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特開2023-174612電気化学発光ナノプローブ、その調製方法、核酸特異的サイト修飾の電気化学発光検出方法、抗体による電気化学発光検出方法のキット、及び電気化学発光ナノプローブ用ナノ粒子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023174612
(43)【公開日】2023-12-07
(54)【発明の名称】電気化学発光ナノプローブ、その調製方法、核酸特異的サイト修飾の電気化学発光検出方法、抗体による電気化学発光検出方法のキット、及び電気化学発光ナノプローブ用ナノ粒子
(51)【国際特許分類】
G01N 21/66 20060101AFI20231130BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20231130BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231130BHJP
【ＦＩ】
G01N21/66
G01N33/543 541A
G01N33/53 M
G01N33/53 N
【審査請求】未請求
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023087169
(22)【出願日】2023-05-26
(31)【優先権主張番号】202210592343.6
(32)【優先日】2022-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】594164542
【氏名又は名称】キヤノンメディカルシステムズ株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】515190906
【氏名又は名称】南京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001771
【氏名又は名称】弁理士法人虎ノ門知的財産事務所
(72)【発明者】
【氏名】ファン ハオ
(72)【発明者】
【氏名】シュ チチ
(72)【発明者】
【氏名】ウー シャオティエン
(72)【発明者】
【氏名】ヂィー フアンシィェン
(72)【発明者】
【氏名】ウー ヂィエ
【テーマコード（参考）】
2G043
【Ｆターム（参考）】
2G043AA04
2G043BA16
2G043CA04
2G043DA02
2G043EA06
(57)【要約】
【課題】核酸特異的サイト修飾を簡便、高感度、迅速、かつ汎用性が高い電気化学発光検出方法を提供することである。
【解決手段】実施形態に係る電気化学発光ナノプローブの調製方法は、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程とを含む。前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される。
【選択図】図１
【解決手段】実施形態に係る電気化学発光ナノプローブの調製方法は、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程とを含む。前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、
二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、
を含み、
前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される、
電気化学発光ナノプローブの調製方法。
二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、
を含み、
前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される、
電気化学発光ナノプローブの調製方法。
【請求項2】
前記無機酸化物ナノ粒子は、二酸化ケイ素ナノ粒子、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、又は酸化鉄ナノ粒子、或いは二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化亜鉛又は酸化鉄が被覆されているナノ粒子である、
請求項１に記載の調製方法。
請求項１に記載の調製方法。
【請求項3】
前記無機酸化物ナノ粒子は、二酸化ケイ素ナノ粒子である、
請求項１に記載の調製方法。
請求項１に記載の調製方法。
【請求項4】
前記二次抗体は、前記特異的抗体の汎用部分を識別するタンパク質である、
請求項１に記載の調製方法。
請求項１に記載の調製方法。
【請求項5】
前記金属錯体イオンは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体イオン（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋）である、
請求項１に記載の調製方法。
請求項１に記載の調製方法。
【請求項6】
金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、を含み、前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される電気化学発光ナノプローブの調製方法により調製される、
電気化学発光ナノプローブ。
電気化学発光ナノプローブ。
【請求項7】
捕捉核酸が修飾されている磁性ビーズを第１反応試薬として、検出される試料と混合し、試料中の標的核酸の修飾を識別及び捕捉する第１工程と、
核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を第２反応試薬として標的核酸の特異的サイト修飾に捕捉及び標識を行う第２工程と、
金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、を含み、前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される電気化学発光ナノプローブの調製方法により調製される電気化学発光ナノプローブを第３反応試薬として第２工程で得られた磁性ビーズ捕捉核酸－標的核酸－特異的抗体との複合体に検出信号標識を行う第３工程と、
前記第３工程で得られた磁性ビーズ捕捉核酸－標的核酸－特異的抗体－ナノプローブとの複合体を電極表面に置き、共反応剤を添加した後に電気化学発光検出を行い、電気化学発光信号の有無及び強度に基づいて前記標的核酸の修飾に対して定性及び定量分析を行う第４工程とを含む、
核酸特異的サイト修飾の電気化学発光検出方法。
核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を第２反応試薬として標的核酸の特異的サイト修飾に捕捉及び標識を行う第２工程と、
金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、を含み、前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される電気化学発光ナノプローブの調製方法により調製される電気化学発光ナノプローブを第３反応試薬として第２工程で得られた磁性ビーズ捕捉核酸－標的核酸－特異的抗体との複合体に検出信号標識を行う第３工程と、
前記第３工程で得られた磁性ビーズ捕捉核酸－標的核酸－特異的抗体－ナノプローブとの複合体を電極表面に置き、共反応剤を添加した後に電気化学発光検出を行い、電気化学発光信号の有無及び強度に基づいて前記標的核酸の修飾に対して定性及び定量分析を行う第４工程とを含む、
核酸特異的サイト修飾の電気化学発光検出方法。
【請求項8】
前記標的核酸は、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）又はＲＮＡ（ribonucleic acid）である、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項9】
前記特異的サイト修飾は、メチル化修飾、メチロール化修飾、又はプソイドウリジン化修飾である
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項10】
前記捕捉核酸は、末端にビオチンが結合され、ビオチン－ストレプトアビジン反応により前記磁性ビーズに修飾されている、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項11】
前記共反応剤は、トリプロピルアミンである、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項12】
前記電極は、ガラス炭素電極、ＩＴＯ（Indium Tin Oxide）電極、スクリーン印刷電極から選択される一種である、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項13】
前記第４工程で使用される電気化学発光電解質のｐＨは６．５以上である、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項14】
前記共反応剤の濃度は１０ｍＭ以上である、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項15】
前記特異的抗体の濃度は１μｇ／ｍＬ以上である、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項16】
前記特異的抗体添加後のインキュベーション時間は１０分間以上である、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項17】
前記電気化学発光ナノプローブの濃度は４μｇ／ｍＬ以上である、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項18】
前記電気化学発光ナノプローブ添加後のインキュベーション時間は１５分間以上である、
請求項７に記載の検出方法。
請求項７に記載の検出方法。
【請求項19】
金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、を含み、前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される電気化学発光ナノプローブの調製方法により調製される電気化学発光ナノプローブを含む、
