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特開2023-170612ブタ生殖細胞の凍結保存液及び凍結保存方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023170612

(43)【公開日】2023-12-01

(54)【発明の名称】ブタ生殖細胞の凍結保存液及び凍結保存方法

(51)【国際特許分類】

C12N 5/076 20100101AFI20231124BHJP

C12N 1/04 20060101ALI20231124BHJP

C12N 5/073 20100101ALI20231124BHJP

A01N 1/02 20060101ALI20231124BHJP

【ＦＩ】

C12N5/076

C12N1/04

C12N5/073

A01N1/02

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022082490

(22)【出願日】2022-05-19

(71)【出願人】

【識別番号】596036256

【氏名又は名称】株式会社ビーエムジー

(74)【代理人】

【識別番号】100121382

【弁理士】

【氏名又は名称】山下託嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100124707

【弁理士】

【氏名又は名称】夫世進

(72)【発明者】

【氏名】三好和睦

(72)【発明者】

【氏名】井尻萌

(72)【発明者】

【氏名】玄丞烋

(72)【発明者】

【氏名】玄優基

【テーマコード（参考）】

4B065

4H011

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AC12

4B065AC20

4B065BD09

4B065BD12

4B065BD25

4B065BD27

4B065BD36

4B065CA60

4H011BB03

4H011BB08

4H011BB19

4H011BB20

4H011CA01

4H011CB08

4H011CC01

4H011CD02

4H011CD06

4H011DH11

(57)【要約】

【課題】ブタ精子やブタ胚（胚盤胞）の凍結保存液または凍結保存方法であって、生産現場に導入し得る実用的な凍結保存効果を有するものを提供する。
【解決手段】ブタ精子の凍結保存には、DMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）0.2～0.3w/w％と、グリセリン２～４w/w％と、トレハロース5～15w/w％と、卵黄15～25w/w％とを含む凍結保存液を用いる。ブタ胚（胚盤胞）の凍結保存には、DMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）またはCPLL（コハク酸変性ポリリシン）8～12w/w％と、エチレングリコール30～35w/w％と、ポリエチレングリコール1～3w/w％と、トレハロース15～25w/w％と、ウシ胎子血清15～25w/w％とを含む凍結保存液を用いる。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

置換された構成単位の割合が50～99モル％であるジメチルグリタル酸変性ポリリシン0.2～0.3重量％と、グリセリン２～４重量％と、トレハロース5～15重量％と、卵黄15～25重量％とを含む、ブタ精子の凍結保存液。

【請求項2】

ジメチルグリタル酸変性ポリリシンの含量が0.3重量％未満であり、グリセリンの含量が３重量％以下である、請求項１記載のブタ精子の凍結保存液。

【請求項3】

請求項１または２の凍結保存液を用いる、ブタ精子の凍結保存方法であって、
ブタ精液を前処理して、ブタ精子を得る前処理工程と、
前処理されたブタ精子を、ブタ精液用希釈液でもって希釈する１次希釈工程と、
ブタ精液用希釈液にジメチルグリタル酸変性ポリリシン及びグリセリンを添加した２次希釈液を準備しておき、１次希釈後の懸濁液に２次希釈液を追加することで、前記凍結保存液中にブタ精子が懸濁されるようにする２次希釈工程と、
保存用ストロー中に充填した後、予備凍結してから、－60℃以下の温度に保持する工程とを含み、
前記ブタ精液用希釈液は、前記トレハロース及び前記卵黄を含有する、ブタ精子の凍結保存方法。

【請求項4】

径が5mm以下である凍結保存用ストローを用い、－140℃以下にまで冷却することを特徴とする請求項３に記載のブタ精子の凍結保存方法。

【請求項5】

置換された構成単位の割合が50～99モル％であるジメチルグリタル酸変性ポリリシンまたはコハク酸変性ポリリシン8～12重量％と、エチレングリコール30～35重量％と、ポリエチレングリコール1～3重量％と、トレハロース15～25重量％と、ウシ胎子血清15～25重量とを含む、ブタ胚の凍結保存液

