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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023174611
(43)【公開日】2023-12-07
(54)【発明の名称】農業用組成物、苗木製品及び植物の栽培方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20231130BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20231130BHJP
A01N 63/20 20200101ALI20231130BHJP
A01G 7/00 20060101ALI20231130BHJP
A01G 7/06 20060101ALI20231130BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231130BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 E ZNA
A01P3/00
A01N63/20
A01G7/00 605Z
A01G7/06 Z
C12N15/31
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023087139
(22)【出願日】2023-05-26
(31)【優先権主張番号】P 2022086296
(32)【優先日】2022-05-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】720001060
【氏名又は名称】ヤンマーホールディングス株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504143441
【氏名又は名称】国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学
(74)【代理人】
【識別番号】100168583
【弁理士】
【氏名又は名称】前井 宏之
(72)【発明者】
【氏名】田中 江梨子
(72)【発明者】
【氏名】藤原 正幸
(72)【発明者】
【氏名】槙嶋 理華子
(72)【発明者】
【氏名】梅木 大輔
(72)【発明者】
【氏名】西條 雄介
【テーマコード（参考）】
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065BA22
4B065CA47
4H011AA01
4H011BB21
(57)【要約】
【課題】病害抑制効果に優れる農業用組成物と、上述の農業用組成物を用いた苗木と、上述の農業用組成物を用いた植物の栽培方法とを提供する。
【解決手段】農業用組成物は、ロイコバクター属微生物を含有する。苗木製品は、養土と、前記養土によって栽培される苗木とを備える。前記苗木及び前記養土のうち少なくとも１つは、上述の農業用組成物によって処理されている。植物の栽培方法は、植物の栽培方法であって、上述の農業用組成物によって前記植物を処理する工程を備える。
【選択図】図１
【解決手段】農業用組成物は、ロイコバクター属微生物を含有する。苗木製品は、養土と、前記養土によって栽培される苗木とを備える。前記苗木及び前記養土のうち少なくとも１つは、上述の農業用組成物によって処理されている。植物の栽培方法は、植物の栽培方法であって、上述の農業用組成物によって前記植物を処理する工程を備える。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ロイコバクター属微生物を含有する、農業用組成物。
【請求項2】
前記ロイコバクター属微生物は、配列番号１で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含む、請求項１に記載の農業用組成物。
【請求項3】
前記ロイコバクター属微生物は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６３４で寄託された株である、請求項２に記載の農業用組成物。
【請求項4】
アルカリゲネス属微生物を更に含有する、請求項１又は２に記載の農業用組成物。
【請求項5】
前記アルカリゲネス属微生物は、配列番号２で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項４に記載の農業用組成物。
【請求項6】
前記ロイコバクター属微生物の含有量Ｌに対して、前記アルカリゲネス属微生物の含有量Ａの比率（Ａ／Ｌ）は、０．０００１以上１００．０以下である、請求項４に記載の農業用組成物。
【請求項7】
前記比率（Ａ／Ｌ）は、０．５以上１５．０以下である、請求項６に記載の農業用組成物。
【請求項8】
ステノトロホモナス属微生物を更に含有する、請求項１又は２に記載の農業用組成物。
【請求項9】
前記ステノトロホモナス属微生物は、配列番号３で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項８に記載の農業用組成物。
【請求項10】
前記ロイコバクター属微生物の含有量Ｌに対して、前記ステノトロホモナス属微生物の含有量Ｓの比率（Ｓ／Ｌ）は、０．０００１以上１００．０以下である、請求項８に記載の農業用組成物。
【請求項11】
前記比率（Ｓ／Ｌ）は、０．５以上１５．０以下である、請求項１０に記載の農業用組成物。
【請求項12】
青枯病防除に用いられる、請求項１又は２に記載の農業用組成物。
【請求項13】
養土と、前記養土によって栽培される苗木とを備える苗木製品であって、
前記苗木及び前記養土のうち少なくとも１つが請求項１又は２に記載の農業用組成物によって処理されている、苗木製品。
前記苗木及び前記養土のうち少なくとも１つが請求項１又は２に記載の農業用組成物によって処理されている、苗木製品。
【請求項14】
植物の栽培方法であって、
請求項１又は２に記載の農業用組成物によって前記植物を処理する工程を備える、植物の栽培方法。
請求項１又は２に記載の農業用組成物によって前記植物を処理する工程を備える、植物の栽培方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、農業用組成物、苗木製品及び植物の栽培方法に関する。
【背景技術】
【0002】
青枯病は、農業上深刻な被害をもたらす病害の一つであり、ナス科植物を代表とする２００種以上の植物に感染して枯死させる。青枯病は、土壌細菌である青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）が植物の根、茎等から感染し、主に導管内で青枯病菌が増殖することで発病する。現在のところ、青枯病を発病した植物に対して有効な化学農薬は存在しない。また、青枯病菌は、土壌中で長期に渡って生存し続けることができる。そのため、青枯病が農地で一度発生してしまうと、その農地において青枯病を根絶することは困難である。現在、青枯病への対策としては、植物の栽培前に化学薬品（例えば、クロルピクリン）によって土壌消毒を行うことが多い。
【0003】
一方、最近では、農業における持続可能性が重視されている。このような流れの中で、上述の化学薬品による土壌消毒は、持続可能性の観点から改善の余地がある。そのため、農業では、青枯病を始めとする様々な病害に対して、持続可能性の高い防除手段が模索されている。このような防除手段として、例えば、植物と共生している天然微生物を用いた生物的防除が検討されている。青枯病に有効な生物的防除として、例えば、フェノール耐性を有する抗菌性物質非産生蛍光性細菌を使用する青枯病防除方法が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開平０８－２６８８２６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかし、上述の防除方法によっても、青枯病を始めとする各種病害に対する防除効果は十分ではない。
【0006】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、病害抑制効果に優れる農業用組成物と、上述の農業用組成物を用いた苗木製品と、上述の農業用組成物を用いた植物の栽培方法とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の一局面によれば、農業用組成物は、ロイコバクター属微生物を含有する。
【0008】
本発明の他の局面によれば、苗木製品は、養土と、前記養土によって栽培される苗木とを備える。前記苗木及び前記養土のうち少なくとも１つは、上述の農業用組成物によって処理されている。
【0009】
本発明の他の局面によれば、植物の栽培方法は、植物の栽培方法であって、上述の農業用組成物によって前記植物を処理する工程を備える。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、病害抑制効果に優れる農業用組成物と、病害に対する耐性に優れる苗木製品と、病害の発生を抑制できる植物の栽培方法とを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ロイコバクター属微生物（Ｈ８７－６）のゲノム配列に基づいて作成した分子系統樹を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
＜第１実施形態：農業用組成物＞
本発明の第１実施形態は、農業用組成物に係る。農業用組成物は、ロイコバクター属微生物を含有する。
本発明の第１実施形態は、農業用組成物に係る。農業用組成物は、ロイコバクター属微生物を含有する。
【0013】
農業用組成物は、上述の構成を備えることにより、病害抑制効果に優れる。農業用組成物は、青枯病防除に用いる農業用組成物として特に好適である。以下、発明者が農業用組成物を完成させるに至った経緯を簡単に説明する。
【0014】
従来から天然微生物を用いた生物的防除の可能性が検討され、各種天然微生物が土壌等からスクリーニングされている。しかし、従来の天然微生物を用いた生物的防除は、試験管レベル（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では優れた病害抑制効果を示すが、実際の圃場においては安定して効果を発揮することは困難である。これは、従来の生物的防除に用いられる天然微生物は、圃場に生息する土着の微生物との生存競争に負けてしまうためと推察される。
【0015】
発明者は、自然界に存在する微生物の多くが他の微生物と共生関係を構築しているという事実に着目した。そして、生物的防除に有効な天然微生物のスクリーニングに新しいアプローチで取り組んだ。
【0016】
具体的には、無農薬栽培又は減農薬栽培されている健康なトマトの根部から、トマトと共生している微生物を抽出した。そして、抽出された微生物の中から、青枯病に対する病害抑制効果を有する微生物をスクリーニングした。このようなスクリーニングでは、まず寒天培地上に微生物のコロニーを形成させる。コロニーの多くは、単一種の微生物により形成されるコロニーである。従来のスクリーニングでは、単一種の微生物により形成されるコロニーから抽出した単一種の微生物をスクリーニングする。一方、寒天培地上に形成されたコロニーの中には、共生関係にある複数種の微生物により形成される共生コロニーも存在する。発明者は、共生コロニーから抽出された複数種の微生物を含む微生物群をスクリーニングした。このスクリーニングでは、単独では生育速度又は病害抑制効果が不十分であるが、他の微生物との共生関係によって優れた病害抑制効果を発揮する微生物を漏らさずスクリーニングできると考えられる。
