2023-168916 レジオネラ属菌による汚染度の判定方法及び水処理方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023168916

(43)【公開日】2023-11-29

(54)【発明の名称】レジオネラ属菌による汚染度の判定方法及び水処理方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20231121BHJP

   C02F 1/50 20230101ALI20231121BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C02F1/50 510A

C02F1/50 510C

C02F1/50 520B

C02F1/50 520J

C02F1/50 520K

C02F1/50 520L

C02F1/50 520Z

C02F1/50 531J

C02F1/50 531P

C02F1/50 532E

C02F1/50 560E

C02F1/50 560Z

C02F1/50 531M

C02F1/50 531L

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022080302

(22)【出願日】2022-05-16

(71)【出願人】

【識別番号】000001063

【氏名又は名称】栗田工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100086911

【弁理士】

【氏名又は名称】重野 剛

(74)【代理人】

【識別番号】100144967

【弁理士】

【氏名又は名称】重野 隆之

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 若子

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ18

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QS25

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】レジオネラ属菌による汚染を迅速に判定することができる方法及びこの判定方法に基づいた水処理方法を提供する。
【解決手段】対象水中のレジオネラ属特異的リボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡの濃度を定量し、あらかじめ設定した基準値と比較することにより、レジオネラ属菌による汚染度を判定する、レジオネラ属菌による汚染度の判定方法。この判定結果に基づいて殺菌処理及び／又はスライムコントロール処理を行うことを特徴とする水処理方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象水中のレジオネラ属特異的リボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡの濃度を定量し、あらかじめ設定した基準値と比較することにより、レジオネラ属菌による汚染度を判定する、レジオネラ属菌による汚染度の判定方法。

【請求項2】

前記基準値は１０^４copies/10ml～１０^５copies/10mlの間から選定された値であり、
前記ＤＮＡ濃度が該基準値以上である場合、前記対象水の汚染度は、レジオネラＣＦＵが検出される可能性が高い汚染度であると判定する、請求項１に記載のレジオネラ属菌による汚染度の判定方法。

【請求項3】

対象水に対して殺菌剤及び／又はスライムコントロール剤を添加して殺菌処理及び／又はスライムコントロール処理を行う水処理方法において、
請求項１又は２のレジオネラ属菌による汚染度の判定方法の判定結果に基づいて殺菌処理及び／又はスライムコントロール処理を行うことを特徴とする水処理方法。

【請求項4】

対象水中のレジオネラ属特異的リボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡの濃度を定量し、このＤＮＡ濃度値を、対象水の濁度の値で除算した除算値を求め、この除算値をあらかじめ設定した基準値と比較することにより、レジオネラ属菌による汚染度を判定する、レジオネラ属菌による汚染度の判定方法。

【請求項5】

前記基準値は１０^３copies/10ml/濁度～１０^４copies/10ml/濁度の間から選定された値であり、
前記除算値が該基準値以上である場合、前記対象水の汚染度は、レジオネラＣＦＵが検出される可能性が高い汚染度であると判定する、請求項４に記載のレジオネラ属菌による汚染度の判定方法。

【請求項6】

対象水に対して殺菌処理、スライムコントロール処理、及び濁質除去処理から選択される少なくとも一つの処理を実施する水処理方法において、
請求項５又は６のレジオネラ属菌による汚染度の判定方法の判定結果に基づいて、殺菌処理、スライムコントロール処理、及び濁質除去から選択される少なくとも一つの処理を実施する、水処理方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、レジオネラ属菌による汚染度の判定方法に関する。本発明の一態様は、レジオネラ属菌ＤＮＡの濃度を指標として、レジオネラＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）が検出される可能性を判定する方法に関する。また、本発明は、この判定方法に基づいた水処理方法に関する。

【0002】

本発明の適用対象としては、冷却水系、給水・給湯設備、浴場施設、加湿器、蓄熱槽、水景施設、池、沼、温泉、土壌などのレジオネラ属菌が生育する水系の水およびスライム、スラッジなどが挙げられる。