【請求項6】

請求項５の凍結保存液を用いる、ブタ胚の凍結保存方法であって、
ブタ胚を第1平衡液、第2平衡液、及び上記の凍結保存液中へと順に移す工程と、
この後に、凍結保存液中のブタ胚を、予備凍結なしに、－60℃以下の雰囲気中にて保持する工程とを含み、
第1平衡液は、細胞培養培地に、5～15％のエチレングリコール、15～25％のウシ胎児血清および3～7％のジメチルグリタル酸変性ポリリシンまたはコハク酸変性ポリリシンの溶液を含有するように添加したものであり、
第2平衡液は、細胞培養培地に、5～15％のエチレングリコール、0.5～2％のポリエチレングリコール、0.2～0.4Mのトレハロース、15～25％のウシ胎児血清および7～13％のジメチルグリタル酸変性ポリリシンまたはコハク酸変性ポリリシンの溶液を含有するように添加したものであるブタ胚の凍結保存方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ブタの精子や胚などの生殖細胞の凍結保存に有用な凍結保存液及び凍結保存方法に関する。

【背景技術】

【0002】

動物の細胞又は組織を長期に保存するために、0℃以下の温度での凍結保存法が日常的に用いられている。しかしながら、動物の細胞又は組織は水を含有し、凍結すると、凍結中に水分子同士が、溶質や混入物の媒質を排除しながら結晶化して水分子のみから成る氷結晶を形成するため、含水物中で溶質や混入物の媒質が不均一に拡散し、凍結濃縮が発生することが知られている。

【0003】

このような凍結濃縮を防止するため、様々な低分子化合物を添加する方法が行われている。例えば、細胞の凍結保存を行う場合に、凍結保存中に起こる細胞内の結晶化による細胞へのダメージを最小限に抑えるために、凍結保護剤として、低分子のジメチルスルホキシドやグリセロール等を添加する方法が行われている。

【0004】

特に、子畜生産性向上や遺伝資源の保存を図るためには、家畜の精子などの生殖細胞を凍結保存することも行われている。特に、ウシ精子の凍結には、グリセリンを６～７重量％で含む凍結保存液が用いられてきた。また、ウシ卵子及び胚の凍結に用いられる凍結保護剤としては、グリセリン、エチレングリコール、プロパンダイオールが知られている。

【0005】

ところが、ブタの精子や胚（胚盤胞）の凍結保存は、凍結時のダメージが大きいことから、一般に困難であるとされている（非特許文献１～２）。非特許文献１の冒頭には、次のように記載されている：「ブタ凍結精液は，凍結時のダメージにより融解後の精子機能性が損なわれ，人工授精後の繁殖成績が低いことから生産現場ではほとんど使用されていない。」

【0006】

また、特許文献４の[0002]～[0003]には、次のとおり記載されている。
[0002]・・ウシ以外の家畜については、人工授精技術が十分に確立していない状況である。
[0003]・・日本の養豚産業では主に自然交配が行われており、種雄ブタを飼育する必要があるため経費がかかる。また、・・作業にも危険が生じる。更に、自然交配には多大な労力を必要とする・・

【0007】

非特許文献１～２及び特許文献４によると、ブタの精子の凍結保存液としては、ブタの人工授精用の一般的な希釈液である「ＮＳＦ（Niwa and Sasaki freezing extender; 80%(v/v), 0.31mol Lactose monohydrate, 20%(v/v) egg yolk, 1000U/ml penicillin G potassium, 1mg/ml streptomycin sulfate）」に、３重量％前後となるようにグリセリンを添加した、浸透圧４００ｍＯｓｍ／ｋｇの溶液などが主として検討されて来た。

【0008】

一方、本件出願人は、ウシ精子の凍結保存を行うにあたり、両性高分子電解質としてのカルボキシル化ポリリジン（特には無水コハク酸変性ポリリジン）0.3～0.9w/w％とグリセリン2～4w/w％という非常に限定された組成により優れた効果を見出した（特許文献１）。