抗体による電気化学発光検出方法のキット。
抗体による電気化学発光検出方法のキット。
【請求項20】
金属錯体イオンが添加された無機酸化物を備える、
電気化学発光ナノプローブ用ナノ粒子。
電気化学発光ナノプローブ用ナノ粒子。
【請求項21】
金属錯体イオンが添加された無機酸化物ナノ粒子と、当該無機酸化物ナノ粒子と結合した二次抗体とを含む、
電気化学発光ナノプローブ。
電気化学発光ナノプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書及び図面に開示の実施形態は、電気化学発光ナノプローブ、その調製方法、核酸特異的サイト修飾の電気化学発光検出方法、抗体による電気化学発光検出方法のキット、及び電気化学発光ナノプローブ用ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸、例えばＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）及びＲＮＡ（ribonucleic acid）には様々な化学修飾が存在し、これらの化学修飾は核酸配列を変更しない前提で、調節メカニズムとして遺伝子の発現を動的に調節する。
【0003】
ＤＮＡメチル化（ＤＮＡ methylation）はシトシンの５番目の炭素原子に発生し、安定的に遺伝できる見かけの修飾であり、動植物ゲノムに広く存在する。ＤＮＡメチル化は哺乳動物の成長発育過程において様々な生理学的過程に広く関与し、遺伝子サイレンシング、ゲノムインプリンティング（genomic imprinting）、Ｘ染色体不活性化及び疾患の発生等を含む。
【0004】
一部の腫瘍の発生が特定の遺伝子の高メチル化イベントに伴い、かつ遺伝子の局所的な高メチル化イベントが細胞の悪性増殖より早く発生するので、特定の遺伝子のメチル化レベルの検出は腫瘍早期予測及び診断の重要な根拠の一つとすることができる。例えば、早期の結腸癌（ＣＲＣ：colorectal cancer）スクリーニング検出は、見かけの遺伝的バイオマーカーに基づいて行われ、ＦＤＡ（Food and Drug Administration）は既に特定遺伝子プロモーターＣｐＧメチル化の増加を検出することによりＣＲＣの早期スクリーニング及び補助診断を行うことを認定した（非特許文献１参照）。また、腫瘍の種類によって高メチル化を発生する癌抑制遺伝子が異なり、例えば卵巣癌においては癌抑制遺伝子であるＲＡＳＳＦ１Ａ、ＢＲＣＡ１、ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ等が高メチル化状態を呈し、乳癌においては癌抑制遺伝子であるＰＣＤＨＢ１５、ＷＢＳＣＲＦ１７、ＩＧＦ１、ＧＹＰＣ等が高メチル化状態を呈する（非特許文献２参照）。これらの特定の腫瘍抑制遺伝子のメチル化レベルを検出することにより、特定の腫瘍のスクリーニング及び診断を強化することだけでなく、腫瘍に対する決定的治療の効果評価及び予後観察にも役立つ。
【0005】
現在、ＤＮＡメチル化検出の標準方法は亜硫酸水素塩処理（バイサルファイト処理）であり、具体的に、亜硫酸水素塩、例えば亜硫酸水素ナトリウムでＤＮＡを処理することにより、ＤＮＡ中のシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換することができる。これに対し、メチル化された５－メチルシトシン（５－ｍＣ）が変化しないように保持され、これにより次のＰＣＲ又はシークエンシングにより５－ｍＣとＣを区別することができ、メチル化ＤＮＡの検出を実現できる。
【0006】
しかし、亜硫酸水素塩処理はストリンジェントな化学的及び温度条件下で核酸の前処理を行う必要があり、かつＰＣＲ又はシークエンシングの検出操作が複雑であり、専門技術者及び専門的な装置を必要とする。これらの理由から該検出方法の効率は低く、時間がかかり、コストが高くなる。したがって、簡便で迅速な高感度のメチル化ＤＮＡ検出方法を開発する必要がある。
【0007】
最近では、特異的抗体がメチル化部位を認識することによるメチル化ＤＮＡ検出方法が注目されている。このような検出方法は核酸の前処理を必要とせず、かつ特異的抗体に異なるプローブを標識することにより、電気化学的（例えば非特許文献３）、蛍光等の検出を行うことができる。
【0008】
近年開発されたＥＣＬ（Electrochemiluminescence）技術は既に生物学的分析、例えば腫瘍タンパク質標識物質の検出に広く応用されている（例えば非特許文献４）。ＥＣＬ技術は、電気化学的原理を利用して電極表面で電気化学反応を行って励起状態を生成して特異的な発光を引き起こす方法である。ＥＣＬはエレクトロルミネセンスであるため、蛍光と比べて、励起光源を追加する必要がなく、かつ光退色及び光干渉等の影響がないため、装置が簡単であり、コストが低く、背景信号が低く、検出感度が高いなどの利点を有する。
【0009】
しかしながら、従来の技術では、核酸特異的サイト修飾を検出するための十分なＥＣＬ検出方法がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Yvette N Lamb et al.，Epi proColon (R) 2.0 CE：A Blood-Based Screening Test for Colorectal Cancer，Mol Diagn Ther. 2017 Apr; 21(2): 225-232
【非特許文献2】Tingting Hong, Selective detections of epigenetic modification in DNA, Wuhan University, 2017, Ph.D dissertation
【非特許文献3】Eloy Povedano et al.,Amperometric Bioplatforms To Detect Regional DNA Methylation with Single-Base Sensitivity,Anal. Chem,2020,92,5604-12
【非特許文献4】Xiaoming Zhou et al.,Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2`-bipyridyl)Ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe,Nat Protoc 2014 May;9(5)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本明細書及び図面に開示の実施形態が解決しようとする課題の一つは、核酸特異的サイト修飾を簡便、高感度、迅速、かつ汎用性が高い電気化学発光検出方法を提供することである。更に、本実施形態は、上記検出方法に用いられる電気化学発光ナノプローブ、その調製方法、及び上記検出方法に用いられるキットを提供する。ただし、本明細書及び図面に開示の実施形態により解決しようとする課題は上記課題に限られない。後述する実施形態に示す各構成による各効果に対応する課題を他の課題として位置づけることもできる。
【課題を解決するための手段】
【0012】
実施形態に係る電気化学発光ナノプローブの調製方法は、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程とを含む。前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、図面を参照して本実施形態の具体的な実施形態を詳細に説明する。なお、以下の実施形態についての説明は本実施形態の発明構想を説明するためだけであり、本実施形態を限定するものではない。
【0015】
本実施形態は、ナノプローブによる核酸特異的サイト修飾の電気化学発光検出方法、及び上記検出方法に用いられる電気化学発光ナノプローブ及びその調製方法、上記検出方法に用いられるキット等を提供する。
【0016】
本実施形態の一つの実施態様は、ナノプローブによる核酸特異的サイト修飾の電気化学発光検出方法であって、捕捉核酸が修飾されている磁性ビーズを反応試薬１（第１反応試薬）として、検出される試料と混合し、試料中の標的核酸の修飾を識別及び捕捉する工程１（第１工程）と、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を反応試薬２（第２反応試薬）として標的核酸の特異的サイト修飾に捕捉及び標識を行う工程２（第２工程）と、上記の調製方法により調製される電気化学発光ナノプローブを反応試薬３（第３反応試薬）として工程２で得られた磁性ビーズ捕捉核酸－標的核酸－特異的抗体との複合体に検出信号標識を行う工程３（第３工程）と、工程３で得られた磁性ビーズ捕捉核酸－標的核酸－特異的抗体－ナノプローブとの複合体を電極表面に置き、共反応剤を添加した後に電気化学発光検出を行い、電気化学発光信号の有無及び強度に基づいて前記標的核酸の修飾に対して定性及び定量分析を行う工程４（第４工程）とを含む、核酸特異的サイト修飾の電気化学発光検出方法（以下、ＥＣＬ検出方法とも記す）に関する。
【0017】
本実施形態は、電気化学発光法により核酸特異的サイト修飾を検出し、前記核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである。前記核酸特異的サイト修飾は特に限定されず、例えばＤＮＡのメチル化修飾（例えば５－メチルシトシンのメチル化、以下、５ｍＣとも記す）、ヒドロキシメチル化修飾（例えば５－メチルシトシンのヒドロキシメチル化、以下５ｈｍＣとも記す）、ＲＮＡのプソイドウリジン化修飾（例えばアデニンの６番目のＮのメチル化、以下にｍ６Ａとも記す）等であってもよい。なお、ヒドロキシメチル化修飾は、メチロール化修飾とも呼ばれる。
【0018】
電気化学発光システムは、発光試薬に応じて主に二種類に分ける：（１）金属錯体電気化学発光システム、（２）縮合環芳香族炭化水素類及びヒドラジド類を含む有機化合物電気化学発光システム。常用の電気化学発光金属錯体は、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｒｅ、Ｉｒ、Ｃｒ、Ｐｄ、Ａｌ、Ｃｄ、Ｐｔ、Ｍｏ、Ｔｂ、Ｅｕ等の金属イオン錯体を含む。そのうち、Ｒｕ、Ｉｒ、Ｏｓ、Ｒｅの金属錯体が良好な電気化学発光特性を有するため注目されている。
【0019】