【0017】
発明者は、上述のスクリーニング及び更なる分析の結果、優れた病害抑制効果を有する微生物群（以下、便宜上「微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）」と記載する）を見出した。微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）は、２０１８年に滋賀県の圃場で栽培されたトマト（品種：千果）の根部を由来とする微生物群である。微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）には、２種のロイコバクター（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ）属微生物、１種類のアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属微生物及び３種類のステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属微生物から成る。これらの微生物は、単独でも優れた病害抑制効果を発揮するが、２種以上を組み合わせて使用することで更に優れた病害抑制効果を発揮する。以上の知見に基づいて、発明者は、農業用組成物を完成させた。
【0018】
微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）に含まれる６種の微生物のうち、１種のロイコバクター属微生物（以下、便宜上微生物（Ｈ８７－６）と記載する）は、２０２２年４月２２日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６３４（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３４）で寄託されている。
【0019】
微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）に含まれる６種の微生物の属、寄託状況及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を下記表１に示す。
【0020】
【表1】
【0021】
微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）が病害抑制効果を示す理由は不明であるが、例えば、微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）が抗生物質を生産する可能性、及び微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）が植物の免疫を活性化させる可能性が考えられる。発明者は、青枯病菌が一面に塗布された寒天培地上に微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）を少量滴下すると、滴下した微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）の周囲の青枯病菌の育成が阻害されることを確認している。この結果から、微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）は、抗生物質を生産する可能性がある。
【0022】
農業用組成物の態様は、有効成分としてロイコバクター属微生物と、必要に応じて含まれるアルカリゲネス属微生物又はステノトロホモナス属微生物とを含有する限り特に限定されない。農業用組成物に含有される上述の微生物は、乾燥状態又は凍結状態でもよい。また、農業用組成物は、上述の微生物のみを含有してもよいが、担体（例えば、水、緩衝液、培地、グリセロール溶液及び多孔質体）、各種添加剤（例えば、ｐＨ調整剤、保湿剤、防腐剤、賦形剤、乳化剤及び防カビ剤）、及び他の植物に有用な成分（例えば、殺虫成分、除草成分、成長促進成分、肥料成分及び抗生物質）を更に含有してもよい。更に、農業用組成物は、例えば、上述の微生物を染み込ませた養土であってもよい。
【0023】
（ロイコバクター属微生物）
ロイコバクター属微生物としては、例えば、下記表２に示す種が挙げられる。下記表２において、「ＮＢＲＣ」と記載されている４種は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）が分譲を行っている。また、この４種以外の他のロイコバクター属微生物についても、市販品の購入、研究機関からの分譲、又は土壌等の自然界からのスクリーニングによって入手できる。
ロイコバクター属微生物としては、例えば、下記表２に示す種が挙げられる。下記表２において、「ＮＢＲＣ」と記載されている４種は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）が分譲を行っている。また、この４種以外の他のロイコバクター属微生物についても、市販品の購入、研究機関からの分譲、又は土壌等の自然界からのスクリーニングによって入手できる。
【0024】
【表2】
【0025】
ロイコバクター属微生物は、配列番号１で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含むことが好ましい。配列番号１で表される塩基配列は、微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）に含まれるロイコバクター属微生物（微生物（Ｈ８７－６）及び（Ｈ８７－２５））の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。ここで、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、微生物の同定において一般的に用いられる配列である。特定の２種の微生物において、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性が９０．０％以上である場合、２種の微生物は近縁種であるとされる。また、特定の２種の微生物において、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性が９８．０％以上である場合、２種の微生物は同種である可能性が高いとされる。配列番号１で表される塩基配列と相同性が９０．０％以上の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含むロイコバクター属微生物は、微生物（Ｈ８７－６）及び（Ｈ８７－２５－１）の同種又は近縁種であるため、特に優れた病害抑制効果を発揮すると判断される。同様に、ロイコバクター属微生物の含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列と９８．０％以上の相同性を有することがより好ましく、１００．０％の相同性を有することが更に好ましい。
【0026】
なお、本明細書において、遺伝子の相同性とは、「ＢＬＡＳＴ （Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）アルゴリズム」により求められる相同性をいう。ＢＬＡＳＴを使用する際の詳細な条件は、実施例に記載の条件と同様とすることができる。
【0027】
実施例で説明する通り、ロイコバクター属微生物（Ｈ８７－６）のゲノム配列（配列番号５）は、近縁な種（Ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（ＡＮＩ）≧９５％）がデータベース上に存在せず、新種の可能性がある。ロイコバクター属微生物としては、配列番号５で表されるゲノム配列とのＡＮＩが９５％以上である微生物が好ましく、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６３４で寄託されているロイコバクター属微生物（Ｈ８７－６）が最も好ましい。
【0028】
なお、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６３４で寄託されているロイコバクター属微生物（Ｈ８７－６）と最も近縁な種は、Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍａｇａｔａｅであった。そのため、ロイコバクター属微生物としては、Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍａｇａｔａｅも比較的好ましい。
【0029】
ロイコバクター属微生物は、例えば、Ｒ２Ａ培地、ＮＹＢＧ培地、ＴＢＳ培地又は２×ＹＴ培地を用いて２５℃で２日～４週間程度培養することにより増殖させることができる。
【0030】
（アルカリゲネス属微生物）
農業用組成物は、アルカリゲネス属微生物を更に含むことが好ましい。アルカリゲネス属微生物は、単独でも一定の病害抑制効果を発揮するが、ロイコバクター属微生物と組み合わせることで更に優れた病害抑制効果を発揮する。このように、農業用組成物が共生関係にある２種以上の微生物を含有することにより、圃場に生息する土着の微生物との生存競争において有利に働くと判断される。
農業用組成物は、アルカリゲネス属微生物を更に含むことが好ましい。アルカリゲネス属微生物は、単独でも一定の病害抑制効果を発揮するが、ロイコバクター属微生物と組み合わせることで更に優れた病害抑制効果を発揮する。このように、農業用組成物が共生関係にある２種以上の微生物を含有することにより、圃場に生息する土着の微生物との生存競争において有利に働くと判断される。
【0031】
ロイコバクター属微生物の含有量Ｌに対して、アルカリゲネス属微生物の含有量Ａの比率（Ａ／Ｌ）は、０．０００１以上１００．０以下が好ましく、０．５以上１５．０以下が更に好ましく、０．５以上２．０以下又は８．０以上１２．０以下が特に好ましい。比率（Ａ／Ｌ）を０．０００１以上１００．０以下とすることで、農業用組成物は、更に優れた病害抑制効果を発揮する。なお、本明細書において、微生物の含有量は、濁度（ＯＤ600）によって定量されるものとする。
【0032】
アルカリゲネス属微生物としては、例えば、下記表３に示す種が挙げられる。下記表３において、「ＮＢＲＣ」と記載されている１２種は、上述のＮＢＲＣが分譲を行っている。また、この１２種以外の他のアルカリゲネス属微生物についても、市販品の購入、研究機関からの分譲、又は土壌等の自然界からのスクリーニングによって入手できる。
【0033】
【表3】
【0034】
アルカリゲネス属微生物は、配列番号２で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含むことが好ましい。配列番号２で表される塩基配列は、微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）に含まれるアルカリゲネス属微生物（微生物（Ｈ８７－３３））の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。配列番号２で表される塩基配列と相同性が９０．０％以上の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含むアルカリゲネス属微生物は、微生物（Ｈ８７－３３）の同種又は近縁種であるため、特に優れた病害抑制効果を発揮すると判断される。同様に、アルカリゲネス属微生物の含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列と９８．０％以上の相同性を有することがより好ましく、１００．０％の相同性を有することが更に好ましい。