【0009】

本件出願人は、これより以前に、このカルボキシル化ポリリジンを例えば7～10w/w％含有する凍結保存液が、繊維芽細胞や幹細胞などの細胞・組織の凍結保存に優れた効果が得られることを見出した（特許文献２）。一方、このような幹細胞などのための凍結保存液を部分的に改良した「ガラス化液」として、エチレングリコール及びスクロースを添加することも提案されている（特許文献３）。この部分的に改良された「ガラス化液」は、具体的には（実施例では）、カルボキシル化ポリリジンとしての、無水コハク酸変性ポリリジン（CPLL）またはジメチルグリタル酸変性ポリリジン（DMGA-PLL）25mM（約10重量％；分子量約4000）と、エチレングリコール6M（約37重量％；分子量62）と、スクロース0.5M（約17重量％；分子量342）とを含有する。特許文献３の実施例８及びその結果を示す図１５によると、ジメチルグリタル酸変性ポリリジンを用いた場合に、間葉系幹細の生存率が高かった。

【0010】

ウシ精子などとは異なり、ブタ精子やブタ胚（胚盤胞）については、生産現場に導入し得る実用的な凍結保存液または凍結保存方法の開発が待ち望まれていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】PCT/JP2017/029979（WO2018/038115A）

【特許文献2】PCT/JP2009/002941（WO2009/157209A；日本特許第5726525号）

【特許文献3】日本特許第6678931号

【特許文献4】特開2018-113936

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】日豚会誌 49（3）128-132 (2012，9月),「高浸透圧凍結希釈液を用いたバークシャーおよびアグー精子の凍結保存におけるglycerol 濃度の影響」，知念司他https://www.jstage.jst.go.jp/article/youton/49/3/49_128/_pdfhttps://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/2010833581

【非特許文献2】Journal of Reproduction and Development, 45(5) 345-350 (1999), “Reproduction in Pigs Using Frozen-Thawed Spermatozoa from Epididymis Stored at 4C”, Kazuhiro KIKUCHI et al.https://www.jstage.jst.go.jp/article/jrd/45/5/45_5_345/_pdf

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

そこで、本発明は、ブタ精子やブタ胚（胚盤胞）の凍結保存用組成物及び凍結保存方法において、子畜生産性向上や遺伝資源の保存を目的として、実用的に問題のないレベルでの保存効果が得られるものを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ブタ精子やブタ胚（胚盤胞）について、下記の非常に限定された組成を採用する場合に、良好な凍結保存効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0015】

ブタ精子の凍結保存には、置換された構成単位（個々の無水リジン単位のうちのカルボキシル化されたもの）の割合が50～99モル％であるDMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）0.2～0.3w/w％（または0.2w/w％以上で0.3w/w％未満）と、グリセリン２～４w/w％（または２～３w/w％）と、トレハロース5～15w/w％（または5～13w/w％）と、卵黄15～25w/w％（または17～23w/w％）とを含む凍結保存液を用いる。

【0016】

ブタ胚（胚盤胞）の凍結保存には、置換された構成単位の割合が50～99モル％であるDMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）またはCPLL（コハク酸変性ポリリシン）8～12w/w％と、エチレングリコール30～35w/w％と、ポリエチレングリコール1～3w/w％と、トレハロース15～25w/w％と、ウシ胎子血清15～25w/w％とを含む、ブタ胚（胚盤胞）の凍結保存液を用いる。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、ブタ精子やブタ胚（胚盤胞）を凍結保存して、子畜生産などの現場で使用することで、生産性向上を図ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】DMGA-PLLの濃度が、融解後のブタ精子の生存指数に及ぼす影響を示すグラフである。

【図2】DMGA-PLLの濃度が、融解後のブタ精子を用いて作出した体外受精卵の体外発生能に及ぼす影響を示すグラフである。

【図3】DMGA-PLLの濃度が、融解後のブタ精子の体外受精能に及ぼす影響を示すグラフである。

【図4】CPLLの濃度が、融解後のブタ精子の生存指数に及ぼす影響を示すグラフである。

【図5】CPLLの濃度が、融解後のブタ精子を用いて作出した体外受精卵の体外発生能に及ぼす影響を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明に係る、ブタ生殖細胞の凍結保存液は、数平均分子量1,000～20,000のε-ポリ-L-リジン（下記化学式I）のアミノ基の50～99モル％について、コハク酸無水物またはジメチルグリタル酸無水物（下記化学式II）を反応させてカルボキシル化することでブロックした、カルボキシル化ポリリジン（以下、適宜「不凍ポリアミノ酸」と称する）を含有する。下記化学式Iのε-ポリ-L-リジンの重合度ｎは、典型的には25～35（数平均分子量3200～4500）である。

