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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023167699
(43)【公開日】2023-11-24
(54)【発明の名称】乳酸菌表層タンパク質担持リポソーム及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 9/127 20060101AFI20231116BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20231116BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231116BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231116BHJP
A61K 35/744 20150101ALI20231116BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20231116BHJP
【ＦＩ】
A61K9/127
A61K47/42
A61P37/02
A61K45/00
A61K35/744
A61K35/747
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022079070
(22)【出願日】2022-05-12
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】山本 直之
(72)【発明者】
【氏名】陳 政霖
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076BB01
4C076CC07
4C076EE41
4C076FF70
4C076GG01
4C084AA17
4C084MA24
4C084MA52
4C084NA13
4C084ZB07
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC56
4C087MA24
4C087MA52
4C087NA13
4C087ZB26
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、腸管免疫系の細胞に選択的に薬物を伝達できるドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【解決手段】前記課題は、本発明の乳酸菌の表層タンパク質を担持した負電荷を有するリポソームによって解決することができる。
【選択図】なし
【解決手段】前記課題は、本発明の乳酸菌の表層タンパク質を担持した負電荷を有するリポソームによって解決することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳酸菌の表層タンパク質を担持した負電荷を有するリポソーム。
【請求項2】
前記乳酸菌が、レビラクトバチラス・ブレビス、レンチラクトバチラス・ケフィリ、ラクトバチラス・アシドフィルス、ラクトバチラス・ヘルベティカス、ラクトバチラス・クリスパタス、ラクトバチラス・アミロボラス、及びラクトバチラス・ガリナラムからなる群から選択される乳酸菌である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項3】
前記表層タンパク質が、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む表層タンパク質である、請求項２に記載のリポソーム。
【請求項4】
薬剤を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項5】
前記薬剤が免疫調整機能を有する薬剤である、請求項４に記載のリポソーム。
【請求項6】
負電荷を有するリポソームに、乳酸菌の表層タンパク質を添加し、接触される工程を含む、Ｓｌｐ担持リポソームの製造方法。
【請求項7】
前記乳酸菌が、レビラクトバチラス・ブレビス、レンチラクトバチラス・ケフィリ、ラクトバチラス・アシドフィルス、ラクトバチラス・ヘルベティカス、ラクトバチラス・クリスパタス、ラクトバチラス・アミロボラス、及びラクトバチラス・ガリナラムからなる群から選択される乳酸菌である、請求項６に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法。
【請求項8】
前記表層タンパク質が、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む表層タンパク質である、請求項７に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法。
【請求項9】
前記リポソームが薬剤を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法。
【請求項10】
前記薬剤が免疫調整機能を有する薬剤である、請求項９に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法。
【請求項11】
請求項１～３のいずれか一項に記載のリポソームが結合した免疫関連細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳酸菌表層タンパク質担持リポソーム及びその製造方法に関する。本発明によれば、薬剤を体内の組織、特に腸管免疫系細胞に選択的に伝達することができる。
【背景技術】
【0002】
医薬品のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は、体内での溶解性及び安定性、並びに組織への特異的集積が求められる。例えば、腸管免疫系の細胞に選択的に薬物を伝達できるドラッグデリバリーシステムの開発が期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】「バイオチミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）」（オランダ）２００７年、第１７６８巻、ｐ３９３－４００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
従って、本発明の目的は、腸管免疫系の細胞に選択的に薬物を伝達できるドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、腸管免疫系の細胞に選択的に薬物を伝達できるドラッグデリバリーシステムについて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、乳酸菌の表層タンパク質Ｂをリポソームに担持させることにより、薬剤を選択的に腸管免疫系細胞に伝達できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］乳酸菌の表層タンパク質を担持した負電荷を有するリポソーム、
［２］前記乳酸菌が、レビラクトバチラス・ブレビス、レンチラクトバチラス・ケフィリ、ラクトバチラス・アシドフィルス、ラクトバチラス・ヘルベティカス、ラクトバチラス・クリスパタス、ラクトバチラス・アミロボラス、及びラクトバチラス・ガリナラムからなる群から選択される乳酸菌である、［１］に記載のリポソーム、
［３］前記表層タンパク質が、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む表層タンパク質である、［２］に記載のリポソーム、
［４］薬剤を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のリポソーム、
［５］前記薬剤が免疫調整機能を有する薬剤である、［４］に記載のリポソーム、
［６］負電荷を有するリポソームに、乳酸菌の表層タンパク質を添加し、接触される工程を含む、Ｓｌｐ担持リポソームの製造方法、
［７］前記乳酸菌が、レビラクトバチラス・ブレビス、レンチラクトバチラス・ケフィリ、ラクトバチラス・アシドフィルス、ラクトバチラス・ヘルベティカス、ラクトバチラス・クリスパタス、ラクトバチラス・アミロボラス、及びラクトバチラス・ガリナラムからなる群から選択される乳酸菌である、［６］に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法、
