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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023172939
(43)【公開日】2023-12-06
(54)【発明の名称】ライチ酵素、その製造方法、及び用途
(51)【国際特許分類】
C12N 9/00 20060101AFI20231129BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20231129BHJP
C12N 1/16 20060101ALN20231129BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20231129BHJP
【ＦＩ】
C12N9/00
A23L33/105
C12N1/16 Z
C12N1/20 Z
【審査請求】有
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023083939
(22)【出願日】2023-05-22
(31)【優先権主張番号】202210565739.1
(32)【優先日】2022-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】522072334
【氏名又は名称】仙楽健康科技股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】甘▲タン▼
(72)【発明者】
【氏名】紀素英
(72)【発明者】
【氏名】韓鐸
(72)【発明者】
【氏名】湯新
(72)【発明者】
【氏名】孫▲シュァン▼
【テーマコード（参考）】
4B018
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB08
4B018LE05
4B018MD52
4B018ME11
4B018MF13
4B065AA02X
4B065AA30X
4B065AA72X
4B065AA76X
4B065AA77X
4B065AA78X
4B065AA79X
4B065AC20
4B065BC03
4B065BD18
4B065BD35
4B065BD36
4B065BD37
4B065BD38
4B065CA27
4B065CA41
4B065CA42
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ライチ酵素、その製造方法及び用途を提供する。
【解決手段】ライチ酵素の、組成物の製造における用途であって、前記組成物は腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、又は腸管健康を改善するために用いられる、用途を提供する。ライチ酵素の製造方法は、（１）一次発酵；（２）一次発酵後の生成物に押出及び濾過を行い、一次発酵濾液を得ること；（３）二次発酵；及び（４）二次発酵液を濾過し、滅菌してライチ酵素を得ること、を含む。本発明のライチ酵素は腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、さらに腸管健康を改善するために用いられる。
【選択図】図３
【解決手段】ライチ酵素の、組成物の製造における用途であって、前記組成物は腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、又は腸管健康を改善するために用いられる、用途を提供する。ライチ酵素の製造方法は、（１）一次発酵；（２）一次発酵後の生成物に押出及び濾過を行い、一次発酵濾液を得ること；（３）二次発酵；及び（４）二次発酵液を濾過し、滅菌してライチ酵素を得ること、を含む。本発明のライチ酵素は腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、さらに腸管健康を改善するために用いられる。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ライチ酵素の、組成物の製造における用途であって、
前記組成物は腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、又は腸管健康を改善するために用いられる、用途。
前記組成物は腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、又は腸管健康を改善するために用いられる、用途。
【請求項2】
ライチ酵素は以下の方法で製造され、当該方法は、
（１）ライチ果実液及びライチ果実滓に第一炭素源を添加し、酵母菌と乳酸菌の混合菌剤である第一菌剤を接種し、２０－４５℃で密封静置して２４－９６時間発酵することを含む、一次発酵；
（２）一次発酵後の生成物に押出及び濾過を行い、一次発酵濾液を得ること；
（３）一次発酵濾液に第二炭素源を添加し、酢酸菌である第二菌剤を接種し、１５－４０℃で３－１５日間で静置するか又は通気培養して二次発酵液を得ることを含む、二次発酵；及び
（４）二次発酵液を濾過し、滅菌してライチ酵素を得ること、を含む、請求項１に記載の用途。
（１）ライチ果実液及びライチ果実滓に第一炭素源を添加し、酵母菌と乳酸菌の混合菌剤である第一菌剤を接種し、２０－４５℃で密封静置して２４－９６時間発酵することを含む、一次発酵；
（２）一次発酵後の生成物に押出及び濾過を行い、一次発酵濾液を得ること；
（３）一次発酵濾液に第二炭素源を添加し、酢酸菌である第二菌剤を接種し、１５－４０℃で３－１５日間で静置するか又は通気培養して二次発酵液を得ることを含む、二次発酵；及び
（４）二次発酵液を濾過し、滅菌してライチ酵素を得ること、を含む、請求項１に記載の用途。
【請求項3】
第一炭素源はフルクトース、スクロース、黒砂糖、マルトース、アラビノースのうちの一種又は複数種であり、第一炭素源の添加量は０－５ｗｔ％である、請求項２に記載の用途。
【請求項4】
前記酵母菌はＨａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、清酒酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ又はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａのうちの一種又は複数種であり；
前記乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉのうちの一種又は複数種であり；
酵母菌：乳酸菌の重量比は５０：１－５００：１であり；
第一菌剤の添加量はライチの総質量の０．１‰－１０‰である、請求項２に記載の用途。
前記乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉのうちの一種又は複数種であり；
酵母菌：乳酸菌の重量比は５０：１－５００：１であり；
第一菌剤の添加量はライチの総質量の０．１‰－１０‰である、請求項２に記載の用途。
【請求項5】
第二炭素源はラクトース、赤砂糖、グルコース、糖蜜又は蜂蜜のうちの一種又は複数種であり、
第二炭素源の添加量は一次発酵濾液の総質量の１％－２０％である、請求項２に記載の用途。
第二炭素源の添加量は一次発酵濾液の総質量の１％－２０％である、請求項２に記載の用途。
【請求項6】
第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓ又はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉのうちの一種又は複数種であり；
第二菌剤の添加量は一次発酵濾液の総質量の０．１‰－１０‰であり；
静置培養は８層のガーゼで密封して静置培養することであり；
通気培養の通気量は０．１－２０ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液である、請求項２に記載の用途。
第二菌剤の添加量は一次発酵濾液の総質量の０．１‰－１０‰であり；
静置培養は８層のガーゼで密封して静置培養することであり；
通気培養の通気量は０．１－２０ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液である、請求項２に記載の用途。
【請求項7】
ライチ酵素の製造方法であって、
（１）ライチ果実液及びライチ果実滓に第一炭素源を添加し、酵母菌と乳酸菌の混合菌剤である第一菌剤を接種し、２０－４５℃で密封静置して２４－９６時間発酵することを含む、一次発酵；
（２）一次発酵後の生成物に押出及び濾過を行い、一次発酵濾液を得ること；
（３）一次発酵濾液に第二炭素源を添加し、酢酸菌である第二菌剤を接種し、１５－４０℃で３－１５日間で静置するか又は通気培養して二次発酵液を得ることを含む、二次発酵；及び
（４）二次発酵液を濾過し、滅菌してライチ酵素を得ること、を含む、方法。
（１）ライチ果実液及びライチ果実滓に第一炭素源を添加し、酵母菌と乳酸菌の混合菌剤である第一菌剤を接種し、２０－４５℃で密封静置して２４－９６時間発酵することを含む、一次発酵；
（２）一次発酵後の生成物に押出及び濾過を行い、一次発酵濾液を得ること；
（３）一次発酵濾液に第二炭素源を添加し、酢酸菌である第二菌剤を接種し、１５－４０℃で３－１５日間で静置するか又は通気培養して二次発酵液を得ることを含む、二次発酵；及び
（４）二次発酵液を濾過し、滅菌してライチ酵素を得ること、を含む、方法。