【背景技術】

【0003】

レジオネラ属菌は単独で生育できず、生物膜内で増殖する細菌であることが知られている。従来、生物膜中のレジオネラ属菌の増殖抑制には、抗菌剤が使用されている。

【0004】

レジオネラ症防止指針（非特許文献１。以下、「指針」ということがある。）においては、レジオネラ属菌が検出された時の対応が具体的に書かれている（第7章 7.3.2(2) レジオネラ属菌が検出された時の対応）。ここで指標とされるのはレジオネラＣＦＵ/100mlである。第４章にはレジオネラ属菌検査の原則について書かれていて、レジオネラ属菌の検査は、指針第５章の「レジオネラ属菌検査法」に示す方法、または、これと同等の結果が得られる培養法による定量的方法により生菌数（すなわちＣＦＵ）を測定することとなっている（4.2レジオネラ検査の実際）。

【0005】

一方、この指針には、レジオネラ属菌の迅速検査法としてレジオネラ属菌の遺伝子増幅法が記載されている(付録２ 2.2 レジオネラ迅速検査法)。この迅速法の意義について、指針では以下のように記載している。「培養法との対比において遺伝子検査は生菌と死菌を区別することなく検出されることから、陽性結果が感染の危険性を示しているわけではない。一方、培養法で得られたＣＦＵは感染性を有する生菌で汚染されている可能性を有している。現時点では遺伝子検査は培養法による検査を補助する検査法として利用することが妥当である」、と書かれている（4.3遺伝子検査法の発達から抜粋）。これは原理的な観点からみると適切であるが、迅速に得られた遺伝子増幅法による検出結果を管理に生かせない。

【0006】

指針の付録２ 2.2レジオネラ迅速検査法には、レジオネラＤＮＡの測定方法について書かれており、その中で定量について記載されている（2.2.5検量線の作成と定量）。概略をまとめると、検量線の作成は、標準株を用い、培養によるＣＦＵ定量と遺伝子増幅反応によるＤＮＡ定量を実施して検量線作成を行う。試料は、検量線作成と同一の方法でＤＮＡ量を求め、検量線からＣＦＵに換算するのであるが、試料のＤＮＡ濃度から得られたＣＦＵ値は死菌を含んだ菌数となると書かれている。指針には換算により得られたＣＦＵの値をＣＦＵの値として代用できるとは書かれていない。

【0007】

このように指針にはレジオネラＤＮＡ測定の重要性、有用性、適用限界が書かれているものの、ＤＮＡ濃度を日常管理に用いるための具体的な記述はない。

【0008】

指針以外では、環境中試料を用いて、レジオネラＣＦＵと１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）をＰＣＲにて定量した文献(非特許文献２：岩手県環境保健センター年報4, 66-69,2004）はあるが、日常管理に用いるＤＮＡ濃度については記載がない。

【0009】

近年の報文では、レジオネラＣＦＵに加えて、レジオネラ属特異的ＤＮＡを測定している報告が多い（例えば、非特許文献３）。その理由は、レジオネラＣＦＵが検出されない系においても必ずと言っていいほどレジオネラ属特異的ＤＮＡが検出されるからである。すなわち、ＣＦＵが検出されないことはレジオネラがいないことを意味するわけではない。具体的には水系にはレジオネラ属菌の生菌だけでなく、死菌やViable but nonculturable（ＶＢＮＣ）状態の菌が存在する（非特許文献４）。これは、レジオネラ症防止のために殺菌剤処理されている系においてより顕著である。また、環境中のレジオネラ属菌の多様性から指針の培養法で検出されないレジオネラ属菌の存在も示唆されている（非特許文献５）。このようにレジオネラＣＦＵが検出されるか否かだけでなく、レジオネラ属菌が存在するかどうかという情報が重要視されてきている。

