特開2023-171937改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、導入キャリア、キット、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法及び細胞製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023171937
(43)【公開日】2023-12-05
(54)【発明の名称】改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、導入キャリア、キット、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法及び細胞製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20231128BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20231128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231128BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20231128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N9/10 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/90 Z
【審査請求】有
【請求項の数】22
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023172885
(22)【出願日】2023-10-04
(62)【分割の表示】P 2020101013の分割
【原出願日】2020-06-10
(71)【出願人】
【識別番号】000003078
【氏名又は名称】株式会社東芝
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】赤星 英一
(72)【発明者】
【氏名】野崎 絵美
(72)【発明者】
【氏名】石原 美津子
(57)【要約】
【課題】 本発明が解決しようとする課題は、より効率的に細胞のゲノムに目的配列を組込むことができる改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、導入キャリア、キット、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法及び細胞製造方法を提供することである。
【解決手段】 実施形態に従う改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列とを含み、非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴＡＴタンパク質であり、典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである。
【選択図】図１
【解決手段】 実施形態に従う改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列とを含み、非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴＡＴタンパク質であり、典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、
典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列と
を含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、
改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド。
典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列と
を含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、
改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド。
【請求項2】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
前記典型的核局在化シグナル、及び前記非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列は、配列番号４及び配列番号３のアミノ酸配列を連結したペプチドである、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、
典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列をコードする塩基配列と
を含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、
改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチド。
典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列をコードする塩基配列と
を含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、
改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
ＤＮＡであり、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列は、配列番号５の配列を含む、請求項４又は５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを構成する各アミノ酸に対応するコドンのうち、少なくとも１つのコドンが、ヒト用にコドン最適化されている、請求項４～６の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記ヒト用にコドン最適化されているとは、前記各アミノ酸に対して次のコドンを用いることである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
アラニン（Ａ）に対して、ＧＣＵ又はＧＣＣ、
システイン（Ｃ）に対して、ＵＧＣ又はＵＧＵ、
アスパラギン酸（Ｄ）に対して、ＧＡＣ又はＧＡＵ、
グルタミン酸（Ｅ）に対して、ＧＡＡ又はＧＡＧ、
フェニルアラニン（Ｆ）に対して、ＵＵＣ又はＵＵＵ、
グリシン（Ｇ）に対して、ＧＧＡ又はＧＧＣ、
ヒスチジン（Ｈ）に対して、ＣＡＣ又はＣＡＵ、
イソロイシン（Ｉ）に対して、ＡＵＣ又はＡＵＵ、
リジン（Ｋ）に対して、ＡＡＡ又はＡＡＧ、
ロイシン（Ｌ）に対して、ＣＵＣ又はＣＵＧ、
メチオニン（Ｍ）に対して、ＡＵＧ、
アスパラギン（Ｎ）に対して、ＡＡＣ又はＡＡＵ、
プロリン（Ｐ）に対して、ＣＣＣ又はＣＣＵ、
グルタミン（Ｑ）に対して、ＣＡＡ又はＣＡＧ、
アルギニン（Ｒ）に対して、ＡＧＡ又はＡＧＧ、
セリン（Ｓ）に対して、ＡＧＣ、ＵＣＣ又はＵＣＵ、
トレオニン（Ｔ）に対して、ＡＣＡ又はＡＣＣ、
バリン（Ｖ）に対して、ＧＵＣ又はＧＵＧ、
トリプトファン（Ｗ）に対して、ＵＧＧ、
チロシン（Ｙ）に対して、ＵＡＣ又はＵＡＵ、
終止コドンに対して、ＵＧＡ、
ここで、Ａはアデニンであり、Ｕはウラシルであり、Ｃはチミンであり、Ｇはグアニンであり、前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合は、Ｕをチミン（Ｔ）に変更したものである。
アラニン（Ａ）に対して、ＧＣＵ又はＧＣＣ、
システイン（Ｃ）に対して、ＵＧＣ又はＵＧＵ、
アスパラギン酸（Ｄ）に対して、ＧＡＣ又はＧＡＵ、
グルタミン酸（Ｅ）に対して、ＧＡＡ又はＧＡＧ、
フェニルアラニン（Ｆ）に対して、ＵＵＣ又はＵＵＵ、
グリシン（Ｇ）に対して、ＧＧＡ又はＧＧＣ、
ヒスチジン（Ｈ）に対して、ＣＡＣ又はＣＡＵ、
イソロイシン（Ｉ）に対して、ＡＵＣ又はＡＵＵ、
リジン（Ｋ）に対して、ＡＡＡ又はＡＡＧ、
ロイシン（Ｌ）に対して、ＣＵＣ又はＣＵＧ、
メチオニン（Ｍ）に対して、ＡＵＧ、
アスパラギン（Ｎ）に対して、ＡＡＣ又はＡＡＵ、
プロリン（Ｐ）に対して、ＣＣＣ又はＣＣＵ、
グルタミン（Ｑ）に対して、ＣＡＡ又はＣＡＧ、
アルギニン（Ｒ）に対して、ＡＧＡ又はＡＧＧ、
セリン（Ｓ）に対して、ＡＧＣ、ＵＣＣ又はＵＣＵ、
トレオニン（Ｔ）に対して、ＡＣＡ又はＡＣＣ、
バリン（Ｖ）に対して、ＧＵＣ又はＧＵＧ、
トリプトファン（Ｗ）に対して、ＵＧＧ、
チロシン（Ｙ）に対して、ＵＡＣ又はＵＡＵ、
終止コドンに対して、ＵＧＡ、
ここで、Ａはアデニンであり、Ｕはウラシルであり、Ｃはチミンであり、Ｇはグアニンであり、前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合は、Ｕをチミン（Ｔ）に変更したものである。
【請求項9】
ＤＮＡであり、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列は、配列番号６又は７の配列を含む、請求項４～８の何れか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
ＤＮＡであり、前記典型的核局在化シグナル及び前記非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号１０の配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
配列番号１８の塩基配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
脂質粒子、及び
前記脂質粒子に封入された、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチド
を備える、細胞のゲノムに目的配列を組込むための導入キャリアであって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、前記典型的核局在化シグナル及び前記非典型的核局在化シグナルを連結させた前記アミノ酸配列をコードする塩基配列とを含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、
前記導入キャリア。
前記脂質粒子に封入された、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチド
を備える、細胞のゲノムに目的配列を組込むための導入キャリアであって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、前記典型的核局在化シグナル及び前記非典型的核局在化シグナルを連結させた前記アミノ酸配列をコードする塩基配列とを含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、
前記導入キャリア。
【請求項13】
前記脂質粒子に、前記目的配列を含むドナーＤＮＡが更に封入されている請求項１２に記載の導入キャリア。
【請求項14】
前記脂質粒子は、その構成成分として、式（１－０１）に示す脂質化合物及び／又は式（１－０２）に示す脂質化合物を含む、請求項１２又は１３に記載の導入キャリア。
【化1】
【請求項15】
細胞のゲノムに目的配列を組込むためのキットであって、
請求項１～３の何れか１項に記載のポリペプチド又は請求項４～１４の何れか１項に記載のポリヌクレオチドと、
前記目的配列を含むドナーＤＮＡと
を少なくとも含むキット。
請求項１～３の何れか１項に記載のポリペプチド又は請求項４～１４の何れか１項に記載のポリヌクレオチドと、
前記目的配列を含むドナーＤＮＡと
を少なくとも含むキット。
【請求項16】
前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドと
前記ドナーＤＮＡとは、
脂質粒子に封入された状態である、請求項１５に記載のキット。
前記ドナーＤＮＡとは、
脂質粒子に封入された状態である、請求項１５に記載のキット。
【請求項17】
目的配列を含むドナーＤＮＡを、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドとともに細胞に導入することを含む、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法であって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列をコードする塩基配列とを含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、方法。
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列をコードする塩基配列とを含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、方法。
【請求項18】
前記導入は、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法又はマグネトフェクション法を用いて行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記導入は、前記リポソーム法により行われ、
脂質粒子と、前記脂質粒子に封入された前記ドナーＤＮＡ及び前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを前記細胞に接触させることを含む、
請求項１８に記載の方法。
脂質粒子と、前記脂質粒子に封入された前記ドナーＤＮＡ及び前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを前記細胞に接触させることを含む、
請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
目的配列を含むドナーＤＮＡを、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドとともに細胞に導入することを含む、細胞の製造方法であって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列をコードする塩基配列とを含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、方法。
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列をコードする塩基配列とを含み、
前記非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、かつ、前記典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである、方法。
【請求項21】
前記導入は、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法又はマグネトフェクション法を用いて行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記導入は、前記リポソーム法により行われ、