【請求項8】
ライチ果実を洗浄し圧搾する前処理ステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
第一炭素源はフルクトース、スクロース、黒砂糖、マルトース、アラビノースのうちの一種又は複数種であり、
第一炭素源の添加量は０－５ｗｔ％である、請求項７に記載の方法。
第一炭素源の添加量は０－５ｗｔ％である、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記酵母菌はＨａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、清酒酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ又はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａのうちの一種又は複数種であり；
前記乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉのうちの一種又は複数種であり；
酵母菌：乳酸菌の重量比は５０：１－５００：１であり；
第一菌剤の添加量はライチの総質量の０．１‰－１０‰である、請求項７に記載の方法。
前記乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉのうちの一種又は複数種であり；
酵母菌：乳酸菌の重量比は５０：１－５００：１であり；
第一菌剤の添加量はライチの総質量の０．１‰－１０‰である、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
第二炭素源はラクトース、赤砂糖、グルコース、糖蜜又は蜂蜜のうちの一種又は複数種であり、
第二炭素源の添加量は一次発酵濾液の総質量の１％－２０％である、請求項７に記載の方法。
第二炭素源の添加量は一次発酵濾液の総質量の１％－２０％である、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓ又はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉのうちの一種又は複数種であり；
第二菌剤の添加量は一次発酵濾液の総質量の０．１‰－１０‰であり；
静置培養は８層のガーゼで密封して静置培養することであり；
通気培養の通気量は０．１－２０ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液である、請求項７に記載の方法。
第二菌剤の添加量は一次発酵濾液の総質量の０．１‰－１０‰であり；
静置培養は８層のガーゼで密封して静置培養することであり；
通気培養の通気量は０．１－２０ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液である、請求項７に記載の方法。
【請求項13】
請求項７－１２のいずれか１項に記載の方法で製造された、ライチ酵素。
【請求項14】
請求項１３に記載のライチ酵素を含み、
腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、又は腸管健康を改善するために用いられる、組成物。
腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、又は腸管健康を改善するために用いられる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は微生物発酵の分野に属し、特にライチ酵素が腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、又は腸管健康を改善する用途に関する。
【背景技術】
【0002】
ライチは、中国の南方の一般的な果実であり、味が甘く、性質が温和であり、脾臓の機能を高め、肝臓の機能を高め、気の働きを良くし、血の機能を高め、脾胃を温めて痛みを止め、心気を補い精神を安定さる等の効果を有する。酵素は、動物、植物、菌類等を原料とし、補助材料を添加するか又は添加せず、微生物発酵により得られた特定の生物活性成分を含有する製品であり、その生物活性成分は多糖、オリゴ糖、ポリフェノール、タンパク質、及びポリペプチド、アミノ酸、ビタミン等を含む。酵素は、新陳代謝を促進し、酒を解し肝臓を保護し、美白する等の効果を有する。
【0003】
従来のライチ加工プロセスは、プロセスが複雑であり、製造周期が長いか、又は特定の設備を導入する必要があり、大規模な産業化製造に不利である。従来の酵素製品において、腸管バリア、腸管免疫機能を改善できる製品が少なく、また改善メカニズムを明確に説明できない現象も存在する。本発明は、独特な発酵プロセスとプロバイオティクスの組み合わせにより、ライチ酵素を取得し、かつ腸管バリア機能を意図的に向上させ、腸管免疫を双方向に調節する。同時に、本発明も改善されたメカニズムを明確に説明する。本発明の技術的意義は、酵素製品の機能を拡張するだけでなく、製品の適用性についてメカニズムの説明を提供することである。
【発明の概要】
【0004】
従来の酵素製品において、腸管バリア、腸管免疫機能を改善することができる製品が少ない。これに鑑み、本発明者は、腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、さらに腸管健康を改善することができるライチ酵素を開発した。
【0005】
また、本発明はライチ酵素の、組成物の製造における用途を提供し、前記組成物は腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、又は腸管健康を改善するために用いられる。
【0006】
また、本発明は、腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、又は腸管健康を改善するためのライチ酵素を提供する。
【0007】
ある実施形態において、ライチ酵素は本発明のライチ酵素である。
【0008】
また、本発明はライチ酵素の製造方法を提供し、当該製造方法は、
（１）ライチ果実液及びライチ果実滓に第一炭素源を添加し、酵母菌と乳酸菌の混合菌剤である第一菌剤を接種し、２０－４５℃で密封静置して２４－９６時間発酵することを含む、一次発酵；
（２）一次発酵後の生成物に押出及び濾過を行い、一次発酵濾液を得ること；
（３）一次発酵濾液に第二炭素源を添加し、酢酸菌である第二菌剤を接種し、１５－４０℃で３－１５日間で静置するか又は通気培養して二次発酵液を得ることを含む、二次発酵；及び
（４）二次発酵液を濾過し、滅菌してライチ酵素を得ること、を含む。
（１）ライチ果実液及びライチ果実滓に第一炭素源を添加し、酵母菌と乳酸菌の混合菌剤である第一菌剤を接種し、２０－４５℃で密封静置して２４－９６時間発酵することを含む、一次発酵；
（２）一次発酵後の生成物に押出及び濾過を行い、一次発酵濾液を得ること；
（３）一次発酵濾液に第二炭素源を添加し、酢酸菌である第二菌剤を接種し、１５－４０℃で３－１５日間で静置するか又は通気培養して二次発酵液を得ることを含む、二次発酵；及び
（４）二次発酵液を濾過し、滅菌してライチ酵素を得ること、を含む。
【0009】
ある実施形態において、方法は、ライチ果実を洗浄し圧搾する前処理ステップを含む。
【0010】
ある実施形態において、第一炭素源は、フルクトース、スクロース、黒砂糖、マルトース、アラビノースのうちの一種又は複数種である。
【0011】
ある実施形態において、第一炭素源の添加量は０－５ｗｔ％である。
【0012】
ある実施形態において、酵母菌は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、清酒酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ又はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａのうちの一種又は複数種である。好ましくは、酵母菌はＨａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、清酒酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのうちの一種又は複数種である。
【0013】
ある実施形態において、乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉのうちの一種又は複数種である。
【0014】
ある実施形態において、酵母菌：乳酸菌の重量比は５０：１－５００：１である。好ましくは、酵母菌：乳酸菌の重量比は３００：１－５００：１である。
【0015】
ある実施形態において、第一菌剤の添加量はライチの総質量の０．１‰－１０‰である。
【0016】
ある実施形態において、第二炭素源は、ラクトース、赤砂糖、グルコース、糖蜜又は蜂蜜のうちの一種又は複数種である。
【0017】
ある実施形態において、第二炭素源の添加量は一次発酵濾液の総質量の１％－２０％である。
【0018】
ある実施形態において、第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓ又はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉのうちの一種又は複数種である。
【0019】
ある実施形態において、第二菌剤の添加量は一次発酵濾液の総質量の０．１‰－１０‰である。