【0010】

培養せずにレジオネラ生菌数を推定する手法として、ＬＣ－ＥＭＡｑＰＣＲ法、ＰＡＬＳＡＲ法が提案されている。たとえば、非特許文献６には、ＬＣ－ＥＭＡｑＰＣＲ法は環境中のレジオネラＣＦＵとの相関があると報告されている。これらは適用例がまだ少なく、特に、冷却水への適用は報告がない。さらに、試薬、手間が追加され、専用の機器が必要とされるというデメリットがある。また、これらの方法は、レジオネラ属菌のＣＦＵ測定の迅速化を目指す方法であるため死菌を検出することができない。このように根本的にレジオネラ属菌ＤＮＡ測定とは異なる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】レジオネラ症防止指針 第３版 発行所 財団法人ビル管理教育センター

【非特許文献2】リアルタイム－ＰＣＲを用いたレジオネラ属菌の迅速検査法の開発(第2報), 保健科学部 佐藤卓ら, 岩手県環保研センター年報４, 66-69, 2004.

【非特許文献3】「入浴施設などにおけるLegionella汚染の実態に関する研究」, 黒木俊郎（神奈川県衛生研究所微生物部）他, 平成27年度厚生労働省科学研究費補助金 健康安全・危機管理対策総合研究事業, 「レジオネラ検査の標準化及び消毒などに係る公衆浴場などにおける衛生管理手法に関する研究」分担研究報告書.

【非特許文献4】A PCR-based method for monitoring Legionella pneumophila in water samples detects viable but noncultivable legionellae that can recover their cultivability. Dusserre, E., et al., Appl. Environ. Microbiol., 74, 4817-4824.

【非特許文献5】Molecular characterization of viable Legionella spp. in cooling tower water samples by combined use of ethidium monoazide and ＰＣＲ. Inoue, H., et al., Microbes Environ., 30, 108-112.

【非特許文献6】「液体培養（Liquid Culture） ＥＭＡ－ｑＰＣＲ法を用いたレジオネラ生菌迅速検査法の検討」, 鳥谷竜哉ら, 平成25年度厚生労働科学研究費補助金（健康安全・危機管理対策総合研究事業） 公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究分担研究報告書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

レジオネラ症防止指針において、水系におけるレジオネラ症感染リスクの指標として用いられるのはレジオネラＣＦＵであるが、その値が得られるまでには一週間以上を要し、迅速性に問題がある。一方、迅速性を解決した方法としてレジオネラＤＮＡを定量する方法があるが、指針中では、感染性のリスク指標が示されていない。

【0013】

迅速にレジオネラ生菌数を測定する試みとしてＬＣ－ＥＭＡｑＰＣＲ法、ＰＡＬＳＡＲ法が開発されているが、コスト、手間の面で負担が増し、データの蓄積も十分ではなく、ＣＦＵに代替できるレベルには達していない。また、冷却水系への実施例がない。そして、これらの方法ではレジオネラＤＮＡ測定で得られる死菌の情報を得ることができない。

【0014】

培養法で検出されないが感染性が疑われるレジオネラ菌種、レジオネラ菌の状態（Viable but nonculturable）が報告され、ＣＦＵで検出されなくても感染性のリスクが存在することが明らかになってきている。このため、レジオネラＣＦＵが検出されないことが感染性リスク零とは言い切れなくなってきている。

【0015】

本発明は、レジオネラ属菌による汚染を迅速に判定することができる方法及びこの判定方法に基づいた水処理方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者は、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、次のような知見を得た。

【0017】

複数の冷却水から経時的にレジオネラ属特異的ＤＮＡ量を定量し、同時にレジオネラＣＦＵ測定を実施したところ、レジオネラＤＮＡが検出されても少量であればＣＦＵが検出されず、レジオネラＤＮＡ量が増えるとレジオネラＣＦＵが検出される現象が観察された。このことから、ＣＦＵが検出されるに至るために必要なレジオネラＤＮＡ量のしきい値があると考えられた。この値を明らかにすることにより、レジオネラＤＮＡ値からレジオネラＣＦＵが検出される可能性を判断できるとの知見を得た。