【0035】
実施例に示すように、微生物（Ｈ８７－３３）は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓと同種である可能性が高い。そのため、アルカリゲネス属微生物としては、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓが好ましい。
【0036】
アルカリゲネス属微生物は、例えば、Ｒ２Ａ培地、ＮＹＢＧ培地、ＴＢＳ培地又は２×ＹＴ培地を用いて２５℃で２日～４週間程度培養することにより増殖させることができる。
【0037】
（ステノトロホモナス属微生物）
農業用組成物は、ステノトロホモナス属微生物を更に含むことが好ましい。ステノトロホモナス属微生物は、単独でも一定の病害抑制効果を発揮するが、ロイコバクター属微生物と組み合わせることで更に優れた病害抑制効果を発揮する。
農業用組成物は、ステノトロホモナス属微生物を更に含むことが好ましい。ステノトロホモナス属微生物は、単独でも一定の病害抑制効果を発揮するが、ロイコバクター属微生物と組み合わせることで更に優れた病害抑制効果を発揮する。
【0038】
ロイコバクター属微生物の含有量Ｌに対して、ステノトロホモナス属微生物の含有量Ｓの比率（Ｓ／Ｌ）は、０．０００１以上１００．０以下が好ましく、０．０００１以上１００．０以下が好ましく、０．５以上１５．０以下が更に好ましく、０．５以上２．０以下又は８．０以上１２．０以下が特に好ましい。比率（Ｓ／Ｌ）を０．０００１以上１００．０以下とすることで、農業用組成物は、更に優れた病害抑制効果を発揮する。
【0039】
ステノトロホモナス属微生物としては、例えば、下記表４に示す種が挙げられる。下記表４において、「ＮＢＲＣ」と記載されている２種は、上述のＮＢＲＣが分譲を行っている。また、この２種以外の他のステノトロホモナス属微生物についても、市販品の購入、研究機関からの分譲、又は土壌等の自然界からのスクリーニングによって入手できる。
【0040】
【表4】
【0041】
ステノトロホモナス属微生物は、配列番号３で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含むことが好ましい。配列番号３で表される塩基配列は、微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）に含まれるアルカリゲネス属微生物（微生物（Ｈ８７－４０）、（Ｈ８７－５４）及び（Ｈ８７－６７））の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。配列番号３で表される塩基配列と相同性が９０．０％以上の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含むステノトロホモナス属微生物は、微生物（Ｈ８７－４０）、（Ｈ８７－５４）及び（Ｈ８７－６７）の同種又は近縁種であるため、特に優れた病害抑制効果を発揮すると判断される。同様に、ステノトロホモナス属微生物の含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列と９８．０％以上の相同性を有することがより好ましく、１００．０％の相同性を有することが更に好ましい。
【0042】
実施例に示すように、微生物（Ｈ８７－４０）、（Ｈ８７－５４）及び（Ｈ８７－６７）は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａと同種である可能性が高い。そのため、ステノトロホモナス属微生物としては、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａが好ましい。
【0043】
ステノトロホモナス属微生物は、例えば、Ｒ２Ａ培地、ＮＹＢＧ培地、ＴＢＳ培地又は２×ＹＴ培地を用いて２５℃で２日～４週間程度培養することにより増殖させることができる。
【0044】
（特に好ましい組成）
農業用組成物は、ロイコバクター属微生物と、アルカリゲネス属微生物と、ステノトロホモナス属微生物とを含有することが好ましい。この場合、ロイコバクター属微生物の含有量Ｌと、アルカリゲネス属微生物の含有量Ａと、ステノトロホモナス属微生物の含有量Ｓとの比（Ｌ：Ａ：Ｓ）は、「１．０：５．０～１５．０：０．２～５．０」又は「１．０：０．２～５．０：５．０～１５．０」が好ましく、「１．０：８．０～１２．０：０．５～２．０」又は「１．０：０．５～２．０：８．０～１２．０」がより好ましい。
農業用組成物は、ロイコバクター属微生物と、アルカリゲネス属微生物と、ステノトロホモナス属微生物とを含有することが好ましい。この場合、ロイコバクター属微生物の含有量Ｌと、アルカリゲネス属微生物の含有量Ａと、ステノトロホモナス属微生物の含有量Ｓとの比（Ｌ：Ａ：Ｓ）は、「１．０：５．０～１５．０：０．２～５．０」又は「１．０：０．２～５．０：５．０～１５．０」が好ましく、「１．０：８．０～１２．０：０．５～２．０」又は「１．０：０．５～２．０：８．０～１２．０」がより好ましい。
【0045】
＜第２実施形態：苗木製品＞
本発明の第２実施形態は、苗木製品に係る。苗木製品は、養土と、養土によって栽培される苗木とを備える。苗木製品は、苗木及び養土のうち少なくとも１つが上述の農業用組成物によって処理されている。
本発明の第２実施形態は、苗木製品に係る。苗木製品は、養土と、養土によって栽培される苗木とを備える。苗木製品は、苗木及び養土のうち少なくとも１つが上述の農業用組成物によって処理されている。
【0046】
苗木製品は、苗木及び養土のうち少なくとも１つが上述の農業用組成物によって処理されていることにより、苗木の表面、苗木の内部、及び養土のうち少なくとも一部（以下、処理部と記載することがある）において、農業用組成物に由来するロイコバクター属微生物が大量に含まれる。例えば、苗木製品は、上述の農業用組成物によって処理されていない市販の同種の苗木製品と比較して、処理部において２倍以上の量（好ましくは５倍以上の量）のロイコバクター属微生物が含まれる。
【0047】
苗木製品において、苗木となる植物としては、例えば、ナス科植物、イネ科植物、ウリ科植物、キク科植物、アブラナ科植物及びセリ科植物が挙げられる。ナス科植物としては、例えば、ナス属植物（例えば、ナス、トマト及びジャガイモ）、トウガラシ属植物及びタバコ属植物が挙げられる。苗木となる植物としては、ナス科植物が好ましく、トマトがより好ましい。
【0048】
＜第３実施形態：植物の栽培方法＞
本発明の第３実施形態は、植物の栽培方法に係る。植物の栽培方法は、上述の農業用組成物によって植物を処理する工程を備える。
本発明の第３実施形態は、植物の栽培方法に係る。植物の栽培方法は、上述の農業用組成物によって植物を処理する工程を備える。
【0049】
植物の栽培方法において栽培される植物としては、上述の苗木となる植物として挙げたものと同様の植物を挙げることができる。
【0050】
農業用組成物によって植物を処理する方法としては、例えば、液体状の農業用組成物に植物の種子を浸漬させる方法、植物の表面に液体状の農業用組成物を塗布する方法、植物を栽培する土壌に予め農業用組成物を投与する方法、及び植物が栽培されている圃場に農業用組成物を散布する方法が挙げられる。また、接ぎ木で植物を栽培する場合、農業用組成物によって処理された台木用植物を、栽培する植物（穂木）の台木として使用する方法も挙げられる。
【0051】
ここで、植物の栽培方法では、病害抑制効果を高める観点から、植物のライフサイクルのなるべく早い段階で植物を農業用組成物で処理することが好ましいと判断される。そのため、農業用組成物によって植物を処理する方法としては、液体状の農業用組成物に植物の種子を浸漬させる方法が好ましい。浸漬時間としては、例えば、３０分以上４時間以下とすることができる。
【実施例0052】
本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【0053】
［濁度の測定］
実施例において、濁度（ＯＤ600）の測定は、吸光光度計（ＷＰＡ社製「ＣＯ７５００」）を使用して行った。
実施例において、濁度（ＯＤ600）の測定は、吸光光度計（ＷＰＡ社製「ＣＯ７５００」）を使用して行った。
【0054】
［培地］
実施例において使用した培地の調製方法を記載する。各培地の組成を下記表５に示す。なお、各培地の原料の詳細を以下に示す。
粉末Ｒ２Ａ培地：Ｒ２Ａ培地「ダイゴ」（日本製薬株式会社製）
ペプトン：バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
粉末ＰＤＡ寒天培地：Ｐｏｔａｔｏ Ｄｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
粉末ＴＳＢ培地：ＴＲＹＰＴＯＮＥ ＳＯＹＡ ＢＲＯＴＨ（ＯＸＯＩＤ社製）
酵母エキス：Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
実施例において使用した培地の調製方法を記載する。各培地の組成を下記表５に示す。なお、各培地の原料の詳細を以下に示す。
粉末Ｒ２Ａ培地：Ｒ２Ａ培地「ダイゴ」（日本製薬株式会社製）
ペプトン：バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
粉末ＰＤＡ寒天培地：Ｐｏｔａｔｏ Ｄｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
粉末ＴＳＢ培地：ＴＲＹＰＴＯＮＥ ＳＯＹＡ ＢＲＯＴＨ（ＯＸＯＩＤ社製）
酵母エキス：Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
【0055】
（Ｒ２Ａ培地）
水９００ｍＬに、下記表５に示す成分（粉末Ｒ２Ａ培地３．２ｇ）を添加し、攪拌した。次に、混合液に水を添加し、混合液の全量を１０００ｍＬにメスアップした。次に、混合液を１２１℃で１５分間オートクレーブした。これにより、Ｒ２Ａ培地を得た。
水９００ｍＬに、下記表５に示す成分（粉末Ｒ２Ａ培地３．２ｇ）を添加し、攪拌した。次に、混合液に水を添加し、混合液の全量を１０００ｍＬにメスアップした。次に、混合液を１２１℃で１５分間オートクレーブした。これにより、Ｒ２Ａ培地を得た。
【0056】
（Ｒ２Ａ寒天培地、ＰＤＡ寒天培地、ＴＳＢ培地、ＴＳＢ寒天培地、素寒天培地、２×ＹＴ培地及び２×ＹＴ寒天培地）
水に添加する成分を下記表５及び表６に示す通りに変更した以外は、Ｒ２Ａ培地の調製と同様の方法により、Ｒ２Ａ寒天培地、ＰＤＡ寒天培地（ポテトデキストロース寒天培地）、ＴＳＢ培地、ＴＳＢ寒天培地、素寒天培地、２×ＹＴ培地及び２×ＹＴ寒天培地を調製した。
水に添加する成分を下記表５及び表６に示す通りに変更した以外は、Ｒ２Ａ培地の調製と同様の方法により、Ｒ２Ａ寒天培地、ＰＤＡ寒天培地（ポテトデキストロース寒天培地）、ＴＳＢ培地、ＴＳＢ寒天培地、素寒天培地、２×ＹＴ培地及び２×ＹＴ寒天培地を調製した。
【0057】
（ＮＹＧＢ培地）
水９００ｍＬに、下記表５に示す成分（ペプトン５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、グリセロール２０ｍＬ）を添加し、攪拌した。得られた混合液にＮａＯＨ水溶液及び塩酸を滴下し、混合液のｐＨを７．０に調整した。次に、混合液に水を添加し、混合液の全量を１０００ｍＬにメスアップした。次に、混合液を１２１℃で１５分間オートクレーブした。これにより、ＮＹＧＢ培地を得た。