［８］前記表層タンパク質が、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む表層タンパク質である、［７］に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法、
［９］前記リポソームが薬剤を含む、［６］～［８］のいずれかに記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法、
［１０］前記薬剤が免疫調整機能を有する薬剤である、［９］に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法、及び
［１１］［１］～［３］のいずれかに記載のリポソームが結合した免疫関連細胞、
に関する。
なお、非特許文献１には、ポジティブチャージのリポソームにラクトバチラス・ブレビスの表層タンパク質を被覆することにより、リポソームが安定化することが記載されている。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］乳酸菌の表層タンパク質を担持した負電荷を有するリポソーム、
［２］前記乳酸菌が、レビラクトバチラス・ブレビス、レンチラクトバチラス・ケフィリ、ラクトバチラス・アシドフィルス、ラクトバチラス・ヘルベティカス、ラクトバチラス・クリスパタス、ラクトバチラス・アミロボラス、及びラクトバチラス・ガリナラムからなる群から選択される乳酸菌である、［１］に記載のリポソーム、
［３］前記表層タンパク質が、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む表層タンパク質である、［２］に記載のリポソーム、
［４］薬剤を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のリポソーム、
［５］前記薬剤が免疫調整機能を有する薬剤である、［４］に記載のリポソーム、
［６］負電荷を有するリポソームに、乳酸菌の表層タンパク質を添加し、接触される工程を含む、Ｓｌｐ担持リポソームの製造方法、
［７］前記乳酸菌が、レビラクトバチラス・ブレビス、レンチラクトバチラス・ケフィリ、ラクトバチラス・アシドフィルス、ラクトバチラス・ヘルベティカス、ラクトバチラス・クリスパタス、ラクトバチラス・アミロボラス、及びラクトバチラス・ガリナラムからなる群から選択される乳酸菌である、［６］に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法、
［８］前記表層タンパク質が、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む表層タンパク質である、［７］に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法、
［９］前記リポソームが薬剤を含む、［６］～［８］のいずれかに記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法、
［１０］前記薬剤が免疫調整機能を有する薬剤である、［９］に記載のＳｌｐ担持リポソームの製造方法、及び
［１１］［１］～［３］のいずれかに記載のリポソームが結合した免疫関連細胞、
に関する。
なお、非特許文献１には、ポジティブチャージのリポソームにラクトバチラス・ブレビスの表層タンパク質を被覆することにより、リポソームが安定化することが記載されている。
【発明の効果】
【0006】
本発明の乳酸菌表層タンパク質担持リポソームによれば、薬剤を体内の組織、特に腸管免疫系細胞に選択的に伝達することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】ＳｌｐＢ担持リポソームの樹状化ＴＨＰ－１細胞への取り込みを示した顕微鏡写真（Ａ）、フローサイトメトリーによる解析（Ｂ）、及び経時的な取り込み量の変化を示したグラフ（Ｃ）である。
【図2】ＳｌｐＢ担持リポソームを取り込んだ樹状化ＴＨＰ－１細胞のサイトカイン（ＩＬ－１２）の産生を示したグラフである。
【図3】ＳｌｐＢ担持リポソームを取り込んだ樹状化ＴＨＰ－１細胞のサイトカイン（ＩＬ－６及びＴＮＦ－α）のｍＲＮＡの増加を示したグラフである。
【図4】ＳｌｐＢ担持リポソームを投与されたマウスにおけるパイエル板のＭ細胞へのＳｌｐＢ担持リポソームの取り込みを示した写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【図5】ＳｌｐＢ担持リポソームを投与されたマウスにおけるパイエル板の抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのＳｌｐＢ担持リポソームの取り込みを示した写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【図6】ＳｌｐＢ担持リポソームを投与されたマウスにおけるパイエル板でのサイトカイン（ＴＮＦ－α及びＩＬ－１２）のｍＲＮＡの増加を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0008】
〔１〕乳酸菌表層タンパク質担持リポソーム
本発明の乳酸菌表層タンパク質担持リポソームは、負電荷を有するリポソームに乳酸菌の表層タンパク質を担持されている。
本発明の乳酸菌表層タンパク質担持リポソームは、負電荷を有するリポソームに乳酸菌の表層タンパク質を担持されている。
【0009】
《乳酸菌》
前記乳酸菌は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えばレビラクトバチラス・ブレビス（L. brevis）、レンチラクトバチラス・ケフィリ（L. kefiri）、ラクトバチラス・アシドフィルス（L. acidophilus）、ラクトバチラス・ヘルベティカス（L. helveticus）、ラクトバチラス・クリスパタス（L. crispatus）、ラクトバチラス・アミロボラス（L. amylovorus）、又はラクトバチラス・ガリナラム（L. gallinarum）が挙げられる。特にはレビラクトバチラス・ブレビスが好ましい。
前記乳酸菌は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えばレビラクトバチラス・ブレビス（L. brevis）、レンチラクトバチラス・ケフィリ（L. kefiri）、ラクトバチラス・アシドフィルス（L. acidophilus）、ラクトバチラス・ヘルベティカス（L. helveticus）、ラクトバチラス・クリスパタス（L. crispatus）、ラクトバチラス・アミロボラス（L. amylovorus）、又はラクトバチラス・ガリナラム（L. gallinarum）が挙げられる。特にはレビラクトバチラス・ブレビスが好ましい。
【0010】
《表層タンパク質》
前記乳酸菌の表層タンパク質は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、好ましくは表層タンパク質Ａ（surface layer protein A;ＳｌｐＡ）又は表層タンパク質Ｂ（surface layer protein B;ＳｌｐＢ）である。ラクトバチラス・アシドフィルス、ラクトバチラス・ヘルベティカス、ラクトバチラス・クリスパタス、ラクトバチラス・アミロボラス、及びラクトバチラス・ガリナラム由来の表層タンパク質はＳｌｐＡである。また、レビラクトバチラス・ブレビス、及びレンチラクトバチラス・ケフィリ由来の表層タンパク質はＳｌｐＢである。
レビラクトバチラス・ブレビス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１、レンチラクトバチラス・ケフィリ由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２、ラクトバチラス・アシドフィルス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３、ラクトバチラス・ヘルベティカス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４、ラクトバチラス・クリスパタス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５、ラクトバチラス・アミロボラス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６、及びラクトバチラス・ガリナラム由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に示す。