【0018】

また、濁質が多いとレジオネラＤＮＡ濃度が増加する傾向にあり、その場合ＤＮＡ量が多くても、レジオネラＣＦＵが検出されない傾向があった。濁質中には生物膜が含まれている場合が多く、レジオネラは生物膜中で生育すると考えられるので、水中に濁質が浮遊するとレジオネラＤＮＡ量も増えると考えられる。しかし、レジオネラＣＦＵは同じように増えるとは限らず、生物膜中の方が液中よりレジオネラ死菌の割合が高いと考えられた。このことから、濁度でレジオネラＤＮＡ濃度を補正することにより、レジオネラＣＦＵが検出される可能性を判断するレジオネラ濃度下限値の精度が向上した。

【0019】

本発明はかかる知見に基づくものであり、以下を要旨とする。

【0020】

［１］ 対象水中のレジオネラ属特異的リボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡの濃度を定量し、あらかじめ設定した基準値と比較することにより、レジオネラ属菌による汚染度を判定する、レジオネラ属菌による汚染度の判定方法。

【0021】

［２］ 前記基準値は１０^４copies/10ml～１０^５copies/10mlの間から選定された値であり、
前記ＤＮＡ濃度が該基準値以上である場合、前記対象水の汚染度は、レジオネラＣＦＵが検出される可能性が高い汚染度であると判定する、［１］に記載のレジオネラ属菌による汚染度の判定方法。

【0022】

［３］ 対象水に対して殺菌剤及び／又はスライムコントロール剤を添加して殺菌処理及び／又はスライムコントロール処理を行う水処理方法において、
［１］又は［２］のレジオネラ属菌による汚染度の判定方法の判定結果に基づいて殺菌処理及び／又はスライムコントロール処理を行うことを特徴とする水処理方法。

【0023】

［４］ 対象水中のレジオネラ属特異的リボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡの濃度を定量し、このＤＮＡ濃度値を、対象水の濁度の値で除算した除算値を求め、この除算値をあらかじめ設定した基準値と比較することにより、レジオネラ属菌による汚染度を判定する、レジオネラ属菌による汚染度の判定方法。

【0024】

［５］ 前記基準値は１０^３copies/10ml/濁度～１０^４copies/10ml/濁度の間から選定された値であり、
前記除算値が該基準値以上である場合、前記対象水の汚染度は、レジオネラＣＦＵが検出される可能性が高い汚染度であると判定する、［４］に記載のレジオネラ属菌による汚染度の判定方法。

【0025】

［６］ 対象水に対して殺菌処理、スライムコントロール処理、及び濁質除去処理から選択される少なくとも一つの処理を実施する水処理方法において、
［４］又は［５］のレジオネラ属菌による汚染度の判定方法の判定結果に基づいて、殺菌処理、スライムコントロール処理、及び濁質除去から選択される少なくとも一つの処理を実施する、水処理方法。

【発明の効果】

【0026】

本発明では、レジオネラ濃度を明らかにする方法としてレジオネラ属特異的ＤＮＡを測定し、その値からレジオネラＣＦＵが検出される可能性を判断する。これにより、測定期間短縮がなされ、レジオネラ存在有無とＣＦＵ検出の可能性との二つの情報を同時に得ることができる。

【0027】

本発明の一態様によると、レジオネラ処理に関する水処理を判断する期間（ＣＦＵの結果が得られるまで一週間程度）を、１日程度に短縮することができる。

【0028】

ＣＦＵが検出されなくてもレジオネラが高濃度に存在する場合がある。本発明の一態様によると、そのような対象に対してもレジオネラ対策の必要性を判断することができる。

【0029】

本発明によると、レジオネラＤＮＡ測定値の適用範囲が広がる。これについて以下に詳しく説明する。

【0030】

レジオネラＤＮＡ測定値を使用する方法としてレジオネラ症防止指針（非特許文献１）には以下のような記述がある。

【0031】

「浴槽の除菌洗浄後では、同一試料について遺伝子検査と培養検査を同時に行う。遺伝子検査で陰性の場合、その水系はレジオネラ属菌に関して安全であるとして営業を再開する。陽性の場合は再度除菌洗浄を行い、遺伝子検査が陰性になるのを待ってから営業を再開する。最終的には培養法で生菌数を確認する。」（第４章 4.3遺伝子検査法の発達から抜粋）。

