．８％ エタノール）中で１～２分間クロロフィルを除去し、試料を固定した後、前記のように蒸留水に溶解した０．１％ Ａｎｉｌｉｎｅ Ｂｌｕｅ（ナカライテスク株式会社、東京、日本）で染色した。試料を光学顕微鏡下で観察した。
【0039】
菌寄生性の詳細を明らかにするため、特にアンペロマイセス菌株の感染過程をリアルタイムで直接観察することを容易にするため、以下の実験を計画した。Ｐｓ．ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ ＫＴＰ－０３の成熟分生子を１４日齢のトマト（ＭＭ）のタイプＩトリコームに直接接種し、接種した植物を上記と同じ条件で、人工気象器内で１０～１４日培養した。トリコーム上に生育したうどんこ病菌を自然環境条件下で観察した。ＫＴＰ－０３におけるアンペロマイセス菌株の感染過程を、高解像能デジタル顕微鏡を使用して観察した。ＭＣｚＡプレートで増殖させたアンペロマイセス属菌 Ｘｓ－ｑ株の成熟した分生子殻を、ガラス針を装着したマイクロマニピュレーターを用いて、Ｐｓ． ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ ＫＴＰ－０３コロニーに接種した。これらの単一分生子殻は、胞子の供給源となり、感染プロセスを開始させた。Ｘｓ－ｑ株の菌糸伸長は、高解像能デジタル顕微鏡の１／２インチインターライン転送型電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを用いて、接種後１４日間にわたって連続的に撮影した。撮影した顕微鏡写真を、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ画像処理ソフト（ｖｅｒ．５．０；Ａｄｏｂｅ，Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析し、元の情報を変えずに撮影した画像のコントラストを向上させた。
【0040】
キュウリうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ）に対するアンペロマイセスＸｓ－ｑ菌株の効果試験
次に、本発明菌株が植物病害に有効であることを具体的に示すが、これらの例に限定されるものではない。
次に、本発明菌株が植物病害に有効であることを具体的に示すが、これらの例に限定されるものではない。
【0041】
キュウリうどんこ病：予防試験
供試植物（キュウリ品種：相模半白節成）の種子を播種後、第１葉が展開するまで栽培した。本発明菌株アンペロマイセス・ストレインＸｓ－ｑ菌株の分生胞子を井戸水に懸濁して１×１０＾６個／ｍｌに調製し、得られた懸濁液を供試植物に散布した（２．５ｍｌ／個体）。風乾後、キュウリうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ）の分生胞子を井戸水に懸濁し、１×１０＾３個／ｍｌに調整して噴霧接種した。接種後、室温２０℃、加湿条件下・非加湿条件下で各々６～１０日栽培後、キュウリうどんこ病コロニー数を計数した。
供試植物（キュウリ品種：相模半白節成）の種子を播種後、第１葉が展開するまで栽培した。本発明菌株アンペロマイセス・ストレインＸｓ－ｑ菌株の分生胞子を井戸水に懸濁して１×１０＾６個／ｍｌに調製し、得られた懸濁液を供試植物に散布した（２．５ｍｌ／個体）。風乾後、キュウリうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ）の分生胞子を井戸水に懸濁し、１×１０＾３個／ｍｌに調整して噴霧接種した。接種後、室温２０℃、加湿条件下・非加湿条件下で各々６～１０日栽培後、キュウリうどんこ病コロニー数を計数した。
【0042】
キュウリうどんこ病：治療試験