前記乳酸菌の表層タンパク質は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、好ましくは表層タンパク質Ａ（surface layer protein A;ＳｌｐＡ）又は表層タンパク質Ｂ（surface layer protein B;ＳｌｐＢ）である。ラクトバチラス・アシドフィルス、ラクトバチラス・ヘルベティカス、ラクトバチラス・クリスパタス、ラクトバチラス・アミロボラス、及びラクトバチラス・ガリナラム由来の表層タンパク質はＳｌｐＡである。また、レビラクトバチラス・ブレビス、及びレンチラクトバチラス・ケフィリ由来の表層タンパク質はＳｌｐＢである。
レビラクトバチラス・ブレビス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１、レンチラクトバチラス・ケフィリ由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２、ラクトバチラス・アシドフィルス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３、ラクトバチラス・ヘルベティカス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４、ラクトバチラス・クリスパタス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５、ラクトバチラス・アミロボラス由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６、及びラクトバチラス・ガリナラム由来の表層タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【0011】
本発明に用いる表層タンパク質は限定されるものではないが、（１）配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
また、本発明に用いる表層タンパク質は、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列において、１－１０のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ樹状細胞への結合活性を有する。
前記（１）配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、（１）配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。また、（２）配列番号１～７で表されるアミノ酸配列において、１～１０のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ樹状細胞への結合活性を有するタンパク質（以下、「機能的等価改変体」と称することがある）は、（２）配列番号１～７で表されるアミノ酸配列において、１～１０のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ樹状細胞への結合活性を有するタンパク質を含む。
前記タンパク質は、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質によって、樹状細胞への結合活性を示すことができ、前記アミノ酸配列中に、樹状細胞への結合活性を示す特定の構造を有している。従って、前記アミノ酸配列中の樹状細胞への結合活性を示す特定の構造が壊されない限りにおいて、他のアミノ酸、ポリペプチド、又はタンパク質が、前記タンパク質に結合しても、本発明のポリペプチドは樹状細胞への結合活性を示すことができる。
また、本発明に用いる表層タンパク質は、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列において、１－１０のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ樹状細胞への結合活性を有する。
前記（１）配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、（１）配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。また、（２）配列番号１～７で表されるアミノ酸配列において、１～１０のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ樹状細胞への結合活性を有するタンパク質（以下、「機能的等価改変体」と称することがある）は、（２）配列番号１～７で表されるアミノ酸配列において、１～１０のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ樹状細胞への結合活性を有するタンパク質を含む。
前記タンパク質は、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質によって、樹状細胞への結合活性を示すことができ、前記アミノ酸配列中に、樹状細胞への結合活性を示す特定の構造を有している。従って、前記アミノ酸配列中の樹状細胞への結合活性を示す特定の構造が壊されない限りにおいて、他のアミノ酸、ポリペプチド、又はタンパク質が、前記タンパク質に結合しても、本発明のポリペプチドは樹状細胞への結合活性を示すことができる。
【0012】
機能的等価改変体における、「１～１０のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加」は、本発明のタンパク質の機能を維持する保存的置換である。「保存的置換」とは、限定されるものではないが、例えばアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることによって実施できる。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷を持つ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。限定されるものではないが、このような保存的置換により、樹状細胞への結合活性を有する機能的等価改変体を得ることができる。樹状細胞への結合活性は、例えば実施例に記載の樹状化ＴＨＰ－１細胞への結合によって確認することができる。
【0013】
《リポソーム》
本発明に用いるリポソームは、負電荷（ネガティブチャージ）を有するリポソームである限りにおいて特に限定されるものではない。リポソームは、ネガティブチャージを有するリポソーム、中性のチャージを有するリポソーム、及びポジティブチャージを有するリポソームに分けることができる。本明細書においては、例えばΖ電位を測定し、０ｍＶ以下のリポソームを、ネガティブチャージリポソームとし、０ｍＶを超えて２０ｍＶ以下のリポソームを中性リポソームとして、２０ｍＶを超えるリポソームを、ポジテイブリポソームとする。リポソームには、カチオン性リポソーム、中性リポソーム、及びアニオン性リポソームがあるが、本発明に用いられるリポソームは、基本的にアニオン性リポソームである。アニオン性リポソームは、脂質として、負荷電脂質を含む。負荷電脂質として、限定されるものではないが、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）が挙げられる。マイナスチャージのリポソームを選択することで、標的組織表層のリセプターに効率よく結合し、薬剤を効率的にデリバリーすることができる。
