特開 2023-171348 酵素が増強されたＡＤＡＭＴＳ－１３活性アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023171348

(43)【公開日】2023-12-01

(54)【発明の名称】酵素が増強されたＡＤＡＭＴＳ－１３活性アッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/37 20060101AFI20231124BHJP

   C12Q 1/32 20060101ALN20231124BHJP

   C12Q 1/40 20060101ALN20231124BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALN20231124BHJP

   C07K 14/745 20060101ALN20231124BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20231124BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/37 ZNA

C12Q1/32

C12Q1/40

C12Q1/34

C07K14/745

C07K19/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023082692

(22)【出願日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】22174472.5

(32)【優先日】2022-05-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】510259921

【氏名又は名称】シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス プロダクツ ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ヘルベルト・シュヴァルツ

(72)【発明者】

【氏名】フランク・フィッツトゥーム

【テーマコード（参考）】

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ36

4B063QR04

4B063QR48

4B063QR65

4B063QX01

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA42

4H045DA65

4H045DA89

4H045EA50

4H045FA50

(57)【要約】

【課題】試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を、効率的で、時間を節約した、自動化可能なやり方で検出することが可能な方法および手段を提供すること。
【解決手段】本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を判定するための方法であって、試料を、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）などのレポーター酵素に連結しているフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ポリペプチドと接触させることを含む方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を判定するための方法であって、以下の工程：
ａ．試料を、
ｉ．ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である阻害されたレポーター酵素複合体、ならびに
ｉｉ．レポーター酵素基質
と混合して反応混合物を提供する工程；
ｂ．活性化されたレポーター酵素によって変換された反応混合物中のレポーター酵素基質の量を測定する工程を含み、
変換されたレポーター酵素基質の測定された量は試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性に比例する方法。

【請求項2】

レポーター酵素は、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、アルファ－アミラーゼ、もしくはグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、またはそれらの機能的バリアントである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

変換されたレポーター酵素基質の測定は、分光光度、輝度、または電気化学技術によって達成する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

阻害されたレポーター酵素複合体は、好ましくはスペーサーを介して、より好ましくは３から１０個の原子を有するスペーサーを介して互いに共有結合しているＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するＶＷＦポリペプチドおよびレポーター酵素を含む、請求項１～３のいずれかに１項に記載の方法。

【請求項5】

ＶＷＦポリペプチドは、ＶＷＦのＡ２ドメインを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ＶＷＦポリペプチドは、配列番号１から配列番号２４のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

ＶＷＦポリペプチドは、Ｃ末端にエピトープタグ、好ましくはビオチン、ＦＩＴＣ、ストレプトアビジン、ＧＳＴ、Ｈｉｓ、Ｆｌａｇ、ＡＣＰ、ＥＬＫ１６、ＨＡ、またはＭＢＰを備えている、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

阻害されたレポーター酵素複合体は、ＶＷＦポリペプチドに特異的に結合している抗体、アプタマー、およびアフィマーからなる群の結合相手をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

特異的に結合している結合相手は、ＶＷＦポリペプチドのエピトープタグに結合している、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

試料は、体液、好ましくは、全血、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、または涙液である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である阻害されたレポーター酵素複合体を含有する第１の試薬、ならびにレポーター酵素基質および場合によりレポーター酵素の１つまたはそれ以上の補因子を含有する第２の試薬を含むキット。

【請求項12】

試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を判定するための、ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するＶＷＦポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である阻害されたレポーター酵素複合体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を判定するための方法であって、試料を、ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有し、レポーター酵素に連結しているフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ポリペプチドを含む阻害されたレポーター酵素複合体と接触させることを含む方法に関する。本発明は、このような阻害されたレポーター酵素複合体、レポーター酵素基質、および場合によりレポーター酵素の１つまたはそれ以上の補因子を含有する試薬を含むキットにさらに関する。本発明は、生物学的試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を判定するための、このような阻害されたレポーター酵素複合体の使用にさらに関する。

【背景技術】

【0002】

ＡＤＡＭＴＳ－１３（トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３）は、インビボにおいてフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を分解する酵素である。血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）などの障害を引き起こすＡＤＡＭＴＳ－１３酵素活性の先天性および後天性欠損症がある。血漿試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を測定するための公知のアッセイは、リストセチン補因子アッセイによって、分解されたＶＷＦ活性の量を判定することによって作用する（特許文献１）。これは、ＶＷＦを基質として比較的少量の試料に添加し、ＡＤＡＭＴＳ－１３を活性化してから、非常に長いインキュベーション期間をかけて（一晩）ＶＷＦを分解することによって達成される。このアプローチでは、血漿中のＶＷＦの活性は大きく変動しやすいため、試料自体が混合物に与えるＶＷＦの関与をできるだけ少なくすることが重要である。さらに、測定するのは試料のＡＤＡＭＴＳ－１３活性のみであるため、基質が混合物にＡＤＡＭＴＳ－１３活性を与えてはならない。

【0003】

同様に、大きなＶＷＦ多量体の喪失を検出するために、コラーゲン結合アッセイを使用することができる（特許文献２）。このＡＤＡＭＴＳ－１３活性アッセイでは、少量の血漿試料しか使用することができず、天然のＶＷＦは非常にゆっくりと分解されるため、インキュベーション期間も非常に長くなる。

【0004】

ＡＤＡＭＴＳ－１３活性アッセイは、熱処理したＶＷＦ欠損血漿を使用することによって改善された。これにより、インキュベーション期間が６０分に短縮された（非特許文献１を参照のこと）。先行技術の別のアッセイでは、ＶＷＦポリペプチドをＡＤＡＭＴＳ－１３の基質として使用する。切断産物を定量的に測定し、ＡＤＡＭＴＳ－１３活性と相関させる（特許文献３を参照のこと）。