Ｒｕの金属錯体において、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体イオン（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋）は水溶性が高く、化学的性能が安定し、酸化還元が可逆的で、発光効率が高く、応用できるｐＨ範囲が広く、電気化学的に再生でき、励起状態寿命が長いなどの特徴により広く応用されている。ここで、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋は、共反応剤であるトリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）との反応により低電位条件下でのＥＣＬ検出が可能となり、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋とトリプロピルアミンＴＰｒＡとの反応式は以下のとおりである。
【0020】
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【0021】
本実施形態の電気化学発光検出方法は、好ましくはルテニウム（ＩＩ）錯体イオン系により行われるが、他の金属錯体イオン系、例えばイリジウム（ＩＩＩ）錯体イオン体系などを用いて行うこともできる。
【0022】
【0023】
具体的に、反応試薬１は捕捉核酸が修飾されている磁性ビーズであり、捕捉核酸は、標的核酸に対して設計され、標的核酸と相補的な核酸配列を有し、両者が安定で特異的にハイブリダイゼーションすることができる。捕捉核酸は、本分野の一般的な方法により合成することができるし、市販品を直接に使用することもできる。
【0024】
図２は、本実施形態の電気化学発光検出方法に用いられる反応試薬１の調製方法を示す模式図である。図２に示すように、捕捉核酸配列が、末端にビオチンが修飾されてもよく、磁性ビーズにストレプトアビジンが結合されてもよく、ビオチン－ストレプトアビジン反応により捕捉核酸が磁性ビーズに修飾される。ストレプトアビジンが結合されている磁性ビーズ（以下Ｓ－ＭＢｓとも記す）は本分野の一般的な方法により合成することができ、市販品を直接に使用することもできる。上記ビオチン－ストレプトアビジンとの結合方式は本分野に最も慣用される方式であるが、捕捉核酸と磁性ビーズとの結合方式がこれに限定されず、捕捉核酸を磁性ビーズに結合できる任意の方式を用いることができる。
【0025】
反応試薬２は標的核酸の特異的サイト修飾に対する特異的抗体（以下一次抗体とも記す）であり、当該抗体は特異的サイト修飾に応じて本分野の抗体の一般的な調製方法により調製されてもよく、市販品を直接に使用してもよい。前記一次抗体は、例えば、ＤＮＡのメチル化シトシン（５ｍＣ）又はヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に対する抗体である。
【0026】
反応試薬３は、本実施形態で調製された電気化学発光ナノプローブ（以下、ＥＣＬナノプローブとも記す）、即ち、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子である。
【0027】
本実施形態の一つの実施形態は、電気化学発光ナノプローブの調製方法であって、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程とを含む、電気化学発光ナノプローブ（以下、ＥＣＬナノプローブとも記す）の調製方法に関する。二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される。
【0028】
本実施形態のＥＣＬナノプローブの調製には、ナノ材料をキャリアとして使用され、ナノ材料は、巨大な表面積又は多孔質構造を有するため、大量の発光体を搭載して超感度検出に用いられることができる。高安定性、低コスト、及び修飾しやすさという点から、本実施形態に用いられるナノ材料は無機酸化物ナノ粒子を使用することが好ましい。無機酸化物ナノ粒子としては、具体的に、二酸化ケイ素ナノ粒子、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、又は酸化鉄ナノ粒子、或いは二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化亜鉛、又は酸化鉄等が表面に被覆されているナノ粒子が挙げられる。そのうち、二酸化ケイ素ナノ粒子がより好ましい。
【0029】
本実施形態のＥＣＬナノプローブの調製方法は、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加する工程を含む。添加方法としては、本分野の常用添加方法、例えば電気化学法、ゾルゲル法、イオン交換法、加水分解沈殿法などを用いることができるが、これに限定されず、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加できる任意の方法を用いることができる。言い換えると、電気化学発光ナノプローブ用ナノ粒子は、金属錯体イオンが添加された無機酸化物を備える。
【0030】
本実施形態のＥＣＬナノプローブの調製方法は、二次抗体を金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程をさらに含む。ここで、二次抗体と金属添加無機酸化物ナノ粒子との結合方式は、好ましくは共有結合方式により行われるが、他の方式、例えば静電吸着等を使用することもできる。共有結合を形成する結合の方式としては、具体的に、カルボキシ－アミノ結合、アルデヒド基－アミノ結合等が挙げられる。共有結合を形成する反応について、特に限定されないが、好ましくは室温で反応でき、かつ反応が迅速で、結合効率が高い共有結合反応である。言い換えると、電気化学発光ナノプローブは、金属錯体イオンが添加された無機酸化物ナノ粒子と、当該無機酸化物ナノ粒子と結合した二次抗体とを含む。
【0031】
図３は、本実施形態の電気化学発光検出方法に用いられる反応試薬３の調製方法を示す模式図である。図３において、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体イオン（Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋）を金属錯体イオンの例とし、ＥＤＣ／ＮＨＳ系（１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩）／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド系）を用いて二次抗体（以下Ａｂ２とも記す）を金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させる。具体的に、Ｒｕ（ｂｐｙ）３
２＋を二酸化ケイ素ナノ粒子に添加し、ルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子（以下、Ｒｕ＠ＳｉＯ２とも記す）を得る。次に、Ｒｕ＠ＳｉＯ２をカルボキシル化させ、カルボキシル化ルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子（以下、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２とも記す）を形成する。次に、ＥＤＣ／ＮＨＳ系を用いて二次抗体をＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２に結合させ、二次抗体修飾されたルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子（以下、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２とも記す）を形成する。
【0032】
本実施形態のＥＣＬナノプローブでは、一つのナノビーズ当たりにいずれも大量の金属錯体イオンを結合させることができるため、電気化学信号を顕著に増幅することができ、それによりＥＣＬ検出の感度を大幅に向上させることができる。
【0033】
また、本実施形態のＥＣＬナノプローブにおいて、１つのナノビーズ当たりにいずれも複数の二次抗体分子を結合させることができ、それによりナノプローブと一次抗体との結合効率を向上させることができる。
【0034】
これにより、本実施形態のＥＣＬナノプローブを用いることにより、ＥＣＬ検出の感度を大幅に向上させることができ、核酸特異的サイト修飾に対する検出はｆＭレベルまでに達することができる。
【0035】
本実施形態の二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する一次抗体を識別する。当該二次抗体は、好ましくは一次抗体と核酸特異的サイト修飾との結合特異的部分に対して設計されるものではなく、一次抗体の汎用部分に対して設計されるものである。すなわち、本実施形態の二次抗体は、好ましくは一次抗体（特異的抗体）の汎用部分を識別するタンパク質である。これにより、本実施形態は、抗体による様々なＥＣＬ検出方法に用いられる汎用ＥＣＬナノプローブを提供することができる。前記二次抗体は特に限定されず、本分野の一般的な抗体の調製方法により調製することができ、市販品を直接に使用することもできる。なお、汎用部分は、定常領域とも呼ばれる。
【0036】
これにより、本実施形態の一つの実施形態は、上記本実施形態のＥＣＬナノプローブの調製方法により調製されるＥＣＬナノプローブをさらに提供する。好ましくは、本実施形態のＥＣＬナノプローブは、抗体によるＥＣＬ検出方法に用いられる汎用ＥＣＬナノプローブである。
【0037】
本実施形態で調製されたＥＣＬナノプローブが、貯蔵安定性に優れ、例えば常温の保存条件下で１０日間以上保存することができる。そのため、本実施形態のＥＣＬナノプローブは、調製後にそのまま使用することができるが、一定の時間を保存した後に必要な時に使用することもできる。
【0038】
これにより、本実施形態のもう一つの実施態様は、上記本実施形態のＥＣＬナノプローブを含む、抗体による電気化学発光検出方法に用いられるキットを提供する。つまり、抗体による電気化学発光検出方法のキットは、金属錯体イオンを無機酸化物ナノ粒子に添加し、金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、二次抗体を前記金属添加無機酸化物ナノ粒子に結合させることで、二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子を得る工程と、を含み、前記二次抗体は、核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体を識別するように構成される電気化学発光ナノプローブの調製方法により調製される電気化学発光ナノプローブを含む。