供試植物（キュウリ品種：相模半白節成）の種子を播種後、第１葉が展開するまで栽培した。キュウリうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ）の分生胞子を井戸水に懸濁して１×１０＾３個／ｍｌに調整し、噴霧接種した。接種４日後、本発明菌株アンペロマイセス・ストレインＸｓ－ｑ菌株の分生胞子を井戸水に懸濁して１×１０＾６個／ｍｌに調製し、散布した（２．５ｍｌ／個体）。散布後、室温２０℃、加湿条件下・非加湿条件下で各々６～１０日栽培後、キュウリうどんこ病コロニー数を計数した。
供試植物（キュウリ品種：相模半白節成）の種子を播種後、第１葉が展開するまで栽培した。キュウリうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ）の分生胞子を井戸水に懸濁して１×１０＾３個／ｍｌに調整し、噴霧接種した。接種４日後、本発明菌株アンペロマイセス・ストレインＸｓ－ｑ菌株の分生胞子を井戸水に懸濁して１×１０＾６個／ｍｌに調製し、散布した（２．５ｍｌ／個体）。散布後、室温２０℃、加湿条件下・非加湿条件下で各々６～１０日栽培後、キュウリうどんこ病コロニー数を計数した。
【0043】
以上の方法で計数したキュウリうどんこ病のコロニー数を用いて、以下の計算式に従って防除価を算出した。
防除価＝１００｛１－（Ａ／Ｂ）｝ Ａ＝各薬剤処理区のコロニー数
Ｂ＝無処理区コロニー数
各試験において防除価８０以上を示し、本発明菌株アンペロマイセス・ストレインＸｓ－ｑ菌株のキュウリうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ）に対する効果を確認した。
防除価＝１００｛１－（Ａ／Ｂ）｝ Ａ＝各薬剤処理区のコロニー数
Ｂ＝無処理区コロニー数
各試験において防除価８０以上を示し、本発明菌株アンペロマイセス・ストレインＸｓ－ｑ菌株のキュウリうどんこ病菌（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｘａｎｔｈｉｉ）に対する効果を確認した。
【0044】
アンペロマイセス菌株のＩＴＳおよびＡＣＴ領域の塩基配列解析
日本で新たに分離されたアンペロマイセス属菌 ２６菌株について、ＩＴＳおよびＡＣＴの断片を決定した（表１）。同一のうどんこ病菌試料から分離されたアンペロマイセス菌株のＩＴＳおよびＡＣＴ配列は同一であった。また、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｑｕｅｒｃｉｃｏｌａとＥ． ｇｌｙｃｉｎｅｓから分離された菌株はＩＴＳ配列が同一であったため、独立した６つのうどんこ病菌サンプルから分離された菌株は５つの異なるＩＴＳ遺伝子型を有していた。また、ＡＣＴの配列から６つの異なる遺伝子型が明らかになった。
日本で新たに分離されたアンペロマイセス属菌 ２６菌株について、ＩＴＳおよびＡＣＴの断片を決定した（表１）。同一のうどんこ病菌試料から分離されたアンペロマイセス菌株のＩＴＳおよびＡＣＴ配列は同一であった。また、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｑｕｅｒｃｉｃｏｌａとＥ． ｇｌｙｃｉｎｅｓから分離された菌株はＩＴＳ配列が同一であったため、独立した６つのうどんこ病菌サンプルから分離された菌株は５つの異なるＩＴＳ遺伝子型を有していた。また、ＡＣＴの配列から６つの異なる遺伝子型が明らかになった。
【0045】
アンペロマイセス分離菌株の系統樹の解析
ＩＴＳ＿ＡＣＴデータセットを組み合わせたＭＬおよびＢＩ解析により、非常によく似た系統樹と同一のクレードのグループ分けが示された。最も尤度の高い系統樹を図１に示す。アンペロマイセス菌株の系統解析の結果、５つの明瞭でよく支持されたクレードが見つかった（ブートストラップ支持率は９４％；事後確率は１）。最も大きなクレードはクレード１と呼ばれ、本研究で分離された８菌株を含む６０菌株から構成されていた。クレード１には、Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓとして分類されているＡＱ－１０株が含まれていた。また、このクレードはいくつかのサブグループを含んでおり、クレード１に含まれる８菌株の日本分離菌株は、２つの異なるサブグループに属していた。