特開 2023-167519 免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液及び培養液生成器

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023167519

(43)【公開日】2023-11-24

(54)【発明の名称】免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液及び培養液生成器

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/742 20150101AFI20231116BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231116BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20231116BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20231116BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20231116BHJP

【ＦＩ】

A61K35/742

A61P37/02

C12N1/20 E

C12M1/00 C

C12N15/31 ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022078776

(22)【出願日】2022-05-12

(71)【出願人】

【識別番号】513036734

【氏名又は名称】株式会社ネイチャーサポート

(74)【代理人】

【識別番号】100181250

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 信介

(72)【発明者】

【氏名】久保 賢介

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029AA08

4B029BB02

4B029CC01

4B029DB19

4B065AA15X

4B065AC20

4B065BC04

4B065BC08

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC64

4C087CA10

4C087NA14

4C087ZB07

(57)【要約】

【課題】人間の健康的な免疫形成を促し、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患を治癒させる免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液と、その培養液を簡易に生成することができる培養液生成器を提供する。
【解決手段】１５０リットルの水に対し３００ｇ以上のバシラス発酵粉末を懸濁し、３０～４５℃の温度に保つとともに、酸素飽和度７０％以上の酸素供給を行って発酵させることにより得られることを特徴とする免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液を生成する培養液生成器１。
【選択図】図１３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１５０リットルの水に対し３００ｇ以上のバシラス発酵粉末を懸濁し、
３０～４５℃の温度に保つとともに、酸素飽和度７０％以上の酸素供給を行って発酵させることにより得られることを特徴とする免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液。

【請求項2】

請求項１に記載の免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液において、
リアルタイムＰＣＲにおいて１×１０^９コピー／ｍｌ以上のバクテリア濃度を持ち、
１６Ｓ ｒＤＮＡのＶ３―Ｖ４ ｒｅｇｉｏｎ ４３０ｂｐの塩基長のＮＳＧ解析で１８０種以上のバクテリアを含有し、
エクトバチルス・フューニキュラスを優勢菌として含有することを特徴とする免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液。

【請求項3】

請求項１又は請求項２に記載の免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液を生成するための培養液生成器であって、
前記培養液を加温するためのヒータ部と、
前記培養液を攪拌するための攪拌部と、
前記培養液の温度を前記ヒータ部により加温して任意の温度に保持させる制御部と、
を備えることを特徴とする免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液生成器。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、人間の健康的な免疫形成を促し、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患を治癒させる免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液及び培養液生成器に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、皮膚炎の治療のために、真菰の発酵粉末（例えば、特許文献１参照）を風呂のお湯に懸濁させ長期にわたり浴水を替えずに入浴する民間療法が一部の愛好家で行われていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開平８ー１３１１５８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ところが、このような民間療法においては、効果はまちまちで科学的な機序の解明もなされることもなく、効果も不安定で副作用も未知数であるという課題があった。さらに、従来の療法では、培養液の温度や酸素供給の適切な管理が行われておらず、不要な雑菌や嫌気性菌が繁殖して悪臭が発生したり、有効なバクテリアが減少し効果が低減したり、有害な病原性菌が繁殖したりするなど、治療に適切な培養液が生成、維持できないという課題があった。

【0005】

本発明は、こうした課題に鑑みなされたもので、人間の健康的な免疫形成を促し、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患を治癒させる免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液と、その培養液を簡易に生成することができる培養液生成器を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の適用例として実現することが可能である。なお、本欄における括弧内の参照符号や補足説明等は、本発明の理解を助けるために、後述する実施形態との対応を示したものであって、本発明を何ら限定するものではない。

【0007】

［適用例１］
適用例１に記載の発明は、
１５０リットルの水に対し３００ｇ以上のバシラス発酵粉末を懸濁し、
３０～４５℃の温度に保つとともに、酸素飽和度７０％以上の酸素供給を行って発酵させることにより得られることを要旨とする免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液である。

【0008】

１５０リットルの水に対し３００ｇ以上のバシラス発酵粉末を懸濁し、３０～４５℃の温度に保つことで新たな発酵が生じ、人体の免疫を刺激し、免疫を改善させる多様な細菌を有する培養液となる。同時に、酸素飽和度７０％以上の酸素供給を行い、好気性を保つことにより、有効細菌が効率よく培養され、有害菌の発生を抑制することができる。

【0009】

このような培養液を用いた入浴療法（以下、バイオ入浴ケア（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐａ Ｃａｒｅ：ＢＳＣと記載する）により、培養液中の多様な細菌により人体の免疫が改善され、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患を抑制することができる。また、基本的な免疫が形成される乳幼児期にＢＳＣを施すことにより、乳幼児の皮膚免疫の発達を促し、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の発症を予防することができる。

【0010】

さらに、このような培養液を飲用することにより、小児から成人において腸管免疫を活性化させることが期待できるとともに、その免疫改善効果により、癌の治療においても効果を発揮することが期待できる。特に、既存の手術、放射線治療、抗癌剤治療、免疫療法との併用において相乗効果が期待できる。

【0011】

［適用例２］
適用例２に記載の免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液は、
適用例１に記載の免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液において、
リアルタイムＰＣＲにおいて１×１０^９コピー／ｍｌ以上のバクテリア濃度を持ち、
１６Ｓ ｒＤＮＡのＶ３―Ｖ４ ｒｅｇｉｏｎ ４３０ｂｐの塩基長のＮＳＧ解析で１８０種以上のバクテリアを含有し、
エクトバチルス・フューニキュラスを優勢菌として含有することを要旨とする。

【0012】

このような培養液では、水にバシラス発酵粉末を懸濁し、適切な温度、酸素供給を行い培養させることで、生きた免疫活性の高いバクテリアを多く繁殖させることができ、特に、粉末状態では検出されないエクトバチルス属芽胞菌であるエクトバチルス・フューニキュラスが最優先菌として繁殖している。

【0013】

エクトバチルス・フューニキュラスのようなバシラス綱バクテリアは地表面で植物を分解し表土を作る機能があり、太古から人の皮膚に接触し皮膚免疫の進化に深く関わってきた。芽胞を形成するものも多くグラム陽性の桿菌として皮膚の免疫刺激に深く関わっており、培養液中においてエクトバチルス・フューニキュラスが最優先菌であるのは、この菌が皮膚免疫を効果的に刺激し人体の免疫改善効果が向上し、アトピー性皮膚炎等のアトピー疾患の治療効果を高めている可能性が高い。

【0014】

［適用例３］
適用例３に記載の免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液生成器は、
適用例１又は適用例２に記載の免疫改善、正常免疫形成を促すための培養液を生成するための培養液生成器であって、
前記培養液を加温するためのヒータ部（３０）と、
前記培養液を攪拌するための攪拌部（２０）と、
前記培養液の温度を前記ヒータ部（３０）により加温して任意の温度に保持させる制御部（４０）と、
を備えることを要旨とする。