水９００ｍＬに、下記表５に示す成分（ペプトン５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、グリセロール２０ｍＬ）を添加し、攪拌した。得られた混合液にＮａＯＨ水溶液及び塩酸を滴下し、混合液のｐＨを７．０に調整した。次に、混合液に水を添加し、混合液の全量を１０００ｍＬにメスアップした。次に、混合液を１２１℃で１５分間オートクレーブした。これにより、ＮＹＧＢ培地を得た。
【0058】
（ＮＹＧＢ寒天培地、ＣＰＧ培地及びＣＰＧ寒天培地）
水に添加する成分を下記表５及び表６に示す通りに変更した以外は、ＮＹＧＢ培地の調製と同様の方法により、ＮＹＧＢ寒天培地、ＣＰＧ培地及びＣＰＧ寒天培地を調製した。
水に添加する成分を下記表５及び表６に示す通りに変更した以外は、ＮＹＧＢ培地の調製と同様の方法により、ＮＹＧＢ寒天培地、ＣＰＧ培地及びＣＰＧ寒天培地を調製した。
【0059】
（ＴＴＣ寒天培地）
水９００ｍＬに、下記表６に示す成分（ペプトン１０．０ｇ、カザミノ酸１．０ｇ、ブドウ糖５．０ｇ及び寒天１８．０ｇ）を添加し、攪拌した。得られた混合液にＮａＯＨ水溶液及び塩酸を滴下し、混合液のｐＨを７．０に調整した。次に、混合液に水を添加し、混合液の全量を１０００ｍＬにメスアップした。次に、混合液を１２１℃で１５分間オートクレーブした。次に、混合液の液温が５０℃～６０℃になるまで混合液を放冷させた。次に、孔径０．２μｍのフィルターでろ過滅菌した１．０質量％テトラゾリウムクロライド（２，３，５－Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を混合液に添加した。１．０質量％テトラゾリウムクロライド溶液の添加量は、混合液におけるテトラゾリウムクロライドの含有割合が５０ｍｇ／Ｌとなる量とした。これにより、ＴＴＣ寒天培地を得た。
水９００ｍＬに、下記表６に示す成分（ペプトン１０．０ｇ、カザミノ酸１．０ｇ、ブドウ糖５．０ｇ及び寒天１８．０ｇ）を添加し、攪拌した。得られた混合液にＮａＯＨ水溶液及び塩酸を滴下し、混合液のｐＨを７．０に調整した。次に、混合液に水を添加し、混合液の全量を１０００ｍＬにメスアップした。次に、混合液を１２１℃で１５分間オートクレーブした。次に、混合液の液温が５０℃～６０℃になるまで混合液を放冷させた。次に、孔径０．２μｍのフィルターでろ過滅菌した１．０質量％テトラゾリウムクロライド（２，３，５－Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を混合液に添加した。１．０質量％テトラゾリウムクロライド溶液の添加量は、混合液におけるテトラゾリウムクロライドの含有割合が５０ｍｇ／Ｌとなる量とした。これにより、ＴＴＣ寒天培地を得た。
【0060】
【表5】
【0061】
【表6】
【0062】
＜スクリーニング＞
以下の方法により、農業用組成物に用いる微生物のスクリーニングを行った。まず、自然界から２０００種の微生物サンプルを分離した。
以下の方法により、農業用組成物に用いる微生物のスクリーニングを行った。まず、自然界から２０００種の微生物サンプルを分離した。
【0063】
［微生物分離源］
無農薬又は減農薬の圃場（滋賀県）で栽培されているトマト（品種：千果）の根部を採取した。得られた根部に付着した土を水道水で洗い流した。その後、根部を石鹸水で１０分間洗浄した。その後、根部を水道水で１０分間洗浄した。その後、根部を１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１分間浸漬した。その後、根部を７０質量％エタノール水溶液に２分間浸漬した。その後、根部を滅菌水で洗浄した。このようにして洗浄及び表面殺菌した根部を、微生物分離源とした。
無農薬又は減農薬の圃場（滋賀県）で栽培されているトマト（品種：千果）の根部を採取した。得られた根部に付着した土を水道水で洗い流した。その後、根部を石鹸水で１０分間洗浄した。その後、根部を水道水で１０分間洗浄した。その後、根部を１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１分間浸漬した。その後、根部を７０質量％エタノール水溶液に２分間浸漬した。その後、根部を滅菌水で洗浄した。このようにして洗浄及び表面殺菌した根部を、微生物分離源とした。
【0064】
［コロニー採取］
次に、微生物分離源をすり潰し、滅菌水で希釈することで抽出液を得た。得られた希釈液を、直径９ｃｍのシャーレ内に作製された５種類の寒天培地（素寒天培地、Ｒ２Ａ寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ寒天培地）、ＮＹＧＢ寒天培地及びＴＳＢ寒天培地）にそれぞれ５０μＬずつ塗布した。各寒天培地を２５℃で保持することにより、微生物分離源に含まれていた微生物を培養した。各寒天培地には、培養に伴って徐々に微生物のコロニーが形成された。培養開始から２日後から４週間後にかけて、各寒天培地に形成されたコロニーを採取し続けた。この際、同種の微生物を重複して採取することを避けるため、コロニーの外観が同一であるコロニーは採取しないようにした。即ち、採取期間（培養開始から２日後～４週間後）中、各寒天培地に新しい外観のコロニー（今まで採取したコロニーとは外観が異なるコロニー）が形成された場合に、そのコロニーを採取するようにした。
次に、微生物分離源をすり潰し、滅菌水で希釈することで抽出液を得た。得られた希釈液を、直径９ｃｍのシャーレ内に作製された５種類の寒天培地（素寒天培地、Ｒ２Ａ寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ寒天培地）、ＮＹＧＢ寒天培地及びＴＳＢ寒天培地）にそれぞれ５０μＬずつ塗布した。各寒天培地を２５℃で保持することにより、微生物分離源に含まれていた微生物を培養した。各寒天培地には、培養に伴って徐々に微生物のコロニーが形成された。培養開始から２日後から４週間後にかけて、各寒天培地に形成されたコロニーを採取し続けた。この際、同種の微生物を重複して採取することを避けるため、コロニーの外観が同一であるコロニーは採取しないようにした。即ち、採取期間（培養開始から２日後～４週間後）中、各寒天培地に新しい外観のコロニー（今まで採取したコロニーとは外観が異なるコロニー）が形成された場合に、そのコロニーを採取するようにした。
【0065】
採取されたコロニーの多くは、共生関係にある複数種の微生物により形成される共生コロニーであった。なお、上述のコロニーの採取において使用した寒天培地（コロニーが形成された寒天培地）を「分離用寒天培地」と称呼することがある。
【0066】
［グリセロールストックの作製］
採取されたコロニーを、直径６ｃｍのシャーレ内に作製された寒天培地に移植した。この際、Ｒ２Ａ寒天培地、ＮＹＢＧ寒天培地及びＴＳＢ寒天培地から採取されたコロニーは、同種の寒天培地に移植した。一方、ＰＤＡ寒天培地及び素寒天培地から採取されたコロニーは、それぞれ、２×ＹＴ寒天培地に移植した。移植後の各コロニーを、それぞれ、２５℃で培養した。各コロニーに含まれる微生物が十分に増殖した後、増殖した微生物を回収してグリセロール含有分散媒に分散させた（グリセロール濃度１５体積％）。このようにして得られたサンプル（以下、グリセロールストックと記載する）を－８０℃で凍結保存した。上述の操作により、２０００種の微生物サンプルのグリセロールストックを得た。
採取されたコロニーを、直径６ｃｍのシャーレ内に作製された寒天培地に移植した。この際、Ｒ２Ａ寒天培地、ＮＹＢＧ寒天培地及びＴＳＢ寒天培地から採取されたコロニーは、同種の寒天培地に移植した。一方、ＰＤＡ寒天培地及び素寒天培地から採取されたコロニーは、それぞれ、２×ＹＴ寒天培地に移植した。移植後の各コロニーを、それぞれ、２５℃で培養した。各コロニーに含まれる微生物が十分に増殖した後、増殖した微生物を回収してグリセロール含有分散媒に分散させた（グリセロール濃度１５体積％）。このようにして得られたサンプル（以下、グリセロールストックと記載する）を－８０℃で凍結保存した。上述の操作により、２０００種の微生物サンプルのグリセロールストックを得た。
【0067】
なお、上述のグリセロールストックの作製において使用した寒天培地（Ｒ２Ａ寒天培地、ＮＹＢＧ寒天培地、ＴＳＢ寒天培地及び２×ＹＴ寒天培地）から寒天を除いた液体培地（Ｒ２Ａ培地、ＮＹＢＧ培地、ＴＳＢ培地及び２×ＹＴ培地）を、「分離用液体培地」と称呼することがある。
【0068】
次に、２０００種の各微生物のそれぞれに対して、シードリングバイオアッセイ及びポット試験を行い、病害抑制効果を評価した。まず、各試験で使用する青枯病菌含有懸濁液及び微生物懸濁液の準備方法を説明した後、各試験の詳細を説明する。
【0069】
［青枯病菌含有懸濁液の準備］
評価用の青枯病菌として、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ三保１株（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構の農業生物資源ジーンバンク事業から受領）を使用した。上述の青枯病菌のグリセロールストック（－８０℃保存）をＴＴＣ寒天培地のプレートに塗布し、温度３０℃で２日間培養した。これにより、ＴＴＣ寒天培地のプレートにコロニーが形成された。次に、ＴＴＣ寒天培地のプレートからコロニー（菌体）を数１０μＬ掻き取った。次に、１２．５ｍＬのＣＰＧ培地が入っているフラスコに、上述の菌体を投入し、温度３０℃で２４時間培養した。なお、培養中、フラスコを攪拌速度２００ｒｐｍで攪拌した。
評価用の青枯病菌として、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ三保１株（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構の農業生物資源ジーンバンク事業から受領）を使用した。上述の青枯病菌のグリセロールストック（－８０℃保存）をＴＴＣ寒天培地のプレートに塗布し、温度３０℃で２日間培養した。これにより、ＴＴＣ寒天培地のプレートにコロニーが形成された。次に、ＴＴＣ寒天培地のプレートからコロニー（菌体）を数１０μＬ掻き取った。次に、１２．５ｍＬのＣＰＧ培地が入っているフラスコに、上述の菌体を投入し、温度３０℃で２４時間培養した。なお、培養中、フラスコを攪拌速度２００ｒｐｍで攪拌した。
【0070】
次に、培養により得られた培養液を４０００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、上澄み液及び沈殿物（青枯病菌）を得た。遠心分離後、上澄み液を捨て、沈殿物に滅菌水１２．５ｍＬを投入した。次に、ピッティングによって沈殿物及び滅菌水を懸濁し、懸濁液を得た。次に、懸濁液を４０００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、上澄み液及び沈殿物（青枯病菌）を得た。遠心分離後、上澄み液を捨て、底に残った沈殿物を回収した。次に、沈殿物を水に懸濁することにより、青枯病菌含有懸濁液を調製した。青枯病菌含有懸濁液の調製においては、青枯病菌含有懸濁液の濁度（ＯＤ600）が１．０となるように、沈殿物及び水の使用量を調整した。得られた青枯病菌含有懸濁液を以下で用いた。
【0071】
［微生物懸濁液の準備］