クレード２には１３菌株、クレード３には１５菌株が含まれ、後者には新たに分離された７菌株が含まれた。２番目に大きなクレードであるクレード４は２２菌株からなり、その半数は今回分離されたものであった。このため、本研究で分離された菌株のほとんどはこのクレードに属し、３種類の遺伝子型を持つ日本分離菌株が含まれていた。最後に、クレード５は１９菌株で構成され、日本分離菌株からは１菌株も分離されなかった。以上の結果、日本で採取されたうどんこ病菌６検体から分離された菌株は、アンペロマイセス属菌の３つの大きなクレードに分類されることがわかった。本結果から、アンペロマイセス属菌には、微生物農薬として使用されているＡＱ－１０株を含むＡｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓとは異なるクレード２～５が存在すること、本発明の８菌株が、それぞれクレード１（７１２４－ｅ株）、クレード３（Ｘｓ－ｑ株）および４（Ｅｑ－ｈ株、Ｅｑ－ｍ株、７１００－ａ株、７１００－ｂ株、７１００－ｄ株、７１００－ｇ株）に属することが明らかとなった。
ＩＴＳ＿ＡＣＴデータセットを組み合わせたＭＬおよびＢＩ解析により、非常によく似た系統樹と同一のクレードのグループ分けが示された。最も尤度の高い系統樹を図１に示す。アンペロマイセス菌株の系統解析の結果、５つの明瞭でよく支持されたクレードが見つかった（ブートストラップ支持率は９４％；事後確率は１）。最も大きなクレードはクレード１と呼ばれ、本研究で分離された８菌株を含む６０菌株から構成されていた。クレード１には、Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓとして分類されているＡＱ－１０株が含まれていた。また、このクレードはいくつかのサブグループを含んでおり、クレード１に含まれる８菌株の日本分離菌株は、２つの異なるサブグループに属していた。クレード２には１３菌株、クレード３には１５菌株が含まれ、後者には新たに分離された７菌株が含まれた。２番目に大きなクレードであるクレード４は２２菌株からなり、その半数は今回分離されたものであった。このため、本研究で分離された菌株のほとんどはこのクレードに属し、３種類の遺伝子型を持つ日本分離菌株が含まれていた。最後に、クレード５は１９菌株で構成され、日本分離菌株からは１菌株も分離されなかった。以上の結果、日本で採取されたうどんこ病菌６検体から分離された菌株は、アンペロマイセス属菌の３つの大きなクレードに分類されることがわかった。本結果から、アンペロマイセス属菌には、微生物農薬として使用されているＡＱ－１０株を含むＡｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓとは異なるクレード２～５が存在すること、本発明の８菌株が、それぞれクレード１（７１２４－ｅ株）、クレード３（Ｘｓ－ｑ株）および４（Ｅｑ－ｈ株、Ｅｑ－ｍ株、７１００－ａ株、７１００－ｂ株、７１００－ｄ株、７１００－ｇ株）に属することが明らかとなった。
【0046】
インビトロ（試験管内）で増殖させたアンペロマイセス属菌日本分離菌株の形態学的観察
クレード３およびクレード４に分類された本発明の８菌株について、形態学的特徴を詳細に観察した。胞子の大きさと形、胞子の発芽率、発芽に要する時間、菌糸の長さ、コロニー面積を測定した。胞子は単細胞で、ヒアルロン酸を含み、楕円形から楕円形、約５．７～９．２×２．６～５．０μｍの球形であった。胞子は接種後約１５～２０時間で発芽し、菌糸を伸長させた後、高湿度の条件下で分枝した。胞子から形成された菌糸の長さは、接種４８時間後に約６．２～７８．２μｍであった。ＭＣｚＡ培地の中央に１個の成熟した分生子殻を接種すると、菌叢はゆっくりと同心円状に広がった。コロニー面積は２０ｄｐｉで約１４８．４～３９１．３ｍｍ２であった。発芽率および菌糸の長さには菌株間で有意差があったが、コロニー面積には有意差はなかった（表２）。