【0015】

バシラス発酵粉末を用いた培養液による免疫改善、正常免疫形成効果は、ＢＳＣのような入浴のみならず、皮膚に塗布するローションとして用いても、類似の免疫改善効果が得られることが確認されている。

【0016】

このような培養液生成器（１）は、コンパクトで使いやすく、皮膚の免疫改善、正常免疫形成のための適切な培養条件を簡易に設定することができ、特にローションとして皮膚に塗布するための培養液を、家庭で容易に生成することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明に係る培養液における細菌数を示す図である。

【図2】本発明に係る培養液における微生物細菌叢の分類結果を示す図である。

【図3】ＢＳＣによる治療効果を示す図である。

【図4】ＢＳＣによる免疫の変化を示す図である。

【図5】ＢＳＣによる血清サイトカインの変化の計測値を示す図である。

【図6】ＢＳＣによる血清サイトカインの変化の計測値をグラフ化した図である。

【図7】ＢＳＣによる治療前後の抹消血中ｍＲＮＡの計測値を示す図である。

【図8】ＢＳＣによる治療前後の抹消血中ｍＲＮＡの計測値をグラフ化した図である。

【図9】症例１における治療結果を示す図である。

【図10】症例２における治療結果を示す図である。

【図11】症例３における治療結果を示す図である。

【図12】症例４における治療結果を示す図である。

【図13】培養液生成器の概略の外観図である。

【図14】制御部の概略の構成を示す構成図である。

【図15】培養液生成器における培養液中の真菌に対する加温効果を示す図である。

【図16】培養液生成器における攪拌効果を示す図である

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本発明が適用された実施形態について説明する。なお、本発明の実施の形態は、下記の実施形態に何ら限定されることはなく、本発明の技術的範囲に属する限り様々な形態をとりうる。

【0019】

本発明に係る培養液は、水にバシラス発酵粉末として、真菰発酵粉末を懸濁し、温度管理、酸素供給及び攪拌を行うことで新たな発酵を生じさせる。条件が満たされると嫌気性の腐敗が生じることなく本来のバシラス科細菌の好気的繁殖が生じバシラス発酵粉末内の有機物の代謝分解が行われる。

【0020】

（バシラス発酵粉末の制作）
真菰、葦、茅、稲藁などイネ科の植物や糠、穀類等の植物由来の材料等を用いてバシラス科細菌を多量に含む発酵粉末を作る事が可能である。特に自然状態の水辺の植物（抽水植物）は、バチルス・サブティリス等の有効バシラス科細菌の芽胞が付着しており材料として適している。

【0021】

ここで、バシラス科細菌について説明する。バチラス科細菌は土壌中に広く生息し枯れた植物を分解する従属栄養細菌であり病原性は低い納豆菌もその１つである。バシラス科細菌は、生育環境が悪化すると耐久性のある芽胞を形成し休眠状態となるものも多い。バシラス科細菌は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）のような常に酸素を必要とする偏性好気性細菌とバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）のように、酸素が利用できない環境では嫌気性代謝を行う通性好気性細菌が存在する。

【0022】

酸素、温度管理等の発酵コントロールを行うことで、有効バシラス芽胞を多量（１×１０^８ＣＦＵ／ｇ以上）に含んだバシラス発酵粉末を作ることができる。粉末の粒子サイズは浮遊粒子を増し底への沈殿を少なくするために直径１００μｍ以下が望ましい。バシラス発酵粉末は発酵が二次発酵以上に進みタンパク等の皮膚に抗原となりうる物質や有害物質、有害微生物を低減させておく必要がある。

【0023】

（培養液の製作）
培養液は、水１５０Ｌに３００ｇ以上の真菰発酵粉末などのバシラス発酵粉末を懸濁し、３０～４５℃の温度管理、酸素飽和度７０％以上の酸素供給と攪拌を行い、数日間新たな発酵を生じさせる。条件が満たされると嫌気性の腐敗が生じることなく本来のバシラスの好気的繁殖が生じバシラス発酵粉末内の有機物の代謝分解が行われる。条件が整うと培養液は、リアルタイムＰＣＲにおいて１×１０^９コピー／ｍｌ以上のバクテリア濃度を有することになる。

【0024】

酸素が少ない静水の底付近では、通性好気性細菌や嫌気性菌による嫌気性代謝が行われ人体に有害で悪臭原因ともなる硫化水素（Ｈ２Ｓ、メタン（ＣＨ４）、メルカプタン低級脂肪酸のプロピオン酸やノルマル酪酸などが形成される。これらの悪臭物質は不快感のみならず人体に有害性があり皮膚炎を悪化させる原因となる。

【0025】

また、細菌は至適発育温度によって、１０～２０℃：低温性菌、３０～４０℃：中温性菌、５０～６０℃：高温性菌の３つのグループに分類される。ここで、病原性菌のほとんどが中温性菌に含まれる。一方、土壌菌であるバシラス科細菌は高温でも増殖が可能で芽胞形成能を持つものが多く、一旦芽胞を形成すると１００℃でも不活化できない。

【0026】

そこで、培養液中に活性が高いバシラス菌数を維持し、バシラス発酵粉末や人体から排泄される脂肪やタンパク質の代謝から産生される有害物質を減らすには、好気的な水質条件を維持するための酸素供給、沈殿しやすい懸濁粒子を常に攪拌し、浴槽低層の嫌気条件を改善し有害物質の揮発を促すための攪拌と２４時間培養温度を安全に維持できる温度管理が必要となる。図２（Ａ）に浴水中のバシラス網細菌の一週毎の経時的減数を示す。

【0027】

なお、ＢＳＣにおいては、この培養液は皮膚炎の入浴者１名に対して専用に使用する。また、この培養液は３週間後頃から皮膚炎の治療効果の低下が生じるため３週から４週の間隔で作り替える。原因は主に菌叢の変化、バシラス綱細菌の経時的減数により臨床効果が低下する事が考えられる。

【0028】

（培養液に含まれる細菌数の確認）
Ｔｈｅｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ I I I およびＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）を使用して、以下の各プライマーセットについて標的領域を含むプラスミドＤＮＡをＴａｋａｒａ Ｂｉｏ社に依頼し作成した。