【0039】
キットでは、本実施形態のＥＣＬナノプローブに加え、使用目的に応じて必要な様々な試薬、例えば反応試薬１、２及び使用説明書等を含むことができる。
【0040】
本実施形態のＥＣＬ検出方法は具体的には図１に示すように、以下の工程１～４を含んでもよい。
【0041】
工程１：反応試薬１（例えば、Ｓ－ＭＢｓ／Ｂ－Ｃａｐ）を検出される試料（例えば標的ＤＮＡ）と混合し、試料中の標的核酸を識別・捕獲する。Ｂ－Ｃａｐに結合されている捕捉核酸（例えば、捕捉ＤＮＡ）は標的ＤＮＡ配列と配列相補するように設計されるため、検出される試料を添加した後にハイブリダイゼーションにより標的核酸と結合できる。これにより、標的ＤＮＡが磁性ビーズに捕捉される。
【0042】
また、Ｓ－ＭＢｓ／Ｂ－Ｃａｐが標的ＤＮＡを識別した後、免疫試薬の非特異的吸着を防止するように、反応系をブロッキングしてもよい。ブロッキングは異種タンパク質又は洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０、ＢＳＡ、動物血清、脱脂乳粉等を採用することができ、好ましくはＢＳＡを採用する。
【0043】
工程２：反応試薬２（例えば、Ａｂ－５ｍＣ）を添加し、標的ＤＮＡを捕捉・標識する。反応試薬２である一次抗体は核酸特異的サイト修飾に対する特異的抗体に応じて設計され、標的核酸における特異的サイト修飾を識別することができる。これにより、標的核酸の特異的サイト修飾を捕捉・標識し、例えば磁性ビーズ捕捉ＤＮＡ－標的ＤＮＡ－Ａｂ－５ｍＣとの複合体を形成する。
【0044】
また、高いＥＣＬ信号強度を得る点から、好ましくは一次抗体濃度、一次抗体添加後のインキュベーション時間等を最適化する。一次抗体濃度として、例えば１．０μｇ／ｍＬ以上であってもよく、具体的に２．０μｇ／ｍＬ以上、２．５μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、２０μｇ／ｍＬ以上等であってもよく、好ましくは２．５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬである。一次抗体のインキュベーション時間として、例えば５ｍｉｎ～８０ｍｉｎであってもよく、具体的に５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４０ｍｉｎ、５０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、７０ｍｉｎ、８０ｍｉｎであってもよく、好ましくは２０ｍｉｎ～４０ｍｉｎである。
【0045】
工程３：反応試薬３（例えば、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２）を添加し、標的ＤＮＡに検出信号標識を行う。反応試薬３に結合されている二次抗体は、工程２で形成された複合体と特異的に結合することができるため、該複合物に検出信号標識を行い、例えば磁性ビーズ捕捉ＤＮＡ－標的ＤＮＡ－Ａｂ－５ｍＣ－Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２との複合体を形成することができる。
【0046】
また、高ＥＣＬ信号強度を得る点から、好ましくはＥＣＬナノプローブ濃度、ＥＣＬナノプローブ添加後のインキュベーション時間などを最適化する。ＥＣＬナノプローブ濃度として、例えば１μｇ／ｍＬ以上であってもよく、具体的に３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１５μｇ／ｍＬ以上、１８μｇ／ｍＬ以上であってもよく、好ましくは４μｇ／ｍＬ～１５μｇ／ｍＬである。ＥＣＬナノプローブのインキュベーション時間として、例えば５ｍｉｎ～８０ｍｉｎであってもよく、具体的には５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４０ｍｉｎ、５０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、７０ｍｉｎ、８０ｍｉｎであってもよく、好ましくは２０ｍｉｎ～４０ｍｉｎである。
【0047】
工程４：工程３で得られた複合物を電極表面に置き、電気化学発光検出を行う。ここで、高いＥＣＬ信号強度を得る点から、好ましくはＥＣＬ検出電解液のｐＨ値及び共反応剤（例えばＴＰｒＡ）の濃度を最適化する。ＥＣＬ検出電解液のｐＨ値として、例えば５．０～１０．０であってもよく、具体的に、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、１０．０であってもよく、好ましくは６．５以上であり、さらに好ましくは７．４である。共反応剤の濃度としては、例えば５．０～１６０．０ｍＭであってもよく、具体的に１０．０ｍＭ以上、２０．０ｍＭ以上、４０．０ｍＭ以上、８０．０ｍＭ以上であってもよく、好ましくは２０．０ｍＭ～８０．０ｍＭであり、より好ましくは４０．０ｍＭ～８０．０ｍＭである。
【0048】
なお、工程３で得られた複合体は図１の右側に示すように、磁性ビーズと、捕捉ＤＮＡと、標的ＤＮＡと、一次抗体と、ＥＣＬナノプローブで形成された複合体であり、当該複合物を電極表面に置くと電気化学発光信号を生成することができる。
【0049】
ＥＣＬ信号の有無及び強度に基づいて検出される試料の核酸特異的サイト修飾に対して定性及び定量分析を行うことができ、例えば反応系においてＥＣＬ信号が検出されない場合、検出される試料に核酸特異的サイト修飾が含まれなく、上記複合物が形成されずに電気化学発光信号を生成することができないと判断する。また、本実施形態の実施例において検証されているように、電気化学発光の強度とメチル化ＤＮＡ濃度の対数が線形関係を呈するため、電気化学発光の強度に基づいてメチル化ＤＮＡを定量分析することができる。
【0050】
本実施形態において、電気化学発光信号の検出は本分野に慣用される電気化学的化学分析システムを使用して検出することができる。使用される電極は、一般的な電極であってもよく、例えばガラス炭素電極、ＩＴＯ（Indium Tin Oxide）電極、又はスクリーン印刷電極等からの一種である。本実施形態において、好ましくは白金ワイヤ電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極及びガラス炭素作用電極（ＧＣＥ）が配置されている標準三電極システムを使用する。
【0051】
なお、本実施形態のＥＣＬ検出方法は上記工程に限定されない。上記工程において、まず一次抗体を標的核酸－捕捉核酸とのハイブリッド生成物に結合させ、次に本実施形態のＥＣＬナノプローブを添加して一次抗体－二次抗体との抗体複合体を形成するが、一次抗体と二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子とを結合させて一次抗体－二次抗体の抗体複合体を形成させた後、該抗体複合体を標的核酸－捕捉プローブとのハイブリッド生成物に結合させてもよい。これによっても、同様に磁性ビーズ捕捉核酸－標的核酸－一次抗体－ＥＣＬナノプローブの複合体を形成することができる。さらに、本実施形態において、一次抗体を二次抗体修飾済の金属添加無機酸化物ナノ粒子に直接修飾させた後に、全体でＥＣＬナノプローブとして検出に用いられることもできる。
【0052】
（実施例）
以下に実施例を挙げて本実施形態を具体的に説明するが、これらの実施例は例示に過ぎず、本実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下に実施例を挙げて本実施形態を具体的に説明するが、これらの実施例は例示に過ぎず、本実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0053】
なお、本実施例で使用されている全ての試薬はいずれも分析純度レベルである。
【0054】
また、使用される各略語の意味は以下のとおりである：
Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋：トリス（２,２’－ビピリジン）ジクロロルテニウム（ＩＩ）六水和物
ＴＥＯＳ：オルトケイ酸テトラエチル
ＮＨ４ＯＨ：アンモニア水
Ｒｕ＠ＳｉＯ２：ルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子
Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２：二次抗体修飾済のルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子
ＣＴＥＳ：Ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅｔｒｉｏｌ Ｎａ ｓａｌｔ
ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２：カルボキシル化ルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子
ＤＩ水：脱イオン水
ＥＤＣ：Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ′－エチルカルボジイミド塩酸塩
ＮＨＳ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
ＭＥＳ：２－（Ｎ－モルホリン）エタノールスルホン酸
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝液
ＢＳＡ：ウシ血清タンパク質
Ｓ－ＭＢｓ：ストレプトアビジン磁性ビーズ
Ｂ－Ｃａｐ：ビオチン－捕捉ＤＮＡ
Ｔ：ＤＮＡ試料
Ａｂ－５ｍＣ：抗５－メチルシトシン抗体
Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋：トリス（２,２’－ビピリジン）ジクロロルテニウム（ＩＩ）六水和物
ＴＥＯＳ：オルトケイ酸テトラエチル
ＮＨ４ＯＨ：アンモニア水
Ｒｕ＠ＳｉＯ２：ルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子
Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２：二次抗体修飾済のルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子