【0020】

＜化学式I＞

【0021】

＜化学式II＞
コハク酸無水物（無水琥珀酸）ジメチルグリタル酸無水物

【0022】

本発明において、ε-ポリ-L-リジンとしては、微生物又は酵素により生産される数平均分子量が1,000～20,000または1,000～10,000、特には3,000～5,000のε-ポリ-L-リジンを挙げることができる。ε-ポリ-L-リジンは、ストレプトマイセス属(Streptomyces)に属する放線菌により生産されて、食品保存料として用いられている。重合度15～35または25～35のものの他、重合度が20以下のものの生産も試みられている(例えば、特開2003-171463号公報及び特開2005-318815号公報)。数平均分子量又は数平均重合度の測定は、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)法により、例えば、アトー(株)製の電気泳動装置及びデンシトグラフ(AE-6920V型)を用いて容易に測定することができる。このとき、標準タンパク質マーカーを用いる。なお、ε-ポリ-L-リジンは、加熱処理による高分子量化により分子量30,000以上として用いることもできる。しかしながら、粘度の上昇を防ぐ等の観点から上記の分子量範囲が好ましい。

【0023】

「不凍ポリアミノ酸」としてのカルボキシル化リジンは、ε-ポリ-L-リジンのアミノ基について、好ましくは50～99モル％、特に50～93モル％、より好ましくは50～90モル％、さらに好ましくは55～80モル％、最も好ましくは58～76モル％をカルボキシル化することでブロックしたものである。

【0024】

ε-ポリ-L-リジンのアミノ基に対して52～53モル％のコハク酸無水物またはジメチルグリタル酸無水物（上記化学式II）を反応させることで約50モル％のアミノ基をブロックすることができる。また、100モル％のコハク酸無水物またはジメチルグリタル酸無水物を反応させた場合、通常の反応条件で、90～95モル％のアミノ基をブロックすることができる。ブロック率が上記の範囲を超えても、また、下回っても、凍結保存効果が小さくなる。

【0025】

本発明に係るブタ生殖細胞の凍結保存液は、生理的水溶液に、上記不凍ポリアミノ酸（カルボキシル化リジン）と、後述する追加成分を溶解したものでありうる。生理的水溶液としては、生理食塩水の他、各種の細胞又は組織用の一般的な培養液を用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグルMEM培地(DMEM)を好ましいものとして挙げることができる。

【0026】

本発明の第一実施形態において、本発明に係るブタ精子の凍結保存液は、DMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）0.2～0.3w/w％と、グリセリン２～４w/w％と、トレハロース5～15w/w％と、卵黄15～25w/w％とを含有する。当該グリセリン含有量は、従来においてウシ精子などの凍結保存に使用される量を有意に低減又は半減した量であり、本発明に係るブタ精子の凍結保存液は細胞毒性が低い。

【0027】

第一実施形態による好ましい凍結保存液は、人工受精の際におけるブタ精液用の希釈液であるＮＳＦ（Niwa and Sasaki freezing extender）に、DMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）及びグリセリンを所定量だけ添加したものである。ここで用いるＮＳＦは、ラクトース水和物に代えて、トレハロースを、低分子ポリアルコール成分ないしは低分子糖類成分として含有する、一種の修正ＮＳＦである。

【0028】

すなわち、凍結保存液のベースをなすＮＳＦは、低分子ポリアルコールないしは低分子糖類化合物（単糖類または二糖類）としてのトレハロースと、卵黄と、抗生物質などの抗菌・抗ウイルス物質とを含有する。ＮＳＦは、特には、浸透圧が約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば３５０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ）である。ＮＳＦは、低卵黄を添加したトリス・クエン酸緩衝液（卵黄トリス糖液（ＥＴ））などをベースにしたものであってもよい。また、抗生物質として、アミカシン、ジベカシン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどを含有しうる。

【0029】

第一実施形態による好ましい凍結保存方法は、(1) ブタ精液を前処理して、ブタ精子（前処理液中におけるブタ精子の高濃度懸濁液）を得る前処理工程と、(2) 前処理されたブタ精子（の高濃度懸濁液）を、上記修正ＮＳＦでもって希釈(１次希釈)する１次希釈工程と、(3) 上記修正ＮＳＦにDMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）及びグリセリンを添加した２次希釈液を準備しておき、１次希釈後の懸濁液に２次希釈液を追加することで２次希釈を行う２次希釈工程と、(4) 保存用ストロー中に充填した後、予備凍結してから、－60℃以下の温度に保持する工程とを含む。