【0005】

別のアッセイは特許文献４に記載されている。ＡＤＡＭＴＳ－１３の切断部位を含有するポリペプチドを基質として使用する。断片の形成を測定する。

【0006】

別の方法は非特許文献２に記載されている。このアプローチは、ＡＤＡＭＴＳ－１３活性を判定するためにポリペプチド基質を使用し、この基質は、ＶＷＦのＡ２ドメイン、特にＡ２ドメインのＤ１５９６からＲ１６６８までの７３アミノ酸残基からなり、ＶＷＦ７３と呼ばれている。これは、検出のためにＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）試薬で修飾された。同様のアプローチが特許文献５に記載されており、ＶＷＦポリペプチド中のアミノ酸の置換または欠失によってＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドのより効果的な切断が達成される。切断は同様にＦＲＥＴ技術によって検出される。しかし、古典的な凝固分析装置では通常、ＦＲＥＴ検出技術を選択することができないため、そのような機器においてこれらのアプローチを応用することはできない。

【0007】

市販のアッセイ（例えば、Ｔｅｃｈｎｏｚｙｍ ＡＤＡＭＴＳ－１３活性試験またはＨｅｍｏｓＩＬ Ａｃｕｓｔａｒ ＡＤＡＭＴＳ－１３活性アッセイ）では、抗体検出法の一部としてＶＷＦ７３ポリペプチドを使用する。ここでは、ＶＷＦ７３ポリペプチドは、試料と接触させる固相上に固定化されている。ＡＤＡＭＴＳ－１３活性によって形成されるＶＷＦ断片は、次に抗体によって認識される。これらのヘテロジニアスアッセイの欠点は、洗浄工程が必要なことである。したがって、通例の凝固分析装置での処理には適していない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２００４／００５４５１号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２０００／０５０９０４号パンフレット

【特許文献3】米国特許出願公開第２００７／０６５８９５号（Ａ１）

【特許文献4】米国特許出願公開第２００５／１８６６４６号（Ａ１）

【特許文献5】国際公開第２０１３／０７１１６８号パンフレット

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋｏｓｔｏｕｓｏｖ他、２００６、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ；１１８（６）：７２３～３１

【非特許文献2】Ｋｏｋａｍｅ他、２００５、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２９：９３～１００

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、本発明の目的は、試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を、効率的で、時間を節約した、自動化可能なやり方で検出することが可能な方法および手段を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

この目的は、独立請求項の主題によって達成される。従属請求項は、本発明のさらなる有利な態様を示している。

【0012】

本発明の目的は、試料を、ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である阻害されたレポーター酵素複合体、ならびにレポーター酵素基質と混合して反応混合物を形成し、試料のＡＤＡＭＴＳ－１３活性によって活性化されたレポーター酵素によって変換された反応混合物中のレポーター酵素基質の量を測定することによって本質的に達成される。こうして測定された変換されたレポーター酵素基質の量は、試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性に比例する。

【0013】

この効果は、試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を効率的かつ時間を節約したやり方で判定できること、およびこの方法をホモジニアスアッセイ形式で、すなわち、洗浄工程なしで実行でき、したがって一般的な凝固分析装置での自動処理に適していることである。

【0014】

したがって、本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を判定するための方法であって、以下の工程：
ａ．試料を、
ｉ．ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である阻害されたレポーター酵素複合体、ならびに
ｉｉ．レポーター酵素基質
と混合して反応混合物を提供する工程；
ｂ．活性化されたレポーター酵素によって変換された反応混合物中のレポーター酵素基質の量を測定する工程を含み、
変換されたレポーター酵素基質の測定された量が試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性に比例する方法を提供する。

【0015】

レポーター酵素は、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、アルファ－アミラーゼ、もしくはグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、またはそれらの機能的バリアントであってもよい。特に好ましいレポーター酵素は、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）である。場合により、１つまたはそれ以上の補因子を使用または存在させることができる。

【0016】

変換されたレポーター酵素基質の測定は、分光光度、輝度（例えば、蛍光測定）、または電気化学技術によって達成することができる。

【0017】

好ましい実施形態では、阻害されたレポーター酵素複合体中のＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するＶＷＦポリペプチドおよびレポーター酵素は、互いに共有結合している。スペーサーを介した結合が好ましく、３～１０個の原子を有するスペーサーを介した結合が最も好ましい。

【0018】

ＶＷＦポリペプチドはＶＷＦのＡ２ドメインを含むことがさらに好ましい。

【0019】

本発明の特に好ましい実施形態では、ＶＷＦポリペプチドは、配列番号１から配列番号２４のいずれかのアミノ酸配列を有する。

【0020】

ＶＷＦポリペプチドは、Ｃ末端にエピトープタグを備えることができる。好ましいエピトープタグは、ビオチン、ＦＩＴＣ、ストレプトアビジン、ＧＳＴ、Ｈｉｓ、Ｆｌａｇ、ＡＣＰ、ＥＬＫ１６、ＨＡ、またはＭＢＰである。

【0021】

本発明による方法では、ＶＷＦポリペプチドのレポーター酵素への連結によるレポーター酵素の阻害は、反応混合物中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性によって取り消され、これは、連結したＶＷＦポリペプチドのＡＤＡＭＴＳ－１３酵素によるタンパク質分解切断によって達成される。ここで、連結したＶＷＦポリペプチドによって引き起こされるレポーター酵素の阻害は、ＶＷＦポリペプチドへの抗体または何らかのその他の特異的な結合相手、例えば、アプタマーもしくはアフィマーの結合によって増強されることが特に好ましい。したがって、好ましくは、阻害されたレポーター酵素複合体は、ＶＷＦポリペプチドに特異的に結合している抗体、アプタマー、およびアフィマーからなる群の結合相手をさらに含む。