ＣＴＥＳ：Ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅｔｒｉｏｌ Ｎａ ｓａｌｔ
ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２：カルボキシル化ルテニウム添加二酸化ケイ素ナノ粒子
ＤＩ水：脱イオン水
ＥＤＣ：Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ′－エチルカルボジイミド塩酸塩
ＮＨＳ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
ＭＥＳ：２－（Ｎ－モルホリン）エタノールスルホン酸
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝液
ＢＳＡ：ウシ血清タンパク質
Ｓ－ＭＢｓ：ストレプトアビジン磁性ビーズ
Ｂ－Ｃａｐ：ビオチン－捕捉ＤＮＡ
Ｔ：ＤＮＡ試料
Ａｂ－５ｍＣ：抗５－メチルシトシン抗体
【0055】
（実施例１：反応試薬３（ＥＣＬナノプローブ）の調製）
（１）Ｒｕ＠ＳｉＯ２の調製
手順１）７．５ ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌａｄｄｉｎ（中国、上海））、１．８ ｍＬのｎ－ヘキサノール（ＴＣＩ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（中国、上海））、１．７７ ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ（中国、上海））を１５分間混合し、
手順２）３４０μＬのＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋（Ｓｉｇｍａ（中国、上海））（４０ｍＭ）水溶液を添加し、３０分間混合し、
手順３）１００μＬのＴＥＯＳ（Ｓｉｇｍａ（中国、上海））を添加し、３０分間混合し、
手順４）６０μＬのＮＨ４ＯＨ（Ｍａｃｋｌｉｎ（中国、上海））を添加し、遮光条件下２４ｈ混合し、Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得た。
（１）Ｒｕ＠ＳｉＯ２の調製
手順１）７．５ ｍＬのシクロヘキサン（Ａｌａｄｄｉｎ（中国、上海））、１．８ ｍＬのｎ－ヘキサノール（ＴＣＩ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（中国、上海））、１．７７ ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ（中国、上海））を１５分間混合し、
手順２）３４０μＬのＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋（Ｓｉｇｍａ（中国、上海））（４０ｍＭ）水溶液を添加し、３０分間混合し、
手順３）１００μＬのＴＥＯＳ（Ｓｉｇｍａ（中国、上海））を添加し、３０分間混合し、
手順４）６０μＬのＮＨ４ＯＨ（Ｍａｃｋｌｉｎ（中国、上海））を添加し、遮光条件下２４ｈ混合し、Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得た。
【0056】
（２）Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の調製
手順１）５０μＬのＣＴＥＳ（Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（中国、上海））を添加し、遮光条件下７ｈ混合し、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得た。
手順２）１５ ｍＬのアセトン、エタノール、ＤＩ水で順次に洗浄し、１０,０００ ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、ＤＩ水に分散し、
手順３）１０μＬの５０ ｍｇ／ｍＬ ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を取って５００μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ（５０ ｍｇ／ｍＬ ｅａｃｈ ｉｎ ２５ｍＭ ＭＥＳ（ＰＨ５．５）、ＥＤＣとＮＨＳはいずれもＪ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（中国、上海）から購入）で３５ｍｉｎ活性化させる；次に、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１２０００ ｒｐｍで５ｍｉｎ洗浄した後に、１ ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳに分散させ、
手順４）２０μＬの２ ｍｇ／ｍＬ Ａｂ２（ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（製品番号：ａｂ６７０９）、Ａｂｃａｍ（中国、上海）から購入）を添加し、６０ ｒｐｍで４ ｈ振とうし、
手順５）１２０００ｒｐｍで２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、及び１０ｍＭ ＰＢＳで５ｍｉｎ洗浄し、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得た。
手順６）最後に、得られたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を４°Ｃで０．１％ＢＳＡ（ＫｅｙＧＥＮ ＢｉｏＴＥＣＨ（中国、江蘇））／５ｍＭ ＰＢＳ緩衝液に使用の時まで保存した。
手順１）５０μＬのＣＴＥＳ（Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（中国、上海））を添加し、遮光条件下７ｈ混合し、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得た。
手順２）１５ ｍＬのアセトン、エタノール、ＤＩ水で順次に洗浄し、１０,０００ ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、ＤＩ水に分散し、
手順３）１０μＬの５０ ｍｇ／ｍＬ ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を取って５００μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ（５０ ｍｇ／ｍＬ ｅａｃｈ ｉｎ ２５ｍＭ ＭＥＳ（ＰＨ５．５）、ＥＤＣとＮＨＳはいずれもＪ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（中国、上海）から購入）で３５ｍｉｎ活性化させる；次に、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１２０００ ｒｐｍで５ｍｉｎ洗浄した後に、１ ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳに分散させ、
手順４）２０μＬの２ ｍｇ／ｍＬ Ａｂ２（ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（製品番号：ａｂ６７０９）、Ａｂｃａｍ（中国、上海）から購入）を添加し、６０ ｒｐｍで４ ｈ振とうし、
手順５）１２０００ｒｐｍで２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、及び１０ｍＭ ＰＢＳで５ｍｉｎ洗浄し、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得た。
手順６）最後に、得られたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を４°Ｃで０．１％ＢＳＡ（ＫｅｙＧＥＮ ＢｉｏＴＥＣＨ（中国、江蘇））／５ｍＭ ＰＢＳ緩衝液に使用の時まで保存した。
【0057】
（実施例２：ＥＣＬナノプローブの特徴づけ）
Ａ：ＴＥＭによるＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２形成の確認
実施例１で得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノ粒子をＪＥＭ－２１００透過電子顕微鏡（日本電子、ＪＥＯＬ）で撮影した。得られた透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を図４Ａに示す。なお、図４Ａ及び図４Ｂは、実施例１で調製されたＥＣＬナノプローブの特徴づけ結果を示す図である。図４Ａには実施例１で得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＴＥＭ写真を示し、図４ＢにはＤＬＳにより得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ａ）及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ｂ）の粒径分布図を示す。
Ａ：ＴＥＭによるＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２形成の確認
実施例１で得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノ粒子をＪＥＭ－２１００透過電子顕微鏡（日本電子、ＪＥＯＬ）で撮影した。得られた透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を図４Ａに示す。なお、図４Ａ及び図４Ｂは、実施例１で調製されたＥＣＬナノプローブの特徴づけ結果を示す図である。図４Ａには実施例１で得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２のＴＥＭ写真を示し、図４ＢにはＤＬＳにより得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ａ）及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ｂ）の粒径分布図を示す。
【0058】
図４Ａから分かるように、得られたＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノ粒子は、均一に分散し、大きさが均一で、直径が約３０ｎｍの球状粒子である。