クレード３およびクレード４に分類された本発明の８菌株について、形態学的特徴を詳細に観察した。胞子の大きさと形、胞子の発芽率、発芽に要する時間、菌糸の長さ、コロニー面積を測定した。胞子は単細胞で、ヒアルロン酸を含み、楕円形から楕円形、約５．７～９．２×２．６～５．０μｍの球形であった。胞子は接種後約１５～２０時間で発芽し、菌糸を伸長させた後、高湿度の条件下で分枝した。胞子から形成された菌糸の長さは、接種４８時間後に約６．２～７８．２μｍであった。ＭＣｚＡ培地の中央に１個の成熟した分生子殻を接種すると、菌叢はゆっくりと同心円状に広がった。コロニー面積は２０ｄｐｉで約１４８．４～３９１．３ｍｍ２であった。発芽率および菌糸の長さには菌株間で有意差があったが、コロニー面積には有意差はなかった（表２）。
【0047】
新規アンペロマイセス属菌８菌株によるうどんこ病菌への寄生性
本発明の８つの新規アンペロマイセス属菌日本分離菌株を、当研究室で継代培養している５種類のうどんこ病菌にそれぞれ接種した。すべての菌株は５種類のうどんこ病菌に感染し、これらのうどんこ病菌のうち４種類のレッドクローバー、メロン、イチゴおよびトマトうどんこ病菌（Ｅ．ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ，Ｐｏ．ｘａｐｈａｎｉｓ，Ｐｏ．ａｐｈａｎｉｓ，Ｐｓ．ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）に成熟分生子殻を形成したが、オオムギうどんこ病菌（Ｂ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）には感染しなかった。メロンうどんこ病菌ＫＭＰ－６Ｎ株に対しては、供試した分離菌株は感染力が強く，１４ｄｐｉでより多くの分生子殻を形成していた。また、アンペロマイセス属菌 ８菌株の菌寄生活性には、３段階のスコアリングによる有意な差は認められなかった（表３）。本結果から、本発明のクレードの異なる８菌株は、１種類のうどんこ病菌だけでなく、複数のうどんこ病菌に感染することが明らかとなった。
本発明の８つの新規アンペロマイセス属菌日本分離菌株を、当研究室で継代培養している５種類のうどんこ病菌にそれぞれ接種した。すべての菌株は５種類のうどんこ病菌に感染し、これらのうどんこ病菌のうち４種類のレッドクローバー、メロン、イチゴおよびトマトうどんこ病菌（Ｅ．ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ，Ｐｏ．ｘａｐｈａｎｉｓ，Ｐｏ．ａｐｈａｎｉｓ，Ｐｓ．ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）に成熟分生子殻を形成したが、オオムギうどんこ病菌（Ｂ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）には感染しなかった。メロンうどんこ病菌ＫＭＰ－６Ｎ株に対しては、供試した分離菌株は感染力が強く，１４ｄｐｉでより多くの分生子殻を形成していた。また、アンペロマイセス属菌 ８菌株の菌寄生活性には、３段階のスコアリングによる有意な差は認められなかった（表３）。本結果から、本発明のクレードの異なる８菌株は、１種類のうどんこ病菌だけでなく、複数のうどんこ病菌に感染することが明らかとなった。
【0048】
【表3】
【0049】
トマトうどんこ病菌（Ｐｓ．ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）における新規アンペロマイセス属菌 Ｘｓ－ｑ株の感染過程