【0030】

なお、ここで、前処理工程から、保存用ストロー（凍結保存用の細管状の容器）への充填までに、37℃前後（例えば33～40℃）から5℃前後（例えば2～8℃）へと、段階的に、または徐々に温度を下げる。また、予備凍結は、例えば－5℃～－20℃の雰囲気中に、充填済みの保存用ストローを置くことで行うことができる。

【0031】

また、好ましくは、径が5mm以下である凍結保存用ストローを用い、予備凍結の後には、プログラムフリーザーなどによる冷却速度100℃／分以下の緩慢凍結法で、または、液体窒素浸漬により冷却速度300℃／分以上のガラス化凍結法で、－140℃以下にまで冷却する。

【0032】

本発明の第二実施形態において、本発明に係るブタ胚（胚盤胞）の凍結保存液は、置換された構成単位の割合が50～99モル％であるDMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）またはCPLL（コハク酸変性ポリリシン）8～12w/w％と、エチレングリコール30～35w/w％と、ポリエチレングリコール1～3w/w％と、トレハロース15～25w/w％と、ウシ胎子血清15～25w/w％とを含有する。凍結保存対象のブタ胚としては、例えば体外受精(IVF)により4～8日間(好ましくは5～7日間)発生させたブタ胚等が挙げられる。

【0033】

第二実施形態による好ましい凍結保存方法は、ブタ胚（胚盤胞）を第1平衡液、第2平衡液、及び上記の凍結保存液中へと順に移す工程、この後、凍結保存液中のブタ胚を、予備凍結なしに、－60℃以下の雰囲気中にて保持する工程とを含み、第1平衡液は、細胞培養培地に、5～15％のエチレングリコール、15～25％のFBS（ウシ胎児血清）および3～7％のDMGA-PLL及び／またはCPLLの溶液を含有するように添加したものであり、第2平衡液は、細胞培養培地に、5～15％のエチレングリコール、0.5～2％のポリエチレングリコール、0.2～0.4Mのトレハロース、15～25％のFBSおよび7～13％のDMGA-PLL及び／またはCPLLの溶液を含有するように添加したものである。

【0034】

凍結したブタ生殖細胞を使用する場合には、各種細胞の一般的な融解方法に準じて、凍結したウシ細胞を融解し、使用することができる。なお、不凍ポリアミノ酸は、細胞毒性が低く、ジメチルスルホキシド等と異なり、融解時に除去する必要はない。

【0035】

また、本発明に係るブタ生殖細胞の凍結保存液を、ブタ生殖細胞の凍結保存用キットとして提供することもできる。当該キットには、凍結保存用組成物に加えて、例えば凍結保存に使用する容器、キットの取扱説明書等を含むことができる。

【実施例0036】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【0037】

〔実施例１〕不凍ポリアミノ酸を用いたブタ精子の凍結保存
１－１．ジメチルグリタル酸変性ポリリジン（DMGA-PLL）の調製
ε-ポリ-L-リジン(ＪＮＣ社、分子量4000)の25％水溶液に、モル％で65％の3,3-ジメチルグルタル酸無水物（ＤＭＧＡ、シグマアルドリッチ）または無水コハク酸（東京化成）を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル％についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。

【0038】

１－２．１次希釈液及び２次希釈液の調製
まず、人工授精の際におけるブタ精液用の希釈液であるＮＳＦ（Niwa and Sasaki freezing extender）として、下記＜表１＞のように、従来のものから修正して用いた。ＮＳＦは、下記の組成で混合した後、延伸処理して上澄み液を採取したものである。

【0039】

＜表１＞NSFの組成（100ml調整時）

【0040】

上記表１のNSFをベースにして、１次希釈液及び２次希釈液を下記のとおりに調製した。
・１次希釈液：NSF 99.26％およびOrvus ES Paste 0.74％（体積比）の混合液。ここで、Orvus ES Pasteは、卵黄に含まれる成分を均一に溶解させるために用いる界面活性剤である。
・２次希釈液：NSF 91.26％、Orvus ES Paste 0.74％、グリセリン6％、および、DMGA-PLLまたはCPLLの25重量％溶液2％（体積比）の混合液。