【0022】

特定の実施形態では、この場合の特異的に結合している結合相手は、ＶＷＦポリペプチドのエピトープタグに結合している。

【0023】

試料は体液、例えば、全血、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、または涙液であってもよい。

【0024】

本発明は、ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するＶＷＦポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である阻害されたレポーター酵素複合体を含有する第１の試薬、ならびにレポーター酵素基質を含有する第２の試薬を含むキットをさらに提供する。場合により、キットは、レポーター酵素および／またはＡＤＡＭＴＳ－１３プロテアーゼのための１つまたはそれ以上の補因子を含む。補因子は、第２の試薬または別の第３の試薬に存在していてもよい。

【0025】

本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を判定するための、ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するＶＷＦポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である、阻害されたレポーター酵素複合体の使用もさらに提供する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】ＶＷＦポリペプチド（３）のＮ末端にレポーター酵素（１）が連結している、本発明による方法の一実施形態を示した図である。ＶＷＦポリペプチド（３）の連結は、レポーター酵素（１）の活性を阻害し、それによってレポーター酵素基質（２）の変換を妨害する。ＡＤＡＭＴＳ－１３（４）によるＶＷＦポリペプチド（３）のタンパク質分解切断によって、ＶＷＦポリペプチド（３）が切断され、レポーター酵素に断片（６）だけが残る。これにより、レポーター酵素（１）の阻害が取り消されるかまたは大幅に減少するため、レポーター酵素基質（２）はレポーター酵素（１）と相互作用することができ、検出可能な産物（５）に変換される。

【図2】ＶＷＦポリペプチド（３）がＣ末端でエピトープタグ（１０）に結合していることは異なるが、図１で示された方法に実質的に対応している本発明による方法のさらなる実施形態を示した図である。前記エピトープタグは、レポーター酵素（１）の阻害の調節のために、またはタンパク質分解工程後の除去目的のために使用することができる。

【図3】抗体または何らかのその他の特異的な結合相手（２０）がＶＷＦポリペプチド（３）のＣ末端エピトープタグ（１０）に結合していることは異なるが、図２で示された方法に実質的に対応している本発明による方法のさらなる実施形態を示した図である。この相互作用は、レポーター酵素（１）の阻害の調節のために、またはタンパク質分解工程後の除去目的のために使用することができる。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本発明は特定の実施形態に関して説明されているが、この説明は限定的な意味で解釈されるべきではない。

【0028】

本発明の例示的な実施形態を詳細に説明する前に、本発明を理解するための重要な定義を記載する。

【0029】

この説明および添付の特許請求の範囲で使用したように、「ａ」および「ａｎ」の単数形はまた、文脈が明確に別段の指示をしていない限り、それぞれの複数形を含む。

【0030】

本発明に関連して、「およそ」および「約」という用語は、問題になっている機能の技術的効果をさらに確実にするために、当業者が理解する精度の間隔を意味する。この用語は、典型的には、示された数値から±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、さらに好ましくは±５％のずれを示す。

【0031】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は限定的ではないことを理解されたい。本発明の目的のために、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」または「本質的にからなる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」という用語の好ましい実施形態であると考えられる。

【0032】

以後、群が少なくともある特定の数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群も包含することを意味する。

【0033】

さらに、説明または特許請求の範囲における用語「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」、または「第１」、「第２」、「第３」などは、同様の要素を区別するために使用されており、必ずしも順序または時系列を説明するために必要なわけではない。

【0034】

そのように使用される用語は、適切な状況下では交換可能であり、本明細書で記載した本発明の実施形態は、本明細書で記載した順序とは異なる順序で使用できることを理解されたい。用語が技術、方法、または使用の工程に関連する場合、工程間に時間または時間間隔の一貫性はなく、すなわち、別段の指示がない限り、工程は同時に実行されるか、そのような工程の間に、秒、分、時間、日、週などの時間間隔が存在していてもよい。

【0035】

本明細書で記載した特定の方法、手順などは変動し得るので、本発明はそれらに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。

【0036】

図面は概略的な表現であると見なされるべきであり、図面に例示された要素は必ずしも一定の縮尺で示されているわけではない。むしろ、様々な要素は、それらの機能および一般的な目的が当業者に明らかになるように表されている。別段の定義がない限り、本明細書で使用した技術的および科学的用語は全て、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0037】

上述のように、本発明による方法は、生物学的試料におけるＡＤＡＭＴＳ－１３活性のホモジニアス判定に適している。本明細書で使用した用語「ホモジニアス判定」とは、ホモジニアス相における分析の実施を意味する。このアプローチは、結合物質と非結合物質を分離する必要がなく、洗浄工程も必要ないため、迅速で簡単である。ホモジニアス判定は、試料をさらなる反応物と、好ましくは液相、例えば、適切な緩衝系中で「接触させること」を含む。

【0038】

通常、ＡＤＡＭＴＳ－１３活性は亜鉛イオンおよびカルシウムイオンに依存している。反応混合物中にそれらが存在することは、本方法を実施する場合に好ましい。さらに最適な条件は、例えば、ｐＨ６（±１）、低イオン強度、反応混合物中のカルシウムイオン１～１０ｍＭおよび／または亜鉛イオン０．０１～１ｍＭである。さらなる実施形態では、特にクエン酸血漿を使用する場合、バリウムイオンが存在しており、これは、クエン酸結合カルシウムの放出によってＡＤＡＭＴＳ－１３活性がさらに刺激されるからである。特定の実施形態では、ｐＨ７．４およびＮａＣｌ１５０ｍＭは、これらの条件下で活性が約７５％に低下するため、避けるべきである。この方法は、好ましくは＋３７℃でのインキュベーションを想定している。