本発明に用いるリポソームは、負電荷（ネガティブチャージ）を有するリポソームである限りにおいて特に限定されるものではない。リポソームは、ネガティブチャージを有するリポソーム、中性のチャージを有するリポソーム、及びポジティブチャージを有するリポソームに分けることができる。本明細書においては、例えばΖ電位を測定し、０ｍＶ以下のリポソームを、ネガティブチャージリポソームとし、０ｍＶを超えて２０ｍＶ以下のリポソームを中性リポソームとして、２０ｍＶを超えるリポソームを、ポジテイブリポソームとする。リポソームには、カチオン性リポソーム、中性リポソーム、及びアニオン性リポソームがあるが、本発明に用いられるリポソームは、基本的にアニオン性リポソームである。アニオン性リポソームは、脂質として、負荷電脂質を含む。負荷電脂質として、限定されるものではないが、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）が挙げられる。マイナスチャージのリポソームを選択することで、標的組織表層のリセプターに効率よく結合し、薬剤を効率的にデリバリーすることができる。
【0014】
本発明に用いるリポソームは、公知の方法によって、作製することができる。リポソームは、脂質人工膜の一種であり、リン脂質、グリセロ糖脂質を重量比５０％以上の水に、当該脂質が持つゲルー液晶相転移温度以上で懸濁することにより形成される脂質二重層からなる閉鎖小胞である。リン脂質として、レシチン、リゾレシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
【0015】
リポソームは、リン脂質を水中に分散させて形成される脂質二分子膜により囲まれた内水相部分を有する閉鎖小胞であり、そのサイズや脂質二分子の数によって多重相リポソーム（Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＭＬＶ）、大きな一枚膜リポソーム（Ｌａｒｇｅ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＬＵＶ）及び小さな一枚膜リポソーム（Ｓｍａｌｌ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ）の３種類に分類される。
本発明で用いるリポソームは、前記リン脂質の他に、他の膜構成成分を含むことができる。他の膜構成成分としては、例えば、リン脂質以外の脂質及びその誘導体が挙げられる。
本発明で用いるリポソームは公知の方法により調製することができる。本発明においては、リポソームの平均粒子径は特に限定されるものではないが、例えば２０ｎｍ～１００μｍであり、好ましくは２０ｎｍ～１０μｍであり、更に好ましくは２０ｎｍ～１μｍであり、更に好ましくは３０～５００ｎｍであり、更に好ましくは５０～２００ｎｍである。
本発明で用いるリポソームは、前記リン脂質の他に、他の膜構成成分を含むことができる。他の膜構成成分としては、例えば、リン脂質以外の脂質及びその誘導体が挙げられる。
本発明で用いるリポソームは公知の方法により調製することができる。本発明においては、リポソームの平均粒子径は特に限定されるものではないが、例えば２０ｎｍ～１００μｍであり、好ましくは２０ｎｍ～１０μｍであり、更に好ましくは２０ｎｍ～１μｍであり、更に好ましくは３０～５００ｎｍであり、更に好ましくは５０～２００ｎｍである。
【0016】
《薬剤》
本発明のリポソームに含まれる薬剤は、特に限定されるものではないが、好ましくは免疫調整機能を有する薬剤である。免疫調整機能を有する薬剤としては、免疫賦活剤、免疫調整剤、又は免疫抑制剤などが挙げられる。
本発明のリポソームに含まれる薬剤は、特に限定されるものではないが、好ましくは免疫調整機能を有する薬剤である。免疫調整機能を有する薬剤としては、免疫賦活剤、免疫調整剤、又は免疫抑制剤などが挙げられる。
【0017】
免疫賦活剤としては、限定されるものではないが、例えばＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－１２、ＭＩＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４又はＤＲ５／ＴＲＡＩＬ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＲＩＧ－１及びＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、β（１→３）グルカン（例えば、レンチナン又はシゾフィラン）、αガラクトシルセラミド、リシン、ジフテリアトキシン、ＯＮＴＡＫ、ウベニメクス、レンチナン、又は乾燥ＢＣＧが挙げられる。
【0018】
免疫調整剤としては、限定されるものではないが、例えばメトトレキセート、レフルノミド、シクロホスファミド、サイトキサン、Ｉｍｍｕｒａｎ、シクロスポリンＡ、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質（例えば、ＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナール、マロノニトリロアミンデ（ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｏａｍｉｎｄｅ）（例えば、レフルナミド）、Ｔ細胞受容体モジュレーター、サイトカイン受容体モジュレーター、及びモジュレーター肥満細胞モジュレーターが挙げられる。
【0019】
免疫抑制剤としては、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、及びプレドニゾン、スタチン、ラパマイシン又はラパマイシン類縁体などのｍＴＯＲインヒビター、ＴＧＦ－βシグナル剤、ＴＧＦ－β受容体アゴニスト、トリコスタチンＡなどのヒストンデアセチラーゼインヒビター、コルチコステロイド、ロテノンなどのミトコンドリア機能のインヒビター、Ｐ３８インヒビター、６Ｂｉｏ、デキサメタゾン、ＴＣＰＡ－１、又はＩＫＫ ＶＩＩなどのＮＦ－κβインヒビター、アデノシン受容体アゴニスト、ミソプロストールなどのプロスタグランジンＥ２アゴニスト（ＰＧＥ２）、ロリプラムなどのホスホジエステラーゼ４インヒビター（ＰＤＥ４）などのホスホジエステラーゼインヒビター、プロテアソームインヒビター、キナーゼインヒビター、Ｇタンパク質共役受容体アゴニスト、Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニスト、グルココルチコイド、レチノイド、サイトカインインヒビター、サイトカイン受容体インヒビター、サイトカイン受容体アクチベーター、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体アンタゴニスト、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体アゴニスト、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、カルシニューリンインヒビター、ホスファターゼインヒビター、ＴＧＸ－２２１などのＰＩ３ＫＢインヒビター、３－メチルアデニンなどのオートファジーインヒビター、アリールハイドロカーボン受容体インヒビター、プロテアソームインヒビターＩ（ＰＳＩ）、又はＰ２Ｘ受容体ブロッカーなどの酸化ＡＴＰ、シクロスポリン、アザチオプリン、ミゾリビン、バシリキシマブ、タクロリムス水和物、グスペリムス塩酸塩、ミコフェノール酸モフェチル、エベロリムス、プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ＡＴＧ又はＡＬＧ、ＯＫＴ３、ダクリズマブ、バシリキシマブ、コルチコステロイド類、１５－デオキシスペルグアリン、シクロスポリン類、タクロリムス類、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレートモフェチル、６－メルカプトプリン、ブレジニン、ブレキナール、レフルナミド、シクロホスファミド、又はシロリムス類、が挙げられる。
【0020】
《リポソーム組成物》
本発明のリポソーム組成物は、本発明のリポソームを含むことができる。リポソームに薬剤を含む場合、本発明のリポソーム組成物は、医薬組成物として、用いることができる。本発明のリポソーム組成物は、ドラッグデリバリーシステムに用いることができる。
本発明のリポソーム組成物は、本発明のリポソームを含むことができる。リポソームに薬剤を含む場合、本発明のリポソーム組成物は、医薬組成物として、用いることができる。本発明のリポソーム組成物は、ドラッグデリバリーシステムに用いることができる。
【0021】