脂質粒子と、前記脂質粒子に封入された前記ドナーＤＮＡ及び前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを前記細胞に接触させることを含む、
請求項２１に記載の方法。
脂質粒子と、前記脂質粒子に封入された前記ドナーＤＮＡ及び前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを前記細胞に接触させることを含む、
請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の実施形態は、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、導入キャリア、キット、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法及び細胞製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
トランスポゾン法は細胞のゲノムに目的配列を組込むための方法として注目されている。トランスポゾン法では、トランスポゼースと呼ばれる酵素が用いられる。トランスポゼースは、両端に認識配列を有する目的配列を切り出し、それをゲノムに挿入する機能を有する。例えば、蛾に由来するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースが知られている。
【0003】
細胞のゲノムに目的配列を組込む技術は遺伝子改変細胞、遺伝子改変動物の製造、遺伝子治療及び再生医療等、様々な分野において応用されている。したがって組込み技術の効率化、簡便化の需要が高まっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Li, Xianghong, et al. "piggyBac transposase tools for genome engineering." Proceedings of the National Academy of Sciences 110.25 (2013): E2279-E2287
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明が解決しようとする課題は、より効率的に細胞のゲノムに目的配列を組込むことができる改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、導入キャリア、キット、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法及び細胞製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
実施形態に従う改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、典型的核局在化シグナル及び非典型的核局在化シグナルを連結させたアミノ酸配列とを含み、非典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質であり、典型的核局在化シグナルのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルである。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下、実施形態について添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。
【0009】
実施形態によれば、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースが提供される。本明細書において単に「改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース」と記載するとき、それは改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドの形態を示す。更なる実施形態によれば改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドもまた提供され得る。
【0010】
実施形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースは、例えば細胞のゲノムに目的配列を組込むために使用され得る。したがって、更なる実施形態によれば改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを用いた細胞のゲノムに目的配列を組込む方法、それに用いられるキット及び細胞製造方法もまた提供される。以下、これらの各実施形態について説明する。
【0011】
（第１実施形態）
・改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース
第１実施形態に係る改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１は、図１に示す通り、核局在化シグナルドメイン２とｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースドメイン３とを含む。以下、核局在化シグナルドメイン２を「ＮＬＳドメイン」、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースドメイン３を「ＰＢドメイン」とも称する。
・改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース
第１実施形態に係る改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１は、図１に示す通り、核局在化シグナルドメイン２とｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースドメイン３とを含む。以下、核局在化シグナルドメイン２を「ＮＬＳドメイン」、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースドメイン３を「ＰＢドメイン」とも称する。
【0012】
ＰＢドメイン３は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列から構成されるドメインである。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースは、蛾の一種であるイラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｈｉａ ｎｉ）由来のトランスポゼース又はその誘導体をいう。ＰＢドメイン３として、例えば表１に示す野生型のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列（配列番号１）を用いることができる。
【0013】
【表1】
又は、ＰＢドメイン３の配列は上記に限定されるものではなく、例えば、表１に示す配列に含まれるアミノ酸に置換、付加、挿入、欠失等の変異がある誘導体も使用することができる。例えば、表１に示す配列と９０％以上のアミノ酸配列相同性を有するものを使用することが好ましい。野生型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースの誘導体である表２に示す配列（配列番号２）を用いることも可能である。配列番号２は、配列番号１から下線の７か所のアミノ酸の置換を行ったものであり、トランスポゼースとしての活性がより高いため好ましい。
【0014】
【表2】
ＮＬＳドメイン２は、核局在化シグナル（Ｎｕｃｌｅａ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ：ＮＬＳ）のアミノ酸配列から構成されるドメインである。ＮＬＳドメイン２として、公知の何れかのＮＬＳのポリペプチドを用いることができる。ＮＬＳは、典型的（ｃｌａｓｓｉｃａｌな）ＮＬＳであってもよいし、非典型的（ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌな）ＮＬＳであってもよい。
【0015】
典型的ＮＬＳとして、例えば、表３に示すシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質のＮＬＳ（配列番号３）を用いることができる。
【0016】
【表3】
又は、典型的ＮＬＳとして、ヌクレオプラスミン又はＳｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ Ｙ（ＳＲＹ）のＮＬＳ等を用いることも可能である。
【0017】
非典型的ＮＬＳとして、例えば、表４に示すヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質（配列番号４）を用いることができる。
【0018】
【表4】
又は、非典型的ＮＬＳとして、ボルナ病ウイルス（Ｂｏｒｎａ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ：ＢＤＶ）のｐ１０、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｓｃｒａｍｂｌａｓｅ１（ＰＬＳＣＲ１）、Ｔｙ１インテグラーゼ、ＨＩＶ－１のＲｅｖ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １：ＨＴＬＶ－１）のＲｅｘ、Ｓｔｅ１２、Ｐｈｏ４又はＹａｐ１のＮＬＳ等を用いることも可能である。
【0019】
ＮＬＳドメイン２として、上記何れかのＮＬＳのうち一種を単独で用いてもよく、或いは同種又は異種の複数のＮＬＳを連結して用いてもよい。例えば、典型的ＮＬＳと非典型的ＮＬＳとを連結したものをＮＬＳドメイン２として用いてもよい。そのようなＮＬＳドメインとして、上記のＨＩＶのＴＡＴタンパク質とＳＶ４０ラージＴ抗原タンパク質のＮＬＳとをＮ末端からこの順番で連結した配列を用いることが好ましい。
【0020】
ＮＬＳドメイン２、ＰＢドメイン３は、例えばＮ末端側からこの順で連結されていることが好ましいが、ＰＢドメイン３、ＮＬＳドメイン２の順に連結していてもよい。
【0021】
本明細書において「連結」とは、各ドメインがその機能を発揮することが可能な状態で結合されていることをいう。また、「連結」は、直接結合されている状態と、他の配列を介して結合されている状態との両方を含む。他の配列とは、各ドメインの機能に悪影響を与えないアミノ酸又はポリペプチドであればよい。例えば、他の配列は、各ドメインの由来となる生物のゲノムにおける当該ドメインの周辺の配列、或いはＧＧＧＧＳ配列若しくはＧＳ配列、又はこれらを１～５回繰り返した配列等であることが好ましい。
【0022】
（改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチド）
更なる実施形態によれば、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は塩基配列を構成できるその他のヌクレオチドから構成されるポリマーである。ポリヌクレオチドは、例えば一本鎖、二本鎖又は三本鎖の、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、人工合成ＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、人工合成ＲＮＡ、或いはこれらの何れかの部位若しくは末端を化学修飾した核酸アナログ等であり得る。ポリヌクレオチドは、複数種類のヌクレオチドから構成されてもよく、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、又はＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）等を含んでもよい。
更なる実施形態によれば、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は塩基配列を構成できるその他のヌクレオチドから構成されるポリマーである。ポリヌクレオチドは、例えば一本鎖、二本鎖又は三本鎖の、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、人工合成ＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、人工合成ＲＮＡ、或いはこれらの何れかの部位若しくは末端を化学修飾した核酸アナログ等であり得る。ポリヌクレオチドは、複数種類のヌクレオチドから構成されてもよく、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、又はＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）等を含んでもよい。
【0023】
実施形態に従うポリヌクレオチドは、例えば改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１をコードし、ＮＬＳドメイン２をコードする領域（塩基配列）及びＰＢドメイン３をコードする領域を少なくとも含む。
【0024】
ここで、「コードする」とは目的のポリペプチドを転写及び／又は翻訳し発現できる情報、即ち塩基配列を含むことをいう。情報は、例えばポリペプチドを構成する各アミノ酸に対応するコドンによって特定される。
【0025】
以下にポリヌクレオチドがＲＮＡである一例について説明する。このＲＮＡは、例えば細胞内に導入されることによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能し、細胞内のタンパク質合成機能により翻訳され、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１を細胞内に供給する。
【0026】
ＲＮＡの配列は、導入する細胞の生物種に従いコドン最適化して用いることが好ましい。「コドン最適化」とは、ペプチドを構成する各アミノ酸に対するコドンをその生物種で頻度の高いコドンに変更することをいう。しかしながら、「コドン最適化」は、必ずしもポリペプチドのアミノ酸配列のうち１００％のアミノ酸についてコドンを変更することをいうのではなく、少なくとも１つのアミノ酸に対応するコドンが変更されていることをいう。しかしながら、５０％以上のコドンが変更されていることが好ましい。
【0027】
例えばヒトの細胞を用いる場合は、ヒト用にコドン最適化を行うことが好ましい。以下に、ヒトにおいて頻度が高く、ヒト用にコドン最適化する場合に好ましいコドンをアミノ酸毎に示す。
アラニン（Ａ）：ＧＣＵ又はＧＣＣが頻度が高く好ましいが、ＧＣＣが最も頻度が高くより好ましい。
システイン（Ｃ）：ＵＧＣ又はＵＧＵが頻度が高く好ましいが、ＵＧＣが最も頻度が高くより好ましい。
アスパラギン酸（Ｄ）：ＧＡＣ又はＧＡＵが頻度が高く好ましいが、ＧＡＣが最も頻度が高くより好ましい。
グルタミン酸（Ｅ）：ＧＡＡ又はＧＡＧが頻度が高く好ましいが、ＧＡＧが最も頻度が高くより好ましい。