【0032】

この記述によれば、レジオネラＤＮＡ測定値の使用法としては、陰性か陽性かの２択である。本発明によると、レジオネラＤＮＡが検出されてもＣＦＵ検出の可能性が低い場合を判定することができる。これによりレジオネラＤＮＡ測定値の適用範囲が広がる。

【発明を実施するための形態】

【0033】

以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。

【0034】

本発明で増殖抑制対象とするレジオネラ属菌は、入浴設備、冷却塔等において増殖し易く、エアロゾルを介して人体に吸入されることでレジオネラ感染症を引き起こす。レジオネラ属菌の感染によるレジオネラ肺炎やポンティアック熱での感染を予防するために、レジオネラ属菌の増殖を抑制することは極めて重要である。現在数十種のレジオネラ属菌が確認されており、代表的なレジオネラ属菌としては、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）が知られている。これらはいずれも感染症を引き起こす可能性があるとされている。

【0035】

本発明の一態様では、このようなレジオネラ属菌による水の汚染度を対象水中のレジオネラ属特異的リボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡ濃度を定量することにより判定する。

【0036】

即ち、本発明の一態様では、対象水中のレジオネラ属特異的リボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡの濃度を定量し、あらかじめ設定した基準値と比較することにより、対象水のレジオネラ属菌による汚染度を判定する。

【0037】

本発明の一態様では、この基準値は１０^４ｃｏｐｉｅｓ／１０ｍｌ～１０^５ｃｏｐｉｅｓ／１０ｍｌの間から選定された値であり、前記ＤＮＡ濃度が該基準値以上である場合、前記対象水の汚染度は、レジオネラＣＦＵが検出される可能性が高い汚染度であると判定する。

【0038】

本発明の一態様の水処理方法では、上記のようにＤＮＡ濃度が基準値以上である場合、対象水に対して殺菌剤及び／又はスライムコントロール剤を添加して殺菌処理及び／又はスライムコントロール処理を行う。

【0039】

また、前述の通り、対象水中の濁質量が多いとレジオネラＤＮＡ濃度が増加する傾向にあり、その場合ＤＮＡ量が多くても、レジオネラＣＦＵが検出されない傾向がある。濁質中には生物膜が含まれている場合が多く、レジオネラは生物膜中で生育すると考えられるので、水中に濁質が浮遊するとレジオネラＤＮＡ量も増えると考えられる。しかし、レジオネラＣＦＵは同じように増えるとは限らず、生物膜中の方が液中よりレジオネラ死菌の割合が高いと考えられる。このことから、本発明の別の一態様の判定方法では、濁度でレジオネラＤＮＡ濃度を除算し、この除算値に基づいて、レジオネラＣＦＵが検出される可能性を判断する。

【0040】

即ち、本発明の別の一態様の判定方法は、対象水中のレジオネラ属特異的リボゾーマルＲＮＡをコードするＤＮＡの濃度を定量し、このＤＮＡ濃度値を、対象水の濁度の値で除算した除算値を求め、この除算値をあらかじめ設定した基準値と比較することにより、レジオネラ属菌による汚染度を判定するレジオネラ属菌による汚染度の判定方法である。

【0041】

本発明の一態様では、この基準値は１０^３ｃｏｐｉｅｓ／１０ｍｌ／濁度～１０^４ｃｏｐｉｅｓ／１０ｍｌ／濁度の間から選定された値であり、前記除算値が該基準値以上である場合、前記対象水の汚染度は、レジオネラＣＦＵが検出される可能性が高い汚染度であると判定する。

【0042】

本発明の別の一態様の水処理方法は、上記除算値がこの基準値以上である場合、対象水に対して殺菌処理、スライムコントロール処理、及び濁質除去処理から選択される少なくとも一つの処理を実施する。

【0043】

本発明の水処理方法において、スライムコントロール剤としては、安定化された酸化系スライムコントロール剤が好ましく、例えば、ヒダントイン、ヒダントイン誘導体（以下、これらをヒダントイン類ということがある。）や、ハロゲン系酸化物がスルファミン酸化合物などの窒素化合物により安定化されたハロゲン系酸化剤が挙げられる。