本発明の医薬組成物の対象となる疾患は、リポソームに含まれる薬剤に応じて、適宜選択することができるが、例えば、免疫関連疾患である。
本発明のリポソーム組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができるが、好ましくは経口剤である。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
本発明のリポソーム組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができるが、好ましくは経口剤である。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【0022】
《ドラッグデリバリーシステム》
本発明の乳酸菌表層タンパク質担持リポソーム及びそれを含むリポソーム組成物は、ドラッグデリバリーシステムに用いることができる。本発明のドラッグデリバリーシステムにおける標的細胞は、前記表層タンパク質が結合できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば免疫関連細胞であり、好ましくは樹状細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、又はＭ細胞（microfold細胞）である。免疫関連細胞に、本発明のドラッグデリバリーシステムによって、免疫調整機能を有する薬剤を効率的に伝達することができる。本発明のドラッグデリバリーシステムの対象疾患としては、限定されるものではないが、免疫関連疾患が挙げられる。
本発明の乳酸菌表層タンパク質担持リポソーム及びそれを含むリポソーム組成物は、ドラッグデリバリーシステムに用いることができる。本発明のドラッグデリバリーシステムにおける標的細胞は、前記表層タンパク質が結合できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば免疫関連細胞であり、好ましくは樹状細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、又はＭ細胞（microfold細胞）である。免疫関連細胞に、本発明のドラッグデリバリーシステムによって、免疫調整機能を有する薬剤を効率的に伝達することができる。本発明のドラッグデリバリーシステムの対象疾患としては、限定されるものではないが、免疫関連疾患が挙げられる。
【0023】
〔２〕Ｓｌｐ担持リポソームの製造方法
本発明のＳｌｐ担持リポソームの製造方法は、負電荷を有するリポソームに、乳酸菌の表層タンパク質を添加し、接触される工程を含む。
本発明のＳｌｐ担持リポソームの製造方法は、負電荷を有するリポソームに、乳酸菌の表層タンパク質を添加し、接触される工程を含む。
【0024】
《接触工程》
接触工程は、負電荷を有するリポソームに、乳酸菌の表層タンパク質を添加し、接触され、乳酸菌の表層タンパク質をリポソームに担持させる。乳酸菌の表層タンパク質の濃度は、リポソームに表層たんぱく質が担持される限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば１０～１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは２０～５００μｇ／ｍＬである。
反応温度は、特に限定されないが、例えば１～５０℃であり、好ましくは５～４０℃であり、更に好ましくは１５～３５℃である。
反応時間も特に限定されるものではないが、例えば１０分～１０時間であり、好ましくは３０分～5時間であり、より好ましくは１～３時間である。
接触工程は、負電荷を有するリポソームに、乳酸菌の表層タンパク質を添加し、接触され、乳酸菌の表層タンパク質をリポソームに担持させる。乳酸菌の表層タンパク質の濃度は、リポソームに表層たんぱく質が担持される限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば１０～１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは２０～５００μｇ／ｍＬである。
反応温度は、特に限定されないが、例えば１～５０℃であり、好ましくは５～４０℃であり、更に好ましくは１５～３５℃である。
反応時間も特に限定されるものではないが、例えば１０分～１０時間であり、好ましくは３０分～5時間であり、より好ましくは１～３時間である。
【0025】
前記接触工程における「乳酸菌」、「表層タンパク質」、及び「薬剤」は、前記「乳酸菌表層タンパク質担持リポソーム」に記載の「乳酸菌」、「表層タンパク質」、及び「薬剤」を限定せずに用いることができる。
【0026】
リポソームに薬剤を封入する方法は、公知の方法を用いることができる。具体的には、凍結融解法、逆相蒸発法、水和法などを用いることができる。
【0027】
〔３〕免疫関連細胞
本発明の免疫関連細胞は、本発明のリポソームが結合しているものである。前記免疫関連細胞は、本発明のリポソームが結合できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば樹状細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、又はＭ細胞（microfold細胞）である。
本発明の免疫関連細胞は、本発明のリポソームが結合しているものである。前記免疫関連細胞は、本発明のリポソームが結合できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば樹状細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、又はＭ細胞（microfold細胞）である。
【実施例0028】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0029】
《実施例１》
本実施例では、レビラクトバチラス・ブレビスから表層タンパク質（ＳｌｐＢ）を回収し、リポソームに担持させた。そして、ＳｌｐＢ担持リポソームの樹状化細胞への取り込みを検討した。
Japan Collection of Microorganismsから入手したLevilactobacillus brevis JCM 1059を、ＭＲＳ培地（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA）で、３０℃で嫌気的に培養し、５，５３０×ｇで１０分間遠心分離することにより、増殖の定常期に回収した。ペレットをＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））で１回洗浄し、１Ｍ塩化リチウム溶液で２回洗浄して、細菌表面から表面層関連タンパク質を除去した。細胞を５Ｍ塩化リチウム溶液とインキュベートすることによって、ＳｌｐＢを細胞から放出した。L. brevis JCM 1059から抽出した画分を、３Ｌの脱イオン水に対して１８時間透析した。透析したＳｌｐＢの純度は、銀で染色し、ドデシル硫酸ナトリウム－１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって確認した。その濃度はブラッドフォードアッセイ（ナカライテスク、京都、日本）によって推定した。高濃度のＳｌｐＢが必要な場合は、タンパク質の濃度を、１０Ｋ遠心フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アイルランド、コーク）を使用し、製造元のプロトコルに従った、遠心ろ過によって得た。
本実施例では、レビラクトバチラス・ブレビスから表層タンパク質（ＳｌｐＢ）を回収し、リポソームに担持させた。そして、ＳｌｐＢ担持リポソームの樹状化細胞への取り込みを検討した。