フェニルアラニン（Ｆ）：ＵＵＣ又はＵＵＵが頻度が高く好ましいが、ＵＵＣが最も頻度が高くより好ましい。
グリシン（Ｇ）：ＧＧＡ又はＧＧＣが頻度が高く好ましいが、ＧＧＣが最も頻度が高くより好ましい。
ヒスチジン（Ｈ）：ＣＡＣ又はＣＡＵが頻度が高く好ましいが、ＣＡＣが最も頻度が高くより好ましい。
イソロイシン（Ｉ）：ＡＵＣ又はＡＵＵが頻度が高く好ましいが、ＡＵＣが最も頻度が高くより好ましい。
リジン（Ｋ）：ＡＡＡ又はＡＡＧが頻度が高く好ましいが、ＡＡＧが最も頻度が高くより好ましい。
ロイシン（Ｌ）：ＣＵＣ又はＣＵＧが頻度が高く好ましいが、ＣＵＧが最も頻度が高くより好ましい。
メチオニン（Ｍ）：使用コドンは１種（ＡＵＧ）であるため、変更の必要はない。
アスパラギン（Ｎ）：ＡＡＣ又はＡＡＵが頻度が高く好ましいが、ＡＡＣが最も頻度が高くより好ましい。
プロリン（Ｐ）：ＣＣＣ又はＣＣＵが頻度が高く好ましいが、ＣＣＣが最も頻度が高くより好ましい。
グルタミン（Ｑ）：ＣＡＡ又はＣＡＧが頻度が高く好ましいが、ＣＡＧが最も頻度が高くより好ましい。
アルギニン（Ｒ）：ＡＧＡ又はＡＧＧが同程度に頻度が高く、どちらも好ましい。
セリン（Ｓ）：ＡＧＣ、ＵＣＣ又はＵＣＵが頻度が高く好ましいが、ＡＧＣが最も頻度が高くより好ましい。ＵＣＣがその次に頻度が高く、好ましい。
トレオニン（Ｕ）：ＡＣＡ又はＡＣＣが頻度が高く好ましいが、ＡＣＣが最も頻度が高くより好ましい。
バリン（Ｖ）：ＧＵＣ又はＧＵＧが頻度が高く好ましいが、ＧＵＧが最も頻度が高くより好ましい。
トリプトファン（Ｗ）：使用コドンが１種（ＵＧＧ）であるため、変更の必要はない。
チロシン（Ｙ）：ＵＡＣ又はＵＡＵが頻度が高く好ましいが、ＵＡＣが最も頻度が高くより好ましい。
終止コドン：ＵＧＡが最も頻度が高くより好ましい。
ここで、Ａはアデニンであり、Ｕはウラシルであり、Ｃはチミンであり、Ｇはグアニンである。
アラニン（Ａ）：ＧＣＵ又はＧＣＣが頻度が高く好ましいが、ＧＣＣが最も頻度が高くより好ましい。
システイン（Ｃ）：ＵＧＣ又はＵＧＵが頻度が高く好ましいが、ＵＧＣが最も頻度が高くより好ましい。
アスパラギン酸（Ｄ）：ＧＡＣ又はＧＡＵが頻度が高く好ましいが、ＧＡＣが最も頻度が高くより好ましい。
グルタミン酸（Ｅ）：ＧＡＡ又はＧＡＧが頻度が高く好ましいが、ＧＡＧが最も頻度が高くより好ましい。
フェニルアラニン（Ｆ）：ＵＵＣ又はＵＵＵが頻度が高く好ましいが、ＵＵＣが最も頻度が高くより好ましい。
グリシン（Ｇ）：ＧＧＡ又はＧＧＣが頻度が高く好ましいが、ＧＧＣが最も頻度が高くより好ましい。
ヒスチジン（Ｈ）：ＣＡＣ又はＣＡＵが頻度が高く好ましいが、ＣＡＣが最も頻度が高くより好ましい。
イソロイシン（Ｉ）：ＡＵＣ又はＡＵＵが頻度が高く好ましいが、ＡＵＣが最も頻度が高くより好ましい。
リジン（Ｋ）：ＡＡＡ又はＡＡＧが頻度が高く好ましいが、ＡＡＧが最も頻度が高くより好ましい。
ロイシン（Ｌ）：ＣＵＣ又はＣＵＧが頻度が高く好ましいが、ＣＵＧが最も頻度が高くより好ましい。
メチオニン（Ｍ）：使用コドンは１種（ＡＵＧ）であるため、変更の必要はない。
アスパラギン（Ｎ）：ＡＡＣ又はＡＡＵが頻度が高く好ましいが、ＡＡＣが最も頻度が高くより好ましい。
プロリン（Ｐ）：ＣＣＣ又はＣＣＵが頻度が高く好ましいが、ＣＣＣが最も頻度が高くより好ましい。
グルタミン（Ｑ）：ＣＡＡ又はＣＡＧが頻度が高く好ましいが、ＣＡＧが最も頻度が高くより好ましい。
アルギニン（Ｒ）：ＡＧＡ又はＡＧＧが同程度に頻度が高く、どちらも好ましい。
セリン（Ｓ）：ＡＧＣ、ＵＣＣ又はＵＣＵが頻度が高く好ましいが、ＡＧＣが最も頻度が高くより好ましい。ＵＣＣがその次に頻度が高く、好ましい。
トレオニン（Ｕ）：ＡＣＡ又はＡＣＣが頻度が高く好ましいが、ＡＣＣが最も頻度が高くより好ましい。
バリン（Ｖ）：ＧＵＣ又はＧＵＧが頻度が高く好ましいが、ＧＵＧが最も頻度が高くより好ましい。
トリプトファン（Ｗ）：使用コドンが１種（ＵＧＧ）であるため、変更の必要はない。
チロシン（Ｙ）：ＵＡＣ又はＵＡＵが頻度が高く好ましいが、ＵＡＣが最も頻度が高くより好ましい。
終止コドン：ＵＧＡが最も頻度が高くより好ましい。
ここで、Ａはアデニンであり、Ｕはウラシルであり、Ｃはチミンであり、Ｇはグアニンである。
【0028】
しかしながら最も頻度が高いコドンの含有量が多すぎると、当該コドン用のｔＲＮＡが枯渇する、或いはポリペプチドのＧＣ含有量が高くなりすぎる等の理由により、翻訳効率がむしろ低下する可能性がある。そのため、２番目に頻度の高いコドンも一定の割合で含ませることが好ましい。
【0029】
ＰＢドメイン３をコードする領域として、例えばｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのｍＲＮＡとして知られた配列を用いることが可能である。又はこの配列を上記のようにコドン最適化した配列を用いることが好ましい。
【0030】
ＮＬＳドメイン２をコードする領域として、上記何れかの所望のＮＬＳドメイン２をコードする公知のＲＮＡ配列を用いればよい。ＮＬＳドメイン２についても用いる細胞の生物種に応じてコドン最適化することが好ましい。
【0031】
実施形態に従うＲＮＡは、ＲＮＡプロセシング前のｐｒｅ－ＲＮＡの形態であってもよいし、プロセシング後の成熟ＲＮＡの形態であってもよい。実施形態に従うＲＮＡは各ドメインをコードする領域の他に更なる配列を含んでもよい。更なる配列は、例えば開始コドン、終止コドン、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）、５’末端リーダー配列、ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）、Ｐ２ＡやＴ２Ａなどの２Ａ配列、転写終結配列又はＰｏｌｙ（Ａ）配列等である。
【0032】
実施形態に従うＲＮＡは、分解耐性を有するように修飾されていることが好ましい。例えば、修飾は、ＲＮａｓｅ等によりＲＮＡが分解されないようにする公知の修飾であればよい。そのような修飾は、例えば、ＲＮＡへの天然修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの使用／導入、非天然配列の使用／付加、又は天然／非天然ＣＡＰ構造の付加、又はＰｏｌｙ（Ａ）配列の付加等である。
【0033】
天然修飾ヌクレオチドは、例えば、シュードウリジン、５－メチルシチジン、１－メチルアデノシン等である。非天然ヌクレオチドは、例えば、ＢＮＡ、ＬＮＡ又はＰＮＡ等である。
【0034】
非天然配列は、例えば、人工的に作成された天然には存在しない塩基配列であり、例えば、ランダムな塩基配列、又は天然／非天然アミノ酸と核酸のハイブリッド配列等である。非天然配列は、例えばＲＮＡの末端に付加することが好ましい。
【0035】
天然ＣＡＰ構造は、例えば、ＣＡＰ０（ｍ７ＧｐｐｐＮ）、ＣＡＰ１（ｍ７ＧｐｐｐＮｍ）等である。非天然ＣＡＰ構造は、例えば、ＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）又はＬＮＡ－グアノシン等である。非天然ＣＡＰ構造は、例えばＲＮＡの５’末端に付加することが好ましい。
【0036】
実施形態に従うＲＮＡは、次に説明する改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのＤＮＡ配列から、インビトロトランスクリプション法等を用いて合成することができる。インビトロトランスクリプションは、例えばＣＵＧＡ（登録商標）７ ｋｉｔ等の市販のキットを用いて行うことができる。或いは、ＲＮＡは直接人工的に合成してもよい。
【0037】
続いて、ポリヌクレオチドがＤＮＡである例について説明する。このＤＮＡは、例えば細胞内に導入された後、転写及び翻訳され、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１を細胞内に供給する。
【0038】
第１実施形態のＤＮＡは、所望の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１の各ドメイン（ＮＬＳドメイン２及びＰＢドメイン３）をそれぞれコードする領域（塩基配列）を少なくとも含む。各ドメインをコードする領域として、例えば各ドメインのポリペプチドをコードする公知のＤＮＡの配列を用いることができる。各ドメインをコードする領域として、上記ＲＮＡの配列のウラシル（Ｕ）をチミン（Ｔ）に変更した配列、又はその相補配列（ｃＤＮＡ）を含み得る。
【0039】
ＰＢドメイン３をコードする領域として、例えば上記配列番号１のアミノ酸配列をコードする、野生型のＤＮＡ配列（表５、配列番号５）を使用することが可能である。
【0040】
【表5】
ヒトの細胞に用いる場合、ＰＢドメイン３をコードする領域は、例えば上記のヒト用にコドン最適化されたＲＮＡを提供できるように選択されたトリプレットを用いた配列であることが好ましい。ＤＮＡ配列についてコドン最適化する場合は、上記各アミノ酸に対応する好ましいコドンのＵをＴに変更したトリプレット又はその相補配列を用いる。例えば、上記配列番号１のＰＢドメイン３のコドン最適化を行ったＤＮＡ配列として、表６に示す配列（配列番号６）を使用することが好ましい。
【0041】
【表6】
また、配列番号２のＰＢドメイン３のヒト用にコドン最適化したＤＮＡ配列として、例えば表７に示す配列（配列番号７）を使用することが好ましい。
【0042】
【表7】
ＮＬＳドメイン２として、配列番号３のＳＶ４０のラージＴ抗原のＮＬＳを用いる場合、ＮＬＳドメイン２をコードする領域として、次の表８に示すＤＮＡ配列（配列番号８）を用いることができる。
【0043】
【表8】
ＮＬＳドメイン２として、配列番号４のＨＩＶのＴＡＴタンパク質を用いる場合、ＮＬＳドメイン２をコードする領域として、次の表９に示すＤＮＡ配列（配列番号９）を用いることができる。
【0044】
【表9】
また、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質及びＳＶ４０のラージＴ抗原のＮＬＳを連結したＮＬＳドメイン２を用いる場合、次の表１０に示すＤＮＡ配列（配列番号１０）を用いることができる。
【0045】
【表10】
表５～表１０に示す塩基配列に含まれるヌクレオチドに置換、付加、挿入、欠失等の変異があるものも使用することができる。例えば、このような変異が存在する場合、表５～表１０に示す配列がコードするアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものを使用することが好ましい。
【0046】
実施形態に係るＤＮＡは、更にＤＮＡの５’末端にプロモーター配列、３’末端に転写終結配列を連結したｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース発現ユニットの構成で使用することが好ましい。プロモーター配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期エンハンサー／プロモーター又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモーター等を用いることができる。転写終結配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子の転写終結配列又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の転写終結配列を用いることができる。当該発現ユニットは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、また直鎖状であってもよく環状であってもよい。ＤＮＡの末端は標識又は官能基で修飾されていてもよい。また、当該発現ユニットは、公知のプラスミドベクターやウイルスベクターに組込んで用いてもよい。
【0047】
（細胞のゲノムに目的配列を組込む方法、細胞製造方法）
以下に、第１実施形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを用いた細胞のゲノムに目的配列を組込む方法について説明する。細胞のゲノムに目的配列を組込む方法は、図２に示すように、ドナーＤＮＡを改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１とともに細胞に導入すること（Ｓ１：導入工程）を含む。
以下に、第１実施形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを用いた細胞のゲノムに目的配列を組込む方法について説明する。細胞のゲノムに目的配列を組込む方法は、図２に示すように、ドナーＤＮＡを改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１とともに細胞に導入すること（Ｓ１：導入工程）を含む。
【0048】
まずドナーＤＮＡについて説明する。図３に示すように、ドナーＤＮＡ２０は、目的配列２１を含む。ドナーＤＮＡ２０は、例えば二本鎖ＤＮＡであり、直鎖状であってもよいし、環状であってもよい。例えば、ドナーＤＮＡ２０は、目的配列２１が組込まれたプラスミドベクター又はウイルスベクターであってもよい。
【0049】
目的配列２１は細胞のゲノムに組込まれるＤＮＡの塩基配列であり、本方法を行う目的に応じて選択される。目的配列２１は、例えば特定の遺伝子又は遺伝子の一部をコードする塩基配列、プロモーター配列と特定の遺伝子と転写終結配列とを含む遺伝子発現カセット、又は遺伝子ではない天然の塩基配列又は非天然の塩基配列等を含む。或いは１個～数個のアミノ酸をコードする塩基配列又は３個～数十個のヌクレオチドからなる配列等を含んでもよい。
【0050】
目的配列２１は、その両端にそれぞれ第１のトランスポゼース認識配列２２ａと第２のトランスポゼース認識配列２２ｂとを含む。第１のトランスポゼース認識配列２２ａ及び第２のトランスポゼース認識配列２２ｂは、トランスポゼースが目的配列２１の位置を認識するための配列である。第１のトランスポゼース認識配列２２ａ及び第２のトランスポゼース認識配列２２ｂは、互いに逆向きの同じ配列を含む、逆向き反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＩＲ）とも称される配列である。
【0051】
目的配列２１の第１のトランスポゼース認識配列２２ａと第２のトランスポゼース認識配列２２ｂと除く領域の長さは、例えば、３～約２００００塩基程度であることが好ましい。
【0052】
「改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１を細胞に導入する」とは、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１をポリペプチドの形態で導入する場合と、ＲＮＡ又はＤＮＡの形態で導入して細胞内で改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１を発現させる場合とを含む。
【0053】