【0029】

次に、この作成されたプラスミドＤＮＡを用いて標準曲線を作成しコピー数を定量した。プライマーは全細菌
Ｅｕｂ３３８Ｆ：ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ
Ｅｕｂ５１８Ｒ：ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ、
真菌類
ＩＴＳ１Ｆ：ＣＴＴＧＧＴＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡ
ＩＴＳ４Ｒ：ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ、
芽胞菌
ｓｐｏＯａ６５５Ｆ：ＧＧＨＧＴＤＣＣＮＧＣＮＣＡＴＡＴＨＡＡ
ｓｐｏＯａ９２３Ｒ：ＧＣＤＡＴＧＡＡＹＴＣＤＧＡＧＴＴＮＧＴＮＧＧ
を使用した。

【0030】

ネイチャーサポート（株）製のバシラス発酵粉末１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、６００ｇをそれぞれ１５０Ｌの浴水に懸濁し４０℃で好気的に培養したと同じ条件をビーカー内で作り５日培養した培養液からＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにて全細菌数をｎ＝３で測定した。外れ値を除き平均値を出し対数グラフ化した。

【0031】

図１にバシラス発酵粉末量に対する細菌数の計測結果を示す。図１（Ａ）は細菌数の計測結果を、図１（Ｂ）は、計測結果を対数グラフ化したものを示す。培養液にはリアルタイムＰＣＲにて１×１０^９～１×１０^１１コピー／ｍｌのバクテリア（全菌数）が認められた。菌数は１５０Ｌの浴水に対しバシラス発酵粉末３００～４００ｇ投与量でほぼ上限値に達する。

【0032】

コストや沈殿物の増加、沈殿物内での嫌気代謝、バイオフィルム増加を考えると入浴剤は３００～４００ｇが適切であり、培養液には１×１０^９コピー／ｍｌ以上のバクテリアが存在することになる。

【0033】

（本発明に係る培養液中に存在する微生物細菌叢の分類結果）
次に、３つの浴槽において療養効果の高い培養開始１週後、２週後、３週後、４週後の浴水、計１２検体の浴水中の微生物細菌叢のメタ１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析を行った。

【0034】

検査はイルミナ社のＮＳＧであるＭｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３(６００サイクル)を使用し、プライマー、３４１ｆ：ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ Ｒ８０６：ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴにて、バクテリアの１６ＳｒＤＮＡのＶ３－Ｖ４ ｒｅｇｉｏｎ ４３０ｂｐの塩基長で実施した。クラス（綱）別の分析はデータベースＲＤＰを利用して８０％の相同率で行った。種別はテクノスルガラボ社のデータベースＤＢ－ＢＡ ｖｅｒ １３．０を利用して９７％の相同率で行った。

【0035】

菌種分類では１検体平均約３５０００リード中４０％程度が分類可能で、１８６～２７１種、平均２３３種が分類された。菌綱レベルでは、上位９種で８９％を占める結果となった。図２（Ａ）に菌綱レベルでの分類結果を示す。

【0036】

人体・土壌・活性汚泥などのＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅと比較して特徴的な点はグラム陽性芽胞菌であるバシラス綱バクテリアが多い点であり、培養液中において優勢菌として存在し最大で３８％を占めている。

【0037】

バクテリア叢は、浴水の入浴剤粉末を投入後浴水内で培養されることで大きく変化する。属分類では４割、種分類では７～８割が置き換わる。その後も人体からの老廃物も加わり菌叢は変化してゆく。

【0038】

培養液中の芽胞菌の占有率は２５～４０％程度である。臨床的に皮膚の免疫刺激に深く関わっていると思われるのはバシラス網のグラム陽性芽胞菌だが経過と共に低下する。浴水の治療効果も低下してゆくため３週～４週で浴水を作り替える必要がある。

【0039】

Ｓｐｅｓｉｅｓ分類が可能であった上位１０種を図２（Ｂ）に示す。上位５種で３８．４％、１０種で４８．９％を占める。培養液中ではエクトバチルス・フューニキュラス（Ｅｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ）が最優勢菌として存在し１８．５％を占めた。

【0040】

ＮＧＳによる発酵粉末のマイクロバイオーム検査ではエクトバチルス・フューニキュラスは全く認められないが抽水植物にわずかに付着していたものが水中という環境下で繁殖し最優勢菌になるものと思われる。

【0041】

１６Ｓ ｒＤＮＡのＶ３－Ｖ４ ｒｅｇｉｏｎ ４３０ｂｐの塩基長でのエクトバチルス・フューニキュラスの塩基配列は、
「ＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＣＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＴＡＣＴＴＡＡＣＧＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＴＧＧＣＧＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＴＴＣＴＴＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴ」であった。

【0042】

結果として、皮膚免疫を刺激し免疫を正常化させるためには培養液中にはエクトバチルス・フューニキュラス（Ｅｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ）を最優勢菌としてバチルス・ジェオトガル（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｏｔｇａｌｉ）、バチルス・ミラビリス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ブレビバチルス・エイディノグルエンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｙｄｉｎｏｇｌｕｅｎｓｉｓ）、メイオサーマス・テラエ（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｔｅｒｒａｅ）が優勢菌として含まれることが必要であると考えられる。

【0043】

グラム陽性菌は主にＴｈ１免疫を誘導しグラム陰性菌はＴｒｅｇ免疫寛容を誘導する可能性がある。マウスでの腸管では、多くの細菌群の中でファーミキューテス門クロストリジウム科グラム陽性、嫌気性、芽胞菌であるセグメント細菌（ｓｅｇｍｅｎｔ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａ）がＩｇＡ、Ｔｈ１、ＴＨ１７の強い免疫誘導を行う事が広く知られている。

【0044】

多くの症例経験から浴水中のファーミキューテス門のバシラス網細菌の経時的減数により臨床効果が低下する事が認められている。よってバシラス綱の最優勢菌であるエクトバチルス・フューニキュラス（Ｅｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ）が免疫作用に最も関与しているものと考えられる。

【0045】

（培養液を用いた入浴療法による免疫改善、正常免疫形成効果確認のための研究結果）
ＢＳＣによる免疫改善、正常免疫形成効果を確認するために、成人重症アトピー性皮膚炎患者に対する免疫改善効果及び新生児・乳幼児期における基本免疫形成ワクチンとしての効果について研究を実施した。

【0046】

（成人重症アトピー性皮膚炎患者に対する免疫改善効果の確認）
患者を以下の３つのグループに分けて実施した。

【0047】

（１）グループ１
５５名の成人重症アトピー性皮膚炎患者に対し、平均７６日の入院でのＢＳＣ後における治療効果を測定。その内２９名においてフローサイトメーターによるＴｈ１／Ｔｈ２の変化を測定。
（２）グループ２
グループ１とは異なる２０名の入院患者でのＢＳＣ前後の血中サイトカインの変化を測定。
（３）グループ３
グループ１、グループ２とは異なる２０名の入院患者でのＢＳＣ前後の白血球のｍＲＮＡの発現変化を測定。