Japan Collection of Microorganismsから入手したLevilactobacillus brevis JCM 1059を、ＭＲＳ培地（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA）で、３０℃で嫌気的に培養し、５，５３０×ｇで１０分間遠心分離することにより、増殖の定常期に回収した。ペレットをＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））で１回洗浄し、１Ｍ塩化リチウム溶液で２回洗浄して、細菌表面から表面層関連タンパク質を除去した。細胞を５Ｍ塩化リチウム溶液とインキュベートすることによって、ＳｌｐＢを細胞から放出した。L. brevis JCM 1059から抽出した画分を、３Ｌの脱イオン水に対して１８時間透析した。透析したＳｌｐＢの純度は、銀で染色し、ドデシル硫酸ナトリウム－１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって確認した。その濃度はブラッドフォードアッセイ（ナカライテスク、京都、日本）によって推定した。高濃度のＳｌｐＢが必要な場合は、タンパク質の濃度を、１０Ｋ遠心フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アイルランド、コーク）を使用し、製造元のプロトコルに従った、遠心ろ過によって得た。
【0030】
凍結乾燥したリポソーム（以下、ＬＰと称することがある）を脱イオン水中で再水和し、最終濃度を５０ｍｇ／ｍＬにした。次に、ｍｇのリポソームごとに、１００μＭのＦＩＴＣ又はＰＩ、又は２０μｇのＣｙ３－ＯＶＡを添加し、カプセル化を容易にするために２０℃で６０分間撹拌した（ＦＩＴＣ－ＬＰ、ＰＩ－ＬＰ、又はＣｙ３－ＯＶＡ－ＬＰを生成した）。ＬＰを１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、脱イオン水で洗浄することにより、過剰な色素又はタンパク質を除去した。ＳｌｐＢでコーティングされたＬＰ（ＳｌｐＢ－ＰＩ－ＬＰ）は、１ｍｇのＬＰを４００μｇのＳｌｐＢと２０℃でインキュベートし、混合物を１２０分間撹拌することによって調製した。
【0031】
理研セルバンクから入手したＴＨＰ－１単球（ＪＲＣＢ０１１２）を、加湿インキュベーター内で、５．０％ＣＯ２で、９．０９％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。ＴＨＰ－１単球をＴＨＰ－１由来樹状細胞（ＴＨＰ－１ ＤＣ）に分化させるために、ＴＨＰ－１単球を９．１％熱不活化ＦＢＳ及び２０ｎＭのＰＭＡを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で４８時間インキュベートし、７２時間静置した。その後、９．１％熱不活化ＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－４を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、４８時間で分化させた。次に、ＴＨＰ－１樹状化細胞（以下、ＴＨＰ－１ ＤＣと称することがある）を、５００μｇ／ｍＬのリポソームＰＩ（ＰＩ－ＬＰ）又はＳｌｐＢ－ＰＩ－ＬＰとともに、３７℃で、さまざまな時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ（－）で２回洗浄して過剰なＰＩ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－ＰＩ－ＬＰを除去し、剥離し、Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁した。懸濁液を４０μｍセルストレーナーでろ過し、ＥＣ８００フローサイトメトリーアナライザー（Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
ＴＨＰ－１ ＤＣによるＳｌｐＢ－ＬＰのエンドサイトーシスの状態を観察するために、ＴＨＰ－１ＤＣをＣｙ３－ＯＶＡ－ＬＰ及びＳｌｐＢ－Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰとそれぞれ３０分及び７０分間共培養し、３．７％ホルムアルデヒド及び０．８％メタノールで固定し、そして３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（－）でブロッキングした。次に、ＤＣ－ＳＩＧＮを、ヒトＤＣ－ＳＩＧＮに対する抗体、続いてマウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合抗体とインキュベートすることにより標識した。すべての抗体は、使用前に１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（－）で希釈した。そしてＤＡＰＩカウンター染色を行った。最後に、ＴＨＰ－１ ＤＣを洗浄し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７８０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、東京、日本）で観察した。
図１Ａに示すように、ＴＨＰ－１ＤＣによるＳｌｐＢ－ＬＰ及びＬＰの取り込みが確認された。また、Ｃｙ３の強度の連続的な増加が観察された。更に、７０分でＳｌｐＢ－Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰと共培養したＴＨＰ－１ ＤＣのピクセルあたりの平均強度は、Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰと共培養したＴＨＰ－１ ＤＣの平均強度よりも高く、ＳｌｐＢがＴＨＰ－１細胞へのリガンド媒介エンドサイトーシスを促進することを示していた。ＳｌｐＢ－ＰＩ－ＬＰは、６０分（２．４２倍）及び７０分（２．３３倍）の共培養後にＰＩ－ＬＰよりも有意に高い取り込みを示した（図１Ｃ）。
ＴＨＰ－１ ＤＣによるＳｌｐＢ－ＬＰのエンドサイトーシスの状態を観察するために、ＴＨＰ－１ＤＣをＣｙ３－ＯＶＡ－ＬＰ及びＳｌｐＢ－Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰとそれぞれ３０分及び７０分間共培養し、３．７％ホルムアルデヒド及び０．８％メタノールで固定し、そして３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（－）でブロッキングした。次に、ＤＣ－ＳＩＧＮを、ヒトＤＣ－ＳＩＧＮに対する抗体、続いてマウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合抗体とインキュベートすることにより標識した。すべての抗体は、使用前に１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（－）で希釈した。そしてＤＡＰＩカウンター染色を行った。最後に、ＴＨＰ－１ ＤＣを洗浄し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７８０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、東京、日本）で観察した。
図１Ａに示すように、ＴＨＰ－１ＤＣによるＳｌｐＢ－ＬＰ及びＬＰの取り込みが確認された。また、Ｃｙ３の強度の連続的な増加が観察された。更に、７０分でＳｌｐＢ－Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰと共培養したＴＨＰ－１ ＤＣのピクセルあたりの平均強度は、Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰと共培養したＴＨＰ－１ ＤＣの平均強度よりも高く、ＳｌｐＢがＴＨＰ－１細胞へのリガンド媒介エンドサイトーシスを促進することを示していた。ＳｌｐＢ－ＰＩ－ＬＰは、６０分（２．４２倍）及び７０分（２．３３倍）の共培養後にＰＩ－ＬＰよりも有意に高い取り込みを示した（図１Ｃ）。
【0032】
《実施例２》
本実施例では、αガラクトシルセラミド（以下、α－ＧａｌＣｅｒと称することがある）を含むＳｌｐＢ担持リポソームを取り込んだ樹状化細胞（ＴＨＰ－１ ＤＣ）のサイトカインの産生を検討した。