【0059】
Ｂ：動的光散乱（ＤＬＳ）法によるＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２形成の確認
９０ Ｐｌｕｓ／ＢＩ－ＭＡＳ機器（米国、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いてそれぞれＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の粒径分布を測定した。結果を図４Ｂに示す。
９０ Ｐｌｕｓ／ＢＩ－ＭＡＳ機器（米国、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いてそれぞれＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２及びＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の粒径分布を測定した。結果を図４Ｂに示す。
【0060】
図４Ｂから分かるように、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ａ）の水和粒径は５０ｎｍ程度で分布し、粒径分布が狭く、サイズが均一であり、かつ単分散性を有する。Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（ｂ）の水和粒径は約７０ｎｍであり、ＣＯＯＨ－Ｒｕ＠ＳｉＯ２より僅かに大きく、Ａｂ２とＲｕ＠ＳｉＯ２とのカップリングが成功し、分散性が高く、凝集現象が発生しないことを示す。
【0061】
Ｃ：Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２に結合されているルテニウム分子の個数と結合されている抗体の個数の確認
単一のＲｕ＠ＳｉＯ２に結合されているルテニウム分子の個数を得るために、実施例１で得られたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２をＮａｎｏｄｒｏｐ－２０００Ｃ紫外光－可視光分光光度計（米国、Ｔｈｅｒｍｏｎ）を用いて紫外光―可視光スペクトル（ＵＶ）の定量分析を行った。結果を図５Ａに示す。なお、図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、実施例１で調製されたＥＣＬナノプローブの特徴づけ結果を示す図である。図５ＡにはＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノプローブの紫外可視スペクトルを示し、図５Ｂには［Ｒｕｂｙｐ３ ２＋］の４５７ｎｍでの濃度検量線を示し、図５ＣにはＢＳＡ標準品の６２０ｎｍでの濃度検量線を示す。
単一のＲｕ＠ＳｉＯ２に結合されているルテニウム分子の個数を得るために、実施例１で得られたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２をＮａｎｏｄｒｏｐ－２０００Ｃ紫外光－可視光分光光度計（米国、Ｔｈｅｒｍｏｎ）を用いて紫外光―可視光スペクトル（ＵＶ）の定量分析を行った。結果を図５Ａに示す。なお、図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、実施例１で調製されたＥＣＬナノプローブの特徴づけ結果を示す図である。図５ＡにはＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２ナノプローブの紫外可視スペクトルを示し、図５Ｂには［Ｒｕｂｙｐ３ ２＋］の４５７ｎｍでの濃度検量線を示し、図５ＣにはＢＳＡ標準品の６２０ｎｍでの濃度検量線を示す。
【0062】
図５Ａに示すように、１００μｇ／ｍＬのＲｕ＠ＳｉＯ２の４５７ｎｍにおける吸光度Ａは０．２６であり、図５Ｂの［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋濃度検量線に基づいて１００μｇ／ｍＬのＲｕ＠ＳｉＯ２における［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋の濃度は１２．５３μｇ／ｍＬである。これにより、１ ｍＬＲｕ＠ＳｉＯ２における［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋分子の個数がＮ［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋＝ＮＡ・ｎ＝ＮＡ・ｍＲｕ／ＭＲｕ＝１．０１×１０１６と推定した。さらに、単一のＲｕ＠ＳｉＯ２に包まれた［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋分子個数＝Ｎ［Ｒｕｂｐｙ３］２＋／ＮＲｕ＠ＳｉＯ２＝３．１×１０４を得た。
【0063】
プレートリーダー用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法タンパク質定量キット（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（中国、上海））により実施例１で得られたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２中のＡｂ２の６２０ｎｍにおける吸光度を測定した結果、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２中のＡｂ２の吸光度Ａ６２０は０．６３である。
【0064】
図５ＣのＢＳＡタンパク質検量線に基づいてＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２におけるＡｂ２の濃度が７３．１１μｇ／ｍＬであり、ＩｇＧ－Ａｂ２のモル質量ＭＡｂ２＝１５０ ＫＤ＝１．５×１０５ｇ／ｍｏｌを得て、１ ｍＬの７３．１１μｇ／ｍＬ Ａｂ２におけるＡｂ２の個数ＮＡｂ２＝ＮＡ・ｎ＝ＮＡ・ｍＡｂ２／ＭＡｂ２＝２．９４×１０１４を得た。
【0065】
２ ｍｇのＲｕ＠ＳｉＯ２におけるＲｕ＠ＳｉＯ２の個数に基づいて、１ ｍＬの１ ｍｇ／ｍＬ Ｒｕ＠ＳｉＯ２におけるＲｕ＠ＳｉＯ２の個数Ｎ２が３．２２×１０１３である。これにより、単一のＲｕ＠ＳｉＯ２に結合されている抗体の個数＝ＮＡｂ２／Ｎ２＝２．９４２１０１４／３．２２×１０１３≒９を得た。
【0066】
Ｄ：Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２の保存安定性
実施例１で得られたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を１％ＢＳＡ含有水溶液に４°Ｃ遮光で保存し、５日間ごとにそのＥＣＬ信号を測定した。結果を図６に示す。なお、図６は、実施例１で調製されたＥＣＬナノプローブの保存時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。
実施例１で得られたＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を１％ＢＳＡ含有水溶液に４°Ｃ遮光で保存し、５日間ごとにそのＥＣＬ信号を測定した。結果を図６に示す。なお、図６は、実施例１で調製されたＥＣＬナノプローブの保存時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。
【0067】
なお、実施例部分において、ＥＣＬはいずれもＭＰＩ－Ａ多機能電気化学発光分析システム（中国、西安Ｒｅｍｅｘ）、標準三電極システムの電解セルで測定した。前記標準三電極システムに白金ワイヤ電極と、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極と、直径が５ｍＭのガラス炭素作用電極（ＧＣＥ）が配置されている。
【0068】
三電極システムを用いてＥＣＬ検出電解液（０．１Ｍ ＰＢＳ、０．１Ｍ ＫＮＯ３、４０ｍＭ ＴＰｒＡ、ＰＨ７．４）でＥＣＬ応答を記録し、電気化学サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）（実験はＣＨＩ ６３０ Ｄ電気化学ワークステーション（中国、上海辰華）で行った。）を用いて０から＋１．２５ Ｖまで連続的に電位走査を行い、走査速度が１００ ｍＶ／ｓであり、光電子増倍管（ＰＭＴ）の電圧が６００ Ｖに設定される。また、全てのＥＣＬ測定はいずれも室温で行い、以下も同様である。
【0069】
図６から分かるように、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２プローブは、ＥＣＬ強度が２０日間内にほとんど変化しないため、１％ＢＳＡ含有水溶液に優れた貯蔵安定性を有することが検証された。
【0070】
（実施例３：ＥＣＬ検出方法）
本実施例で使用されたＤＮＡ配列はいずれも上海Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成・精製された。使用する配列を具体的に表１に示す。
本実施例で使用されたＤＮＡ配列はいずれも上海Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成・精製された。使用する配列を具体的に表１に示す。
【0071】
【表1】
【0072】
（１）ＤＮＡ試料の準備
下記の配列を含むＤＮＡ試料（Ｔ）を準備する。
陰性コントロール配列：０×５ｍＣ－ＲＡＳＳＦ１Ａ（Ｔ０）（配列番号２）
標的ＤＮＡ配列：７×５ｍＣ－ＲＡＳＳＦ１Ａ（Ｔ５ｍＣ）（配列番号３）
非目標ＤＮＡ配列：７×５ｍＣ－ＰＣＤＨＧＢ７（ＴＰ）（配列番号５）
下記の配列を含むＤＮＡ試料（Ｔ）を準備する。
陰性コントロール配列：０×５ｍＣ－ＲＡＳＳＦ１Ａ（Ｔ０）（配列番号２）
標的ＤＮＡ配列：７×５ｍＣ－ＲＡＳＳＦ１Ａ（Ｔ５ｍＣ）（配列番号３）
非目標ＤＮＡ配列：７×５ｍＣ－ＰＣＤＨＧＢ７（ＴＰ）（配列番号５）
【0073】
（２）反応試薬１（Ｓ－ＭＢｓ／Ｂ－Ｃａｐ）の調製：
手順１）ＴＥ緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌを含有するＢ＆Ｗ緩衝液、ｐＨ７．５）で２μＬＳ－ＭＢｓ（ＢｉｏＭａｇ（江蘇、無錫））を洗浄し、
手順２）２５μＬの０．１μＭ Ｂ－Ｃａｐ（ｉｎ ｐＨ７．５ ＴＥ緩衝液）と混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、