【0048】

（グループ１における治療結果）
日本皮膚科学会の診断基準でアトピー性皮膚炎と診断され重症度は体表面の１０％以上に強い炎症を伴う皮疹があり、ＰＯＥＭ（０―２８）の重症度分類においても１７以上である、１８歳以上の重症患者５５人（平均年齢３４．７歳、男性２４名、女性３１名）の患者を対象としている。

【0049】

培養浴水は１５０Ｌに対しバシラス発酵粉末として４００ｇ程の真菰の発酵粉末を懸濁し、２４時間常時作動し温度管理と酸素の供給を行う専用の培養液循環装置を使用し３５～４２℃の温度で酸素飽和度７０％以上の酸素供給と攪拌を行い、浴槽内で３～７日間新たな発酵を生じさせた。

【0050】

全ての患者は専用の浴室を使用し４～２０週間（平均７５．７日）にわたり、１日２～４時間の入浴を行った。浴水は交換することなく連日使用し３～４週毎あるいは痒みが悪化あるいは改善スピードが低下した場合に交換した。バシラス発酵粉末と専用循環装置はネイチャーサポート社が販売しているものを使用した。

【0051】

入浴剤粉末懸濁から４日程で菌叢の大きな変化が終了する。入浴開始後は人の皮膚の落屑や分泌物を分解する菌叢が発達してくる。また、バクテリアを捕食する原生生物も増加するが２週間程で減少過程になる。菌叢は常に変化し、皮膚免疫は反復的な刺激を受ける事になる。

【0052】

治療効果の判定は患者の自覚症状、血液マーカーを指標とした。自覚症状としては、患者自身が記入する自覚症状のアンケートＰＯＥＭ：Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｅｃｚｅｍａ Ｍｅａｓｕｍｅｎｔ（ＰＯＥＭ０－２８）を使用した。

【0053】

ＰＯＥＭはＥＡＳＩと共に国際的に認められたアトピー性皮膚炎重症度のスケールであり、重症度分類では０－２（ｃｌｅａｒ／ａｌｍｏｓｔ ｃｌｅａｒ）；３－７（ｍｉｌｄ）；８－１６（ｍｏｄｅｒａｔｅ）；１７－２４（ｓｅｖｅｒｅ）；２５－２８（ｖｅｒｙ ｓｅｖｅｒｅ）である。観察者の主観の影響の強いＥＡＳＩに比較し、患者の自覚症状
を重視したＰＯＥＭはより客観性が高い。

【0054】

血液マーカーとしては血清ＴＡＲＣ、総ＩｇＥ、％好酸球の３つを採用し客観性を持たせた。正常値はそれぞれ、ＴＡＲＣ（４５０ｐｇ／ｍｌ以下）、総ＩｇＥ（１７０ＩＵ／ｍｌ以下）、％好酸球（７％以下）である。検査は、臨床検査としてＢＭＬ．Ｃｏ．ＪＰにて行った。特にＴＡＲＣ（Ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ―ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）は、アトピー性皮膚炎の重症度と相関している事が国際的に認められており、２０００以上は中程度、５０００以上は、およそ重症を示す。

【0055】

入院時のベースラインと退院時に得られた数値の比較を標準分布データは、ｔ検定、離散データではノンパラメトリック検定であるウィルコクソン符号付順位和検定を使用して行った。マン・ホイットニ検定は母集団からの選択のテストに使用した。データは平均±標準誤差（ＳＥ）で示した。

【0056】

ｐ≦０．０５は統計的に有意とみなし、*ｐ≦０．０５、**ｐ≦０．０１と表記した。
図３に示すように平均ＰＯＥＭスコアは入院時の２４．７±０．４から退院時には９．５±０．８（ｎ＝５５ Ｐ＜０．００１）へ６１．８％減少させた。重症度は最重症から中等度に軽減したことになる。

【0057】

図３に入退院時における各指標の計測結果を示す。平均ＴＡＲＣレベルは全員が低下し入院時の１１５６２．５±１７０１．８ｐｇ／ｍｌから退院時には、１１９７．３±１９４．３ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝５５ Ｐ＜０．００１）と８９．６％の顕著な減少を示した。ＴＡＲＣは入院後１ヶ月には７２．７％改善しており早期からの改善が認められた。

【0058】

％好酸球は１８．９±１．２％から１０．４±１．０％（ｎ＝５５ Ｐ＜０．００１）に減少し、総ＩｇＥも９０４６．９±１２８８．１ＩＵ／ｍｌから６８６３．７±８９９．０ＩＵ／ｍｌに減少した（ｎ＝５５Ｐ＜０．００１）。

【0059】

全ての患者が、退院時には強い炎症を伴う皮疹は改善され、軽度の炎症や乾燥肌を残すのみ、あるいは正常肌になった。

【0060】

次に、本願発明者は、ＢＳＣの明確な効果についてその機序を考察するうえで免疫の変化を調べた。過去多くの研究が示すようにアトピー性皮膚炎患者は健康人に比較して明確に末梢血Ｔリンパ球サブタイプＣＤ４＋／ＩＦＮγ＋は低く、ＣＤ４＋／ＩＬ－４＋が高いことが判明している。それはアトピー性皮膚炎におけるＴｈ１／Ｔｈ２のアンバランスとしてよく知られている。

【0061】

ここで、Ｔｈ１、Ｔｈ２について説明する。免疫には自然免疫（細胞性免疫）と獲得免疫（液性免疫）の２つの免疫の系統がある。獲得免疫のＴ細胞リンパ球は大きくＴｈ１とＴｈ２の２つの系統に分かれる。Ｔｈ１は自然免疫（細胞性免疫）と連動して機能し、Ｔｈ２は獲得免疫（液性免疫）と連動して機能する。よってＴｈ１とＴｈ２の活動性の比率Ｔｈ１／Ｔｈ２比が免疫体質を把握する判りやすい指標となる。アレルギーではＴｈ２の活動性が高くＴｈ１／Ｔｈ２比は低値となる。アトピー性皮膚炎の重症度を示すバイオマーカーであるＴＡＲＣもＴｈ２免疫に関わるサイトカインの1つである。

【0062】

哺乳類には妊娠中に遺伝子の異なる母子がお互いを免疫的異物として傷害させないように細胞障害性免疫であるＴｈ１免疫を抑制し妊娠を維持させる免疫寛容という仕組みがある。よって出生時、新生児はＴｈ１免疫が抑制されＴｈ２免疫が過剰な状態にある。いわゆるアレルギー体質で生まれてくることになる。