【0039】

本明細書で記載した「ＡＤＡＭＴＳ－１３活性」は、「トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３」を意味し、「フォン・ヴィルブランド因子切断プロテアーゼ」（ＶＷＦＣＰ）とも呼ばれる。ＡＤＡＭＴＳ－１３は、亜鉛、カルシウム、バリウム、およびその他の金属イオンの存在下で活性化されるプロテアーゼである。フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）をアミノ酸残基Ｙ１６０５とＭ１６０６との間のペプチド結合で切断する血漿タンパク質であり、したがって、そのサイズは限定されており、血小板の接着も制限されている。ＡＤＡＭＴＳ－１３遺伝子の遺伝的変異または、例えば、自己抗体の発達によってＡＤＡＭＴＳ－１３活性が低下した場合、非常に大きなＶＷＦ多量体の蓄積が血小板凝集を引き起こし、したがって微小血管血栓症を引き起こす可能性がある。これは、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の致命的な症候群に相当するおそれがある。本発明において、ＡＤＡＭＴＳ－１３の活性は、ＶＷＦの切断に関連して測定される。

【0040】

「フォン・ヴィルブランド因子」または「ＶＷＦ」は、特に、循環する血小板の血管損傷部位への結合および接着を媒介することによって、抗血友病因子のキャリアとして、および血液凝固系における血小板－血管壁メディエータとして作用するので、止血を維持するために非常に重要な大きな多量体血漿糖タンパク質である。ＶＷＦ遺伝子の変異またはこのタンパク質の欠損は、フォンヴィルブランド病（ＶＷＤ）を引き起こす。ＶＷＦは通常、内皮細胞および巨核球によって発現される。合成されるのは２５０ｋＤａの単量体で、細胞内プロセシング、グリコシル化、多量体化、およびプロペプチドの除去を受け、最終的に成熟ＶＷＦ多量体の形成を引き起こす。ＶＷＦ多量体のサイズは、上述のように、ＶＷＦタンパク質のＡ２ドメインの特定の単一部位でＶＷＦタンパク質を切断するＡＤＡＭＴＳ－１３プロテアーゼによって調節される。

【0041】

ＶＷＦ単量体は、２０５０アミノ酸のタンパク質である。この単量体は、特定の機能を有するいくつかの特定のドメインを含有する。単量体は、とりわけ、凝固第ＶＩＩＩ因子に結合するＤ’／Ｄ３ドメイン；血小板、ヘパリン、およびおそらくコラーゲンのＧＰＩｂ受容体に結合するＡ１ドメイン；ＡＤＡＭＴＳ－１３の露出していない切断部位を露出させるために部分的に展開する必要があるＡ２ドメイン；コラーゲンに結合するＡ３ドメイン；活性化されたときにＲＧＤモチーフが血小板インテグリンαＩＩｂβ３に結合するＣ４ドメイン；このタンパク質のＣ末端の「シスチンノット」ドメインを含有する。単量体は発現された後、通常Ｎ－グリコシル化され、小胞体で二量体を形成し、ゴルジ体でジスルフィド結合を介してシステイン残基を架橋することよって多量体を形成するように配置される。

【0042】

本発明に包含されるＶＷＦポリペプチド配列は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇにおいて寄託番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４２７５－１（ＶＷＦ＿ＨＵＭＡＮ）で検索することができる標準的なヒト型のＶＷＦアイソフォーム１に関する。配列番号２５は、標準的なヒト型のＶＷＦアイソフォーム１に対応する。ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位が位置するＡ２ドメインは、前記標準的なＶＷＦアイソフォーム１（Ｐ０４２７５－１）の１４９８位から１６６８位にわたる。配列番号２４はＶＷＦのＡ２ドメインに対応し、Ｄ１４９８からＲ１６６８位を含む。

【0043】

本明細書で使用した「ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ポリペプチド」という用語は主に、Ｙ１６０５とＭ１６０６との間にＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を含むＡ２ドメイン、またはその断片を意味し、この断片はＹ１６０５とＭ１６０６（Ｔｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６との間；上記の標準配列に基づく）との間にＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を含む。この断片は、Ｙ１６０５とＭ１６０６との間の切断部位でＡＤＡＭＴＳ－１３によるタンパク質分解切断を可能にする立体構造を有しており、すなわち、機能的なＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有している。

【0044】

ＶＷＦポリペプチドは、上記の標準配列と比較して、異なる長さであってもよく、１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を有していてもよい。

【0045】

例えば、ＶＷＦポリペプチドは、例えば、４５から１７１アミノ酸、例えば、６５から１７１アミノ酸、４５から１１０アミノ酸、４５から７６アミノ酸、４５から８２アミノ酸、５０から７３アミノ酸、または５０から７０アミノ酸の長さであってもよい。より好ましいのは、７０から８２アミノ酸、７２から１１０アミノ酸、または７０から７６アミノ酸の長さである。さらなる実施形態では、ＶＷＦポリペプチドは４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１５アミノ酸の長さである。

【0046】

ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するＶＷＦポリペプチドは、１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を有していてもよい。この修飾は、アミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはアミノ酸の化学的修飾であってもよい。前記修飾は、特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ－１３による切断の切断能力および速度に影響を与えることができ；それらは、ポリペプチドの立体構造を変化させたり、ポリペプチドの折り畳み方法に影響を与えたり、検出に役立つ化学的修飾を含んだりすることができる。

【0047】

好ましい実施形態では、修飾は、配列番号２５の１５９９、１６１０、および１６１７位に関する。より好ましくは、配列番号２５の１５９９位のアミノ酸がＱからＫに変化しており、および／または配列番号２５の１６１０位のアミノ酸がＮからＣに変化しており、および／または配列番号２５の１６１７位のアミノ酸がＫからＲに変化している。