具体的には、α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ（Ｒｅｇｉｍｍｕｎｅ（Ｄａｔｏｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｔａｉｐｅｉ）から寄贈）、５ｍｇのα－ＧａｌＣｅｒ及び約５０ｍｇのリポソーム／ｍＬ）を使用して、ＳｌｐＢによるリポソーム取り込みの増強が薬物の治療効果に及ぼす影響を評価した。実施例１と同様に、ＳｌｐＢ（２０ｍｇ）をｍＬのα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰにコーティングし、ＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰを調製した。α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰを最終濃度１０μＬのα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ／ｍＬ細胞培養培地でＴＨＰ－１ ＤＣに添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、培地を等量の新鮮な培地と交換した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートし、細胞外サイトカインの産生を、製造元のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡで評価した。
図２に示すように、ＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ処理によって、ＩＬ－１２産生が劇的に誘導された。
本実施例では、αガラクトシルセラミド（以下、α－ＧａｌＣｅｒと称することがある）を含むＳｌｐＢ担持リポソームを取り込んだ樹状化細胞（ＴＨＰ－１ ＤＣ）のサイトカインの産生を検討した。
具体的には、α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ（Ｒｅｇｉｍｍｕｎｅ（Ｄａｔｏｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｔａｉｐｅｉ）から寄贈）、５ｍｇのα－ＧａｌＣｅｒ及び約５０ｍｇのリポソーム／ｍＬ）を使用して、ＳｌｐＢによるリポソーム取り込みの増強が薬物の治療効果に及ぼす影響を評価した。実施例１と同様に、ＳｌｐＢ（２０ｍｇ）をｍＬのα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰにコーティングし、ＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰを調製した。α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰを最終濃度１０μＬのα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ／ｍＬ細胞培養培地でＴＨＰ－１ ＤＣに添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、培地を等量の新鮮な培地と交換した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートし、細胞外サイトカインの産生を、製造元のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡで評価した。
図２に示すように、ＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ処理によって、ＩＬ－１２産生が劇的に誘導された。
【0033】
《実施例３》
本実施例では、α－ＧａｌＣｅｒを含むＳｌｐＢ担持リポソームを取り込んだ樹状化細胞（ＴＨＰ－１ ＤＣ）のサイトカインの産生を、ｍＲＮＡの測定によって検討した。
α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰを最終濃度１０μＬのα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ／ｍＬ細胞培養培地でＴＨＰ－１ＤＣに添加し、３７℃で、６０分間共培養した。細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、培地を等量の新鮮な培地と交換した。細胞をα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰで処理してから８時間、１６時間、及び２４時間後に細胞を収集し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、製造元のプロトコルに従って、ＲＮＡを抽出した。 ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）によって、ＲＮＡの質と量を評価した後、８時間、１６時間、及び２４時間に抽出された等量のＲＮＡサンプルを混合し、製造元の指示に従ってｑＰＣＲＲＴマスターミックスを使用し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した。得られたｃＤＮＡをヌクレアーゼフリー水で５倍に希釈し、特異的プライマー（表１）及びＳＹＢＲｑＰＣＲミックスと混合した。混合物は、製造元の指示に従って、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州、米国）でインキュベートした。得られたデータは、ハウスキーピング遺伝子であるβ－アクチンのｍＲＮＡ発現レベルに対して補正した。
本実施例では、α－ＧａｌＣｅｒを含むＳｌｐＢ担持リポソームを取り込んだ樹状化細胞（ＴＨＰ－１ ＤＣ）のサイトカインの産生を、ｍＲＮＡの測定によって検討した。
α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰを最終濃度１０μＬのα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ／ｍＬ細胞培養培地でＴＨＰ－１ＤＣに添加し、３７℃で、６０分間共培養した。細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、培地を等量の新鮮な培地と交換した。細胞をα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰで処理してから８時間、１６時間、及び２４時間後に細胞を収集し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、製造元のプロトコルに従って、ＲＮＡを抽出した。 ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）によって、ＲＮＡの質と量を評価した後、８時間、１６時間、及び２４時間に抽出された等量のＲＮＡサンプルを混合し、製造元の指示に従ってｑＰＣＲＲＴマスターミックスを使用し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した。得られたｃＤＮＡをヌクレアーゼフリー水で５倍に希釈し、特異的プライマー（表１）及びＳＹＢＲｑＰＣＲミックスと混合した。混合物は、製造元の指示に従って、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州、米国）でインキュベートした。得られたデータは、ハウスキーピング遺伝子であるβ－アクチンのｍＲＮＡ発現レベルに対して補正した。
【0034】
【表1】
【0035】
《実施例４》
本実施例では、ＳｌｐＢ担持リポソームのマウスパイエル板のＭ細胞への取り込みを検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、１２週齢、２０～２５ｇ）を、日本ノチャールズリバー研究所から入手した。動物実験は、東京工業大学の動物実験委員会（認可番号Ｄ２０１９００６－２）により承認され、ガイドラインに従って実施された。ＦＩＴＣ－ＯＶＡ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－ＦＩＴＣ－ＯＶＡ－ＬＰ（２００μＬ、それぞれ２ｍｇのリポソームと４０μｇのＦＩＴＣ－ＯＶＡを含む）を、１時間絶食させたマウスに強制経口投与した（ｎ＝３）。投与１時間後、マウスを安楽死させ、腸を切除した。次に、腸をＰＢＳ（－）で洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド及び０．８％メタノールで固定した。ホールマウントされたパイエル板切片を準備するために、パイエル板を各腸から分離し、腸間膜側で縦方向に切断した。成熟Ｍ細胞を染色するために、全体のマウントされた切片を、マウスＧＰ２に対するウサギ抗体、続いてウサギＩｇＧに対するＤｙＬｉｇｈｔ４０５結合抗体とともにインキュベートした。染色された組織は、レーザー走査型顕微鏡ＬＳＭ ７８０（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して観察された。