【0063】

本願発明者は便宜的に選択した５５名中２９名の患者に対して、フローサイトメトリー分析を使用して抹消血中のＣＤ４（ＩＦＮγ＋／ＩＬ４－）（便宜的にＴｈ１と呼ぶ）とＣＤ４（ＩＦＮγ－／ＩＬ４＋）（便宜的にＴｈ２と呼ぶ）を測定した。計測した患者は便宜的に選択したが、ＰＯＥＭスコア，ＴＡＲＣ、％好酸球の値はマン・ホィツトニ検定においては母集団と差は認めなかった。

【0064】

図４に基づいて、ＢＳＣによる免疫の変化について説明する。
このときのアトピー性皮膚炎患者群では入院時Ｔｈ１ １６．２±１．２％、Ｔｈ２ ３．９±０．４％であり、Ｔｈ１は健常者平均２１．３％と比較して低く、Ｔｈ２は健常者平均２．７％と比較して高い、Ｔｈ２優位のアトピー特有の免疫状態を示していた。（健常者数値は、「田中らの５３名の健常者の研究：フローサイトメーターを用いた健常成人末梢血におけるヘルパーＴ細胞サブセット（Ｔｈ１、Ｔｈ２）の動態の解析 1998.12臨床病理」による。）

【0065】

しかし、ＢＳＣ前後でＴｈの不均衡は大きく変化し、
Ｔｈ１（ＩＦＮγ＋／ＩＬ４－） 入院時 １６．２±１．２％、退院時 １７．９±１．３％（１０．５％の改善）、Ｐ＜０．０５、
Ｔｈ２（ＩＦＮγ－／ＩＬ４＋） 入院時 ３．９ ±０．４％、退院時 ２．３±０．２％（４０．９％の改善）、Ｐ＜０．０１となり、明確な改善を認めた。

【0066】

（グループ２における治療結果）
次に、アトピー性皮膚炎患者２０名（年齢平均３８．４歳、男性７名、平均入院日数８０日）の入院前後および対照健常者１７名（年齢平均３５．９歳、男性７名）の血清サイトカイン値をマルチプレックスサスペンションアレイにて計測した。

【0067】

ＢＩＯ－ＲＡＤ社Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １７－Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌ（Ｆ－Ｍ５０－０００３１ＹＶ）を使用し１７のサイトカインＩＬ－１β，ＩＬ－２，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－６，ＩＬ－７，ＩＬ－８，ＩＬ－１０，ＩＬ－１２（ｐ７０），ＩＬ－１３，ＩＬ－１７，Ｇ－ＣＳＦ，ＧＭ－ＣＳＦ，ＩＦＮ－ｇａｍｍａ，ＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ），ＭＩＰ－１β，ＴＮＦ－α、そして、ＥＬＩＳＡにてＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ） Ａｓｓａｙ ｒａｎｇｅ１．７－１５．４ｐｇ／ｍＬ．ＴＳＬＰを（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ） Ａｓｓａｙ ｒａｎｇｅ ３．２８－８００ｐｇ／ｍＬにて測定した。検体はｎ２でスタンダードはｎ３で測定した。

【0068】

測定値はスタンダードカーブ範囲外の値でもスタンダードカーブの回帰式から算出された数値を含めている。検出限界未満のものは検出最低値の半分の値とした。統計は入院時と退院時の比較はウィルコクソン符号付順位和検定、入院時と健常対照者の比較はマン・ホイットニ検定を用いた。ｐ≦０．０５は統計的に有意とみなした。また、ＴＡＲＣ、％好酸球については臨床検査としてＢＭＬ．Ｃｏ．ＪＰにて行った数値である。

【0069】

図５、図６に基づき、ＢＳＣ前後の血清サイトカインの変化について説明する。図５は、各サイトカインの計測値、図６は、検査１９項目中、計測可能であった１５項目の計測値をグラフ化したものを示す。検査１９項目中、計測可能であった１５項目の内１０項目ＩＬ－１３．ＩＬ－２．ＩＬ－７．ＩＬ－１７．ＩＬ－１０．ＩＬ－６．ＩＬ－８．ＩＦＮ－γ．ＴＮＦ－α．ＭＣＰ－１はＢＳＣ前後で統計上有意な低下を示した。ＰＯＥＭは２３．７±１．３から９．３±１．１で６１％、ＴＡＲＣは２０１５９±５５２９から２０５８±４１３で８９．８％、％好酸球は２３．５±２．２から８．７±１．０で６３．３％の改善だった。

【0070】

重症アトピー性皮膚炎における各種のサイトカイン群Ｔｈ１（ＩＬ２、ＩＦＮ－γ）Ｔｈ２（ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３）、Ｔｈ１７（ＩＬ１７）、その他炎症誘発性サイトカイン（ ｔｈｅ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）（ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＴＮＦ－α、ＭＣＰ－１）など炎症にかかわるＴＳＬＰ以外の全てのサイトカインの末梢血における過剰分泌が治療により抑制されていた。

【0071】

Ｔｈ１／Ｔｈ２比としてＩＦＮ－γ／ＩＬ１３を指標とすると、ＢＳＣにより２４．６倍（Ｐ＝０．０００１）、ＩＬ２／ＩＬ１３では２２．２倍（Ｐ＝０．０００２）に上昇した。

【0072】

このことから培養液中に含まれる多種多量の免疫刺激物質が皮膚免疫に作用しアレルギーという免疫異常を是正しているものと考えられる。

【0073】

アトピー性皮膚炎の最近の知見では、急性期のＴｈ２サイトカイン主体の炎症に慢性期のＴｈ１７やＴｈ１サイトカインが加わった複雑なサイトカインストーム状態であると考えられているが、ＢＳＣによる免疫刺激はＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善させながら複雑なアレルギー炎症をコントロールしていた。特に典型的なＴｈ２系サイトカインＩＬ１３の低下率は９８．７％と非常に高く特徴的であった。

【0074】

ＩＬ４、ＩＬ１３レセプターの阻害モノクロール抗体製剤であるデュピルマブの登場により、Ｔｈ２サイトカインのアトピー性皮膚炎での影響力の大きさが再認識されＩＬ１３中和抗体であるＴｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ（トラロキヌマブ）も効果を示している。ＩＬ１３は特に皮膚組織での炎症やバリア機能の障害に深く関与していることが示されていることからも、ＩＬ１３の著明な低下はサイトカインレベルでもＢＳＣの効果を実証している。

【0075】

以上より、ＢＳＣによるバクテリア群の皮膚への免疫刺激が何らかの機序でＩＬ１３を中心とする様々な炎症性サイトカインの分泌を制御し、Ｔｈ２．Ｔｈ１７サイトカインを中心とする急性期のアトピー性皮膚炎そしてＴｈ１サイトカインも加わった慢性期のアトピー性皮膚炎を抑制させていると考えられる。