【0020】
ある実施形態において、静置培養は８層のガーゼで密封して静置培養することである。
【0021】
ある実施形態において、通気培養の通気量は０．１－２０ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液である。
【0022】
別の態様では、本発明のライチ酵素を含む組成物を提供する。組成物は医薬品であってもよい。又は、組成物は、食品又は機能性食品であってもよく、ドリンク、飲料、ゼリー、又はゲルキャンディ形態である。ある実施形態において、ライチ酵素は液体である。
【0023】
本発明の利点は、以下を含む：
１．腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、さらに腸管健康を改善するライチ酵素を提供し；及び
２．新たなライチ酵素の製造プロセスを提供し、異なる菌剤の配合を採用し、段階的に二次発酵を行う。
１．腸管バリア機能を向上させ、腸管免疫を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、さらに腸管健康を改善するライチ酵素を提供し；及び
２．新たなライチ酵素の製造プロセスを提供し、異なる菌剤の配合を採用し、段階的に二次発酵を行う。
【図面の簡単な説明】
【0024】
図１は、異なる濃度のライチ酵素のリポ多糖（ＬＰＳ）処理ヒト結腸癌細胞Ｃａｃｏ－２の経上皮電気抵抗値（Ｔｒａｎｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）への影響を示す。ライチ酵素の濃度が０．１μｇ／ｍＬより大きい場合、腸管細胞の経上皮電気抵抗値（ｐ＜０．０５）を顕著に向上させることができ、ライチ酵素が腸管バリアを修復することができ、腸管バリア機能を向上させる作用を有することを示す。注意：＃＃＃はブランク対照群に比べて極めて有意差（ｐ＜０．０００１）があることを示し；ｎｓはモデル群（ＬＰＳ群）に比べて有意差がないことを示し；＊はモデル群（ＬＰＳ群）に比べて有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【0025】
図２は、異なる濃度のライチ酵素のマクロファージＲＡＷ２６４．７のＮＯ放出量に対する影響を示す。異なる濃度のライチ酵素は、マクロファージＲＡＷ２６４．７がＮＯを分泌することを促進することができ、酵素サンプルがマクロファージを活性化させ、免疫調節に関与することができることを示す。注意：図中の異なるアルファベットは有意差（ｐ＜０．０５）があることを示し、同じアルファベットを含むことは有意差がないことを示す。単一因子分散分析（ＯＮＥ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ）におけるＤｕｎｃａｎマルチ範囲検定で有意差分析を行い、ｐ＜０．０５を有意差閾値として定義する。
【0026】
図３は、異なる濃度のライチ酵素のリポ多糖（ＬＰＳ）によって誘導されたマクロファージＲＡＷ２６４．７のＮＯ放出量への影響を示す。ライチ酵素は、一定の濃度範囲内に炎症細胞がＮＯを放出することを抑制することができ、抗炎症活性を有し、その抗炎症活性を有する濃度範囲は０．１－８μｇ／ｍＬである。マクロファージの実験結果は、ライチ酵素の免疫への調節が双方向性を有し、腸管の定常状態を維持することに役立つことを示す。注意：＃＃＃＃はブランク対照群と比べて極めて有意差（ｐ＜０．０００１）があることを示し；ｎｓはモデル群（ＬＰＳ群）と比べて有意差がないことを示し、＊はモデル群（ＬＰＳ群）と比べて有意差（ｐ＜０．０５）があることを示し、＊＊はモデル群（ＬＰＳ群）と比べて極めて有意差（ｐ＜０．０１）があることを示し、＊＊＊はモデル群（ＬＰＳ群）と比べて極めて有意差（ｐ＜０．００１）があることを示し、＊＊＊＊はモデル群（ＬＰＳ群）と比べて極めて有意差（ｐ＜０．０００１）があることを表す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下の詳細な説明及び添付のクレームを読むことにより、本発明のこれら及び他の態様、特徴、及び利点は、当業者にとって明らかである。本発明の一態様の任意の特徴は、本発明の任意の他の態様に使用することができる。用語「含む」は開放式であることを意図し、かつ適切な場合に「からなる」で置き換えることができる。本明細書において、特に指摘しない限り、パーセントは、重量／重量パーセントを指す。実施例において、又はさらに明確的に説明する以外に、明細書及びクレームにおいて、物質の品質、物理的性質等を示す全ての数字は、「約」で修飾されていると理解すべきであり、前記数値±１０％又は５％を表すことができる。
【0028】
本明細書で使用されるように、「酵素」は、動物、植物、菌類等を原料とし、補助材料を添加するか又は添加せず、微生物発酵により得られた特定の生物活性成分を含有する製品を指す。本発明ではライチ酵素を提供し、ライチを原料として炭素源を添加した場合に微生物発酵により得られた製品を指す。
【0029】
本明細書に使用されるように、「生物活性成分」は、発酵により製造されて生命現象に影響を与える微量又は少量の物質を指す。生物活性成分は、多糖、オリゴ糖、ポリフェノール、タンパク質及びポリペプチド、アミノ酸、ビタミン等を含むことができる。
【0030】
本発明はライチ酵素の製造方法を提供し、当該製造方法は二段階発酵過程を含む。具体的には、方法は一次発酵を含み、それはライチ果実液とライチ果実滓に第一炭素源を添加し、第一菌剤を接種し、第一温度で第一時間帯で密封静置発酵することを含み、第一菌剤は酵母菌と乳酸菌の混合菌剤である。酵母菌は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、清酒酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ又はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａのうちの一種又は複数種であってもよい。乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉのうちの一種又は複数種であってもよい。
【0031】
第一温度の範囲は、２０－４５℃であってもよく、例えば２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃又はその間の任意の範囲である。第一時間帯の範囲は、２４－９６時間であってもよく、例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、７０、７５、８０又は９０時間である。
【0032】
第一炭素源は、フルクトース、スクロース、黒砂糖、マルトース、アラビノースのうちの一種又は複数種であってもよい。第一炭素源の添加量は、０－５ｗｔ％であってもよく、例えば１ｗｔ％、１．５ｗｔ％、２ｗｔ％、２．５ｗｔ％、３ｗｔ％、３．５ｗｔ％、又は４ｗｔ％である。第一炭素源は、二種以上の糖類、例えば重量パーセントが同じである二種以上の糖類を含むことができる。ある実施形態において、第一炭素源は、フルクトース：黒砂糖＝１：１である。ある実施形態において、第一炭素源は、スクロースである。ある実施形態において、第一炭素源は、マルトース：アラビノース＝１：１である。ある実施形態において、第一炭素源はマルトースである。ある実施形態において、第一炭素源は、フルクトース：スクロース：黒砂糖が１：１：１である。ある実施形態において、第一炭素源は、スクロース：アラビノース＝１：１である。
【0033】
酵母菌：乳酸菌の重量比は、５０：１－５００：１であってもよく、例えば５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１又は４００：１である。
【0034】
第一菌剤の添加量は、ライチの総質量の０．１‰－１０‰であってもよく、例えば０．５‰、０．９‰、１‰、２‰、３‰、４‰、５‰、６‰、７‰、８‰又は９‰である。
【0035】
ある実施形態において、第一菌剤は、酵母菌：乳酸菌が４００：１であり；酵母菌は清酒酵母であり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉが１：１：１である。ある実施形態において、第一菌剤の添加量はライチの総質量の０．９‰である。
【0036】
ある実施形態において、第一菌剤は酵母菌：乳酸菌が１００：１であり；酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘが１：１：１であり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉが１：１：１である。ある実施形態において、第一菌剤の添加量はライチの総質量の５‰である。
【0037】
ある実施形態において、第一菌剤は酵母菌：乳酸菌が５０：１であり；酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ：Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘが１：１：１であり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉが１：１である。ある実施形態において、第一菌剤の添加量はライチの総質量の０．１‰である。
【0038】