【0048】

代替実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸を２，３－ジアミノプロピオン酸（Ａ２ｐｒ）に変化させることができる。特に好ましくは、配列番号２５の１５９９位のアミノ酸はＱから２，３－ジアミノプロピオン酸（Ａ２ｐｒ）に変化しており、および／または配列番号２５の１６１０位のアミノ酸はＮから２，３－ジアミノプロピオン酸（Ａ２ｐｒ）に変化している。代替実施形態では、Ａ２ｐｒに変化したアミノ酸は、２－（Ｎ－メチルアミノ）ベンゾイル基および／または２，４－ジニトロフェニル基で修飾することができる。より好ましくは、１５９９位で変化したアミノ酸は２－（Ｎ－メチルアミノ）ベンゾイル基（Ｎｍａ）で修飾され、１６１０位で変化したアミノ酸は２，４－ジニトロフェニル基（Ｄｎｐ）で修飾されている。この組み合わせでは、修飾されたアミノ酸は、波長３４０ｎｍの照射による２－（Ｎ－メチルアミノ）ベンゾイル基の励起に続いて、蛍光共鳴エネルギーがいわゆるクエンチャー、すなわち２，４－ジニトロフェニル基に移行するＦＲＥＴシステムを表す。

【0049】

好ましくは、ＶＷＦポリペプチドは、配列表の配列番号１～２４の配列のうちの１つを含み、以下の表１に再現される通りである。

【0050】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0051】

本明細書で使用した「阻害されたレポーター酵素複合体」という用語は、レポーター酵素およびＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するＶＷＦポリペプチドからなる複合体を意味し、この複合体は、本発明による方法におけるシグナル生成に役立つ。阻害されたレポーター酵素複合体は、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能であり、したがって試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性の検出を可能にする。ＶＷＦポリペプチドのＡＤＡＭＴＳ－１３媒介切断の結果として活性化されたレポーター酵素は、ＡＤＡＭＴＳ－１３活性の存在または量に応じてレポーター酵素基質を変換し、これは検出可能である。変換されたレポーター酵素基質の測定量は、試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性に比例する。検出は、様々なやり方および様々な方法で達成することができる。ここでは、分光光度測定、発光測定、蛍光測定、および電気化学的検出が好ましい。検出の性質および実施は、レポーター酵素および使用したレポーター酵素基質によって左右される。

【0052】

検出方法は、対照試料および／または較正試料の助けを借りて較正することができる。レポーター酵素は、天然型、すなわち野生型アミノ酸配列を有するものを使用することができるか、または遺伝子改変することができる。例えば、アミノ酸配列を特定の状況に適合させることができ、例えば、レポーター酵素基質の結合を最適化することができるか、または特定の宿主生物におけるタンパク質の発現能力に影響を与えることができる。さらに、相互作用物質との共有結合能力は、システイン、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸などの追加のアミノ酸残基の存在または導入によって達成することができる。

【0053】

好ましい実施形態では、レポーター酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、アルファ－アミラーゼ、またはグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼである。

【0054】

リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）は、ＮＡＤ^＋を消費しながらリンゴ酸を脱水素してオキサロ酢酸を形成する酵素である。ＭＤＨの活性は通常、ＭＤＨ触媒反応、リンゴ酸＋ＮＡＤ^＋→オキサロ酢酸＋ＮＡＤＨにおけるＮＡＤＨの生成を測定することによって判定される。反応の定量的測定は、例えば、３４０ｎｍで直接測定することによって分光光度的に達成するか、または下流のＮＡＤＨの色素による色反応後の比色測定によって、すなわち、レポーター色素の低下および４５０ｎｍの吸収の判定によって、実施することができる。あるいは、ＮＡＤ＋の他に、ＮＡＤＰ＋、チオ－ＮＡＤ＋、またはチオ－ＮＡＤＰ＋を使用することも可能である。

【0055】

ベータ－ガラクトシダーゼは、ガラクトースとその有機的結合相手との間のベータ－グリコシド結合を加水分解する酵素である。ベータ－ガラクトシダーゼは通常、ガラクトースに変換される無色のレポーター基質ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）および４２０ｎｍで分光光度的に定量することができる発色団ｏ－ニトロフェノールを使用して測定される。

【0056】

グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）は、ＮＡＤ＋を使用してグルコース－６－リン酸を６－ホスホグルコノラクトンおよびＮＡＤＨに変換する酵素である。反応の定量的測定は、例えば、３４０ｎｍでＮＡＤＨを直接測定することによって分光光度的に達成するか、または下流のＮＡＤＨの色素による色反応後の比色測定によって、すなわち、レポーター色素の低下および４５０ｎｍの吸収の判定によって、実施することができる。あるいは、ＮＡＤ＋の他に、ＮＡＤＰ＋、チオ－ＮＡＤ＋、またはチオ－ＮＡＤＰ＋を使用することも可能である。さらなる詳細は、当業者によって適切な文献資料に見出すことができる。

【0057】

レポーター酵素としてＧ６ＰＤＨを使用することが特に好ましい。

【0058】

本明細書で使用した「レポーター酵素基質」という用語は、レポーター酵素の活性部位に対して親和性を有し、それによって触媒反応において変換される分子を意味する。レポーター酵素基質は、選択したレポーター酵素に左右される。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）に適したレポーター酵素基質は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオ－ＮＡＤＨ、またはチオ－ＮＡＤＰＨに変換されるＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、チオ－ＮＡＤ＋、またはチオ－ＮＡＤＰ＋である。ベータ－ガラクトシダーゼに適したレポーター酵素基質は、とりわけｏ－ニトロフェノールに変換されるＯＮＰＧである。さらに、特定のレポーター酵素の場合のレポーター酵素基質は、当業者には公知である。

【0059】

レポーター酵素基質に加えて、１つまたはそれ以上の補因子を反応混合物中でさらに使用することができる。本発明の文脈において、「補因子」という用語は、生化学反応の進行に寄与する低分子量物質を意味する。補因子は、例えば、レポーター酵素に共有結合もしくは非共有結合しているか、またはレポーター酵素に組み込まれている。補因子の例は、ＡＴＰ、ＡＤＰ、または金属イオン、例えば、亜鉛、カルシウム、バリウム、マグネシウム、または銅である。