【0076】

（グループ３における治療結果）
ＢＳＣを行った患者の内検体採取ができた２０名（男性１２名、平均年齢３２歳、平均入院日数８１日）の末梢血白血球中ｍＲＮＡの発現をＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｎ３にて検査し、健常者２０名（男性１１名、平均年齢２９．６歳）の検体と比較した。

【0077】

検体はＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｔｕｂｅｓ（ＢＤ社）にて全血を採取し－２０℃にて凍結保存し、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）に示された手技で全血細胞からＲＮＡを分離精製し逆転写試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてｃＤＮＡを合成した。

【0078】

検査項目はＩＦＮＧ．ＩＬ２．ＴＢＸ２１．ＩＬ４．ＩＬ１３．ＩＬ１０．ＧＡＴＡ３．ＲＯＲＣ．ＦＯＸＰ３．ＩＬ１３ＲＡ１．ＩＬ１３ＲＡ２である。

【0079】

ＴＡＲＣ、ＩｇＥ、％好酸球は臨床検査としてＢＭＬ．Ｃｏ．ＪＰにて行い、数値を掲載した。検出率はほぼ１００％であったが、検出限界未満のものは検出最低値の半分の値とした。統計は入院時と退院時の比較はウィルコクソン符号付順位和検定、入院時と健常対照者の比較はマン・ホイットニ検定を用いた。

【0080】

図７．図８に基づき、治療前後の抹消血中ｍＲＮＡの発現について説明する。図７は、各ｍＲＮＡの計測値、図８は、計測値をグラフ化したものを示す。治療前の患者は健常者と比較しＴｈ１系サイトカインであるＩＦＮＧ．ＩＬ２のｍＲＮＡの発現は低く、Ｔｈ１転写因子であるＴＢＸ２１は有意（Ｐ＝０．０００）に低下していた。

【0081】

逆にＴｈ２系サイトカインであるＩＬ４，ＩＬ１０，ＩＬ１３のｍＲＮＡ発現は高値であった。特にＩＬ１３は１５０％（Ｐ＝０．００９）有意に上昇していた。いわゆるＴｈ２優位の典型的なアレルギーパターンを示していた。

【0082】

ＢＳＣにより、健常者より低かったＴｈ１サイトカインのｍＲＮＡは有意に上昇した。ＩＦＮＧ １６．３％（Ｐ＝０．００８）、ＩＬ２ ７０．０％（Ｐ＝０．００３）。それとは対照的に健常者に比較し高値であったＴｈ２サイトカインのＩＬ４、ＩＬ１０、ＩＬ１３は全てが有意ではないが低下した。

【0083】

ＢＳＣによるＴｈ１／Ｔｈ２の上昇が有意に確認され、ＩＦＮＧ／ＩＬ４の治療後上昇は１．０８倍（Ｐ＝０．０４４）、ＩＦＮＧ／ＩＬ１３は１．７２倍（Ｐ＝０．００４）、ＩＬ２／１Ｌ１３は２．６５倍（Ｐ＝０．００１）であった。Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇの転写因子であるＴＢＸ２１は６２．４％（Ｐ＝０．０００）、ＧＡＴＡ３は５７．２％（Ｐ＝０．００１）、ＲＯＲＣは９１．５％（Ｐ＝０．０００）、ＦＯＸＰ３は３６．６％（０．０１５）と、全てが明確な有意差を持って上昇した。

【0084】

このＴｈ１７転写因子ＲＯＲＣの上昇率９１．５％（Ｐ＝０．０００）、Ｔｈ２転写因子ＴＢＸ２１の上昇率は７０％（Ｐ＝０．０００）と共に高く、浴水中のバクテリア群に反応したものと考えられ、血清サイトカインの分泌低下とは逆に転写因子はいずれもが上昇しアトピー性皮膚炎の抑制に関与している可能性がある。

【0085】

グループ２において血清ＩＬ１３の値が９８．７％低下したにも関わらず末梢血のＩＬ１３ｍＲＮＡの低下は２５．２％（Ｐ＝０．２１１）にとどまり乖離があった。またＴｈ１７転写因子ＲＯＲＣのｍＲＮＡ発現は９１．５％上昇したにも関わらず血清ＩＬ１７値は逆に６４．２％低下しており乖離していた。これは、ｍＲＮＡと実際のサイトカイン等の蛋白の生成は緩やかな相関はあるが一致する訳ではないことによるものと考えられる。

【0086】

以上より、ＢＳＣによる皮膚の免疫刺激は全身を流れる末梢血リンパ球の遺伝子発現に明確な影響を与えていると考えられる。

【0087】

（成人重症アトピー性皮膚炎患者に対する免疫改善効果の確認試験のまとめ）
ＢＳＣによるＴＡＲＣの低下率はグループ１ ８９．６％、グループ２ ８９．８％、グループ３ ８６．６％でいずれも明確な改善を示した。この低下率はアトピー性皮膚炎の治療薬として世界的に有効性が認められているデュピルマブ（３００ｍｇを２週毎に１２週間、皮下注射を行い、ＴＡＲＣ低下率は約８２．９％）と同等の効果を示している。ＢＳＣでは、血清ＩＬ１３を９８．７％低下させたが、デュピルマブがＩＬ１３、ＩＬ４に対するブロック抗体である事を考えると同等の効果であることがこの事実からも示唆される。

【0088】

アトピー性皮膚炎はＴｈ１／Ｔｈ２のアンバランスを基軸とするものの自然免疫及び獲得免疫 Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ、ＩＬＣ２等が複雑に絡まった病態であると考えられている。

【0089】

ＢＳＣはバクテリア群による皮膚の免疫刺激を通して全身の免疫のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを是正しながらほとんど全ての炎症性サイトカインを低下させる抑制機能を果たしていると考えられる。

【0090】

（乳幼児期における基礎免疫形成ワクチンとしての効果の確認）
次に、本発明に係る培養液の免疫形成ワクチンとしての効果を確認した治療結果について説明する。乳幼児期における基本的な免疫形成は、新生児期からおよそ２歳までの乳幼児期の限られた短い期間に終了し、乳幼児期に形成された免疫が生涯続く基本免疫になるとされている。

【0091】

そこで、本発明に係る培養液を用いることで、乳幼児の本来の健康的な免疫形成を促すことが期待できる。以下の症例では、皮膚の基本的免疫形成が行われているであろうと考えられる１歳以前の乳幼児にＢＳＣによる免疫刺激を与えた。

【0092】

（症例１）
生後１０ヶ月男児。生後４ヶ月から全身性の中等度アトピー性皮膚炎。食物アレルギーもあり特に卵白に強く反応した。

【0093】

図９に基づき、治療結果を説明する。
男児は、４０日の入院期間中、１日３０分ＢＳＣを行った。退院後は自宅でＢＳＣを１５分程継続した。ＢＳＣ開始後２か月でＴＡＲＣは半分以下に低下、その後もＴＡＲＣ、％好酸球、ＩｇＥは順調に低下し、１年後には皮膚の湿疹は消失し全くの普通肌になった。