手順３）１０ｍＭ ＰＢＳで洗浄し、余分なＢ－Ｃａｐを洗浄し、Ｓ－ＭＢｓ／Ｂ－Ｃａｐを得た。
手順１）ＴＥ緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌを含有するＢ＆Ｗ緩衝液、ｐＨ７．５）で２μＬＳ－ＭＢｓ（ＢｉｏＭａｇ（江蘇、無錫））を洗浄し、
手順２）２５μＬの０．１μＭ Ｂ－Ｃａｐ（ｉｎ ｐＨ７．５ ＴＥ緩衝液）と混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、
手順３）１０ｍＭ ＰＢＳで洗浄し、余分なＢ－Ｃａｐを洗浄し、Ｓ－ＭＢｓ／Ｂ－Ｃａｐを得た。
【0074】
（３）標的ＤＮＡへの識別
手順１）５０μＬのＴ（ｉｎ １０ｍＭ ＰＢＳ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、
手順２）次に１０ｍＭ ＰＢＳで洗浄し、未反応のＴを除去した。
手順１）５０μＬのＴ（ｉｎ １０ｍＭ ＰＢＳ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、
手順２）次に１０ｍＭ ＰＢＳで洗浄し、未反応のＴを除去した。
【0075】
（４）５ｍＣへのＡｂ－５ｍＣによる識別
手順１）５０μＬの２％ＢＳＡ（ｉｎ １０ｍＭ ＰＢＳ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、
手順２）５０μＬのＡｂ－５ｍＣ（製品番号：ａｂ１０８０５、Ａｂｃａｍ（中国、上海）、２．５μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で２０分間インキュベートし、
手順３）その後に１０ｍＭ ＰＢＳで洗浄し、未反応のＡｂ－５ｍＣを洗浄した。
手順１）５０μＬの２％ＢＳＡ（ｉｎ １０ｍＭ ＰＢＳ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、
手順２）５０μＬのＡｂ－５ｍＣ（製品番号：ａｂ１０８０５、Ａｂｃａｍ（中国、上海）、２．５μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で２０分間インキュベートし、
手順３）その後に１０ｍＭ ＰＢＳで洗浄し、未反応のＡｂ－５ｍＣを洗浄した。
【0076】
（５）ＥＣＬナノプローブによる標識
手順１）５０μＬのＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（６μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で２０分間インキュベートし、
手順２）その後に１０ｍＭ ＰＢＳで洗浄し、６５μＬ １０ｍＭ ＰＢＳに分散させた。
手順１）５０μＬのＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２（６μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で２０分間インキュベートし、
手順２）その後に１０ｍＭ ＰＢＳで洗浄し、６５μＬ １０ｍＭ ＰＢＳに分散させた。
【0077】
（６）ＥＣＬ検出
手順１）上記Ｓ－ＭＢｓ／Ｂ－Ｃａｐ－Ｔ－Ａｂ－５ｍＣ－Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２との複合体（以下、複合体と略称する）溶液をＧＣＥ電極に滴下し、乾燥した後にＥＣＬ電解液（０．１Ｍ ＰＢＳ、０．１Ｍ ＫＮＯ３、４０ｍＭ ＴＰｒＡ、ｐＨ７．４）に浸漬し、
手順２）０～１．２５Ｖで電位走査を行い、ＰＭＴ６００でＥＣＬを収集した。
手順１）上記Ｓ－ＭＢｓ／Ｂ－Ｃａｐ－Ｔ－Ａｂ－５ｍＣ－Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２との複合体（以下、複合体と略称する）溶液をＧＣＥ電極に滴下し、乾燥した後にＥＣＬ電解液（０．１Ｍ ＰＢＳ、０．１Ｍ ＫＮＯ３、４０ｍＭ ＴＰｒＡ、ｐＨ７．４）に浸漬し、
手順２）０～１．２５Ｖで電位走査を行い、ＰＭＴ６００でＥＣＬを収集した。
【0078】
（実施例４：ＥＣＬセンサ体系の特徴づけ）
以下、実施例３で得られた上記複合物を含むＧＣＥ電極検出システムを本実施形態のＥＣＬセンサ体系とも称する。
以下、実施例３で得られた上記複合物を含むＧＣＥ電極検出システムを本実施形態のＥＣＬセンサ体系とも称する。
【0079】
（１）本実施形態のＥＣＬセンサ体系の測定
実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系の各ステップの結果に対して、電気化学的サイクリックボルタンメトリー実験（ＣＶ）及び電気化学インピーダンススペクトルスコピー（ＥＩＳ）テストを行い、ここでは、ＣＶはＣＨＩ６３０Ｄ電気化学ワークステーション（中国、上海辰華）で行い、ＥＩＳテストはＤＨ７０００（中国、江蘇東華）で測定した。結果を図７に示す。なお、図７Ａ及び図７Ｂは、実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系の測定結果を示す図である。図７ＡはＥＣＬセンサ体系が段階的に修飾されたことを示すサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）図であり、図７ＢはＥＣＬセンサ体系が段階的に修飾されたことを示す電気化学インピーダンススペクトルスコピー（ＥＩＳ）図である。
実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系の各ステップの結果に対して、電気化学的サイクリックボルタンメトリー実験（ＣＶ）及び電気化学インピーダンススペクトルスコピー（ＥＩＳ）テストを行い、ここでは、ＣＶはＣＨＩ６３０Ｄ電気化学ワークステーション（中国、上海辰華）で行い、ＥＩＳテストはＤＨ７０００（中国、江蘇東華）で測定した。結果を図７に示す。なお、図７Ａ及び図７Ｂは、実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系の測定結果を示す図である。図７ＡはＥＣＬセンサ体系が段階的に修飾されたことを示すサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）図であり、図７ＢはＥＣＬセンサ体系が段階的に修飾されたことを示す電気化学インピーダンススペクトルスコピー（ＥＩＳ）図である。
【0080】
図７において、ａが裸ＧＣＥ電極を表し、ｂがＳ－ＭＢｓ／ＧＣＥを表し、ｃが表示Ｂ－Ｃａｐ／Ｓ－ＭＢｓ／ＧＣＥを表し、ｄがＢＳＡ／Ｂ－Ｃａｐ／Ｓ－ＭＢｓ／ＧＣＥを表し、ｅがＴ／ＢＳＡ／Ｂ－Ｃａｐ／Ｓ－ＭＢｓ／ＧＣＥを表し、ｆがＡｂ－５ｍＣ／Ｔ／ＢＳＡ／Ｂ－Ｃａｐ／Ｓ－ＭＢｓ／ＧＣＥを表し，ｇがＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２／Ａｂ－５ｍＣ／Ｔ／ＢＳＡ／Ｂ－Ｃａｐ／Ｓ－ＭＢｓ／ＧＣＥを表す。
【0081】
図７から分かるように、磁性ガラス炭素電極の裸電極（ａ）又はＳ－ＭＢ及び異なる複合体（ｂ－ｇ）が修飾されているＳ－ＭＢ及び複合体について、Ｓ－ＭＢ及び複合体をＧＣＥに添加した後に、磁性ビーズ及び複合体の導電性が低いため、電極表面の抵抗が段階的に増加し、電子伝達効率が減少し、対応する酸化還元電流が段階的に減少し（図７Ａ：ａ－ｇ）、ＥＩＳインピーダンスが段階的に増加した（図７Ｂ：ａ－ｇ）。
【0082】
（２）本実施形態のＥＣＬセンサ体系の電気化学的パラメータについての最適化
実施例３で使用されているＥＣＬ検出電解液のｐＨ値及びＴＰｒＡ濃度を変更し、ｐＨを６．０～８．５の範囲内で変化させ、ＴＰｒＡ濃度を１０ｍＭ～８０ｍＭの範囲内で変化させる。結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。図８Ａ及び図８Ｂは、実施例３で調製されたＲｕ＠ＳｉＯ２の異なるＥＣＬ検出条件でのＥＣＬ応答状況を示す図であり、図８Ａは異なるＴＰｒＡ濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図であり、図８ＢはＥＣＬ検出電解液の異なるｐＨとＥＣＬ強度との関係を示す図である。
実施例３で使用されているＥＣＬ検出電解液のｐＨ値及びＴＰｒＡ濃度を変更し、ｐＨを６．０～８．５の範囲内で変化させ、ＴＰｒＡ濃度を１０ｍＭ～８０ｍＭの範囲内で変化させる。結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。図８Ａ及び図８Ｂは、実施例３で調製されたＲｕ＠ＳｉＯ２の異なるＥＣＬ検出条件でのＥＣＬ応答状況を示す図であり、図８Ａは異なるＴＰｒＡ濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図であり、図８ＢはＥＣＬ検出電解液の異なるｐＨとＥＣＬ強度との関係を示す図である。
【0083】
図８から分かるように、ＥＣＬ検出電解液のｐＨ値が６．５以上である場合、いずれも良好なＥＣＬ強度を得ることができ、ここでｐＨ値が７．４である場合、ＥＣＬ信号強度が最も高く、最適なｐＨである。また、ＴＰｒＡ濃度が１０ｍＭ以上である場合、いずれも良好な結果を得ることができ、ここでＴＰｒＡが４０ｍＭである場合、ＥＣＬ信号強度が最も高く、最適なＴＰｒＡ濃度である。
【0084】
実施例３におけるＡｂ－５ｍＣ濃度、Ａｂ－５ｍＣインキュベーション時間、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２濃度、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２インキュベーション時間を変更し、Ａｂ－５ｍＣ濃度を０～２０μｇ／ｍＬの範囲内で変化させ、Ａｂ－５ｍＣインキュベーション時間を１０～４０分間の範囲内で変化させ、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２濃度を３～１５μｇ／ｍＬの範囲内で変化させ、Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２インキュベーション時間を１０～３０分間の範囲内で変化させ、結果を図９Ａ～図９Ｄに示す。図９Ａ～図９Ｄは、実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系の異なる検出条件でのＥＣＬ応答状況を示す図である。図９Ａは異なるＡｂ－５ｍＣ濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図であり、図９Ｂは異なるＡｂ－５ｍＣインキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図であり、図９Ｃは異なるＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２濃度とＥＣＬ強度との関係を示す図であり、図９Ｄは異なるＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２インキュベーション時間とＥＣＬ強度との関係を示す図である。