【0060】

ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である、適切な阻害されたレポーター酵素複合体は、共有結合を介してＶＷＦポリペプチドをレポーター酵素に連結することによって提供することができる。レポーター酵素中では、共有結合は、例えば、システイン残基中のチオールまたはスルフヒドリル基の存在、リジン残基中のアミノ基の存在、またはアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基中のカルボキシル基の存在を介して生じる。典型的に、連結は活性化した分子を介して生じる。例えば、システインは、マレイミド、ジスルフィド、ヨードアセトアミド、ハロアセチレン、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、およびその他のジスルフィドと選択的に反応することができる。リジンなどの側鎖第一級アミンを有するアミノ酸は活性化され、スクシンイミドエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、スルホスクシンイミド、またはその他のスクシンイミジルエステル）またはＰＩＴＣもしくはＦＩＴＣなどの特定のイソチオシアネートに結合することができる。カルボキシル基は、カルボジイミドによる活性化によってアミン基に連結することができる。さらなる選択肢は、還元的アルキル化およびトシル化である。さらに、タンパク質への共有結合の反応基として、光反応性分子、例えば、アリールアジドまたはジアジリンを使用することが可能である。この場合、反応は紫外線照射によって惹起される。共有結合は、ＶＷＦポリペプチドのＮ末端のアミノ基またはＶＷＦポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と実施することが好ましい。

【0061】

さらに好ましい実施形態では、結合はスペーサーを介して実施される。「スペーサー」という用語は、レポーター酵素をＶＷＦポリペプチドに共有結合させる分子鎖の任意の構造を意味する。スペーサーは、炭素原子および窒素原子および／または酸素原子および／または水素原子からなっていてもよい。例えば、分子鎖は、主鎖に存在する炭素原子、窒素原子、および酸素原子の総数が、少なくとも３原子、好ましくは３原子から１００原子の間、より好ましくは３原子から３０原子の間、さらにより好ましくは３原子から２０原子の間、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０原子であってもよい。３から１０原子の長さが特に好ましい。別の実施形態では、スペーサーの主鎖の長さは、約０．４ｎｍから約１００ｎｍ、より好ましくは約０．６ｎｍから３０ｎｍの間、例えば、０．６、０．８、１、２、４、８、１０、２０、２５、または３０ｎｍであってもよい。さらに好ましい実施形態では、スペーサーは、ペプチドスペーサー、例えば、２から１０個のグリシン残基を有するグリシンスペーサーである。さらなる実施形態では、スペーサーは、エチレングリコールをベースとした親水性スペーサーであってもよい。

【0062】

ＶＷＦポリペプチドは、自由末端、すなわち、レポーター酵素に連結していない末端に、分子エピトープタグを備えることができる。この分子エピトープタグは、Ｎ末端またはＣ末端に結合させることができる。ＶＷＦポリペプチドのＣ末端での結合が好ましい。本明細書で使用した「分子エピトープタグ」という用語は、抗体結合のエピトープとして、または別の結合相手との分子相互作用の相互作用物質として使用できる小さな有機化学分子または短いアミノ酸配列を意味する。本発明に関連して使用できる分子エピトープタグの例は、ＡＬＦＡタグ、Ａｖｉタグ、Ｃタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、ポリアルギニンタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｇｌｙ－Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＮＥタグ、Ｒｈｏ１Ｄ４タグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ１タグ、Ｓｏｆｔａｇ３タグ、Ｓｐｏｔタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｔ７タグ、ＴＣタグ、Ｔｙタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグなどのペプチドタグである。さらなる例には、ＢＣＣＰタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、Ｈａｌｏタグ、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＨＵＨタグ、マルトース結合タンパク質タグ、チオレドキシンタグ、Ｆｃタグ、ＣＲＤＳＡＴタグ、またはＨｉＢｉＴタグなどのタンパク質タグが含まれる。ビオチン、ＦＩＴＣ、ストレプトアビジン、ＧＳＴ、Ｈｉｓ、Ｆｌａｇ、ＡＣＰ、ＥＬＫ１６、ＨＡ、またはＭＢＰのタグが特に好ましい。あるいは、エピトープタグは、相補的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズするＤＮＡオリゴヌクレオチドの形態で存在していてもよい。

【0063】

図１および図２で例示したように、本発明による方法は、切断されていないＶＷＦポリペプチド、好ましくは配列番号１から配列番号２４までのいずれかによるＶＷＦポリペプチドの連結によって引き起こされ、レポーター酵素がレポーター酵素基質と相互作用または定量的に相互作用することができないことに関与するレポーター酵素の阻害は、タンパク質分解性のＡＤＡＭＴＳ－１３活性によって、すなわち、ＡＤＡＭＴＳ－１３によって誘導される、連結したＶＷＦポリペプチドのＹ１６０５とＭ１６０６との間の切断部位での切断によって取り消されるという事実に基づいている。好ましくはＹ１６０５で終わる断片、またはＭ１６０６で終わる断片にも連結したＶＷＦポリペプチドのトランケーションの結果として、レポーター酵素の活性部位の遮蔽は取り消される。反応物質である酵素基質が反応混合物中に存在する場合、レポーター酵素はそれを定量的に変換することができる。基質の変換は、反応産物の測定によって測定することができる。前記測定は、使用した試料中に存在するＡＤＡＭＴＳ－１３の量の定量的判定である。本明細書で使用した「定量的判定」という用語は、ＡＤＡＭＴＳ－１３の量と、連結したＶＷＦポリペプチドのタンパク質分解切断の結果として、活性化されたレポーター酵素によって変換されたレポーター酵素基質の量との間が正比例することを意味する。結果として、反応混合物中に存在するＡＤＡＭＴＳ－１３活性の量を示すことが可能である。