ある実施形態において、第一菌剤は酵母菌：乳酸菌が３００：１であり；酵母菌はＨａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａであり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉである。ある実施形態において、第一菌剤の添加量はライチの総質量の１０‰である。
【0039】
ある実施形態において、第一菌剤は酵母菌：乳酸菌が５００：１であり；酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：清酒酵母が１：１であり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉが１：１：１である。ある実施形態において、第一菌剤の添加量はライチの総質量の８‰である。
【0040】
ある実施形態において、第一菌剤は酵母菌：乳酸菌が２００：１であり；酵母菌はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａであり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉが１：１である。ある実施形態において、第一菌剤の添加量はライチの総質量の２‰である。
【0041】
ある実施形態において、第一菌剤は酵母菌：乳酸菌が１５０：１であり；酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉである。ある実施形態において、第一菌剤の添加量はライチの総質量の４‰である。
【0042】
一次発酵後の生成物に押出及び濾過を行い、一次発酵濾液を得ることができる。該過程は本分野の既知の様々な方式で行うことができ、例えばフィルタープレスで行うことができる。一次発酵過程の前にライチ果実の洗浄及び圧搾の前処理ステップを行うことができる。
【0043】
ライチ酵素の製造方法は、さらに二次発酵過程を含み、それは一次発酵濾液に第二炭素源を添加し、第二菌剤を接種し、第二温度で第二時間帯で静置するか又は通気培養してライチ酵素を得ることを含み、第二菌剤は酢酸菌である。第二菌剤は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓ又はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉのうちの一種又は複数種であってもよい。第二炭素源は、ラクトース、赤砂糖、グルコース、糖蜜又は蜂蜜のうちの一種又は複数種であってもよい。第二炭素源は、二種以上の糖類、例えば重量パーセントが同じである二種以上の糖類を含むことができる。第二炭素源の添加量は、一次発酵濾液の総質量の１％－２０％であり、例えば２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％又は１９％である。ある実施形態において、第二炭素源はラクトースである。ある実施形態において、第二炭素源は赤砂糖である。ある実施形態において、第二炭素源は糖蜜：ラクトースが１：１である。ある実施形態において、第二炭素源はグルコースである。ある実施形態において、第二炭素源は蜂蜜である。ある実施形態において、第二炭素源はグルコース：蜂蜜が１：１である。
【0044】
第二温度の範囲は、１５－４０℃であってもよく、例えば１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃又はその間の任意の範囲である。第二時間帯の範囲は、３－１５日であってもよく、例えば４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日又は１５日である。
【0045】
第二菌剤の添加量は、一次発酵濾液の総質量の０．１‰－１０‰であってもよく、例えば０．５‰、１‰、２‰、３‰、４‰、５‰、６‰、７‰、８‰又は９‰である。
【0046】
ある実施形態において、第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉである。ある実施形態において、第二菌剤の添加量は一次発酵濾液の総質量の１‰である。
【0047】
ある実施形態において、第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓである。ある実施形態において、添加量は一次発酵濾液の総質量の５‰である。
【0048】
ある実施形態において、第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉである。ある実施形態において、添加量は一次発酵濾液の総質量の９‰である。
【0049】
ある実施形態において、第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓが１：１：１である。ある実施形態において、添加量は一次発酵濾液の総質量の０．１‰である。
【0050】
ある実施形態において、第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓが１：１：１である。ある実施形態において、添加量は一次発酵濾液の総質量の０．９‰である。
【0051】
ある実施形態において、第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓである。ある実施形態において、添加量は一次発酵濾液の総質量の３‰である。
【0052】
ある実施形態において、第二菌剤はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓである。ある実施形態において、添加量は一次発酵濾液の総質量の１０‰である。
【0053】
ある実施形態において、接種用の酵母菌の含有量はいずれも少なくとも１．０×１０６ＣＦＵ／ｇであり、例えば１．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、２×１０６ＣＦＵ／ｇ、２．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、３×１０６ＣＦＵ／ｇ、３．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、４×１０６ＣＦＵ／ｇ、４．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、５×１０６ＣＦＵ／ｇ、５．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、６×１０６ＣＦＵ／ｇ、６．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、７×１０６ＣＦＵ／ｇ、７．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、８×１０６ＣＦＵ／ｇ、８．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、９×１０６ＣＦＵ／ｇ又は９．５×１０６ＣＦＵ／ｇである。
【0054】
ある実施形態において、接種用の乳酸菌含有量はいずれも少なくとも１．０×１０５ＣＦＵ／ｇであり、例えば１．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、２×１０６ＣＦＵ／ｇ、２．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、３×１０６ＣＦＵ／ｇ、３．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、４×１０６ＣＦＵ／ｇ、４．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、５×１０６ＣＦＵ／ｇ、５．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、６×１０６ＣＦＵ／ｇ、６．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、７×１０６ＣＦＵ／ｇ、７．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、８×１０６ＣＦＵ／ｇ、８．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、９×１０６ＣＦＵ／ｇ又は９．５×１０６ＣＦＵ／ｇである。
【0055】
ある実施形態において、接種用の酢酸菌の原始菌含有量はいずれも少なくとも１．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、２×１０６ＣＦＵ／ｇ、２．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、３×１０６ＣＦＵ／ｇ、３．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、４×１０６ＣＦＵ／ｇ、４．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、５×１０６ＣＦＵ／ｇ、５．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、６×１０６ＣＦＵ／ｇ、６．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、７×１０６ＣＦＵ／ｇ、７．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、８×１０６ＣＦＵ／ｇ、８．５×１０６ＣＦＵ／ｇ、９×１０６ＣＦＵ／ｇ又は９．５×１０６ＣＦＵ／ｇである。