【0044】

ハロゲン系酸化物としては、例えば、塩素、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム等の次亜塩素酸アルカリ金属塩、次亜塩素酸カルシウム、次亜塩素酸バリウム等の次亜塩素酸アルカリ土類金属塩、亜塩素酸ナトリウム、亜塩素酸カリウム等の亜塩素酸アルカリ金属塩、亜塩素酸バリウム等の亜塩素酸アルカリ土類金属塩、亜塩素酸ニッケル等の他の亜塩素酸金属塩、塩素酸アンモニウム、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム等の塩素酸アルカリ金属塩、塩素酸カルシウム、塩素酸バリウム等の塩素酸アルカリ土類金属塩等の塩素系酸化剤や、これらの塩素系酸化剤の塩素を臭素に置き換えた臭素系酸化剤が挙げられる。これらのハロゲン系酸化剤は１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

【0045】

このうち、次亜塩素酸アルカリ金属塩や次亜臭素酸アルカリ金属塩が好ましく、次亜塩素酸ナトリウムや次亜臭素酸ナトリウムがより好ましい。

【0046】

スルファミン酸化合物としては、例えば、スルファミン酸、Ｎ－メチルスルファミン酸、Ｎ，Ｎ－ジメチルスルファミン酸及びＮ－フェニルスルファミン酸、及び／又はこれらの塩（例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）などが例示される。これらのスルファミン酸化合物は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

【0047】

例えば、次亜塩素酸イオン及びスルファミン酸は、次式のように反応して、Ｎ－モノクロロスルファミン酸イオン又はＮ，Ｎ－ジクロロスルファミン酸イオンを形成し、塩素系酸化剤の有効成分を安定化させる。

【0048】

ＣｌＯ^－＋Ｈ_２ＮＳＯ_３Ｈ→ＨＣｌＮＳＯ_３ ^－＋Ｈ_２Ｏ
２ＣｌＯ^－＋Ｈ_２ＮＳＯ_３Ｈ＋Ｈ^＋→Ｃｌ_２ＮＳＯ_３ ^－＋２Ｈ_２Ｏ

【0049】

これらのスライムコントロール剤は、添加効果が得られる程度において、なるべく少なく用いることが望ましく、残留塩素濃度として１ｍｇ／ｌ ａｓ Ｃｌ_２以上、例えば５～１０ｍｇ／ｌ ａｓ Ｃｌ_２程度とすることが好ましい。また、この濃度での酸化系スライムコントロール剤の維持時間は３０～６０分程度が望ましい。

【0050】

本発明の水処理方法において、濁質除去処理としては、沈殿、担体濾過、膜ろ過があり、具体的にはストレーナー、ライトフィルター、ＭＦ膜処理などが例示されるが、これらに限定されない。

【実施例0051】

以下に実施例、比較例及び実験例を挙げて本発明をより具体的に説明する。

【0052】

［実施例１］
＜概要＞
冷却水のレジオネラＣＦＵとレジオネラ属特異的ＤＮＡ量、濁度の結果が得られるまでの期間を明らかにし、それぞれの値の相関の有無を明らかにするために、稼働中の冷却塔（Ｄ２ＣＴ２冷却塔）水系にいくつかのスライムコントロール処理を施し、その間、レジオネラＣＦＵ、レジオネラ属特異的ＤＮＡ、及び濁度を計測した。