改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１をＲＮＡの形態で導入した場合に目的配列２１が細胞のゲノムに組込まれるプロセスの一例について、図４を用いて説明する。まず、図４の（ａ）部に示すようにドナーＤＮＡ２０と改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１のＲＮＡ３０とを細胞４０に導入すると、細胞４０のタンパク質合成機能により図４の（ｂ）部に示すようにＲＮＡ３０から改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１（図中、「ＰＢ」）が発現する。図４の（ｃ）部に示すように、ドナーＤＮＡ２０及び改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１は核４１内に移行し得る。
【0054】
次に核内でドナーＤＮＡ２０に改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１が結合する（図４の（ｄ）部）。例えば２つの改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１が、ドナーＤＮＡ２０の第１のトランスポゼース認識配列２２ａ及び第２のトランスポゼース認識配列２２ｂにそれぞれ結合し得る。次いで、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１はドナーＤＮＡ２０の目的配列２１を切り出して、図４の（ｅ）部に示すように細胞４０のゲノム４２に目的配列２１を組込む。
【0055】
改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１のＤＮＡを用いる場合、当該ＤＮＡを細胞４０に導入した後、当該ＤＮＡが転写及び翻訳され、図４の（ｂ）部と同様に改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１が発現し、次のプロセスへと続く。改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１をポリペプチドの形態で導入した場合、直接核４１内へ移行し得る。
【0056】
実施形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１はＮＬＳドメイン２を有していることにより核４１内への移行効率がより向上しており、より効率的に目的配列２１を組込むことができる。
【0057】
また、ＲＮＡ３０のＰＢドメイン３をコードする領域が細胞の生物種に合わせてコドン最適化されている場合、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１がより効率的に発現し、組込み効率が更に改善され得る。
【0058】
改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１をどの形態で導入するかは導入方法の種類や入手の容易さ等に従ってより適切なものを選択すればよい。しかしながら、ＲＮＡの形態を用いることが好ましい。その場合、ＤＮＡ形態を用いる場合と比較して転写工程を省略することができるので、より迅速かつ高効率で改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１が発現され、組込み効率が向上し得る。また、ＲＮＡ形態を用いる場合は、それが細胞４０のゲノム４２に組込まれることがないため好都合である。
【0059】
導入工程（Ｓ１）は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの細胞への導入に使用される公知の何れかの方法を用いて行うことができる。例えば、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法又はマグネトフェクション法等を用いることが好ましい。導入方法は、細胞４０の種類、目的配列２１の種類、又は導入後の細胞４０の用途等に応じて適切なものが選択される。
【0060】
リポソーム法はより好適な導入方法であり、ドナーＤＮＡ２０及び改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１又はそれをコードするポリヌクレオチドをリポソーム（脂質粒子）に封入し、それを細胞４０に接触させる方法をいう。リポソーム法の実施形態については後に詳述する。
【0061】
リポフェクション法は、例えばドナーＤＮＡ２０及び改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１を脂質とともに複合体を形成した状態で細胞４０に接触させる方法をいう。
【0062】
ドナーＤＮＡ２０及びＲＮＡ３０は、好ましくはそれぞれ１分子～１００分子程度導入することが好ましい。
【0063】
細胞４０は、好ましくは生体外の細胞である。生体外の細胞４０は、例えば単離細胞、培養細胞又は組織等、或いは株化した細胞等であり得る。細胞４０は、好ましくは哺乳動物の細胞であり、より好ましくはヒトの細胞である。
【0064】
生体外の細胞４０を用いて実施形態の細胞のゲノムに目的配列を組込む方法を行うことにより、目的配列２１をゲノムに組込んだ目的細胞を製造することが可能である。したがって、実施形態によれば、導入工程（Ｓ１）を含む細胞製造方法が提供される。細胞製造方法は、導入工程（Ｓ１）の後、細胞４０を生存に適した条件で培養する工程を更に含んでもよい。また、培養後に目的配列２１が組込まれた目的細胞をスクリーニングする工程を更に含んでもよい。
【0065】
実施形態に従う細胞製造方法によれば、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１により組込み効率が改善されているため、より効率的に目的細胞を製造することが可能である。実施形態に従う細胞製造方法は、限定されるものではないが例えば目的細胞を含む医薬組成物の製造又は物質生産細胞の製造等に使用することができる。
【0066】
或いは、細胞４０は生体内の細胞であってもよい。この場合、導入工程（Ｓ１）はドナーＤＮＡ２０及び改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１を生体に投与することによって行われ得る。投与は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、硬膜外、脳脊髄腔、胸腔内、腹腔内又は局所・病巣内への注射又は点滴等により行うことができる。
【0067】
（リポソーム法）
以下、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１のＲＮＡを用いたリポソーム法の実施形態の一例について説明する。しかしながらリポソーム法では必ずしもＲＮＡの形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１を用いる必要はなく、ＤＮＡの形態、他のポリヌクレオチドの形態又はポリペプチドの形態を用いてもよい。しかしながら、ポリヌクレオチドの形態であることが好ましい。
以下、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１のＲＮＡを用いたリポソーム法の実施形態の一例について説明する。しかしながらリポソーム法では必ずしもＲＮＡの形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１を用いる必要はなく、ＤＮＡの形態、他のポリヌクレオチドの形態又はポリペプチドの形態を用いてもよい。しかしながら、ポリヌクレオチドの形態であることが好ましい。
【0068】
図５の（ａ）は、ドナーＤＮＡ２０と改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１のＲＮＡ３０とを脂質粒子５０に封入して得られた導入キャリア５１の一例を示す。導入キャリア５１を細胞４０に接触させることで、例えばエンドサイトーシスにより脂質粒子５０と細胞膜とが融合し、ドナーＤＮＡ２０とＲＮＡ３０とが細胞４０内に放出され得る。
【0069】
図５の（ｂ）は、ドナーＤＮＡ２０とＲＮＡ３０とを別々の脂質粒子５０にそれぞれ封入して得られた導入キャリア５２、５３の一例を示す。導入キャリア５２、５３は一緒に用いられる。これらは同時に細胞４０接触させてもよいし、どちらかを先に接触させてもよい。
【0070】
脂質粒子５０は、複数の脂質分子が非共有結合で配列してできた脂質膜からなる、略球状の中空体である。その中心の内腔にドナーＤＮＡ２０及び／又はＲＮＡ３０が封入されている。脂質粒子５０は、脂質単分子膜であってもよいし、脂質二重膜であってもよい。また、脂質粒子５０は、一層の膜からなっていてもよいし、多重層の膜からなっていてもよい。
【0071】
脂質粒子５０の材料として、下記に例示するベース脂質を用いることができる。ベース脂質は、例えば、生体膜の主成分の脂質を用いることができる。ベース脂質は、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等である。ベース脂質は、細胞膜と融合しやすく、特にジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンを用いる場合、脂質粒子５０の構造や粒子径の制御が容易であり、且つ細胞膜と融合しやすいため好ましい。脂質に含まれるアシル基の炭化水素鎖の長さはＣ１０～Ｃ２０であることが好ましい。この炭化水素鎖は飽和炭化水素基であっても、不飽和炭化水素基であってもよい。
【0072】
例えば、ベース脂質として、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデシル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０ ＤＡＰ）、
Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、又は
コレステロール、
或いはこれらの何れかの組み合わせ等を用いることが好ましい。ベース脂質として、特にカチオン性脂質又は中性脂質の脂質を用いること好ましく、その含有量によって脂質粒子５０の酸解離定数を調節することができる。カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを用いることが好ましく、中性脂質としてＤＯＰＥを用いることが好ましい。
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデシル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０ ＤＡＰ）、
Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、又は
コレステロール、
或いはこれらの何れかの組み合わせ等を用いることが好ましい。ベース脂質として、特にカチオン性脂質又は中性脂質の脂質を用いること好ましく、その含有量によって脂質粒子５０の酸解離定数を調節することができる。カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを用いることが好ましく、中性脂質としてＤＯＰＥを用いることが好ましい。
【0073】
ベース脂質は、脂質粒子５０に含まれる脂質分子全体に対して１００％近く含まれてもよいが、ベース脂質の他に下記に例示する第１の脂質化合物及び／又は第２の脂質化合物を更に含むことが好ましい。これらの脂質化合物を含む場合は、ベース脂質は脂質分子全体に対して約３０％～約８０％（モル比）含まれることが好ましい。
【0074】
第１の脂質化合物は、例えば、生分解性である。第１の脂質化合物は、Ｑ－ＣＨＲ２の式で表すことができる。
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。
【0075】
脂質粒子５０が第１の脂質化合物を含む場合、脂質粒子５０の表面が非カチオン性となるため、細胞導入における障害が低減され、封入物の導入効率が高まり得る。
【0076】
第１の脂質化合物として、例えば、下記式で表される構造を有する脂質を用いれば導入効率がより優れているため好ましい。
特に、脂質粒子５０はその構成成分として、式（１－０１）の脂質化合物及び／又は式（１－０２）の脂質化合物を含むことが好ましい。
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【化1-4】
特に、脂質粒子５０はその構成成分として、式（１－０１）の脂質化合物及び／又は式（１－０２）の脂質化合物を含むことが好ましい。
【0077】
第２の脂質化合物は、例えば、生分解性である。第２の脂質化合物は、Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２の式で表すことができる。
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）。
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）。
【0078】
第２の脂質化合物を含む場合、脂質粒子５０への核酸の封入量が多くなり得る。
【0079】
例えば、以下の構造を有する第２の脂質化合物を用いれば、核酸封入量がより優れているため好ましい。
以上に説明した第１及び第２の脂質化合物を含む脂質粒子５０を用いた場合、封入量を増加させ、且つ導入効率を高めることが可能である。かつ導入した細胞の細胞死も低減することができる。特に、式（１－０１）、式（１－０２）及び／又は式（２－０１）の化合物を用いれば封入量及び導入効率が特に優れているため好ましい。
【化2-1】
【化2-2】
【化2-3】
以上に説明した第１及び第２の脂質化合物を含む脂質粒子５０を用いた場合、封入量を増加させ、且つ導入効率を高めることが可能である。かつ導入した細胞の細胞死も低減することができる。特に、式（１－０１）、式（１－０２）及び／又は式（２－０１）の化合物を用いれば封入量及び導入効率が特に優れているため好ましい。
【0080】
第１及び第２の脂質化合物は、脂質粒子５０の材料全体に対して約２０％～約７０％（モル比）で含まれることが好ましい。
【0081】
脂質粒子５０は、脂質粒子５０の凝集を防止する脂質を含むこともまた好ましい。例えば、凝集を防止する脂質は、ＰＥＧ修飾した脂質、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、オメガ－アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）又はモノシアロガングリオシド等を更に含むことが好ましい。このような脂質は、脂質粒子５０の材料全体に対して約１％～約５％（モル比）で含まれることが好ましい。
【0082】
脂質粒子５０は、毒性を調整するための相対的に毒性の低い脂質；脂質粒子５０に配位子を結合させる官能基を有する脂質；ステロール、例えばコレステロール等の封入物の漏出を抑制するための脂質等の脂質を含んでもよい。特に、コレステロールを含ませることが好ましい。
【0083】
脂質粒子５０に用いる脂質の種類及び組成は、目的とする脂質粒子５０の酸解離定数（ｐＫａ）若しくは脂質粒子５０のサイズ、封入物の種類、或いは導入する細胞中での安定性等を考慮して適切に選択される。酸解離定数（ｐＫａ）は、６．５～８．０であることが好ましい。この値であれば、導入効率を高めることが可能である。
【0084】
例えば、脂質粒子５０は、式（１－０１）若しくは式（１－０２）の化合物及び／又は式（２－０１）の化合物と、ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＴＡＰと、コレステロールと、ＤＭＧ－ＰＥＧとを含む場合、核酸封入量及び核酸導入効率が特に優れているため好ましい。