本実施例では、ＳｌｐＢ担持リポソームのマウスパイエル板のＭ細胞への取り込みを検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、１２週齢、２０～２５ｇ）を、日本ノチャールズリバー研究所から入手した。動物実験は、東京工業大学の動物実験委員会（認可番号Ｄ２０１９００６－２）により承認され、ガイドラインに従って実施された。ＦＩＴＣ－ＯＶＡ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－ＦＩＴＣ－ＯＶＡ－ＬＰ（２００μＬ、それぞれ２ｍｇのリポソームと４０μｇのＦＩＴＣ－ＯＶＡを含む）を、１時間絶食させたマウスに強制経口投与した（ｎ＝３）。投与１時間後、マウスを安楽死させ、腸を切除した。次に、腸をＰＢＳ（－）で洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド及び０．８％メタノールで固定した。ホールマウントされたパイエル板切片を準備するために、パイエル板を各腸から分離し、腸間膜側で縦方向に切断した。成熟Ｍ細胞を染色するために、全体のマウントされた切片を、マウスＧＰ２に対するウサギ抗体、続いてウサギＩｇＧに対するＤｙＬｉｇｈｔ４０５結合抗体とともにインキュベートした。染色された組織は、レーザー走査型顕微鏡ＬＳＭ ７８０（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して観察された。
【0036】
図４Ａに示すようにＦＩＴＣ－ＯＶＡからの信号のほとんどは、Ｍ細胞上のＧＰ－２からの信号と重複していた。ＧＰ２に対するＦＩＴＣの強度の比率は、ＳｌｐＢ－ＬＰを投与した場合、パイエル板で２．０３倍高かった（図４Ｂ）。
【0037】
《実施例５》
本実施例では、ＳｌｐＢ担持リポソームのマウスパイエル板の抗原提示細胞への取り込みを検討した。
Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰ（２００μＬ、それぞれ４００μｇのリポソームと８μｇのＣｙ３－ＯＶＡを含む）を、１時間絶食させたマウスに強制経口投与した（ｎ＝３）。投与の１時間後にマウスを安楽死させ、腸を切除し、ＰＢＳ（－）で洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド及び０．８％メタノールで固定した。凍結切片の準備のために、２つのパイエル板を各腸からランダムにサンプリングし、３０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液に置換し、最適な切断温度のコンパウンドに包埋し、クリオスタットでドームを通って横方向に切断した。ＡＰＣを染色するために、切片をマウスＣＤ２３に対するウサギ抗体、続いてウサギＩｇＧに対するＤｙＬｉｇｈｔ４０５結合抗体とともにインキュベートした。染色された組織は、蛍光顕微鏡ＺＯＥ蛍光Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で観察した。
本実施例では、ＳｌｐＢ担持リポソームのマウスパイエル板の抗原提示細胞への取り込みを検討した。
Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰ（２００μＬ、それぞれ４００μｇのリポソームと８μｇのＣｙ３－ＯＶＡを含む）を、１時間絶食させたマウスに強制経口投与した（ｎ＝３）。投与の１時間後にマウスを安楽死させ、腸を切除し、ＰＢＳ（－）で洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド及び０．８％メタノールで固定した。凍結切片の準備のために、２つのパイエル板を各腸からランダムにサンプリングし、３０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液に置換し、最適な切断温度のコンパウンドに包埋し、クリオスタットでドームを通って横方向に切断した。ＡＰＣを染色するために、切片をマウスＣＤ２３に対するウサギ抗体、続いてウサギＩｇＧに対するＤｙＬｉｇｈｔ４０５結合抗体とともにインキュベートした。染色された組織は、蛍光顕微鏡ＺＯＥ蛍光Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で観察した。
【0038】
図５Ａに示すように、Ｃｙ３－ＯＶＡはマウスパイエル板の限られた領域で観察された。対照的に、パイエル板に広く分布しているＣｙ３－ＯＶＡ－ＬＰは、主に上皮下ドーム、濾胞間領域、及び胚中心に見られた（図５Ａ）。更に、ＳｌｐＢ－ＬＰは抗原提示細胞（ＡＰＣ）であるＣＤ２３＋細胞に局在していたのに対し、ＬＰはＣＤ２３－細胞に局在していた（図５Ａ）。ＳｌｐＢがＣｙ３－ＯＶＡ－ＬＰと結合した場合（図５Ｂ）、Ｃｙ３－ＯＶＡ－ＬＰの信号強度がパイエル板のマウスで有意に高いことがわかった。この結果は、パイエル板で、ＳｌｐＢがＭ細胞を介してＡＰＣへのリポソームのトランスサイトーシスを促進できることを示している。
【0039】
《実施例６》
本実施例では、ＳｌｐＢ担持リポソームが投与されたマウスのパイエル板におけるサイトカインのｍＲＮＡの発現を検討した。
α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ（２００μＬ、それぞれ８μＬのα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰを含む）をＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、９週齢、１８～２３ｇ）に強制経口投与した。経口投与の８時間後、マウスを安楽死させ、パイエル板を分離して急速凍結した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを使用し、製造元のプロトコルに従ってパイエル板からＲＮＡを抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して質と量を評価した。ＲＴ－ｑＰＣＲは実施例３のように実施した。データは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現レベルに対して補正した。
本実施例では、ＳｌｐＢ担持リポソームが投与されたマウスのパイエル板におけるサイトカインのｍＲＮＡの発現を検討した。
α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ又はＳｌｐＢ－α－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰ（２００μＬ、それぞれ８μＬのα－ＧａｌＣｅｒ－ＬＰを含む）をＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、９週齢、１８～２３ｇ）に強制経口投与した。経口投与の８時間後、マウスを安楽死させ、パイエル板を分離して急速凍結した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを使用し、製造元のプロトコルに従ってパイエル板からＲＮＡを抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して質と量を評価した。ＲＴ－ｑＰＣＲは実施例３のように実施した。データは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現レベルに対して補正した。
【0040】
【産業上の利用可能性】
【0041】
本発明の乳酸菌表層タンパク質担持リポソームはドラッグデリバリーシステムに用いることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】