【0064】

例えば、図３で例示したさらなる実施形態では、連結したＶＷＦポリペプチドによる阻害は、結合相手のＶＷＦポリペプチドの遠位端への結合によって増強される。連結したＶＷＦポリペプチドの「遠位」端は、レポーター酵素との連結部位の反対側にあるポリペプチドの末端、または連結部位から見てポリペプチドのより離れた領域を意味すると理解されるべきである。前記末端は、好ましくは、ポリペプチドの連結していないＣ末端であるが、あるいは、連結していないＮ末端であってもよい。本明細書で使用した「結合相手」という用語は、ポリペプチドの前記遠位領域に特異的に結合できる、当業者に公知の全単位を意味する。さらなる特定の実施形態では、結合相手の結合部位は、連結したＶＷＦポリペプチドのその他の部位またはその他の領域にあってもよく、例えば、非遠位領域のエピトープであってもよい。好ましくは、そのような結合部位は、ＶＷＦポリペプチドのＹ１６０５とＭ１６０６との間のＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位に対して遠位にある。好ましくは抗体または何らかのその他の結合相手によって認識される、例えば、上記で定義したような分子エピトープタグが遠位端に存在することがより好ましい。さらに好ましい実施形態では、抗体によって認識される末端エピトープが存在する。

【0065】

ＶＷＦポリペプチド、好ましくはＡＤＡＭＴＳ－１３の存在下でレポーター酵素複合体から切断されるＶＷＦポリペプチドの領域に結合相手がさらに結合することによって、ＶＷＦポリペプチドがタンパク質分解切断されない間にレポーター酵素の阻害が増強される。

【0066】

レポーター酵素複合体の阻害を増強するための結合相手には、例えば、特異的に結合する抗体、アプタマー、またはアフィマーが含まれる。さらに、人工抗体模倣体、すなわち、典型的には抗体の範囲内の結合親和性で標的分子に特異的に結合する高分子有機または無機構造が含まれる。

【0067】

本明細書で使用した「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）および任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。さらなる実施形態では、本発明の抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、マウス、ヒト、ヒト化、もしくはキメラ抗体、または免疫グロブリン分子全体が含まれる。

【0068】

本明細書で使用した「アプタマー」という用語は、標的エピトープに特異的に結合するペプチドまたは核酸を意味する。アプタマーは、典型的には、それらの選択的結合特性に基づいて、核酸および／またはペプチドのプールから選択される。「核酸アプタマー」は、短い核酸分子、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、もしくはＡＮＡ、または当業者に公知の任意のその他の適切な核酸形式であり、タンパク質標的分子に特異的に結合することができる。「ペプチドアプタマー」は、タンパク質標的と相互作用し、それに特異的に結合することができる短いペプチドである。典型的には、ペプチドアプタマーは、両端でタンパク質足場に結合する可変ペプチドループを含む。この２つの構造の制約により、ペプチドアプタマーの結合親和性は大幅に増加し、したがって抗体の結合親和性に匹敵すると考えられる。可変ループ長は、好ましくは、１０から２０個のアミノ酸から構成される。

【0069】

ペプチドアプタマーの好ましいサブフォームは「アフィマー」である。これは、シスタチン群から人工的に生成されたタンパク質である。アフィマーは、プロテアーゼ阻害剤シスタチンＡをベースにしており、タンパク質設計によって分子表面で個々に修飾されている。その結果、特異的なアフィマーは、特異的に選択された分子に結合することができる。シスタチン成分は、例えば、表面に挿入された配列、例えば、アルファヘリックスの立体構造を安定化するための足場として機能する。アフィマーは、生物学的半減期が長く、熱安定性が高く、比較的長期間安定して使用できるという利点がある。

【0070】

ＶＷＦポリペプチドの遠位端に特異的に結合している結合相手の存在は、連結したＶＷＦポリペプチドの阻害効果を増加させる。特定の実施形態では、それによって、機能的なＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を含む４５から１７１アミノ酸のアミノ酸長を有する、上記のような比較的短いＶＷＦ断片を使用することが可能である。

【0071】

本明細書で使用した「試料」という用語は、脊椎動物の体液、好ましくは哺乳動物の体液、より好ましくはヒトの体液を含む。ＡＤＡＭＴＳ－１３活性が存在する可能性がある全ての種類の体液が含まれる。特に、全血、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、または涙液が好ましい。

【0072】

本発明のさらなる態様は、ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）ポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である阻害されたレポーター酵素複合体を含有する第１の試薬、ならびに本明細書で記載したようなレポーター酵素基質および場合によりレポーター酵素の１つまたはそれ以上の補因子を含有する第２の試薬を含むキットに関する。さらに、キットは、特定の実施形態では、抗体、アプタマー、またはアフィマーなどの結合相手を含有することができる。レポーター酵素およびＶＷＦポリペプチドは、方法の文脈で本明細書で提供した、または例示的で非限定的な図で説明される、定義および説明に対応する。

【0073】

本発明によるキットは、例えば、ＡＤＡＭＴＳ－１３活性の欠損またはＡＤＡＭＴＳ－１３活性のレベルを判定できるようにするために、個体、例えば、患者またはヒトの試料におけるＡＤＡＭＴＳ－１３活性のインビトロ判定のための診断用組成物である。その結果、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の存在またはＴＴＰの素因を判定することがさらに可能である。さらに、キットは、使用説明が記載された添付文書を含有することができる。さらに、キットは、定義されたＡＤＡＭＴＳ－１３活性を有する１つまたはそれ以上の陽性対照および／または１つまたはそれ以上の標準物質を含有することができる。本発明によるキットは、試料希釈剤および／または基質緩衝液をさらに含有することができる。