【0056】
本明細書において、静置培養は、当業者に知られている任意の形式の静置培養であってもよく、例えば８層のガーゼで密封して静置培養する。また、通気培養は、当業者に知られている任意の形式の通気培養であってもよい。通気量は、０．１－２０ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液であってもよく、例えば０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液である。
【0057】
本方法により製造されたライチ酵素を添加成分として製品に添加することができ、例えば食品又は機能性食品に添加し、又は食品又は機能性食品として用いられる。ライチ酵素の形態は特に限定されない。例えば、ライチ酵素は液体であってもよい。本発明のライチ酵素は、腸管バリア機能を向上させ、免疫（例えば腸管免疫）を双方向に調節し、腸管炎症を改善し、腸管定常状態を維持し、さらに腸管健康を改善するために用いられる。本発明のライチ酵素は、マクロファージのＮＯ分泌を調節してこれらの効果を実現することができる。また、本発明のライチ酵素は、マクロファージを活性化してＮＯを生成し、非特異的免疫効用を発揮することができる。また、本発明のライチ酵素は、ＬＰＳで誘導された炎症細胞のＮＯの放出ことを抑制することができ、抗炎症活性を有する。
【0058】
以上、本発明の複数の実施形態について説明した。しかしながら、理解すべきことは、本発明の本質及び範囲から逸脱することなく様々な調整を行うことができることである。それに応じて、他の実施形態は以下のクレームの範囲内にある。
【0059】
以下に実施例を参照して本願をさらに詳細に説明する。しかしながら、当業者であれば、これらの実施形態は説明の目的のためだけに提供されるものであり、本願を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【0060】
実施例
以下に実施例を参照しながら、本出願の実施形態を詳細に説明するが、当業者であれば、以下の実施例は本出願を説明するためのものに過ぎず、本出願の範囲を限定するものと見なされないと理解すべきである。実施例において具体的な条件を明記していないものは、通常の条件又はメーカーが提案した条件に応じて行われる。使用される試薬又は機器は、メーカーを明記していないものであり、いずれも市販により取得できる従来の製品である。特に指定しない限り、列挙された全ての量はいずれも総重量の重量パーセントに基づいて説明される。本願は、記載された具体的な実施例に限定されていると解釈すべきではない。
以下に実施例を参照しながら、本出願の実施形態を詳細に説明するが、当業者であれば、以下の実施例は本出願を説明するためのものに過ぎず、本出願の範囲を限定するものと見なされないと理解すべきである。実施例において具体的な条件を明記していないものは、通常の条件又はメーカーが提案した条件に応じて行われる。使用される試薬又は機器は、メーカーを明記していないものであり、いずれも市販により取得できる従来の製品である。特に指定しない限り、列挙された全ての量はいずれも総重量の重量パーセントに基づいて説明される。本願は、記載された具体的な実施例に限定されていると解釈すべきではない。
【0061】
実施例に使用される菌剤は以下のとおりである：
清酒酵母：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓａｋｅ ＣＣＴＣＣ ＣＹ ２００８１２７０（典型的な培養物寄託センターから購入される）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＤＭＣＣ ２．１１５（広東省微生物菌種寄託センター（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）から購入される）；Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ：Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ ＣＩＣＣ １８５９（中国工業微生物菌種寄託（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）センターから購入される）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘ ＧＤＭＣＣ ２．５５（広東省微生物菌種寄託センターから購入される）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ Ｓａｃｃａｒｄｏ ＧＤＭＣＣ ２．６０（広東省微生物菌種寄託センターから購入される）；Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ：Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ ＣＩＣＣ １３２３７（中国工業微生物菌種寄託センターから購入される）；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ ｖａｒ．Ａｎｏｍａｌａ ＣＩＣＣ １６４１ （中国工業微生物菌種寄託センターから購入される）。
清酒酵母：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓａｋｅ ＣＣＴＣＣ ＣＹ ２００８１２７０（典型的な培養物寄託センターから購入される）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＤＭＣＣ ２．１１５（広東省微生物菌種寄託センター（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）から購入される）；Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ：Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ ＣＩＣＣ １８５９（中国工業微生物菌種寄託（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）センターから購入される）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘ ＧＤＭＣＣ ２．５５（広東省微生物菌種寄託センターから購入される）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ Ｓａｃｃａｒｄｏ ＧＤＭＣＣ ２．６０（広東省微生物菌種寄託センターから購入される）；Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ：Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ ＣＩＣＣ １３２３７（中国工業微生物菌種寄託センターから購入される）；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ ｖａｒ．Ａｎｏｍａｌａ ＣＩＣＣ １６４１ （中国工業微生物菌種寄託センターから購入される）。
【0062】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＧＭＣＣ １．９０８９（中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター（Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）から購入される）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＣＧＭＣＣ １．５７２（中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターから購入される）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＣＧＭＣＣ １．５７５（中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターから購入される）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＣＩＣＣ ６１２１（中国工業微生物菌種寄託センターから購入される）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ ＣＩＣＣ ２１８５８（中国工業微生物菌種寄託センターから購入される）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＦＲＩ ２００８０８２（ＮＩＮＧ ＢＯ ＴＥＳＴＯＢＩＯ有限責任会社）である。
【0063】