各微生物サンプルのグリセロールストック（－８０℃保存）を、シャーレ内に作製された寒天培地に塗布し、温度２５℃で４～６日間培養した。培養に用いた寒天培地としては、各微生物サンプルを分離する際に使用した分離用寒天培地と同種の観点培地を用いた。これにより、寒天培地上にコロニーを形成させた。次に、寒天培地からコロニー（菌体）を数μＬ掻き取った。次に、２ｍＬの液体培地が入っているフラスコに、上述の菌体を投入し、温度２８℃で２日間培養した。なお、培養中、フラスコを攪拌速度２００ｒｐｍで攪拌した。培養に用いた液体培地としては、各微生物サンプルを分離する際に使用した分離用液体培地と同種の液体培地を用いた。
各微生物サンプルのグリセロールストック（－８０℃保存）を、シャーレ内に作製された寒天培地に塗布し、温度２５℃で４～６日間培養した。培養に用いた寒天培地としては、各微生物サンプルを分離する際に使用した分離用寒天培地と同種の観点培地を用いた。これにより、寒天培地上にコロニーを形成させた。次に、寒天培地からコロニー（菌体）を数μＬ掻き取った。次に、２ｍＬの液体培地が入っているフラスコに、上述の菌体を投入し、温度２８℃で２日間培養した。なお、培養中、フラスコを攪拌速度２００ｒｐｍで攪拌した。培養に用いた液体培地としては、各微生物サンプルを分離する際に使用した分離用液体培地と同種の液体培地を用いた。
【0072】
次に、培養により得られた培養液を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄み液及び沈殿物（微生物サンプル）を得た。遠心分離後、上澄み液を捨て、沈殿物に滅菌水２ｍＬを投入した。次に、ピッティングによって沈殿物及び滅菌水を懸濁し、懸濁液を得た。次に、懸濁液を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄み液及び沈殿物（微生物サンプル）を得た。遠心分離後、上澄み液を捨て、底に残った沈殿物を回収した。沈殿物を水に懸濁することにより、微生物懸濁液を調製した。微生物懸濁液の調製においては、微生物懸濁液の濁度（ＯＤ600）が０．１となるように、沈殿物及び水の使用量を調整した。このようにして、２０００種の微生物サンプルのいずれかを含む微生物懸濁液を２０００種調製した。
【0073】
［シードリングバイオアッセイ］
シャーレにトマト（品種：千果）の種子１２個を投入した。このシャーレに微生物懸濁液（ＯＤ600：０．１）を投入し、２時間静置した。微生物懸濁液の投入量は、種子が微生物懸濁液に十分に浸漬する量とした。これにより、種子を微生物懸濁液で処理した。
シャーレにトマト（品種：千果）の種子１２個を投入した。このシャーレに微生物懸濁液（ＯＤ600：０．１）を投入し、２時間静置した。微生物懸濁液の投入量は、種子が微生物懸濁液に十分に浸漬する量とした。これにより、種子を微生物懸濁液で処理した。
【0074】
赤玉土及び野菜養土（ヤンマーアグリ株式会社製「Ｈ－１５０」）を赤玉土：野菜養土＝３：１の体積比率で混合し、培土を調製した。植物培養試験管（φ４０ｍｍ）に、培土３０ｍＬ及び滅菌水８ｍＬを投入した。次に、微生物懸濁液で処理した後の種子１２個を植物培養試験管に投入（播種）した。次に、植物培養試験管に、微生物懸濁液（ＯＤ600：０．１）２ｍＬを灌注した。次に、植物培養試験管にバーミキュライト１ｍＬを投入した。この際、バーミキュライトが種子を覆うようにした。次に、植物培養試験管に播種された種子を温度２８℃で９日間栽培した。
【0075】
（シードリングバイオアッセイでの発病低減率）
次に、植物培養試験管に青枯病菌含有懸濁液（ＯＤ600：１．０）４ｍＬを灌注した。次に、植物培養試験管に播種された種子を温度３２℃で３週間栽培した。その後、植物培養試験管において、発芽した個体の数（発芽数）と、発芽した個体のうち青枯病を発病した個体の数（発病数）とを計測した。同様の試験を植物培養試験管３本で行い、各植物培養試験管での発病数及び発芽数の合計をそれぞれ総発病数及び総発芽数とした。「発病率＝１００×総発病数／総発芽数」を算出した。得られた発病率を発病率Ｘとした。
次に、植物培養試験管に青枯病菌含有懸濁液（ＯＤ600：１．０）４ｍＬを灌注した。次に、植物培養試験管に播種された種子を温度３２℃で３週間栽培した。その後、植物培養試験管において、発芽した個体の数（発芽数）と、発芽した個体のうち青枯病を発病した個体の数（発病数）とを計測した。同様の試験を植物培養試験管３本で行い、各植物培養試験管での発病数及び発芽数の合計をそれぞれ総発病数及び総発芽数とした。「発病率＝１００×総発病数／総発芽数」を算出した。得られた発病率を発病率Ｘとした。
【0076】
コントロール試験として、微生物懸濁液の代わりに滅菌水を用い、それ以外は上述した操作と同様の操作を行い、発病率を求めた。得られた発病率を発病率Ｙとした。「発病低減率＝（発病率Ｙ－発病率Ｘ）／発病率Ｙ」を算出した。得られた発病低減率を、シードリングバイオアッセイにおける病害抑制効果の評価値とした。
【0077】
［微生物の有力候補］
２０００種の微生物懸濁液を用いて、上述のシードリングバイオアッセイを行い、２０００種の微生物サンプルのそれぞれの病害抑制効果を求めた。発病低減率が５０％を超えていた微生物サンプルを、農業用組成物に用いる微生物の有力候補とした。有力候補として選抜された９種類の微生物サンプルの便宜上の名称と、シードリングバイオアッセイにおける発病低減率とを下記表７に示す。
２０００種の微生物懸濁液を用いて、上述のシードリングバイオアッセイを行い、２０００種の微生物サンプルのそれぞれの病害抑制効果を求めた。発病低減率が５０％を超えていた微生物サンプルを、農業用組成物に用いる微生物の有力候補とした。有力候補として選抜された９種類の微生物サンプルの便宜上の名称と、シードリングバイオアッセイにおける発病低減率とを下記表７に示す。
【0078】
【表7】
【0079】
上述の９種類の微生物サンプルについて、実際の圃場に比較的近い条件の試験であるポット試験を行い、病害抑制効果を更に評価した。
【0080】
［ポット試験］
シャーレにトマト（品種：千果）の種子１２個を投入した。このシャーレに微生物懸濁液（ＯＤ600：０．１）を投入し、２時間静置した。微生物懸濁液の投入量は、種子が微生物懸濁液に十分に浸漬する量とした。これにより、種子を微生物懸濁液で処理した。
シャーレにトマト（品種：千果）の種子１２個を投入した。このシャーレに微生物懸濁液（ＯＤ600：０．１）を投入し、２時間静置した。微生物懸濁液の投入量は、種子が微生物懸濁液に十分に浸漬する量とした。これにより、種子を微生物懸濁液で処理した。
【0081】
セルトレイの各穴（縦３０ｍｍ×横３０ｍｍ）に、上述の野菜養土を投入した。次に、セルトレイの各穴に、微生物懸濁液で処理された種子を１粒ずつ播種した。次に、セルトレイの各穴に、微生物懸濁液（ＯＤ600：０．１）２ｍＬを灌注した。次に、セルトレイの各穴に、バーミキュライト５ｍＬを投入した。この際、バーミキュライトが種子を覆うようにした。次に、セルトレイの各穴に播種された種子を、温度２５～２８℃で３週間栽培した。これにより、種子が成長して苗を形成した。
【0082】
次に、直径６０ｍｍのポットに、上述の苗を移植した。次に、苗を２５～２８℃で９日間栽培した。これにより、本葉４葉の苗に成長させた。次に、上述の苗を栽培しているポットに、底面給水によって青枯病菌含有懸濁液（ＯＤ600：１．０）２ｍＬを供給した。これにより、苗に青枯病菌を接種した。次に、苗を３２℃で２週間栽培した。その後、苗が青枯病を発病したか否かを観察した。ポット試験は、各微生物サンプルについて、８本の苗（ｎ＝８）に対して行った。
【0083】
（ポット試験での発病低減率）
ポット試験の結果から、「発病率＝１００×発病した苗の数／苗の総数（８本）」を算出した。得られた発病率を発病率ｘとした。
ポット試験の結果から、「発病率＝１００×発病した苗の数／苗の総数（８本）」を算出した。得られた発病率を発病率ｘとした。
【0084】
コントロール試験として、微生物懸濁液の代わりに滅菌水を用い、それ以外は上述した操作と同様の操作を行い、発病率を求めた。得られた発病率を発病率ｙとした。「発病低減率＝（発病率ｙ－発病率ｘ）／発病率ｙ」を算出した。得られた発病低減率を、ポット試験における病害抑制効果の評価値とした。
【0085】
［微生物サンプル（Ｈ８７）の選抜］
上述の９種類の微生物サンプルに対応する微生物懸濁液を用いて、上述のポット試験を３回行った。そして、３回のポット試験において、発病低減率の平均値が正の値であり、かつ少なくとも１回のポット試験において発病低減率が３０％以上であった微生物サンプルを合格とした。そして、合格した微生物サンプルについては、更なる確認のために、対応する微生物懸濁液を用いて４回目のポット試験を行った。一方、上述の条件を満たさなかった微生物サンプルについては、不合格とし、４回目のポット試験は行わなかった。４回のポット試験における発病低減率の平均値を、その微生物サンプルの病害抑制効果の最終評価とした。なお、４回目のポット試験を行わなかった微生物サンプルは、病害抑制効果なしと判断した（下記表８における「－」）。評価結果を下記表８に示す。
上述の９種類の微生物サンプルに対応する微生物懸濁液を用いて、上述のポット試験を３回行った。そして、３回のポット試験において、発病低減率の平均値が正の値であり、かつ少なくとも１回のポット試験において発病低減率が３０％以上であった微生物サンプルを合格とした。そして、合格した微生物サンプルについては、更なる確認のために、対応する微生物懸濁液を用いて４回目のポット試験を行った。一方、上述の条件を満たさなかった微生物サンプルについては、不合格とし、４回目のポット試験は行わなかった。４回のポット試験における発病低減率の平均値を、その微生物サンプルの病害抑制効果の最終評価とした。なお、４回目のポット試験を行わなかった微生物サンプルは、病害抑制効果なしと判断した（下記表８における「－」）。評価結果を下記表８に示す。
【0086】
【表8】
【0087】
ポット試験において、最も優れた病害抑制効果を示した微生物サンプル（Ｈ８７）を、農業用組成物に用いる微生物のベースとした。次に、微生物サンプル（Ｈ８７）について、更なる解析を行った。
【0088】
［微生物サンプル（Ｈ８７）を構成する微生物の単離］
微生物サンプル（Ｈ８７）は、共生コロニーに由来し、共生関係にある複数種の微生物を含有する微生物サンプルであった。微生物サンプル（Ｈ８７）は、上述の「コロニー採取」において、ＮＹＧＢ寒天培地に形成されたコロニーに由来する微生物サンプルであった。そこで、以下の点を変更した以外は、上述の「コロニー採取」と同様の方法により、微生物サンプル（Ｈ８７）を構成する各微生物の単離を行った。
微生物サンプル（Ｈ８７）は、共生コロニーに由来し、共生関係にある複数種の微生物を含有する微生物サンプルであった。微生物サンプル（Ｈ８７）は、上述の「コロニー採取」において、ＮＹＧＢ寒天培地に形成されたコロニーに由来する微生物サンプルであった。そこで、以下の点を変更した以外は、上述の「コロニー採取」と同様の方法により、微生物サンプル（Ｈ８７）を構成する各微生物の単離を行った。
【0089】
詳しくは、上述の「コロニー採取」においては、微生物分離源から調製した抽出液を５種類の寒天培地に塗布した。これに対して、微生物サンプル（Ｈ８７）を構成する微生物の単離においては、微生物サンプル（Ｈ８７）を、ＮＹＧＢ寒天培地に塗布した。これにより、微生物サンプル（Ｈ８７）を構成する微生物に由来するコロニーを８０種採取した。採取したコロニーに対して、上述の「グリセロールストックの作製」と同様の操作を行うことにより、微生物サンプル（Ｈ８７）を構成する微生物として単離された微生物サンプルのグリセロールストックを作製した。