【0085】
導入キャリアには、必要に応じて更なる成分が封入されていてもよい。更なる成分は、例えば、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、遺伝子活性化剤又はＴ細胞性腫瘍細胞の他の治療薬、他の診断薬等である。ｐＨ調整剤は、例えば、クエン酸などの有機酸及びその塩等である。浸透圧調整剤は、糖又はアミノ酸等である。遺伝子活性化剤については後述する。
【0086】
導入キャリアは、例えば、小分子を脂質粒子に封入する際に用いられる公知の方法、例えば、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法又は凍結融解法等を用いて製造することができる。例えば、脂質粒子５０の材料を所望の比率でアルコール等の有機溶媒に含ませて得られた脂質混合物と、封入するべき成分を含む水性緩衝液を用意し、脂質混合物に水性緩衝液を添加する。得られた混合物を撹拌して懸濁することにより導入キャリアが形成される。
【0087】
ドナーＤＮＡ２０及びＲＮＡ３０は、核酸凝縮ペプチド６０で凝縮された状態で封入されていてもよい。核酸凝縮ペプチド６０は、核酸を小さく凝縮する機能を持つペプチドである。核酸凝縮ペプチド６０を用いることにより脂質粒子５０内に多くの核酸を封入し、脂質粒子５０の粒径を小さくすることができる。また、脂質粒子５０外に残存する核酸の量が減少され、それによって導入キャリア同士の凝集が防止される。その結果、核酸の送達効率が向上し得る。
【0088】
好ましい核酸凝縮ペプチド６０は、例えば、カチオン性のアミノ酸を全体の４５％以上含むペプチドである。より好ましい核酸凝縮ペプチド６０は、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有し、他方の端が配列ＲＱＲＱＲ（第２のアミノ酸配列）を有する。第１のアミノ酸配列と第２アミノ酸配列との間には、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。中性アミノ酸は、例えば、Ｇ又はＹである。或いは、他方の端は第２のアミノ酸配列に変えて、ＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有してもよい。
【0089】
上記核酸凝縮ペプチドは、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１１）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１２）
ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１３）。
ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１１）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１２）
ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号１３）。
【0090】
更に、次のようなアミノ酸配列を有する核酸凝縮ペプチドを上記の何れかの核酸凝縮ペプチドと組み合わせて用いることもできる。このペプチドは、上記核酸凝縮ペプチドで凝縮した核酸凝集体を更に凝縮することができる。
【0091】
ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ
（Ｍ９）（配列番号１４）
例えば、脂質粒子５０に封入する前に、核酸を核酸凝縮ペプチド６０と撹拌混合することによって核酸を凝縮することができる。ドナーＤＮＡ２０とＲＮＡ３０とを一緒に凝縮してもよいし、別々に凝縮してもよい。
（Ｍ９）（配列番号１４）
例えば、脂質粒子５０に封入する前に、核酸を核酸凝縮ペプチド６０と撹拌混合することによって核酸を凝縮することができる。ドナーＤＮＡ２０とＲＮＡ３０とを一緒に凝縮してもよいし、別々に凝縮してもよい。
【0092】
以上に説明した効果を奏することから核酸凝縮ペプチド６０を用いることが好ましいが、用いる核酸の種類、又は細胞の種類等によっては核酸凝縮ペプチド６０を用いなくともよい。
【0093】
（キット）
実施形態によれば、細胞のゲノムへの目的配列２１の組込みに用いるためのキットが提供される。キットは、上記何れかの改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１、又はそれをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含む。
実施形態によれば、細胞のゲノムへの目的配列２１の組込みに用いるためのキットが提供される。キットは、上記何れかの改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１、又はそれをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含む。
【0094】
例えば、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１、又はそれをコードするポリヌクレオチドは、適切な担体に含まれた組成物として提供され得る。或いは、これらは上記導入キャリアの形態で適切な担体に含まれた組成物として提供され得る。適切な担体は、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液又は緩衝液等である。
【0095】
組成物は、一般的な方法によって滅菌されていてもよい。また、組成物は、液体として提供されてもよいし、それを乾燥した粉末として提供されてもよい。粉末の組成物は、例えば、適切な液体に溶解することにより使用可能となる。
【0096】
キットは、組成物の保管安定性を向上させる物質を更に含んでもよい。保管安定性を向上させる物質は、限定されるものではないが、例えば、アルブミン、リポタンパク、アポリポタンパク、グロブリン等の糖タンパク等：ｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤等；ナトリウムアセテート、ナトリウムラクテート、ナトリウムクロリド、カリウムクロリド、カルシウムクロリド等の製薬学的に許容可能であり、医薬組成物を生理的状態に近づける関与剤；フリーラジカルによるダメージを抑制する、α－トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャー；脂質の過酸化損傷を抑制し、貯蔵安定性を改良するためのフェリオキサミンのような水溶性キレーター等の脂質保護剤等である。これらは組成物に含まれてもよいし、組成物とは別々にキットに含まれてもよい。
【0097】
ドナーＤＮＡを封入した導入キャリアを含む場合を除き、キットは、ドナーＤＮＡ２０を更に含んでもよい。
【0098】
（第２実施形態）
第２実施形態によれば、細胞分裂促進ドメインを更に含む改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースが提供される。図６の（ａ）に示す通り、第２実施形態に係る改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１０は、例えば核局在化シグナルドメイン２とｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースドメイン３との間に細胞分裂促進ドメイン４を更に含む。
第２実施形態によれば、細胞分裂促進ドメインを更に含む改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースが提供される。図６の（ａ）に示す通り、第２実施形態に係る改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１０は、例えば核局在化シグナルドメイン２とｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースドメイン３との間に細胞分裂促進ドメイン４を更に含む。
【0099】
細胞分裂促進ドメイン４は、細胞分裂を促進する機能を有するペプチドのアミノ酸配列から構成される。細胞分裂促進ドメイン４として、そのような機能を有することが知られている公知のペプチドであれば何れのものも用いることができるが、例えば、表１１に示すＳＶ４０のラージＴ抗原タンパク質のＮ末端側から１３３アミノ酸までの領域の配列（配列番号１５）を用いることが好ましい。この配列は、Ｊドメイン及びＲｂファミリー結合モチーフを含む。
【0100】
【表11】
細胞分裂促進ドメイン４はこれに限定されるものではなく、例えば、ヒト・ポリオーマウイルスに属するＪＣウイルス又はＢＫウイルスのラージＴ抗原タンパク質の細胞分裂促進ドメイン等を用いることも可能である。
【0101】
細胞分裂促進ドメイン４を含む場合、各ドメインの連結される順番は例えば図６の（ａ）に示すように、Ｎ末端側からＮＬＳドメイン２、細胞分裂促進ドメイン４、ＰＢドメイン３の順であることが好ましい。しかしながらドメインの順番はこれに限定されるものではなく、例えば、Ｎ末端側から細胞分裂促進ドメイン４、ＮＬＳドメイン２、ＰＢドメイン３の順に連結していてもよい。或いは、その他の順番であってもよい。
【0102】
第２実施形態においても改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１０をコードするポリヌクレオチドが提供される。細胞分裂促進ドメイン４として配列番号１５のアミノ酸配列を用いる場合、それをコードするＤＮＡ配列として、例えば、表１２に示す配列（配列番号１６）を用いることが好ましい。
【0103】
【表12】
表１１及び表１２に示すアミノ酸配列又はＤＮＡ配列は置換、付加、挿入、欠失等の変異があるものも使用することができる。例えば、このような変異が存在する場合、表１１及び表１２に示す配列がコードするアミノ酸配列と９０％以上相同なアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものを使用することが好ましい。
【0104】
第２実施形態に係る改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１０も、第１実施形態で説明したものと同様の導入キャリアとして提供され得る。また、第１実施形態と同様に細胞のゲノムに目的配列を組込む方法及び細胞製造方法に使用することができる。
【0105】
しかしながら、第２実施形態に係る改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１０を細胞４０に導入すると、細胞分裂促進ドメイン４の細胞分裂促進機能により、一時的に細胞４０の分裂が起こりやすくなり得る。細胞４０の分裂の過程で起こる核膜消失は、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１０及びドナーＤＮＡ２０の核４１内への取り込みをより促進させ得る。故に、第２実施形態に係る改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１０によれば更に目的配列２１の組込み効率が更に向上し得る。
【0106】
更なる実施形態によれば、細胞分裂促進ドメイン４は必ずしも改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースに含まれて使用される必要はなく、図６の（ｂ）に示すように第１実施形態に係る改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース１と、それとは別体の細胞分裂促進ドメイン４を含むポリペプチドとを一緒に用いてもよい。この時、細胞分裂促進ドメイン４を含むポリペプチドは、ＮＬＳドメイン２を更に含んでもよい。
【0107】
［例］
以下に、実施形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを製造し、使用した例について説明する。
以下に、実施形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを製造し、使用した例について説明する。
【0108】
例１ 改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのＤＮＡ配列の合成
・ＰＢドメインＤＮＡ配列の合成
野生型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース（ＷｔＰＢ、配列番号１）の遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）と、配列番号５のＤＮＡ配列をヒト用にコドンに最適化した、ヒト・コドン最適化ＰＢ（ＨｕＰＢ）のＤＮＡ配列（配列番号６）とを合成した。加えて、アミノ酸配列を改変した高活性型ＰＢ（ＨｙＰＢ）のＤＮＡ配列（配列番号７）を合成した。
・ＰＢドメインＤＮＡ配列の合成
野生型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース（ＷｔＰＢ、配列番号１）の遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）と、配列番号５のＤＮＡ配列をヒト用にコドンに最適化した、ヒト・コドン最適化ＰＢ（ＨｕＰＢ）のＤＮＡ配列（配列番号６）とを合成した。加えて、アミノ酸配列を改変した高活性型ＰＢ（ＨｙＰＢ）のＤＮＡ配列（配列番号７）を合成した。
【0109】
・ＮＬＳドメインＤＮＡ配列の合成
ＮＬＳドメインとして、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質の核移行シグナル（ＴＡＴ ＮＬＳ、配列番号４）と、ＳＶ４０のラージＴ抗原タンパク質の核移行シグナル（ＳＶ４０ ＮＬＳ、配列番号３）を使用した。ヒト用にコドン最適化したＴＡＴ ＮＬＳのＤＮＡ配列（配列番号９）と、ヒト用にコドン最適化したＳＶ４０ ＮＬＳのＤＮＡ配列（配列番号８）と、ＴＡＴ ＮＬＳ及びＳＶ４０ ＮＬＳをこの順にリンカー配列を介して連結したＤＮＡ配列（ＴＡＴ－ＳＶ４０ ＮＬＳ、配列番号１０）を合成した。
ＮＬＳドメインとして、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質の核移行シグナル（ＴＡＴ ＮＬＳ、配列番号４）と、ＳＶ４０のラージＴ抗原タンパク質の核移行シグナル（ＳＶ４０ ＮＬＳ、配列番号３）を使用した。ヒト用にコドン最適化したＴＡＴ ＮＬＳのＤＮＡ配列（配列番号９）と、ヒト用にコドン最適化したＳＶ４０ ＮＬＳのＤＮＡ配列（配列番号８）と、ＴＡＴ ＮＬＳ及びＳＶ４０ ＮＬＳをこの順にリンカー配列を介して連結したＤＮＡ配列（ＴＡＴ－ＳＶ４０ ＮＬＳ、配列番号１０）を合成した。
【0110】
・細胞分裂促進ドメインＤＮＡ配列の合成
細胞分裂促進ドメインとして、ＳＶ４０のラージＴ抗原タンパク質のJドメインとＲｂドメインを含むＮ末端の１３３アミノ酸配列（ＬＴ－Ｊ／Ｒｂ、配列番号１５）を用いた。配列番号１５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号１６）を合成した。