【0094】

それと並行して小麦、グルテン、卵白などの食物アレルギーも改善し、食物アレルギー抗体値も大幅に低下、特に卵アレルギーが強く、加熱した卵白（オボムコイド）でも湿疹が生じていたが、オボムコイド抗体も急速に低下し１年後には生卵摂取も可能となった。

【0095】

免疫成長を示すＩｇＧ値がＩｇＥ値を追い越して高くなり、正常な免疫成長が促されている。アレルギー性鼻炎などのアレルギー症状もなく、感冒などのウイルス感染症もほとんどなく、罹患しても速やかに回復する健康的な免疫状態になっている。

【0096】

（症例２）
ＴＡＲＣ上昇を伴うアトピー性皮膚炎を持つ女児。生後３か月から全身性にアトピー性皮膚炎が生じている。図１０に基づき、治療結果を説明する。

【0097】

浴液をタオルで湿らす程度から始め徐々に入浴時間を増加し、入浴時間増加後、４か月後にはＴＡＲＣは、１／３に低下し皮膚炎はほぼ改善し、８か月でＴＡＲＣは正常化。その後も正常皮膚が持続、ＴＡＲＣの軽度の上昇は見られるもののＩｇＥの上昇はなくＩｇＡ及びＩｇＧ抗体は上昇してきており免疫形成は進んでいるものと思われる。

【0098】

（症例３）
図１１に基づき治療結果を説明する。
この症例では母はＩｇＥ７１７９７、ＴＡＲＣ３９８１２の慢性の最重症アトピー患者であり、６歳でＢＳＣを開始した兄もＩｇＥ１１６１１、ＴＡＲＣ２６５５５の最重症タイプのアトピー性皮膚炎であった。

【0099】

しかし、兄と同時に生後８ヶ月でＢＳＣを開始した妹（症例）は、当初は卵白アレルギーがあり乳児湿疹が生じていたが、開始３ヶ月でほぼ消失した。母や兄と全く違う点は３年後の時点でＩｇＥ１３、ＴＡＲＣ１００以下でアレルギー体質が全く見られず普通肌で感冒などの感染症にもほとんど罹患しない健康体となっている点である。

【0100】

アトピー性皮膚炎は家族内発症が多い疾患としても知られており、遺伝的要素と家庭内環境や食事が近似している事が影響すると考えられる。
また、一般的にアトピー性皮膚炎は１歳までに発症した乳児湿疹から始まり次第に重症化してゆく経過をたどるので、２歳までの免疫形成期にＢＳＣによる皮膚免疫刺激を加えることが如何に必要かわかる。もしＢＳＣによる治療を行っていなければ兄と同じ経過をたどった可能性が高い。

【0101】

（症例４）
生後１か月で両頬に乳児湿疹が生じた。この患者にはＢＳＣではなく、培養液をローションとして皮膚に塗布した。ローション塗布開始２か月でステロイドなしでも頬の湿疹は全く出なくなった。この症例はアレルギー体質は軽く、ＩｇＥ、ＴＡＲＣは正常だが食物アレルギーから始まる小児のアレルギー性乳児湿疹を呈していた。

【0102】

ローションによる免疫刺激は皮膚炎を治癒させ、ＩｇＥ抗体上昇を抑制し、卵白へのアレルギー反応を低下させる一方、正常な免疫形成を示すＩｇＧ、ＩｇＡ抗体の上昇を促している。
この免疫発達促進の機序は、初期の乳児湿疹をアトピー性皮膚炎に移行させないために非常に重要である。図１２に各種指標の計測結果を示す。

【0103】

（乳幼児期における基礎免疫形成ワクチンとしての効果の確認試験まとめ）
以上、１歳未満の乳幼児に対するＢＳＣを適用した３症例及びローション使用例１例を提示したが、アトピー性皮膚炎ではアレルギーを示す血液マーカーＴＡＲＣ及び％好酸球が速やかに正常範囲に低下している。

【0104】

生後１年以内にＢＳＣを開始し、１年以上継続した３例の他の成人型ＡＤと全く違う特徴は、全く皮膚炎が存在せず保湿剤すら必要のない普通肌であること。また、アトピー性皮膚炎以外のアレルギー性鼻炎、食物アレルギー等のアレルギー反応もほとんどみられない事。他のインフルエンザ感染なども生じないか非常に軽微で終わる事。など免疫が正常に形成されたと考えられる体質を獲得している。

【0105】

以上から、小児においては、重度のアトピー性皮膚炎等に対しては、ＢＳＣが適切であり、アレルギー反応が低い正常皮膚や乳児湿疹例では培養液をローションとして皮膚に塗布することにより免疫形成を促す事が望まれる。また妊婦がＢＳＣやローションを使用する事により胎児の段階から免疫形成を行うとが可能になる。

【0106】

（ＢＳＣのその他の期待される効果）
近年、分子標的治療薬のニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）に代表されるがん免疫逃避機構の1つを阻害するＰＤ－１ ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤の臨床効果が認められている。効果として癌による免疫的な抑制を是正しＴｈ１／Ｔｈ２バランスを大きく改善させ抗腫瘍効果を発揮することが判っている。

【0107】

これまでの治療結果より、ＢＳＣは免疫チェックポイント阻害剤とは別の機序によりＴｈ１／Ｔｈ２バランスを是正していると考えられることから、ＢＳＣの免疫改善作用は癌の治療においても効果を発揮する可能性は非常に高い。特に、既存の手術、放射線、抗がん剤、免疫療法と併用することで相乗効果が期待できる。

【0108】

（本発明に係る培養液を飲用することにより期待される効果）
本発明に係る培養液を健康飲料として飲用することにより、主に学童期以降の腸管免疫の刺激による免疫改善が期待される。また、妊婦が飲用することで、胎児の段階から免疫の発達を促すことが期待される。さらに、人以外の哺乳類での使用も可能であり近年増加しているペットのアトピー性皮膚炎の抑制効果が期待される。

【0109】

［培養液生成器１の構成］
ＢＳＣを適切に実施するためには、浴槽と特殊な循環機能を有するシステムが必要であり、一般家庭では、費用の面からなかなか準備することができず、ＢＳＣを受けるためには、このような設備が整った場所までいかなければならず、費用と時間がかかってしまう。

【0110】

そこで家庭において簡易に、本発明に係る培養液を生成することができる培養液生成器１について説明する。このような培養液生成器１を用いて生成された培養液を用いて、特にローションとして皮膚に塗布したり、飲用したりすることで、ＢＳＣと類似した効果を得ることができる。