【0090】
微生物サンプル（Ｈ８７）を構成する微生物の中には、好ましくない微生物（例えば、病害抑制効果とは無関係の微生物、及び青枯病の発病を逆に促進する微生物）が含まれている可能性がある。そこで、微生物サンプル（Ｈ－８７）から採取された微生物サンプルに対して、上述のシードリングバイオアッセイを行い、各微生物サンプルの病害抑制効果を求めた。このシードリングバイオアッセイでは、好ましくない微生物の排除を目的とする。シードリングバイオアッセイにおいて、発病低減率の閾値を高くしすぎると、他の微生物の病害抑制効果を増進する機能を有するものの、単独では病害抑制効果が弱い微生物まで排除してしまうおそれがある。そのため、このシードリングバイオアッセイでは、発病低減率の閾値を１０％超に設定した。
【0091】
発病低減率が１０％を超えていた微生物サンプルの便宜上の名称と、シードリングバイオアッセイにおける発病低減率とを下記表９に示す。このようにして、微生物サンプル（Ｈ８７）が病害抑制効果を発揮するために必要な微生物の候補として、７種の微生物サンプルを単離した。
【0092】
【表9】
【0093】
［微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）～（Ｈ８７－Ｃ７）の作製］
上述の７種の微生物サンプルを混合し、微生物サンプル（Ｈ８７－Ｃ０）を再構築した。詳しくは、７種の微生物サンプルについて、上述の「微生物懸濁液の準備」と同様の方法により、微生物懸濁液を得た。得られた７種の微生物サンプルの微生物懸濁液を等量ずつ混合することにより、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）の懸濁液を得た。微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）は、微生物サンプル（Ｈ８７）と比較し、好ましくない微生物が含まれていないため、より優れた病害抑制効果を発揮すると判断される。
上述の７種の微生物サンプルを混合し、微生物サンプル（Ｈ８７－Ｃ０）を再構築した。詳しくは、７種の微生物サンプルについて、上述の「微生物懸濁液の準備」と同様の方法により、微生物懸濁液を得た。得られた７種の微生物サンプルの微生物懸濁液を等量ずつ混合することにより、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）の懸濁液を得た。微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）は、微生物サンプル（Ｈ８７）と比較し、好ましくない微生物が含まれていないため、より優れた病害抑制効果を発揮すると判断される。
【0094】
また、上述の７種の微生物サンプルの中には、単独で病害抑制効果を有するものの、他の微生物の病害抑制効果を阻害する効果も有し、トータルでは微生物サンプル（Ｈ８７）の病害抑制効果を低下させている微生物サンプルが含まれる可能性がある。そこで、別途、７種の微生物サンプルの微生物懸濁液を下記表１０の通りに等量ずつ混合することにより、微生物群（Ｈ８７－Ｃ１）～（Ｈ８７－Ｃ７）の懸濁液を得た。微生物群（Ｈ８７－Ｃ１）～（Ｈ８７－Ｃ７）は、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）から１種の微生物サンプルを除いたものに相当する。微生物群（Ｈ８７－Ｃ１）～（Ｈ８７－Ｃ７）は、他の微生物の病害抑制効果を阻害する微生物サンプルの有無を見つけるために作製した。
【0095】
【表10】
【0096】
［微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）～（Ｈ８７－Ｃ７）の評価］
微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）～（Ｈ８７－Ｃ７）の懸濁液、及び滅菌水（コントロール）を用いて、上述のポット試験を３回行った。この際、病害抑制効果をより詳細に解析するため、以下の方法で発病度を評価した。
微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）～（Ｈ８７－Ｃ７）の懸濁液、及び滅菌水（コントロール）を用いて、上述のポット試験を３回行った。この際、病害抑制効果をより詳細に解析するため、以下の方法で発病度を評価した。
【0097】
（ポット試験での発病度）
ポット試験後、８本の苗（ｎ＝８）について、青枯病が発病しているか否かを観察した。この際、青枯病が発病している苗については、葉の総数と、萎れている葉の数とを計測した。そして、各苗の発病程度を下記基準に沿って判断した。
ポット試験後、８本の苗（ｎ＝８）について、青枯病が発病しているか否かを観察した。この際、青枯病が発病している苗については、葉の総数と、萎れている葉の数とを計測した。そして、各苗の発病程度を下記基準に沿って判断した。
【0098】
（苗の発病程度）
程度０：発病なし。
程度１：葉の総数のうち２５％以下の葉が萎れている。
程度２：葉の総数のうち２５％超５０％以下の葉が萎れている。
程度３：葉の総数のうち５０％超７５％以下の葉が萎れている。
程度４：葉の総数のうち７５％超の葉が萎れている。
程度０：発病なし。
程度１：葉の総数のうち２５％以下の葉が萎れている。
程度２：葉の総数のうち２５％超５０％以下の葉が萎れている。
程度３：葉の総数のうち５０％超７５％以下の葉が萎れている。
程度４：葉の総数のうち７５％超の葉が萎れている。
【0099】
８本の苗について、各苗の発病程度の合計値を算出した。例えば、８本の苗のうち、１本の苗が程度０、２本の苗が程度１、２本の苗が程度２、２本の苗が程度３、１本の苗が程度４であった場合、「０×１＋１×２＋２×２＋３×２＋４×１＝１６」を発病程度の合計値とした。発病程度の合計値に基づいて、下記式により発病度を算出した。３回行ったポット試験の各回での発病度の平均値を、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）～（Ｈ８７－Ｃ７）の病害抑制効果の評価値とした。評価結果を下記表１１に示す。
「発病度＝Σ（苗の発病程度の合計値）×１００／（苗の総数（８本））×４」
「発病度＝Σ（苗の発病程度の合計値）×１００／（苗の総数（８本））×４」
【0100】
【表11】
【0101】
表１１に示すように、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）～（Ｈ８７－Ｃ７）は、いずれも、コントロールよりも発病度が低かった。即ち、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）～（Ｈ８７－Ｃ７）は、病害抑制効果を発揮した。この中でも、微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）は、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）よりも優れた病害抑制効果を発揮した。微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）は、上述の通り、微生物（Ｈ８７－６）、（Ｈ８７－２５）、（Ｈ８７－３３）、（Ｈ８７－４０）、（Ｈ８７－５４）及び（Ｈ８７－６７）の混合物であった。このことから、上述の６種の微生物は、単独でも病害抑制効果を発揮し、組み合わされることで病害抑制効果が向上すると判断される。
【0102】
［拮抗試験］
以下の方法により、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）及び（Ｈ８７－Ｃ５）と、微生物（Ｈ８７－６）、（Ｈ８７－２５）、（Ｈ８７－３３）、（Ｈ８７－４０）、（Ｈ８７－５４）及び（Ｈ８７－６７）を評価対象として、拮抗試験を行った。まず、直径９ｃｍのシャーレ内に、ＣＰＧ寒天培地を形成した。次に、ＣＰＧ寒天培地上に、青枯病菌含有懸濁液（ＯＤ600：１．０）２００μＬを滴下した。次に、ＣＰＧ寒天培地上に滴下した青枯病菌含有懸濁液を、コンラージ棒を用いて全面に塗り広げた。次に、評価対象の微生物懸濁液（ＯＤ600：０．１）及び滅菌水（コントロール）を、異なる位置（スポット）にそれぞれ１５μＬずつ滴下した。その後、ＣＰＧ寒天培地を３０℃で２日間静置し、青枯病菌及び滴下した微生物懸濁液に含まれる微生物を培養した。
以下の方法により、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）及び（Ｈ８７－Ｃ５）と、微生物（Ｈ８７－６）、（Ｈ８７－２５）、（Ｈ８７－３３）、（Ｈ８７－４０）、（Ｈ８７－５４）及び（Ｈ８７－６７）を評価対象として、拮抗試験を行った。まず、直径９ｃｍのシャーレ内に、ＣＰＧ寒天培地を形成した。次に、ＣＰＧ寒天培地上に、青枯病菌含有懸濁液（ＯＤ600：１．０）２００μＬを滴下した。次に、ＣＰＧ寒天培地上に滴下した青枯病菌含有懸濁液を、コンラージ棒を用いて全面に塗り広げた。次に、評価対象の微生物懸濁液（ＯＤ600：０．１）及び滅菌水（コントロール）を、異なる位置（スポット）にそれぞれ１５μＬずつ滴下した。その後、ＣＰＧ寒天培地を３０℃で２日間静置し、青枯病菌及び滴下した微生物懸濁液に含まれる微生物を培養した。
【0103】
培養により、ＣＰＧ寒天培地上のほぼ全面で、青枯病菌が増殖した。一方、評価対象を滴下した位置（スポット）の周囲には、青枯病菌が増殖しないリング状の領域（阻止円）が形成された。コントロール（滅菌水）を滴下した位置の周囲には、阻止円が形成されなかった。阻止円は、評価対象が青枯病菌の増殖を阻害したことを示す。阻止円のサイズが大きいほど、評価対象が青枯病菌の増殖を効果的に阻害したことを示す。拮抗試験の結果を下記表１２に示す。なお、下記表１２において、拮抗試験の結果の説明は、以下に示す通りである。
【0104】
（拮抗試験の結果）
－：阻止円が形成されなかった。
＋：外径２０ｍｍ以下の阻止円が形成された。
＋＋：外径２０ｍｍ超３０ｍｍ以下の阻止円が形成された。
＋＋＋：外径３０ｍｍ超の阻止円が形成された。
－：阻止円が形成されなかった。
＋：外径２０ｍｍ以下の阻止円が形成された。
＋＋：外径２０ｍｍ超３０ｍｍ以下の阻止円が形成された。
＋＋＋：外径３０ｍｍ超の阻止円が形成された。
【0105】
【表12】
【0106】
表１２に示す通り、各評価対象は、阻止円を形成した。このことから、各評価対象は、青枯病菌の増殖を阻害することで病害抑制効果を発揮すると判断される。また、微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）は、微生物群（Ｈ８７－Ｃ０）よりも大きい阻止円を形成した。微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）を構成する６種の微生物は、単独でも一定の病害抑制効果を発揮した。これらの結果は、上述のポット試験の結果と概ね一致していた。
【0107】
＜微生物の同定＞
微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）を構成する微生物（Ｈ８７－６）、（Ｈ８７－２５）、（Ｈ８７－３３）、（Ｈ８７－４０）、（Ｈ８７－５４）及び（Ｈ８７－６７）について、属種の同定を行った。また、微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）に含めなかった微生物（Ｈ８７－５０）についても、属種の同定を行った。