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ ＡＴＣＣ １５９７３（米国典型培養物寄託センター（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からのもの）；Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ＢＮＣＣ １５９６３９（ＢｅＮａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＢＮＣＣ）から購入される）；Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ ＧＤＭＣＣ １．６７（広東省微生物菌種寄託センターから購入される）；Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ ＣＩＣＣ ７００２（中国工業微生物菌種寄託センターから購入される）；Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓ ＢＮＣＣ １８３８２４（ＢｅＮａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＢＮＣＣ）から購入される）。以上の菌株を菌粉で購入し、酵母菌の原始菌含有量はいずれも１．０×１０６ＣＦＵ／ｇであり、乳酸菌の原始菌含有量はいずれも１．０×１０５ＣＦＵ／ｇであり、酢酸菌の原始菌含有量はいずれも１．０×１０５ＣＦＵ／ｇである。実験過程において菌株菌粉として添加する。
【0064】
実施例１：ライチ酵素の調製
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、３０℃で密封静置して７２ｈ発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、１５℃で５日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、３０℃で密封静置して７２ｈ発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、１５℃で５日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
【0065】
本実施例において、糖１はフルクトース：黒砂糖＝１：１であり；糖１の添加量は２％（ｗ／ｗ）であり；菌剤１は酵母菌：乳酸菌が４００：１であり；酵母菌は清酒酵母であり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉが１：１：１であり；菌剤１の添加量はライチの総質量の０．９‰である。
【0066】
本実施例において、糖２はラクトースであり；糖２の添加量は一次発酵濾液の総質量の１５％であり；菌剤２はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉが１：１であり；菌剤２の添加量は一次発酵濾液の総質量の１‰であり；培養方式は通気量が１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液の通気培養である。
【0067】
上記方法によりライチ酵素を調製した。
【0068】
実施例２：ライチ酵素の調製
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、２１℃で９６ｈ密封静置発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、３７℃で７日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、２１℃で９６ｈ密封静置発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、３７℃で７日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
【0069】
本実施例において、糖１はスクロースであり；糖１の添加量は５％（ｗ／ｗ）であり；菌剤１は酵母菌：乳酸菌が１００：１であり；酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘが１：１：１であり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉが１：１：１であり；菌剤１の添加量はライチの総質量の５‰である。
【0070】
本実施例において、糖２は赤砂糖であり；糖２の添加量は一次発酵濾液の総質量の１％であり；菌剤２はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓであり；菌剤２の添加量は一次発酵濾液の総質量の５‰であり；培養方式は通気量が１５ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬの発酵液の通気培養である。
【0071】
実施例３：ライチ酵素の調製
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、４５℃で密封静置して２４ｈ発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、３０℃で３日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、４５℃で密封静置して２４ｈ発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、３０℃で３日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
【0072】
本実施例において、糖１はマルトース：アラビノースが１：１であり；糖１の添加量は４％（ｗ／ｗ）であり；菌剤１は酵母菌：乳酸菌が５０：１であり；酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ：Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘが１：１：１であり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉが１：１であり；菌剤１の添加量はライチの総質量の０．１‰である。
【0073】
本実施例において、糖２は糖蜜：ラクトースが１：１であり；糖２の添加量は一次発酵濾液の総質量の５％であり；菌剤２はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉであり；菌剤２の添加量は一次発酵濾液の総質量の９‰であり；培養方式は通気量が２０ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液の通気培養である。
【0074】
実施例４：ライチ酵素の調製
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、３９℃で２５ｈ密封静置発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、２５℃で１０日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、３９℃で２５ｈ密封静置発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、２５℃で１０日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
【0075】
本実施例において、糖１はマルトースであり；糖１の添加量は１％（ｗ／ｗ）であり；菌剤１は酵母菌：乳酸菌が３００：１であり；酵母菌はＨａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａであり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉであり；菌剤１の添加量はライチの総質量の１０‰である。
【0076】
本実施例において、糖２はグルコースであり；糖２の添加量は一次発酵濾液の総質量の１８％であり；菌剤２はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓが１：１：１であり；菌剤２の添加量は一次発酵濾液の総質量の０．１‰であり；培養方式は通気量が３ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬの通気培養である。
【0077】
実施例５：ライチ酵素の調製
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、２５℃で密封静置して４８ｈ発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、４０℃で９日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、２５℃で密封静置して４８ｈ発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、４０℃で９日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
【0078】
本実施例において、糖１はフルクトース：スクロース：黒砂糖が１：１：１であり；糖１の添加量が３％（ｗ／ｗ）であり；菌剤１は酵母菌：乳酸菌が５００：１であり；酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：清酒酵母が１：１であり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉが１：１：１であり；菌剤１の添加量はライチの総質量の８‰である。