【0085】
図９Ａ～図９Ｄから分かるように、Ａｂ－５ｍＣ濃度が１μｇ／ｍＬ以上である場合、いずれも良好なＥＣＬ強度が得られ、ここでＡｂ－５ｍＣ濃度が２．５μｇ／ｍＬ以上である場合、ＥＣＬ信号強度が安定し、最適なＡｂ－５ｍＣ濃度である。Ａｂ－５ｍＣインキュベーション時間が１０分以上である場合、いずれも良好なＥＣＬ強度が得られ、ここでＡｂ－５ｍＣインキュベーション時間が２０分以上である場合、ＥＣＬ信号強度が安定し、最適なＡｂ－５ｍＣインキュベーション時間である。Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２濃度が４μｇ／ｍＬ以上である場合、いずれも良好なＥＣＬ強度が得られ、ここでＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２濃度が６μｇ／ｍＬ以上である場合、ＥＣＬ信号強度が安定し又はより高くなり、最適なＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２濃度である。Ａｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２インキュベーション時間が１５分間以上である場合、いずれも良好なＥＣＬ強度が得られ、ここでＡｂ２－Ｒｕ＠ＳｉＯ２インキュベーション時間が２０分間以上である場合、ＥＣＬ信号強度が安定し、最適なＡｂ－５ｍＣインキュベーション時間である。すなわち、電気化学発光ナノプローブの濃度は、４μｇ／ｍＬ以上が好適である。また、電気化学発光ナノプローブ添加後のインキュベーション時間は１５分間以上が好適である。
【0086】
（実施例５：本実施形態のＥＣＬ検出方法の実行可能性についての検証）
実施例３におけるＴをそれぞれＴ０、Ｔ５ｍＣ、Ｔなしの背景溶液とし、上記実施例３のステップを行い、複合物を得た。
実施例３におけるＴをそれぞれＴ０、Ｔ５ｍＣ、Ｔなしの背景溶液とし、上記実施例３のステップを行い、複合物を得た。
【0087】
複合物をＰＢＳに分散させ、３μＬを取ってＩＴＯ導電ガラスに置き、６２０ｎｍの励起波長を印加し、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８倒立顕微鏡、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｐｒｉｍｅ ９５Ｂカメラが配置されている）で撮影し、得られた蛍光顕微鏡写真を図１０のａ、ｂ、ｃに示す。図１０は、実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系による標的核酸の検出原理を示す蛍光検証図である。図１０において、ａ、ｂ及びｃはそれぞれＣｙ５－Ｐｒｏ核酸検出プローブを用いる時のブランク溶液（Ｔなし）、陰性コントロール配列（Ｔ０）及び標的ＤＮＡ配列（Ｔ５ｍＣ）の蛍光イメージング図を示し、ｄ、ｅ及びｆはそれぞれ蛍光標識二次抗体（Ａｂ２－Ａｌｅｘａ Ｆ６４７）を用いる時のブランク溶液（Ｔなし）、陰性コントロール配列（Ｔ０）及び標的ＤＮＡ配列（Ｔ５ｍＣ）の蛍光イメージング図を示す。
【0088】
図１０のａ、ｂ及びｃに示すように、核酸と結合しないＳ－ＭＢ／Ｂ－Ｃａｐは蛍光現象が見られず、Ｔ０、Ｔ５ｍＣと結合した後、磁性ビーズにいずれも蛍光が生成された。この結果から、Ｂ－ＣａｐがＴ０、Ｔ５ｍＣを捕捉することができ、メチル化サイトが二本鎖塩基の相補的なペアリングに影響を与えないことが分かった。また、Ｂ－ＣａｐがＳ－ＭＢと結合することができることも分かった。
【0089】
実施例１におけるＡｂ２の代わりに、Ａｂ－５ｍＣと特異的に結合できる蛍光標識二次抗体（Ａｂ２－Ａｌｅｘａ Ｆ６４７）を使用し、Ａｂ２－Ａｌｅｘａ Ｆ６４７－Ｒｕ＠ＳｉＯ２を得て、実施例３に用いられる。上記と同様に実施例３で得られた複合体を蛍光顕微鏡で撮影した。結果を図１０のｄ、ｅ、ｆに示す。
【0090】
図１０のｄ、ｅ及びｆに示すように、Ｔと結合しなかった、及びＴ０とを結合したＳ－ＭＢ／Ｂ－Ｃａｐではいずれも蛍光がなく、Ｔ５ｍＣと結合した磁性ビーズでは明らかな蛍光が見られました。この結果から、Ａｂ－５ｍＣが標的ＤＮＡ鎖上のメチル化サイトに結合することができることが分かった。
【0091】
上記結果から分かるように、本実施形態のＥＣＬ検出方法は実現可能な方法である。
【0092】
（３）本実施形態のＥＣＬセンサ体系の検出限界測定
実施例３におけるＴ中のメチル化ＤＮＡの濃度を変更し、０．５ｐＭ～５０,０００ｐＭの濃度範囲内で変化させ、結果を図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。図１１Ａ及び図１１Ｂは、実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系の異なる濃度のメチル化ＤＮＡにおけるＥＣＬ応答状況を示す図である。図１１Ａは異なる濃度のメチル化ＤＮＡのＥＣＬ応答曲線を示し、図１１Ａにおいて、ａ～ｉはそれぞれ０．５ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１０ｎＭ及び５０ｎＭを示す。図１１Ｂは異なる濃度のメチル化ＤＮＡを検出する検量線を示し、ｎ＝３である。
実施例３におけるＴ中のメチル化ＤＮＡの濃度を変更し、０．５ｐＭ～５０,０００ｐＭの濃度範囲内で変化させ、結果を図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。図１１Ａ及び図１１Ｂは、実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系の異なる濃度のメチル化ＤＮＡにおけるＥＣＬ応答状況を示す図である。図１１Ａは異なる濃度のメチル化ＤＮＡのＥＣＬ応答曲線を示し、図１１Ａにおいて、ａ～ｉはそれぞれ０．５ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１０ｎＭ及び５０ｎＭを示す。図１１Ｂは異なる濃度のメチル化ＤＮＡを検出する検量線を示し、ｎ＝３である。
【0093】
図１１Ａ及び図１１Ｂから分かるように、ＥＣＬの強度（Ｉ）はメチル化ＤＮＡ濃度の増加に伴って増加し（図１１Ａ）、ＥＣＬの強度（Ｉ）とメチル化ＤＮＡ濃度の対数は線形関係を呈し（図１１Ｂ）、その相関係数は０．９９１５である。かつ、三倍ＳＮ比（ｓｉｇｎａｌ－ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ）で計算されたメチル化ＤＮＡの最低検出限界（ＬＯＤ）は０．１３ｐＭである。
【0094】
（４）本実施形態のＥＣＬ検出方法の選択性についての検証
実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系を用いて、Ｔ０、Ｔ５ｍＣ及び背景溶液をそれぞれ測定し、その結果を図１２に示す。図１２は、本実施形態のＥＣＬ検出方法の選択性についての評価結果を示す図である。
実施例３で調製されたＥＣＬセンサ体系を用いて、Ｔ０、Ｔ５ｍＣ及び背景溶液をそれぞれ測定し、その結果を図１２に示す。図１２は、本実施形態のＥＣＬ検出方法の選択性についての評価結果を示す図である。
【0095】
図１２に示すように、Ｔ０と背景溶液ではＥＣＬ信号がほとんど発生されず、Ｔ５ｍＣでは高いＥＣＬ強度が発生された。これにより、本実施形態のＥＣＬセンサ体系は良好な選択性を有することが確認された。
【0096】
（５）本実施形態のＥＣＬ検出方法の安定性についての検証
実施例３のＥＣＬセンサ体系について、Ｔ５ｍＣを含む電極に対して、０～２５０秒内で、０Ｖ～＋１．２５ Ｖの走査電位を１０回連続的に印加し、その結果を図１３Ａに示す。図１３Ａ及び図１３Ｂは、本実施形態のＥＣＬ検出方法の安定性についての評価結果を示す図である。図１３Ａは本実施形態のＥＣＬ検出方法の信号安定性についての評価結果を示す図であり、図１３Ｂは本実施形態のＥＣＬ検出方法の長期検出安定性についての評価結果を示す図である。
実施例３のＥＣＬセンサ体系について、Ｔ５ｍＣを含む電極に対して、０～２５０秒内で、０Ｖ～＋１．２５ Ｖの走査電位を１０回連続的に印加し、その結果を図１３Ａに示す。図１３Ａ及び図１３Ｂは、本実施形態のＥＣＬ検出方法の安定性についての評価結果を示す図である。図１３Ａは本実施形態のＥＣＬ検出方法の信号安定性についての評価結果を示す図であり、図１３Ｂは本実施形態のＥＣＬ検出方法の長期検出安定性についての評価結果を示す図である。
【0097】
図１３Ａに示すように、ＥＣＬ信号が安定した。これから、本実施形態のＥＣＬ検出方法によるＥＣＬ信号の安定性が良好であることが確認された。
【0098】
調製された反応試薬１（Ｂ－Ｃａｐ／Ｓ－ＭＢ）をＰＢＳに、４℃で保存し、７日ごとに５００ｐＭの目標ＤＮＡ配列（ＲＡＳＳＦ１Ａ）を含む試料に対してＥＣＬ検出を行い、その結果を図１３Ｂに示す。
【0099】
図１３Ｂに示すように、本実施形態の検出方法が、２８日間内に高い検出安定性、良好な長期検出安定性を有することが示された。
【0100】
上記実施例の実験結果から分かるように、本実施形態の電気化学発光検出方法は簡単で、迅速で、検出効率が高く、コストが低くかつキット化可能であり、かつ検出の感度が高く、核酸特異的サイト修飾に対する検出限界はｆＭレベルまでに達することができる。
【0101】
以上、実施形態に基づいて本実施形態のＥＣＬ検出方法、及び該検出方法に用いられるＥＣＬナノプローブ及びその調製方法等を説明したが、本実施形態はこれらに限定されるものではない。本実施形態の趣旨を逸脱しない限り、実施の形態に当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される他の形態も本実施形態の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【0102】
１，２，３ 反応試薬
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【配列表】