微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）を構成する微生物（Ｈ８７－６）、（Ｈ８７－２５）、（Ｈ８７－３３）、（Ｈ８７－４０）、（Ｈ８７－５４）及び（Ｈ８７－６７）について、属種の同定を行った。また、微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）に含めなかった微生物（Ｈ８７－５０）についても、属種の同定を行った。
【0108】
対象となる微生物のグリセロールストックを、シャーレ内に形成されたＮＹＧＢ寒天培地に画線培養した。次に、ＮＹＧＢ寒天培地を２５℃で４～６日間静置することにより、対象となる微生物に由来するコロニーをＮＹＧＢ寒天培地上に形成させた。
【0109】
次に、ＮＹＧＢ寒天培地上に形成されたコロニーを掻き取り、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲでは、以下の配列の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用のＤＮＡ増幅プライマーを用いた。このＤＮＡ増幅プライマーは、細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の超可変領域であるＶ１領域－Ｖ５領域を含む領域（以下、特定領域と記載する）を増幅するためのＤＮＡ増幅プライマーであった。ＰＣＲにより、特定領域に係るＤＮＡを増幅した。
Ｆｗプライマー（２７Ｆ）：ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ
Ｒｖプライマー（９０７Ｒ）：ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＭＴＴＴＲＡＧＴＴＴ
Ｆｗプライマー（２７Ｆ）：ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ
Ｒｖプライマー（９０７Ｒ）：ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＭＴＴＴＲＡＧＴＴＴ
【0110】
ＰＣＲを行った後、得られた反応生成物に含まれるＤＮＡをアガロース電気泳動で分離し、特定領域に係るＤＮＡを単離した。次に、単離したＤＮＡをシークエンスし、特定領域の塩基配列を解析した。このようにして、上述のコロニーに含まれる微生物の特定領域の塩基配列を解析した。
【0111】
微生物（Ｈ８７－６）は、特定領域の塩基配列の解析において、配列番号１で表される塩基配列を有する微生物を含むコロニーであった。
【0112】
同様に、微生物（Ｈ８７－２５）、（Ｈ８７－３３）、（Ｈ８７－４０）、（Ｈ８７－５０）、（Ｈ８７－５４）、（Ｈ８７－６７）の解析を行った。結果を下記表１３に示す。
【0113】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法に準拠し、微生物（Ｈ８７－６）の同定を行った。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析においては、ＮＣＢＩ（アメリカ国立生物工学情報センター）で提供されているＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を利用した。詳しくは、ＢＬＡＳＴを用いて、配列番号１で表される塩基配列と、データベースに登録された様々な微生物の塩基配列との相同性を解析した。配列番号１で表される塩基配列と最も相同性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物は、微生物（Ｈ８７－６）と同種又は近縁種であると判断される。
【0114】
配列番号１で表される塩基配列は、Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍａｇａｔａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と非常に高い相同性を有していた（下記表１４）。そのため、微生物（Ｈ８７－６）は、ロイコバクター属微生物であると判断した。また、微生物（Ｈ８７－６）は、Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍａｇａｔａｅの同種又は近縁種である可能性が高いと判断した。
【0115】
同様の解析を、他の微生物に対しても行った。結果を下記表１３に示す。なお、下記表１３において、「ＷＧＳＳ」、「ＣＧ」及び「ＣＳ」は、それぞれ、「ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｏｔｇｕｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、「ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ」及び「ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の略語を示す。
【0116】
【表13】
【0117】
以上の通り、発明者は、高い病害抑制効果を有する微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）を自然界からスクリーニングすることに成功した。微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）には、２種のロイコバクター属微生物、１種のアルカリゲネス属微生物及び３種のステノトロホモナス属微生物が含まれていた。ロイコバクター属微生物、アルカリゲネス属微生物及びステノトロホモナス属微生物は、単独でも病害抑制効果を発揮するが、組み合わされることで更に優れた病害抑制効果を発揮した。微生物群（Ｈ８７－Ｃ５）に含まれていた微生物（Ｈ８７－６）については、上述の特許微生物寄託センターに寄託を行った。
【0118】
＜ゲノム解析＞
微生物（Ｈ８７－６）について、ゲノム解析を行った。その結果、配列番号５で示すゲノム配列を得た。ゲノム解析の方法としては、具体的には、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ＠Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ．社製）を使用し、使用説明書に従ってゲノムＤＮＡを抽出した（ゲノム配列の解析は、株式会社生物技研において実施された）。ゲノムＤＮＡは、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を使用し精製した。次に、精製したゲノムＤＮＡを、ｇ－ｔｕｂｅ（Ｃｏｖａｒｉｓ社製）を使用し断片化した。次に、断片化したゲノムＤＮＡについて、ＳＭＲＴｂｅｌｌ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ２．０（ＰａｃＢｉｏ社製）を使用して、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ＆Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ－Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ＨｉＦｉ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｏｗ ＤＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｕｓｉｎｇ ＳＭＲＴｂｅｌｌ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ２．０のマニュアル通りにライブラリーを調製した。Ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｔ ２．２（ＰａｃＢｉｏ社製）を使用してマニュアル通りに作製されたライブラリーのポリメラーゼ複合体を使用して、Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩｅ（ＰａｃＢｉｏ社製）によってシーケンシングを行った。
微生物（Ｈ８７－６）について、ゲノム解析を行った。その結果、配列番号５で示すゲノム配列を得た。ゲノム解析の方法としては、具体的には、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ＠Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ．社製）を使用し、使用説明書に従ってゲノムＤＮＡを抽出した（ゲノム配列の解析は、株式会社生物技研において実施された）。ゲノムＤＮＡは、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を使用し精製した。次に、精製したゲノムＤＮＡを、ｇ－ｔｕｂｅ（Ｃｏｖａｒｉｓ社製）を使用し断片化した。次に、断片化したゲノムＤＮＡについて、ＳＭＲＴｂｅｌｌ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ２．０（ＰａｃＢｉｏ社製）を使用して、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ＆Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ－Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ＨｉＦｉ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｏｗ ＤＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｕｓｉｎｇ ＳＭＲＴｂｅｌｌ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ２．０のマニュアル通りにライブラリーを調製した。Ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｔ ２．２（ＰａｃＢｉｏ社製）を使用してマニュアル通りに作製されたライブラリーのポリメラーゼ複合体を使用して、Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩｅ（ＰａｃＢｉｏ社製）によってシーケンシングを行った。
【0119】
得られた微生物（Ｈ８７－６）のゲノム配列について、ＮＣＢＩに登録されているゲノム配列との比較解析を上述のＢＬＡＳＴを用いて行った。その結果、微生物（Ｈ８７－６）のゲノム配列と近縁（Ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（ＡＮＩ）≧９５％）な種は登録されていないことを確認した。そのため、微生物（Ｈ８７－６）は、ロイコバクター属の新種である可能性があると判断した。
【0120】