【0079】
本実施例において、糖２は蜂蜜であり；糖２の添加量は一次発酵濾液の総質量の２０％であり；菌剤２はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ ａｃｅｔｉ：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓが１：１：１であり；菌剤２の添加量は一次発酵濾液の総質量の０．９‰であり；培養方式は通気量が５ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬの発酵液の通気培養である。
【0080】
実施例６：ライチ酵素の調製
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、３２℃で密封静置して８６ｈ発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、３５℃で１５日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、３２℃で密封静置して８６ｈ発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、３５℃で１５日間通気培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
【0081】
本実施例において糖１の添加量は０％であり；菌剤１は酵母菌：乳酸菌が２００：１であり；酵母菌はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａであり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉが１：１であり；菌剤１の添加量はライチの総質量の２‰である。
【0082】
本実施例において糖２はグルコース：蜂蜜が１：１であり；糖２の添加量は一次発酵濾液の総質量の１０％であり；菌剤２はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｎｃｅｎｓであり；菌剤２の添加量は一次発酵濾液の総質量の３‰であり；培養方式は通気量が０．１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ発酵液の通気培養である。
【0083】
実施例７：ライチ酵素の調製
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、２８℃で６５ｈ密封静置発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、２８℃で１３日間静置培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
（１）前処理：５トンのライチ果実を洗浄し、圧搾し、
（２）一次発酵：果実液と果実滓の混合物に糖１を添加し、菌剤１を接種し、２８℃で６５ｈ密封静置発酵し、
（３）濾過：フィルタープレスで押圧し、一次発酵濾液を得て、一次発酵濾液の質量がライチ果実の総質量の６０％より大きく、
（４）二次発酵：一次発酵濾液に糖２を添加し、菌剤２を接種し、２８℃で１３日間静置培養し、
（５）濾過し、滅菌した。
【0084】
本実施例において、糖１はスクロース：アラビノースが１：１であり；糖１の添加量は２．５％（ｗ／ｗ）であり；菌剤１は酵母菌：乳酸菌が１５０：１であり；酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり；乳酸菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉであり；菌剤１の添加量はライチの総質量の４‰である。
【0085】
本実施例において、糖２は赤砂糖であり；糖２の添加量は一次発酵濾液の総質量の３％であり；菌剤２はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｇｈａｎｅｎｓｉｓであり；菌剤２の添加量は一次発酵濾液の総質量の１０‰であり；静置培養は８層のガーゼで密封して静置培養することである。
【0086】
実施例８：効果試験方法
ライチ酵素の実験処理方式：
１ｍｇのライチ酵素サンプルを秤量して１ｍＬのＰＢＳに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの母液を調製し、次に３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００倍のサンプル液に希釈し、それに対応する濃度は３２、１６、８、４、２、１ μｇ／ｍＬである。
ライチ酵素の実験処理方式：
１ｍｇのライチ酵素サンプルを秤量して１ｍＬのＰＢＳに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの母液を調製し、次に３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００倍のサンプル液に希釈し、それに対応する濃度は３２、１６、８、４、２、１ μｇ／ｍＬである。
【0087】
ヒト結腸癌細胞Ｃａｃｏ－２腸管バリア機能試験実験
細胞培養及び細胞単層バリアモデルの確立：
液体窒素に保存されたＣａｃｏ－２細胞を蘇生し、細胞壁接着融合率が８５％に達する場合、３７℃で細胞を約５ｍｉｎ消化した後に継代培養を行った。ここで、完全培地には、１％の１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０％のウシ胎児血清が含まれている。
細胞培養及び細胞単層バリアモデルの確立：
液体窒素に保存されたＣａｃｏ－２細胞を蘇生し、細胞壁接着融合率が８５％に達する場合、３７℃で細胞を約５ｍｉｎ消化した後に継代培養を行った。ここで、完全培地には、１％の１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０％のウシ胎児血清が含まれている。
【0088】
単層バリアモデルを確立する前に、予め冷却されたＰＢＳ溶液で移行カップＴｒａｎｓｗｅｌｌの上室を湿潤し、その後に細胞を１ｘ１０４個の細胞数／孔の密度でＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの上室に接種し、かつ無血清の培地を用いて細胞を２４ｈ飢餓し、その後に完全培地に交換した。細胞が連続的に１８～２１日成長した後にＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの上室に連続的で緻密な細胞単層を形成することができ、この時に後続の実験処理を行うことができる。
【0089】
実験全体は三つの群に分けられた：ブランク群、リポ多糖（ＬＰＳ）モデリング群、酵素処理群。実験は段階的にインキュベートしたモデルを選択し、ブランク群は、完全培地のみを添加し、いずれの実験処理を行わないことを代表し；モデリング群は、完全培地に最終濃度が５μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加し、細胞と共に２４ｈインキュベートした後にＰＢＳで洗浄した必要があることを代表し；酵素処理群は、ＬＰＳとＣａｃｏ－２細胞を共に２４ｈインキュベートした後にＰＢＳで洗浄し、この時に異なる濃度のライチ酵素液（実施例５）とＣａｃｏ－２細胞を共に６ｈインキュベートしたことを代表した。
【0090】
腸管細胞膜貫通抵抗値（ＴＥＥＲ）の検出
Ｃａｃｏ－２細胞を２４ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌセルに接種した。細胞を１８～２１日間連続的に培養した後、ＴＥＥＲ値が３００～１０００Ω・ｃｍ２に達すると、緻密な細胞単層が形成されたことを示す。その後、下室に最終濃度が５μｇ／ｍＬであるＬＰＳを添加して上層細胞と２４ｈ作用し、その後に細胞ＴＥＥＲ値を測定し、抵抗値が２０％を超えるとモデリングに成功したと考えられた。その後、さらにライチ酵素を添加して細胞と合計６ｈインキュベートし、再びＴＥＥＲ値を測定した。最後に、腸管細胞ＴＥＥＲの相対変化値を計算した。
Ｃａｃｏ－２細胞を２４ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌセルに接種した。細胞を１８～２１日間連続的に培養した後、ＴＥＥＲ値が３００～１０００Ω・ｃｍ２に達すると、緻密な細胞単層が形成されたことを示す。その後、下室に最終濃度が５μｇ／ｍＬであるＬＰＳを添加して上層細胞と２４ｈ作用し、その後に細胞ＴＥＥＲ値を測定し、抵抗値が２０％を超えるとモデリングに成功したと考えられた。その後、さらにライチ酵素を添加して細胞と合計６ｈインキュベートし、再びＴＥＥＲ値を測定した。最後に、腸管細胞ＴＥＥＲの相対変化値を計算した。
【0091】
Ｃａｃｏ－２上皮細胞単層のＴＥＥＲ値は、腸上皮のバリア機能を反映することができ、ＬＰＳモデリングを採用した後に腸管バリア機能が損傷され、ライチ酵素の介入は上皮細胞単層のＴＥＥＲ値を上昇させることができれば、それが損傷された腸バリアを回復する作用を有することを説明した。
【0092】