【0111】

図１３に基づき、培養液生成器１の構成について説明する。図１３は、培養液生成器１の概略の外観図である。図８に示すように、培養液生成器１は、培養タンク部１０、攪拌部２０、ヒータ部３０、制御部４０を備える。

【0112】

培養タンク部１０は、水とバシラス発酵粉末を懸濁、培養させる部分であり、ステンレス製で円筒形状に形成されており、一方の端部が、同じくステンレス製の平板で塞がれている。

【0113】

攪拌部２０としては、マグネティックスターラーを用いており、攪拌部本体２１と図示しない攪拌子を備えている。攪拌子は、棒磁石をフッ素樹脂などで封止させたもので、繭状または八角棒状等に形成されており、培養タンク部１０内部に設置される。マグネティックスターラーを使用することにより、撹拌子を培養タンク部１０から容易に取り外すことができるので、培養タンク部１０内の洗浄、殺菌が容易となり、培養タンク部１０内において、レジオネラ等の病原菌が繁殖しやすいバイオフィルムを簡単に除去することが可能となる。

【0114】

攪拌部本体２１は、セラミクス製やプラスティック製の天板２２を備えており、その天板２２の上に、培養タンク部１０が設置される。また、攪拌部本体２１は、図示しないモーターと磁石を備えており、モーターで磁石を回転させ、発生する磁力により、培養タンク部１０内部に設置された攪拌子を回転させる。なお、攪拌部本体２１のモーターの作動は、攪拌部本体２１に設けられた電源スイッチにより制御される。

【0115】

ヒータ部３０は、面状で、培養タンク部１０の外周を巻くように設置されている。

【0116】

制御部４０は、培養タンク部１０と同程度の径を有する円柱形状の外形を有し、培養タンク部１０の上に設置される。図１４に示すように、操作ボタン及び表示画面を備え、その内部にＣＰＵ４１、ＲＯＭ４２，ＲＡＭ４３、Ｉ／Ｏ４４を備えており、このＩ／Ｏ４４を介して操作ボタン、表示画面、攪拌部本体２１及びヒータ部３０と接続されており、操作ボタンによる操作指令を受け、ヒータ部３０による加温温度、加温時間及び攪拌部本体２１のモーター駆動を制御する。

【0117】

制御部４０は、以下の（ア）～（エ）の機能を有している。
（ア）制御部４０の電源入切
（イ）加温温度設定
（ウ）加温時間設定
（エ）設定された温度、時間に基づくヒータ部３０の制御

【0118】

［培養液生成器１の特徴］
このような培養液生成器１を用いることで、バシラス発酵粉末を水に懸濁し、３０～４５℃の温度で常時管理、飽和度７０％以上の酸素を供給させることができ、皮膚の免疫を改善する培養液を簡易に生成することができる。

【0119】

酸素飽和度７０％を維持するために、マグネティックスターラーにより培養液を常時攪拌させている。これにより、専用のポンプやチューブ等が必要な酸素供給装置を必要せず、容易に培養液中に適切な酸素供給を行うことができる。

【0120】

また、培養液生成器１により培養する培養液は、培養液生成器内部で、バイオフィルム内にレジオネラ等の病原性菌が繁殖しないように、６５℃以上の加温減菌が可能であると同時に、１週ごとに作り替えバイオフィルムを長期に残存させないようにする。また、ステンレス製で凹凸のない円筒形状とすることにより、培養液の作り替えの際に、洗浄や次亜塩素酸、モノクラミン、二酸化塩素などの殺菌剤処理を容易に実施することができる。

【0121】

（培養液生成器１における真菌の除去能力）
培養液をフラスコ内で３０～４０℃で攪拌培養し、４０℃培養の１つは１日１０時間４５℃に加熱し真正細菌、芽胞菌類、真菌類の数の変化を確認した。真菌はアトピー性皮膚炎患者では皮膚の真菌であるマラセチアやカンジダに強いアレルギー反応を起こすため、培養液中から消失させる必要がある。

【0122】

リアルタイムＰＣＲによる１μＬ当たりのコピー数を図１５に示す。図１５は、培養液を加温することによる真菌の数の変化を計測した結果を示す。培養液中には真菌類が混入しているがバクテリア総数に比較すると１００分の１程度の含有率である。１日１０時間４５℃まで温度を上げると３日目には真菌類をほぼ消失させることができる。なお、この操作によって細菌数、芽胞菌数の低下は生じない。

【0123】

（マグネティックスターラーによる酸素供給能力）
直径９センチ円筒形ガラス容器内の５００ｍｌの水に３ｇのバシラス発酵粉末を懸濁し４０℃で、長さ２．５ｃｍの攪拌子を使用し攪拌培養し、攪拌しない培養液との酸素飽和度を比較した。

【0124】

図１６に酸素飽和度の計測結果を示す。マグネティックスターラーによる培養液の攪拌により好気培養に充分な飽和度７０％以上の酸素を培養液に供給することができる。

【0125】

［その他の実施形態］
（１）上記実施形態では，培養液を所定温度に加温するために、ヒータ部３０として面状ヒータを培養タンク部１０外周に巻いているが、攪拌部本体２１の天板２２としてホットプレート等を用いて、培養タンク部１０の下部から培養液を加温させても良い。

【0126】

（２）上記実施形態では、培養液の攪拌、酸素供給にマグネティックスターラーを使用しているが、マグネティックスターラーの替わりに洗浄消毒が容易な形状を持つ小型のエアーポンプや循環ポンプを使用して、培養液の攪拌、酸素供給を行っても良い。しかし、レジオネラ等の病原菌が繁殖しやすいバイオフィルムの抑制と除去に配慮する必要がある。

【0127】

（３）上記実施形態では、培養タンク部１０の材質として、ステンレスを用いているが、セラミクス、耐熱・薬品耐性プラスティック等を用いても良い。

【0128】

（４）上記実施形態では、攪拌部２０として、モーターにより磁石を回転させて、その発生する磁場を利用して培養タンク部１０内の攪拌子を回転させ、培養液を攪拌させているが、モーターの替わりに、コイルに電気を流すことで発生する磁場を利用して攪拌子を回転させても良い。

【0129】

（５）上記実施形態では、攪拌部２０の作動入切を攪拌部本体２１に設けられた電源スイッチにより行っているが、攪拌部の作動入切制御を制御部４０において実施させても良い。

【符号の説明】

【0130】

１…培養液生成器、１０…培養タンク部、２０…攪拌部、２１…攪拌部本体、２２…天板、３０…ヒータ部、４０…制御部、４１…ＣＰＵ、４２…ＲＯＭ、４３…ＲＡＭ、４４…Ｉ／Ｏ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】