細胞分裂促進ドメインとして、ＳＶ４０のラージＴ抗原タンパク質のJドメインとＲｂドメインを含むＮ末端の１３３アミノ酸配列（ＬＴ－Ｊ／Ｒｂ、配列番号１５）を用いた。配列番号１５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号１６）を合成した。
【0111】
・第１実施形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースＤＮＡ配列の合成
上記ＴＡＴ ＮＬＳのＤＮＡ配列をリンカー配列を介してＨｙＰＢのＮ末端に付加したＴ－ＨｙＰＢ（配列番号１７）と、ＴＡＴ－ＳＶ４０ ＮＬＳにリンカー配列を連結してＨｙＰＢのＮ末端に付加したＴＳ－ＨｙＰＢ（配列番号１８）を作製した。これらの配列を表１３、１４にそれぞれ示す。
上記ＴＡＴ ＮＬＳのＤＮＡ配列をリンカー配列を介してＨｙＰＢのＮ末端に付加したＴ－ＨｙＰＢ（配列番号１７）と、ＴＡＴ－ＳＶ４０ ＮＬＳにリンカー配列を連結してＨｙＰＢのＮ末端に付加したＴＳ－ＨｙＰＢ（配列番号１８）を作製した。これらの配列を表１３、１４にそれぞれ示す。
【0112】
【表13】
【0113】
【表14】
これらの改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースＤＮＡ配列は、ＴＡＴ ＮＬＳ又はＴＡＴ－ＳＶ４０ ＮＬＳとＨｙＰＢとのＮ末端部のＤＮＡ配列を化学合成した後、合成Ｎ末端配列を取り除いたＨｙＰＢのＤＮＡ配列に連結することにより作製した。
【0114】
・第２実施形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースＤＮＡ配列の合成
ＴＡＴ－ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号１０）とＬＴ－Ｊ／Ｒｂ（配列番号１６）とを連結した、表１５に示すＤＮＡ配列（配列番号１９）をリンカー配列を介してＨｙＰＢのＮ末端に付加し、表１６に示すＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢ（配列番号２０）を作製した。
ＴＡＴ－ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号１０）とＬＴ－Ｊ／Ｒｂ（配列番号１６）とを連結した、表１５に示すＤＮＡ配列（配列番号１９）をリンカー配列を介してＨｙＰＢのＮ末端に付加し、表１６に示すＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢ（配列番号２０）を作製した。
【0115】
【表15】
【0116】
【表16】
ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢは、ＴＡＴ－ＳＶ４０ ＮＬＳとＬＴＪ／Ｒｂとリンカー配列とＨｙＰＢとのＮ末端部のＤＮＡを化学合成した後、合成Ｎ末端配列を取り除いたＨｙＰＢのＤＮＡ配列に連結することにより作製した。また、ＰＢと連結しない細胞分裂促進ドメイン単独のポリペプチドとして、表１７に示すＤＮＡ配列（ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ、配列番号２１）を作製した。
【0117】
【表17】
ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂは、ＴＡＴ－ＳＶ４０ ＮＬＳとＬＴ－Ｊ／ＲｂとのＤＮＡ配列の末端に終始コドンを付加することにより化学合成で作製した。
【0118】
例２ プラスミドの作製
改変型ＰＢのＲＮＡ調整用の鋳型ＤＮＡとして、ｐＧＥＭ－ＧＬ－ｐＡに例１で得たＰＢ（ＷｔＰＢ、ＨｕＰＢ、ＨｙＰＢ、Ｔ－ＨｙＰＢ、ＴＳ－ＨｙＰＢ、ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢ）のＤＮＡ配列を組込んだプラスミドを作製した。
改変型ＰＢのＲＮＡ調整用の鋳型ＤＮＡとして、ｐＧＥＭ－ＧＬ－ｐＡに例１で得たＰＢ（ＷｔＰＢ、ＨｕＰＢ、ＨｙＰＢ、Ｔ－ＨｙＰＢ、ＴＳ－ＨｙＰＢ、ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢ）のＤＮＡ配列を組込んだプラスミドを作製した。
【0119】
ｐＧＥＭ－ＧＬ－ｐＡは、Ｔ７プロモーターとＰｏｌｙ（Ａ）配列とが組込まれた市販のＲＮＡ合成鋳型プラスミドＤＮＡ：ｐＧＥＭ（登録商標）－４Ｚ（プロメガ）に、ヒトβグロビンのリーダー配列（Ｇｌｏｂｉｎ ｌｅａｄｅｒ）とｐＳＰ６４ ｐＡ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）のＰｏｌｙ（Ａ）配列とを組込んで作製した。例１で得たＰＢのＤＮＡ配列は、ｐＧＥＭ－ＧＬ－ｐＡのヒトβグロビン・リーダー配列とＰｏｌｙ（Ａ）配列との間に組込んだ。
【0120】
また、ＰＢドメインと非連結の細胞分裂促進ドメイン（ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ）のＲＮＡ調整用の鋳型ＤＮＡも作製した。この鋳型ＤＮＡのプラスミドは、ＴＳ－ＬＴＪ／ＲｂのＤＮＡ配列を、ｐＧＥＭ－ＧＬ－ｐＡのヒトβグロビン・リーダー配列とＰｏｌｙ（Ａ）配列の間に組込んで作製した。
【0121】
例３ ｍＲＮＡの合成
例２で得られたｐＧＥＭ－ＧＬ－ｐＡを用いて次のようにｍＲＮＡの合成を行った。まず、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して精製した後、１．０μｇの鋳型ＤＮＡを含む２０μＬのｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応液を調整し、３７℃の恒温槽で２時間反応させた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応液には、ＣＵＧＡ（登録商標）７ ｋｉｔ付属の３種のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）と、ヌクレオチドアナログのψＵＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加えた。ＲＮＡ合成手順は、ＣＵＧＡ（登録商標）７ ｋｉｔのプロトコルに従った。
例２で得られたｐＧＥＭ－ＧＬ－ｐＡを用いて次のようにｍＲＮＡの合成を行った。まず、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して精製した後、１．０μｇの鋳型ＤＮＡを含む２０μＬのｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応液を調整し、３７℃の恒温槽で２時間反応させた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応液には、ＣＵＧＡ（登録商標）７ ｋｉｔ付属の３種のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ）と、ヌクレオチドアナログのψＵＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加えた。ＲＮＡ合成手順は、ＣＵＧＡ（登録商標）７ ｋｉｔのプロトコルに従った。
【0122】
反応終了後、合成ＲＮＡをＭＥＧＡｃｌｅａｒＴＭ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ｋｉｔ（インビトロジェン）で精製した。精製の操作は、同キットの手順に従った。
【0123】
精製後、ＲＮＡの５’－ＵＴＲと３’－ＵＴＲとに、それぞれＣａｐ構造とＰｏｌｙ（Ａ）構造とを付加してｍＲＮＡ化した。Ｃａｐ構造とＰｏｌｙ（Ａ）構造との付加は、ＳｃｒｉｐｔＣａｐＴＭ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）とＳｃｒｉｐｔＣａｐＴＭ ２’－Ｏ－ＭｅｔＨｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）を用いて行った。操作は、キットのマニュアルに従って次のように行った。
【0124】
得られたＲＮＡを６５℃に１０分間インキュベートした後、氷上で急冷し、ＲＮＡの二次構造を破壊した。このＲＮＡを６０μｇ含むＣａｐｐｉｎｇ反応液１００μＬを調整し、３７℃の恒温槽で１時間反応させて、ＲＮＡの５’－ＵＴＲにＣａｐ構造を付加した。同溶液にＡ－ＰｌｕｓＴＭ Ｐｏｌｙ（Ａ） Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔａｉｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）を加えて、３７℃の恒温槽で２時間反応させて、３’－ＵＴＲにＰｏｌｙ（Ａ）構造を付加した。反応終了後、キットのマニュアルに従い、酢酸アンモニウム沈殿法で、反応液中のｍＲＮＡを精製した。ＲＮＡの濃度は、分光光度計（ＢｉｏＳｐｅｃ－ｍｉｎｉ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて、吸光度（Ａ２６０）を測定し、ＯＤ１．０＝４０．０μｇ／ｍＬ ＲＮＡとして算出した。
【0125】
例４ ｍＲＮＡ内包導リポソームの調整
エタノール脂質液（ＦＦＴ２０（上記式（１－０２）の化合物）／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４（ｍｏｌ比））１００μＬに、１／２０量のｍＲＮＡ液（１．６μｇ／ｍＬ）を加えて、ＲＮＡ含有脂質液を１０５μＬ調整した後、６９５μＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加して、リポソーム溶液とした。このリポソーム溶液を４セット調整し、これらを遠心式限外ろ過チューブ：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－５０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、１４,０００×ｇの遠心で濃縮した。濃縮後、４００μＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を加えてバッファー交換及び濃縮をおこない、最終量を１００μＬに調整した。リポソームの内包ＲＮＡ量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒＴＭ ＲＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
エタノール脂質液（ＦＦＴ２０（上記式（１－０２）の化合物）／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１０．５／５．２５／６０／４（ｍｏｌ比））１００μＬに、１／２０量のｍＲＮＡ液（１．６μｇ／ｍＬ）を加えて、ＲＮＡ含有脂質液を１０５μＬ調整した後、６９５μＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加して、リポソーム溶液とした。このリポソーム溶液を４セット調整し、これらを遠心式限外ろ過チューブ：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－５０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、１４,０００×ｇの遠心で濃縮した。濃縮後、４００μＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を加えてバッファー交換及び濃縮をおこない、最終量を１００μＬに調整した。リポソームの内包ＲＮＡ量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒＴＭ ＲＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
【0126】
例５ ＷｔＰＢ、ＨｕＰＢ、ＨｙＰＢのトランスポゾン切出し活性の測定
上記各改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのトランスポゾン（ＴＰ）切出し活性は、ＴＰ切出し活性測定用プラスミドＤＮＡ：ｐＭＳＣＶ－ＳｐＮＬを用いて測定した。
上記各改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのトランスポゾン（ＴＰ）切出し活性は、ＴＰ切出し活性測定用プラスミドＤＮＡ：ｐＭＳＣＶ－ＳｐＮＬを用いて測定した。
【0127】
ｐＭＳＣＶ－ＳｐＮＬには、コーディング配列をＮ末端側とＣ末端側とに２分割したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（トゲオキヒオドシエビ由来の発光酵素）の遺伝子（プロメガ）が組込まれており、２分割したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の遺伝子の間にｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース認識配列（トランスポゾンの末端配列、５’－ＩＲ及び３’－ＩＲ）を備えるＴＰが挿入されている。分割ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＲＮＡ遺伝子（Ｓｐｌｉｔ－ＮＬｕｃ）のＮ末端側（ＮＬｕｃ－Ｎ）の上流には、ＭＳＣＶ（Ｍｏｕｓｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ）のプロモーターを、Ｃ末端側（ＮＬｕｃ－Ｃ）の下流には、ＢＧＨ（Ｂｏｖｉｎｅ ＧｒｏＷｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子のＰｏｌｙ（Ａ）付加シグナル配列を、それぞれ連結した。
【0128】
ｐＭＳＣＶ－ＳｐＮＬは、発光酵素であるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の遺伝子を、ＴＰの挿入によりＮ末端側とＣ末端側とに２分割しており、この状態では細胞内で活性型のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）は発現されない。しかしながら細胞に導入された後、ＴＰがトランスポゼースにより切出されると、細胞のＤＮＡ修復機構により、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）のＮ末端とＣ末端とが連結されて活性型のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子が構成される。この結果、細胞内で活性型ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）が発現して細胞が発光する。
【0129】
したがって、細胞の発光強度はトランスポゼースのＴＰ切出し活性と相関する。したがって、ｐＭＳＣＶ－ＳｐＮＬを用いれば、ＰＢのＴＰ切出し活性を細胞の発光強度として定量化できる。
【0130】