【0053】

＜実験方法＞
≪冷却水のレジオネラＣＦＵ計測≫
レジオネラ症防止指針第３版の方法に基づき、冷却遠心濃縮法で実施した。

【0054】

レジオネラ分離培地はＧＶＰＣレジオネラ選択用培地を用いた。レジオネラ様コロニーのＬ－システイン要求性を確認し、レジオネラ菌と判断した。

【0055】

≪レジオネラ属特異的ＤＮＡ濃度の定量≫
下記の手順（１）～（１２）によりＤＮＡの抽出、精製を行った。

【0056】

（１）対象水１０ｍｌを６０００ｒ．ｐ．ｍで、３０ｍｉｎ遠心分離する。

【0057】

（２）上清を取り除き、１００μＬ程度の濃縮水を得る。

【0058】

（３）この１００μｌ程度の濃縮水をNucleo Spin（登録商標）Bead Tube（２ｍｌ容）に入れ、Extraction
Bufferを１ｍｌ添加する。

【0059】

（４）ホモジナイズを３０００ｒ．ｐ．ｍにて２ｍｉｎ行う。

【0060】

（５）２０％ＳＤＳを１１０μｌ添加し、６０℃で３０ｍｉｎ静置する。

【0061】

（６）室温で３０００ｒ．ｐ．ｍにて２ｍｉｎ再度ホモジナイズする。次いで１５０００ｒ．ｐ．ｍで１５ｍｉｎ遠心分離する。

【0062】

（７）遠心分離後、上清７００μｌを新しいエッペンドルフチューブに移す。そして、同量のＤＮＡ抽出用クロロフォルム７００μｌを添加し、よく混ぜる。

【0063】

（８）１２０００ｒ．ｐ．ｍにて５ｍｉｎ室温で遠心分離し、上清６３０μｌを新しいエッペンドルフチューブに移す。そして、０．６容量の２－プロパノールを加え、よく混和する。

【0064】

（９）１５０００ｒ．ｐ．ｍにて２０ｍｉｎ室温で遠心分離した後、上清を取り除きTE Buffer５０μｌを加えて溶解させる。

【0065】

（１０）MonoFas（登録商標）DNA精製キットＩを用いて精製する。

【0066】

（１１）溶出液量（１２．５μｌ）のうち、４μｌをＰＣＲ測定に使用する。

【0067】

ｑＰＣＲはCycleave（登録商標）PCR Legionella(16S rRNA) Detection Kit（タカラバイオ）を用いて実施した。

【0068】

ＰＣＲ装置はLightCycler（登録商標） (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いた。

【0069】

ＰＣＲに用いた標準液はキット付属のLegionella DNA（16SrRNA）を用いた。

【0070】

標準液濃度は４０，４００，４０００，４００００copies/tubeの範囲で検量線を作成した。

【0071】

（１２）検量線から得られたＤＮＡ濃度を３．１倍（１２．５μl／４μｌ）し、１０ｍｌ当たりのＤＮＡ量とした。抽出工程における、回収率は１とした。抽出に供した液量が１０ｍｌと異なる場合には、１０ｍｌ当たりに換算した。

【0072】

≪濁度測定≫
サンプル水をよく懸濁し、５０ｍｍセル、６６０ｎｍの吸光度を測定した。

【0073】

あらかじめ作成されたカオリン１ｍｇ／ｌを添加した時の濁り度合いを濁度１とする検量線から濁度を求めた。

【0074】

≪レジオネラＣＦＵ測定≫
レジオネラＣＦＵ測定は、前処理として、０．２Ｍ ＨＣｌ－ＫＣｌ緩衝液を植菌用サンプルに対し等量混合して２５℃で４分静置後、２００μｌをＧＶＰＣレジオネラ選択用培地に植菌して行った。３７℃で１０～１４日間培養し、灰白色のレジオネラ様コロニーを計測した。レジオネラ様コロニーは、システイン要求性を確認し、システイン要求性を示したものをレジオネラコロニーとした。

【0075】

＜結果及び考察１＞
冷却水処中のレジオネラＣＦＵ濃度、レジオネラ属特異的ＤＮＡ濃度、濁度の経時変化を表１に示す。

【0076】

【表1】

【0077】

表１から、レジオネラＣＦＵが検出されていなくてもレジオネラ属特異的ＤＮＡが検出されていることが分かる。

【0078】

また、レジオネラＤＮＡ濃度が高いと、ＣＦＵが検出される頻度が高いことが分かる。なお、レジオネラＤＮＡ濃度が低いときは、レジオネラＣＦＵは検出されていない。

【0079】

なお、レジオネラＣＦＵ測定値については、送付、培養、コロニーのレジオネラ属菌同定期間を含め、結果が得られるまでに１０日～２０日を要した。１０月上旬に冷却塔の洗浄が行われたが、その時点で洗浄直前のレジオネラＣＦＵの値は得られておらず、レジオネラＣＦＵが存在する冷却塔である認識がなかった。また、１０月３０日から１２月３日までレジオネラＣＦＵが継続して検出されたが、ＣＦＵ測定結果が得られるまでの間、処理が適切かどうか判断できず、レジオネラＣＦＵ検出期間が長期にわたった。