【0074】

さらなる態様では、本発明は、生物学的試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性を判定するための、ＡＤＡＭＴＳ－１３切断部位を有するＶＷＦポリペプチドおよびレポーター酵素を含み、ＡＤＡＭＴＳ－１３によるＶＷＦポリペプチドの酵素的切断によって活性化可能である阻害されたレポーター酵素複合体の使用に関する。レポーター酵素およびＶＷＦポリペプチドは、方法の文脈で本明細書で提供した、または例示的で非限定的な図で説明される、定義および説明に対応する。同様に、この使用は、上記で定義した、または非限定的な図で例示した抗体、アプタマー、またはアフィマーなどの結合相手の使用に基づいている。

【0075】

以下の実施例および図は、例示のために提供されている。したがって、実施例および図は限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。当業者であれば、本明細書で提示した原理のさらなる改変を明確に想定することができるであろう。

【実施例0076】

Ａ）阻害されたＧ６ＰＤＨ－ＶＷＦレポーター酵素複合体を生成するためのＶＷＦ７３－Ｇ６ＰＤＨコンジュゲーション
ＮＨＳエステル活性化ＶＷＦ７３ポリペプチド（配列番号１）を使用して、Ｇ６ＰＤＨ（Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ；１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＳＰＢ）、ｐＨ７．３に溶かした凍結乾燥粉末）に対してＧ６ＰＤＨのＮＨ２基を介して共有結合を実施した。ここで、Ｇ６ＰＤＨ１００Ｕ／ｍＬをＶＷＦ７３ポリペプチド１ｍＭに室温で４時間連結させた。次いで、過剰なＶＷＦ７３ポリペプチドを、ＰＤ－１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するゲル濾過および／または、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ－３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する遠心濾過によって除去した。工程は全て室温で実施した。

【0077】

Ｂ）本発明によるＡＤＡＭＴＳ－１３活性の判定
本発明による方法は、Ａｔｅｌｌｉｃａ ＣＯＡＧ ３６０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｉｎｅｅｒｓ）で自動化された方法で行った。これには、３０μＬのＶＷＦ７３－Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート（０．５Ｕ／ｍＬ）（試薬１）と３０μＬの試料および５０μＬの活性化緩衝液（試薬２＝２０ｍＭ ＢＩＳ－トリス、ｐＨ６．０、ＢａＣｌ２ １２．５ｍＭ、ＺｎＣｌ２ ５ｍＭ、ＣａＣｌ２ １．５ｍＭおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）とを混合し、＋３７℃で２０分間インキュベートすることが含まれた。その後、＋３７℃の温度に予め調整した基質溶液（試薬３＝ＭｇＣｌ２ ３．３ｍＭを含む５５ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．８に溶かしたグルコース－６－リン酸０．０１８ＭおよびＮＡＤ＋０．０１８Ｍ）１３０μＬを反応混合物に添加し、ｍＯＤ（Ｇ６ＰＤＨ活性によるＮＡＤ＋の還元の結果としてのＮＡＤＨ＋Ｈ＋の形成の結果として）での反応混合物の吸光度の増加を３４０ｎｍで２分間測定した。ｍＯＤ測定値を使用して、酵素反応の反応速度を決定した（デルタｍＯＤ／分、ΔｍＯＤ／分）。

【0078】

このようにして、５人の健康なドナー、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の２人のドナー、およびＡＤＡＭＴＳ－１３に対する自己抗体を有するがＴＴＰの臨床診断を受けていない１人のドナーのクエン酸血漿試料を、それぞれの場合において３回の独立した反応で試験し、平均を計算した（表３を参照）。

【0079】

試料中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性は、ＡＤＡＭＴＳ－１３欠損血漿で希釈した１００％の任意ＡＤＡＭＴＳ－１３活性を有する健康なドナー（正常血漿）の８０を超えるクエン酸血漿のＦＦＰ（新鮮な凍結血漿プール）の希釈系列から調製したＡＤＡＭＴＳ－１３標準曲線（０％～１００％ＡＤＡＭＴＳ－１３活性）と比較することによって判定した。各希釈工程は、それぞれの場合において３回の独立した反応で試験し、平均を計算した（表２を参照）。

【0080】

【表2】

【0081】

表２の結果は、ＶＷＦ７３－Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートのＶＷＦ７３ポリペプチドの切断および関連するＧ６ＰＤＨ活性の再活性化が、ＡＤＡＭＴＳ－１３活性に関して濃度依存的に起こることを示している。ＡＤＡＭＴＳ－１３活性が増加するにつれて（正常に対する％）、連結したＶＷＦ７３ポリペプチドの切断率が増加し、関連するＧ６ＰＤＨ活性の再活性化によって、３４０ｎｍの波長での反応の吸光度の増加が引き起こされる。実験の結果はまた、記載した方法によって、正常の５％のＡＤＡＭＴＳ－１３活性でも、ＡＤＡＭＴＳ－１３活性のない試料（ＡＤＡＭＴＳ－１３欠損血漿）と十分に区別できることを示している。

【0082】

【表3】

【0083】

表３は、記載した方法によって、ＴＴＰ患者試料（正常の９％を有するＴＴＰ患者０１、正常の７％を有するＴＴＰ患者０２）、またはＡＤＡＭＴＳ－１３活性が減少したＡＤＡＭＴＳ－１３自己抗体を有する患者試料（正常の２１％を有する患者）は、健康な血液ドナーの試料と明確に区別できることを示している。血中のＡＤＡＭＴＳ－１３活性の大幅な低下（残存活性＜５～１０％）は、古典的ＴＴＰ（血栓性血小板減少性紫斑病）（先天性または後天性）の特異的な徴候であると考えられる。

【符号の説明】

【0084】

１ レポーター酵素
２ レポーター酵素基質
３ ＶＷＦポリペプチド
４ ＡＤＡＭＴＳ－１３
５ 検出可能な産物
６ 断片
１０ エピトープタグ
２０

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

2023171348000001.app

【外国語明細書】