図１から分かるように、ライチ酵素は、濃度が０．１μｇ／ｍＬより大きい場合、腸管細胞の経上皮電気抵抗値を顕著に向上させる作用（ｐ＜０．０５）を有し、ライチ酵素が腸管バリア機能を修復することができることを説明した。
【0093】
マクロファージＲＡＷ２６４．７免疫活性試験実験
マクロファージＲＡＷ２６４．７の一酸化窒素（ＮＯ）分泌量の測定：
一酸化窒素（ＮＯ）は、マクロファージにより生成された主要な効果分子であり、マクロファージが活性化された後、生成されたＮＯが非特異的免疫の主要な細胞毒性効果を発揮する。ライチ酵素がＮＯの分泌に影響を与えることができれば、ライチ酵素が免疫を調節することができることを示す。本実験は、ライチ酵素のマクロファージのＮＯ分泌量に対する影響を測定した。
マクロファージＲＡＷ２６４．７の一酸化窒素（ＮＯ）分泌量の測定：
一酸化窒素（ＮＯ）は、マクロファージにより生成された主要な効果分子であり、マクロファージが活性化された後、生成されたＮＯが非特異的免疫の主要な細胞毒性効果を発揮する。ライチ酵素がＮＯの分泌に影響を与えることができれば、ライチ酵素が免疫を調節することができることを示す。本実験は、ライチ酵素のマクロファージのＮＯ分泌量に対する影響を測定した。
【0094】
対数増殖期細胞を、各ウェル５×１０５個の細胞に応じて２４ウェルプレートに添加し、各濃度のライチ酵素１、２、４、８、１６、３２μｇ／ｍＬを添加して２４ｈ刺激し、上清を吸引し、５０μＬ／ウェルに応じて、９６ウェルプレートに添加し、同時にブランク対照を設置し；各ウェルに５０μＬの室温Ｇｒｉｅｓｓ Ｉを添加し、軽く均一に混合し；各ウェルに５０μｌの室温Ｇｒｉｅｓｓ ＩＩを添加し軽く均一に混合し；マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍでの吸光度を測定した。
【0095】
図２から分かるように、異なる濃度のライチ酵素（実施例５）は、マクロファージがＮＯを分泌することを促進することができ、酵素サンプルがマクロファージを活性化し、免疫調節に関与することができることを示している。
【0096】
マクロファージＲＡＷ２６４．７の炎症モデル実験
マクロファージＲＡＷ２６４．７を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン、ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地で培養し、二酸化炭素培養器の条件は３７℃、５％ＣＯ２であった。細胞が培養皿の８０％まで成長する時に継代を行い、継代時にピペットで吸引された培地で繰り返して吸引して細胞を脱壁させかつ単細胞懸濁液を形成し、２００ｇで３分間遠心分離し、上清を捨て、新鮮な培地を添加して均一に吹き付けた後に培養皿に接種した。マクロファージＲＡＷ２６４．７を各ウェル５ｘ１０５の密度で六ウェルプレートに接種し、各処理に３つのウェルを設けた。壁を貼り付けかつ孔面積の７０％まで成長する時に処理を開始し、異なる濃度（０．０１、０．１、１、２、４、８、１６ μｇ／ｍＬ）のライチ酵素（実施例５）及びＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ）を含有する特製ＤＭＥＭ培地で細胞を２４ｈ処理した。終了した後、培地上清液を収集し、各サンプルに５０μＬを取って９６ウェルプレートに添加して検出し、各ウェルに５０μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬Ｉを添加し、さらに５０μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬IIを添加し、発色反応が発生した後、５４０ｎｍで吸光度値を検出した。
マクロファージＲＡＷ２６４．７を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン、ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地で培養し、二酸化炭素培養器の条件は３７℃、５％ＣＯ２であった。細胞が培養皿の８０％まで成長する時に継代を行い、継代時にピペットで吸引された培地で繰り返して吸引して細胞を脱壁させかつ単細胞懸濁液を形成し、２００ｇで３分間遠心分離し、上清を捨て、新鮮な培地を添加して均一に吹き付けた後に培養皿に接種した。マクロファージＲＡＷ２６４．７を各ウェル５ｘ１０５の密度で六ウェルプレートに接種し、各処理に３つのウェルを設けた。壁を貼り付けかつ孔面積の７０％まで成長する時に処理を開始し、異なる濃度（０．０１、０．１、１、２、４、８、１６ μｇ／ｍＬ）のライチ酵素（実施例５）及びＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ）を含有する特製ＤＭＥＭ培地で細胞を２４ｈ処理した。終了した後、培地上清液を収集し、各サンプルに５０μＬを取って９６ウェルプレートに添加して検出し、各ウェルに５０μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬Ｉを添加し、さらに５０μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬IIを添加し、発色反応が発生した後、５４０ｎｍで吸光度値を検出した。
【0097】
評価基準：
マクロファージがＬＰＳ等の刺激を受けると、誘導型一酸化窒素合成酵素が顕著に増加し、それにより大量のＮＯを生成して免疫応答を行う。ＮＯは、一定の細胞毒性を有し、さらに生体に損傷を与え、それにより炎症部位の滲出及び水腫を促進する。ＮＯの生成を抑制する程度は、抗炎症活性を検出する直接的な指標である。ライチ酵素サンプルを添加することでＮＯの生成を抑制することができれば、ライチ酵素が良好な抗炎症活性を有することを説明する。
マクロファージがＬＰＳ等の刺激を受けると、誘導型一酸化窒素合成酵素が顕著に増加し、それにより大量のＮＯを生成して免疫応答を行う。ＮＯは、一定の細胞毒性を有し、さらに生体に損傷を与え、それにより炎症部位の滲出及び水腫を促進する。ＮＯの生成を抑制する程度は、抗炎症活性を検出する直接的な指標である。ライチ酵素サンプルを添加することでＮＯの生成を抑制することができれば、ライチ酵素が良好な抗炎症活性を有することを説明する。
【0098】
図３から分かるように、異なる濃度のライチ酵素は、ＬＰＳで誘導された炎症細胞のＮＯ放出を抑制することができ、ライチ酵素が抗炎症活性を有することを示している。抗炎症活性を有する濃度範囲は０．１－８μｇ／ｍＬであった。図２と図３の実験結果により、ライチ酵素の免疫への調節は、双方向性を有し、腸管定常状態の維持に役立つことが明らかになった。
【0099】
実施例１－７のライチ酵素の効果比較
実施例１－７のライチ酵素を利用し、サンプル濃度が４μｇ／ｍＬで上記のヒト結腸癌細胞Ｃａｃｏ－２腸管バリア機能試験実験、マクロファージＲＡＷ２６４．７免疫活性試験実験及びマクロファージＲＡＷ２６４．７の炎症モデル実験を行い、かつ各ライチ酵素の効果を比較した。表１に、ライチ酵素の効果を示した。
実施例１－７のライチ酵素を利用し、サンプル濃度が４μｇ／ｍＬで上記のヒト結腸癌細胞Ｃａｃｏ－２腸管バリア機能試験実験、マクロファージＲＡＷ２６４．７免疫活性試験実験及びマクロファージＲＡＷ２６４．７の炎症モデル実験を行い、かつ各ライチ酵素の効果を比較した。表１に、ライチ酵素の効果を示した。
【0100】
表１：異なる実施例の効果
注：経上皮電気抵抗値回復率＝酵素介入群経上皮電気抵抗値／初期経上皮電気抵抗値＊１００％
抗炎症効率＝（モデル群ＮＯ放出量－サンプル群ＮＯ放出量）／モデル群ＮＯ放出量＊１００％
抗炎症効率＝（モデル群ＮＯ放出量－サンプル群ＮＯ放出量）／モデル群ＮＯ放出量＊１００％
【0101】
表１から分かるように、実施例７で得られたライチ酵素の効果が最も低い。実施例１－５ではいずれも第一炭素源を添加しかつ通気培養の方式を採用したが、実施例６では第一炭素源を添加せずかつ二次発酵過程において通気量が０．１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬであり、実施例７では第一炭素源を添加しかつ二次発酵過程において静置培養の方式を採用し、その結果、第一炭素源の添加及び二次発酵過程の通気培養が発酵過程に対して有利な変化を生成し、さらにライチ酵素の腸管健康に対する有益な効果を強化したことを示した。実施例５で得られたライチ酵素を用いて経上皮電気抵抗値回復率、免疫活性試験における一酸化窒素（ＮＯ）放出量、炎症モデルにおける一酸化窒素（ＮＯ）放出量及び抗炎症効率に最適な効果を得た。発明者らは、長期の研究において菌株及び培養パラメータを調整することにより、実施例５以外の他の培養菌株又は条件（例えば実施例１－４及び６）がこのような高い抗炎症効率を実現することができない；かつ実施例５における単一の菌を使用して行われた実験により得られた効果の和が本発明の実施例５の菌を組み合わせて得られた効果よりはるかに低いことを発見した。
【0102】
上記実施例は本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の実施形態は上記実施例に限定されず、本発明の精神的実質と原理から逸脱せずに行われた他の任意の変更、修飾、代替、組み合わせ、簡略化は、いずれも等価の置換方式であり、いずれも本発明の保護範囲内に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