【0041】

１－３．ブタ精子の凍結保存
食用ブタ（デュロック）の精子を凍結保存するにあたり、精子の濃度を測定後、前処理液（モデナ液）、1次希釈液および2次希釈液を用いて定法により希釈・平衡しつつ、徐々に温度を下げるようにした。この際、1次希釈液と2次希釈液とは同一の量を用いるようにした。具体的には、下記のとおりに行った。

【0042】

（１）前処理
採取した精液を、37℃に温めたモデナ(Modena)液により希釈し、遠心分離処理（3000rpm、25℃、15分間）後、パスツールピペットを接続したアスピレーターを用いて、沈殿物（精子）を吸引しないように上澄みを除去した。次いで、精子濃度が10.0×10⁸匹/mlになるように前処理液（モデナ液）を添加して懸濁した。ここで、モデナ(Modena)液としては、下記表２の組成のものを用いた。

【0043】

＜表２＞モデナ液の組成（1000ml調整時）

【0044】

（２）1次希釈
再度、前処理の際と同様に、遠心分離処理し、上澄みを除去した。そして、精子濃度が20.0×10⁸匹/mlになるように1次希釈液を添加して懸濁させた。次いで、15℃のインキュベーター内に30分間、10℃のインキュベーター内に1.5時間、及び5℃のインキュベーター内に1時間、この順に静置した。

【0045】

（３）2次希釈
上記の1次希釈で得られた懸濁液に、1次希釈液と等量の2次希釈液を数回に分けて添加することで、精子の最終濃度が10.0×10⁸匹/mlになるように調整した。次いで、5℃のインキュベーター内にて20分間静置した。

【0046】

（４）保存用ストローへの充填と凍結保存
以上のように作製した精子希釈液を保存用ストローへ0.5mlずつ充填し、ストロー封入器を用いて封入した。次いで、ストローを液体窒素の上面4cmの位置に10分間保持することにより予備凍結後、液体窒素中に移して保存した。

【0047】

（５）融解・人工授精
凍結ストローを温湯中で融解し、注入器を用いて人工授精した。

【0048】

１－４．DMGA-PLL及びCPLLを0.25重量％添加した場合のブタの妊娠および分娩状況に及ぼす影響
DMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）またはCPLL（コハク酸変性ポリリシン）を、上記2次希釈液に0.5重量％となるように添加することで、凍結保存液中に0.25重量％の濃度で含有されるようにした。後述するように、CPLLおよびDMGA-PLLのいずれにおいてもNSFへの最適添加濃度は0.25重量％であることが示された。

【0049】

上記の手順で、凍結保存したブタ精子を雌（ランドレース×大ヨークシャー）に人工授精し、妊娠および分娩状況について調査した。同時に、カルボキシル化リジン無添加の液中で凍結保存した精子、および、低温（17℃）で３日間保存した精子を用いた人工授精も実施した。このようにして人工授精したブタの妊娠および分娩状況に及ぼす影響について調べた結果を、下記表３にまとめて示す。

【0050】

低温（17℃）での保存は、ブタの人工授精のために子畜生産の現場で一般に行われている方法にしたがって行った。詳しくは、雄豚から採精後、37℃に加温したHIRO-SWINE B液にて希釈したものを、遮光可能な容器に入れて25℃の環境を維持しながら運搬し、その後緩やかに17℃まで冷却して保存した。なお、別途の精子運動解析装置（Sperm Motility Analysis System: SMAS）を用いた実験により、15～17℃で３日間の保存までは、精子の運動性（静止運動率及び直線速度）の低下の兆候は見られなかった。

【0051】

下記表３において、「総産子数」及び「生存産子数」の括弧の中の数字は、分娩した一頭あたりの数である。下記表３の右端には、「生存産子数」を「人工授精頭数」で割った値を示す。なお、「生存産子数」は、分娩時に生存していた産子の数である。