【0080】

これに対し、濁度、レジオネラＤＮＡ濃度は翌日までに分析値が得られた。

【0081】

＜考察２＞
レジオネラＤＮＡ濃度ごとのレジオネラＣＦＵ検出割合を表２に示す。表２の通り、レジオネラＤＮＡ濃度が１０^５copies/10ml以上であると、レジオネラＣＦＵが検出される頻度が高くなる。

【0082】

また、１０^４～１０^５copies/10mlの範囲では、１０ＣＦＵ/100mlのＣＦＵが１検体から検出されたので、まれにＣＦＵが検出されることが分かった。

【0083】

【表2】

【0084】

＜考察３＞
さらに、レジオネラ属特異的ＤＮＡ濃度が高くても、レジオネラＣＦＵが不検出の場合濁度が高い傾向が認められたことから、レジオネラ属特異的ＤＮＡを濁度で除算した値とレジオネラＣＦＵの関係を検討した。

【0085】

濁度当たりのレジオネラ属特異的ＤＮＡ濃度ごとのレジオネラＣＦＵ検出割合を表３に示す。

【0086】

表３のとおり、濁度当たりのレジオネラＤＮＡ濃度が１０^４copies/10ml/濁度以上であると、レジオネラＣＦＵが検出される頻度が急激に高くなる。１０^３copies/10ml/濁度未満ではレジオネラＣＦＵが不検出で、ＣＦＵ形成しないレジオネラＤＮＡの影響を低くできると考えられる。

【0087】

【表3】

【0088】

［実施例２］
＜概要＞
レジオネラＤＮＡ濃度を指標として冷却水系にスライムコントロール剤を添加し、レジオネラ処理の有効性を確認する。

【0089】

また、冷却水のレジオネラＤＮＡ濃度と濁度を測定し、レジオネラＤＮＡ濃度と濁度当たりのレジオネラＤＮＡ濃度を求める。求められた値からスライムコントロール処理の実施、強化、維持を決定する。同時にレジオネラＣＦＵを測定し、レジオネラ対策が適当であったかどうかを検証する。

【0090】

＜実験方法＞
実施例１とは別の冷却塔において、１２月３日以降、実施例１と同様の方法でレジオネラＣＦＵの定量、ＤＮＡの定量及び濁度測定を行った。そして、１月８日以降、スライムコントロール剤として安定化されたハロゲン系酸化剤を残留塩素濃度として２ｍｇ／Ｌ ａｓ Ｃｌ_２添加した。ＤＮＡ濃度を指標として添加濃度を、１週間ごとに見直した。ＤＮＡ濃度が低下した場合は、スライムコントロール剤の残留濃度を５０％程度低下させた。

【0091】

＜結果＞
各指標の経時変化を表４に示す。表４には、後日得られたレジオネラＣＦＵ計測値も併せて示す。

【0092】

本実施例は、当初無処理で、冷却水中のレジオネラ属特異的ＤＮＡ濃度はＣＦＵ検出リスクがあると考えられる値を示した。

【0093】

スライムコントロール剤添加処理を開始した１月８日以降は、レジオネラ属特異的ＤＮＡは低下傾向を示した。また、目視レベルでスライムコントロール状況は好転した。スライムコントロール剤の検出率も上昇した。後日得られたレジオネラＣＦＵ計測値も、全て検出下限以下であった。

【0094】

このことから、レジオネラ属特異的ＤＮＡを指標にすることで、ＣＦＵ測定を用いるよりも迅速かつ的確に効率的なレジオネラ対策を実施できることが示された。

【0095】

【表4】