細胞には、ヒト急性白血病細胞：Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ）を使用した。ＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で培養したＪｕｒｋａｔを５．０×１０６細胞／ｍＬで培地に縣濁し、５０μＬを９６ウェル培養プレートのウェルに加えた。
【0131】
ここにＴｅｘＭＡＣＳを５０μＬ加えて穏やかに混合した後、例４で作製したＷｔＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソーム、ＨｕＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソーム、或いはＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソーム（０．５μｇ／ウェル）と、ｐＭＳＣＶ－ＳｐＮＬ（０．５μｇ／ウェル）とを添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で細胞を培養した。７２時間後、インキュベータから培養プレートを取り出し、細胞をピペッティングで縣濁した後、９６ウェル黒色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、細胞縣濁液５０μＬを移し、ここに等量のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）アッセイ液（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ）を加えた。室温で５分間混合した後、黒色プレートのウェルの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ＰＲＰ、ＴＥＣＡＮ）で測定した。
【0132】
結果を図７に示す。ＴＰ切り出し活性は、ＷｔＰＢと比較して、ＨｕＰＢは約３倍、ＨｙＰＢは約１１倍であった。したがって、ＨｕＰＢ、ＨｙＰＢが優れたＴＰ切り出し活性を有することが示された。
【0133】
例６ Ｔ－ＨｙＰＢ、ＴＳ－ＨｙＰＢのＴＰ切出し活性の測定
Ｔ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソームとＴＳ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソームとを用いて、例５に記載の方法でＴＰ切出し活性を測定した。
Ｔ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソームとＴＳ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソームとを用いて、例５に記載の方法でＴＰ切出し活性を測定した。
【0134】
結果を図８に示す。Ｔ－ＨｙＰＢ、ＴＳ－ＨｙＰＢのＴＰ切出し活性は、ＨｙＰＢ単独の活性のそれぞれ約１．４倍、約３倍であった。更にＷｔＰＢの活性と比較するとそれぞれ約１６倍、約３６倍であり、両者が優れたＴＰ切り出し活性を有することが示された。
【0135】
例７ ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢのＴＰ切出し活性の測定
ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソームを用いて、例５に記載の方法で、ＴＰ切出し活性を測定した。
ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソームを用いて、例５に記載の方法で、ＴＰ切出し活性を測定した。
【0136】
結果を図９に示す。細胞分裂促進ペプチドを付加したＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢのＴＰ切出し活性は、ＴＳ－ＨｙＰＢの活性の約１６倍、ＷｔＰＢの活性と比較すると約５７０倍に増加した。したがって、細胞分裂促進ドメインを更に付加すると更に優れたＴＰ切り出し活性が得られることが示された。
【0137】
例８ ＷｔＰＢ、ＴＳ－ＨｙＰＢ、ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢを用いたＣＡＲ－Ｔの作製
例４で作製したＷｔＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソーム、ＴＳ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソーム、ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソームを用いて、次のようにトランスポゾン法でＣＡＲ－Ｔ（キメラ抗体組込みＴ細胞）を作製した。
例４で作製したＷｔＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソーム、ＴＳ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソーム、ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソームを用いて、次のようにトランスポゾン法でＣＡＲ－Ｔ（キメラ抗体組込みＴ細胞）を作製した。
【0138】
ドナーＤＮＡとして、ＣＡＲトランスポゾンが組込まれたプラスミドＤＮＡ（ｐＩＲＩＩ－ＣＡＲ．ＣＤ１９（ＣＤ２８））を使用した。プラスミドＤＮＡ内包リポソームの調整は、例４記載のリポソーム調整法に従った。細胞は、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を使用した。
【0139】
一晩培養したＰＢＭＣを、２００×ｇ、１０分間の遠心で回収した後、サイトカイン（ＩＬ－７、１０ｎｇ／ｍＬ；ＩＬ－１５、５ｎｇ／ｍＬ）を加えたＴｅｘＭＡＣＳに懸濁し、２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調整した。細胞縣濁液５００μＬを、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングした４８ウェル培養プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。培養プレートのコーティングは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１００倍希釈したＣＤ３／ＣＤ２８抗体液を、４８ウェル培養プレート（Ｎｏｎ－ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ、Ｎｕｎｃ）に、ウェルあたり１５０μＬ加えて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気に２時間以上静置することにより行った。
【0140】
ＰＢＭＣの播種から２４時間後に、プラスミドＤＮＡ内包リポソーム（４．０μｇ／ウェル）とＰＢ－ｍＲＮＡ内包リポソーム（４．０μｇ／ウェル）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で細胞を培養した。
【0141】
２週間後、ＰＢＭＣをインキュベータから取り出し、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で次のようにＣＡＲ－Ｔの作製率を調べた。ＦＡＣＳはＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＦＡＣＳＶｅｒｓｅを使用した。ＰＢＭＣを回収後、ＰＢＳで一度洗浄してから、５０μＬのＰＢＳに細胞を懸濁し、これに抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体［ＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］を２μＬ加えて、４℃、１５分間の抗原抗体反応をおこなった。反応終了後、ＰＢＳで一度洗浄し、５０μＬのＰＢＳに細胞を懸濁して、抗ＣＤ３抗体（Ｖ４５０ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３、Ｃｌｏｎｅ ＵＣＨＴ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を２μＬ加えた。４℃で１５分間の抗原抗体反応後、ＰＢＳで一度洗浄してから、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁してＦＡＣＳの分析試料とした。ＦＡＣＳでは、ＣＡＲ発現細胞の緑色蛍光（ＦＩＴＣ）と、ＣＤ３発現Ｔ細胞の青色蛍光（Ｖ４５０）を検出した。ＣＡＲ－Ｔは、緑色蛍光と青色蛍光とが共陽性の細胞（ＣＡＲ陽性かつＣＤ３陽性の細胞）である。ＣＡＲ－Ｔ作製率は、全検出細胞に対するＣＡＲ－Ｔの割合とした。
【0142】
結果を図１０に示す。ＣＡＲ－Ｔは、ＷｔＰＢではＱ２領域、ＴＳ－ＨｙＰＢ及びＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢではＵＲ領域（ＣＡＲ／ＣＤ３共陽性領域）の細胞である。ＣＡＲ－Ｔ作製率は、図１０のグラフに示す通り、ＷｔＰＢでは約５％であった。これに対して、ＴＳ－ＨｙＰＢでは約２０％であり、ＷｔＰＢの約４倍であった。また、ＴＳ－ＬＴＪ／Ｒｂ－ＨｙＰＢでは約５０％であり、ＷｔＰＢの約１０倍であった。
【0143】
したがって、実施形態の改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースによれば、細胞の製造効率が大きく改善されることが示された。
【0144】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
以下に、本願出願の原出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、
核局在化シグナルのアミノ酸配列と
を含む、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド。
［２］
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有する［１］に記載のポリペプチド。
［３］
前記核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルを連結したペプチドである、［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
［４］
前記核局在化シグナルのアミノ酸配列は、配列番号４及び配列番号３のアミノ酸配列を連結したペプチドである、［３］に記載のポリペプチド。
［５］
細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列を更に含む、［１］～［４］の何れか１つに記載のポリペプチド。
［６］
前記細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、［５］に記載のポリペプチド。
［７］
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、
核局在化シグナルをコードする塩基配列と
を含む、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチド。
［８］
ＤＮＡ又はＲＮＡである、［７］に記載のポリヌクレオチド。
［９］
ＤＮＡであり、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列は、配列番号５の配列を有する、［７］又は［８］に記載のポリヌクレオチド。
［１０］
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを構成する各アミノ酸に対応するコドンのうち、少なくとも１つのコドンが、ヒト用にコドン最適化されている、［７］～［９］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１１］
前記ヒト用にコドン最適化されているとは、前記各アミノ酸に対して次のコドンを用いることである、［１０］に記載のポリヌクレオチド。
アラニン（Ａ）に対して、ＧＣＵ又はＧＣＣ、
システイン（Ｃ）に対して、ＵＧＣ又はＵＧＵ、
アスパラギン酸（Ｄ）に対して、ＧＡＣ又はＧＡＵ、
グルタミン酸（Ｅ）に対して、ＧＡＡ又はＧＡＧ、
フェニルアラニン（Ｆ）に対して、ＵＵＣ又はＵＵＵ、
グリシン（Ｇ）に対して、ＧＧＡ又はＧＧＣ、
ヒスチジン（Ｈ）に対して、ＣＡＣ又はＣＡＵ、
イソロイシン（Ｉ）に対して、ＡＵＣ又はＡＵＵ、
リジン（Ｋ）に対して、ＡＡＡ又はＡＡＧ、
ロイシン（Ｌ）に対して、ＣＵＣ又はＣＵＧ、
メチオニン（Ｍ）に対して、ＡＵＧ、
アスパラギン（Ｎ）に対して、ＡＡＣ又はＡＡＵ、
プロリン（Ｐ）に対して、ＣＣＣ又はＣＣＵ、
グルタミン（Ｑ）に対して、ＣＡＡ又はＣＡＧ、
アルギニン（Ｒ）に対して、ＡＧＡ又はＡＧＧ、
セリン（Ｓ）に対して、ＡＧＣ、ＵＣＣ又はＵＣＵ、
トレオニン（Ｕ）に対して、ＡＣＡ又はＡＣＣ、
バリン（Ｖ）に対して、ＧＵＣ又はＧＵＧ、
トリプトファン（Ｗ）に対して、ＵＧＧ、
チロシン（Ｙ）に対して、ＵＡＣ又はＵＡＵ、
終止コドンに対して、ＵＧＡ、
ここで、Ａはアデニンであり、Ｕはウラシルであり、Ｃはチミンであり、Ｇはグアニンであり、前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合は、Ｕをチミン（Ｔ）に変更したものである。
［１２］
ＤＮＡであり、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列は、配列番号６又は７の配列を有する、［７］～［１１］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１３］
ＤＮＡであり、前記核局在化シグナルをコードする塩基配列は、配列番号８、９又は１０の配列を有する、［７］～［１２］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１４］
配列番号１７又は配列番号１８の塩基配列を有する、［７］～［１３］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１５］
細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列を更に含む、［７］～［１４］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１６］
ＤＮＡであり、前記細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、［１５］に記載のポリペプチド。
［１７］
配列番号２０の塩基配列を有する、［１５］又は［１６］に記載のポリヌクレオチド。
［１８］
脂質粒子、及び
前記脂質粒子に封入された、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチド
を備える、細胞のゲノムに目的配列を組込むための導入キャリアであって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、核局在化シグナルのアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、核局在化シグナルをコードする塩基配列とを含む、前記導入キャリア。