次に、微生物（Ｈ８７－６）のゲノム配列に基づいて、ＮＣＢＩに登録されている他のロイコバクター属微生物のゲノム配列との系統関係を示す系統樹を作成した。系統樹の作成においては「Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｒｖｅｒ」（ＴＹＧＳ、ｈｔｔｐｓ：／／ｔｙｇｓ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）を利用した。作成した分子系統樹を図１に示す。図１において、微生物（Ｈ８７－６）のゲノム配列の位置は、「Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｈ８７－６」に示す。バーは、塩基配列の置換数の尺度を示す。図１に示すように、微生物（Ｈ８７－６）と比較的近縁な種は、Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍａｇａｔａｅ ｓｔｒａｉｎ ＤＳＭ ８８０３であった。
【0121】
＜混合比率の検討＞
上述の微生物サンプルのうち、微生物（Ｈ８７－６）（Ｌ：ロイコバクター属）、微生物（Ｈ８７－３３）（Ａ：アルカリゲネス属）及び微生物（Ｈ８７－４０）（Ｓ：ステノトロホモナス属）について、上述の「微生物懸濁液の準備」と同様の方法により、微生物懸濁液を得た。得られた微生物懸濁液を下記表１４に示す混合比率（基準：濁度）で混合し、必要に応じて滅菌水で希釈することにより、サンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）、サンプル（Ｌ１Ａ０．１Ｓ０．１）、サンプル（Ｌ１Ａ１０Ｓ１）及びサンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１０）を得た（何れも濁度（ＯＤ600）＝０．５）。別途、コントロールとして、滅菌水を準備した。
上述の微生物サンプルのうち、微生物（Ｈ８７－６）（Ｌ：ロイコバクター属）、微生物（Ｈ８７－３３）（Ａ：アルカリゲネス属）及び微生物（Ｈ８７－４０）（Ｓ：ステノトロホモナス属）について、上述の「微生物懸濁液の準備」と同様の方法により、微生物懸濁液を得た。得られた微生物懸濁液を下記表１４に示す混合比率（基準：濁度）で混合し、必要に応じて滅菌水で希釈することにより、サンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）、サンプル（Ｌ１Ａ０．１Ｓ０．１）、サンプル（Ｌ１Ａ１０Ｓ１）及びサンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１０）を得た（何れも濁度（ＯＤ600）＝０．５）。別途、コントロールとして、滅菌水を準備した。
【0122】
【表14】
【0123】
トマト（品種：千果）の種子を表面殺菌した。滅菌した紙製タオルを滅菌水に浸し、その上に上述の表面殺菌した種子を載置した。２８℃で２日間静置することにより、種子を発根させた。これにより、発根した種子を得た。
【0124】
（サンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）の発病率ｘの測定）
上述の発根した種子１０個をシャーレに投入した。このシャーレにサンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）（ＯＤ600：０．５）を投入し、室温で２時間静置した。これにより、発根した種子をサンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）で処理した。
上述の発根した種子１０個をシャーレに投入した。このシャーレにサンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）（ＯＤ600：０．５）を投入し、室温で２時間静置した。これにより、発根した種子をサンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）で処理した。
【0125】
赤玉土及び野菜養土（ヤンマーアグリ株式会社製「Ｈ－１５０」）を赤玉土：野菜養土＝３：１の体積比率（質量比率＝６：１）で混合し、培土を調製した。植物培養試験管（φ４０ｍｍ）に、培土３０ｍＬ及び滅菌水８ｍＬを投入した。次に、サンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）で処理した後の発根した種子１０個を植物培養試験管に投入（播種）した。次に、植物培養試験管に、サンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）（ＯＤ600：０．５）２ｍＬを灌注した。次に、植物培養試験管に播種された種子を温度２５℃で９日間栽培した。
【0126】
次に、植物培養試験管に青枯病菌含有懸濁液（ＯＤ600：１．０）２．６ｍＬを灌注した。なお、青枯病菌含有懸濁液（ＯＤ600：１．０）のＣＦＵは、８×１０8ｃｆｕ／ｍＬであった。次に、植物培養試験管に播種された種子を温度３２℃で１０日間栽培した。その後、植物培養試験管において、青枯病を発病した個体の数（発病数）を計測した。発根した種子の総数１０個のうちの発芽した種子の数（発芽種子数）に対する発病数の比率である発病率ｘ（１００×発病数／発芽種子数）を算出した。
【0127】
サンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１）（ＯＤ600：０．５）の代わりに、サンプル（Ｌ１Ａ０．１Ｓ０．１）（ＯＤ600：０．５）、サンプル（Ｌ１Ａ１０Ｓ１）（ＯＤ600：０．５）、サンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１０）（ＯＤ600：０．５）又はコントロールを用いた以外は、上述の試験と同様の操作を行い、各サンプル又はコントロールを用いた際の発病率ｘを求めた。また、コントロールの発病率ｘと、各サンプルの発病率ｘとを下記式に当てはめ、得られた数値を各サンプルの発病低減率とした。結果を下記表１５に示す。
発病低減率［％］＝（コントロールの発病率（８６％）－各サンプルの発病率ｘ）／コントロールの発病率（８６％）
発病低減率［％］＝（コントロールの発病率（８６％）－各サンプルの発病率ｘ）／コントロールの発病率（８６％）
【0128】
【表15】
【0129】
表１５に示すように、何れのサンプルも一定の発病低減率を示したが、最も発病低減率が高かったのはサンプル（Ｌ１Ａ１０Ｓ１）又はサンプル（Ｌ１Ａ１Ｓ１０）であった。そのため、農業用組成物において、ロイコバクター属微生物、アルカリゲネス属微生物及びステノトロホモナス属微生物の混合比率としては、ロイコバクター属微生物：アルカリゲネス属微生物：ステノトロホモナス属微生物＝１：１０：１又は１：１：１０が好ましいと判断される。
【0130】
本願は、以下の付記を開示する。以下の付記は、本発明を限定するものではない。
【0131】
（付記１）
ロイコバクター属微生物を含有する、農業用組成物。
ロイコバクター属微生物を含有する、農業用組成物。
【0132】
（付記２）
前記ロイコバクター属微生物は、配列番号１で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含む、付記１に記載の農業用組成物。
前記ロイコバクター属微生物は、配列番号１で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含む、付記１に記載の農業用組成物。
【0133】
（付記３）
前記ロイコバクター属微生物は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６３４で寄託された株である、付記２に記載の農業用組成物。
前記ロイコバクター属微生物は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３６３４で寄託された株である、付記２に記載の農業用組成物。
【0134】
（付記４）
アルカリゲネス属微生物を更に含有する、付記１～３の何れかに記載の農業用組成物。
アルカリゲネス属微生物を更に含有する、付記１～３の何れかに記載の農業用組成物。
【0135】
（付記５）
前記アルカリゲネス属微生物は、配列番号２で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、付記４に記載の農業用組成物。
前記アルカリゲネス属微生物は、配列番号２で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、付記４に記載の農業用組成物。
【0136】
（付記６）
前記ロイコバクター属微生物の含有量Ｌに対して、前記アルカリゲネス属微生物の含有量Ａの比率（Ａ／Ｌ）は、０．０００１以上１００．０以下である、付記４又は５に記載の農業用組成物。
前記ロイコバクター属微生物の含有量Ｌに対して、前記アルカリゲネス属微生物の含有量Ａの比率（Ａ／Ｌ）は、０．０００１以上１００．０以下である、付記４又は５に記載の農業用組成物。
【0137】
（付記７）
前記比率（Ａ／Ｌ）は、０．５以上１５．０以下である、付記６に記載の農業用組成物。
前記比率（Ａ／Ｌ）は、０．５以上１５．０以下である、付記６に記載の農業用組成物。
【0138】
（付記８）
ステノトロホモナス属微生物を更に含有する、付記１～７の何れかに記載の農業用組成物。
ステノトロホモナス属微生物を更に含有する、付記１～７の何れかに記載の農業用組成物。
【0139】
（付記９）
前記ステノトロホモナス属微生物は、配列番号３で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、付記８に記載の農業用組成物。
前記ステノトロホモナス属微生物は、配列番号３で表される塩基配列と９０．０％以上の相同性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、付記８に記載の農業用組成物。
【0140】
（付記１０）
前記ロイコバクター属微生物の含有量Ｌに対して、前記ステノトロホモナス属微生物の含有量Ｓの比率（Ｓ／Ｌ）は、０．０００１以上１００．０以下である、付記８又は９に記載の農業用組成物。
前記ロイコバクター属微生物の含有量Ｌに対して、前記ステノトロホモナス属微生物の含有量Ｓの比率（Ｓ／Ｌ）は、０．０００１以上１００．０以下である、付記８又は９に記載の農業用組成物。
【0141】
（付記１１）
前記比率（Ｓ／Ｌ）は、０．５以上１５．０以下である、付記１０に記載の農業用組成物。
前記比率（Ｓ／Ｌ）は、０．５以上１５．０以下である、付記１０に記載の農業用組成物。
【0142】
（付記１２）
青枯病防除に用いられる、付記１～１１の何れかに記載の農業用組成物。
青枯病防除に用いられる、付記１～１１の何れかに記載の農業用組成物。
【0143】
（付記１３）
養土と、前記養土によって栽培される苗木とを備える苗木製品であって、
前記苗木及び前記養土のうち少なくとも１つが付記１～１１の何れかに記載の農業用組成物によって処理されている、苗木製品。
養土と、前記養土によって栽培される苗木とを備える苗木製品であって、
前記苗木及び前記養土のうち少なくとも１つが付記１～１１の何れかに記載の農業用組成物によって処理されている、苗木製品。
【0144】
（付記１４）
植物の栽培方法であって、
付記１～１１の何れかに記載の農業用組成物によって前記植物を処理する工程を備える、植物の栽培方法。
植物の栽培方法であって、
付記１～１１の何れかに記載の農業用組成物によって前記植物を処理する工程を備える、植物の栽培方法。
【産業上の利用可能性】
【0145】
本発明は、農業に用いることができる。
【図1】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】