【0052】

＜表３＞精子凍結保存液へのCPLLおよびDMGA-PLLの添加が人工授精したブタの妊娠および分娩状況に及ぼす影響

【0053】

^*人工授精頭数に対する割合
^**妊娠頭数に対する割合
^***生存産子数/人工授精頭数
^a-c各カラムの異符号間に有意差あり (P<0.01あるいは0.05)

【0054】

表３の右端の結果によると、DMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）を0.25重量％含有する所定の凍結保存液を用いた場合に、凍結を行わずに比較的低温（17℃）にて短時間保存した場合と、あまり差がなかった。このことから、子畜生産の現場などに適用可能なレベルでの凍結保存効果が得られたと判断された。

【0055】

一方、DMGA-PLL（ジメチルグリタル酸変性ポリリシン）やCPLL（コハク酸変性ポリリシン）の濃度が、融解後のブタ精子の生存指数、体外発生能及び体外受精能に及ぼす影響について、上記表３の実験の前に予め調べておいた。この実験結果を、図１～６に示す。

【0056】

上述の手順にて、凍結保存液として、上記修正NSF（トレハロースベース）に、3.0％のグリセリンと、0、0.125、0.25および0.5％のカルボキシル化リジン（DMGA-PLLまたはCPLL）が含有されるようにしたものを用い、食用ブタ（デュロック）の精子を凍結保存した。融解0、3、6、9および12時間後に精子の活力を顕微鏡下で観察し、得られた結果から精子生存指数を算出した。ここで、精子生存指数は、顕微鏡観察により、運動性を有していると判断された精子の割合とその運動力の強弱を数値化したものである。

【0057】

また、凍結保存したブタ精子の体外受精能について調査するために、食肉センター由来の卵巣から回収・作出した体外成熟卵に、融解後の精子を媒精した。媒精12時間後の卵子を固定・染色して受精状況を観察した。

【0058】

最後に、種々の濃度のCPLLを添加した液中で凍結保存したブタ精子を用いて作出した体外受精卵の体外発生能について調査した。媒精12時間後の卵子を発生用培地に移して培養を継続し、2日後に卵割状況および7日後に胚盤胞形成状況を観察した。

【0059】

図１～３には、カルボキシル化リジンとしてDMGA-PLLを用いた場合に、DMGA-PLLの濃度が、融解後のブタ精子の生存指数、融解後のブタ精子を用いて作出した体外受精卵の体外発生能、及び融解後のブタ精子の体外受精能に及ぼす影響について、それぞれ示す。また、図４～５には、カルボキシル化リジンとしてDMGA-PLLに代えてCPLLを用いた場合に、CPLLの濃度が融解後のブタ精子の生存指数、及び、融解後のブタ精子を用いて作出した体外受精卵の体外発生能に及ぼす影響について、それぞれ示す。

【0060】

DMGA-PLLを用いた場合、図１に示すように、融解0～9時間後の精子生存指数には、異なった濃度間で有意な差は見られなかったが、融解12時間後の精子生存指数は、0.25％のDMGA-PLLを添加した区が無添加区より有意に高くなった。また、図２に示すように、体外発生能に関して、胚盤胞形成率は0.25％のDMGA-PLLを添加した区が無添加区より有意に高くなった。但し、卵割率での差は有意とは言えなかった。なお、図３に示すように、体外受精能では濃度の違いによる有意な差は見られなかった。

【0061】

CPLLを用いた場合、図４に示すように、融解0～３時間後の精子生存指数には、異なった濃度間で有意な差は見られなかったが、融解6～12時間後の精子生存指数は、0.125～0.25％のCPLLを添加した区が無添加区より有意に高くなった。また、図５に示すように、体外発生能に関して、胚盤胞形成率は0.25％のCPLLを添加した区が無添加区より有意に高くなった。但し、卵割率での差は有意とは言えなかった。

【0062】

〔実施例２〕不凍ポリアミノ酸を用いたブタ胚（胚盤胞）の凍結保存
食用ブタ（デュロック）の精子を用いて体外受精を行い、その6日後に得られた初期胚盤胞を３～１４日間凍結保存し、融解1日後、及び2日後の生存状況について調べた。具体的には、下記のとおりに行った。