Ｐｓ．ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ ＫＴＰ－０３は、トマトＩ型トリコーム（毛状突起細胞）に分生子を接種してから４８時間以内に、分生子から菌糸（Ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｈｙｐｈａｅ）を形成し、トリコーム細胞への感染に成功した。トリコーム上で伸長したＫＴＰ－０３菌糸が表皮細胞上に到達すると表皮細胞上で活発に生育（侵入・感染）した。ＫＴＰ－０３は、トリコームで生育した菌糸の先端が表皮細胞上に付着してから７日以内に分生子柄を形成した（図３Ａ）。Ｘｓ－ｑ株の胞子を噴霧接種した後、胞子はトマトの葉で発芽し、ＫＴＰ－０３分生子（図３Ｂ）または／および菌糸に侵入・感染し、ＫＴＰ－０３菌糸の内部で細胞から細胞へと生育を続けた（図３Ｃ）。最終的に、Ｘｓ－ｑ株は、８～１０ｄｐｉでＫＴＰ－０３分生子柄に新しい細胞内分生子殻（図３Ｄ）を形成し、約１０～１４ｄｐｉで成熟した分生子殻から胞子（図３Ｅ）を産生・放出された。分生子殻細胞壁の破裂によって細胞内分生子殻から放出された成熟胞子は、宿主であるうどんこ病菌のその後の感染源となった。最終的に、ＫＴＰ－０３菌糸はＸｓ－ｑ株の侵入によって崩壊された（図３Ｆ）。
Ｐｓ．ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ ＫＴＰ－０３は、トマトＩ型トリコーム（毛状突起細胞）に分生子を接種してから４８時間以内に、分生子から菌糸（Ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｈｙｐｈａｅ）を形成し、トリコーム細胞への感染に成功した。トリコーム上で伸長したＫＴＰ－０３菌糸が表皮細胞上に到達すると表皮細胞上で活発に生育（侵入・感染）した。ＫＴＰ－０３は、トリコームで生育した菌糸の先端が表皮細胞上に付着してから７日以内に分生子柄を形成した（図３Ａ）。Ｘｓ－ｑ株の胞子を噴霧接種した後、胞子はトマトの葉で発芽し、ＫＴＰ－０３分生子（図３Ｂ）または／および菌糸に侵入・感染し、ＫＴＰ－０３菌糸の内部で細胞から細胞へと生育を続けた（図３Ｃ）。最終的に、Ｘｓ－ｑ株は、８～１０ｄｐｉでＫＴＰ－０３分生子柄に新しい細胞内分生子殻（図３Ｄ）を形成し、約１０～１４ｄｐｉで成熟した分生子殻から胞子（図３Ｅ）を産生・放出された。分生子殻細胞壁の破裂によって細胞内分生子殻から放出された成熟胞子は、宿主であるうどんこ病菌のその後の感染源となった。最終的に、ＫＴＰ－０３菌糸はＸｓ－ｑ株の侵入によって崩壊された（図３Ｆ）。
【0050】
寄生の間、うどんこ病菌の感染構造体への侵入、特に細胞内分生子殻の形成に注目した。ＫＴＰ－０３に感染したタイプＩトリコーム細胞を利用し、高解像能デジタル顕微鏡を用いてＸｓ－ｑ株のＫＴＰ－０３菌糸内への侵入過程を連続的に観察した。トマト葉のトリコーム近傍にＸｓ－ｑ株の単一分生子殻を接種したところ（図４Ａ）、分生子殻から放出されたＸｓ－ｑ胞子は発芽し、その菌糸をＫＴＰ－０３菌糸に向かって伸長させた（図４Ｂ、４Ｃ）。Ｘｓ－ｑ菌糸のＫＴＰ－０３菌糸への侵入により、ＫＴＰ－０３の分生子柄と菌糸は５ｄｐｉで萎縮を開始し（図４Ｄ）、６ｄｐｉで萎縮し（図４Ｅ）、７ｄｐｉで完全に崩壊した（図４Ｆ）。Ｘｓ－ｑ株の細胞内菌糸は分生子柄上に形成された上部の分生子細胞内から伸長していた（図４Ｄ～４Ｆ）。
【0051】
分生子殻形成に関する詳細な観察には、噴霧接種後にアンペロマイセス菌株を感染させたトマトうどんこ病菌菌叢を用いた。図５ＡはＫＴＰ－０３の分生子柄が形成していることを示している。ＫＴＰ－０３の分生子柄の脚胞と生殖細胞は５～６ｄｐｉで萎縮の兆しを見せた（図５Ｂ）。Ｘｓ－ｑ株の細胞内分生子殻は、６～８ｄｐｉ頃から分生子柄の基部細胞で多く作られ始めた（図５Ｃ）。一方、Ｘｓ－ｑ株の菌糸と分生子殻はＫＴＰ－０３菌糸内で伸長・生育し続けた（図５Ｄ）。未熟なＸｓ－ｑ菌糸は淡黄色であり、成熟後は暗褐色あるいは黒色に近い色になった。その結果、分生子柄は１０～１４ｄｐｉ頃に完全に崩壊した（図５Ｅ）。Ｘｓ－ｑ株に寄生されたトマトうどんこ病菌菌叢に蒸留水２０μＬを滴下したところ、成熟した分生子殻から大量の胞子が放出された。放出された成熟胞子は、その後のＫＴＰ－０３菌糸への感染源となった。
【産業上の利用可能性】
【0052】
本発明の新規アンペロマイセス菌株は、各種うどんこ病の防除に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】