［１９］
前記ポリペプチドは、細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列を更に含み、
前記ポリヌクレオチドは、細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列を更に含む、［１８］に記載の導入キャリア。
［２０］
前記脂質粒子に、前記目的配列を含むドナーＤＮＡが更に封入されている［１８］又は［１９］の何れか１つに記載の導入キャリア。
［２１］
前記脂質粒子は、その構成成分として、式（１－０１）に示す脂質化合物及び／又は式（１－０２）に示す脂質化合物を含む、［１８］～［２０］の何れか１つに記載の導入キャリア。
［２２］
細胞のゲノムに目的配列を組込むためのキットであって、
請求項１～６の何れか１項に記載のポリペプチド又は［７］～［１７］の何れか１つに記載のポリヌクレオチドと、
前記目的配列を含むドナーＤＮＡと
を少なくとも含むキット。
［２３］
前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドと
前記ドナーＤＮＡとは、
脂質粒子に封入された状態である、［２２］に記載のキット。
［２４］
目的配列を含むドナーＤＮＡを、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドとともに細胞に導入することを含む、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法であって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、核局在化シグナルのアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、核局在化シグナルをコードする塩基配列とを含む、方法。
［２５］
前記ポリペプチドは、細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列を更に含み、
前記ポリヌクレオチドは、細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列を更に含む、［２４］に記載の方法。
［２６］
前記導入は、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法又はマグネトフェクション法を用いて行われる、［２４］又は［２５］に記載の方法。
［２７］
前記導入は、前記リポソーム法により行われ、
脂質粒子と、前記脂質粒子に封入された前記ドナーＤＮＡ及び前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを前記細胞に接触させることを含む、
［２６］に記載の方法。
［２８］
目的配列を含むドナーＤＮＡを、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドとともに細胞に導入することを含む、細胞の製造方法であって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、核局在化シグナルのアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、核局在化シグナルをコードする塩基配列とを含む、方法。
［２９］
前記ポリペプチドは、細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列を更に含み、
前記ポリヌクレオチドは、細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列を更に含む、［２８］に記載の方法。
［３０］
前記導入は、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法又はマグネトフェクション法を用いて行われる、［２８］又は［２９］に記載の方法。
［３１］
前記導入は、前記リポソーム法により行われ、
脂質粒子と、前記脂質粒子に封入された前記ドナーＤＮＡ及び前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを前記細胞に接触させることを含む、
［３０］に記載の方法。
以下に、本願出願の原出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、
核局在化シグナルのアミノ酸配列と
を含む、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド。
［２］
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有する［１］に記載のポリペプチド。
［３］
前記核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質の核局在化シグナルを連結したペプチドである、［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
［４］
前記核局在化シグナルのアミノ酸配列は、配列番号４及び配列番号３のアミノ酸配列を連結したペプチドである、［３］に記載のポリペプチド。
［５］
細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列を更に含む、［１］～［４］の何れか１つに記載のポリペプチド。
［６］
前記細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、［５］に記載のポリペプチド。
［７］
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、
核局在化シグナルをコードする塩基配列と
を含む、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチド。
［８］
ＤＮＡ又はＲＮＡである、［７］に記載のポリヌクレオチド。
［９］
ＤＮＡであり、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列は、配列番号５の配列を有する、［７］又は［８］に記載のポリヌクレオチド。
［１０］
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを構成する各アミノ酸に対応するコドンのうち、少なくとも１つのコドンが、ヒト用にコドン最適化されている、［７］～［９］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１１］
前記ヒト用にコドン最適化されているとは、前記各アミノ酸に対して次のコドンを用いることである、［１０］に記載のポリヌクレオチド。
アラニン（Ａ）に対して、ＧＣＵ又はＧＣＣ、
システイン（Ｃ）に対して、ＵＧＣ又はＵＧＵ、
アスパラギン酸（Ｄ）に対して、ＧＡＣ又はＧＡＵ、
グルタミン酸（Ｅ）に対して、ＧＡＡ又はＧＡＧ、
フェニルアラニン（Ｆ）に対して、ＵＵＣ又はＵＵＵ、
グリシン（Ｇ）に対して、ＧＧＡ又はＧＧＣ、
ヒスチジン（Ｈ）に対して、ＣＡＣ又はＣＡＵ、
イソロイシン（Ｉ）に対して、ＡＵＣ又はＡＵＵ、
リジン（Ｋ）に対して、ＡＡＡ又はＡＡＧ、
ロイシン（Ｌ）に対して、ＣＵＣ又はＣＵＧ、
メチオニン（Ｍ）に対して、ＡＵＧ、
アスパラギン（Ｎ）に対して、ＡＡＣ又はＡＡＵ、
プロリン（Ｐ）に対して、ＣＣＣ又はＣＣＵ、
グルタミン（Ｑ）に対して、ＣＡＡ又はＣＡＧ、
アルギニン（Ｒ）に対して、ＡＧＡ又はＡＧＧ、
セリン（Ｓ）に対して、ＡＧＣ、ＵＣＣ又はＵＣＵ、
トレオニン（Ｕ）に対して、ＡＣＡ又はＡＣＣ、
バリン（Ｖ）に対して、ＧＵＣ又はＧＵＧ、
トリプトファン（Ｗ）に対して、ＵＧＧ、
チロシン（Ｙ）に対して、ＵＡＣ又はＵＡＵ、
終止コドンに対して、ＵＧＡ、
ここで、Ａはアデニンであり、Ｕはウラシルであり、Ｃはチミンであり、Ｇはグアニンであり、前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合は、Ｕをチミン（Ｔ）に変更したものである。
［１２］
ＤＮＡであり、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列は、配列番号６又は７の配列を有する、［７］～［１１］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１３］
ＤＮＡであり、前記核局在化シグナルをコードする塩基配列は、配列番号８、９又は１０の配列を有する、［７］～［１２］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１４］
配列番号１７又は配列番号１８の塩基配列を有する、［７］～［１３］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１５］
細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列を更に含む、［７］～［１４］の何れか１つに記載のポリヌクレオチド。
［１６］
ＤＮＡであり、前記細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、［１５］に記載のポリペプチド。
［１７］
配列番号２０の塩基配列を有する、［１５］又は［１６］に記載のポリヌクレオチド。
［１８］
脂質粒子、及び
前記脂質粒子に封入された、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチド
を備える、細胞のゲノムに目的配列を組込むための導入キャリアであって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、核局在化シグナルのアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、核局在化シグナルをコードする塩基配列とを含む、前記導入キャリア。
［１９］
前記ポリペプチドは、細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列を更に含み、
前記ポリヌクレオチドは、細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列を更に含む、［１８］に記載の導入キャリア。
［２０］
前記脂質粒子に、前記目的配列を含むドナーＤＮＡが更に封入されている［１８］又は［１９］の何れか１つに記載の導入キャリア。
［２１］
前記脂質粒子は、その構成成分として、式（１－０１）に示す脂質化合物及び／又は式（１－０２）に示す脂質化合物を含む、［１８］～［２０］の何れか１つに記載の導入キャリア。
【化3】
［２２］
細胞のゲノムに目的配列を組込むためのキットであって、
請求項１～６の何れか１項に記載のポリペプチド又は［７］～［１７］の何れか１つに記載のポリヌクレオチドと、
前記目的配列を含むドナーＤＮＡと
を少なくとも含むキット。
［２３］
前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドと
前記ドナーＤＮＡとは、
脂質粒子に封入された状態である、［２２］に記載のキット。
［２４］
目的配列を含むドナーＤＮＡを、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドとともに細胞に導入することを含む、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法であって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、核局在化シグナルのアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、核局在化シグナルをコードする塩基配列とを含む、方法。
［２５］
前記ポリペプチドは、細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列を更に含み、
前記ポリヌクレオチドは、細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列を更に含む、［２４］に記載の方法。
［２６］
前記導入は、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法又はマグネトフェクション法を用いて行われる、［２４］又は［２５］に記載の方法。
［２７］
前記導入は、前記リポソーム法により行われ、
脂質粒子と、前記脂質粒子に封入された前記ドナーＤＮＡ及び前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを前記細胞に接触させることを含む、
［２６］に記載の方法。
［２８］
目的配列を含むドナーＤＮＡを、改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチド又は改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドとともに細胞に導入することを含む、細胞の製造方法であって、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのポリペプチドはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースのアミノ酸配列と、核局在化シグナルのアミノ酸配列とを含み、
前記改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードする塩基配列と、核局在化シグナルをコードする塩基配列とを含む、方法。
［２９］
前記ポリペプチドは、細胞分裂を促進するペプチドのアミノ酸配列を更に含み、
前記ポリヌクレオチドは、細胞分裂を促進するペプチドをコードする塩基配列を更に含む、［２８］に記載の方法。
［３０］
前記導入は、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法又はマグネトフェクション法を用いて行われる、［２８］又は［２９］に記載の方法。
［３１］
前記導入は、前記リポソーム法により行われ、
脂質粒子と、前記脂質粒子に封入された前記ドナーＤＮＡ及び前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを前記細胞に接触させることを含む、
［３０］に記載の方法。
【符号の説明】
【0145】
１、１０…改変型ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース、
２…核局在化シグナルドメイン、
３…ＰＢドメイン、
４…細胞分裂促進ドメイン、
２０…ドナーＤＮＡ、
２１…目的配列、
５０…脂質粒子、
５１、５２、５３…導入キャリア。
２…核局在化シグナルドメイン、
３…ＰＢドメイン、
４…細胞分裂促進ドメイン、
２０…ドナーＤＮＡ、
２１…目的配列、
５０…脂質粒子、
５１、５２、５３…導入キャリア。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】