【0063】

（１）基礎培地、第1および第2平衡液、及び凍結保存液の調製
・基礎培地：下記表４に示すHEPES-PZM-3。
・第1平衡液：基礎培地に、10％のエチレングリコール、20％のFBS（ウシ胎児血清）および5％のCPLL溶液を含有するように添加。
・第2平衡液：基礎培地に、10％のエチレングリコール、1％のポリエチレングリコール、0.3Mのトレハロース、20％のFBSおよび10％のCPLL溶液を含有するように添加。

【0064】

・凍結保存液：基礎培地に、33％のエチレングリコール、2％のポリエチレングリコール、0.6Mのトレハロース、20％のFBSおよび20％のCPLL溶液を含有するように添加。

【0065】

＜表４＞基礎培地の組成（100ml調整時）

【0066】

（２）凍結保存のための一連の操作
・胚の準備：交配させた雌から胚盤胞を回収あるいは体外受精後に体外培養した卵子から胚盤胞に発生したものを回収。
・平衡液および凍結液での処理：ブタ胚を第1平衡液、第2平衡液、及び凍結保存液中へと順に移すことにより脱水する。
・凍結保存：処理後の胚をクライオトップの先端に乗せ、液体窒素に浸漬して、３～１４日間保存する。

【0067】

（２）融解
・融解液の調製：基礎培地に、10％のエチレングリコール、0.3Mのトレハロースおよび20％のFBSを含有するように添加。
・融解の操作：液体窒素から取り出したクライオトップの先端を融解液に浸漬して胚を融解する。胚を融解液中で平衡した後に通常の培地へ移す。

【0068】

融解後、１日後及び２日後の生存状況について調べた結果を、下記の表５～１０に示す。下記にて、拡張胚盤胞は、体外受精6日後に得られたものである。

【0069】

＜表５＞凍結保存液中のCPLL濃度が、融解したブタ体外受精卵由来初期胚盤胞の生存状況に及ぼす影響

【0070】

実験回数：5回
^a-b異符号間に有意差あり (P<0.01)

【0071】

＜表６＞凍結保存液中のCPLL濃度が、融解したブタ体外受精卵由来拡張胚盤胞の生存状況に及ぼす影響

【0072】

実験回数：5回
^a-b異符号間に有意差あり (P<0.05)

【0073】

表５に示すように、体外受精6日後に得られた初期胚盤胞を凍結保存した場合、融解1日後の生存率には異なった濃度間で有意な差は見られなかったが、融解2日後の生存率は、10％のCPLLを添加した区が無添加区より有意に高くなった。また、表６に示すように、体外受精6日後に得られた拡張胚盤胞を凍結保存した場合には、融解1日後の生存率は、10％のCPLLを添加した区が無添加区より有意に高くなったが、融解2日後の生存率には、異なった濃度間で有意な差は見られなかった。

【0074】

表５～６に示されるとおり、カルボキシル化ポリリジンとしてCPLLを用い、CPLLの濃度を約10重量％とする場合、初期胚盤胞及び拡張胚盤胞についての凍結保存効果が見られた。

【0075】

＜表７＞凍結保存液中のDMGA-PLL濃度が、融解したブタ体外受精卵由来初期胚盤胞の生存状況に及ぼす影響

【0076】

実験回数：5回
^a-b異符号間に有意差あり (P<0.01あるは0.05)

【0077】

＜表８＞凍結保存液中のDMGA-PLL濃度が、融解したブタ体外受精卵由来拡張胚盤胞の生存状況に及ぼす影響

【0078】

実験回数：5回
^a-b異符号間に有意差あり (P<0.01あるいは0.05)

【0079】

表７に示すように、体外受精6日後に得られた初期胚盤胞を凍結保存した場合、融解1日後の生存率は、10％のDMGA-PLLを添加した区が無添加区より有意に高くなった。また、表８に示すように、体外受精6日後に得られた拡張胚盤胞を凍結保存した場合には、融解2日後の生存率は、10％のDMGA-PLLを添加した区が無添加区より有意に高くなった。

【0080】

表７～８に示されるとおり、カルボキシル化ポリリジンとしてDMGA-PLLを用い、DMGA-PLLの濃度を約10重量％とする場合、初期胚盤胞及び拡張胚盤胞についての凍結保存効果が見られた。

【0081】

＜表９＞凍害保護剤が、融解したブタ体外受精卵由来初期胚盤胞の生存状況に及ぼす影響